JPH07505052A

JPH07505052A - ハイブリッドｄｎａ，プラスミド，オリゴハイブリッドペブチド，及びワクチン

Info

Publication number: JPH07505052A
Application number: JP5513792A
Authority: JP
Inventors: ブラハムバット，ヒマンシュ; スー，グオーフー; ヴェーランド，ユルゲン; ティミス，ケニート・エヌ
Original assignee: ゲゼルシャフト・フュア・ビオテクノロギッシェ・フォルシュンク・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング　（ゲー・ベー・エフ）
Priority date: 1992-02-17
Filing date: 1993-02-12
Publication date: 1995-06-08
Also published as: EP0627006A1; ES2104130T3; EP0627006B1; DK0627006T3; ATE152483T1; DE4219696A1; DE59306342D1; AU3628293A; AU672388B2; WO1993016186A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】ハイブリッドＤＮＡ、プラスミド、オリゴハイブリッドペプチド、及びワクチン背景技術赤痢菌属（ンゲラ）による細菌性赤痢は、人間及びその他の霊長類の腸粘膜を侵す伝染病である。その内赤痢菌ｌ型（志賀赤痢菌）が最も重症の病気の原因となり、特に子供の場合に重い合併症、例えば溶血性尿毒症症候群（＋１．　（１，Ｓ、　、　これには溶血性貧血、血小板減少症、及び急性腎不全がある）、類白血病性反応、及び敗血症を引き起こす恐れがある。現在のインド大陸、アフリカの一部、東南アジア、中国及びラテンアメリカの一部の大流行はこの赤痢菌が原因である。

赤痢菌ｌ型を識別する特徴の一つとして、この菌がこれまで知られた最も強力な細胞毒素の一つである志賀毒素を大量に形成する。

志賀毒素は多くの種類の細胞を殺すが、特に血管の内皮細胞に対して活性を示し、これが志賀赤痢閑の感染に関連した重い合併症の原因であると推測される。従って赤痢ワクチンはこの微生物自体だけでなく、志賀毒素に対しても防御作用を有する必要がある。

志賀菌属の毒素は人間や動物のその他の感染にも関与する。大腸菌のある種の血清型、例えば０１５７：ｔ＋７は出血性大腸炎、無熱性の水様便の下痢が出血性に移行する下痢を引き起こし、又実験動物に於いてこの精製した毒素のみを投与して出血性大腸菌の症状を再現することができる。しばしば出血性大腸炎は重い合併症、例えば、Ｈ，Ｕ、　Ｓ、を伴い、これは同様に志賀菌の感染とも関連する。志賀菌属の毒素を生産する血清型の大腸菌は同様に、農場で飼育される動物の場合に豚の浮腫病のような重い疾患を引き起こし、農業経営上大きな損害をもたらすことになる。

従って、志賀菌属の毒素に対して人間及び動物の両方の分野で適用できるワクチンを早急に開発する必要がある。

志賀菌属の毒素は、二つの異なる型のサブユニット、即ちサブユニットＡ　（分子量３２．０００）とサブユニットＢ　（分子量７．７００）とから構成された、２部から成る分子で、この両方のサブユニットは化学量論的に５個のＢ鎖に対して約１個のＡ鎖の割合で非共有結合的に会合している。このサブユニットＡは真核細胞に対して毒性があり、一方すブユニッｌ−Ｂは受容体結合部位を有し、これが細胞内への毒素の受入れを可能にする。従って、サブユニッｌ−Ｂに対して有効な粘膜及び血清の抗毒素免疫応答は、腸の上皮細胞と血管の内皮細胞への毒素の侵入を防止して重い罹病を排除するものでなければならない。

しかし、ワクチン株の中での異種ポリペプチドの高品位の発現には幾つかの欠点がある。例えば、（ｉ）安定に使用可能の、通過するポリペプチド乃至パラセンジャー・ポリペプチドにはその大きさに制限があるので、異種ポリペプチドと担体分子、例えばＬａｍＢ−タンパク質（大腸菌の外膜タンパク質）との融合が困難なことが多い（Ｃｈａｒｂｉｔ等１９８８）。

（ｉ）細胞質での異種ポリペプチドの高効果の発現はしばしばタンパク質の分解と封入体の形成を生ずる。

（ｉｌｉ）細胞質での発現という点では、異種ポリペプチドと担体分子、例えば βガラクトシダーゼとの融合が同様に細胞に対して毒性を生ずることがあり、そのためワクチン株を使用不能にする。

従って、封入体の形成やワクチン株に対する毒性の発生を伴うことなく、大きな異種ポリペプチドを安定に大きな収量で発現するのに適した発現システムの開発が必要である。

最近、通過する乃至パラセンジャー・タンパク質を溶血素（ＨｌｙＡ）の２３　ｋＤの大きさのＣ末端信号ドメインに融合する方法で大腸菌から培地に輸送する遺伝子システムが開発された（ｌＪａｃｋｍａｎ　１９８７）。

溶血素遺伝子は一つのオペロンＣｈＬｙ　Ｃ，Ａ、　Ｂ、　Ｄ）に構成されており、ＨＩｙＣ−タンパク質は１０７　ｋＤの大きさの旧ＹＡ−タンパク質の翻訳後の活性化にその活性な形で取り込まれる。輸出機構乃至導出機構は、ＨＩＹＡの最後の５０のＣ末端アミノ酸の中の特定分泌信号と、それ自体臼ＶＢと旧ｙＤとから構成された膜結合のトランスロケーション複合体（Ｗａｇｎｅｒ等１９８３）と、少なくとも一つのゲストタンパク質、ＨＩＹＡ−分子をペリプラズマの中間段階なしに直接培地に輸送する（Ｇｒａｙ等１９８６とＫｏｒｏｎａｋｉｓ等１９８９　）小さめの外膜タンパク質Ｔａｌｃ（ＷａｎｄｅｒｓｍａｎとＤｅｌｅｐｅｌａｉｒｅ　１９９０）とを利用する。

次にこの従来技術を更に詳細に説明する。志賀赤痢菌ｌ型に起因する感染に対する経口投与可能のワクチンを開発する目的で、０抗原に特異性の局在する粘膜免疫応答を刺激するために、志賀赤痢菌１型のＯ抗原を発現する、アテニュエーンヨンした乃至弱化したサルモネラ・ハイブリッド株を構築した（Ｍｉ　ＩＩｓ等１９８８とＭｉｌｌｓ　＆Ｔｉｍｍ１ｓ　１９８８）。ハイブリッドワクチン株に必要なその他の成分は、毒素の活性を中和して疾患の重症度を軽減する免疫応答を呼び出すための、適当な方法により発現した志賀毒素サブユニットＢの封入である。

担体分子、例えばＬａｍＢ−タンパク質と融合した異種ポリペプチドの発現には、安定に使用できるパラセンジャー・ポリペプチドの大きさが制限されるという欠点がある（Ｃｈａｒｂｉｔ等１．９８８）。大きなポリペプチドに対してはその代わり、例えばβガラクトシダーゼのＮ末端の範囲に融合する方法を用いることができる（Ｊａｃｏｂ等１９８５、Ｂｒｏｗｎ″＄　１９８７）。最近、溶血素（ＨＩｙＡ）の２３　ｋＤの大きさのＣ末端信号ドメインに融合する方法を用いて、パラセンジャー・タンパク質を大腸菌から培地に導出するための遺伝子システムが、組換えタンパク質を精製する目的で開発された（Ｍａｃｋｍａｎ等１９８７）等線９８７、即ち溶血素は大腸菌の尿路の病原株（Ｗｅｌｃｈ等１９８１）により分泌され、Ｎ末端信号−５ｅｃＡ／５ｅｃＹ−経路の仲介なしで培地に導出又は移動される（Ｆｅｌｍｌｅｅ等１９８５とＢｌｉｇｈｔ等１９９０）。溶血素遺伝子は一つのオペロン（ｈａｙ　Ｃ，Ａ、　Ｂ、　Ｄ）の中に構成されており、ＨｌｙＣ−タンパク質は１０７　ｋＤの大きさのＨｌｙＡ−タンパク質の翻訳後の活性化にその活性な形で取り入れられる。輸出機構は、Ｈ１ｙＡの最後の５０のＣ末端アミノ酸の中の特定分泌信号と、ｏ＋ｙｔｔと旧ｙＤとから構成された膜結合のトランスロケーション複合体（Ｗａｇｎｅｒ等１９８３等色９８３くとも一つのゲストタンパク質、ＨＩＹＡ−分子をペリプラズマの中間段階なしに直接培地に輸送する（Ｇｒａｙ等１９８６とＫＯ「０ｎａｋｉｓ等１９８９）小さめの外膜タンパク質ＴｏＩＣ（ＷａｎｄｅｒｓｍａｎとＤｅｌｅｐｅｌａｉｒｅ　１９９０）とを利用する。

発明の開示本発明により、志賀毒素サブユニットＢを大腸菌溶血素Ａ（旧ｙＡ）の２３　ｋＤの大きさのＣ末端と融合し、この融合タンパク質がアテニュエーションした抗原担体株、ネズミチフス菌ａｒＯＡ　−５Ｌ３２６１により導出されることを確認した。遺伝子融合の発現を、修飾した合成βラクタマーゼ・プロモーターの調節下で（構成的発現）且つ生体内に誘導可能のアエロバクチン・プロモーターの調節下で検討した。

ネズミチフス菌１ｕｒｌ）Ａ−（ＳＬ３２６１）−ハイブリット株の経口及び腹腔内投与によりマウスを免疫にしたところ、粘膜に特異性のサブユニットＢに対する免疫応答と血清抗体応答とが刺激された。

本発明により、抗原特異性の免疫応答のためにサルモネラ属の抗原担体ワクチン株により選択された抗原（候補の抗原）が導出されることを始めて報告することができる。このシステムには次のような長所がある。

（ｉ）異種のポリペプチドが伝達停止配列（ｒストップ・トランスファーｊ配列）をコードしない限り、大きめのポリペプチドを溶血素輸出マシンに融合することができる。

（ｉｉ）融合タンパク質が細胞内に蓄積しないので、ワクチンに対して毒性を示すことなしに、高い発現レベルが得られる。

従って１本発明のシステムは、毒素の受容体結合サブユニットに対する強い免疫応答を与えるための、志賀菌属の毒素、例えば５ＬＴ−■及び５ＬＴ−ＩＩ　ｖの発現に適しており、更に他の粘膜病原菌の細菌毒素に対しても適している。

即ち、本発明によれば、サブユニットＢ／１（１ｙＡ−融合タンパク質を細胞外培地に輸送するために、サブユニットＢの志賀毒素タンパク質をＨＩＶＡの２３　ｋＤｋ大きさのＣ末端と融合した。この種のハイブリッドタンパク質（キメラタンパク質）がサブユニットＢに特異性の免疫応答を刺激できるかどうか調べるために、経口又は腹腔内免疫感作に使用する目的で、この種のハイブリッドタンパク質をネズミチフス菌ａｒｏＡ−抗原担体ワクチン株５Ｌ３２６１　（Ｈｏｓｅｉｔｈ　ｌ　５ｔｏｃｋｅｒ１９８１）の中に発現した。

即ち、本発明によれば志賀毒素サブユニットＢを大腸菌溶血素Ａ（４１１ｙＡ）の２３　ｋＤの大きさのＣ末端と融合して、アテニュエーションした抗原担体株ネズミチフス菌ａ１６Ａ−５Ｌ３２６１により輸出した。このハイブリッドタンパク質の発現を修飾した合成βラクタマーゼ・プロモーターの調節下で（構成的発現）且つ生体内に誘導可能のアエロバクチン・プロモーターの調節下で検討した。更にプラスミドコピー数の影響を培地コピー・プラスミドベクター及び高性能コピー・プラスミドベクターを使用して検討した。次の三つの異なる種類のサブユニットＢの発現を検討するために、ハイブリット株５Ｌ３２６１による経口及び腹腔内免疫感作後にマウスの中のサブユニットＨに特異性の抗体応答の刺激を実施した。

（ｉ）サブユニットＢの細胞質高性能発現、（ｉｆ）細胞質発現のサブユニットＢ／βガラクトシダーゼ融合タンパク質、（ｉｉｉ）細胞外環境に導出された、サブユニットＢ／ＨＩｙＡ　（２３ｋＤＣ末端）−融合タンパク質。

本発明により、志賀毒素サブユニットＢ／溶血素Ａ−（Ｃ末端）−融合タンパク質の発現を次の四つの条件下で検討した。

（ａ）　５ｔｒＢ／Ｃ−Ｔ：ｈｌｙ　Ａ−遺伝子融合は生体内で誘導可能のアエロバクチン・プロモーターの調節下にあった。このプロモーターはプラスミドベクターｐＢＲ３２２（コピー数的３０〜４０）細胞／世代）又は、（ｂ）プラスミドｐｕｃｔａ　（コピー数約７０／細胞／世代）により運ばれた。又、（ｃ）　５ｔｘＢ／Ｃ−Ｔ：ｈＬｙ　Ａ−融合は構成的且つ修飾した合成βラクタマーゼ・プロモーターの調節下にあった。このプロモーターは中程度のレベルの発現を供給し、その際融合は同様にプラスミドｐＢＲ３２２又は、（ｄ）プラスミドｐＵｃ１８により実施された。こうして、５ｔｘＢ／Ｃ−Ｔ：旧ｙＡ−融合タンパク質の発現の安定度に関してプロモーターの強度とプラスミドコピー数の検討が可能になった。

（ｅ）更にサブユニットＢを高レベルで細胞質に発現し、又βガラクトシダーゼ融合タンパク質を細胞質に発現して、比較分析を実施した。

異種ポリペプチドを分泌するために溶血素輸出マシンを使用した従来の技術を大腸菌の中で検討した。しかし、この種の融合タンパク質がネズミチフス菌によっても輸出可能であるかどうかは未だ知られていなかった。本発明による発現研究を、大腸菌に−１２と抗原担体ワクチン株ネズミチフス菌ａｒ’Ａ　−５Ｌ３２８１との両方により同時に実施した。

比較分析の結果、融合タンパク質が大腸菌に−１２とネズミチフス菌ａｒｏＡ− 株の両方により輸出可能であることが判明した。これから溶血素輸出マシンがネズミチフス菌の中でも機能することが容易に想到された。しかし、ｐＵｃｌＢベースの組換えプラスミドは細胞に対して毒性を有することが判り、その際融合タンパク質のある程度の分解を確認することができた。このプラスミドが滞留する細菌細胞を、−当たりの生存細胞数で１０　’を越える細胞密度までは増殖できなかった。一方ｐＢＲ３２２ベースのプラスミドは安定であり、融合タンパク質の分解の兆しは見られず、１０”細胞／−の生存細胞密度が容易に達成できた。

以前の、志賀毒素すブユニツｌ−Ｂの種々のドメインを細菌細胞表面のＬａｍｂ −タンパク質のループ中に融合した研究の際に、短いサブユニットＢ・ポリペプチドのみがＬａｍｂを担体分子として使用して安定に発現できることが確認された。Ｌａｍｂ−発現システムに融合した完全なサブユニットＢ（６９のアミノ酸）は宿主細菌に対して毒性を示し、大きな細胞内凝集体を形成した。従って大きめのポリペプチドを融合タンパク質として発現しなければならない場合には、挿入したポリペプチドが伝達停止配列（ｔストップ・トランスファ−１配列）を備えていない限り、溶血素輸出マシンが適しているように思われる。

ネズミチフス菌−訂ＯＡ−ハイブリッド株はサブユニットＢを（ｉ）細胞質タンパク質として発現するか、或いは、（ｉｉ）βガラクトシダーゼに融合してから細胞質として発現するか又は、（ｉｉｉ）　ｆｌｌｙＡ　（Ｃ末端）と融合して細胞外環境に導出するか、サブユニットＢに特異性の抗体応答を刺激するのにどの発現システムが最も有効であるかを検討するために、このハイブリッド株をマウスの経口及び腹腔内免疫感作に使用した。その結果、この三つのシステムの全てによってサブユニットＢに対する最も重要な抗体応答を得ることができた。しかし、所望の抗原（候補の抗原）の高品位の発現は宿主細菌にとっては不利のように思われ、従って中程度の発現が本目的に合うようである。例えば合成βラクタマーゼ・プロモーターによる構成的発現、或いは例えばアエロバクチン・プロモーターによる生体内で誘導可能のシステムにより、宿主細菌の安定性に関してよりよい結果が得られた。

血清応答は一般に粘膜抗体応答よりも強かった。この現象の理由としては、腸からの抗体の取得又は分離が困難な点が考えられる。

サブユニットＢ／βガラクトシダーゼ融合タンパク質はかなり高いβガラクトシダーゼ応答を示したが、これはサブユニットＢ　（７，７ｋＤ）に比べてβガラクトシダーゼポリペプチド（１０７ｋＤ）が遥かに大きく、従ってエピトープ密度が高いためであろう。

次に本発明を図と実験データとにより詳しく説明する。

図面の簡単な説明図１は、５ｔｘＢ／Ｃ−Ｔ：旧ｙＡ−融合タンパク質の発現用のプラスミドの構成で、見やすくするために、プラスミドの挿入に関連する部分のみを示した。

図２は、古賀毒素サブユニットＢ／溶血素Ａ−（Ｃ末端）−融合タンパク質の発現のウェスタンプロット分析で、融合タンパク質のサブユニットＢの領域は、サブユニットＢに特異性のモノクローナル抗体ＳｔｘＢＭｂｌにより測定した。

（Ａ）バンド１は大腸菌ＪＭ１０１／ｐＬＧ６１：１ｌｐＬＧ５７５　（全細胞抽出物）、バンド２はバンドｌの細胞の培養上清、／＜　：／　Ｆ　３　ハＪＭ１０１．／ｐｓＵ２０４＋ｐＬＧ５７５（アエロバクチン・プロモーター／　ＳｔＸ　Ｂ／Ｃ−Ｔ：Ｉｔ！ｙ　Ａ／ｐＢＲ３２２、全細胞抽出物）、バンド４はバンド３の細胞の培養上清、バンド５はＪＭ１０１／Ｉ）ＳＵ２０６＋ｐＬＧ５７５　（ＭＳβ−ラクタマーゼ・プロモーター／　５ｔｘＢ／Ｃ−Ｔ：ｈＬｙ　Ａ／ｐＢＲ３２２、全細胞抽出物）、バンド６はバンド５の細胞の培養上清である。

（Ｂ）図２Ａに対しては宿主株がネズミチフス菌ａｒＯＡ　−５Ｌ３２６１である点が異なる。

（Ｃ）バンドｌは大腸菌５Ｌ３２６１／Ｉ）ＬＧ６１２＋ｐＬＧ５７５　（全細胞抽出物）、バンド２はバンドｌの細胞の培養上清、バンド３は５Ｌ３２６１／ｐｓＵ２０３＋ｐＬＧ５７５（アエロバクチン・ブｏ−ｔ−−ター／　ｓｉｒ　Ｂ／Ｃ−Ｔ：ｈＬｙ　Ａ／ｐＵｃ１８、全細胞抽出物）、バンド４はバンド３の細胞の培養上清、バンド５は５Ｌ３２６１／ｐｓＵ２０５＋ｐＬＧ５７５　（ＭＳβ−ラクタマーゼ・プロモーター／ｓｔＸ　Ｂ／Ｃ−Ｔ：ｈＬｙ　Ａ／ｐＵｃ１８　、全細胞抽出物）、バンド６はバンド５の細胞の培養上清である。

図３は、種々のネズミチフス菌ａｒＯＡ−（ＳＬ３２６１）ハイブリッド株により経口及び腹腔内免疫感作したマウスの粘膜抗体応答と血清抗体応答で、図３，１は、ＳＬ３’２６１／ｌｌ５ＩＪ１０８（サブユニットＢの細胞質高性能発現）と５Ｌ３２６１／ｐＪＬ５０３　（負の対照）とによる免疫感作後のサブユニットＢに対する応答、図３．２は、５Ｌ３２６１／ｐｓＬＩ２０７（サブユニットＢ／βガラクトシダーゼ融合タンパク質、細胞質発現、アエロバクチン・プロモーターの調節の発現）と５Ｌ３２６１．／ｐｃｏｎｌ　（Ｌｌｌｌｌ：Ｚをアエロバクチン・プロモーターの調節下で発現するプラスミドベクター、サブユニットＢに対する応答の負の対照）とによる免疫感作後のサブユニットＢ及びβガラクトシダーゼに対する抗体応答、図３．３は、５Ｌ３２６１／ｐＬＧ５７５／ｐｓＵ２０４　（アエロバクチン・プロモーターの調節下テ（Ｄ　５ｆｒＢ／Ｃ−Ｔ：：　ｈＬｙ　Ａ　（７）発現）と５Ｌ３２６１／ｐＬＧ５７５／ｐＳυ２０６　（ＭＳ−βラクタマーゼ・プロモータの調節下でのｓｔｒ［ｌ／Ｃ−Ｔ：：　ｈｌｙＡの発現）と５Ｌ３２６１／ｐＬＧ５７５／ｐＬＧ６１２　ＣＩａＣ−プＣ１（−一ターの調節下Ｔ：（ＤＣ−Ｔ：：ｈｔｙ　Ａの発現、サブユニットＢに対する応答の負の対照）とによる免疫感作後のサブユニットＢに対する抗体応答である。

発明を実施するための最良の形態材料と方法細菌株、プラスミド、培地、大腸菌ＪＭＩＯＩ　（Ｆ−、ｔｒａ　Ｄ３６．　ｊａｃｌ　ｑ、　（１ａｃＺ）ｌＪ１５．　ＤｒＱ　ＡＢ、　５ｕｐ　Ｂ、ｔｈＩ、　ｔａｃ−ｐｒｏ　ＡＢ、　ｙａｎｉｓｃｈ−ｐｅｒｒｏｎ等１９８５参照）を全ての組換えプラスミドのりンピエントとして使用した。ネズミチフス菌ａｒｏＡ−変異体５Ｌ３２６１　（ｔｌｏｓｅｉｔｈ　＆　５ｔｏｃｋｅｒ　１９８１）と制限ネガティブのネズミチフス菌株５Ｌ５２８３とはＢ、Ａ、Ｄ、　５Ｌｏｃｋｅｒ（米国５ｔａｎｆｏｒｄ大学、医学部）より提供された。プラスミドｐＬＧ６１２　（ＩＰＴＧにより誘導可能のＬａｃ−プロモータの調節下でｈＬｙＡの２３　ｋＤの大きさのＣ声端トｈＬｙＢ　（７）Ｎ末端の一部とを運ぶ）と、プラスミドｐＡＣＹＣ１８４のｔｅｔ−耐性遺伝子（Ｍａｃｋｍａｎ等＋９８５）等巾９８５−ン化したｈＬｙＢ−遺伝子とｈｔｙ□−遺伝子とを運ふｐＬＧ５７５　（クロラムフェニコール耐性プラスミド）とはＤｒ、　Ｈｏ１ｌａｎｄ　（英国Ｌｅｉｃｅｓｔｅｒ大学）より提供された。

プラスミドｐｓＵ２０１　（Ｇｕｏ−ｆｕ　Ｓｕ’ｔ！　１９９２）はアエロバクチン・プロモーターの調節下で５（ｘＢ−遺伝子を運び、プラスミドｐＢＲ３２（Ｂｏ−１ｉｖａｒ等１９７７）とｐＵＣ１８（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐａｒｒｏｎ等１９８５等色９８５用のクローニングベクターとして用いた。次のプラスミドに就いては、Ｇｕｏ−ｆｕ　Ｓｕとその共同研究者の報告がある（１９９２）：（ｉ）プラスミドｐｓＵｔｏ８（加熱誘導可能のλＰＬ−プロモーターとλＰ、−プロモーターとの調節下で５ｔｘＢ−遺伝子を運ぶ）、（ｉ）プラスミドｐＪＬＡ５０３　（高性能発現プラスミド、５ｃｈａｕｄｅｒ等１９８７）、（ｉｉｉ）プラスミドｐｓＵ２０７　（アエロバクチン・プロモーターの調節下で５Ｉｘｆ３／ＬａｃＺ−遺伝子融合を運ぶ）、（ｉｖ）プラスミドｐｃｏｎ　Ｉ　（アエロバクチン・プロモーターの調節下でＬａｃＺ−遺伝子を運ぶ、Ｌｏｒｅｎｚｏ等１９８７）。

又ルリア肉汁とルリア寒天（Ｍｉｌｌｅｒ　１９７２）とを全ての株の通常の増殖用の完全培地として使用し、必要の場合には細菌増殖培地に抗生物質としてアンピシリン（１００μｇ／Ｊ　）又はクロラムフェニコール（３０μｇ／ｍｌ’ ）を補った。制限エンドヌクレアーゼ、Ｔ４−ＤＮＡ−リガーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ（フレノウ酵素）、及びその他の酵素はＢｏｈｒｉｎｇｅｒ　［１＋ｍｂＨ（Ｍａｎｎｈｅｉｍ、ドイツ）又はＮｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ。

Ｉｎｃ、　（Ｂｅｖｅｒｌｙ、　Ｍａｓｓ、）より入手し、メーカーの記載に従って使用した。

ＤＮＡ操作：　ＤＮＡ生産と遺伝子工学的操作は標準のプロトコルに準して実施した（Ｍａｎｉａｔｉｓ等１９８２）。等閑９８２プラスミドＤＮＡ−形質転換はＨａｎａｈａｎ　（１，９８３）により行った。

５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動：不連続式ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−Ｐａｇｅ）はＳｃｔ＋ａｇ−ｇｅｒ −Ｊａｇｏｗ　（＋９８７）の方法で行った。予めＳＤＳ−Ｐａｇｅ−分子量マーカーをＢｉｏ−Ｒａｄ　（９７，４，６６，２，４５，０，３１，０，２１，５，１４，４ｋＤ）又は、Ｓｉｇ−ｍａ　（８４，０，５８，０，４８，５，３６，５，２６，６ｋＤ）により記した。図面を参照されたい。

全細胞抽出物と培養上清画分とのウェスタンプロット分析ニー晩の培養（１−）の細菌細胞を遠心により集めた。培養上清画分（約９００　ｕ　ｌ）ｌ：Ｉｏｏ　ｕ　１（Ｄ　１００　％　ＴＣＡ　（ｈリクロロ酢酸）を加えて細胞外タンパク質を沈殿した。十分混合してからサンプルを４℃で３０分温装し、１５分遠心し、上清を除いた。タンパク質ベレット（培養上清画分）は、これを２０μｌの緩衝液に再懸濁した（ＩＭのトリス塩基１６μＡ、１０倍に希釈したＣｒａｃｋ緩衝液２μｌ　［Ｃｒａｃｋ原液＝６０ｍＭトリス塩酸ｐＨ６，８，１％ＳＤＳ、　Ｉ　Ｘ　２−メルカプトエタノール、１０　％グリセリン、０．０１　ｍｇブロモフェノールブルー］、グリセリン２μｌ）。細菌ベレット（全細胞画分）は５０μ！の緩衝液に再懸濁した。上清と全細胞画分とを１００℃で１０分加熱してから、２０μｌのサンプルをＳＤＳ−Ｐａｇｅに加えた。電気泳動の後でゲルをニトロセルロースにプロットした。古賀毒素サブユニットＢ／Ｈ１ｙＡ−融合タンパク質の存在を、サブユニットＢに特異性のモノクロナール抗体Ｓ【ｘＢＭｂｌにより検出した（Ｇｕｏ（ｕ　Ｓｕ等＋９９２）。

免疫感作と血清の収集及び腸の洗浄・　８〜１０週齢の雌のＢＡＬＢ／ｃマウス（免疫感作光たり４匹）を実質的にＧｕｏ−Ｆｕ　Ｓｕ等の方法で経口及び腹腔内で免疫感作した。免疫感作用の接種材料は次のように準備した。

プラスミドｐｓｕｔｏａ又はプラスミドｐＪＬＡ５０３　（負の対照）を運ぶネズミチフスａｒｏへ−株５Ｌ３２６１の一晩の培養を、アンピシリンを加えたルリア肉汁の中で、０Ｄｓｏｏ−値が０．７に達するまで新たに培養した。λＰ、 −プロモーターとλＰ、−プロモーターとを誘導するために細胞を４２℃で４５分保った。滅菌した普通の食塩水で培養を２回洗浄し、適当な容積の食塩水に最終濃度が１０１１ＣＦＵ／−になるように再懸濁した。細胞懸濁液の０．１ｍ／を経口免疫感作に使用した。

更に細胞懸濁液を１０’　ＣＦＵ／−に希釈し、そのＯ，１ｍｌを腹腔内免疫感作に使用した。

プラスミドｐｃｏｎｌ　（負の対照）又はプラスミドｐｓＵ２０７を運ぶ５Ｌ３２６１−株を前述と同じようにＯＤｇｏ。−値が０．７に達するまで増殖した。

これに２．２゛−ビピリジルを加えた（最終濃度１００μＭ、アエロバクチン・プロモーターを誘導するため）。この細胞を更に３時間増殖した。培養を洗浄し、再懸濁して、前述のように免疫感作に使用した。プラスミドｐＬＧ６１２（負の対照）、　ｐｓＵ２０４又はｐｓＵ２０６を運ぶ５Ｌ３２６１／ｐＬＧ５７５ −株を前述のようにルリア肉汁（アンピシリンとクロラムフェニコールとを補う）の中で、００ｓ。。−値が１．０（プラスミドｐｓＵ２０６）場合）或いは０．３（プラスミドｐＬＧ６１２及び９ＳＵ２０４の場合）になるまで増殖した。

プラスミドｐＬＧ６１２を有する細胞は、ＩＰＴＧ　（最終濃度１　ｍＭ）により誘導し、プラスミド９ＳＵ２０４を有する細胞は２．２−ビピリジル（最終濃度１００μＭ）により誘導した５Ｌ３２６１／ｐＬＧ５７５／ｐＬＧ６１２−培養を更ニ４５分、又５Ｌ３２６１／ｐＬＧ５７５／ｐＳＵ２０４−培養の方は更に３時間増殖した。培養を洗浄し、再懸濁して、前述のように免疫感作に使用した。

ＥＬＩＳＡ：　ＥＬＩＳＡ用のサンプルを、リン酸塩を加えた食塩緩衝溶液（ｐＨ７，２）により段階的に希釈した。抗サブユニットＢ及び抗ガラクトシダーゼの測定は次のように実施した。予めマイクロタイタープレートにｌｕｇの精製したサブユニットＢ　（Ｇｕｏ−ｆｕ　Ｓｕ等１９９２）又はｌｕｇの精製したβ ガラクトシダーゼ（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、製）を塗布しておいた。ＩｇＧ　＋　ＩｇＭの血清測定にはＩｇＧ　＋　ＩｇＭ　（ヤギ抗マウスＩｇＧ　＋　ＩｇＭを抱合したベルオキシダーゼ、Ｄｉａｎｏｖａ製）を用いた。

粘膜１ｇＡの測定には、ＩｇＡ　（ヤギ抗マウスＩｇＡを抱合したベルオキシダーゼ、５ｏｕｔｈｅｒｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｃ、製）を用いた。

測定結果はＢｉｏ−Ｒａｄ−マイクロプレートリーダー（３５５０型）により読み取った。

ＨｌｙＡ−（Ｃ末端）／サブユニットＢ−融合タンパク質の発現のためのプラスミド構築：アエロバクチン・プロモーターの調節下で５ｔｘＢを運ぶプラスミドｐｓ［Ｉ２０１のＥｃｏＲ１／　ＢｇＬ　ｎ−断片をプラスミドｐｕｃｉｓのε （：ＯＲ１／　５Ｉｌａ　ｌ一部位にサブクローニングして、プラスミドｐＳＵ２０２を得た（図１　）　。Ｓｅａ　■／Ｈｐａ−断片上のｈＬｙＡのＣ末端の２３ｋＤの大きさのドメインＣＣ−Ｔ：ｈＬｙ　Ａと表示）とｈＬｙＢのＮ末端範囲の約５０の塩基対とを、プラスミドｐｓＵ２０２のＨｉａｃ■一部位に挿入した。

得られたプラスミドｐｓＵ２０３　（図１）は、読み枠の中でＣ−Ｔ：ｈｌｆｆ　Ａと融合する５ｔｘｆ３−遺伝子を運ぶ。アエロバクチン・プロモーター／ｓｔｙ　Ｑ／（−７：　ｈＬｙＡ−カセットを運ぶプラスミドｐｓＵ２０３のＥｃ、ｏｌ／　＃（ｎｄ［［−断片をプラスミドｐＢＲ３２２のεＣ（ＩＲＩ／　ＨＩｎａｐｌ一部位にサブクローニングして、プラスミドｐｓｕ　２０４を得た（図１）。アエロバクチン−プロモーターを運ぶプラスミドｐｓｕ　２０３のＥｃｏＲ１／　Ｂａｇ旧−断片を修飾した合成βラクタマーゼ・プロモーターによって置き換えた（ＭＳ−βラクタマーゼ・プロモーターと表示）。この構築によりプラスミドｐｓＵ２０５　（図１）が得られ、これがＥｃｏＲ１／　ＨＩｎｄｍ −カセットを運び、これにはＭＳ−βラクタマーゼ・プロモーター／　ｓｔｘ　［１／Ｃ−Ｔ：ｈ＋ｙＡ−ドメインが含まれ、これをプラスミドｐＢＲ３２２のＥｃｏｆ（■／Ｈｉｎｄ■一部位に挿入することができたので、こうしてプラスミドｐｓＬ１２０６　（図１）が得られた。

プラスミドｐｓＵ２０３及びｐｓＵ２０４（これがベクターｐＬｌｃ１８乃至ｐＢＲ３２２の中のアエロバクチン・プロモーター／　ｓｔｘ　Ｂ／Ｃ−Ｔ：ｈｌｙ　Ａ−カセットを運ぶ）並びにプラスミドｐｓＵ２０５及びｐｓＵ２０６　（これがベクターｐＵｃ１８又はｐＢＲ３２２の中のＭＳ−βラクタマーゼ・プロモーター／　ｓｔｘ　Ｂ／Ｃ−Ｔ：ｈｌｙ　Ａ−カセットを運ぶ）が、プラスミドｐＬＧ５７５を運ぶ大腸菌に１２及びネズミチフス菌ａｒａＡ−株５Ｌ３２６１の中に形質転換された。ネズミチフス菌ａｒＯＡ　−５Ｌ３２６１に於ける形質転換の前にこれらのプラスミドを先ず制限ネガティブの株ネズミチフス菌５Ｌ５２８３を通過させた。

大腸＠Ｋ　１２及びネズミチフス菌ａｒｏＡ−株５Ｌ３２６１の中の５ｔｘＢ／Ｃ−Ｔ：旧ＹＡ−融合タンパク質のウェスタンプロット分析：組換えプラスミド乃至比較プラスミドが滞留する細菌細胞のペレット及び上清面ニスタンプロット分析とを実施した。サブユニットＢに特異性のモノクローナル抗体ＳｔｘＢＭｂｌを使用して融合タンパク質を調べた（図２）。５ｔｘＢ／Ｃ−Ｔ：ＨＩｙＡ− 融合タンパク質が全ての検討した株に於いて細胞外環境に輸出されたことが確かめられた（図２Ａ　、　２Ｂ、２Ｃとバンド４と６）。アエロバクチン・プロモーターにより発現される５ｔｘＢ／Ｃ−Ｔ：ＨＩｙＡ−融合タンパク質は、ＭＳ −βラクタマーゼ・プロモーターにより発現される同じ融合タンパク質よりも７　ｋＤだけ大きい。

これはプラスミドｐｓＵ２０１の中のＥｃｏＲＩ／　Ｂａｇ旧−プロモーター断片が更にＩｕＣＡ−遺伝子を運び（アエロバクチン・オペロンの第一の遺伝子）、これが７　ｋＤの大きさのポリペプチドをコードするからである（Ｌｏｒｅｎｚｏ等１９８７）。発現された融合タンパク質の量は、ｐＵＣ１８ベースのプラスミドの場合の方がｐＢＲ３２２−ベースのベクターの場合よりも遥かに多かった（図２８．２Ｃ、バンド４と６参照）。しかし、発現の割合が多くなると融合タンパク質がある程度分解するようになり（図２０、バンド４と６参照）、宿主細胞に対する毒性を生じた。これらの細菌を１０７／−を越える生存細胞密度まで増殖することは不可能であった。ｐＢＲ３２２−ベースの構築物は安定で、細菌を１０’生存細胞／−まで増殖することができた。

ネズミチフス菌ａｒｏＡ−ハイブリッド株５Ｌ３２６１による経口及び腹腔内免疫感作後のマウスの中の、サブユニットＢに特異性の免疫応答の分析：経口乃至腹腔内免疫感作後のマウスの中の、サブユニットＢに特異性の免疫応答を刺激するために、三つの異なる形でサブユニットＢを発現するネズミチフス菌ａｒｏＡ −株（ＳＬ３２６１）を分析した。試験した発現システムは次の発現を含んでいた：（ｉ）サブユニットＢの細胞質高性能発現（プラスミドｐｓＵ１０８；Ｇｕｏ−ｆｕ　Ｓｕ等１９９２）、（ｉ）サブユニットＢ／βガラクトシダーゼ融合タンパク質の細胞質発現（プラスミドｐｓＵ２０７；　Ｇｕｏ−ｆｕ　Ｓｕ等１９９２）、（ｉｉ）アエロバクチン・プロモーター又はＭＳ−βラクタマーゼ・プロモーターの調節下で発現されたサブユニットＢ　／Ｃ−Ｔ：：ＨＩｙＡ−融合タンパク質（プラスミドｐｓｕｚｏ４とｐｓＵ２０６）。これらの融合タンパク質は細胞外の腸の中に輸出された。腸の液体並びに抗すブユニットＢ粘膜１ｇＡ一応答と血清抗体応答（ＩｇＧ　＋　ＩｇＭ）とを分析し、一方ではマウスの腹腔内免疫感作の血清を抗体応答（ＩｇＧ　＋　ＩｇＭ）に就いて分析した。プラスミドｐｓＵ２０７を運ぶネズミチフス菌ａｒｏＡによる免疫感作の後で得られたサンプルに就いて、βガラクトシダーゼ応答を調べた。結果（図３．１．３．２．３．３）が示すように、全ての場合にサブユニットＢに特異性の抗体応答に対する特徴を血清と腸の液体の両方に認めることができた。しかし、プラスミドｐｓ０１０８を運ぶサルモネラ菌は不安定であり、これは組換えサブユニットＢの高品位の発現の結果と思われる。血清抗体応答の方が一般に粘膜抗体応答よりも高い。プラスミドｐｓＵ２０７　（図３．２）に対して、抗βガラクトシダーゼ抗体応答は、サブユニットＢに特異性の抗体応答よりも著しく高かった。

生体材料　入手先Ｈ１ｙＡ用ＤＮＡ（＝溶血素）　ｐｓＵ　２０４　：ＤＳＭ　７０４５　又は、ｐｓＵ　２０５　＝　ＤＳＭ　７０４６　参照５ＬＴ−ｎ　（＝古賀様毒素ＩＩ　）　５ｔｏｃｋｂｉｎ等、Ｉｎｆｅｃｔ、　１ｍｍｕｎ、。

６９５−７００．５３　（１９８６）３ＬＴ−ｎｖ　同前 βラクタマーゼ・プロモーター　ｐｓＵ　２０５　＝　ＤＳＭ　７０４６　参照アエロバクチン・プロモーター　ｐｓｕ　２０４　＝　ＤＳＭ　７０４５　参照ｐＢＲ３２２Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　ＭａｎｎｈｅｉｍｐＵｃ　１８　Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍネズミチフス菌ａｒｏＡ　ＳＬ　３２６１　Ｈｏ５ｉｅｔｈ　＆　５ｊｏｃｋｅｒ、　Ｎａｔｕｒｅ、　２９１（１９８１，）　２３Ｂ−２３９匁−黙Ｂｌｉｇｈｔ　ＭＡ、　Ｈｏ１ｌａｎｄ　ＩＢ　（１９９０）　膜トランスロケータ−の新しいグループの溶血素Ｂ、　Ｐ−糖タンパク質、その他のメンバーの構造と機能、Ｍｏ１ｅｃ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、４：　８７３−８８０Ｂｏｌｉｖａｒ　Ｆ、　Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ　ＲＬ、　Ｂｅｔｌａｃｈ　ＭＣ，Ｂｏｙｅｒ　ＨＷ　（１９７７）　新しいクローニング運搬手段の構成と特色、１．プラスミドｐＭＢ９のアンピシリン耐性誘導体、Ｇｅｎｅ　２：　７５−９３゜Ｂｒｏｗｎ　Ａ、Ｈｏｒｍａｅｃｈｅ　ＣＥ、Ｄｅ　Ｈｏｒｍａｅｃｈｅ　ＲＤ、Ｗｉｎｔｈｅｒ　Ｍ、Ｄｏｕｇａｎ　Ｇ。

Ｍａｓｋｅｌｌ　ＤＪ、　５ｔｏｃｋｅｒ　ＢＡＤ　（１９８７）　アテニュエーションしたａｅｒｏＡネズミチフス菌ワクチンがマウスの中のクローニングしたβガラクトシダーゼに対する体液免疫及び細胞免疫を誘導する、Ｊ、　Ｉｎｆｅｃｔ。

Ｄｉｓ、　１５５：　８６−９２゜Ｃｈａｒｂｉｔ　Ａ、　Ｍｏ１ｌａ　Ａ、　５ａｕｒｉｎ　Ｗ、　Ｈｏｆｎｕｎｇ　Ｍ　（１９８８）　グラム陰性菌の表面に異種ポリペプチドを発現するためのベクターの機能、Ｇｅｎｅ７０：　１８１−１８９゜Ｆｅ１ｍ１ｅｅ　Ｔ、　Ｐｅ１ｌｅｔ　Ｓ、　Ｌｅｅ　Ｅ−Ｙ、　Ｗｅｌｃｈ　Ｒ（１９８５）大腸菌溶血素は信号ペプチドの切断なしに細胞外に放出される、Ｊ、　Ｂａｃｔｅ口ｏ１゜１６３：　８８−９３゜Ｇｒａｙ　Ｌ、　Ｍａｃｋｍａｎ　Ｎ、　Ｎ１ｃａｕｄ　Ｊ−Ｍ、　）ｌｏｌｌａｎｄ　ＩＢ　（１９８６）、、、Ｍｏ１．　Ｇｅｎ。

Ｇｅｎｅｌ　２０５：　１２７−１３３゜Ｇｕｏ−ｆｕ　Ｓｕ、Ｂｒａｈｍｂｈａｔｔ　ＨＮ、　Ｗｅｈｌａｎｄ　Ｊ、　Ｒｏｈｄｅ　Ｍ、　Ｔｉｍｍ１ｓ　ＫＮ（１９９２）　安定なＬａｍＢ／志賀毒素古賀サブユニットハイブリッドの構築、ネズミチフス菌ａｇｒｏへ−株の発現の分析及びＢ−サブユニットに特異性の粘膜及び血清の抗体応答の刺激、赤痢ワクチンの抗古賀毒素成分としての可能性１１０．。

）１ａｎａｈａｎ　Ｄ　（１９８３）　プラスミドによる大腸菌の形質転換の研究、Ｊ。

Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　１６Ｂ＋　５７７−５８０゜）１ｏｉｓｅｔｈ　Ｓに、　５ｔｏｃｋｅｒ　Ｂ、Ａ、Ｄ　（１９８１）　芳香属依存のネズミチフス菌は生体ワクチンとして無毒て有効、Ｎａｔｕｒｅ　２９１・２３８−２３９゜Ｋｏｒｏｎａｋｉｓ　Ｖ、　Ｋｏｒｏｎａｋｉｓ　Ｅ、　Ｈｕｇｈｅｓ　Ｃ（１９８９）　両方の細菌膜を通しての大腸菌溶血素タンパク質の輸出を指示するＣ末端信号の分離と分析、ＥＭＢＯＪ、　８：　５９５−６０５゜Ｌｏｒｅｎｚｏ　ＶＤ、　Ｗｅｅ　Ｓ、　Ｈｅｒｒｅｒｏ　Ｍ、　Ｎｅ１ｌａｎｄｓ　ＪＢ　（１９８７）　第二鉄認識調節（ｆｏｒ）リプレッサーを結合するプラスミドＣｏ１Ｖ −に３０のアエロノくクチ＞オヘロンノオペレーター配列、Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｔｏｌ、　１６９：２６２４−２６３０　。

Ｍａｎｉａｔｉｓ　Ｔ、　Ｆｒ１ｔｓｃｈ　ＥＦ、　Ｓａｍｂｒｏｏｋ　Ｊ　（１９８２）分子クローニング、実験室マニュアル、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　ＮＹ。

Ｍａｃｋｍａｎ　Ｎ、　Ｎ１ｃａｕｄ　Ｊ−Ｍ、　Ｇｒａｙ　Ｌ、　Ｈｏ１ｌａｎｄ　ＩＢ　（１９８５）　大腸菌溶血素決定基２００１の遺伝的、機能的組織、Ｍｏ１．　Ｇｅｎ、　ＧｅｎｅＬ、　２０１：　２８２−２８８　。

Ｍａｃｋｍａｎ　Ｎ、　Ｂａｋｅｒ　Ｋ、　Ｇｒａｙ　Ｌ、　ｔ（ａｉｇｈ　Ｒ，、Ｎ１ｃａｕｄ　Ｊ−Ｍ、　Ｈｏ１ｌａｎｄ　ＩＢ（１９８７）　溶血素のＣ末端分泌信号を用いた大腸菌かち培地へのキメラタンパク質の放出、ＥＭＢＯｊ、　６：２８３５−２８４１゜Ｍｉｌｌｓ　ＳＤ、　５ｅｋｉｚａｋｉ　Ｔ、　Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｃａｒｒｅｒｏ　Ｍｌ、　Ｔｉｍｍ１ｓ　ＫＮ　（１９８８）ワクチン開発のためのシゲラ毒性決定基の分析と遺伝子操作、Ｖａｃｃｉｎｅ　６：　１１６−１２２゜Ｍｉｌｌｓ　ＳＤ、　Ｔｉｍｍ１ｓ　ＫＮ　（１９８８）　シゲラの中のＯ抗原多糖生合成の遺伝学とワクチンの開発、Ｃａｂｅｌｌｏ　ＦＣ，Ｐｒｕｚｚｏ　Ｃ（編）　Ｂａｃｔｅｒｉａ。

Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ　ａｎｄ　ｔｈｅ　Ｐｈａｇｏｃｙｔｉｃ　Ｃｅ１ｌ　（細菌、補体と食細胞）、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ　Ｖｅｒｌａｇ、　Ｂｅｒｌｉｎ、　Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、　ｐｐ　２１−３９゜Ｓｃｈａｇｇｅｒ　ｈ、　Ｊａｇｏｗ　Ｇｖ（＋９８７）　１〜１００　ｋＤａの範囲のタンパク質分離用のトリシン−ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１６６：　３６８−３７９゜５ｃｈａｕｄｅｒ　Ｂ、　Ｂｌｏｃｋｅｒ　Ｈ，Ｆｒａｎｋ　Ｒ，ＭｃＣａｒｔｈｙ　ＪＥＧ　（１９８７）大腸菌ａｔＤ　Ｅ翻訳開始ドメインを取り込む誘導可能の発現ベクター、Ｇｅｎｅ５２：　２７９−２８３　。

Ｓ＋ｏｉＬｈ　ＨＷ　（１９６３）大腸菌の溶血素、Ｊ、　Ｐａｔｈｏｌ、口ａｃｔｅｒｉｏ１．８５：１９７−２１１　。

Ｗａｇｎｅｒ　Ｗ、　Ｖｏｇｅｌ　Ｍ、　Ｇｏｅｂｅｌ　Ｗ　（１９８３）　大腸菌の外膜を通しての溶血素の輸送には二つの機能が必要、Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１５４：　２００−２１０゜Ｗａｎｄｅｒｓｍａｎ　Ｃ，Ｄｅｌｅｐｅｌａｉｒｅ　Ｐ　（＋９９０）　ＴｏＬＣと溶血素分泌に必要な大腸菌の外膜タンパク質、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８７：　４７７６−４７８０゜Ｗｅｌｃｈ　ＲＡ、　Ｐａｔｃｈｅｎ−Ｄｅｌｌｉｎｇｅｒ　Ｅ、　Ｍｉｎｓｃｈｅｗ　Ｂ、　Ｆａｌｋｏｗ　Ｓ　（１９８１）腸外大腸菌感染の毒性に寄与する溶血素、Ｎａｔｕｒｅ　２９４：　６６５−６６７゜Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ　Ｃ，Ｖｉｅｉｒａ、　Ｊ、　Ｍｅｓｓｉｎｇ　Ｊ　（１９８５）改良されたＭ１３ファージクローニングベクターと宿主株：　Ｍ１３ｍｐ１８とｐＵｃ１９ベクターのヌクレオチド配列、Ｇｅｎｅ　３３：　１０３−１１９゜図３．１！Ｉｌ　堰　堤四　社　吐 ■　サブユニットＢ／粘膜ロ　サブユニットＢ／体液［ａ　サブユニットＢ／体液図３．２粘膜　体液　体液釘ｍ　サブユニットＢ応答［］　βガラクトシダーゼ応答ＩｇＪ３．３経口　腹腔内７　ａｒｏＰ／Ｂ−’フ′ブシンメＣ−Ｔ：：ＨＩｙＡＱ　ｐ−１ａｃＰ／Ｂ− ”７フユｄ／Ｃ−Ｔ：、Ｈ１ｙＡフロントページの続き（８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、　ＰＴ、ＳＥ）、　ＡＵ、ＪＰ、　ＵＳ（７２）発明者　スー、グオーフードイツ連邦共和国　デー−３３００ブラウンシュヴアイク、マシェローデル・ヴエーク（７２）発明者　ヴエーランド２．ユルゲンドイツ連邦共和国　デー−３３００ブラウンシュヴアイク、マシェローデル・ヴエーク（７２）発明者　ティミス、ケニート・エヌドイツ連邦共和国　デー−３３００ブラウンシュヴアイク、マシェローデル・ヴエーク

Claims

【特許請求の範囲】

１．細菌毒素のサブユニットＢをコードするＤＮＡ構造が、ＨＩｙＡ（溶血素）をコードするＤＮＡ構造乃至そのＣ末端断片と融合していることを特徴とするハイブリッドＤＮＡ。
２．前記細菌毒素が志賀毒素又は志賀類似の毒素、例えばＳＬＴ−Ｈ又は、ＳＬＴ−ＩＩｖであることを特徴とする請求の範囲第１項記載のハイブリッドＤＮＡ。
３．コードする両方の前記ＤＮＡ構造に構成的プロモーター又は、生体内条件で誘導可能のプロモーターが前置してあることを特徴とする請求の範囲第１項又は第２項記載のハイブリッドＤＮＡ。
４．コードする両方の前記ＤＮＡ構造に、サルモネラ株、特にネズミチフス菌、例えばネズミチフス菌ａｒｏＡ−ＳＬ３２６１の中での発現用のプロモーターが前置してあることを特徴とする請求の範囲第３項記載のハイブリッドＤＮＡ。
５．野性型の又は野性型の一時変異としてのβラクタマ−ゼ・プロモーターを特徴とし、その場合該プロモーターが合成的に生産可能又は不能である請求の範囲第４項記載のハイブリッドＤＮＡ。
６．アエロバクチン・プロモーターを特徴とする請求の範囲第４項記載のハイブリッドＤＮＡ。
７．前記請求の範囲第１項から第５項のいずれか１項記載のハイブリッドＤＮＡを特徴とするプラスミド。
８．請求の範囲第７項記載のプラスミドを特徴とする宿主株、特にサルモネラ株、特にネズミチフス菌、例えばネズミチフス菌σｒｏＡ−ＳＬ３２６１。
９．ＨｌｙＡと乃至そのＣ末端断片と融合している細菌毒素のサブユニットを特徴とするオリゴハイブリッドペプチド。
１０．請求の範囲第９項記載のオリゴハイブリッドペプチドからなる又は、該ペプチドを含むワクチン発明の詳細な説明