ES2245306T3 - Sistema de expresion de proteina microbiana. - Google Patents
Sistema de expresion de proteina microbiana.Info
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Abstract
Una cepa bacteriana Gram-negativa que tiene la capacidad de segregar una proteína heteróloga recombinante hacia el periplasma de dicha bacteria, expresando dicha bacteria simultáneamente una proteína de fusión de (péptido señal de Cafl)-(proteína heteróloga madura)- (subunidad de una estructura de la superficie bacteriana, que es Cafl de Yersinia pestis), y un chaperón periplásmico Cafl M específico para dicha subunidad.
Description
Sistema de expresión de proteína microbiana.
Esta invención se refiere a la biotecnología y,
de forma más específica, a la producción de proteínas heterólogas
recombinantes por microbios. En particular, esta invención se
refiere a la secreción de proteínas heterólogas biológicamente
activas solubles hacia el periplasma y/o sobre una superficie/hacia
un medio de cultivo de bacterias Gram-negativas. La
invención aprovecha el sistema de secreción de la bacterias
Gram-negativas, incluyendo los chaperones
periplásmicos y las proteínas ujier/secretina del sistema.
La producción comercial de diversas proteínas
recombinantes médica e industrialmente valiosas por microbios es uno
de los desafíos clave de la biotecnología moderna. Aunque estos
sistemas son conocidos, existen graves problemas técnicos en la
explotación a gran escala de la maquinaria celular microbiana. Hay
varios sistemas de secreción en bacterias
Gram-negativas que pueden aprovecharse, en potencia,
para la secreción de proteínas heterólogas recombinantes. Los
sistemas se resumen brevemente a continuación.
La mayoría de las proteínas segregadas en
Escherichia coli se sintetizan como precursores con un
péptido señal (SP) N-terminal clásico, que resulta
esencial para una exportación eficaz, y que se escinde durante o
después de la translocación a través de la membrana interna. La
translocación es mediada por la translocasa Sec (SecA/Y/G/E). La
SecA es una ATPasa periféricamente asociada, que interacciona con la
secuencia señal y la parte madura del precursor, guía al
polipéptido hacia el translocador y proporciona energía al proceso.
Las SecY, E y G son proteínas de membrana integrales que forman el
translocador en sí mismo y un canal acuoso central a través del cual
se transloca el polipéptido. Las SecD y F tienen grandes dominios
periplásmicos. Las funciones propuestas de estas dos proteínas están
relacionadas con etapas posteriores en el proceso, e incluyen la
liberación de la membrana y la mediación de la transferencia de
energía desde la fuerza motriz de protones. Los polipéptidos se
translocan en un estado "no plegado". Por tanto, la SecB es un
chaperón citosólico aparentemente dedicado a la vía secretora, que
se requiere para la exportación de un subgrupo de proteínas
segregadas. La SecB inhibe el plegamiento prematuro y dirige al
precursor hacia el complejo de translocasa de la membrana. Ahora
parece que los principios básicos del sistema de exportación son
universales. Aunque la translocación es principalmente
cotraduccional en sistemas eucariotas, y el transporte dirigido
hacia el aparato de secreción se realiza principalmente a través de
SRP ("signal recognition particle", partícula de
reconocimiento de señal), el núcleo del translocador es homólogo en
ambos sistemas (las Sec 61 \alpha y \gamma de levadura son
homólogas a SecY/E de E. coli). Además, ffh de E.
coli y 4,5S RNA son homólogos de la subunidad de 54 KD y 7S RNA
eucariota de SPR, respectivamente. La comparación de los sistemas
eucariotas y procariotas se ha publicado extensamente en fechas
recientes (Rapoport, T., et al. (1996), Annual Review of
Biochemistry, 65:271-303; Schatz, G., y B.
Dobberstein (1996), Science, 271:1519-1526).
Las similitudes en la función básica de los
sistemas de exportación eucariotas y procariotas significan que
algunas proteínas de mamífero pueden segregarse con éxito hacia el
periplasma de E. coli. Los ejemplos incluyen la insulina
humana. Sin embargo, a menudo se requiere un ajuste preciso, como
la optimización del N-terminal de la proteína
madura, la eliminación de los restos con carga positiva al final del
SP o al comienzo de la proteína madura, lo cual asegura la
presencia de un buen sitio de ruptura. Con frecuencia se ha
utilizado un péptido señal bacteriano, como el SP OmpA. La secuencia
señal Cafl también se ha utilizado con éxito para exportar
citoquinas de mamífero (véase a continuación). Un problema
importante en la expresión recombinante de E. coli es el
plegamiento incorrecto acompañado de la degradación de la proteína
o la acumulación en una forma insoluble e inactiva en forma de
cuerpos de inclusión.
Además del sistema de secreción dependiente de
sec, existen al menos dos otros sistemas de translocación de
proteínas a través de la membrana interna bacteriana. La proteína
de revestimiento de fago M13 también se sintetiza con una SP
adicional, pero el ensamblaje de esta proteína a través de la
membrana es independiente de la maquinaria sec.
Recientemente se ha elucidado una nueva vía implicada en la
secreción de proteínas que contienen cofactor (Santini, G., et
al. (1998), EMBO Journal, 17:101-112; Weiner,
J., et al. (1998), Cell, 93:91-101). Las
proteínas que siguen esta vía tiene un conductor largo que contiene
un motivo característico de "argininas gemelas". Se ha
propuesto que la unión del cofactor se produce en el citosol, y que
la proteína totalmente plegada se transloca a través de la membrana
interna por medio de productos del operón mttABC. Además,
existen proteínas citosólicas de E. coli que parecen estar en
un sitio privilegiado que es sensible al choque osmótico. Por
tanto, puede haber algún acceso transitorio al periplasma. Estas
proteínas incluyen tiorredoxina (Lunn, C.A., y V.P. Pigiet (1982),
J. Biol. Chem., 257:11424-11430), implicada en la
reacción de disulfuro de los componentes celulares, el chaperón
citosólico DnaK (Yaagoubi, A., et al. (1994), Journal of
Bacteriology, 176:7074-7078), el factor de
alargamiento Tu (Jacobson, G., et al. (1976), Biochemistry,
15:2297-2303), y los componentes unidos a la
membrana interna del complejo de
enterobactina-sintasa (Hantash, F., et al.
(1997), Microbiology, 143:147-156), y el ensamblaje
de la cápsula (Rigg, G., et al. (1998), Microbiology,
144:2905-2914). Se ha sugerido que este
"compartimento" puede estar relacionado con la formación
transitoria de zonas de adhesión entre las membranas interna y
externa bacterianas, pero nada se sabe acerca de las propiedades de
la proteína que las dirige hacia este emplazamiento ni acerca de la
naturaleza física de este "compartimento". Una serie de
proteínas recombinantes "citosólicas" (es decir, sin SP)
también se comportan de forma similar y, por tanto, son dirigidas
presumiblemente hacia el mismo emplazamiento celular. Éstas
incluyen las proteínas de fusión GST, interleuquina 1\beta
(Joseph-Liauzun, E., et al. (1990), Gene,
86:291-295).
Petrovskaia et al. (Bioorganicheskaia
Khimiia, 1995, 21:912-919) describen la secreción
del factor estimulante de colonias de
granulocitos-macrófagos (GM-CSF)
humano recombinante en el periplasma de E. coli. Está
acompañado de la fusión del péptido señal del antígeno de la
cápsula (Cafl) de Yersinia pestis a la secuencia de
aminoácidos de GM-CSF.
Pérez-Pérez et al.
(Biochem. Biophys. Res. Commun., 1995, 210:524-529),
por otra parte, describen la coexpresión de los chaperones
citoplásmicos DnaK/DnaJ para mejorar la secreción de
hG-CSF recombinante hacia el periplasma. Además, las
solicitudes de patente EP 0885967 y 0774512 describen el uso de
chaperones citoplásmicos en la expresión de proteínas.
Se han identificado seis vías diferentes para la
exportación de proteínas extracelulares en bacterias
Gram-negativas. Cada vía se ha identificado en una
gama diversa de bacterias. Las propiedades básicas de estos sistemas
se resumen en la figura 1 (publicada recientemente por Lory (Lory,
S. (1998), Current Opinión in Microbiology,
1:27-35)).
La vía de tipo II, que se considera la rama
terminal principal de la vía dependiente de sec, se utiliza
para exportar muchas proteínas solubles no relacionadas diferentes.
Implica un intermedio periplásmico plegado y requiere
aproximadamente 12 genes dedicados para la exportación a través de
la membrana externa. Las ramas terminales alternativas a la vía
sec incluyen el ensamblaje de fimbrias dependiente de
chaperones específicos y la vía de auxiliar de la membrana externa.
La primera vía también implica un intermedio periplásmico (al menos
parcialmente plegado), pero en este caso el polipéptido segregado se
transporta específicamente asociado con su propio sistema de
chaperón/proteína ujier de la membrana externa. Los auxiliares de la
membrana externa se pliegan hacia el interior de la membrana
externa, con la exposición concomitante del dominio efector en la
superficie celular y, en el caso de la proteasa IgA, la liberación
a través de autohidrólisis. Se ha demostrado que la interacción con
chaperones periplásmicos generales, por ejemplo, DsbA, es una etapa
crítica en la vía de secreción para una serie de proteínas
dependientes de sec.
Las vías de tipo I, tipo III, y la mayoría de los
miembros del tipo IV son independientes de sec y median en la
secreción de una proteína específica (subgrupo de proteínas o DNA
(tipo IV)) directamente desde el citosol. El tipo I da como
resultado la secreción hacia el medio externo, mientras que el tipo
III dirige la proteína segregada directamente hacia el interior de
la célula eucariota después la activación, estimulada por contacto,
del sistema de secreción. La vía de tipo III también comparte muchas
características con los sistemas de ensamblaje flagelar.
El plegamiento incorrecto de las proteínas en el
citosol puede conducir a la degradación o formación de una proteína
mal plegada en forma de cuerpos de inclusión. Por tanto, en muchos
casos, resulta deseable contar con la expresión heteróloga de
proteínas recombinantes en el periplasma bacteriano, en la
superficie celular, o en el medio extracelular, permitiendo el
plegamiento correcto y la formación de un producto funcional. Las
proteínas segregadas hacia el periplasma de E. coli están en
un medio oxidante, comparado con el medio reductor del citosol. El
periplasma contiene oxidorreductasas y chaperones (isomerasa de
enlace disulfuro, DsbA y C,
peptidil-prolil-cis-transisomerasa,
RotA, SurA y FkpA) que son esenciales para el plegamiento correcto
de las proteínas (Missiakas, D., y S. Raina (1997), Journal of
Bacteriology, 179:2465-2471). Además, las proteínas
recombinantes expresadas en el periplasma o segregadas hacia el
medio extracelular representarían un alto porcentaje del contenido
final de proteínas de estos respectivos compartimentos. Por tanto,
cuando el objetivo final es obtener un producto recombinante
purificado, la secreción del producto hacia el periplasma o
externamente facilitaría en gran medida los protocolos de
purificación. Aunque existen unos cuantos sistemas disponibles para
la localización periplásmica de proteínas, no hay un sistema
principal para la secreción de productos extracelulares desde E.
coli. A lo largo de la década pasada, también ha suscitado gran
interés la expresión de proteínas y péptidos sobre la superficie de
microorganismos. La tecnología de presentación de fagos (Winter, G.,
et al. (1994), Annual Review of Immunology,
12:433-455) utiliza la proteína de revestimiento de
bacteriófagos filamentosos para la presentación en superficie de
proteínas o péptidos. Esta tecnología se ha aplicado al aislamiento
de fragmentos de anticuerpos específicos y para la rápida
identificación de ligandos de péptidos. El interés en la
presentación en superficie en E. coli (Georgiou, G., et
al. (1993), Trends in Biotechnology, 11:6-10) y
otras bacterias Gram-negativas se ha centrado
alrededor de la identificación de epitopos protectores y sus
aplicaciones como vacunas vivas, producción de adsorbentes
bacterianos y biocatalizadores de células completas.
Aunque se ha obtenido algo de éxito en la
expresión de proteínas, existe una serie de limitaciones dentro de
los sistemas existentes, como se resume a continuación.
La mayoría de las vías secretoras/de ensamblaje
de E. coli se han investigado para determinar su
aprovechamiento potencial como vehículos de secreción para
proteínas heterólogas. Éstas incluyen sistemas que dirigen la
proteína hacia el periplasma, la superficie celular o el medio
extracelular.
Una serie de vectores de expresión utilizan una
SP bacteriana (a menudo el de la proteína de la membrana externa
OmpA) para mediar en la exportación a través de la membrana
interna. El destino de la proteína depende de la naturaleza de la
proteína en sí misma. No resulta infrecuente que las proteínas
exportadas de esta manera a niveles altos formen complejos
insolubles, cuerpos de inclusión, en el periplasma como resultado
de un plegamiento incompleto.
Se han desarrollado sistemas de expresión de
fusión para facilitar la purificación corriente abajo de productos
recombinantes. Los ejemplos incluyen la inserción de una cola de
His para la purificación en una columna de níquel (Clontech, Qiagen,
Invitrogen); la fusión a MalE (New England Biolabs), proteína de
unión a maltosa, con la posterior purificación en una columna de
amilosa; fusiones de tiorredoxina con resina de PAO (óxido de
fenilarsina), y fusiones del dominio de unión a quitina con columnas
de quitina (New England Biolabs). Mediante la inclusión u omisión
de SP en el vector, algunos de estos sistemas (por ejemplo, MalE,
cola de His) pueden adaptarse para la expresión periplásmica o
citosólica, respectivamente. En general, estos vectores contienen
un sitio de ruptura de proteasas muy específico para la purificación
corriente abajo del producto. Pueden obtenerse fusiones funcionales
en ambos dominios, por ejemplo MalE y dominio segregado. Sin
embargo, esto depende de la naturaleza de la proteína. El dominio
de transporte puede interferir con el plegamiento de la proteína
recombinante produciendo la degradación de la proteína, la
insolubilidad de la proteína debido a la asociación con la membrana
o la formación de cuerpos de inclusión insolubles a concentraciones
mayores.
Consiste en la inserción de epitopos en proteínas
principales de la membrana externa (OmpA, LamB, PhoE), flagelos,
fimbrias. Estos sistemas implican la inserción de epitopos en un
sitio permitido, es decir, un bucle de la superficie dentro de
proteínas de la membrana externa o subunidades flagelares o
fimbriares, sin afectar al ensamblaje de la proteína de membrana o
apéndices de la superficie. En general, existen graves restricciones
de tamaño del inserto (10-60 aminoácidos) para
evitar los efectos sobre el plegamiento y ensamblaje de la
proteína. Hay informes de presentación en superficie de proteínas
completas mediante la preparación de fusiones terminales a parte de
la proteína de la membrana externa OmpA o de la proteasa IgA.
Utilizando un vector Lpp-OmpA se han localizado
enzimas completas sobre la superficie de E. coli que ofrecen
el potencial de presentación en superficie, pero estos constructos
conducen a la ruptura de la membrana externa con una toxicidad
concomitante para la célula y la pérdida del contenido periplásmico.
Además, las proteínas de fusión siguen la vía de ensamblaje de las
proteínas de la membrana externa. Esto limita el número máximo de
moléculas en la superficie y, de modo más importante, es evidente
que las proteínas completamente plegadas que poseen enlaces
disulfuro no pueden ensamblarse a través de la membrana externa
mediante esta vía (Klauser, T., et al. (1990), EMBO Journal,
9:1991-1999; Stathopoulos, C., et al. (1996),
Applied Microbiology and Biotechnology,
45:112-119).
Existen informes limitados sobre la secreción
extracelular de proteínas no relacionadas mediante alguna de las
vías de secreción mencionadas anteriormente. La vía de secreción de
tipo I de Hly se ha adaptado para el transporte de antígenos
heterólogos (Gentschev, I., et al. (1996), Gene,
179:133-140). Aunque tiene un éxito aparente, este
sistema transporta las proteínas directamente desde el citosol y
excluye cualquier proteína que requiera la exposición al espacio
periplásmico para su plegamiento correcto, por ejemplo, la
formación de enlaces disulfuro.
A continuación se resumen algunos de los
inconvenientes graves asociados con la expresión de proteínas
recombinantes:
(i) Sistemas de expresión periplásmica: Muchos
polipéptidos heterólogos expresados en E. coli se degradan o
forman agregados y cuerpos de inclusión como resultado de un
plegamiento incorrecto. Esto puede producirse a pesar de dirigir la
proteína hasta un emplazamiento preferido, es decir, el citosol (con
un medio más reductor) o el periplasma (con un medio más oxidante y
chaperones específicos implicados en el plegamiento). El empleo de
una secuencia señal para las proteínas transportadas al periplasma
produce grados variables de eficacia del procesamiento del
precursor, terminación de la translocación y plegamiento correcto.
Algunas proteínas plegadas de forma incorrecta permanecen asociadas
con la membrana interna e inducen toxicidad. Además, se degradan
extensamente produciendo un bajo rendimiento. Otras se acumulan en
una conformación no nativa como agregados insolubles. Se encuentran
disponibles sistemas que emplean proteínas de fusión. Éstas pueden,
hasta cierto grado, potenciar la solubilidad de algunas proteínas
recombinantes, pero otras permanecen insolubles debido al
plegamiento incompleto del dominio heterólogo. Un sistema que
conduce a la estimulación del acontecimiento de plegamiento temprano
después de la translocación a través de la membrana interna
permitiría evidentemente la expresión periplásmica de muchos
polipéptidos heterólogos que, hasta la fecha, han eludido una
expresión con éxito en E. coli.
(ii) Localización en superficie en bacterias
Gram-negativas: En general, hay una estricta
limitación en el tamaño de los epitopos que pueden expresarse sobre
la superficie celular utilizando vectores de expresión de
superficie probados. Los sistemas que permiten la expresión en
superficie de dominios completos o proteínas mediante la fusión de
éstos con una proteína de la membrana externa conducen a la
permeabilización de la membrana, pérdidas periplásmicas y toxicidad.
Además, existen limitaciones sobre el grado al cual pueden plegarse
las proteínas si son exportadas mediante esta vía. Por último,
puesto que todos estos sistemas utilizan proteínas de membrana
integrales, están limitados con respecto al máximo nivel de
expresión y son muy laboriosos de purificar.
La presente invención proporciona cepas
bacterianas para la secreción de proteínas heterólogas recombinantes
biológicamente activas solubles hacia el periplasma o sobre una
superficie/hacia un medio de cultivo de bacterias. La invención
aprovecha el sistema de secreción de bacterias
Gram-negativas, incluyendo chaperones periplásmicos
y proteínas ujier/secretina. Para lograr el objetivo, las cepas
bacterianas expresan simultáneamente la proteína de fusión de
(péptido señal)-(proteína heteróloga madura)-(subunidad de una
estructura de superficie bacteriana, Cafl), el chaperón
periplásmico específico para la subunidad, y la proteína
ujier/secretina de la membrana externa específica para la
subunidad. Secreción de proteínas de fusión: (péptido señal de
Cafl)-(IL-1\beta humana madura)-(Cafl madura),
(péptido señal de Cafl)-(GM-CSF humano
maduro)-(Cafl madura), y (péptido señal de
Cafl)-(IL-1ra humana madura)-(Cafl madura) que se
expresaron en Escherichia coli simultáneamente con el
chaperón periplásmico Cafl M y la proteína ujier/secretina Cafl A
son ejemplos del uso de la invención.
Figura 1. Sistemas de secreción extracelular
en bacterias Gram-negativas. Los componentes
principales incluyen: (i) Tipo I (por ejemplo, HlyA) -
transportador ABC de la membrana interna (Hly B y D) + una proteína
de la membrana externa (Tol C), no se detecta intermedio
periplásmico; (ii) Tipo II (por ejemplo, pululanasa) -
sistema Sec para la translocación a través de la membrana interna;
translocación a través de la membrana externa - 14 productos del
gen pul, incluyendo una secretina de la membrana externa
(PulC, S), ocho productos pul de la membrana interna (Pul C,
E, F, K-O) y cuatro productos de tipo prepilina
(Pul G-J), las pruebas apoyan un intermedio
periplásmico; (iii) Tipo III (por ejemplo, Yops) - 24
proteínas Ysc, incluyendo una secretina de la membrana externa
(YscC) y ATPasa de la membrana interna (YscN), chaperones
citosólicos Syc específicos, y se requiere Yop B y D para el
transporte hacia la célula eucariota; (iv) Tipo IV - grupos
recién clasificados, incluyendo sistemas implicados en la
transferencia de DNA a células vegetales u otras células bacterianas
(por ejemplo, T-DNA de Agrobacterium
tumefaciens, 11 genes virB, no es probable que se
transporten mediante un intermedio periplásmico) y exportación de
la toxina pertussis (9 genes ptl, es probable el ensamblaje
periplásmico de la toxina); (v) auxiliar de la membrana
externa (por ejemplo, proteasa IgA) - sistema Sec para la
translocación a través de la membrana interna; no hay proteínas
accesorias específicas; utiliza un "dominio auxiliar" dentro de
la proteína que, presumiblemente, sigue la vía de ensamblaje de la
proteína de la membrana externa, y se pliega hacia el interior de
la membrana externa, exponiendo el dominio segregado sobre la
superficie; (vi) Ensamblaje mediado por chaperones
específicos (por ejemplo, fimbrias Pap) - sistema Sec para la
translocación a través de la membrana interna; translocación a
través de la membrana externa - chaperón periplásmico (PapD) que
reconoce específicamente las subunidades de pilina, proteína
ujier/secretina de la membrana externa (PapC) homóloga a PulC e
YscC de las vías de tipo II y tipo III, respectivamente.
Figura 2. Construcción de genes híbridos que
codifican las proteínas de fusión
^{s.p.}Cafl-hIL-1\beta.
Figura 3. Expresión de proteínas de fusión
^{s.p.}Cafl-hIL-1\beta. A.
SDS-PAGE teñido con azul de Coomassie de proteínas
solubles (carriles 2-5) e insolubles (carriles
6-9) de células E. coli transformadas con
pKKmod (carriles 2, 6),
pKKmod/^{s.p.}Cafl-hIL-1\beta
(carriles 3, 7),
pKKmod/^{s.p.}Cafl(-2)hIL-1\beta
(carriles 4, 8), y
pKKmod/^{s.p.}Cafl(+3)hIL-1\beta
(carriles 5, 9). La hIL-1\beta se cargó como
control (carriles 1, 10). B. Inmunotransferencia del mismo gel
analizado con anticuerpos policlonales de conejo
anti-hIL-1\beta. Las posiciones de
hIL-1\beta no procesada (I) y procesada (II) se
indican con flechas.
Figura 4. Secreción de proteínas de fusión
^{s.p.}Cafl-hIL-1\beta.
Inmunotransferencias de proteínas periplásmicas (A) y citoplásmicas
solubles (B) de las cepas de expresión
^{s.p.}Cafl(+3)hIL-1\beta (carril 1),
^{s.p.}Cafl(-2)hIL-1\beta (carril 2), y
^{s.p.}Cafl-hIL-1\beta (carril
3). Se utilizaron las correspondientes proteínas de células que
portan pKKmod para la comparación (carril 4). La
hIL-1\beta se cargó como control (carril 5). Las
proteínas se analizaron con anticuerpos policlonales de conejo
anti-hIL-1\beta. Las posiciones
de hIL-1\beta no procesada (I) y procesada (II) se
indican con flechas.
Figura 5. Digestión con tripsina de células
permeabilizadas. Las proteínas insolubles (carriles
1-2) y solubles (carriles 3-4) se
obtuvieron a partir de células de expresión de
^{s.p.}Cafl(-2)hIL-1\beta antes (carriles
1, 3) y después (carriles 2, 4) del tratamiento con tripsina.
Figura 6. Construcción del plásmido pCIC que
codifica la proteína de fusión
^{s.p.}Cafl(-2)-hIL-1\beta-Cafl.
Figura 7. Secuencia N-terminal de
CIC maduro. Después de la purificación parcial de fracciones
periplásmicas en una columna de DEAE-Sepharose
CL-6B (Pharmacia, Suecia), las proteínas se
separaron mediante SDS-PAGE, seguido de una
transferencia sobre una membrana PVDF (Amersham, Reino Unido). Las
bandas deseadas se cortaron y se colocaron sobre un filtro de fibra
de vidrio preciclado y revestido de polibreno. Los análisis de la
secuencia de aminoácidos se realizaron con un secuenciador de
proteínas de Applied Biosystems modelo 477A, equipado con un
analizador de aminoácidos de feniltiohidantoína de Applied
Biosystems modelo 120A.
Figura 8. La Cafl M facilita la expresión de
^{s.p.}Cafl(-2)-hIL-1\beta-Cafl
(CIC). A. SDS-PAGE teñido con azul de Coomassie de
la fracción periplásmica procedente de células transformadas con
pCIC (carril 1), pFMA (carril 2), pMA-CIC (carril
3), pA-CIC (carril 4), pM-CIC
(carril 5), pMA-PrCIC (carril 6),
pA-PrCIC (carril 7), pM-PrCIC
(carril 8), pCIC, pCafl M (carril 9), pCIC, y pCafl MA (carril 10).
B. Inmunotransferencia del mismo gel analizado con anticuerpos
policlonales de conejo
anti-hIL-1\beta.
Figura 9. Representación gráfica de plásmidos
construidos para experimentos de coexpresión de tipo operón con Cafl
M, Cafl A y CIC. Los pFMA y pCIC se incluyen para la
comparación.
Figura 10. Detección de CIC en el periplasma con
anticuerpos monoclonales anti-IL utilizando ELISA.
Detección de CIC en diluciones de una parte alícuota de periplasma
procedente de células control que portan pTrc99 con plásmido
(triángulos), procedente de células que portan pCIC (círculos), y
procedente de células que portan pCIC y pCafl MA (cuadrados).
Figura 11. Construcción de plásmidos pFGMF1 y
pFRF275 que codifican las proteínas de fusión
scaf-GMCSF-Cafl y
scaf-IL1ra-Cafl.
Figura 12. Fraccionamiento de las proteínas
expresadas en células JM101 con plásmidos pFGMF1 (carriles 3, 4, 7,
8), pFRF275 (carriles 1, 2, 5, 6) y pCafl M (carriles 2, 4, 6, 8).
Después de la inducción las células se precipitaron, se
resuspendieron en tampón con lisozina y se incubaron en hielo
durante 1 hora, seguido de una sonicación durante 1 minuto. Las
proteínas solubles e insolubles se separaron mediante
centrifugación. Carriles 1-4 - fracción insoluble;
carriles 5-8 - fracción soluble.
Figura 13. Expresión del gen de fusión
scafl-GMCSF-Cafl. A. Análisis
SDS-PAGE de proteínas periplásmicas obtenidas a
partir de células que portan pFGMF1 (carril 1), pFGMF1 y pCafl M
(carril 2), y pFGM13 (carril 3). B. Inmunotransferencia de las
proteínas analizadas con anticuerpos policlonales de conejo
anti-GMCSF. Carriles 1,2 - proteínas celulares
totales; carriles 3-5 - proteínas periplásmicas. Las
fracciones de las proteínas se obtuvieron a partir de células que
portan pFGMF1 (carriles 1, 4), pFGMF1 y pCafl M (carriles 2, 3), y
pFGM13 (carril 5). C. Inmunotransferencia de proteínas
periplásmicas analizadas con anticuerpos policlonales de conejo
anti-Cafl. Las células produjeron la proteína de
fusión GMCSF-Cafl sin (carril 1) o con (carril 2) el
chaperón Cafl M.
Figura 14. Expresión del gen de fusión
scafl-IL1ra-Cafl. A.
SDS-PAGE de proteínas periplásmicas obtenidas a
partir de células que portan sólo pFRF275 (carril 1) o con pCafl M
(carril 2). B. Inmunotransferencia del mismo gel analizado con
anticuerpos policlonales de cabra anti-IL1ra.
Según la presente invención, la secreción de
proteínas por bacterias Gram-negativas puede
realizarse con adhesinas mediante la vía de chaperón/ujier. Los
chaperones periplásmicos del sistema:
- median en el reparto de las subunidades
nacientemente translocados fuera de la membrana interna y hacia el
periplasma;
- ayudan al plegamiento de las subunidades
nacientes para formar la conformación nativa;
- protegen las subunidades de la degradación
proteolítica.
El periplasma de las cepas de tipo salvaje de
bacterias contiene oxidorreductasas y otros chaperones (isomerasa
de enlace disulfuro, DsbA y C,
peptidil-prolil-cis-transisomerasa,
RotA, SurA y FkpA), que son esenciales para el plegamiento correcto
de las proteínas.
El operón caf es el operón más sencillo en
comparación con el tamaño de los operones dedicados a la mayoría de
los otros sistemas de secreción extracelulares (Karlyshev, A.V.
et al. (1994), en Biological Membranes: Structure,
Biogenesis and Dynamic, NATO-ASI Series, vol.
H-82, Op den Kamp, J.A.F., ed., pp.
321-330, Springer-Verlag, Berlín).
Comprende caflR que codifica un regulador de la
transcripción, el gen estructural del polipéptido Cafl (Galyov, E.E.
et al. (1990), FEBS Lett., 277, 230-232), y
dos genes que codifican productos para la secreción específica de
Cafl - el chaperón periplásmico Cafl M (Galyov, E.E. et al.
(1991), FEBS Lett., 286, 79-82) y la proteína de la
membrana externa Cafl A (Karlyshev, A.V. et al. (1992), FEBS
Lett., 297, 77-80).
El polipéptido Cafl se sintetiza con un SP
escindible de 20 aa. Después de la translocación a través de la
membrana interna (presumiblemente a través de la vía sec),
Cafl M se une a Cafl maduro y le protege de la degradación
proteolítica ayudando a su plegamiento y, además, a su liberación
de la membrana interna (Zav'jalov, V. et al. (1997),
Biochem. J., 324, 571-578; Chapman, D. et al.
(1999), J. Bacteriology, en imprenta). La interacción de la
subunidad con el chaperón Cafl M entonces estimula una señal para
la interacción con la proteína de la membrana externa Cafl A, y Cfl
A transloca Cafl hacia la superficie celular. El Cafl ensamblado en
la superficie forma una estructura de tipo cápsula amorfa sobre la
superficie de la bacteria. Esta estructura de la superficie puede
recuperarse con facilidad con las células bacterianas y lavarse de
la superficie para producir una preparación relativamente pura de
la proteína Cafl. El chaperón Cafl M y el ujier Cafl A son
específicos de la subunidad Cafl y no resultan adecuados para la
secreción de proteínas heterólogas desde este punto de vista. Sin
embargo, de forma sorprendente, se descubrió en la presente
invención que las fusiones de tres proteínas heterólogas diferentes
con la subunidad Cafl se segregan en forma biológicamente activa
soluble y protegidas de la degradación proteolítica cuando se
expresan simultáneamente con el chaperón Cafl M.
Según la presente invención, el sistema Caf puede
aplicarse a:
- la producción de proteínas heterólogas
recombinantes en el periplasma de bacterias en una conformación
biológicamente activa soluble;
- la presentación en superficie de proteínas
heterólogas recombinantes completas sobre bacterias
Gram-negativas, para obtener vacunas atenuadas vivas
heterólogas, la construcción de ligandos de células completas,
biocatalizadores de células completas, la purificación de proteínas
heterólogas recombinantes de la superficie celular mediante el
lavado de la proteína de fusión de la superficie celular, o mediante
ruptura proteolítica de la proteína de fusión;
- la presentación en superficie de secuencias de
aminoácidos heterólogas (epitopos) dentro de la subunidad Cafl, y su
uso como ligando, candidato de vacuna, etc.
1. Exportación de CaflSP a través de la
membrana interna: Al igual que muchas otras proteínas
secretoras, la secuencia señal Cafl puede utilizarse directamente
para la secreción de proteínas a través de la membrana interna
bacteriana. No contiene restos cargados positivamente en su
C-terminal que puedan interferir con la exportación
y, por tanto, pueden emplearse directamente. Como la proteína
segregada seguiría la vía Sec hacia el periplasma, la eficacia de
la exportación de la proteína heteróloga también dependerá de la
naturaleza de la proteína que se va a segregar. En particular, la
eficacia de la secreción dependerá del N-terminal
del polipéptido maduro, la ausencia de secuencias de anclaje
potenciales largas dentro de la proteína segregada, y la ausencia
de plegamiento de la proteína antes de la exportación. Las dos
primeras cuestiones pueden solucionarse alterando las secuencias
relevantes. El plegamiento "prematuro" es más difícil de
controlar, aunque el exceso de chaperones SecB, GroEL, DnaK
citosólicos puede retrasar el plegamiento en algunos casos. Después
de la translocación a través de la membrana interna y la escisión
del SP, la liberación de la proteína heteróloga de la membrana
interna y el plegamiento de la proteína de nuevo dependerán de la
naturaleza de la proteína heteróloga en sí misma.
2. Chaperonamiento de Cafl M en el
periplasma: El sistema caf tiene la ventaja añadida de
que incluye un chaperón periplásmico que se une específicamente a la
subunidad Cafl. El Cafl M evita la degradación de la subunidad Cafl,
probablemente mediante un plegamiento potenciado y la liberación de
la membrana interna. El reconocimiento del chaperón se realiza a
través del C-terminal de la subunidad Cafl, aunque
también puede requerirse la interacción con otras partes de la
subunidad Cafl para una unión de alta afinidad. Por tanto, la
fusión de la subunidad Cafl de modo C-terminal a la
proteína destinada para la liberación puede estimular el plegamiento
de la proteína heteróloga, ayudar a liberar la proteína de la
membrana interna, aumentar su solubilidad y evitar la agregación
(formación de cuerpos de inclusión periplásmicos) y la degradación
proteolítica.
3. Cafl A - exportación de las proteínas
heterólogas extracelularmente a través de la membrana externa.
El chaperón Cafl M también dirige a Cafl hasta la secretina de la
membrana externa Cafl A. Después de la interacción del complejo con
la secretina Cafl A, la Cafl se transloca a través de la membrana
externa y forma una gran estructura polimérica sobre la superficie
celular, anclada a través de Cafl A. En el caso en el que el
anclaje esté desfavorecido, puede prepararse un mutante adecuado de
Cafl. Por tanto, la inclusión de Cafl A en el vector de expresión
permite el transporte dirigido de la proteína recombinante hasta la
secretina Cafl A.
4. Las proteínas híbridas exportadas mediante
este sistema pueden escindirse proteolíticamente para eliminar la
Cafl mediante la introducción de un sitio de ruptura apropiado
entre Cafl y la proteína de interés. Para las proteínas dispuestas
sobre la superficie de E. coli, esto proporciona un método
enormemente eficaz de purificación a partir de las células
aisladas. El híbrido localizado en la superficie celular también
puede utilizarse para la preparación de vacunas, la unión de
ligandos o como biocatalizador de célula completa. Las proteínas
segregadas a partir de la célula o recuperadas del periplasma ya
estarán en una forma muy purificada. Todas las proteínas segregadas
mediante este sistema se expondrán al periplasma, ofreciendo el
medio para el plegamiento correcto de las proteínas segregadas.
Utilizando este sistema, la probabilidad de plegamiento para
producir una proteína/dominio funcional aumentará más para algunas
proteínas de fusión, debido a la interacción con el chaperón Cafl
M.
Además de la secreción de dominios o proteínas
completos como una fusión N-terminal con la
subunidad Cafl (o posiblemente con dominios más pequeños de ésta),
también se dará el caso, sin duda, de que epitopos cortos puedan
insertarse en sitios permitidos dentro de la subunidad Cafl,
permitiendo la presentación en superficie de los epitopos. De forma
similar, pueden insertarse péptidos cortos en el sitio FGL del
chaperón Cafl M.
- a pesar del hecho de que la proteína
hIL-1\beta es insoluble en el periplasma y una
fusión de hIL-1\beta-Cafl también
es insoluble, la coexpresión con el chaperón Cafl M conduce, de
forma sorprendente, a un producto soluble. Por tanto, el chaperón
Cafl M cataliza el plegamiento, no sólo del dominio Cafl
transportador, sino también del dominio
IL-1\beta, produciendo la liberación de la
membrana y la formación de un producto procesado soluble. Debido al
plegamiento correcto, la proteína de fusión heteróloga no se
degrada y se acumula a niveles altos. Es decir, Cafl M puede
estimular el plegamiento, la liberación de la membrana y la
solubilidad de polipéptidos heterólogos expresados como proteínas
de fusión Cafl;
- mientras que los sistemas de presentación en
superficie disponibles de proteínas completas en E. coli
producen problemas de pérdida de integridad de la membrana externa
y tienen limitaciones respecto al grado de plegamiento de la
proteína exportada, el sistema caf no posee estas limitaciones. La
proteína de fusión se ancla a la superficie celular o se libera
como una proteína soluble sin romper la membrana. De forma similar,
el ensamblaje no sigue la vía de plegamiento de las proteínas de la
membrana externa, y se exporta una proteína de fusión totalmente
plegada;
- existe la opción para expresar con facilidad
niveles altos de proteína recombinante en el periplasma (Cafl M
solo) o sobre la superficie celular/en el medio (Cafl M + Cafl)
utilizando el mismo sistema;
- la purificación resulta fácil a partir de la
superficie celular mediante ruptura proteolítica o recuperación a
niveles altos a partir de fracciones periplásmicas (lo que se
prefiera);
- es exquisitamente sencillo comparado con otros
vectores de secreción extracelular potenciales, puesto que
emplea sólo un chaperón periplásmico (Cafl M) y una proteína de la
membrana externa (Cafl A);
- posee la capacidad de segregar
extracelularmente una proteína completa o una parte de ésta;
- la localización periplásmica transitoria o
permanente de la proteína de fusión permite el plegamiento correcto
y la oxidación de las proteínas secretoras.
La invención se ilustra más a fondo a
continuación con ejemplos específicos no limitantes. Los ejemplos
describen la secreción de las proteínas de fusión (péptido señal de
Cafl)-(IL-1\beta humana madura)-(Cafl madura),
(péptido señal de Cafl)-(GM-CSF maduro)-(Cafl
humana madura) y (péptido señal de Cafl)-(IL-1ra
humana madura)-(Cafl madura) expresadas en Escherichia coli
simultáneamente con el chaperón periplásmico Cafl M y la proteína
ujier/secretina Cafl A, como ejemplos del uso del sistema. Aunque
los ejemplos describen la secreción de tres proteínas, es obvio que
cualquier otra proteína puede segregarse utilizando este sistema.
Además, aunque se utiliza E. coli como microbio hospedante
que contiene el sistema de expresión en estos ejemplos, es obvio
que también pueden utilizarse otras células que tengan un espacio
periplásmico apropiado para acomodar el sistema de expresión
caf.
El péptido señal Cafl (^{s.p.}Cafl) se fusionó
con hIL-1\beta en tres variantes (figura 2). 1.
^{s.p.}Cafl-hIL-1\beta es la
fusión lineal en la que el último aminoácido del péptido señal Cafl
se une al primer aminoácido de hIL-1\beta. 2.
^{s.p.}Cafl(-2)-hIL-1\beta es
la fusión lineal con una mutación en el péptido señal Cafl,
Asn(-2)Asp. 3.
^{s.p.}Cafl(+3)hIL-1\beta es la fusión
que contiene la región de articulación de tres aminoácidos
N-terminales de Cafl madura para conservar el sitio
de procesamiento natural.
En la presente y en lo sucesivo, las
manipulaciones del DNA y la transformación de E. coli se
realizaron según Maniatis, T., et al. (1989), Molecular
Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory
Press, Cold Spring Harbor. Las enzimas de restricción, la nucleasa
de judía mungo y la DNA-ligasa T4 se compraron en
Promega (EEUU). Se utilizó DNA-polimerasa Taq
(Hytest, Finlandia) para los experimentos de reacción en cadena con
polimerasa (PCR). La secuenciación de los nucleótidos se realizó
utilizando un kit de secuenciación TaqTrack (Promega, EEUU). La
elución de los fragmentos de DNA a partir de geles de agarosa se
realizó con el kit USBClean (USB, EEUU). Se emplearon los
siguientes oligonucleótidos en los ejemplos 1 y 2:
- CAF-RI
- 5'-GGGAATTCAGAGGTAATATATGAAAAAAATC-3'
- IL-PST
- 5'-CCGCCTGCAGATGCGGCACCTGTACGATCACTG-3'
- CAF-PST
- 5'-CCGCCTGCAGTTGCAATAGTTCCAAATA-3'
- IL-cebador
- 5'-AGAACACCACTTGTTGCTCC-3'
- Romo
- 5'-TGGAACTATTGCAACTGCAAATGCGGCACCTGTACGA-3'
- 3AA
- 5'-GCAACTGCAAATGCGGCAGATTTAGCACCTGTACGATCACTG-3'
- IL-BamHI
- 5'-ACCGGATCCACCTCCACCAGATCCACCTCCGGAAGACACAAATTGC-ATGG-3'
- BamHI-Caf
- 5'-GGTGGATCCGGTGGTGGTGGATCTGCAGATTTAACTGCAAGCAC-3'
- Caf-SalI
- 5'-GCCAAGCTTGTCGACGAGGGTTAGGCTCAAAGT-3'
- SBEKP-1
- 5'-TCGACAGATCTCGAATTCCGGTACCGGCTGCA-3'
- SBEKP-2
- 3'-GTCTAGAGCTTAAGGCCATGGCCG-5'
- TERMINO
- 5'-GATCATTAATTAAT-3'
- TRC
- 5'-CCAGATCTGGCAAATATTCTGAAATG-3'
Los constructos genéticos que codifican las tres
proteínas de fusión
^{s.p.}Cafl-hIL-1\beta se
construyeron según el esquema de la figura 2. El fragmento
EcoRI-PstI (aproximadamente 110 pb) que codifica la
región 5'-no traducida de Cafl y la parte
N-terminal del péptido señal Cafl con la mutación
Asn(-2)Asp se obtuvo mediante PCR, utilizando los
oligonucleótidos CAF-RI e IL-Pst y
el plásmido molde pKM4 (Karlyshev, A.V., et al. (1992), FEBS
Letters, 297, 77-80), seguido de una digestión del
producto de PCR1 con EcoRI y PstI. El fragmento
PstI-HindIII que codifica la parte
C-terminal del péptido señal Cafl junto al
N-terminal de hIL-1\beta se obtuvo
mediante PCR, en la que se utilizaron los oligonucleótidos
CAF-PST e IL-cebador, y el plásmido
molde
pPR-TGATG-hIL-1\beta-tsr
(Mashko, S.V., et al. (1991), Gene, 97,
259-266). El producto de PCR2 se digirió con
PstI y HindIII. Los dos fragmentos se acoplaron con un
fragmento del vector pUC19/EcoRI-HindIII. La
estructura de nucleótidos del inserto de
EcoRI-HindIII resultante se verificó mediante
secuenciación de DNA. El fragmento EcoRI-HindIII
obtenido como se describió y el fragmento
HindIII-BamHI aislado a partir de
pPR-TGATG-hIL-1\beta-tsr
se acoplaron con el fragmento EcoRI-BamHI del vector
pUC19\DeltaHindIII (un derivado de pUC19 en el que el sitio
HindIII se deleciona mediante el relleno con extremos
pegajosos, seguido de un acoplamiento de extremos romos). El
fragmento EcoRI-BamHI obtenido de esta manera
codifica la proteína de fusión
^{s.p.}Cafl(-2)hIL-1\beta. La mutación
puntual G a A que convierte el gen
^{s.p.}Cafl(-2)hIL-1\beta en el gen
Cafl-hIL-1\beta se realizó
mediante un procedimiento PCR en dos etapas (Landt, O., Grunert,
H.-P. y Hahn, U. (1990), Gene, 96, 125-128)
utilizando el oligonucleótido Romo y dos cebadores flanqueantes
(cebador de secuencia M13 e IL-cebador) con el
plásmido
pUC19\DeltaHindIII/^{s.p.}Cafl(-2)hIL-1\beta
como molde. En la primera etapa se obtuvo un producto de PCR
intermedio a partir del oligonucleótido Romo mutagénico y el cebador
de secuencia M13. Después de una purificación a partir de un gel de
agarosa, el producto de PCR intermedio se utilizó con el
IL-cebador en la segunda etapa de la PCR. Este
último producto de PCR se digirió con EcoRI y
HindIII, seguido de un acoplamiento en el fragmento de vector
realizado mediante la restricción del plásmido
pUC19\DeltaHindIII/^{s.p.}Cafl(-2)hIL-1\beta
con las mismas enzimas. Por tanto, el fragmento
EcoRI-HindIII que proporciona la mutación
Asn(-2)Asp en la proteína de fusión
^{s.p.}Cafl(-2)hIL-1\beta se sustituyó
por el correspondiente fragmento que codifica el péptido señal Cafl
natural, y se obtuvo el gen
^{s.p.}Cafl-hIL-1\beta. El gen
^{s.p.}Cafl(+3)hIL-1\beta se construyó de
una manera similar utilizando el oligonucleótido 3AA como cebador
mutagénico y el plásmido
pUC19\DeltaHindIII/^{s.p.}Cafl-hIL-1\beta
como molde. En todos los tres genes híbridos se secuenciaron los
fragmentos EcoRI-HindIII para demostrar que las
estructuras de nucleótidos eran
correctas.
correctas.
Los fragmentos EcoRI-BamHI que
codifican las proteínas de fusión se cortaron de los plásmidos
descritos anteriormente y se transfirieron a pKKmod (un derivado de
pKK 223-3 (Pharmacia), creado mediante la deleción
de los sitios BamHI y SalI en la región del gen
tet, y mediante la sustitución del policonector de pKK
223-3 por el policonector de pUC18). Por tanto, se
obtuvieron los plásmidos de expresión
pKKmod/^{s.p.}Cafl(-2)hIL-1\beta,
pKKmod/^{s.p.}Cafl-hIL-1\beta y
pKKmod/^{s.p.}Cafl(+3)hIL-1\beta, y se
transformaron E. coli JM105 [F' traD36, lacl^{q}
\Delta(lacZ)M15, proA^{+}B^{+}/thi,
rpsL(Str^{+}), endA, sbcB, sbcC, hsdR4(r_{k}^{-}
m_{k}^{+}), \Delta(lac-proAB)] (NE
BioLabs) con estos plásmidos.
La expresión y procesamiento de las proteínas de
fusión ^{s.p.}Cafl-hIL-1\beta,
^{s.p.}Cafl(-2)hIL-1\beta y
^{s.p.}Cafl(+3)hIL-1\beta se controló
mediante electroforesis en SDS-PAGE e
inmunotransferencia. Las cepas de E. coli recombinantes se
cultivaron hasta aproximadamente 0,5 AU a 600 nm, se añadió IPTG
(0,5 mM) y las células se cultivaron durante más tiempo. Las
proteínas solubles e insolubles se analizaron como fracciones
separadas obtenidas como sigue. Después de ciertos intervalos de
tiempo, se retiraron muestras del cultivo de crecimiento con
cantidades fijadas de células, las células se precipitaron y se
lavaron en Tris\cdotCl 25 mM, pH 7,5/NaCl 100 mM/EDTA 1 mM. Las
células reprecipitadas se suspendieron en
H_{3}PO_{4}-Tris 50 mM, pH 6,8, y se sonicaron
utilizando un generador Labsonic U (B. Braun Diessel Biotech). Las
muestras sonicadas se centrifugaron a 14.000 g durante 10 min. El
sobrenadante contenía las proteínas solubles. Las proteínas
insolubles se extrajeron del sedimento con el tampón de muestras de
SDS-PAGE que contenía SDS al 2% y
\beta-mercaptoetanol al 5%.
En la presente y en lo sucesivo, la SDS al
10-15%-PAGE de las proteínas a partir de las
fracciones solubles e insolubles se realizó según el procedimiento
de Laemmli en un aparato Mini-PROTEAN II
(BIO-RAD). Las proteínas se transfirieron a una
membrana Hybond-C (Amersham) mediante
electrotransferencia en una célula de transferencia electroforética
mini-Trans-Blot
(BIO-RAD), seguido de inmunodetección. Los
resultados de las inmunotransferencias se revelaron con el kit ECL
(Amersham). Se utilizaron anticuerpos policlonales de conejo contra
hIL-1\beta (Calbiochem) y anticuerpos
monoespecíficos contra Cafl para la visualización de las proteínas
de fusión que contienen IL-1\beta y Cafl. Se
utilizaron anticuerpos policlonales de conejo contra Cafl M y
anticuerpos policlonales de ratón contra Cafl A para la detección de
Cafl M y Cafl A, respectivamente. La unión de los anticuerpos
primarios se visualizó mediante conjugado de conejo (Calbiochem) y
ratón (Amersham).
Se observó una alta expresión para las tres
proteínas de fusión (aproximadamente 20-30% de las
proteínas celulares totales). Sin embargo, en las tres cepas
recombinantes, las fracciones de proteínas solubles no contenían
cantidades significativas de proteínas recombinantes (figura 3A y
B, carriles 1-4). Se descubrió la proteína
hIL-1\beta recombinante en fracciones de proteínas
celulares insolubles (figura 3A y B, carriles 6-9).
Otra proteína que contiene hIL-1\beta se observó
claramente en los tres constructos. Lo más probable es que fuera un
producto de una proteolisis algo específica de la proteína de
fusión no procesada acumulada en el citoplasma.
La fusión lineal parece no procesada (figura 3A y
B, carril 7), mientras que en los otros dos productos, la
eliminación de los péptidos señal Cafl de los restos
hIL-1\beta alcanzó unos niveles considerables
(figura 3A y B, carriles 8, 9).
Para elucidar la secreción de proteínas
hIL-1\beta recombinantes procesadas, las
proteínas periplásmicas se separaron de las proteínas citoplásmicas
mediante un procedimiento de choque osmótico como sigue. Las células
precipitadas a partir de 10 ml de medio de crecimiento se
suspendieron en 200 \mul de sacarosa al 20% (en
p/v)/Tris-HCl 0,3 M, pH 8,0/EDTA 0,5 mM, y se
mantuvieron a temperatura ambiente durante 10 min. Las células
tratadas con sacarosa obtenidas mediante centrifugación se
suspendieron en MgCl_{2} 10 mM/PMSF 0,1 mM enfriado en hielo, y se
incubaron en agua helada durante 10 min. Después de la
centrifugación, las proteínas periplásmicas se recuperaron en las
fracciones del sobrenadante. Los sedimentos se suspendieron en
H_{3}PO_{4}-Tris 50 mM, pH 6,8, y se sonicaron,
seguido de una centrifugación a 14.000 g durante 10 min. Estos
sobrenadantes contenían proteínas citoplásmicas solubles. Se
comprobó la actividad de la enzima citoplásmica
glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa,
como control de la pureza de la fracción periplásmica (Naglak, T.J.
et al., 1990, 12, 603-611). Las muestras
obtenidas de la fracción periplásmica no mostraron más de 0,25% de
la actividad
glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa
citoplásmica.
Un análisis de la transferencia Western de las
proteínas periplásmicas y citoplásmicas solubles (figura 4) demostró
que sólo una parte pequeña de las proteínas de fusión procesadas se
encontraba en forma soluble en los periplasmas de las cepas de
expresión ^{s.p.}Cafl(-2)hIL-1\beta y
^{s.p.}Cafl(+3)hIL-1\beta (figura 4A,
carriles 1, 2). No se detectó proteína procesada en el periplasma de
la cepa de expresión
^{s.p.}Cafl-hIL-1\beta (figura
4A, carril 3). Las proteínas hIL-1\beta procesadas
estaban ausentes en las fracciones citoplásmicas (figura 4B).
Los datos obtenidos demostraron que las proteínas
de fusión ^{s.p.}Cafl(-2)hIL-1\beta y
^{s.p.}Cafl(+3)hIL-1\beta estaban
parcialmente procesadas (por contraste con la proteína de fusión
Cafl-hIL-1\beta). Los productos
procesados se segregaron hacia el periplasma. Sin embargo, la
mayoría de la hIL-1\beta recombinante procesada se
acumula en forma insoluble. Además, esta proteína insoluble está
oculta de la fase líquida del periplasma, puesto que no se digiere
durante el tratamiento con tripsina de las células permeabilizadas
(figura 5). La variación de la temperatura de crecimiento y la
concentración del inductor no facilitó la eliminación del péptido
señal Cafl y la secreción de hIL-1\beta (los
datos no se
muestran).
muestran).
Se diseñó la proteína CIC
(^{s.p.}Caf-IL-1\beta-Caf),
en la que la secuencia de aminoácidos de
^{s.p.}Cafl(-2)hIL-1\beta
(N-terminal de la fusión) se une a la secuencia de
la proteína Cafl (C-terminal de la fusión) mediante
el espaciador GlyGlyGlyGlySer repetido tres veces. El espaciador se
insertó para minimizar los posibles problemas conformacionales de
las dos proteínas fusionadas en CIC.
Se construyó el vector de expresión pCIC según el
esquema de la figura 6. La parte de IL del CIC se obtuvo mediante
PCR utilizando los oligonucleótidos IL-Pst e
IL-BamHI como cebadores, y el plásmido
pUC19\DeltaHindIII/^{s.p.}Cafl(-2)hIL-1\beta
como molde. La parte de Cafl del CIC se obtuvo mediante PCR
utilizando los oligonucleótidos BamHI-Cafl y
Cafl-SalI como cebadores, y el plásmido pKM4 como
molde. Los productos de PCR se digirieron con restrictasas como se
muestra en la figura 3, seguido de un acoplamiento triple con el
vector
pUC19\DeltaHindIII/^{s.p.}Cafl(-2)hIL-1\beta
obtenido mediante digestión con PstI y SalI. Para
producir el pCIC, el fragmento EcoRI-SalI se cortó
del plásmido pUC19\DeltaHindIII/CIC y se acopló en el
vector EcoRI-SalI obtenido a partir del plásmido
pTrc99\DeltaNco (un derivado de pTrc99a (Pharmacia), creado
mediante la digestión con NcoI, seguido de un tratamiento
con nucleasa de judía mungo y acoplamiento de los extremos
romos).
Después de un inducción con IPTG, las células
E. coli JM105 que portan pCIC produjeron la proteína de
fusión CIC que se procesó con éxito. Se demostró la eliminación
precisa del péptido señal mediante secuenciación
N-terminal del CIC periplásmico soluble (figura 7).
Sin embargo, sólo una parte pequeña de la proteína
IL-1\beta-Cafl madura se extrajo
mediante un procedimiento de choque osmótico (figura 8B, carril 1).
La mayor parte de la proteína se encontró en la fracción de las
membranas (los datos no se muestran), de forma similar a la
hIL-1\beta madura.
La expresión/secreción de CIC en presencia del
chaperón (Cafl M) y el ujier (Cafl A) se estudió en dos sistemas:
a) los genes caflm y Cafla se situaron en un plásmido
pACYC compatible con el derivado pTrc99 que codifica el CIC; b) los
genes caflm, cafla y cic forman juntos un
operón artificial.
En experimentos de plásmidos compatibles, células
E. coli JM105 se transformaron simultáneamente con pCIC y
pCafl M (un plásmido que porta el gen caflm bajo el promotor
tac en un derivado de pACYC184, véase el ejemplo 3) para
estudiar la influencia del chaperón sobre la secreción de la
proteína de fusión hIL-1\beta. Además, se creó
pCafl MA, un plásmido de expresión/secreción de Cafl
M-Cafl A, como sigue. El fragmento
ApaLI-ApaLI que contiene los genes caflm y
cafla bajo el promotor trc se cortó del plásmido pFMA
(Chapman, D., et al., Structural and functional significance
of the FGL sequence of the periplasmic chaperone, Cafl M, of
Yersinia pestis, J. Bateriology, en imprenta), y se acopló al
vector obtenido mediante la digestión de pCafl M con ApaLI.
Las células E. coli JM105 se transformaron simultáneamente
con pCIC y pCafl MA para obtener la coexpresión de las tres
proteínas.
Se construyeron varios plásmidos para estudiar la
expresión y secreción de las proteínas CIC, Cafl M y Cafl A
producidas a partir de un operón artificial (figura 9). Para
sustituir al gen cafl por un policonector sintético SBEKP, se
obtuvo un plásmido pMA-link mediante acoplamiento
triple de un vector pFMA/PstI-SpeI, un fragmento
SpeI-PstI de pFMA, y los oligonucleótidos
SBEKP-1 y SBEKP-2 se asociaron entre
sí. Se obtuvo un plásmido pM-link a partir del
plásmido pMA-link mediante el corte de un fragmento
SalI-SalI que codifica la proteína Cafl A, seguido del
autoacoplamiento del vector. Se obtiene un plásmido
pA-link a partir del plásmido
pMA-link mediante el corte de un fragmento
BamHI-BamHI que codifica la parte
C-terminal de la proteína Cafl M. Para interrumpir
el marco de traducción de Cafl M, se insertó un codón de terminación
mediante acoplamiento de un oligonucleótido TÉRMINO
autocomplementario en el sitio BamHI. La inserción del
oligonucleótido TÉRMINO produjo la pérdida del sitio BamHI.
Un fragmento que codifica la proteína CIC se cortó de pCIC con
EcoRI y SalI, se clonó en pBCSK^{+} (Stratagene,
EEUU), y se recuperó con EcoRI y KpnI. Para obtener
los plásmidos pMA-CIC, pM-CIC y
pA-CIC, el fragmento EcoRI-KpnI se
clonó en los sitios correspondientes de pMA-link,
pM-link y pA-link. El plásmido
pM-PrCIC difiere de pM-CIC por la
presencia de un promotor trc adicional antes del gen CIC, y
se obtuvo como sigue. Se obtuvo un fragmento de DNA que codifica el
promotor trc y la región 5' del gen cic mediante PCR
utilizando los oligonucleótidos TRC y CAF-Pst como
cebadores y pCIC como molde. El producto de PCR se digirió con
BglII y EcoRI, seguido del acoplamiento del fragmento
BglII-EcoRI que codifica el promotor trc en los
correspondientes sitios de pM-CIC. El
pMA-PrCIC y pA-PrCIC se obtuvieron
mediante acoplamiento del fragmento BglII-KpnI de
pM-PrCIC en los correspondientes sitios de
pMA-link y pA-link. Se utilizó E.
coli NM522 [F', proAB,
lacl^{q}\Delta(lacZ)M15/ supE,
thi-1,
\Delta(lac-proAB),\Delta(hsdSM-mcrB)5,
(r_{k}^{-} m_{k}^{-})] (Stratagene, EEUU) como cepa
hospedante para los plásmidos descritos en la presente.
Se obtuvieron resultados similares en ambos
métodos de coexpresión. La expresión simultánea de CIC y Cafl M
aumentó significativamente la concentración de CIC madura en el
periplasma. Los resultados demuestran que el chaperón molecular
periplásmico estimula la liberación de la proteína segregada de la
membrana interna, así como evita la degradación y la agregación no
específica de la proteína.
En presencia de Cafl M, se detectó una parte
significativa de la proteína CIC madura en una fracción periplásmica
(figura 8B, carriles 3, 4, 6, 7, 9, 10). Una cantidad elevada de
CIC segregada y soluble coexpresada con Cafl M demuestra que el
chaperón molecular periplásmico estimula la liberación de la
proteína segregada de la membrana interna. Se demostró el papel
crítico de la parte Cafl en la proteína CIC en esta estimulación en
un experimento similar con un plásmido que se diferencia de pCIC
por una deleción en un par de bases en el espaciador. La deleción
produce un desplazamiento de marco de la parte Caf del gen
fusionado. No se observó mayor facilidad de secreción de
hIL-1\beta cuando las células portaban el plásmido
mutado (los datos no aparecen).
El Cafl M evita la degradación de CIC. Como se
muestra en la figura 8B, carril 1, la proteína CIC madura en la
fracción periplásmica se degrada con rapidez para formar la forma
truncada, con un peso molecular de aproximadamente
20-23 kDa. En presencia de Cafl M, la forma
truncada desaparece (figura 8B, carriles 3, 4, 6, 7, 10). La
cantidad de forma degradada se correlaciona con la cantidad de Cafl
M. Por ejemplo, cuando Cafl M se expresa a partir de pCafl M a un
nivel bajo, se encuentra la forma truncada (figura 8B, carril 9).
Sin embargo, la cantidad de Cafl M es suficiente para facilitar la
liberación de la proteína de fusión de la membrana. La digestión
específica de la CIC madura se produce en un sitio en la parte Cafl
de la proteína de fusión, puesto que la forma truncada fue
correctamente detectada por los anticuerpos IL, pero no fue
detectada por los anticuerpos Cafl (los datos no se muestran). Lo
más probable es que la ruptura fue debida a la acción de la
proteasa DegP, que se ha demostrado que es inducida por subunidades
capsulares o de fimbrias segregadas y las rompe (Soto, G.E., et
al. (1998), EMBO J., 17, 6155-6167).
La parte hIL-1\beta de CIC
segregada en presencia de Cafl M se plegó correctamente. La proteína
CIC madura se detectó con anticuerpos monoclonales contra
hIL-1\beta con ELISA (figura 10). El ELISA se
realizó utilizando anticuerpos monoclonales de ratón contra
hIL-1\beta (HyTest, Finlandia), como se describió
previamente (Zav'jalov, V. et al. (1997), Biochem. J., 324,
571-578).
La CIC se excreta sobre una superficie celular
cuando se expresa con Cafl M y Cafl A. Se demostró la presencia del
chaperón molecular y la proteína ujier en células transformadas con
pMA-CIC o con pCIC y pCafl MA juntos mediante
inmunotransferencia con anticuerpos anti-Cafl M y
anti-Cafl A (los datos no se muestran). Para
demostrar la excreción de CIC sobre una superficie celular se
realizaron experimentos de aglutinación celular con un diagnóstico
monoclonal de reticulocitos para la detección de Yersinia
pestis (Middle Asian Research Institute, URSS). Las células de
E. coli que expresan CIC, Cafl M, Cafl A fueron capaces de
precipitar reticulocitos con un anticuerpo monoclonal unido a la
superficie contra Cafl a una concentración de aproximadamente
10^{7} células/ml. Además, según el ELISA realizado con
anticuerpos monoclonales
anti-hIL-1\beta, se detectó una
pequeña cantidad de hIL-1\beta en el medio
de
cultivo.
cultivo.
El plásmido de expresión para la proteína de
fusión hGM-CSF-Cafl se basó en
pFGM13, descrito en Petrovskaya, L.E. et al. (1995), Russian
Journal of Bioorganic Chemistry, 21, 785-791. El
plásmido pFGM13 contiene un gen sintético que codifica hGMCSF con
la secuencia señal Cafl (scafl) clonada en los sitios HindIII
y XbaI de pUC19. La transcripción es controlada por el
promotor lac y es inducible con IPTG. La traducción del gen
scafl-gmcsf en pFGM13 se inicia en el primer
codón de metionina del gen lacZ y utiliza su secuencia
Shine-Dalgarno. Una estructura primaria de la
secuencia señal (scafl) codificada por este gen difiere de la del
tipo salvaje en su N-terminal, que contiene siete
restos más del N-terminal de
\beta-galactosidasa.
La construcción del plásmido pFGMF1 que codifica
el gen gmscf-cafl se muestra en la figura
11. El gen scafl-gmscf de pFGM13 se modificó
para la posterior clonación del fragmento de pCIC que contiene un
espaciador (4GlySer)_{3} y la región codificadora Cafl. El
sitio Kpn21 se introdujo en el 3'-terminal
del gen gmcsf mediante PCR utilizando dos cebadores (5'
ATCGGAAATGTTCGACCTTCAAG y 5'
ATTATTCCGGACTCCTGCACTGG-TTCCCAGC) y pFGM13 como
molde. Se utilizó DNA-polimerasa Pfu para una máxima
fidelidad. El fragmento de PCR se trató con Kpn21, seguido
de un acoplamiento en el fragmento grando EcoRV-SalGI
de pFGM13, junto con el fragmento Kpn21-SalGI de
pCIC. El plásmido final (pFGMF1) contiene el gen que codifica un
precursor híbrido que consiste en la secuencia señal scafl, GMCSF
con 2 cambios en los aminoácidos N-terminales
(Ala_{2}Pro_{3} a Asp), un espaciador
Ser(4GlySer)_{3}, y Cafl. La estructura del plásmido
se confirmó mediante análisis de restricción y secuenciación de las
regiones amplificadas.
La expresión del gen precursor híbrido en células
E. coli JM101 que portan pFGMF1 se indujo con IPTG 0,2 mM
después de que el cultivo celular alcanzase una densidad óptica de
0,5-0,8. El crecimiento con IPTG continuó durante 3
horas. Las células de 1 ml se recogieron mediante centrifugación, y
el sedimento (muestra de proteínas celulares totales) se analizó
mediante electroforesis en SDS-PAGE. Una fracción
de las proteínas periplásmicas se aisló mediante un procedimiento de
choque osmótico frío (véase el ejemplo 1) a partir del sedimento
celular obtenido del resto del cultivo.
Un análisis con SDS-PAGE de la
muestra de proteínas celulares totales procedente de células E.
coli que portan pFGMF1 reveló la presencia de una gran cantidad
de una proteína de fusión con una masa molécular que se corresponde
con la proteína de fusión hGMCSF-Cafl (31 kDa).
Cuando las células se destruyeron mediante sonicación, esta
proteína se localizó en una fracción insoluble (figura 12, carriles
3, 4).
El examen de los extractos periplásmicos mediante
SDS-PAGE y análisis de la transferencia Western
demostró que una parte de la fusión hGMCSF-Cafl se
translocó al periplasma. Su movilidad electroforética es la misma
que la de la proteína insoluble. La fusión interacciona con los
anticuerpos policlonales anti-hGMCSF y
anti-Cafl (figura 13B, carril 1; figura 14C, carril
1). La proteína con un peso molecular de aproximadamente 18 kDa
también se detectó con anticuerpos anti-hGMCSF
(figura 13B, carril 4). Los inventores pueden suponer que esta
proteína es el producto de la degradación proteolítica de la fusión
hGMCSF-Cafl.
Para estudiar la influencia del chaperón Cafl M
sobre la expresión del gen gmcsf-cafl, el
gen caflm se insertó en pACYC-trx, un vector
con un bajo número de copias y compatible con los plásmidos basados
en pBR322. El pACYC-trx es un derivado de pACYC184
que contiene el gen trx bajo el control del promotor
tac. La región codificadora Trx, flanqueada con los
sitios KpnI y Alw441, se sustituyó por el fragmento
de DNA que codifica el chaperón Cafl M como sigue. El gen
caflm se amplificó mediante PCR, que incluye
DNA-polimerasa Pfu, dos cebadores
(GTTGTCGGTACCATTCCGTAAGGAGG y
5'-GTTAACGTGCACACAGGAACAGC), y el plásmido pFS2
(Galyov, E.E., et al. (1990), FEBS Letters, 277,
230-232). El fragmento de PCR se trató con
KpnI y Alw441, y se clonó en el fragmento grande
KpnI-Alw441 de pACYC-trx. El plásmido
obtenido se denominó pCafl M.
Se transformaron células E. coli JM101 con
los plásmidos pFGMF1 y pCafl M, seguido de un análisis de las
proteínas celulares recombinante como se describió anteriormente. La
coexpresión del gen de chaperón procedente del plásmido pCafl M
condujo a un aumento marcado en la cantidad de proteínas de fusión
hGMCSF-Cafl de longitud completa en el periplasma
(figura 13B, carril 3; figura 3C, carril 2). La cantidad de
proteína de 18 kDa, el producto de la degradación proteolítica de la
fusión hGMCSF-Cafl, disminuyó. Estos resultados
demuestran que Cafl M estimula el plegamiento correcto de
hGMCSF-Cafl y potencia la estabilidad de la proteína
de fusión.
Basándose en pFGM13 se obtuvo el plásmido
pFRA275. En este plásmido la parte 5'-terminal de la
región codificadora hIL-1ra madura contiene la
secuencia codificadora de AlaAspAsp, en lugar del primer codón Arg
para neutralizar la carga positiva N-terminal de
hIL1ra. El promotor lac controla la expresión del gen
scaf-hil1ra en pFRA275.
El plásmido de expresión pFRF275 que codifica el
gen scaf-hil1ra-cafl se
construyó como se indica en la figura 11. En el
3'-terminal del gen hil1ra se introdujo el
sitio Kpn21 mediante PCR del plásmido pFRA275 con los
cebadores 5'-GGAATCCATGGAGGGAAGAT y
5'-ATTATTCCGGACTCGTCCTCCTGAAAGTAG. El fragmento
amplificado se cortó con NcoI y Kpn21, y se acopló con
el fragmento grande HindIII-Kpn21 de pFGMF1, junto
con el fragmento HindIII-NcoI de pFRA275. El plásmido
resultante (pFRF275) contiene un gen que codifica el precursor
híbrido que consiste en la secuencia señal scaf,
hIl-1ra con los cambios en los aminoácidos
mencionados anteriormente, un espaciador
Ser(4GlySer)_{3}, y Cafl. La estructura del
plásmido se confirmó mediante análisis de restricción y
secuenciación de las regiones amplificadas.
La expresión del gen
scaf-hil1ra-cafl en células
E. coli JM101 se analizó como se describe en el ejemplo 3.
Cuando las células se transforman sólo con pFRF275, la proteína de
fusión hIL1ra se acumula principalmente en una forma insoluble (35
kDa, figura 12, carriles 1, 2). Sin embargo, parte de la proteína de
fusión se transloca hacia el periplasma, donde se somete a
degradación (figura 14B, carril 1). Cuando pFGF275 y pCafl M (véase
el ejemplo 3) están presentes simultáneamente en las células
recombinantes, Cafl M disminuye notablemente la cantidad de los
productos de ruptura (figura 4B, carril 2).
Claims (5)
1. Una cepa bacteriana
Gram-negativa que tiene la capacidad de segregar una
proteína heteróloga recombinante hacia el periplasma de dicha
bacteria, expresando dicha bacteria simultáneamente una proteína de
fusión de (péptido señal de Cafl)-(proteína heteróloga
madura)-(subunidad de una estructura de la superficie bacteriana,
que es Cafl de Yersinia pestis), y un chaperón periplásmico
Cafl M específico para dicha subunidad.
2. La cepa bacteriana según la reivindicación 1,
que expresa además la proteína ujier o secretina de la membrana
externa Cafl A, específica para dicha subunidad, con el objetivo de
la secreción de una proteína heteróloga recombinante soluble sobre
una superficie externa de la bacteria, o hacia el medio de cultivo
de la bacteria.
3. El uso de cepas bacterianas según la
reivindicación 1 ó 2, para producir proteínas recombinantes
heterólogas.
4. El uso según la reivindicación 3, en el que la
proteína que se va a producir es GMCSF,
IL-1\beta, o el antagonista del receptor
IL-1.
5. La cepa bacteriana según la reivindicación 1 ó
2, en la que la bacteria es Escherichia coli.
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