JP2002515456A - 免疫処置のためのベロ毒素ｂサブユニット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ほ乳類における免疫反応を、毒素−抗原抱合体を投与することにより刺激する方法を提供する。抗原の関連する状態を治療するための薬剤組成及び方法も説明する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 発明の背景 樹状細胞は免疫系の標識である。これらは骨髄前駆細胞を起源とし
、血液を通じて移動して、皮膚などの非リンパ組織に接種される。樹状細胞は外
来の抗原を捕獲し、処理して細胞表面上にペプチド−ＭＨＣ抱合体として現れた
後、血液及び輸入リンパ球を介して二次性リンパ節に移動する。このリンパ節で
、これらはＴリンパ球と相互作用してヘルパー細胞及びキラーＴ細胞の活性化を
促す（Steinman, R. (1991)Annu. Rev. Immunol. 9:271; Cella et al. (1997)
Curr. Opin. Immunol 9:10）。

【０００２】 樹状とは、それらの外観と身体への分布具合とに基づいて名付けられたもので
ある。例えば表皮に位置する樹状細胞はランゲルハンス細胞として知られる。真
皮及び間質に位置する樹状細胞は間質樹状細胞として知られる。血液、膜及びリ
ンパ細胞はそれぞれ、循環系、輸入リンパ球及びリンパ節で見られる。さらに樹
状細胞は成熟段階ではこれらの段階の機能的及び表現型という特徴で系統によっ
て特徴付けられ、またそれらの移動及び機能に関与した機序によっても特徴付け
られている（Cella et al., ; Austyn, J. (1996) J. Exp. Med. 183:1287）。

【０００３】 最近の研究により、コレラ毒素が、マウスで非侵襲性、経皮免疫処置において
潜在的な経皮的アジュバントとして作用することができることが実証された（Gl
enn, G. M. et al. Nature (1998)391:851）。皮膚表面に塗布されたコレラ毒素
は、ジフテリア又は破傷風トキソイドなどの同時投与された抗原に対する強い免
疫反応を刺激する。この方法は、皮膚表面面積が大きい場合、そしてその中に潜
在的に免疫細胞が存在する場合に特に重要である（例えばBos, J.D., Clin. Exp
. Immunol., 107(Suppl. 1), 3-5, 1997）。

【０００４】 コレラ毒素を用いた研究の結果、ヘロ毒素がマクロファージ上の可溶性ペプチ
ドの提示を高めるが、可溶性又は細菌性抗原の細胞内プロセッシングを阻害する
ことが示唆された。対照的に、組換えＢサブユニットは抗原の表面提示を高める
が細胞内プロセッシングを阻害しなかった（Matousek, M.P., J.G. Nedrud and
C.V. Harding, J. Immunol., 156, 4137-4145, 1996）。動物研究でも、樹状細
胞が抗主要免疫性を誘起する潜在的可能性が実証されている（Nestle, F. O. et
al. Nature Medicine, 4:328-332, 1998）。

【０００５】 発明の概要 一実施例では、本発明は、ほ乳類の免疫反応が刺激されるように、ほ乳類に対
して毒素−抗原抱合体を投与することにより、ほ乳類の免疫反応を刺激する方法
に関するものである。好ましくは、毒素−抗原抱合体を、皮膚又は粘膜を通じて
経皮的に投与する。

【０００６】 有利な実施例では、本毒素−抗原抱合体は、例えば腫瘍抗原、ウィルス抗原、
又は細菌抗原を含む。腫瘍抗原は肺組織、皮膚組織、乳房組織、胃組織、結腸組
織、直腸組織又は脳組織を由来とするものでもよい。ある好適な実施例では、本
腫瘍抗原は、例えばメラノーマ腫瘍を由来とする。有利なことに、本発明の毒素
−抗原抱合体には、シガ毒素、ベロ毒素、又はコレラＢ毒素などの毒素を含めて
もよい。好ましくは、この毒素はベロ毒素のＢフラグメントであるとよい。

【０００７】 別の実施例では、本発明は、有効量の抗原−毒素抱合体をほ乳類に投与し、こ
のほ乳類の免疫反応を刺激することによって、ほ乳類における抗原の関連する状
態を治療する方法を特徴とするものである。好ましくは、この毒素−抗原抱合体
を、例えばほ乳類の呼吸器管、胃腸管又は生殖管など、皮膚又は粘膜を通じて経
費的にほ乳類に投与するとよい。特に好適な実施例ではこのほ乳類はヒトである
。さらにアジュバントを本発明の抱合体と一緒に投与しても有利である。

【０００８】 本発明はさらに、毒素−抗原抱合体及び薬学的に容認可能な担体を含む薬剤組
成に関する。好ましくは、当該組成が、皮膚又は粘膜を通じて経費的にほ乳類に
投与するのに適しているとよい。当該の薬学的に容認可能な担体が、経口、経皮
又は気管支内投与に適していると有利である。好ましくは、当該薬剤組成が非侵
襲的投与に適しているとよい。

【０００９】 本発明は、例えばシガ毒素又はベロ毒素Ｂサブユニットなどの毒素のレセプタ
結合非毒性フラグメントと、例えばMage1などの腫瘍抗原のエピトープとを含む
、毒素−抗原抱合体などの組換えたんぱく質に関するものである。本発明は、さ
らに、請求項に記載された抱合体を用いる方法をも特徴としている。この毒素−
抗原抱合体を用いると、例えばほ乳類の免疫反応を刺激したり、又はほ乳類の抗
原が関連する状態を治療することができる。さらに、抗原提示細胞上に抗原を提
示させたり、また薬剤組成の調製のためにも、本毒素−抗原抱合体を用いること
ができる。

【００１０】 発明の詳細な説明 本発明は、少なくとも部分的には、免疫反応を刺激するための薬剤組成及び方
法に関するものである。本発明は、例えば共有結合などによりシガ毒素、ベロ毒
素などの毒素に結合させたMage1などの抗原又は抗原エピトープを含む、毒素−
抗原抱合体などの組換えたんぱく質を特徴とする。好適な実施例の一つでは、当
該薬剤組成は、例えば呼吸系、胃腸系又は生殖系などの皮膚又は粘膜のいずれか
を通じて経皮投与するのに適しているとよい。

【００１１】 「抗原」という術語には、独立して免疫反応を起こさせる物質や、本発明の抱
合体に組み込まれたときに免疫反応を起こさせるものが含まれる。「抗原エピト
ープ」という術語には、抗原性を決定することのできるたんぱく質のフラグメン
トが含まれる。エピトープは、例えば長さで６から８個の残基から成るペプチド
を含んでいてもよい（Berzofsky, J. and I. Berkower, (1993) in Paul, W., E
d., Fundamental Immunology, Raven Press, N.Y., p.246)。エピトープの中に
はかなり長いものもあるであろう。抗体分子のその認識エピトープへの親和性は
低い方で例えば１０^−６Ｍから高い方で例えば１０^−１１Ｍの範囲がある。

【００１２】 例えば、抗原にはたんぱく質や、腫瘍細胞など特定の種類のガン細胞の表面に
特異的関連のあるその他の分子が含まれる。多くの形のガンが、その疾患の形に
関連したたんぱく質の産生で特徴付けることができる。しばしばこれらのたんぱ
く質は胚発達の特異的段階で用いられるが、正常な成人の一生では観察されない
。これらの抗原は、抗ガンワクチンのエピトープの源として特に有用である。本
発明の抱合体のための抗原として考えられている腫瘍抗原の例は、乳房、子宮、
胚、皮膚、及び脳に罹患するガンに対応するものが含まれる。例えば、乳房の腫
瘍は異常に発現したレセプタ、例えばヒトＥＧＦ様レセプタファミリ（ＨＥＲ）
のもので特徴付けることができるかも知れない。加えて、正常なほ乳類の胎児発
達の間に神経上皮幹細胞によって発現するネスチンたんぱく質もまた、大部分の
型の脳のガンを含め、中枢神経系の腫瘍上で発現する（McKay, D.G. Ronald, U.
S. Patent No. 5,338,839, 8/16/94）。それはまた皮膚で見られるメラノーマ、
及び、その他の組織に転移したものの上でも発現する（V.A. Florenes, R. Holm
, O. Myklebost, U. Lendahl, O. Fodstad, 1994, Cancer Res. 54:354-6）。本
発明は、これらの抗原又はこれらの抗原のエピトープを本発明の化合物に組み込
むことを考察するものである。好ましくは、本発明の毒素−抗原抱合体の抗原は
、メラノーマに関連するペプチドであるとよく、またこのメラノーマは例えば組
換えにより又は腫瘍細胞の溶解産物を由来としてもよい。

【００１３】 本発明の考察する抗原を発現する腫瘍のその他の例には、ウィルムス腫瘍（A.
J. Buckler, K.M. Call, T.M. Glaser, D.A. Haber, D.E. Housman, C.Y. Ito,
Ito, J. Pelletier, Rose, E.A. Rose, 米国特許第5,350,840号）、胃腸のガン
（R. Fishel et al., 国際出願WO95/14085, 05/26/95）、化学療法中の多剤耐性
の発達を特徴とするガン（J.M. Croop et al., 米国特許第5,198,344号）、及び
、その配列は当業者であれば分析用に入手可能であるRb、ras、及びc-mycなど、
当業者に公知の数多くの腫瘍遺伝子の少なくとも一つの存在を特徴とするガン、
がある。

【００１４】 その代わりに、本発明の抗原を微生物又は病原体の表面又は分泌生成物に結び
付けてもよい。「病原体」という術語は、疾患を発生させる生命体である、一つ
又はそれ以上の特定の種の細菌、ウィルス、真菌、及びプロトゾアが発生させる
異常を引き起こす生命体が含まれる。病原体の例には、エシェリヒアコリのセロ
タイプである0157:H7、ヘリコバクターピロリ、Ｈ．ムステラエ、ハエモフィリ
スインフルエンザ及びＨ．ジュクレー、シュードモナスアエルギノーザ、志賀赤
痢菌、サルモネラチフィ及びＳ．パラチフィなどのグラム陰性細菌種、マイコバ
クテリウムツベルクローシス、Ｍ．レプレ、クロストリジウムテタニ、スタフィ
ロコッカスアウレウス、及び、溶連菌などのグラム陽性細菌種、リケッチア及び
クラミジア種などの偏性細胞内細菌生物や、ＨＩＶ−１及び−２を含む、しかし
これに限らない、逆転写酵素を用いて相補ＤＮＡを合成するＲＮＡ含有ウィルス
であるレトロウィルス、ＨＳＶ−１及び−２、非−Ａ非−Ｂ非−Ｃ肝炎ウィルス
、ポックスウィルス、及び狂犬病ウィルスなどのその他の病原性ウィルス、カン
ジダ及びアスペルギルス種などの真菌、クリプトスポリジウムパルヴム、赤痢ア
メーバ及びランブル鞭毛虫などのプロトゾア、及びニューキャッスル疾患ウィル
スなどの動物病原体、が含まれる。たんぱく質をスクリーニングし、ペプチドを
試験管内アッセイすることにより、これらの生物から固有のエピトープを得るこ
とは当業者に公知であり、数多くの例が説かれており、また適切なアミノ酸残基
配列をGenbankから得てもよい。

【００１５】 「感染」という術語は、当該のホストにおける病原体の生存及び成長を含むも
のとして意図されている。感染の存在を診断するのに用いられる症状には発熱、
炎症、疼痛、感染部位又は感染部位近傍の関節及び筋肉の感覚があるが、これら
の症状のうちの一つ又はそれ以上がなかったとしても、ホスト生物の被験体への
感染の可能性を除外するものではない。「炎症」という術語は感染を伴う一組の
ホスト反応を示唆するが、さらに感染がない場合でも、例えば自己免疫反応、変
性疾患、組織リモデリング異常、アレルゲンへの曝露、及び／又は、その他の状
態として存在する可能性がある。炎症反応には、プロテアーゼ、ヒスタミンの放
出、及びスーパーオキシド生成、及びインターフェロン及び腫瘍壊死因子などの
サイトカインの産生及びサイトカインへの反応を伴った好中球、マスト細胞、及
び好塩基球の脱顆粒など、細胞内のプロセスが含まれる。

【００１６】 抗原の種類の一つはアレルゲンであってもよい。「アレルゲン」とは、感受性
のある被験体においてアレルギー反応又は喘息性反応を引き起こすことのできる
物質である。ある一集団のうちのある一定の割合に感受性反応を引き起こすアレ
ルゲンの数は膨大であり、その中には花粉、昆虫の毒液、動物の鱗屑、塵ダニた
んぱく、真菌胞子及び薬剤（例えばペニシリン）が含まれる。天然の動物及び植
物のアレルゲンの例には以下の属に特異的なたんぱく質がある。即ち、ネコ属（
フェリスドメスティクス）、イヌ属（カニスファミリアリス）、デルマトファゴ
イデス属（例えばデルマトファゴイデスファリネ）、ワモンゴキブリ属（ワモン
ゴキブリ）、ブタクサ属（アンブロシアアルテミスフォリア）、ライグラス属（
ロリウムペレン又はロリウムムルティフォーラム）、スギ属（ニホンスギ）、ア
ルテルナリア属（アルテルナリアアルテルナータ）、ハンノキ（アルヌスグルテ
ィノーザ）、マカンバ属（ベツーラベルコーザ）、コナラ属（クエルカスアルバ
）、オレア属（オレアエウロパ）、アルテミシア属（アルテミシアブルガリス）
、プランタゴ属（例えばプランタゴランセオラータ）、パリエタリア属（例えば
パリエタリアオフィシアナリス又はパリエタリアジュダイカ）、チャバネゴキブ
リ属（チャバネゴキブリ）、ミツバチ属（アピスムルチフローラム）、キュープ
レス属（キュープレッサスセンペルヴィレンス、キュープレッサスアリゾニカ、
及びキュープレッサスマクロカルパ）、ビャクシン属（ジュニペルスサビノイデ
ス、ニュニペルスヴィルギニアーナ、ジュニペルスコミュニス及びジュニペルス
アスヘイ）、ツヤ属（例えばツヤオリエンタリス）、ヒノキ属（ヒノキ）、アグ
ロパイロン属（シバムギ）、ライムギ属（例えばライムギ）、コムギ属（例えば
トリティカムアエスチヴム）、ダクチリス属（例えばダクチリスグロメラータ）
、フェスキュ属（例えばフェスキュエラチオール）、ポア属（例えばポアプラテ
ンシス又はポアコンプレッサ）、カラスムギ属（例えばマカラスムギ）、ホルキ
ュス属（ホルキュスラナタス）、アントキサンタム属（例えばハルガヤ）、アル
ヘナセラム属（例えばアルヘナセラムエラチウス）、アグロスチス属（例えばア
グロスチスアルバ）、フレウム属（例えばチモシー）、ファラリス属（ファラリ
スアルンディナセア）、スズメノヒエ属（例えばバヒアグラス）、モロコシ属（
例えばジョンソングラス）、及びブロムグラス属（例えばブロムスイネルミス）
、である。「アレルゲンが関連する状態」には、アレルゲンに対するアレルギー
反応又は喘息性反応から生ずる状態が含まれる。

【００１７】 「毒素」という術語には、抗原の免疫反応を促すことのできる化合物が含まれ
る。代表的な毒素には、コレラｂ鎖、シガ毒素、及び好ましくは、シガ様毒素、
例えばベロ毒素など、が含まれる。シガ毒素は、志賀赤痢菌が分泌するＡＢ_５サ
ブユニットファミリーの細菌たんぱく毒素である。このＡＢサブユニットは、高
等真核細胞において、細胞質内に移行した後に、２８ＳｒＲＮＡの逆転した残基
を修飾することによって、たんぱく質生合成を阻害する。ホモペンタマー（0/0
Ｂフラグメント）であるＢサブユニットは、標的細胞への結合及び内部移行にお
いて、これらの細胞の細胞膜に見られる糖脂質Ｇｂ_３と相互作用することによっ
て関与する。このＢフラグメントは毒性ではないが、細胞膜からエンドソームを
経由して生合成／分泌の経路に輸送されるホロ毒素の細胞内輸送特性を、多くの
Ｇｂ_３発現細胞において逆行する態様で、逆転させる。

【００１８】 関連する実施例では、この毒素は志賀様毒素、例えばベロ毒素である。現在公
知のベロ毒素には、Ｅ．コリのいくつかの株から作製されたサブユニット毒素の
ベロ毒素１、ベロ毒素２、ベロ毒素２ｃ及びベロ毒素２ｅがある。これらの毒素
は、溶血性尿毒症症候群及び出血性大腸炎の病因に関与している。細胞の細胞毒
性は、感受性細胞において、ホロ毒素のＢサブユニットがレセプタ糖脂質、グロ
ボトリアシルセラミドに結合することが伝達している。有利なことに、本発明の
毒素は非毒性であり、例えば好ましくはシガ毒素Ｂ又はベロ毒素Ｂである。

【００１９】 「結び付いた」という術語には、毒素と抗原との間の共有結合が含まれる。好
適な共有結合には、例えばペプチド結合及びブロモシアン活性化が含まれる。こ
の術語はさらに、たんぱく質対たんぱく質の相互作用、疎水性相互作用、ファン
デルワールス相互作用及びイオン相互作用を含む。例にはビオチンを含む共役が
ある。

【００２０】 実施例の一つでは、当該の毒素−抗原抱合体を組換えにより生成する。本発明
の化合物を組換えにより作製する方法は当業者に公知であり、例に詳述されてい
る。

【００２１】 更なる実施例では、本毒素−抗原抱合体はさらに活性又は不活性の小胞体検索
シグナルを含んでいてもよい。「小胞体検索シグナル」という術語には、本発明
の抱合体が免疫反応に関与する細胞と相互作用する能力を高めるようなペプチド
配列が含まれる。活性小胞体検索シグナルの一例はＫＤＥＬであり、このシグナ
ルは例えば当該毒素のＣ末端に結合すると有利である。適した不活性の小胞体検
索シグナルの一例はＫＤＥＬＧＬである。ＫＤＥＬＧＬがこの毒素のＣ末端に結
合していると有利である。

【００２２】 特に好適な実施例では、本発明の毒素−抗原抱合体はベロ毒素Ｂ及び腫瘍抗原
、例えばメラノーマ関連ペプチドを含んでいる。この抱合体を組換えにより作製
すると便利であろう。

【００２３】 さらに本発明は、ほ乳類に毒素−抗原抱合体を投与することによって、ほ乳類
の免疫反応を刺激する方法を特徴とするものでもある。好ましくは、免疫反応の
刺激には、樹状、例えばランゲルハンス細胞の関与が含まれる。「免疫反応」と
いう術語には、本発明の抱合に対するほ乳類のあらゆる免疫学的反応が含まれる
。有利なことに、この免疫反応には、例えば、Ｔ細胞の促進、抗原に対する抗体
の産生、及び／又は、樹状細胞、例えば好ましくはランゲルハンス細胞による抗
原の提示、を含めてもよい。この術語には、本発明の抱合体に対する、そのほ乳
類の免疫系のあらゆる反応が含まれる。「刺激する」という術語には、例えば、
免疫反応の開始又は促進が含まれる。

【００２４】 抗原のプロセッシング及びＴリンパ球への提示は、免疫反応の発生において重
要な事象である。一般的なルールとして、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラ
ス１の分子は、主に細胞質ゾル及び核たんぱくを由来とする内生のペプチドエピ
トープをＣＤ８＋Ｔリンパ球（ＣＴＬ）に提示する（Monaco, J.J. Immunol. To
day (1992) 13:173-179; Heemels, M.T. and Ploagh, H., Annu. Rev. Biochem.
(1995) 64:463491）が、外生のたんぱく質を由来とするペプチドはエンドサイ
トーシス経路で産生し、ＣＤ４．Ｔリンパ球に対してＭＨＣクラス２分子上に提
示される（Janeway, C.A. Jr., et al., Inf. Rev. Immnol. (1993) 10:301-311
; Pieters, J., Curr. Opin. Immunol. (1997)9:89-96）。しかしながら、様々
な報告によって、正常又は腫瘍組織が発現する自己内生抗原は、外生クラス１で
制限された経路を通じて効率的にプロセッシングされてＣＤ８＋Ｔ細胞に提示さ
れることが示されている。

【００２５】 膵臓島細胞及び腎尿細管細胞、のみにある膜に結合した型のオブアルブミン（
ＯＶＡ）を発現するトランスジェニックマウスでは、ＯＶＡを由来とするペプチ
ドは、骨髄由来細胞によって、腎臓及び膵臓の排出リンパ節で、クラス１で制限
された態様で提示される（Kurts, C., et al. J. Exp. Med. (1996) 184:923-93
0）。ハン氏らが、Ｔ細胞のＭＨＣクラス１制限腫瘍抗原による初回抗原刺激に
は、これらの抗原が腫瘍細胞から、骨髄由来抗原提示細胞へ移行してプロセッシ
ングされることが必要であると実証した（Huang, A. Y., et al. Science (1994
) 264:961-965）。ＭＨＣクラス１分子に関連した提示と、外生プロセッシング
経路を通じたＣＴＬの産生を実証したこれらの議論にも拘わらず、大半の研究は
、試験管内でのクラス１制限された効率的な提示を実証したり、又は、異物の外
生可溶性抗原による生体内でのＣＴＬ誘導を実証することに失敗している（Moor
e, M. W., et al., Cell (1988) 54: 777-785; Rock, K, L., Immunol. Today (
1996) 17: 131-137; Watts, C., Annu. Rev. Immunol. (1997)15:821-850）。

【００２６】 ＣＴＬはウィルス感染及び腫瘍に対する防御的及び治療的免疫反応の重要な成
分である（Sabzovari, H. et al. Cancer. Res. (1993) 53:4933-4937; Rosenbu
rg, S.A., et al. J. Natl. Cancer. Inst. (1994) 86:1159-1166; Stevenson,
P.G., et al. Virology (1997) 232:158-166; Feltkarnp, M. C. Eur. J. Immun
ol. (1995) 25:2638-2642）、ＭＨＣクラス１制限された提示、及び、外生の可
溶性抗原によるＣＴＬの刺激を可能とする様々な戦略が開発されてきた。

【００２７】 ワクシニア、リステリア又はサルモネラが発現するウィルス抗原又は腫瘍抗原
など、組換え生存ベクタは、これらの抗原を細胞質ゾルに効率的に運び、こうし
てクラス１で制限される提示経路にそれらを導入させ、また生体内でのＣＴＬの
感作を起こさせた（Gao, X. M. et al. Cancer. Res. (1995) 55:4776-4779; Ts
ang, K. Y. et al., J. Natl. Cancer. Inst. (1995) 87:952-990）。しかしな
がら、同様のベクタの利用は、用いるベクタの潜在的病原性があるために、特に
ガン及びＨＩＶ感染患者などの免疫抑制された患者において、レシピエントにと
ってリスクがある（Kavanaugh, D. Y. et al. Hematol. Oncol. Clin. North. A
rnenca (1996)10:927-951; Redfield, R.R. et al. N. Eng. J. Med. (1987)316
:673-676）。

【００２８】 ラテックス・ビードに結合させた微粒子抗原（Kovacsovics-Bankowski, M. et
al., Pro. Nat. Acad. Sci. USA (1993) 90:4942-4946; Harding, C. C. et al
. J. Immunol. (1994) 153:4925-4933）、リポソームに融合させた微粒子抗原（
Nair, S., et al., J. Exp. Med. (1992)175:609-612）又はアジュバントに結び
付けた微粒子抗原（Ke, Y. et al. Eur. J. Immunol. (1995)25:549-553; Lipfo
rd, G.B. et al. Eur. J. Immunol. (1997)27:2340-2344）を用いるその他の方
法は、試験管内及び生体内でＭＨＣクラス１経路に外来の抗原を導入することに
成功した。大半の場合では、食細胞活動がこのプロセスに関与しており、このク
ラス１の提示経路には高い抗原濃度が必要であり、かつ、その効率は低いように
見えた（Reis e Sousa, C. et al. J. Exp. Med. (1995)1B2:841-851）。

【００２９】 「ほ乳類」という術語には、例えばげっ歯類（例えばラット、マウス、ハムス
ター、リス）、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ネコ、イヌ、クマ、ヤギ、及び霊長
類（例えばサル、チンパンジー、ゴリラ、及び好ましくは、ヒト）などの温血動
物が含まれる。

【００３０】 「樹状細胞」という術語には、ランゲルハンス細胞、間質樹状細胞、趾間樹状
細胞、瀘胞樹状細胞及び循環樹状細胞が含まれる。ランゲルハンス細胞は表皮及
び粘膜に見られる。間質樹状細胞は例えば心臓、肺臓、肝臓、腎臓、及び胃腸管
など、大部分の臓器にその集団がある。趾間樹状細胞は第二リンパ様組織及び胸
腺髄質のＴ細胞区域に存在する。循環樹状細胞には血液白血球の約０．１％を成
す「膜化細胞」が含まれる。

【００３１】 一般的には、樹状細胞は、神経細胞の樹状突起に似た長い膜突起の迷路で覆わ
れている。それらの樹状突起が長いために、樹状細胞は、リンパ球及び付属の免
疫系細胞を単離する従来の手法を用いた研究には課題が多い。樹状細胞は高いレ
ベルの両クラス２ＭＨＣ分子及び同時刺激Ｂ７分子を発現する傾向がある。この
理由のために、ＡＰＣとして機能するには両方とも活性化が必要なマクロファー
ジ及びＢ細胞よりも強力な抗原提示細胞である。食細胞活動及又はエンドサイト
ーシスによって組織内に抗原を捕獲した後は、樹状細胞はリンパ血液内に移動し
て様々なリンパ器官に循環し、そこでそれらは抗原をＴリンパ球に提示する。

【００３２】 さらに本発明は、ほ乳類に治療上有効量の抗原−毒素抱合体を投与し、それに
よってほ乳類の免疫反応を刺激することによって、ほ乳類において抗原の関連す
る状態を治療する方法にも関するものである。例えば、この方法は、抗原をベロ
毒素Ｂサブユニットと一緒に同時投与するステップか、又は、ベロ毒素Ｂサブユ
ニットに結合させた抗原を被験体、例えばほ乳類、に投与して樹状細胞の抗原提
示能力を刺激するステップを含む。

【００３３】 「抗原関連状態」という術語は、微生物又は病原体感染、アレルゲン関連状態
、及び、好ましくは、例えば乳房、子宮、脳、皮膚、肺、等々などの腫瘍が含ま
れる。好ましくは、抗原関連状態がメラノーマであるとよい。

【００３４】 「治療する」という術語は、抗原の関連する状態の少なくとも一つの症状を予
防する及び治療する、並びに改善させることを含む。さらにそれは、そのほ乳類
が感受性のある可能性がある、しかし必ずしもそれで苦しむとも限らないような
抗原関連状態に対して免疫反応を開始させることも含む。例えば、メラノーマの
危険性のあるほ乳類においては、本発明の抱合体をこのほ乳類に投与して、この
潜在的メラノーマの開始を防止する又は送らせるよう、免疫反応を生じさせても
よい。

【００３５】 「投与する」という術語には、本発明の抱合体が、その意図された機能、例え
ば免疫反応を刺激するなど、を果たすことができるような投与経路が含まれる。
好適な投与経路には、経口、気管支内、及び経皮が含まれるが、これらに限定さ
れるものではない。投与経路に応じて、本発明の抱合体を、所定の材料で皮膜す
る、又は所定の材料内に配置することで、それに対して意図された機能をそれが
果たす能力に悪影響を及ぼしかねない天然条件からそれを保護することができる
。本発明の抱合体は、単独で投与しても、又は薬学的に容認可能な担体と一緒に
投与してもよい。さらに、本発明の抱合体は、本発明の抱合体の混合物としても
投与することができ、この混合物は、さらに、薬学的に容認可能な担体と一緒に
同時投与してもよい。本発明の抱合体は、抗原の関連する状態の開始前に投与し
ても、又は抗原の関連する状態の開始後に投与してもよい。

【００３６】 好ましくは、本発明の抱合体を皮膚又は粘膜を通じて経皮的にほ乳類に投与す
るとよい。粘膜には、ほ乳類の数多くの内部系の内層の潤滑膜が含まれる。粘膜
を持つ系の例には、呼吸系、胃腸管、及び生殖管が含まれるが、これらに限定さ
れるものではない。好適な粘膜系には、例えば、ほ乳類の鼻の膜、鼻の通路、ノ
ド、肺、口、胃、腸、結腸、直腸、尿道、及び膣が含まれる。理論に縛られるわ
けではないが、ほ乳類の粘膜又は皮膚へ塗布又はその他の手段によって本発明の
化合物を投与することは、例えばランゲルハンス細胞などの樹状細胞など、特殊
化した、かつ強力な免疫細胞の存在があるために、有用であると考えられる。

【００３７】 特に好適な実施例では、本発明は、本発明の抱合体経皮的に投与することによ
って、特異抗原に対してほ乳類を免疫処置するための、好ましくは侵襲的な方法
を考察するものである。非侵襲的な形の免疫処置の利点の一つは、ほ乳類に対し
て薬剤組成を注射する必要が少なくとも部分的に避けられるために、注射の必要
性が減少し、かつ、例えば外来の病原、例えばＨＩＶなどに対してほ乳類を曝露
する危険性が減少することである。非侵襲性という術語には、皮膚及び粘膜を通
じて経皮投与するなどの投与が含まれる。例には、呼吸管粘膜を通じて経皮投与
のための当該薬剤組成の吸入、例えば胃腸管粘膜や、口、喉、胃、小腸、結腸及
び直腸の膜など、の粘膜などを通じた経皮投与などによる投与に向けて当該薬剤
組成を飲み込むことが含まれる。さらに本発明は、本発明の毒素−抗原抱合体と
、当該抱合体の経皮投与に適した薬学的に容認可能な担体とを含む、ほ乳類の免
疫処置のための薬剤組成に関する。

【００３８】 更なる実施例では、本発明は、アジュバントをさらに含む薬剤組成及び方法に
関するものである。アジュバントの一例はＫＬＨである。成功裏に経皮投与する
上での化合物の能力を高めるのに重要な役割はアジュバントが果たす（Edelman
Rev. Infec. Dis. (1980) 2:370-383）。アジュバントは、例えば経皮又は粘膜
などの経皮的経路の開発において、化合物をほ乳類に投与するための有用な及び
容易に入手できる非侵襲的方法として以前より重要である（Snider, Crit. Rev.
Immunol. (1995)14:317-348）。適したアジュバントは関連する分野の当業者に
公知である。

【００３９】 更なる実施例では、本発明は、治療上有効量の本発明の毒素−抗原抱合体と、
ほ乳類への投与に適した薬学的担体とを投与することによって、ほ乳類の免疫性
を誘起する方法を考察する。好ましくは、この担体が、鼻孔投与、経口投与、又
は局所投与に適しているとよい。有利なことに、本方法にはさらにアジュバント
の投与を含めてもよい。さらに本発明は、有効量の本発明の毒素−抗原抱合体と
薬学的な担体とを含む、ほ乳類の免疫性を誘起することのできる薬剤組成に関す
るものである。好適な担体には、本発明の抱合体をほ乳類に鼻孔投与、経口投与
、又は局所投与するのに適したものが含まれる。

【００４０】 当該化合物の「治療上有効量」という言語は、例えば抗原が関連する状態の様
々な形態学的及び身体上の症状を防止するなど、抗原が関連する状態を治療する
又は防止するのに必要な又は充分な量である。有効量は、被験体の大きさ及び体
重、病気の種類、又は、本発明に基づく特定の抱合体などの因子に基づいて変え
ることができる。例えば、本発明の抱合体の選択が、何が「有効量」に影響を与
えるか、に作用することもあろう。当業者であれば、上述の因子を研究すること
ができ、また本発明の抱合体の有効量に関する決定を過度の実験を行うことなく
下すことができるであろう。

【００４１】 さらに本発明は、抗原提示細胞が抗原を提示するよう、抗原提示細胞を毒素−
抗原抱合体に接触させるステップを含む、抗原提示細胞上に抗原を提示させる方
法に関するものである。好ましくは、抗原が、例えばメラノーマ抗原などの腫瘍
抗原であるとよい。例えば、ベロ毒素のＢサブユニットは、樹状細胞による抗原
の表面提示と、細胞内抗原プロセッシングの両方を刺激することができる。

【００４２】 「抗原提示細胞」という術語には、抗原又は抗原フラグメントを表示するよう
な細胞が含まれる。抗原提示細胞の例には、いくつかの末梢血単核細胞及び、好
ましくはランゲルハンス細胞などの樹状細胞が含まれる。

【００４３】 別の実施例では、本発明は、毒素−抗原抱合体及び薬学的に容認可能な担体を
含む薬剤組成を特徴とする。ここで用いられる「薬学的に容認可能な担体」とい
う文言は、本発明の化合物がそれに意図された機能を果たさせるように被験体内
又は被験体に運ばれる又は輸送させることに関与する、薬学的に容認可能な材料
、組成又は伝播体、例えば液体又は固体の充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒又は封
入剤など、を意味する。典型的には、このような化合物は、一つの臓器、又は身
体の一部分から、別の臓器、又は身体部分へと運ばれる又は輸送される。各担体
は、その調剤のその他の成分と適合性があり、かつ患者にとって有害でない、と
いう意味において、「容認可能」でなければならない。薬学的に容認可能な担体
として働くことのできる材料のいくつかの例には、ラクトース、グルコース及び
スクロースなどの糖類、コーンスターチ及びいもでんぷんなどのでんぷん類、セ
ルロース、及びその誘導体、例えばカルボキシメチルセルロース、エチルセルロ
ース及びセルロースアセテート、粉末トラガカント、麦芽、ゼラチン、タルク、
ココアバター及び座薬ろうなどの賦形剤、ピーナッツ油、綿実油、べにばな油、
ごま油、オリーブ油、コーン油、及び大豆油などの油脂、プロピレングリコール
などのグリコール、オレイン酸エチル及びラウリル酸エチルなどのエステル、寒
天、水酸化マグネシウム及び水酸化アルミニウムなどの緩衝剤、アルギン酸、無
発熱源水、等張食塩水、リンゲル溶液、エチルアルコール、リン酸緩衝液、及び
、その他の、薬剤調製に用いられる非毒性適合性物質、がある。

【００４４】 上述したように、本抱合体のいくつかの実施例には、アミノ又はアルキルアミ
ノなどの塩基性官能基を含めることができるため、薬学的に容認可能な酸で薬学
的に容認可能な塩を形成することができる。この点において「薬学的に容認可能
な塩類」という術語は、本発明の化合物の、比較的に非毒性の無機及び有機酸添
加塩類を言う。これらの塩類は、本発明の化合物の最終的な単離及び精製の際に
in situで調製するか、又は、本発明の精製された化合物をその遊離塩基型のま
ま、適した有機又は無機の酸に別々に反応させて、このように形成された塩を単
離させることにより、調製することができる。代表的な塩類には、ヒドロブロミ
ド、ヒドロクロリド、スルフェート、ビスルフェート、ホスフェート、ニトレー
ト、アセテート、吉草酸塩、オレイン酸塩、パルミチン酸塩、ステアリン酸塩、
ラウリン酸塩、ベンゾエート、乳酸塩、ホスフェート、トシル酸塩、クエン酸塩
、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、ナフチル酸塩、メシル酸
塩、グルコヘプト酸塩、ラクトビオネート、及び、ラウリルスルホネートの塩類
等々がある（例えばBerge et al. (1977) "Pharmaceutical Salts", J. Pharm.
Sci. 66:1-19）。

【００４５】 別の場合では、本発明の化合物には、一つ又はそれ以上の酸性官能基を含める
ことができるため、薬学的に容認可能な塩基で薬学的に容認可能な塩を形成する
ことができる。この場合の「薬学的に容認可能な塩類」という術語は、本発明の
化合物の、比較的に非毒性の無機及び有機塩基添加塩類を言う。これらの塩類は
、本発明の化合物の最終的な単離及び精製の際にin situで調製するか、又は、
本発明の精製された化合物をその遊離酸型のまま、適した塩基、例えば薬学的に
容認可能な金属カチオンや、又は薬学的に容認可能な有機の第一級、第二級又は
第三級アミンなどのヒドロキシド、炭酸塩又は重炭酸塩など、に反応させること
により、調製することができる。代表的なアルカリ又はアルカリ土類塩には、リ
チウム、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、及びアルミニウム
塩類、等々がある。塩基添加塩類の形成に有用な代表的な有機アミンには、エチ
ルアミン、ジエチルアミン、エチレンジアミン、エタノールアミン、ジエタノー
ルアミン、ピペラジン、等々がある。

【００４６】 湿潤剤、乳化剤及び潤滑剤、例えばラウリル硫酸ナトリウム及びステアリン酸
マグネシウムなど、や、着色剤、はく離剤、被膜剤、甘味料、着香料、及び芳香
剤、保存剤及び抗酸化剤もまた、組成中にあってよい。

【００４７】 薬学的に容認可能な抗酸化剤の例には、アスコルビン酸、システイン塩酸塩、
重硫酸ナトリウム、メタ重硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、等々の水溶性抗
酸化剤、アスコルビン酸パルミテート、ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）
、ブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、アルフ
ァトコフェロール、等々などの油溶性抗酸化剤、クエン酸、エチレンジアミン四
酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸、等々などの金属キレート剤
、がある。

【００４８】 本発明の製剤には、経口、鼻孔、局所、経皮、バッカル、舌下、直腸、膣及び
／又は非経口投与がある。本製剤は、便利なように単位投薬型で提供してもよく
、また薬学の分野において公知のいかなる方法で調製してもよい。一回分の投薬
型を作製するのに担体材料と配合することのできる有効成分の量は、治療効果を
生じる化合物の量であることが一般的であろう。一般的には、百パーセントのう
ちで、この量は約１パーセントから約９９パーセントの有効成分、好ましくは約
５パーセントから約７０パーセント、最も好ましくは約１０パーセントから約３
０パーセントの範囲であろう。

【００４９】 これらの製剤又は組成を調製する方法には、本発明の化合物を担体、及び選択
に応じて一つ又はそれ以上の付属成分に会合させるステップが含まれる。一般的
には、本製剤は、本発明の化合物を液体の担体、又は微細に分割された固体の担
体、又は両方、に均一かつ密接に会合させた後、必要に応じてこの生成物を成形
することによって調製される。

【００５０】 経口投与に適した本発明の製剤は、カプセル、カシェ剤、丸剤、錠剤、ロゼン
ジ（多くの場合スクロース及びアカシア又はトラガカントを用いた着香した基剤
を用いて）、粉末、顆粒、又は、水性又は非水性の液体による溶液又は懸濁液と
して、あるいは水中油又は油中水乳濁液として、あるいはエリキシル又はシロッ
プとして、あるいは香錠として（ゼラチン及びグリセリンなど、又はスクロース
又はアカシアなど、の不活性の基剤を用いて）及び／又は、口内洗剤、等々の形
で、それぞれに所定量の本発明の化合物が有効成分として含まれたものであって
もよい。さらに本発明の化合物は、巨丸剤、し剤又はパスタとして投与してもよ
い。

【００５１】 経口投与用の本発明の固形投薬型（カプセル、錠剤、丸剤、糖衣剤、粉末、顆
粒、等々）においては、有効成分を、例えばクエン酸ナトリウム又はリン酸２カ
ルシウム、及び／又は以下のうちのいずれかなどの一つ又はそれ以上の薬学的に
容認可能な担体と一緒に混合する。即ち、充填剤又は増量剤、例えばでんぷん、
ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、及び／又は、珪酸など、
例えばカルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロ
リドン、スクロース及び／又はアカシアなどの結着剤、グリセロールなどの湿潤
剤、寒天、炭酸カルシウム、いも又はタピオカでんぷん、アルギン酸、特定の珪
酸塩、及び炭酸ナトリウムなどの崩壊剤、パラフィンなどの溶解遅延剤、第四級
アンモニア化合物などの吸収促進剤、例えばセチルアルコール及びモノステアリ
ン酸グリセロールなどの湿潤剤、カオリン及びベントナイトクレイなどの吸収剤
、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固形ポリエチ
レングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、及びこれらの混合物などの潤滑剤、
及び着色剤、である。カプセル、錠剤及び丸剤の場合には、本薬剤組成にさらに
緩衝剤を含めてもよい。同様の種類の固定の組成を、ラクトース又は乳糖などの
賦形剤や、高分子量ポリエチレングリコール等々を用いて軟質及び硬質の充填ゼ
ラチンカプセルの充填剤として利用してもよい。

【００５２】 錠剤は、選択に応じて一つ又はそれ以上の付属成分と一緒に圧縮又は鋳込みに
よって作製することができる。圧縮された錠剤は結着剤（例えばゼラチン又はヒ
ドロキシプロピルメチルセルロース）、潤滑剤、不活性の希釈剤、保存剤、崩壊
剤（例えばでんぷんグリコレートナトリウム又は架橋カルボキシメチルセルロー
スナトリウム）、界面活性剤又は分散剤を用いて作製してもよい。鋳込み成形さ
れた錠剤は、不活性の液体希釈剤でしめらせた粉末状の化合物の混合物を適した
機械で鋳込み成形することによって作製してもよい。

【００５３】 本発明の薬剤組成の錠剤、及びその他の固体の投薬形態、例えば糖衣錠、カプ
セル、丸剤及び顆粒など、には、選択に応じて切れ込みを入れてもよく、又は腸
溶コーティング及びその他の製薬業で公知のコーティング剤など、コーティング
及びシェルと一緒に調製してもよい。これらはさらに、所望の放出曲線、その他
のポリマーマトリックス、リポソーム及び／又はマイクロスフィアを提供するた
めに、ヒドロキシプロピルメチルセルロースなどを様々な比率で用いて、その中
の有効成分の放出を遅延させる又は調節するように調製してもよい。それらは、
例えば細菌保持フィルタを通した濾過や、又は、滅菌剤を、無菌水に溶解可能な
無菌の固体組成の形状や、何らかのその他の無菌の注射可能な媒質に使用直前に
取り入れることによって、無菌化してもよい。さらに本組成に、選択に応じて乳
白剤を含めてもよく、また、有効成分を胃腸管の特定の部分のみ、又は特定の部
分で選択的に、そして選択に応じて遅延する態様で放出させるような組成であっ
てもよい。利用の可能な包埋組成の例には、ポリマー物質及びろうがある。有効
成分はさらに、必要に応じて上述の賦形剤のうちの一つ又はそれ以上を備えたマ
イクロ封入型であってもよい。

【００５４】 本発明の化合物の経口投与のための液体投薬型には、薬学的に容認可能な乳濁
液、マイクロ乳濁液、溶液、懸濁液、シロップ及びエリキシルが含まれる。有効
成分に加え、液体投薬型には、例えば、水又はその他の溶媒、可溶化剤及び乳化
剤、例えばエチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチ
ル、ベンジルアルコール、ベンジルベンゾエート、プロピレングリコール、1,3-
ブチレングリコール、油脂類（特に綿実油、落花生、コーン、はい芽、オリーブ
、ひまし及びごま油）、グリセロール、テトラヒドロフリルアルコール、ポリエ
チレングリコール及びソルビタンの脂肪酸エステル、及びこれらの混合物を含め
てもよい。不活性の希釈剤の他に、経口組成にはさらに湿潤剤、乳化剤及び懸濁
剤、甘味料、着香料、着色剤、芳香剤及び保存剤を含めることができる。

【００５５】 懸濁液は、有効化合物に加えて、例えばエトキシル化イソステアリルアルコー
ル、ポリオキシエチレンソルビトール及びソルビタンエステル、微結晶セルロー
ス、重水酸化アルミニウム、ベントナイト、寒天及びトラガカント、及びこれら
の混合物などの懸濁剤を含んでいてもよい。

【００５６】 直腸又は膣投与のための本発明の薬剤組成の処方は、座薬として提供してもよ
く、またこの座薬は本発明の一つ又はそれ以上の化合物を一つ又はそれ以上の適
した非刺激性賦形剤又は担体と混合することで調製してもよく、この賦形剤又は
担体には、ココアバター、ポリエチレングリコール、座薬ろう又はサリチル酸塩
が含まれ、またこの賦形剤又は担体は室温では固形であるが、体温では液体であ
るため、直腸又は膣腔で融解して有効化合物を放出することとなる。

【００５７】 膣投与に適した本発明の製剤は、さらに、当業で適切であることが知られてい
る担体などを含むペッサリ、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、フォーム又
はスプレー製剤が含まれる。

【００５８】 本発明の化合物の局所又は経皮投与用の投薬型には、粉末、スプレー、軟膏、
ペースト、クリーム、ローション、ゲル、溶液、パッチ及び吸入剤が含まれる。
この有効化合物は無菌条件下で薬学的に容認可能な担体や、また必要な何らかの
保存剤、緩衝剤、又は推進剤と混合してもよい。

【００５９】 軟膏、ペースト、クリーム及びゲルには、本発明の有効化合物に加え、動物性
及び植物性油脂、ろう、パラフィン、でんぷん、トラガカント、セルロース誘導
体、ポリエチレングリコール、シリコン、ベントナイト、珪酸、タルク及び酸化
亜鉛、又はこれらの混合物が含まれていてもよい。

【００６０】 粉末及びスプレーには、本発明の化合物に加えて、ラクトース、タルク、珪酸
、水酸化アルミニウム、珪酸カルシウム及びポリアミドの粉末、又はこれらの物
質の混合物が含まれていてもよい。スプレーにはさらに通常の推進剤、例えばク
ロロフルオロ炭化水素及び揮発性の未置換炭化水素、例えばブタン及びプロパン
など、が含まれていてもよい。

【００６１】 経皮パッチには、本発明の化合物の身体への送達を調節できるという更なる利
点がある。このような投薬型は、本化合物を適した媒質中に溶解又は分散させる
ことで作製が可能である。さらに吸収促進剤を用いると、本化合物の皮膚の透過
を増加させることができる。このような透過の速度は、速度調節膜を提供するか
、又は、本有効化合物をポリマーマトリックス又はゲル中に分散させることによ
って、調節することができる。

【００６２】 眼用製剤、眼用軟膏、粉末、溶液、等々もまた、本発明の範囲内にあるものと
して考察されるところである。

【００６３】 非経口投与に適した本発明の薬剤組成は、一つ又はそれ以上の本発明の化合物
を、一つ又はそれ以上の薬学的に容認可能な無菌の等張水性又は非水性溶液、分
散液、懸濁液又は乳濁液、又は無菌の粉末に組み合わせて含み、またこの無菌の
粉末は使用直前に無菌の注射可能な溶液又は分散液に再構築してもよく、この注
射可能な溶液又は分散液には、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、製剤を予定のレシピ
エントの血液に等張にする溶剤、又は懸濁剤又は増粘剤が含まれていてもよい。

【００６４】 本発明の薬剤組成に利用可能な適した水性及び非水性の担体の例は、水、エタ
ノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレ
ングリコール、等々）、及び適したこれらの混合物、オリーブ油などの植物油、
オレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステル、が含まれる。適切な流動性は
、例えばレシチンなどのコーティング材料を利用したり、分散液の場合には必要
な粒子の大きさを維持したり、そしてサーファクタントを利用するなどによって
維持することができる。

【００６５】 これらの組成はさらに、保存剤、湿潤剤、乳化剤及び分散剤などを含んでいて
もよい。微生物の活動を抑えるには、様々な抗菌剤及び抗カビ剤、例えばパラベ
ン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸、等々を含めて確実にすることが
できる。さらに、糖類、塩化ナトリウム、等々などの等張剤を組成に含めるのも
好ましいであろう。加えて、注射可能な薬剤型の吸収を長引かせるには、モノス
テアリン酸アルミニウム及びゼラチンなど、吸収を送らせる物質を含めるとよい
。

【００６６】 場合によっては、薬剤の効果を長引かせるためには、皮下又は筋肉内注射から
薬剤の吸収を遅らせることが好ましい。これは、水溶性の乏しい結晶質又は無晶
質材料の液体懸濁液を利用して達成してもよい。こうして薬剤の吸収速度は溶解
の速度に依存することとなり、ひいては結晶の大きさ及び結晶の形に依存するこ
ととなる。あるいは、非経口投与した薬剤型の吸収の遅延は、薬剤を油脂の伝播
体に溶解又は懸濁させることにより達成される。

【００６７】 注射可能なデポー型は、当該化合物のマイクロ封入マトリックスを、ポリラク
チド−ポリグリコリドなどの生分解性ポリマ中に形成して作製する。薬剤のポリ
マーに対する割合に応じて、そして用いた特定のポリマーに応じて、薬剤放出の
速度を調節することができる。その他の生分解性ポリマーの例にはポリ（オルト
エステル）及びポリ（無水物）がある。デポーの注射可能な製剤は、さらに、薬
剤を、身体組織と適合性のあるリポソーム又はマイクロ乳濁液中に捕獲すること
で作製する。

【００６８】 本発明の調剤は経口、非経口、局所、又は直腸を通じて与えてもよい。それら
はもちろん、各投与経路に適した形で与える。例えば、それらは、錠剤又はカプ
セル型で、注射、吸入、眼用ローション、軟膏、座薬、等々、注射、輸注又は吸
入による投与、ローション又は軟膏による局所、及び座薬による直腸投与によっ
て投与される。経口投与が好ましい。

【００６９】 ここで用いられる「非経口投与」及び「非経口的に投与する」という文言は、
多くの場合注射による腸内投与及び局所投与以外の投与形態を意味し、限定され
るわけではないが静脈内、筋肉内、動脈内、鞘内、莢膜内、眼窩内、心臓内、皮
内、腹膜内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内及び胸
骨内注射及び輸注が含まれる。

【００７０】 ここで用いられる「全身投与」「全身投与する」「末梢投与」及び「末梢投与
する」という文言は、化合物、薬剤又はその他を、患者の系に進入するように、
従って代謝及びその他の同様のプロセスに向けられるよう、例えば皮下投与など
、中枢神経系に直接届く以外の投与を意味する。

【００７１】 これらの化合物は、ヒト及びその他の動物に対し、例えばスプレー、直腸、膣
内、非経口、槽内、及び局所による経口、鼻孔、また頬側及び舌下を含む粉末、
軟膏又はドロップによるなど、いかなる適した投与経路による治療に向けて投与
してもよい。

【００７２】 選択された投与経路に関係なく、本発明の化合物は適した水和型で用いてもよ
く、及び／又は、本発明の薬剤組成を、当業者に公知の従来の方法によって薬学
的に容認可能な投薬型に調製してもよい。

【００７３】 本発明の薬剤組成中の有効成分の実際の投薬量は、患者に毒性となることなく
、特定の患者、組成、及び投与経路にとって所望の治療反応を得るのに効果的な
有効成分の量が得られるように変更してもよい。

【００７４】 選択される投薬量は、利用する本発明の特定の化合物、又はそのエステル、塩
、又はアミドの活性、投与経路、投与時間、用いた特定の化合物の排出速度、治
療の期間、用いた特定の化合物と組み合わせて用いるその他の薬剤、化合物及び
／又は材料、治療する患者の年齢、性別、体重、状態、全身の健康及び以前の医
療歴、及び医業で公知の同様の因子を含む様々な因子に依存することであろう。

【００７５】 当業の通常の技術を有する内科医又は獣医であれば、必要な当該薬剤組成の効
果的な量を容易に決定かつ処方できる。例えば、内科医又は獣医であれば、薬剤
組成中に用いる本発明の化合物の用量を、所望の治療効果を達成するのに必要な
ものよりも低いレベルで開始し、所望の効果が得られるまでこの用量を次第に増
加させていってもよいかも知れない。

【００７６】 本発明の化合物を単独で投与することもできるが、薬剤組成として当該化合物
を投与することが好ましい。好適な薬剤組成には、経口、経皮、又は気管支内に
適したものが含まれる。

【００７７】 本発明に基づくと、ベロ毒素Ｂサブユニットなどの毒素と同時投与するか、又
はこの毒素に共有結合などにより結合させた抗原、例えばMage1は、ランゲルハ
ンス細胞などの樹状細胞の抗原提示能力を刺激してワクチンとして作用するため
に被験体に投与される。このようなワクチンは、経口、経皮又は気管支内投与す
ることができ、それらが曝露された組織の樹状細胞を刺激することができる。

【００７８】 本発明はさらに、ほ乳類の抗原が関連する状態を治療するための薬剤組成に関
するものである。この薬剤組成には、有効量の毒素−抗原抱合体と薬学的に容認
可能な担体とが含まれる。好ましくは、抗原が関連する状態は腫瘍、例えばメラ
ノーマであり、また毒素−抗原抱合体は、例えばベロ毒素のＢサブユニットを含
む。

【００７９】 本発明は、さらに、毒素−抗原抱合体及び薬学的に容認可能な担体を含む、腫
瘍などの抗原が関連する状態に対してほ乳類、例えばヒト、を予防接種するため
のワクチンに関する。

【００８０】 本発明は、ベロ毒素Ｂサブユニット、及び、ベロ毒素Ｂサブユニットの全部又
は一部を含むハイブリッド組成を利用して、例えば効果的な予防接種戦略を提供
するためなど、免疫反応の抗原提示機能を刺激するなどのために免疫反応を刺激
する方法に関する。

【００８１】 いくつかの実施例では、ベロ毒素（ＶＴ）のＢ毒素は、ホロ毒素（例えばＶＴ
１、ＶＴ２、ＶＴ２ｃ、ＶＴ２ｅ）を被験体に投与することにより投与される。
しかしながら、好適な実施例では、ベロ毒素のＢサブユニットをＶＴホロ毒素の
毒性部分無しで投与して、ホロ毒素の毒性を避ける。ベロ毒素のＢサブユニット
は、樹状細胞による抗原の表面提示と、細胞内抗原プロセッシングとの両方を刺
激できると考えられる。

【００８２】 別の実施例では、ベロ毒素Ｂ鎖又はコレラＢ鎖に結合させたメラノーマ関連ペ
プチドを、樹状細胞を刺激し、このような抗原の活発な提示をリンパ球に行わせ
ることにより、抗腫瘍ワクチンとして被験体に投与する。好適な実施例の一つで
は、腫瘍溶解産物をベロ毒素Ｂ鎖に、共有結合、例えば臭化シアン活性化など、
の技術を用いて結合させる。別の好適な実施例では、例えばＫＬＨなどのアジュ
バントを同時投与する。

【００８３】 以下の例で本発明をさらに説明するが、以下の例は限定的なものとして捉えら
れてはならない。本出願全体を通じて引用されたすべての参考文献、特許出願、
特許、及び公開済みの特許出願の内容は、参考としてここに編入されたものであ
る。

【００８４】 例 シガ毒素のＢフラグメントに融合させた外生可溶性腫瘍抗原の、主要組織適合
生複合体クラスＩによる提示：シガ毒素ＢフラグメントはＭＨＣクラス１提示経
路に外生抗原を向かわせる。 Mage1腫瘍抗原を由来とするＣＤ８エピトープに融合させたシガ毒素Ｂフラグ
メント（van der Bruggen, P. et al., Science (1991) 254:1643-1647)から成
る組換えたんぱく質を構築した。最初にヒトメラノーマからクローンしたこの抗
原は異なる起源の腫瘍で発現する。この遺伝子の発現は、ＭＨＣクラス１分子を
発現しなかった睾丸を除き、正常組織の大型パネルでは全く見られなかった（va
n der Bruggen, P. et al., Science (1991) 254:1643-1647）。この操作された
腫瘍抗原がクラス１制限経路で試験管内プロセッシングされ、提示される能力を
調べた。

【００８５】 材料及び方法 細胞 末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をフィッコール・ハイパック勾配で遠心分離して
ＨＬＡ−Ａ１＋の健康なドナーの末梢血液から分離した。本研究で用いられた樹
状細胞は以前に説かれたプロトコル（Sallusto, F. and Lanzavecchia, A., J.
Exp. Med. (1994) 179:1109-1118）に基づいてＰＢＭＣから生成させた。簡単に
説明すると、フィッコール／ハイパック郊外で分離した単核細胞集団をプラスチ
ック製の皿上で２時間インキュベートした後に付着細胞を得た。次にこれらの細
胞を、１０％の加熱不活化ウシ胎児血清、２ｍＭのＬ−グルタミン、５０ＩＵ／
ｍｌのペニシリン、５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、５％のピルビン酸ナ
トリウム（「完全培地」）及び５００Ｕ／ｍｌの組換えＧＭ−ＣＳＦ（Leucomax
, Molgramostin, Sandoz Pharma, Basel, Switzerland）及び１００ＩＵ／ｍｌ
のＩＬ４（Diaclone, Besancon, France）を補ったＲＰＭＩ１６４０培地で培養
した。３日目に、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ４を一回加え、６−７日目で得られた樹
状細胞を抗原提示アッセイに用いた。

【００８６】 Ｂリンパ幼若細胞系ＬＢ７０５（ＨＬＡ−Ａ１、Ａ２、Ｂ８、Ｂ２７）は既に
説かれている（van der Bruggen, P. et al., Eur. J. Immunol. (1994)24:3038
-3043）。ＥＢＶ形質転換Ｂ細胞系ＢＭ２１は同型接合ＨＬＡ−Ａ１の個人から
得た（Yang, S. Y. et al., Immunobiology of HLA. (Springer-Verlag, New Yo
rk:1989)）。このＨＬＡ−Ａ２ＥＢＶ−形質転換Ｂ細胞系Ｖ．１はＵ．ブランク
博士より贈呈いただいた。Ｂリンパ幼若細胞系はすべて、１μＭの２−メルカプ
トエタノールを補った完全培地に維持した。

【００８７】 ＭＺ２ ＣＴＬ８２／３０及びＬＢ３７３ ＣＴＬ２４６／１５クローンは、そ
れぞれ、ＨＬＡ−Ａ１制限態様でMage1たんぱく質の１６０−１６８ペプチド（T
raversari, C. et al., J. Exp. Med. (1992) 176:1453-1457）及びＨＬＡ−Ａ
２制限態様でMart1たんぱく質の２７−３５ペプチド（Coulle, P, G. et al., J
. Exp. Med. (1994) 180:35-42）を認識した。

【００８８】 ＣＴＬの培養を、僅かに変更を加えたトラベルサリ氏らの説いたプロトコルの
後に行った（Traversari, C. et al., Immunogenetics (1992) 35:145-152）。
簡単に説明すると、３×１０^５のＣＴＬを、健康なドナーから採った１０^５のヒ
トプールＡ、Ｂ及びＯ血清（ＳＡＢ）を補った、Ｌ−アルギニン（１１６μｇ／
ｍｌ）、Ｌ−アスパラギン（３６μｇ／ｍｌ）及びＬ−グルタミン（２１６μｇ
／ｍｌ）を含有する２ｍｌの完全イスコーブ培地で、１０^６の照射済み（１００
Ｇｙ）ＬＧ−２ＥＢＶ支持細胞、１０^６照射（３０Ｇｙ）アレゴリック（原語：
allegoric）ＰＢＭＣ、ＰＨＡ−Ｌ（５μｇ／ｍｌ）ＩＬ−２（１５０ＩＵ／ｍ
ｌ）の存在下で培養した。刺激後３から４日後に、ＣＴＬをＩＬ−２（５０ＩＵ
／ｍｌ）を補った培養培地で希釈した。ＣＴＬの支持細胞による刺激を一週間に
一回、繰り返した。ＩＦＮγアッセイについては、ＣＴＬ培養株を最後の再刺激
から６日後に用いた。

【００８９】 プラスミドの構築及び融合ペプチドの作製 シガ毒素のＢフラグメンを発現するpSU108を基にしたプラスミドか、又は、こ
のＢフラグメントのＣ末端に、Ｎ−グリコシレーション部位及び活性（ＫＤＥＬ
）又は不活性（ＫＤＥＬＧＬ）ＥＲ検索シグナルが導入された融合たんぱく質の
構築が、既に説かれている（Johannes, L. et al., J. Biol. Chem. (1997) 272
:19554-19561）。ＰＣＲを基にした戦略を用いてMage1エピトープ及びその５’
及び３’フランキング配列（ＤＶＫＥＡＤＰＴＧＨＳＹＶＬＧ）を、予め構築さ
れたB-Glyc-KDEL及びB-Glyc-KDELGL発現ベクタのNot1部位に導入した。その結果
得られた融合たんぱく質はB-Mage1-Glyc-KDEL及びB-Mage1-Glyc-KDELGLと名付け
られた。配列は二本鎖ＤＮＡ配列決定法によりチェックした。このたんぱく質は
E.coli株DH5αで発現させ、精製は基本的には説かれたように行った（Johannes,
L. et al., J. Biol. Chem. (1997) 272:19554-1956）。

【００９０】 簡単に説明すると、ペリプラスム抽出物の調製後、これらをQFFカラム（ファ
ーマシア社製）に入れ、直線NaCl勾配（１２０から４００mM）によって２０mMTr
is／ＨＣｌ、ｐＨ７．５中で溶出させた。シガB-Mage1融合たんぱく質を含有す
る画分を２０mMのTris／ＨＣｌ、ｐＨ７．５で透析し、モノＱカラム（ファーマ
シア社製）に入れ、前と同じに溶出させた。

【００９１】 アンテナペディア−Mage1（Antp-Mage1）融合遺伝子を、Mage1エピトープ及び
その５’及び３’フランキング配列（上述を参照されたい）をコードする合成オ
リゴヌクレオチドを、ＰＡＨ６１ＳプラスミドのＸｈｏ１及びＢａｍＨ１制限部
位間に、Ｒａｂ３コドン配列の代わりに挿入することで得た（Perez, F. et al.
, J. Cell. Sci. (1992) 102:717-722）。次に、Antp-Mage1配列を含むNdel-Bam
HI制限断片を、ノヴァゲンプラスミドpET2gb(＋）（英国ロンドン、ＲアンドＤ
システム社製）内にサブクローンしたが、このプラスミド内ではこの融合たんぱ
く質の発現はT7プロモータの制御下にあり、そのＣ末端ではHis標識をされてい
た。この融合ペプチドを、E.coli株ＢＬ２１（ＤＥ３）Lys内で、説かれたよう
にＩＰＴＧ誘導を行った後に発現させた（Studier, F. W. et al., Methods in
Enzymol. (1990) 185: 60-89）。次のこのAntp-Mage1たんぱく質をNi-NTAアガロ
ースゲル（ドイツ、ヒルデン、キアゲン社製）上で、このメーカのプロトコルに
基づいて変性条件下で精製した。その結果得られた融合たんぱく質は、ＳＤＳ−
ポリアクリルアミドゲル電気泳動法及びクーマシー・ブルー染色法で９５％の純
度であることが判定された（図１Ａ、Ｂ、及びＣ）。

【００９２】 ウェスタン・ブロット 高解析度のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法の後で、たんぱく質を
ニトロセルロースの膜（BA85、0.45mm、ドイツ、ダーゼル、シュライヒャー・ア
ンド・シュエル社）に、移動緩衝液（192mMのグリシン、25mMのTris塩基pH8.3、
20%のエタノール）中でトランス−ブロット細胞（バイオ−ラド社製）を用いて
電気移動させた。次に、この膜を１時間、３７℃で２０ｍＭのTris（pH7.4）、
１５０ｍＭのＮａＣｌ（ウェスタン緩衝液（ＷＢ））、５％ウシ血清アルブミン
（ＢＳＡ）、０．１％のトゥイーン２０内で飽和させ、シガＢ−Mage1融合たん
ぱく質を得るにはシガ毒素のＢフラグメントを狙ったマウスモノクローナル抗体
１３Ｃ４（４μｇ／ｍｌ）（米国ロックビル、ＡＴＣＣ社）か、又は、Antp-Mag
e1融合たんぱく質を得るにはマウス抗-(His)₆-標識抗体（１μｇ／ｍｌ）（フラ
ンス、ゲネヴィリエ、ディアノーヴァ、タカラバイオメディカルヨーロッパＳ．
Ａ．社製）と一緒に１８時間、４℃でインキュベートする。この膜をＷＢ及び０
．１％のトゥイーン２０で洗浄し、西洋わさびペルオキシダーゼ（フランス、レ
スウィリス、アマーシャム社製）に結合させた抗マウス免疫グロブリンと一緒に
１時間、インキュベートした。ＷＢ及び０．１％のトゥイーン２０で洗浄した後
、このフィルタをウェスタンブロッティング試薬ＥＣＬ（アマーシャム社製）と
一緒にインキュベートし、化学発光を、この膜をバイオマックスＭＲフィルム（
コダック社製）に露光させることで検出した。

【００９３】 抗原ペプチド 合成ペプチド２７−３５Mart1（ＡＡＧＩＧＩＬＴＶ）及び１６０−１６８Mag
e1（ＥＡＤＰＴＧＭＳＹ）をネオシステム社（フランス、ストラスブルグ）から
得たが、これは既に公開済みの配列（Traversari, C. et al J. Exp. Med. (199
2) 176:1453-1457; Kawakami, Y. et al., J. Exp. Med. (1994)180:347-352)に
由来するものである。

【００９４】 抗原提示アッセイ 抗原提示細胞（ＰＢＭＣ、Ｂ−ＥＢＶ、Ｔ細胞又は樹状細胞）を９６ウェルの
底の平らなマイクロプレートに１０^５細胞／ウェルになるようにプレーティング
し、３７℃で４時間又は１５時間、１００μｌのイスコーブ媒質中に抗原を入れ
た状態で、ＳＡＢは加えずにパルスした。インキュベートの最後に媒質を取り除
き、２０，０００のＣＴＬクローンを、２５単位／ｍｌのＩＬ２を含有する１０
０μｌのＣＴＬ培養培地の各ウェルに加えた。２４時間後、５０μｌの上清を回
収し、ＩＦＮγをＥＬＩＳＡで測定した（Diaclone, Basancon, France)。

【００９５】 いくつかの実験では、細胞を１％のパラホルムアルデヒドに１０分間、室温で
固定し、入念に洗浄してからマイクロプレートに移した。適当な場合には、ブレ
フェルディンＡ（シグマ社製）又はクロロキン（シグマ社製）をそれぞれ２μｇ
／ｍｌ及び２５０μＭになるように、３０分間加えてから、抗原を加え、また抗
原提示インキュベーションの間、同じ最終濃度になるようにした。

【００９６】 ＤＴＡＦカップリング B-Mage1-Glyc-KDELを、基本的には前に説明したようにＤＴＡＦ（5-(4,6-ジク
ロロトリアジン-2-イル）アミノ）フルオレセイン）に結合させた。簡単に説明
すると、20mMのHEPES、pH7.4、150mMのNaClに溶かした６０μｇの組換えB-Mage1
-Glyc-KDELを２５０ｍＭのＮａＨＣＯ_３及び１０倍モル過剰のＤＴＡＦ（シグマ
社製）に加え、３０分間、室温で逆さまに振って回転させてインキュベートした
。次に０．２ｍＭのＮＨ４Ｃｌを加え、結合させたたんぱく質をＰＤ１０カラム
（ファーマシア社製）で精製した。

【００９７】 内部移行及び免疫蛍光染色 ポリリシン予処理した１２−ｍｍの円形ガラス製カバースリップ上で成長させ
た１０^５Ｂ−ＥＢＶ ＢＭ２１細胞を氷上で４５分間、１μｇ／ｍｌのＤＴＡＦ
標識付組換えB-Mage1-Glyc-KDELと一緒にインキュベートした。洗浄後、細胞を
１時間、３７℃でインキュベートし、３％のパラホルムアルデヒドで１０分間固
定し、サポニン（０．０１％）で透過化し、モノクローナル抗Lamp２抗体H4B4（
サンディエゴ社ファーミンゲン）で染色し、テキサス・レッドに結合させた抗マ
ウスIgG抗体（米国ウェストグローブ、ジャクソン）で顕像させた。

【００９８】 共焦点レーザスキャニング顕微鏡法及び免疫蛍光分析を、アルゴン／クリプト
ンレーザを接続したＤＭ顕微鏡に基づいたＴＣＳ４Ｄ共焦点顕微鏡を用いて行っ
た（Johannes, L. et al., J. Biol. Chem. (1997) 272:19554-19561）。

【００９９】 結果 シガＢ−Mage1及びAntp-Mage1融合たんぱく質の生化学的特徴付け 図１Ａに示すように、活性ＥＲ検索シグナル（テトラペプチドＫＤＥＬ）又は
このシグナルの不活性版（ヘキサペプチドＫＤＥＬＧＬ）を持つＢフラグメント
融合たんぱく質を含有するMage1は、これらの予測される大きさに相当する約１
１．３ｋＤａの分子量で還元条件下で泳動する。モノクローナル抗Ｂフラグメン
ト抗体（１３Ｃ４）を用いたウェスタン・ブロット分析の結果、精製されたシガ
Ｂ融合たんぱく質（図１Ｂ）のすべての同一性が確認された。

【０１００】 二つのシガＢ-Mage1融合たんぱく質は、精製後、既に部分的に開裂しており、
９．５ｋＤａのフラグメントが生じていた（図１Ａ−Ｂ）。しかしながら、Mage
1配列はB-Mage1-Glyc-KDEL及びB-Mage1-Glyc-KDELGL内部にある。このように、
もしＣ末端の開裂が、９．５ｋＤａフラグメントの生成に関係していたとしても
、その分子量から判断されるように、それらにはやはりMage1エピトープが含ま
れている。

【０１０１】 別の融合たんぱく質を構築したが、その中ではMage1ペプチドを、アンテナペ
ディアホメオドメイン（Perez, F. et al., J. Cell. Sci (1992)102717-722）
の第三セグメントを由来とするポリペプチドに融合させた。クーマシーブルー・
ポリアクリルアミドゲル染色法及びウェスタン・ブロット分析の結果、組換えAn
tp-Mage1たんぱく質が１５kDaのポリペプチドとして同定された（図１Ｃ）。

【０１０２】 クラス１分子による外生可溶性シガＢ−Mage1融合たんぱく質の提示：ＫＤＥ
Ｌ配列の役割 内部Mage1エピトープのＭＨＣクラス１提示を駆動する外生シガＢMage1融合た
んぱく質の能力を評価するために、ＰＢＭＣをB-Mage1-Glyc-KDELと一緒にパル
スした。図２に示されるように、これらのＰＢＭＣは、シガＢMage1融合たんぱ
く質を由来とするMage1ペプチドを、ＨＬＡ−Ａ１制限的態様で特異的ＣＴＬに
効率的に提示させた。提示に効率に対するＫＤＥＬシグナルの影響を次にテスト
した。ＫＤＥＬと、ＫＤＥＬＧＬを持つシガＢMage1融合たんぱく質の両方がMag
e1特異的ＨＬＡクラス１制限されたＣＴＬ反応を活性化することができた（図２
）。二つの分子の同様な活性が、異なる濃度の両たんぱく質をテストしたときも
観察された（データは図示せず）。実験中のＰＢＭＣの存在が必要であったが、
それはなぜなら、シガＢ-Mage1融合たんぱく質による直接のＣＴＬ活性化が起き
なかったからである（データは図示せず）。

【０１０３】 以下の例については、BMage1-Glyc-KDELのみを用いたが、それはＫＤＥＬ及び
ＫＤＥＬＧＬを持つシガＢMage1融合たんぱく質の抗原提示能力が同等だったか
らである。

【０１０４】 異なる抗原提示細胞による可溶性ＢMage1-Glyc-ＫＤＥＬたんぱく質のＭＨＣ
クラス１提示の分析 均一の抗原提示細胞を、シガＢ−Mage1融合たんぱく質で感作した。Ｂリンパ
幼若細胞及び樹状細胞をパルスした後、クラス１制限されたMage1特異ＣＴＬの
活性化を実証した（図３）。これらの結果は、二人のＨＬＡ−Ａ１ドナーを由来
とする二つの異なるＢ−ＥＢＶ細胞系（ＥＩＭ２１及びＬＢ７０５）及び樹状細
胞で観察された。０．２μＭと低いシガＢMage1たんぱく質があれば、Mage1ペプ
チド提示のためにＢ−ＥＢＶ細胞及び樹状細胞を感作させるのに充分であった（
図３）。反対に、シガＢ−Mage1融合たんぱく質で試験管内で感作させたＴ細胞
クローンは、自己Ｔ細胞クローンを活性化させられなかった（図３）。この研究
で抗原提示細胞として用いられた８２／３０クローンＴ細胞はＨＬＡ−Ａ１分子
を発現し、合成Mage1ペプチドを提示した（データは図示せず）。

【０１０５】 Ｂリンパ幼若細胞系による外生可溶性シガＢ−Mage1融合たんぱく質を由来と
するMage1ペプチドのＭＨＣクラス１提示の特異性の分析 外生クラス１制限抗原提示経路はＢ−ＥＢＶ細胞ではめったに観察されない（
Rock, K, L., Immunol. Today (1996) 17:131-137; Watts, C., Annu. Rev. Imm
unol. (1997) 15:821-850）。このプロセスにおけるシガ毒素Ｂフラグメントの
役割を実証するために、このＢフラグメントが、ショウジョウバエの転写因子で
あるアンテナペディアホメオドメインの三番目のセグメントにより置換された組
換えたんぱく質を作製した。このドメインは、いくつかのペプチドを真核細胞の
細胞質及び核に転位させることが示されてきた（Perez, F. et al., J. Cell. S
ci (1992)102:717-722）。さらに、外生の抗原をいくつかの細胞種におけるＭＨ
Ｃクラス１プロセッシング経路に狙いうちした（Schutze-Redelmeier, M.P. et
al., J. Immunol. (1996) 157:650-655）。図４Ａに示すように、Mage1ペプチド
の提示は、antp-Mage1融合たんぱく質を用いてＨＬＡ−Ａ１ Ｂ−ＥＢＶ細胞を
パルスした場合には何ら、検出できなかった。ＨＬＡ−Ａ２ハプロタイプのＢ−
ＥＢＶ細胞をシガＢ−Mage1たんぱく質で感作したときには、Mage1特異ＣＴＬの
活性化は何ら観察されなかった（図４Ａ）。この活性化の特異性は、さらにＨＬ
Ａ−Ａ１又はＡ２Ｂ ＥＢＶ細胞をシガＢMage1融合たんぱく質でパルスしたと
きに、Mart1特異的ＣＴＬクローンの刺激がないことでも裏付けられた（図４Ｂ
）。Mage1エピトープのないB-Glyc-ＫＤＥＬはMage1特異的ＣＴＬクローンでは
認識されなかった（図４Ａ）。まとめると、これらのデータは、シガＢ-Mage1融
合たんぱく質を由来とするMage1の特異的ＨＬＡ-Ａ１制限提示を実証するもので
ある。

【０１０６】 Ｂリンパ幼若細胞系による可溶性シガＢ-Mage1融合たんぱく質のＭＨＣクラス
１提示における内部移行及び細胞内プロセッシングの役割 内部ペプチドエピトープをクラス１制限経路に向かわせる組換えシガＢ-Mage1
融合たんぱく質の能力、そしてこのたんぱく質の内部移行に対するその依存性を
テストした。

【０１０７】 パラホルムアルデヒドで固定したＢリンパ幼若細胞は、シガＢ-Mage1由来Mage
1ペプチドの、クラス１制限Mage1特異ＣＴＬクローンへの提示を起こさせなかっ
たが、固定したＢ-ＥＳＢＶ細胞と一緒にインキュベートした外生合成Mage1ペプ
チドはこのＣＴＬを活性化した（図５）。これによって、細胞外シガＢ-Mage1プ
ロセッシングは、観察される外生ＨＬＡクラス制限抗原提示の説明としては除外
された。さらに細胞内輸送又はプロセッシングがこの抗原提示モデルに関与して
いることを実証するために、生合成／分泌経路におけるたんぱく質輸送を遮断す
るブレフェルディンＡ（ＢＦＡ）、又は、エンドソームのｐＨを上げてエンドソ
ームのたんぱく質分解を阻害するクロロキンを用いた。クロロキン又はＢＦＡの
いずれも、外生合成Mage1ペプチドの提示に干渉しなかった（図５Ｂ）。これら
の細胞の抗原提示能力を維持した。対照的に、可溶性シガＢ-Mage1融合たんぱく
質のインキュベーション中にＢＦＡが存在すると、Mage1Ｔ細胞エピトープの提
示が妨げられた（図５Ｃ）。この効果はクロロキンでは観察されなかった。対照
実験では、同じ濃度のクロロキンが、破傷風毒素由来ペプチドのＨＬＡクラス２
制限提示を阻害するのに効果があった（データは図示せず）。

【０１０８】 Ｂ−ＥＢＶ細胞におけるシガＢ−Mage1融合たんぱく質の内部移行： ライソ
ゾームマーカによる共局在化の分析 Ｂ−Mage1-Glyc-ＫＤＥＬのＢ−ＥＢＶ細
胞中での細胞内輸送を追跡するために、このたんぱく質を蛍光体ＤＴＡＦに共有
結合させた。それを氷上で細胞に結合させて１時間３７℃でインキュベートする
と、このたんぱく質は著しい傍核染色を見せて細胞質構造内に内部移行した（図
６）。この染色パターンは、ゴルジ及びＥＲ区画に相当しており、ヒーラ細胞に
関するそれまでの研究と一致していた（Johannes, L. et al., J. Biol. Chem.
(1997) 272:19554-19561）。二重標識免疫蛍光実験でライソゾーム関連膜たんぱ
く質−２（Lamp−２）に対する抗体を用いて（図６Ｂ）、このシガB-Mage1融合
たんぱく質はLamp-2陽性ライソゾーム区画から概ね排除された（図６Ｃ）。

【０１０９】 Ｂ−ＥＢＶ細胞のうち、おおよそ１０から２０％がM-Mage-Glyc-ＫＤＥＬ内部
移行後に中間から強いＢフラグメント特異的染色を呈した。ある一つの集団の中
の細胞間のこのような不均質性については既に説明されて（Sandvig, K. et al.
J. Cell Biol (1994) 126:53-64)おり、細胞周期の機能のうちの毒素レセプタ
発現におけるばらつきが原因である（Pudymaitis, A. and Lingwood, C. A., J.
Cell. Physiol. (1992) 150:632-639）。

【０１１０】 議論 シガ毒素のＢフラグメントに融合させた可溶性ＣＤ８腫瘍抗原がＨＬＡクラス
１制限態様で特異ＣＴＬに効率的に提示されることが実証された。精製された組
換えたんぱく質のうちのいくらか部分的なたんぱく質分解による開裂は観察され
たが、細胞外プロセッシングは以下の理由から想定されない。即ち、ｉ）ＣＴＬ
Mage1エピトープはシガＢ-Mage1融合たんぱく質内部にあり、従って二つ又はそ
れ以上の別々及び特異的な開裂事象が、ＨＬＡ−Ａ１結合Mage1ペプチドを生成
させるには必要であること。シガＢ-Mage1融合たんぱく質を由来とするMage1ペ
プチドの提示が、同じ実験で合成Mage1ペプチドを結合させ、かつ提示する能力
を維持したＴ細胞でなかったことは、細胞外での開裂があったことを割り引く（
図３）；ｉｉｉ）パラホルムアルデヒドで固定した抗原提示細胞は、合成外生Ma
ge1ペプチドを提示することができたが、それでもこれらはシガＢ-Mage1融合た
んぱく質をプロセッシングしなかった。及びｉｖ）ブレフェルディンＡは、可溶
性シガＢ-Mage1たんぱく質を由来とするMage1エピトープの提示を妨げた。ブレ
フェルディンＡは、シガＢ-Mage1の小胞体への輸送（Johannes, L. et al., J.
Biol. Chem. (1997) 272:19554-19561)、及び、プロセッシングされたペプチド
の発生期のクラス１分子の細胞膜への結合及び輸送（Monaco, J.J., Immunol. T
oday (1992) 13:173-179）の両方を阻害するため、その正確な阻害機序は確定さ
れていないままである。しかしながら、ＢＦＡを用いた実験は、シガB-Mage1融
合たんぱく質の内部移行がＨＬＡクラス１制限提示が効率的に行われるには必要
であることを実証するものである。

【０１１１】 等価物 当業者であれば、ごく通常の実験を行うのみで、ここに説明した本発明
の特定の実施例の等価物を数多く認識され、又は確認できることであろう。この
ような等価物は以下の請求の範囲が包含するところとして意図されている。

【図面の簡単な説明】

【図１】 シガＢ−Mage1及びAnt-Mage1融合たんぱくの生化学的特徴付け。シ
ガ毒素（＝Ｂ）又は組換えB-Glyc-KDEL、B-Mage1-Glyc-KDEL、又はB-Mage1-Glyc
-KDELGLたんぱくのＢフラグメントを還元条件下のTris-tricineゲルによる電気
泳動法で分析した。次にこのゲルをクーマシーブルー（Ａ）で染色するか、又は
、シガ毒素（Ｂ）のＢフラグメントを狙ったモノクローナル抗体13C4を用いたウ
ェスタン・ブロット分析で現像した。アンテナペディア−Mage1（Antp-Mage1、C
）融合たんぱく質はクーマシー・ブルー染色（ａ)又は抗His Tag抗体（ｂ）を用
いたウェスタン・ブロット分析で分析した。

【図２】 ＰＢＭＣに対する可溶性シガB-Mage1融合たんぱく質のＭＨＣクラ
ス１の提示。ＫＤＥＬ配列の役割。ＰＢＭＣ（５×１０^４）を一晩、活性（B-Ma
ge1-Glyc-KDEL）又は不活性（B-Mage1-Glyc-KDELGL）ＥＲリトリーバル配列を加
えた、ペプチド１９１age１（１μＭ）又はMart1（１１μＭ）又はシガＢ−Mage
1融合たんぱく質（１μＭ）と一緒にパルスした。洗浄後、２×１０^４のMage1特
異細胞毒性Ｔ細胞を、パルス済みのＰＢＭＣと一緒に２４時間インキュベートし
た。次に上清を採集し、ＩＦＮγ産生についてテストした。このデータは三重±
標準偏差（棒）の中間値であり、少なくとも二つの同様な実験を表したものであ
る。

【図３】 異なる種類の抗原提示細胞による可溶性シガB-Mage1融合たんぱく
質のＭＨＣクラス１の提示。Ｂリンパ球幼若細胞、樹状細胞、及びクローンした
Ｔ細胞を、可溶性シガB-Mage1融合たんぱく質と一緒に図２に示したようにパル
スした。ペプチドMage1の提示を８２／３０ＣＴＬでテストした。

【図４】 Ｂリンパ球幼若細胞系による可溶性B-Mage1融合たんぱく質のＭＩ
ＩＣクラスＩ提示の特異性の分析。Ｂリンパ球幼若細胞系ＢＭ２１（ＨＬＡ−Ａ
１）又はＢ−Ｖ．１（ＨＬＡ−４２）を一晩、媒質のみ、合成ペプチドMage1（
１μＭ）、合成ペプチドMart1（１μＭ）、シガＢ-Mage1融合たんぱく質（１μ
Ｍ）、組換えAntp-Mage1融合たんぱく質、及び野生型シガ毒素Ｂフラグメントと
一緒にパルスした。洗浄後、Mage1特異CTL82/30(A)又はMart1特異ＬＢ３７３Ｃ
ＴＬ（Ｂ）をパルス済みのＢ−ＥＢＶと一緒に２４時間、インキュベートした。
次に上清を採集し、ＩＦＮγ産生についてテストした。このデータは三重±標準
偏差（棒）の中間値であり、少なくとも二つの同様な実験を表したものである。

【図５】 Ｂリンパ球幼若細胞系による可溶性シガＢ−Mage1融合たんぱく質
のＭＨＣクラスＩの提示。内部移行（Ａ）及び細胞内プロセッシング（Ｂ−Ｃ）
の極。Ａ：いくつかの未固定のＢ−ＥＢＶ（ＢＭ２１）をクロロキン（２５０μ
Ｍ）又はブレフェルディンＡ（２μｇ／ｍｌ）で３０分間、予処理してから、４
時間、合成Mage1ペプチド（１μＭ）又はシガＢ-Mage1融合たんぱく質（１μＭ
）又は媒質のみと一緒にパルスした。洗浄後、Mage1特異CTLをパルス済みのＢ−
ＥＢＶと一緒に２４時間、インキュベートした。次に上清を採集し、ＩＦＮγ産
生についてテストした。このデータは三重±標準偏差（棒）の中間値であり、少
なくとも二つの同様な実験を表したものである。

【図６】 B-EBV細胞への内部移行後のシガＢ-Mage1融合たんぱく質局在化の
分析。B-EBV細胞をDTAF標識したB-Mage1-Glyc-KDEL（Ａ）と一緒に氷上で４５分
間インキュベートし、洗浄し、３７℃で１時間放置した。次に細胞をパラホルム
アルデヒドで固定し、サポニンで透過性化し、モノクローナル抗ランプ２抗体（
Ｂ）で染色した。Ｃでは、Ｂフラグメント特異的標識（Ａ）及びランプ２標識（
Ｂ）を上に重ねた。共焦点顕微鏡法で得られた代表的画像を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，Ｇ Ｅ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，Ｚ Ａ，ＺＷ

Claims (46)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ほ乳類における免疫反応が刺激されるように、前記ほ乳類に毒
   素−抗原抱合体を投与するステップを含む、ほ乳類の免疫反応を刺激する方法。
2. 【請求項２】 前記毒素−抗原抱合体が前記ほ乳類に、皮膚又は粘膜を通じて
   経皮的に投与される、請求項１に記載の方法。
3. 【請求項３】 前記毒素−抗原抱合体が、前記ほ乳類の皮膚を通じて経皮的に
   投与される、請求項２に記載の方法。
4. 【請求項４】 前記粘膜が、前記ほ乳類の呼吸管、胃腸管又は生殖管に位置す
   る、請求項２に記載の方法。
5. 【請求項５】 呼吸管の前記粘膜が前記ほ乳類の鼻、喉又は肺の粘膜のうちの
   いずれかから選択される、請求項４に記載の方法。
6. 【請求項６】 胃腸管の前記粘膜が、前記ほ乳類の口、喉、胃、小腸、大腸、
   結腸、尿道、又は直腸の粘膜のうちのいずれかから選択される、請求項４に記載
   の方法。
7. 【請求項７】 前記ほ乳類にアジュバントを投与するステップをさらに含む、
   請求項１に記載の方法。
8. 【請求項８】 前記毒素−抗原抱合体が腫瘍抗原、ウィルス抗原、又は細菌抗
   原を含む、請求項１に記載の方法。
9. 【請求項９】 前記腫瘍抗原が腫瘍溶解産物を由来とする、請求項８に記載の
   方法。
10. 【請求項１０】 前記腫瘍抗原が、肺組織、皮膚組織、乳房組織、胃組織、結
    腸組織、直腸組織又は脳組織を由来とする、請求項９に記載の方法。
11. 【請求項１１】 前記腫瘍抗原がメラノーマ抗原である、請求項８に記載の方
    法。
12. 【請求項１２】 前記毒素−抗原抱合体が、シガ毒素、ベロ毒素、及びコレラ
    Ｂ毒素のうちのいずれかから選択される毒素を含む、請求項１に記載の方法。
13. 【請求項１３】 前記毒素がベロ毒素又はそのフラグメントである、請求項１
    ２に記載の方法。
14. 【請求項１４】 前記ベロ毒素がベロ毒素Ｂである、請求項１３に記載の方法
    。
15. 【請求項１５】 前記毒素−抗原抱合体が組換えにより生成される、請求項１
    に記載の方法。
16. 【請求項１６】 前記毒素−抗原抱合体が非共有的相互作用又は共有結合を通
    じて結び付けられている、請求項１に記載の方法。
17. 【請求項１７】 前記共有結合が臭化シアン結合である、請求項１６に記載の
    方法。
18. 【請求項１８】 前記非共有的相互作用が、たんぱく質対たんぱく質相互作用
    、疎水性相互作用、ファンデルワールス相互作用、又はイオン相互作用である、
    請求項１６に記載の方法。
19. 【請求項１９】 前記毒素−抗原抱合体が、さらに、活性又は不活性小胞体検
    索シグナルを含む、請求項１に記載の方法。
20. 【請求項２０】 前記毒素−抗原抱合体がベロ毒素Ｂ及び腫瘍抗原を含む、請
    求項１に記載の方法。
21. 【請求項２１】 前記免疫反応が樹状細胞の刺激を含む、請求項１に記載の方
    法。
22. 【請求項２２】 前記樹状細胞がランゲルハンス細胞を含む、請求項２１に記
    載の方法。
23. 【請求項２３】 前記ほ乳類がヒトである、請求項１に記載の方法。
24. 【請求項２４】 前記毒素−抗原抱合体が前記ほ乳類に非侵襲的に投与される
    、請求項１に記載の方法。
25. 【請求項２５】 ほ乳類において、抗原が関連する状態を治療する方法であっ
    て、 前記ほ乳類に対し、有効量の前記抗原−毒素抱合体を投与するステップと、 前記ほ乳類の免疫反応を刺激するステップと、 それによって前記ほ乳類の前記抗原が関連する状態を治療するステップと を含む、方法。
26. 【請求項２６】 前記毒素−抗原抱合体が前記ほ乳類に、前記ほ乳類の皮膚又
    は粘膜を通じて経皮的に投与される、請求項２５に記載の方法。
27. 【請求項２７】 前記毒素−抗原抱合体が、前記ほ乳類の皮膚を通じて経皮的
    に投与される、請求項２６に記載の方法。
28. 【請求項２８】 前記粘膜が、前記ほ乳類の呼吸管、胃腸管又は生殖管内に位
    置する、請求項２６に記載の方法。
29. 【請求項２９】 前記抗原が関連する状態が、感染又は腫瘍である、請求項２
    ５に記載の方法。
30. 【請求項３０】 前記腫瘍が皮膚腫瘍、脳腫瘍、肺腫瘍、結腸腫瘍、肺腫瘍、
    直腸腫瘍、又は乳房腫瘍である、請求項２９に記載の方法。
31. 【請求項３１】 前記腫瘍がメラノーマ腫瘍である、請求項２９に記載の方法
    。
32. 【請求項３２】 前記毒素−抗原抱合体がメラノーマ腫瘍抗原を含む、請求項
    ２５に記載の方法。
33. 【請求項３３】 前記ほ乳類がヒトである、請求項２５に記載の方法。
34. 【請求項３４】 アジュバントを投与するステップをさらに含む、請求項２５
    に記載の方法。
35. 【請求項３５】 前記ほ乳類が、前記抗原が関連する状態に苦しんでいる、請
    求項２５に記載の方法。
36. 【請求項３６】 前記ほ乳類が、前記抗原が関連する状態に苦しんでいない、
    請求項２５に記載の方法。
37. 【請求項３７】 前記毒素−抗原抱合体が非侵襲的に投与される、請求項２５
    に記載の方法。
38. 【請求項３８】 毒素−抗原抱合体及び薬学的に容認可能な担体を含む、薬剤
    組成。
39. 【請求項３９】 前記組成が、前記ほ乳類の皮膚又は粘膜を通じて経皮的にほ
    乳類に投与するのに適している、請求項３８に記載の薬剤組成。
40. 【請求項４０】 前記組成が、前記ほ乳類の皮膚を通じて経皮的に投与するの
    に適している、請求項３９に記載の薬剤組成。
41. 【請求項４１】 前記粘膜が、前記ほ乳類の呼吸管、胃腸管又は生殖管に位置
    する、請求項３９に記載の薬剤組成。
42. 【請求項４２】 前記毒素−抗原抱合体がメラノーマ抗原を含む、請求項３８
    に記載の薬剤組成。
43. 【請求項４３】 前記薬学的に容認可能な担体が、経口、経皮、又は気管支内
    投与するのに適している、請求項３８に記載の薬剤組成。
44. 【請求項４４】 前記抗原抱合体がベロ毒素を含む、請求項３８に記載の薬剤
    組成。
45. 【請求項４５】 前記ベロ毒素がベロ毒素Ｂである、請求項４４に記載の薬剤
    組成。
46. 【請求項４６】 前記薬学的に容認可能な担体が、非侵襲的投与に適している
    、請求項３８に記載の薬剤組成。