ES2255269T3 - Subunidad b de la verotoxina para inmunizacion. - Google Patents

Abstract

El uso de un conjugado toxina-antígeno en el que la toxina del conjugado toxina-antígeno es la subunidad B de la toxina Shiga o la subunidad B de verotoxina, para la fabricación de un medicamento para estimular una respuesta inmunitaria contra el antígeno en un humano, en el que el medicamento que comprende el conjugado toxina-antígeno es para ser administrado a dicho humano de forma que se esti mula una respuesta inmunitaria en dicho humano contra el antígeno.

Description

Subunidad B de la verotoxina para inmunización.

Antecedentes de la invención

Las células dendríticas son centinelas del sistema inmunitario. Se originan a partir de un precursor en la médula ósea, viajan por la sangre y se colocan en tejido no linfoide, p.ej. piel. Las células dendríticas captan y procesan antígenos exógenos para la presentación como complejos péptido-MHC en la superficie celular, y después migran por la sangre y linfa aferente a los nódulos linfáticos secundarios. En los nódulos linfáticos, interaccionan con linfocitos T para facilitar la activación de los linfocitos T cooperadores y citotóxicos (Steinman, R. (1991) Annu. Rev. Immunol. 9:271; Cella et al. (1997) Curr. Opin. Immunol. 9:10).

Las células dendríticas se han nombrado según su aspecto y distribución en el cuerpo. Por ejemplo, las células dendríticas localizadas en la epidermis se conocen como células de Langerhans. Las células dendríticas localizadas en la dermis e intersticio se conocen como células dendríticas intersticiales. Las células dendríticas sanguíneas, veladas y linfoides se encuentran, respectivamente, en el sistema circulatorio, en la linfa aferente y en los nódulos linfáticos. Las células dendríticas se han caracterizado además por el linaje, por la etapa de maduración, por las características funcionales y fenotípicas de estas etapas, y por los mecanismos implicados en su migración y función (Cella et al., anteriormente mencionado; Austyn, J. (1996) J. Exp. Med. 183:1287).

Trabajos recientes han demostrado que la toxina del cólera puede actuar como un potente adyuvante transcutáneo en la inmunización no invasiva transcutánea en ratones (Glenn, G. M. et al. Nature (1998) 391: 851). La toxina del cólera aplicada a la superficie de la piel estimula una fuerte respuesta inmunitaria a los antígenos coadministrados, tales como los toxoides diftérico o tetánico. Este método es particularmente importante, dada la gran superficie de piel y la existencia de células inmunitarias potentes en ella (véase, p.ej., Bos, J. D., Clin. Exp. Immunol., 107 (Supl. 1),
3-5, 1997).

Los estudios con la toxina del cólera sugieren que la holotoxina aumenta la presentación de péptidos solubles sobre los macrófagos, sin embargo ésta inhibió el procesamiento intracelular de antígenos solubles o bacterianos. Por contraste, la subunidad B recombinante aumentó la presentación superficial de los antígenos, pero no inhibió el procesamiento intracelular (Matousek, M. P., J. G. Nedrud y C. V. Harding, J. Immunol., 156, 4137-4145, 1996). Los estudios en animales han demostrado también la potente capacidad de las células dendríticas para inducir inmunidad antitumoral (Nestle, F. O. et al. Nature Medicine, 4:328-332, 1998).

El documento EP-A-0 532 090 se dirige a proteínas híbridas recombinantes que tienen dos componentes primarios. El primer componente es una toxina bacteriana modificada que tiene capacidad de translocación, mientras el segundo componente es un polipéptido o proteína que es exógeno para una célula presentadora de antígenos. El híbrido tiene la capacidad de ser interiorizado por una célula presentadora de antígenos, en la que el híbrido se procesa posteriormente y se presenta un segmento antigénico del híbrido en la superficie de la célula presentadora de antígenos, donde el segmento provoca una respuesta inmunitaria por los linfocitos T citotóxicos.

El documento WO 98/11229 A se dirige al aislamiento y purificación de toxinas Shiga, una toxina asociada con CH y con la secuela potencialmente mortal SUH trasmitida por cepas de bacterias patógenas, marcadas con histidina (marcadas con His) biológicamente e inmunológicamente activas. Se describe cómo el marcado con His simplifica enormemente y acelera la purificación de toxinas Shiga, y describe un método mejorado para tal purificación. Se describe la obtención y el uso de toxoides Shiga que son inmunorreactivos pero atóxicos. También se describe la obtención y uso de proteínas de fusión de toxinas o toxoides Shiga marcadas con His. Por último, se describe la obtención y uso de anticuerpos para toxinas, toxoides o proteínas de fusión toxina/toxoide Shiga marcadas
con His.

El documento WO 96/16178 A se dirige a inmunógenos para estimular la inmunidad mucosa hacia patógenos capaces de infectar a su hospedador por medio del contacto con membranas mucosas mamíferas. El particular, se describen varios polipéptidos y construcciones genéticas que incluyen un polipéptido de unión a membrana unido de forma operable a un péptido de un patógeno. Se detallan métodos para introducir estos inmunógenos en un mamífero para estimular respuestas inmunitarias mucosas.

La invención se refiere al uso de un conjugado toxina-antígeno, en el que la toxina del conjugado toxina-antígeno es la subunidad B de la toxina Shiga o la subunidad B de verotoxina, para la fabricación de un medicamento para estimular una respuesta inmunitaria contra el antígeno en un humano, en el que el medicamento que comprende el conjugado toxina-antígeno se administra a dicho humano de forma que se estimula una respuesta inmunitaria en dicho humano contra el antígeno. Las características preferidas de este uso se definen en las reivindicaciones 2 a 5. En otro aspecto, la invención se refiere al uso de un conjugado toxina-antígeno en el que la toxina del conjugado toxina-antígeno es la subunidad B de la toxina Shiga o la subunidad B de verotoxina para la fabricación de un medicamento, en el que el medicamento que comprende el conjugado toxina-antígeno es para tratar un estado asociado a antígeno en un mamífero, que comprende: administrar a dicho mamífero una cantidad efectiva de dicho conjugado toxina-antígeno, estimular una respuesta inmunitaria en dicho mamífero contra el antígeno, y por ello tratar dicho estado asociado a antígeno en dicho animal, en el que dicho estado asociado a antígeno es un tumor o una infección. Las características preferidas de este uso se definen en la reivindicación 7. En un aspecto adicional, la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende un conjugado toxina-antígeno, en la que la toxina del conjugado toxina-antígeno es la subunidad B de verotoxina, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Las características preferidas de esta composición se definen en la reivindicación 9.

También se describen métodos para estimular una respuesta inmunitaria en un mamífero, administrando al mamífero un conjugado toxina-antígeno de forma que se estimula una respuesta inmunitaria en el mamífero. Preferiblemente, el conjugado toxina-antígeno se administra al mamífero de forma transcutánea a través de la piel o de una membrana mucosa.

En una realización ventajosa, el conjugado toxina-antígeno incluye, por ejemplo, un antígeno tumoral, un antígeno viral o un antígeno bacteriano. El antígeno tumoral puede derivar de tejido de pulmón, tejido de piel, tejido de mama, tejido de estómago, tejido de colon, tejido rectal o tejido de cerebro. En una realización preferida, el antígeno tumoral es, por ejemplo, de un melanoma. De forma ventajosa, el conjugado toxina-antígeno de la invención puede incluir una toxina tal como una toxina Shiga, una verotoxina o una toxina B del cólera. Preferiblemente, la toxina es el fragmento B de verotoxina.

También se describe un método para tratar un estado asociado a antígeno en un mamífero, administrando al mamífero una cantidad efectiva de un conjugado antígeno-toxina y estimulando una respuesta inmunitaria en el mamífero. Preferiblemente, el conjugado toxina-antígeno se administra al mamífero de forma transcutánea a través de la piel o de una membrana mucosa, p.ej. una membrana mucosa localizada en el tracto respiratorio, tracto gastrointestinal o tracto reproductivo del mamífero. En un método particularmente preferido, el mamífero es un humano. De forma ventajosa, se puede administrar también un adyuvante con el conjugado de la invención.

La invención también está relacionada con una composición farmacéutica que comprende un conjugado toxina-antígeno y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Preferiblemente, la composición es adecuada para administración al mamífero de forma transcutánea a través de la piel o de una membrana mucosa. De forma ventajosa, el vehículo farmacéuticamente aceptable es adecuado para administración oral, transdérmica o intrabronquial. Preferiblemente, la composición farmacéutica es adecuada para administración no invasiva.

La presente invención se refiere a proteínas recombinantes, tales como conjugados toxina-antígeno, que comprenden un fragmento atóxico de unión a receptor de una toxina, p.ej. una toxina Shiga o una subunidad B de verotoxina, y un epítopo de un antígeno tumoral, p.ej. Mage 1.

Los conjugados toxina-antígeno se pueden usar, por ejemplo, para estimular una respuesta inmunitaria en un mamífero, o para tratar un estado asociado a antígeno en un mamífero. Los conjugados toxina-antígeno también se pueden usar para presentar antígenos en células presentadoras de antígenos y para la formulación de composiciones farmacéuticas.

Breve descripción de las figuras

Figura 1: Caracterización bioquímica de las proteínas de fusión Shiga B-Mage 1 y Ant-Mage 1. El fragmento B de la toxina Shiga (=B) o de las proteínas recombinantes B-Glyc-KDEL, B-Mage1-Glyc-KDEL, o B-Mage1-Glyc-KDELGL se analizó mediante electroforesis en geles de Tris-tricina en condiciones reductoras. Los geles se tiñeron después con azul de Coomassie (A) o se revelaron mediante análisis de transferencia de Western con el anticuerpo monoclonal 13C4 dirigido contra el fragmento B de la toxina Shiga (B). La proteína de fusión Antennapedia-Mage 1 (Antp-Mage 1, C) se analizó mediante tinción con azul de Coomassie (a) o análisis de transferencia de Western con anticuerpo anti-marca de His (b).

Figura 2: Presentación por el MHC de clase I de proteínas de fusión solubles Shiga B-Mage 1 a CMSP: papel de la secuencia KDEL. Se pulsaron CMSP (5x10^{4}) durante la noche con péptido Mage 1 (1 \muM) o las proteínas de fusión Mart 1 (11 \muM) o Shiga B-Mage 1 (1 \muM) con secuencia de reenvío al RE activa (B-Mage 1-Glyc-KDEL) o inactiva (B-Mage 1-Glyc-KDELGL). Después de lavar, se incubaron 2x10^{4} células T citotóxicas específicas de Mage 1 (clon B2/30) con las CMSP pulsadas durante 24 horas. Después se recogieron los sobrenadantes y se analizó la producción de IFN\gamma. Los datos son las medias de triplicados \pm desviación estándar (barras) y son representativos de al menos dos experimentos similares.

Figura 3: Presentación por el MHC de clase 1 de la proteína soluble de fusión Shiga B-Mage 1 por diferentes tipos de células presentadoras de antígenos. Se pulsaron células linfoblastoides B, células dendríticas y células T clonadas como se describió en la Figura 2 con proteína soluble de fusión Shiga B-Mage 1. Se analizó la presentación del péptido Mage 1 con LTC 82/30.

Figura 4: Análisis de la especificidad de la presentación por el MHC de clase I de la proteína soluble de fusión Shiga B-Mage 1 por líneas celulares linfoblastoides B. Se pulsaron las líneas celulares linfoblastoides B BM21 (HLA-A1) o B-V.1 (HLA-A2) durante la noche con medio solo, péptido sintético Mage-1 (1 \muM), el péptido sintético Mart 1 (1 \muM), la proteína de fusión Shiga B-Mage 1 (1 \muM), la proteína de fusión recombinante Antp-Mage 1, y el fragmento B de la toxina Shiga de tipo natural. Después de lavar, se incubaron durante 24 horas LTC 82/30 específicos de Mage 1 (A) o LTC LB 373 específicos de Mart 1 (B) con las B-VEB pulsadas. Después se recogieron los sobrenadantes y se analizó la producción de IFN\gamma. Los datos son medias de triplicados \pm desviación estándar (barras), y son representativos de al menos dos experimentos similares.

Figura 5: Presentación por el MHC de clase 1 de proteína soluble de fusión Shiga B-Mage 1 mediante líneas celulares linfoblastoides B. Polo de interiorización (A) y procesamiento intracelular (B-C): A: La línea celular linfoblastoide B fijada en paraformaldehído (BM21) se pulsó durante la noche con péptido sintético Mage 1 (1 \muM), proteína de fusión Shiga B-Mage 1 (1 \muM) o medio solo. Después de lavar, los LTC específicos de Mage 1 se incubaron durante 24 horas con las B-VEB pulsadas. Después se recogieron los sobrenadantes y se analizó la producción de IFN\gamma. B y C: Algunas B-VEB (BM21) sin fijar se pretrataron con cloroquina (250 \muM) o Brefeldina A (2 \mug/ml) durante 30 min antes de que se pulsasen durante 4 horas con péptido sintético Mage 1 (1 \muM) o proteína de fusión Shiga B-Mage 1 (1 \muM) o medio solo. Después de lavar, se incubaron durante 24 horas LTC específicos de Mage 1 con las B-VEB pulsadas. Después se recogieron los sobrenadantes y se analizó la producción de IFN\gamma. Los datos son medias de triplicados \pm desviación estándar (barras), y son representativos de al menos dos experimentos similares.

Figura 6: Análisis de la localización de la proteína de fusión Shiga B-Mage 1 después de la interiorización en células B-VEB. Las células B-VEB se incubaron con B-Mage 1-Glyc-KDEL marcado con DTAF (A) en hielo durante 45 min, se lavaron y se dejaron durante 1 hora a 37°C. Las células se fijaron después con paraformaldehído, se permeabilizaron con saponina y se tiñeron con un anticuerpo monoclonal anti-lamp-2 (B). En C, se superpone el marcado específico del fragmento B (A) y el marcado de Lamp-2 (B). Se muestran las imágenes representativas obtenidas mediante microscopia confocal.

Descripción detallada de la invención

La presente invención está relacionada, al menos en parte, con composiciones farmacéuticas y métodos para estimular una respuesta inmunitaria. La invención se caracteriza por una proteína recombinante, p.ej. un conjugado toxina-antígeno, que comprende un antígeno o un epítopo de antígeno, p.ej. Mage 1, que está asociado, p.ej. mediante enlace covalente, a una toxina, p.ej. una toxina Shiga o una verotoxina B. En una realización preferida, las composiciones farmacéuticas son adecuadas para la administración transcutánea a través de la piel o de una membrana mucosa, p.ej. del sistema respiratorio, del sistema gastrointestinal o del sistema reproductor.

El término "antígeno" incluye agentes que provocan una respuesta inmunitaria de forma independiente, y aquellos que son capaces de provocar una respuesta inmunitaria cuando se incorporan en un conjugado de la invención. La expresión "epítopo de antígeno" incluye los fragmentos de proteínas capaces de determinar la antigenicidad. Un epítopo puede comprender, por ejemplo, un péptido de seis a ocho residuos de longitud (Berzofsky, J. y I. Berkower, (1993) en Paul, W., Ed., Fundamental Immunology, Raven Press, N.Y., p. 246). Algún epítopo puede ser significativamente mayor. La afinidad de una molécula de anticuerpo por su epítopo relacionado oscila de una afinidad baja, p.ej. 10^{-6} M, a una alta, p.ej. 10^{-11} M.

Por ejemplo, los antígenos incluyen proteínas y otras moléculas que están asociadas de forma específica a las superficies de tipos particulares de células cancerosas, p.ej. células tumorales. Muchas formas de cáncer se pueden caracterizar por la producción de proteínas asociadas con esa forma de la enfermedad, y no se encuentran en tejido normal. A menudo estas proteínas se usan en una etapa específica del desarrollo embrionario, y no se observan durante la vida adulta normal. Estos antígenos son particularmente útiles como fuente de epítopos para vacunas antineoplásicas. Los ejemplos de antígenos tumorales que se prevén como antígenos para los conjugados de la presente invención incluyen aquellos que corresponden a tumores malignos que afectan a la mama, ovario, pulmón, piel y cerebro. Por ejemplo, los tumores de mama se pueden caracterizar por receptores expresados de forma anormal, p.ej. los de la familia de receptores de EGF humano (HER). Además, la proteína nestina, que se expresa en células precursoras neuroepiteliales durante el desarrollo fetal mamífero normal, también se expresa en tumores del sistema nervioso central, que incluyen la mayor parte de las formas de cáncer de cerebro (McKay, D. G. Ronald, patente de EE.UU. Nº 5.338.839, 16/8/94). También se expresa en melanomas que se encuentran en la piel y en los que han metastatizado a otros tejidos (V. A. Florenes, R. Holm, O. Myklebost, U. Lendahl, O. Fodstad, 1994, Cancer Res. 54: 354-6). La presente invención contempla incorporar estos antígenos o epítopos de estos antígenos en los compuestos de la invención. Preferiblemente, los antígenos de los conjugados toxina-antígeno de la invención son péptidos asociados a melanoma que se pueden derivar, por ejemplo, de forma recombinante o a partir de lisado de células tumorales.

Otros ejemplos de tumores que expresan los antígenos contemplados por la presente invención incluyen tumor de Wilm (A. J. Buckler, K. M. Call, T. M. Glaser, D. A. Haber, D. E. Housman, C. Y. Ito, J. Pelletier, Rose, E. A. Rose, patente de EE.UU. nº 5.350.840), cáncer gastrointestinal (R. Fishel et al., solicitud internacional WO 95/14085, 26/05/95), tumores malignos caracterizados por el desarrollo de resistencia múltiple a fármacos durante la quimioterapia (J. M. Croop et al., patente de EE.UU. nº 5.198.344), y tumores malignos caracterizados por la presencia de al menos uno de un gran número de oncogenes bien conocidos para los técnicos expertos, tales como Rb, ras, y c-myc, cuyas secuencias están disponibles para el análisis para los expertos en la técnica.

De forma alternativa, los antígenos de la invención pueden estar asociados a las superficies o productos de secreción de microorganismos o patógenos. El término "patógeno" pretende incluir los organismos que provocan trastornos, tales como los trastornos producidos por una o más especies particulares de bacterias, virus, hongos y protozoos que son organismos productores de enfermedad. Los ejemplos de patógenos incluyen especies bacterianas gramnegativas tales como Escherichia coli de serotipo 0157:H7, Helicobacter pylori, H. mustelae, Haemophilus influenzae y H. ducreyi, Pseudomonas aeruginosa, Shigella dysenteria, Salmonella typhi y S. paratyphi; especies bacterianas granpositivas tales como Mycobacterium tuberculosis, M. leprae, Clostridium tetani, Staphylococcus aureus, y Streptococcus hemolyticus; organismos bacterianos intracelulares obligados tales como las especies Rickettsia y Chlamydia; retrovirus, que son los virus que contienen ARN que usan transcripción inversa para sintetizar ADN complementario, que incluyen, pero no se limitan a, VIH-1 y 2; otros virus patógenos tales como VHS-I y II, virus de hepatitis ni A, ni B, ni C, poxvirus, y virus de la rabia; hongos tales como las especies Candida y Aspergillus; protozoos tales como Cryptosporidium parvum, Entamoeba histolytica y Giardia lamblia; y patógenos animales tales como el virus de la enfermedad de Newcastle. La obtención de epítopos únicos a partir de estos organismos cribando las proteínas y analizando los péptidos in vitro es conocida para los expertos en la técnica; se han descrito muchos ejemplos y se puede tener acceso a la secuencia de aminoácidos apropiada en Genbank.

El término "infección" pretende incluir la persistencia y crecimiento de un patógeno en un sujeto hospedador. Aunque los síntomas usados para diagnosticar la presencia de infección incluyen fiebre, inflamación, dolor, sensaciones articulares y musculares en, o cerca de, los focos de infección, la ausencia de uno o más de estos síntomas no excluye la infección en un organismo hospedador. El término "inflamación" indica un conjunto de reacciones del hospedador que acompañan a la infección, y también puede estar presente en ausencia de infección, por ejemplo, como síntoma de reacciones autoinmunes, enfermedades degenerativas, trastornos del remodelado tisular, exposición a alérgenos, y/o otros trastornos. Las respuestas inflamatorias incluyen procesos celulares tales como desgranulación de neutrófilos, mastocitos y basófilos con liberación asociada de proteasas, histaminas y generación de superóxido, y producción de, y respuesta a, citocinas tales como interferones y factor de necrosis tumoral.

Un tipo de antígeno puede ser un alérgeno. Un "alérgeno" se refiere a una sustancia que puede inducir una respuesta alérgica o asmática en un sujeto susceptible. El número de alérgenos que provocan una respuesta sensible en una proporción de una población es enorme, e incluye pólenes, venenos de insectos, caspa de animales, proteínas de ácaros del polvo, esporas de hongos y fármacos (p.ej. penicilina). Los ejemplos de alérgenos naturales de animales y plantas incluyen proteínas específicas para los siguientes géneros: Felis (Felis domesticus); Canis (Canis familiaris); Dermatophagoides (p.ej. Dermatophagoides farinae); Periplaneta (p.ej. Periplaneta americana); Ambrosia (Ambrosia artemiisfolia; Lolium (p.ej. Lolium perenne o Lolium multiflorum); Cryptomeria (Cryptomeria japonica); Alternaria (Alternaria alternata); Alnus (Alnus gultinosa); Betula (Betula verrucosa); Quercus (Quercus alba); Olea (Olea europa); Artemisia (Artemisia vulgaris); plantago (p.ej. plantago lanceolata); parietaria (p.ej. Parietaria officinalis o Parietaria judaicas); Blattella (p.ej. Blattella germanica); Apis (p.ej. Apis multiflorum); Cupressus (p.ej. Cupressus sempervivens, Cupressus arizonica y Cupressus macrocarpa); Juniperus (p.ej. Juniperus sabinoides, Juniperus virginiana, Juniperus communis y Juniperus ashei); Thuya (p.ej. Thuya orientalis), Chamaecyparis (p.ej. Chamaecyparis obtusa); Agropyron (p.ej. Agropyron repens); Secale (p.ej. Secale cereale); Triticum (p.ej. Triticum aestivum); Dactylis (p.ej. Dactylis glomerata); Festuca (p.ej. Festuca elatior); Poa (p.ej. Poa pratensis o Poa compressa); Avena (p.ej. Avena sativa); Holcus (p.ej. Holcus lanatus); Anthoxanthum (p.ej. Anthoxanthum odoratum); Arrhenatherum (p.ej. Arrhenatherum elatius); Agrostis (p.ej. Agrostis alba); Phleum (p.ej. Phleum pratense); Phalaris (p.ej. Phalaris arundinacea); Paspalum (p.ej. Paspalum notatum); Sorghum (p.ej. Sorghum halepensis); y Bromus (p.ej. Bromus inermis). Un "estado asociado a alérgeno" incluye los estados que son el resultado de una respuesta alérgica o asmática a un alérgeno.

El término "toxina" incluye los compuestos que son capaces de facilitar una respuesta inmunitaria al antígeno. Las toxinas ejemplares incluyen la cadena b del cólera, toxinas Shiga, y preferiblemente toxinas similares a Shiga, p.ej. verotoxina. La toxina Shiga es una toxina proteica bacteriana de la familia de subunidades AB_{5} que es segregada por Shygella dysenteriae. La subunidad A inhibe la biosíntesis de proteínas en células eucarióticas superiores después de la transferencia al citoplasma modificando un residuo conservado del rARN 28S. La subunidad B, un homopentámero (%-B fragmentos), es responsable de la unión de la toxina y de la interiorización en las células diana mediante la interacción con el glicolípido Gb_{3} que se encuentra en la membrana plasmática de estas células. El fragmento B no es tóxico, pero conserva las características de transporte intracelular de la holotoxina, que en muchas células que expresan Gb_{3} es transportada de una manera retrógrada desde la membrana plasmática por medio de endosomas a la ruta biosintética/secretora.

En un aspecto, la toxina es una toxina similar a Shiga, p.ej. verotoxina. Las verotoxinas conocidas actualmente incluyen verotoxina 1, verotoxina 2, verotoxina 2c y verotoxina 2e de las toxinas de subunidades elaboradas por algunas cepas de E. coli. Estas toxinas están implicadas en la etiología del síndrome urémico hemolítico y de la colitis hemorrágica. La citotoxicidad celular está mediada por la unión de la subunidad B de la holotoxina al glicolípido receptor, globotriaosilceramida, en las células sensibles. De forma ventajosa, la toxina de la invención es atóxica, p.ej. toxina Shiga B o verotoxina B.

El término "asociado" incluye enlaces covalentes entre la toxina y el antígeno. Los enlaces covalentes preferidos incluyen, por ejemplo, enlaces peptídicos y activación mediante bromuro de cianógeno. El término también incluye interacciones proteína-proteína, interacciones hidrofóbicas, interacciones de Van der Waals e interacciones iónicas. Los ejemplos incluyen conjugados que comprenden biotina.

Preferiblemente, el conjugado toxina-antígeno se produce de forma recombinante. Los métodos para producir compuestos de la invención de forma recombinante son bien conocidos para el técnico experto, y se elaboran en el Ejemplo.

En una realización adicional, el conjugado toxina-antígeno puede comprender además una señal de reenvío al retículo endoplásmico activa o inactiva. La expresión "señal de reenvío al retículo endoplásmico" incluye secuencias peptídicas que aumentan la capacidad de un conjugado de la invención para interaccionar con las células implicadas en la respuesta inmunitaria. Un ejemplo de una señal activa de reenvío al retículo endoplásmico es KDEL, que puede, por ejemplo, unirse de forma ventajosa al extremo C-terminal de la toxina. Un ejemplo de una señal de reenvío al retículo endoplásmico inactiva adecuada es KDELGL. De forma ventajosa, KDELGL se une al extremo C-terminal de la toxina.

En una realización particularmente preferida, el conjugado toxina-antígeno de la invención comprende verotoxina B y un antígeno tumoral, p.ej. un péptido asociado a melanoma. De forma ventajosa, el conjugado se puede producir de forma recombinante.

También se describe un método para estimular una respuesta inmunitaria en un mamífero administrando a un mamífero un conjugado toxina-antígeno. Preferiblemente, la estimulación de la respuesta inmunitaria incluye la implicación de células dendríticas, p.ej. células de Langerhans. La expresión "respuesta inmunitaria" incluye cualquier respuesta inmunológica del mamífero al conjugado de la invención. De forma ventajosa, la respuesta inmunitaria puede incluir, por ejemplo, la promoción de células T, la generación de anticuerpos contra el antígeno, y/o la presentación del antígeno por las células dendríticas, p.ej., preferiblemente, células de Langerhans. La expresión incluye cualquier respuesta del sistema inmunológico del mamífero al conjugado de la invención. El término "estimular" incluye, por ejemplo, la iniciación o la potenciación de una respuesta inmunitaria.

El procesamiento y la presentación de antígenos a los linfocitos T son sucesos críticos en el desarrollo de una respuesta inmunitaria. Como norma general, las moléculas del complejo principal de histocompatibilidad (MHC) de clase I presentan epítopos peptídicos endógenos, derivados principalmente de proteínas citosólicas y nucleares a linfocitos T CD8+ (LTC) (Monaco, J. J. Immunol. Today (1992) 13: 173-179; Heemels, M. T. y Ploagh, H., Annu. Rev. Biochem. (1995) 64: 463491), mientras los péptidos derivados de proteínas exógenas se generan en la ruta endocítica y se presentan en las moléculas del MHC de clase II a los linfocitos T CD4 (Janeway, C. A. Jr., et al., Inf. Rev. Imunol. (1993) 10:301-311; Pieters, J., Curr. Opin. Immunol. (1997) 9:89-96). Sin embargo, diferentes informes han mostrado que los antígenos endógenos propios expresados por tejidos normales o tumorales se pueden procesar de forma eficaz por medio de una ruta restringida de clase I exógena para la presentación a las célu-
las T CD8+.

En ratones transgénicos que expresan una forma asociada a membrana de ovoalbúmina (OVA) solamente en las células de los islotes pancreáticos y en las células tubulares renales, los péptidos derivados de OVA se presentan de una manera restringida de clase I mediante células originarias de la médula ósea en el nódulo linfático de drenaje del riñón o del páncreas (Kurts, C., et al. J. Exp. Med. (1996) 184:923-930). Huang et al. demostraron que la sensibilización de las células T a los antígenos tumorales restringidos del MHC de clase I necesitaba la transferencia y procesamiento de estos antígenos desde las células tumorales a las células presentadoras de antígenos derivadas de médula ósea (Huang, A. Y., et al. Science (1994) 264: 961-965). A pesar de estos argumentos que demuestran la presentación en el contexto de las moléculas del MHC de clase I y la generación de LTC por medio de una ruta de procesamiento exógena, la mayor parte de los estudios no fueron capaces de demostrar la presentación o inducción restringida de clase I in vitro eficaz de LTC in vivo con antígenos solubles exógenos extraños (Moore, M. W., et al., Cell (1988) 54: 777-785; Rock, K, L., Immunol. Today (1996) 17:131-137; Watts, C., Annu. Rev. Immunol. (1997)
15:821-850).

Ya que los LTC son un componente importante de las respuestas inmunitarias protectoras y terapéuticas hacia infecciones virales y tumores (Sabzovari, H. et al. Cancer. Res. (1993) 53:4933-4937; Rosenburg, S. A., et al. J. Natl. Cancer. Inst. (1994) 86:1159-1166; Stevenson. P. G., et al. Virology (1997) 232:158-166; Feltkarnp, M. C. Eur. J. Immunol. (1995) 25:2638-2642), se han desarrollado diferentes estrategias para permitir la presentación y estimulación restringida por el MHC de clase I de LTC por antígenos solubles exógenos.

Los vectores vivos recombinantes tales como Vaccinia, Listeria o Salmonella que expresan antígenos virales o tumorales llevaron de forma eficaz estos antígenos al citosol, y permitieron por ello su introducción en la ruta de presentación restringida de clase I y la sensibilización de LTC in vivo (Gao, X. M. et al. Infect. Immunity (1992) 60:3780-3789; Pan, Z. K. et al. Cancer. Res. (1995) 55:4776-4779; Tsang, K. Y. et al., J. Natl. Cancer. Inst. (1995) 87:952-990). Sin embargo, el uso de vectores similares posee riesgos para el receptor debido a la patogenicidad potencial de los vectores utilizados, especialmente en pacientes inmunodeprimidos, tales como pacientes de cáncer e infectados con el VIH (Kavanaugh, D. Y. et al. Hematol. Oncol. Clin. North. Arnenca (1996) 10:927-951; Redfield, R. R. et al. N. Eng. J. Med. (1987) 316:673-676).

Otras aproximaciones que usan antígenos particulados unidos a esferas de látex (Kovacsovics-Bankowski, M. et al., Pro. Nat. Acad. Sci. USA (1993) 90:4942-4946; Harding, C. V. et al. J. Immnunol. (1994) 153:4925-4933), fusionados con liposomas (Nair, S., et al., J. Exp. Med. (1992) 175:609-612) o asociados con adyuvantes (Ke, Y. et al. Eur. J. Immunol. (1995) 25:549-553; Lipford, G. B. et al. Eur. J. Immunol. (1997) 27:2340-2344) lograron introducir un antígeno extraño en la ruta del MHC de clase I in vitro e in vivo. En la mayoría de los casos, la fagocitosis estuvo implicada en este proceso y pareció que esta ruta de presentación de clase I necesitó concentraciones elevadas de antígeno y su eficacia fue baja (Reis e Sousa, C. et al. J. Exp. Med. (1995) 1B2:841-851).

El término "mamífero" incluye animales de sangre caliente tales como, por ejemplo, roedores (p.ej. ratas, ratones, hámsteres, ardillas), caballos, vacas, cerdos, ovejas, gatos, perros, osos, cabras y primates (p.ej. monos, chimpancés, gorilas y, preferiblemente, humanos).

La expresión "células dendríticas" incluye células de Langerhans, células dendríticas intersticiales, células dendríticas interdigitantes, células dendríticas foliculares y células dendríticas circulantes. Las células de Langerhans se encuentran en la epidermis y en membranas mucosas. Las células dendríticas intersticiales pueblan la mayor parte de órganos, tales como corazón, pulmones, hígado, riñón y tracto gastrointestinal. Las células dendríticas interdigitantes están presentes en áreas de células T del tejido linfoide secundario y la médula tímica. Las células dendríticas circulantes incluyen "células veladas", que constituyen alrededor del 0,1% de los leucocitos sanguíneos.

En general, las células dendríticas están cubiertas con un laberinto de largas prolongaciones de membrana que se parecen a las dendritas de las neuronas. Debido a sus largas prolongaciones dendríticas, las células dendríticas han sido difíciles de estudiar usando procedimientos convencionales para aislar linfocitos y células accesorias del sistema inmunitario. Las células dendríticas tienden a expresar niveles elevados de moléculas del MHC de clase II y la molécula coestimuladora B7. Debido a esto, son células presentadoras de antígenos más potentes que los macrófagos y las células B, los cuales necesitan ser activados antes de que puedan funcionar como CPAs. Después de captar un antígeno en los tejidos mediante fagocitosis o endocitosis, las células dendríticas migran a la sangre o linfa y circulan hacia diversos órganos linfoides, en los que presentan el antígeno a los linfocitos T.

También se describe un método para tratar un estado asociado a antígeno en un mamífero administrando al mamífero una cantidad terapéuticamente efectiva de un conjugado antígeno-toxina y, por lo tanto, estimulando una respuesta inmunitaria en el mamífero. Por ejemplo, este método incluye coadministrar un antígeno con subunidad B de verotoxina o administrar un antígeno unido a una subunidad B de verotoxina a un individuo, p.ej. un mamífero, para estimular la capacidad de presentación de antígenos de las células dendríticas.

La expresión "estado asociado a antígeno" incluye las infecciones por microorganismos o patógenos, estados asociados a alérgenos, y, preferiblemente, tumores tales como, por ejemplo, tumor de mama, de ovario, de cerebro, de piel, de pulmón, etc. Preferiblemente, el estado asociado a antígeno es melanoma.

El término "tratar" incluye prevenir y curar, así como mejorar, al menos un síntoma del estado asociado a antígeno. También incluye la iniciación de una respuesta inmunitaria contra un estado asociado a antígeno al que el mamífero puede ser susceptible, pero que no lo padece necesariamente. Por ejemplo, en un mamífero con riesgo de melanoma, se le puede administrar un conjugado de la invención a dicho mamífero, y así se genera una respuesta inmunitaria para prevenir o retrasar el inicio del melanoma potencial.

El término "administrar" incluye las vías de administración que permiten que el conjugado de la invención realice la función deseada, p.ej. estimular una respuesta inmunitaria. Las vías preferidas de administración incluyen, pero no se limitan a, vía oral, intrabronquial y transdérmica. Dependiendo de la vía de administración, el conjugado de la invención se puede revestir con, o colocar en, un material seleccionado para protegerlo de las condiciones naturales que pueden perjudicar su capacidad para realizar la función deseada. El conjugado de la invención se puede administrar solo o con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Además, el conjugado de la invención se puede administrar como una mezcla de conjugados de la invención, que también se pueden coadministrar con un vehículo farmacéuticamente aceptable. El conjugado de la invención se puede administrar antes del inicio de un estado asociado a antígeno, o después del inicio de un estado asociado a antígeno.

Preferiblemente, los conjugados de la invención se administran al mamífero de forma transcutánea a través de la piel o a través de una membrana mucosa. Las membranas mucosas incluyen membranas lubricadas de los revestimientos interiores de muchos sistemas internos de los mamíferos. Los ejemplos de sistemas con membranas mucosas incluyen, pero no se limitan a, el sistema respiratorio, el tracto gastrointestinal y el tracto reproductivo. Las membranas mucosas preferidas incluyen, por ejemplo, las membranas de la nariz, fosas nasales, garganta, pulmones, boca, estómago, intestino, colon, recto, uretra y vagina de un mamífero. Sin limitarse por la teoría, se cree que el administrar un compuesto de la invención a un mamífero mediante aplicación u otros medios a una membrana mucosa o a la piel de un mamífero es ventajoso, por ejemplo, debido a la presencia de células inmunitarias especializadas y potentes tales como, por ejemplo, células dendríticas, p.ej. células de Langerhans.

También se describen métodos, preferiblemente no invasivos, para inmunizar a un mamífero de un antígeno específico administrando de forma transcutánea un conjugado de la invención. Una ventaja de las formas no invasivas de inmunización es que se evita la necesidad de inyección de la composición farmacéutica en un mamífero, al menos en parte, y se reduce así potencialmente la necesidad de inyecciones y, por ejemplo, el riesgo del mamífero de exposición a patógenos extraños, p.ej. VIH. La expresión no invasivo incluye métodos de administración tales como administración transcutánea a través de la piel y membranas mucosas. Los ejemplos incluyen la inhalación de la composición farmacéutica para la administración transcutánea a través de las membranas mucosas del tracto respiratorio, la ingestión de la composición farmacéutica para la administración por medio de, por ejemplo, administración transcutánea, a través de, por ejemplo, las membranas mucosas, p.ej. del tracto gastrointestinal, p.ej. las membranas de la boca, garganta, estómago, intestino, colon y recto. La invención también está relacionada con composiciones farmacéuticas para la inmunización de mamíferos, que comprende un conjugado toxina-antígeno de la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable para la administración transcutánea del conjugado.

En una realización adicional, la invención está relacionada con composiciones farmacéuticas y métodos que además comprenden adyuvantes. Un ejemplo de un adyuvante es KLH. Los adyuvantes juegan un papel crítico en aumentar la capacidad de los compuestos para ser administrados satisfactoriamente de forma transcutánea (Edelman Rev. Infec. Dis. (1980) 2:370-383). Los adyuvantes han sido importantes en el desarrollo de la vía transcutánea, p.ej. transdérmica o mucosa, como métodos no invasivos útiles y fácilmente accesibles para la administración de compuestos a mamíferos (Snider, Crit. Rev. Immunol. (1995) 14:317-348). Los expertos en las técnicas relevantes conocen bien los adyuvantes adecuados.

También se describe un método para inducir inmunidad en un mamífero administrando al mamífero una cantidad terapéuticamente efectiva de un conjugado toxina-antígeno de la invención y un vehículo farmacéutico adecuado para la administración al mamífero. Preferiblemente, el vehículo es adecuado para la administración de forma nasal, oral o tópica. De forma ventajosa, el método puede comprender además la administración de un adyuvante. También se describen composiciones farmacéuticas capaces de inducir inmunidad en un mamífero que comprenden una cantidad efectiva de un conjugado toxina-antígeno y un vehículo farmacéutico. Los vehículos preferidos incluyen los adecuados para administrar el conjugado de la invención al mamífero por vía nasal, oral o tópica.

La expresión "cantidad terapéuticamente efectiva" del compuesto es la cantidad necesaria o suficiente para tratar o prevenir un estado asociado a antígeno, p.ej. prevenir los diversos síntomas morfológicos y somáticos de un estado asociado a antígeno. La cantidad efectiva puede variar dependiendo de factores tales como el tamaño y peso del sujeto, el tipo de enfermedad o el conjugado particular de la invención. Por ejemplo, la elección del conjugado puede afectar a lo que constituye una "cantidad efectiva". Alguien de experiencia ordinaria en la técnica podría estudiar los factores anteriormente mencionados y hacer la determinación por lo que respecta a la cantidad efectiva del conjugado de la invención sin experimentación excesiva.

También se describe un método para presentar antígenos en células presentadoras de antígenos, que comprende poner en contacto las células presentadoras de antígenos con un conjugado toxina-antígeno de forma que las células presentadoras de antígenos presentan dichos antígenos. Preferiblemente, los antígenos son antígenos tumorales, p.ej. antígenos de melanoma. Se cree, por ejemplo, que la subunidad B de verotoxina puede estimular tanto la presentación superficial del antígeno por las células dendríticas como el procesamiento intracelular del antígeno.

La expresión "células presentadoras de antígenos" incluye aquellas células que presentan antígenos o fragmentos antigénicos. Los ejemplos de células presentadoras de antígenos incluyen algunas células mononucleares de sangre periférica y, preferiblemente, células dendríticas, p.ej. células de Langerhans.

En otra realización, la invención se caracteriza por una composición farmacéutica que incluye un conjugado toxina-antígeno y un vehículo farmacéuticamente aceptable. La frase "vehículo farmacéuticamente aceptable", como se usa aquí, significa un material, composición o vehículo farmacéuticamente aceptable, tal como un relleno, diluyente, excipiente, disolvente o material de encapsulación líquido o sólido, implicado en llevar o transportar el/los compuesto(s) de la presente invención dentro o hacia el sujeto, de forma que puede realizar la función deseada. Típicamente, tales compuestos son llevados o transportados desde un órgano, o parte del cuerpo, a otro órgano, o parte del cuerpo. Cada vehículo debe ser "aceptable" en el sentido de ser compatible con los otros ingredientes de la formulación y no ser perjudicial para el paciente. Algunos ejemplos de materiales que pueden servir como vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen: hidratos de carbono, tales como lactosa, glucosa y sacarosa; almidones, tales como almidón de maíz y almidón de patata; celulosa y sus derivados, tales como carboximetilcelulosa sódica, etilcelulosa y acetato de celulosa; goma de tragacanto en polvo; malta; gelatina; talco; excipientes, tales como manteca de cacao y ceras de supositorio; aceites, tales como aceite de cacahuete, aceite de algodón, aceite de cártamo, aceite de sésamo, aceite de oliva, aceite de maíz y aceite de soja; glicoles, tales como propilenglicol; polioles, tales como glicerina, sorbitol, manitol y polietilenglicol; ésteres, tales como oleato de etilo y laurato de etilo; agar; agentes tamponadores, tales como hidróxido magnésico e hidróxido alumínico; ácido algínico; agua apirógena; suero salino isotónico; disolución de Ringer; alcohol etílico; disoluciones tampón fosfato; y otras sustancias compatibles atóxicas empleadas en las formulaciones farmacéuticas.

Como se expuso anteriormente, ciertos conjugados pueden contener un grupo funcional básico, tal como amino o alquilamino, y son, así, capaces de formar sales farmacéuticamente aceptables con ácidos farmacéuticamente aceptables. La expresión "sales farmacéuticamente aceptables", a este respecto, se refiere a las sales de adición de ácidos inorgánicos y orgánicos relativamente atóxicas de los compuestos descritos aquí. Estas sales se pueden preparar in situ durante el aislamiento y la purificación final de los compuestos, o haciendo reaccionar separadamente un compuesto purificado en su forma de base libre con un ácido orgánico o inorgánico adecuado, y aislar la sal así formada. Las sales representativas incluyen las sales de hidrobromuro, hidrocloruro, sulfato, bisulfato, fosfato, nitrato, acetato, valerato, oleato, palmitato, estearato, laurato, benzoato, lactato, fosfato, tosilato, citrato, maleato, fumarato, succinato, tartrato, naftilato, mesilato, glucoheptonato, lactobionato y laurilsulfonato, y similares (véase, p.ej., Berge et al. (1977) "Pharmaceutical Salts", J. Pharm. Sci. 66:1-19).

En otros casos, los compuestos de la presente invención pueden contener uno o más grupos funcionales ácidos y, así, son capaces de formar sales farmacéuticamente aceptables con bases farmacéuticamente aceptables. La expresión "sales farmacéuticamente aceptables", a este respecto, se refiere a las sales de adición de bases inorgánicas y orgánicas relativamente atóxicas de los compuestos descritos aquí. Estas sales se pueden preparar de forma similar in situ durante el aislamiento y purificación final de los compuestos, o haciendo reaccionar separadamente el compuesto purificado en su forma de ácido libre con una base adecuada, tal como el hidróxido, carbonato o bicarbonato de un catión metálico farmacéuticamente aceptable, con amoníaco, o con una amina orgánica primaria, secundaria o terciaria farmacéuticamente aceptable. Las sales alcalinas o alcalinotérreas representativas incluyen las sales de litio, sodio, potasio, calcio, magnesio y aluminio y similares. Las aminas orgánicas representativas útiles para la formulación de sales de adición de base incluyen etilamina, dietilamina, etilendiamina, etanolamina, dietanolamina, piperazina y similares.

También puede haber presente en las composiciones agentes humectantes, emulsionantes y lubricantes, tales como lauril sulfato sódico y estearato magnésico, así como agentes colorantes, agentes de liberación, agentes de revestimiento, agentes edulcorantes, aromatizantes y perfumantes, conservantes y antioxidantes.

Los ejemplos de antioxidantes farmacéuticamente aceptables incluyen: antioxidantes hidrosolubles, tales como ácido ascórbico, hidrocloruro de cisteína, bisulfato sódico, metabisulfito sódico, sulfito sódico y similares; antioxidantes solubles en aceites, tales como palmitato de ascorbilo, hidroxianisol butilado (BHA), hidroxitolueno butilado (BHT), lecitina, galato de propilo, alfa-tocoferol y similares; y agentes quelantes de metales, tales como ácido cítrico, ácido etilendiamintetraacético (EDTA), sorbitol, ácido tartárico, ácido fosfórico, y similares.

Las formulaciones descritas aquí incluyen aquellas que son adecuadas para administración oral, nasal, tópica, transdérmica, bucal, sublingual, rectal, vaginal y/o parenteral. Las formulaciones se pueden presentar convenientemente en forma de dosis unitaria y se pueden preparar mediante cualquier método bien conocido en la técnica farmacéutica. La cantidad de ingrediente activo que se puede combinar con un vehículo para producir una forma de dosificación única será en general la cantidad del compuesto que produce un efecto terapéutico. En general, en porcentaje, esta cantidad oscilará de alrededor del 1 por ciento a alrededor del noventa y nueve por ciento de ingrediente activo, preferiblemente de alrededor del 5 por ciento a alrededor del 70 por ciento, lo más preferiblemente de alrededor del 10 por ciento a alrededor del 30 por ciento.

Los métodos de preparación de estas formulaciones o composiciones incluyen la etapa de asociar un compuesto descrito aquí con el vehículo y, opcionalmente, uno o más ingredientes accesorios. En general, las formulaciones se preparan asociando de forma uniforme e íntima un compuesto descrito aquí con vehículos líquidos, o vehículos sólidos finamente divididos, o ambos, y después, si es necesario, dando forma al producto.

Las formulaciones de la invención adecuadas para administración oral pueden estar en forma de cápsulas, obleas, píldoras, comprimidos, pastillas (usando una base con sabor, normalmente sacarosa y goma arábiga o de tragacanto), polvos, gránulos, o como una disolución o una suspensión en un líquido acuoso o no acuoso, o como una emulsión líquida de aceite en agua o agua en aceite, o como un elixir o jarabe, o como pastillas (usando una base inerte, tal como gelatina y glicerina, o sacarosa y goma arábiga) y/o como colutorios y similares, y cada uno contiene una cantidad predeterminada de un compuesto descrito aquí como ingrediente activo. Un compuesto descrito aquí también se puede administrar como un bolo, electuario o pasta.

En las formas de dosificación sólidas de la invención para administración oral (cápsulas, comprimidos, píldoras, grageas, polvos, gránulos y similares), el ingrediente activo se mezcla con uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables, tales como citrato sódico o fosfato dicálcico, y/o cualquiera de los siguientes: rellenos o cargas, tales como almidones, lactosa, sacarosa, glucosa, manitol, y/o ácido silícico; aglutinantes tales como, por ejemplo, carboximetilcelulosa, alginatos, gelatina, polivinilpirrolidona, sacarosa y/o goma arábiga; humectantes, tales como glicerol; agentes disgregantes, tales como agar-agar, carbonato cálcico, almidón de patata o de tapioca, ácido algínico, ciertos silicatos, y carbonato sódico; agentes retardantes de disolución, tales como parafina; aceleradores de la absorción, tales como compuestos de amonio cuaternarios; agentes humectantes, tales como, por ejemplo, alcohol cetílico y monoestearato de glicerol; absorbentes, tales como arcilla caolínica y bentonítica; lubricantes, tales como talco, estearato cálcico, estearato magnésico, polietilenglicoles sólidos, laurilsulfato sódico, y sus mezclas; y agentes colorantes. En el caso de las cápsulas, comprimidos y píldoras, las composiciones farmacéuticas pueden también comprender agentes de tamponamiento. También se pueden emplear composiciones sólidas de tipo similar como rellenos en cápsulas rellenas de gelatina blanda y dura usando excipientes tales como lactosa o hidratos de carbono de la leche, así como polietilenglicoles de peso molecular elevado y similares.

Un comprimido puede hacerse mediante compresión o moldeado, opcionalmente con uno o más ingredientes accesorios. Los comprimidos mediante compresión se pueden preparar usando agentes aglutinantes (por ejemplo, gelatina o hidroxipropilmetilcelulosa), lubricantes, diluyentes inertes, conservantes, desintegrantes (por ejemplo, glicolato de almidón sódico o carboximetilcelulosa sódica reticulada), tensoactivos o dispersantes. Los comprimidos mediante moldeado se pueden hacer moldeando en un aparato adecuado una mezcla del compuesto en polvo humedecido con un diluyente líquido inerte.

Los comprimidos, y otras formas de dosificación sólidas de las composiciones farmacéuticas descritas aquí tales como grageas, cápsulas, píldoras y gránulos, se pueden opcionalmente ranurar o preparar con revestimientos y cubiertas, tales como revestimientos entéricos y otros revestimientos bien conocidos en la técnica de formulación farmacéutica. También se pueden formular para proporcionar una liberación lenta o controlada del ingrediente activo usando, por ejemplo, hidroxipropilmetilcelulosa en proporciones variables para proporcionar el perfil de liberación deseado, otras matrices poliméricas, liposomas y/o microesferas. Se pueden esterilizar mediante, por ejemplo, filtración a través de un filtro de retención de bacterias, o incorporando agentes esterilizantes en forma de composiciones sólidas estériles que se pueden disolver en agua estéril, o en algún otro medio inyectable estéril inmediatamente antes del uso. Estas composiciones también pueden contener opcionalmente agentes opacificantes y pueden ser de una composición que libere el/los ingrediente(s) activo(s) solamente, o preferentemente, en una cierta porción del tracto gastrointestinal, opcionalmente, de una manera retardada. Los ejemplos de composiciones encapsuladas que se pueden usar incluyen sustancias poliméricas y ceras. El ingrediente activo también puede estar en forma microencapsulada, si es apropiado, con uno o más de los excipientes anteriormente descritos.

Las formas de dosificación líquidas para administración oral de los compuestos de la invención incluyen emulsiones, microemulsiones, disoluciones, suspensiones, jarabes y elixires farmacéuticamente aceptables. Además del ingrediente activo, las formas de dosificación líquidas pueden contener diluyentes inertes usados comúnmente en la técnica, tales como, por ejemplo, agua u otros disolventes, agentes solubilizantes y emulgentes, tales como alcohol etílico, alcohol isopropílico, carbonato de etilo, acetato de etilo, alcohol bencílico, benzoato de bencilo, propilenglicol, 1,3-butilenglicol, aceites (en particular, aceites de algodón, de cacahuete, germen de maíz, de oliva, de ricino y de sésamo), glicerol, alcohol de tetrahidrofurilo, polietilenglicoles y ésteres de ácidos grasos de sorbitán, y sus mezclas. Además de diluyentes inertes, las composiciones orales también pueden incluir adyuvantes tales como agentes humectantes, emulsionantes y de suspensión, agentes edulcorantes, aromatizantes, colorantes, perfumantes y conservantes.

Las suspensiones, además de los compuestos activos, pueden contener agentes de suspensión como, por ejemplo, alcoholes de isoestearilo etoxilados, polioxietilen sorbitol y ésteres de sorbitán, celulosa microcristalina, metahidróxido alumínico, bentonita, agar-agar y goma de tragacanto, y sus mezclas.

Las formulaciones de las composiciones farmacéuticas descritas aquí para administración rectal o vaginal se pueden presentar como un supositorio, que puede prepararse mezclando uno o más compuestos de la invención con uno o más excipientes o vehículos no irritantes adecuados que comprenden, por ejemplo, manteca de cacao, polietilenglicol, una cera de supositorio o un salicilato, y que son sólidos a temperatura ambiente, pero líquidos a la temperatura corporal y, por lo tanto, se fundirán en la cavidad rectal o vaginal y liberarán el compuesto activo.

Las formulaciones de la presente invención que son adecuadas para administración vaginal también incluyen formulaciones en forma de óvulos vaginales, tampones, cremas, geles, pastas, espumas o pulverizadores que contienen vehículos tales como los que se sabe en la técnica que son apropiados.

Las formas de dosificación para la administración tópica o transdérmica de un compuesto descrito aquí incluye polvos, pulverizadores, pomadas, pastas, cremas, lociones, geles, disoluciones, parches e inhalantes. El compuesto activo se puede mezclar en condiciones estériles con un vehículo farmacéuticamente aceptable, y con los conservantes, tampones, o propelentes que sean necesarios.

Las pomadas, pastas, cremas y geles pueden contener, además del compuesto activo de esta invención, excipientes, tales como grasas animales y vegetales, aceites, ceras, parafinas, almidón, goma de tragacanto, derivados de celulosa, polietilenglicoles, siliconas, bentonitas, ácido silícico, talco y óxido de cinc, o sus mezclas.

Los polvos y los pulverizadores pueden contener, además de un compuesto de esta invención, excipientes tales como lactosa, talco, ácido silícico, hidróxido alumínico, silicatos de calcio y polvo de poliamida, o mezclas de estas sustancias. Los pulverizadores pueden contener adicionalmente propelentes habituales, tales como clorofluorohidrocarburos e hidrocarburos sin sustituir volátiles, tales como butano y propano.

Los parches transdérmicos tiene la ventaja añadida de proporcionar una administración controlada de un compuesto descrito aquí al organismo. Tales formas de dosificación se pueden hacer disolviendo o dispersando el compuesto en el medio apropiado. Los potenciadores de absorción también se pueden usar para incrementar el flujo del compuesto a través de la piel. La velocidad de tal flujo se puede controlar proporcionando una membrana de control de velocidad o dispersando el compuesto activo en una matriz polimérica o gel.

También se contemplan las formulaciones oftálmicas, pomadas oculares, polvos, disoluciones y similares.

Las composiciones farmacéuticas adecuadas para administración parenteral comprenden uno o más compuestos descritos aquí en combinación con una o más disoluciones, dispersiones, suspensiones o emulsiones, acuosas o no acuosas, isotónicas estériles farmacéuticamente aceptables, que se pueden reconstituir en disoluciones o dispersiones inyectables estériles justo antes del uso, que pueden contener antioxidantes, tampones, bacteriostáticos, solutos que hacen la formulación isotónica con la sangre del receptor deseado o agentes de suspensión o espesantes.

Los ejemplos de vehículos acuosos y no acuosos adecuados que se pueden emplear en las composiciones farmacéuticas descritas aquí incluyen agua, etanol, polioles (tales como glicerol, propilenglicol, polietilenglicol, y similares), y sus mezclas adecuadas, aceites vegetales, tales como aceite de oliva, y ésteres orgánicos inyectables, tales como oleato de etilo. Se puede mantener una fluidez apropiada, por ejemplo, mediante el uso de materiales de revestimiento, tales como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula necesario en el caso de las dispersiones, y mediante el uso de tensoactivos.

Estas composiciones también pueden contener adyuvantes tales como conservantes, agentes humectantes, agentes emulsionantes y agentes dispersantes. La prevención de la acción de microorganismos se puede asegurar mediante la inclusión de diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabeno, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, y similares. También puede ser deseable incluir agente isotónicos, tales como hidratos de carbono, cloruro sódico, y similares en las composiciones. Además, se puede provocar la absorción prolongada de la forma farmacéutica inyectable mediante la inclusión de agentes que retrasan la absorción, tales como monoestearato de aluminio y gelatina.

En algunos casos, para prolongar el efecto de un fármaco, es deseable disminuir la absorción del fármaco de la inyección subcutánea o intramuscular. Esto se puede conseguir mediante el uso de una suspensión líquida de material cristalino o amorfo que tiene poca solubilidad en agua. La velocidad de absorción del fármaco depende entonces de su velocidad de disolución que, a su vez, puede depender del tamaño del cristal y de la forma cristalina. De forma alternativa, la absorción retardada de un fármaco administrado parenteralmente se consigue disolviendo o suspendiendo el fármaco en un vehículo de aceite.

Las formas inyectables de liberación lenta se hacen formando matrices de microencapsulación de los compuestos de interés en polímeros biodegradables tales como polilactida-poliglicolida. Dependiendo de la proporción de fármaco respecto de polímero, y de la naturaleza del polímero particular empleado, se puede controlar la velocidad de liberación de fármaco. Los ejemplos de otros polímeros biodegradables incluyen poli(ortoésteres) y poli(anhídridos). Las formulaciones inyectables de liberación lenta también se preparan atrapando el fármaco en liposomas o microemulsiones que son compatibles con el tejido corporal.

Las preparaciones descritas aquí se pueden administrar de forma oral, parenteral, tópica o rectal. Por supuesto, se administran mediante formas adecuadas para cada vía de administración. Por ejemplo, se administran en forma de comprimidos o cápsulas, mediante inyección, inhalación, loción ocular, pomada, supositorio, etc.; administración mediante inyección, infusión o inhalación; de forma tópica mediante loción o pomada; y de forma rectal mediante supositorios. Se prefiere la administración oral.

Las frases "administración parenteral" y "administrado de forma parenteral", como se usan aquí, significan modos de administración distintos de la administración enteral y tópica, normalmente mediante inyección, e incluyen, sin limitación, inyección e infusión intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardíaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutánea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoidea, intraespinal e intraesternal.

Las frases "administración sistémica", "administrado de forma sistémica", "administración periférica" y "administrado de forma periférica", como se usan aquí, significan la administración de un compuesto, fármaco u otro material de forma distinta que directamente en el sistema nervioso central, de forma que entra en el sistema del paciente y, así, se somete al metabolismo y otros procesos similares, por ejemplo, la administración subcutánea.

Estos compuestos se pueden administrar a humanos y otros animales para terapia mediante cualquier vía de administración adecuada, que incluye la vía oral, nasal, mediante, por ejemplo, un pulverizador, rectal, intravaginal, parenteral, intracisternal y tópica, mediante polvos, pomadas o gotas, que incluye la vía bucal y sublingual.

Independientemente de la vía de administración seleccionada, los compuestos descritos aquí, que se pueden usar en una forma hidratada adecuada, y/o las composiciones farmacéuticas descritas aquí, se formulan en formas de dosificación farmacéuticamente aceptables mediante métodos convencionales conocidos por los expertos en la técnica.

Los niveles de dosis reales de los ingredientes activos en las composiciones farmacéuticas de esta invención se pueden variar para obtener una cantidad del ingrediente activo que es efectiva para conseguir la respuesta terapéutica deseada para un paciente, composición y modo de administración particular, sin que sean tóxicos para el paciente.

El nivel de dosis seleccionado dependerá de una diversidad de factores, que incluyen la actividad del compuesto particular de la presente invención empleado, o su éster, sal o amida, la vía de administración, el momento de la administración, la velocidad de excreción del compuesto particular que se está empleando, la duración del tratamiento, otros fármacos, compuestos y/o materiales usados en combinación con el compuesto particular empleado, la edad, sexo, peso, enfermedad, estado general y antecedentes médicos del paciente a tratar, y factores similares bien conocidos en las técnicas médicas.

Un médico o veterinario que tiene experiencia habitual en la técnica puede determinar y prescribir fácilmente la cantidad efectiva de la composición farmacéutica necesaria. Por ejemplo, el médico o veterinario podría iniciar dosis de los compuestos descritos aquí empleados en la composición farmacéutica con niveles inferiores que los necesarios para conseguir el efecto terapéutico deseado, e incrementar gradualmente la dosis hasta consiguir el efecto deseado.

Aunque es posible que un compuesto descrito aquí se administre solo, es preferible administrar el compuesto como una composición farmacéutica. Las composiciones farmacéuticas preferidas incluyen las adecuadas para administración oral, transdérmica o intrabronquial.

Los antígenos, p.ej. Mage 1, coadministrados con una toxina, p.ej. la subunidad B de verotoxina, o unidos, p.ej. mediante enlace covalente, a la toxina se administran a un individuo para estimular la capacidad de presentación de antígenos de las células dendríticas, p.ej. células de Langerhans, y actúan como una vacuna. Tales vacunas se pueden administrar de forma oral, transdérmica o intrabronquial, y son capaces de estimular a las células dendríticas en el tejido en el que son expuestas.

También se describe una composición farmacéutica para tratar un estado asociado a antígeno en un mamífero. La composición farmacéutica incluye una cantidad efectiva de un conjugado toxina-antígeno y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Preferiblemente, el estado asociado a antígeno es un tumor, p.ej. melanoma, y el conjugado toxina-antígeno comprende, por ejemplo, una subunidad B de una verotoxina.

También se describe una vacuna para vacunar a un mamífero, p.ej. un humano, de un estado asociado a antígeno, p.ej. un tumor, que comprende un conjugado toxina-antígeno y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

La presente invención se refiere al uso de subunidades B de verotoxina, y a composiciones híbridas que incluyen todo o parte de una subunidad B de verotoxina, para estimular células inmunitarias, p.ej. para estimular la función presentadora de antígenos de células inmunitarias, p.ej. para proporcionar una estrategia de vacunación efectiva.

En ciertas realizaciones, la toxina B de verotoxina (VT) se administra administrando una holotoxina (p.ej. VT1, VT2, VT2c, VT2e) al individuo. Sin embargo, en una realización preferida, la subunidad B de verotoxina se administra sin las porciones tóxicas de la holotoxina VT, evitando por ello la toxicidad de la holotoxina. Se cree que la subunidad B de verotoxina puede estimular tanto la presentación superficial del antígeno por las células dendríticas como el procesamiento intracelular del antígeno.

Se administran péptidos asociados a melanoma unidos a la cadena B de verotoxina o a la cadena B de cólera al individuo como vacunas antitumorales estimulando a las células dendríticas y proporcionando una presentación activa de tales antígenos a los linfocitos. En una realización preferida, los lisados tumorales están unidos a la cadena B de verotoxina usando técnicas tales como enlaces covalentes, p.ej. activación mediante bromuro de cianógeno. En aún otra realización preferida, se coadministran adyuvantes, p.ej. KLH.

Ejemplo Presentación por el complejo principal de histocompatibilidad de clase I de antígeno tumoral soluble exógeno fusionado con el fragmento B de la toxina Shiga: El fragmento B de la toxina Shiga dirige al antígeno exógeno hacia la ruta de presentación del MHC de clase I

Se construyeron proteínas recombinantes compuestas del fragmento B de la toxina Shiga fusionado con un epítopo CD8 derivado del antígeno tumoral Mage 1 (van der Bruggen, P. et al., Science (1991) 254:1643-1647). Este antígeno, inicialmente clonado a partir de melanoma humano, se expresa en tumores de diferentes orígenes. No se halló expresión de este gen en un gran panel de tejido normal excepto en testículo, que no expresaba moléculas del MHC de clase I (van der Bruggen, P. et al., Science (1991) 254:1643-1647). Se investigó la capacidad in vitro de este antígeno tumoral modificado genéticamente para ser procesado y presentado en una ruta restringida de
clase I.

Materiales y métodos Células

Se separaron células mononucleares de sangre periférica (CMSP) de la sangre periférica de donantes sanos HLA-A1+ mediante centrifugación en gradientes de Ficoll-Hypaque. Las células dendríticas usadas en el presente estudio se generaron a partir de CMSP según los protocolos descritos previamente (Sallusto, F. y Lanzavecchia, A., J. Exp. Med. (1994) 179:1109-1118). Brevemente, se obtuvieron células adherentes después de 2 horas de incubación de la población mononuclear separada mediante gradiente Ficoll/Hypaque en placas de plástico. Estas células se cultivaron después en medio RPMI 1640 complementado con 10% de suero bovino fetal termoinactivado, L-glutamina
2 mM, 50 UI/ml de penicilina, 50 \mug/ml de estreptomicina, 5% de piruvato sódico, ("medio completo") y 500 U/ml
de GM-CSF recombinante (Leucomax, Molgramostin, Sandoz Pharma, Basilea, Suiza) y 100 UI/ml de IL4 (Diaclone, Besançon, Francia). En el día 3, se añadió GM-CSF e IL4 una vez más y las células dendríticas obtenidas en el día
6-7 se usaron para los ensayos de presentación de antígeno.

La línea celular linfoblastoide B LB 705 (HLA-A1, A2, B8, B27) se describió previamente (Van der Bruggen, P. et al. Eur. J. Immunol. (1994) 24:3038-3043). La línea celular B transformada con VEB derivó de un individuo HLA-A1 homocigoto (Yang, S. Y. et al., Immunobiology of HLA. (Springer-Verlag, Nueva York: 1989)). La línea celular B transformada con VEB de HLA-A2 V.1 fue cedida por el Dr. U. Blank. Todas las líneas celulares linfoblastoides B se mantuvieron en medio completo complementado con 2-mercaptoetanol 1 \muM.

Los clones MZ2 CTL 82/83 y LB373 CTL 246/15 reconocieron respectivamente el péptido 160-168 de la proteína Mage 1 de una manera restringida HLA-A1 (Traversari, C. et al., J. Exp. Med. (1992) 176:1453-1457) y el péptido 27-35 de la proteína Mart 1 de una manera restringida HLA-A2 (Coulle, P, G. et al., J. Exp. Med. (1994) 180:35-42).

El cultivo de LTC siguió los protocolos descritos por Traversari et al. con ligeras modificaciones (Traversari, C. et al., Immunogenetics (1992) 35:145-152). Brevemente, se cultivaron 3x10^{5} LTC en 2 ml de medio Iscove que contenía L-arginina (116 \mug/ml), L-asparagina (36 \mug/ml) y L-glutamina (216 \mug/ml) complementado con 10% de mezcla de suero humano A, B y O (SAB) de donantes sanos y en presencia de 10^{6} células de soporte LG-2 VEB irradiadas (100 Gy), 10^{6} CMSP irradiadas (30 Gy), PHA-L (5 \mug/ml) e IL-2 (150 UI/ml). Tres o cuatro días después de la estimulación, se diluyeron LTC en medio de cultivo complementado con IL-2 (50 UI/ml). La estimulación de LTC con células de soporte se repitió una vez a la semana. Para los ensayos de INF\gamma, se usaron cultivos de LTC seis días después de la última reestimulación.

Construcción de plásmidos y producción de péptidos de fusión

Se describió previamente la construcción de los plásmidos basados en pSU108 que expresan el fragmento B de la toxina Shiga o proteínas de fusión en las que se introdujo un sitio de N-glicosilación y una señal de reenvío al retículo endoplásmico (RE) activa (KDEL) o inactiva (KDELGL) en el extremo C-terminal del fragmento B (Johannes, L. et al., J. Biol. Chem. (1997) 272:19554-19561). Se usó una estrategia basada en PCR para introducir el epítopo Mage 1 y sus secuencias flanqueadoras de 5' y 3' (DVKEADPTGHSYVLG) en el sitio Not 1 de los vectores de expresión B-Glyc-KDEL y B-Glyc-KDELGL construidos previamente. Las proteínas de fusión resultantes se denominaron B-Mage 1-Glyc-KDEL y B-Mage 1-Glyc-KDELGL. Las secuencias se comprobaron mediante secuenciación de ADN de doble cadena. Las proteínas se expresaron en la cepa de E. coli DH5\alpha y se realizó la purificación esencialmente como se describió (Johannes, L. et al., J. Biol Chem. (1997) 272:19554-19561).

Brevemente, después de la preparación de los extractos periplásmicos, se cargaron en una columna QFF (Pharmacia) y se eluyeron mediante un gradiente de NaCl lineal (120 a 400 mM) en Tris/HCl 20 mM, pH 7,5. Se dializaron las fracciones que contenían la proteína de fusión Shiga B-Mage 1 con Tris/HCl 20 mM, pH 7,5, se recargaron en una columna Mono Q (Pharmacia) y se eluyeron como antes.

El gen de fusión Antennapedia-Mage 1 (Antp-Mage 1) se obtuvo mediante la inserción de oligonucleótidos sintéticos que codifican el epítopo Mage 1 y sus secuencias flanqueadoras 5' y 3' (véase lo anterior) entre los sitios de restricción XhoI y BamHI del plásmido PAH61S en sustitución de la secuencia codificante Rab3 (Pérez, F. et al., J. Cell. Sci. (1992) 102:717-722). Después se subclonó un fragmento de restricción NdeI-BamHI que contenía la secuencia Antp-Mage 1 en el plásmido de Novagen pET 2gb (+) (R&D System, Londres, R.U.) en el que la expresión de la proteína de fusión estaba bajo control del promotor T7 y estaba marcada con His en su extremo C-terminal. Los péptidos de fusión se expresaron en la cepa de E. coli BL21 (DE3)Lys después de la inducción de IPTG como se describió (Studier, F. W. et al., Methods in Enzymol. (1990) 185: 60-89). La proteína Antp-Mage 1 se purificó después en un gel de agarosa Ni-NTA (QIAGEN GmbH, Hilden, Alemania) en condiciones desnaturalizantes según el protocolo del fabricante. Se estimó que las proteínas de fusión resultantes tenían una pureza del 95% mediante electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida y tinción con azul de Coomassie (Figura 1 A, B y C).

Transferencia de Western

Después de la electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida de alta resolución, las proteínas se electrotransfirieron a una membrana de nitrocelulosa (BA85, 0,45 mm, Schleicher & Schuell, Darsell, Alemania) en tampón de transferencia (glicocola 192 mM, Tris base 25 mM de pH 8,3, 20% de etanol) usando Transblot Cell (Bio-Rad). Después se saturó la membrana durante 1 hora a 37ºC en Tris 20 mM (pH 7,4), NaCl 150 mM (tampón de Western (TW)), 5% de albúmina de suero bovino (BSA), 0,1% de Tween 20 y se incubó durante 18 horas a 4ºC con el anticuerpo monoclonal de ratón 13C4 (4 \mug/ml) (ATCC, Rockville, EE.UU.) dirigido contra el fragmento B de la toxina Shiga para las proteínas de fusión Shiga B-Mage 1 o el anticuerpo anti-Marca-(His)_{6} de ratón (1 \mug/ml) (Dianova, Takara Biomedical Europe S.A., Genevilliers, Francia) para la proteína de fusión Antp-Mage 1. Las membranas se lavaron con TW y 0,1% de Tween 20, y se incubaron durante 1 hora con inmunoglobulina anti-ratón unida a peroxidasa de rábano (Amersham, Les Ulis, Francia). Después de lavar con TW y 0,1% de Tween 20, los filtros se incubaron con el reactivo de transferencia de Western ECL (Amersham), y se detectó la quimioluminiscencia mediante la exposición de las membranas a películas Biomax MR (Kodak).

Péptidos antigénicos

Se obtuvieron péptidos sintéticos 27-35 Mart 1 (AAGIGILTV) y 160-168 Mage 1 (EADPTGMSY) de Neosystem (Estrasburgo, Francia) y derivados de secuencias publicadas previamente (Traversari, C. et al. J. Exp. Med. (1992) 176:1453-1457; Kawakami, Y. et al. J. Exp. Med. (1994) 180:347-352).

Ensayos de presentación de antígenos

Se colocaron células presentadoras de antígenos (CMSP, B-VEB, células T o células dendríticas) en microplacas de fondo plano de 96 pocillos a 10^{5} células/pocillo, y se pulsaron a 37ºC durante 4 horas o 15 horas con antígeno en 100 \mul de medio Iscove sin SAB. Al final de la incubación, se eliminó el medio y se añadieron 20.000 clones de LTC a cada pocillo en 100 \mul de medio de cultivo de LTC que contenía 25 unidades/ml de IL2. Después de 24 horas, se recogieron 50 \mul del sobrenadante y se midió el IFN\gamma mediante ELISA (Diaclone, Besançon, Francia).

En algunos experimentos, las células se fijaron en paraformaldehído del 1% durante 10 min a temperatura ambiente y se lavaron de forma extensiva antes de la transferencia a las microplacas. Donde fue apropiado, se añadió Brefeldina A (Sigma) o Cloroquina (Sigma) a 2 \mug/ml y 250 \muM respectivamente durante 30 min antes de la adición del antígeno, y estuvieron presentes durante la incubación de procesamiento del antígeno en las mismas concentraciones finales.

Unión de DTAF

Se unió B-Mage 1-Glyc-KDEL a DTAF (5-(4,6-diclorotriazin-2-il)amino)fluoresceína) esencialmente como se describió previamente. Brevemente, se añadieron 60 \mug de B-Mage 1-Glyc-KDEL recombinante en HEPES 20 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, a NaHCO_{3} 250 mM y un exceso molar de diez veces de DTAF (Sigma) y se incubó mediante rotación vertical durante 30 min a temperatura ambiente. Después se añadió NH_{4}Cl 0,2 mM y la proteína unida se purificó en columnas PD10 (Pharmacia).

Interiorización y tinción de inmunofluorescencia

Se incubaron 10^{5} células B-VEB BM 21, cultivadas en cubreobjetos de vidrio redondos de 12 mm pretratados con polilisina, en hielo durante 45 min con 1 \mug/ml de B-Mage 1-Glyc-KDEL recombinante marcado con DTAF. Después de lavar, las células se incubaron durante 1 hora a 37ºC, se fijaron con paraformaldehído del 3% durante 10 min, se permeabilizaron con saponina (0,01%), se tiñeron con el anticuerpo monoclonal anti-Lamp-2 H4B4 (Pharmingen, San Diego) y se revelaron con anticuerpo IgG anti-ratón unido a Texas Red (Jackson, West Grove, EE.UU.).

La microscopía confocal de barrido con láser y el análisis de inmunofluorescencia se realizaron usando un microscopio confocal TCS4D basado en un microscopio DM interconectado con un láser de argón/criptón (Johannes, L. et al., J. Biol. Chem. (1997) 272:19554-19561).

Resultados Caracterización bioquímica de las proteínas de fusión Shiga B-Mage 1 y Antp-Mage 1

Como se muestra en la Figura 1A, las proteínas de fusión de fragmento B que contienen Mage 1 que portan una señal de reenvío al RE activa (el tetrapéptido KDEL) o una versión inactiva de esta señal (el hexapéptido KDELGL) migran en condiciones reductoras con pesos moleculares de alrededor de 11,3 kDa que corresponden con sus tamaños esperados. Los análisis de transferencia de Western con un anticuerpo monoclonal anti-fragmento B (13C4) confirmaron la identidad de todas las proteínas de fusión Shiga B purificadas (Figura 1B).

Las dos proteínas de fusión Shiga B-Mage 1 después de la purificación se fragmentaron parcialmente, produciendo fragmentos de 9,5 kDa (Figura 1 A-B). Se debería notar, sin embargo, que la secuencia Mage 1 es interna en B-Mage 1-Glyc-KDEL y B-Mage 1-Glyc-KDELGL. Así, incluso si la escisión del extremo C-terminal fue responsable de la producción de los fragmentos de 9,5 kDa, a juzgar por sus pesos moleculares, todavía contienen el epítopo Mage 1.

Se construyó otra proteína de fusión en la que el péptido Mage 1 se fusionó con un polipéptido derivado del tercer segmento del homodominio Antennapedia (Pérez, F. et al., J. Cell. Sci. (1992) 102:717-722). La tinción del gel de poliacrilamida con azul de Coomassie y el análisis de transferencia de Western identificaron la proteína recombinante Antp-Mage 1 como un polipéptido de 15 kDa (Figura 1C).

Presentación de proteínas de fusión Shiga B-Mage 1 solubles exógenas mediante moléculas de clase I: Papel de la secuencia KDEL

Para valorar el potencial de la proteína de fusión exógena Shiga B-Mage 1 para controlar la presentación por el MHC de clase I del epítopo Mage 1 interno, se pulsaron CMSP con B-Mage 1-Glyc-KDEL. Como se muestra en la Figura 2, estas CMSP presentaron de forma eficaz el péptido Mage 1 derivado de la proteína de fusión Shiga B-Mage 1 de una manera restringida HLA-A1 a LTCs específicos. La influencia de la señal KDEL sobre la eficacia de la presentación se analizó después. Las proteínas de fusión Shiga B-Mage 1 que albergaban tanto KDEL como KDELGL fueron capaces de activar una respuesta de LTC restringida por HLA de clase I específica de Mage 1 (Figura 2). También se observaron actividades similares de las dos moléculas cuando se analizaron diferentes concentraciones de ambas proteínas (datos no mostrados). La presencia de las CMSP durante el experimento fue necesaria porque la activación directa de LTC por las proteínas de fusión Shiga B-Mage 1 no ocurrió (datos no mostrados).

Para los siguientes ejemplos, se usó solamente B-Mage 1-Glyc-KDEL, ya que las capacidades de presentación del antígeno de las proteínas de fusión Shiga B-Mage 1 que albergaban KDEL y KDELGL fueron equivalentes.

Análisis de la presentación por el MHC de clase I de la proteína soluble B-Mage 1-Glyc-KDEL mediante diferentes células presentadoras de antígenos

Se sensibilizaron células presentadoras de antígenos homogéneas con la proteína de fusión Shiga B-Mage 1. Después de pulsar células linfoblastoides B y células dendríticas, se demostró la activación de LTC específicos de Mage 1 restringidos de clase I (Figura 3). Estos resultados se observaron con dos líneas celulares B-VEB diferentes (EIM21 Y LB 705) y células dendríticas derivadas de dos donantes HLA-A1. Fue suficiente una concentración de proteína Shiga B-Mage 1 tan baja como 0,2 \muM para sensibilizar células B-VEB y células dendríticas para la presentación del péptido Mage 1 (Figura 3). De forma inversa, los clones de células T sensibilizados in vitro con proteína de fusión Shiga B-Mage 1 no pudieron activar clones de células T autólogos (Figura 3). Las células T clonadas 82/30 usadas para este estudio como células presentadoras de antígenos expresaron moléculas de HLA-A1 y presentaron el péptido sintético Mage 1 (datos no mostrados).

Análisis de la especificidad de la presentación por el MHC de clase I del péptido Mage 1 derivado de la proteína soluble de fusión Shiga B-Mage 1 exógena por líneas celulares linfoblastoides B

Se observa raramente una ruta de presentación de antígeno restringida de clase I exógena en células B-VEB (Rock, K, L., Immunol. Today (1996) 17:131-137; Watts, C., Annu. Rev. Immunol. (1997) 15:821-850). Para demostrar el papel del fragmento B de la toxina Shiga en este proceso, se produjo una proteína recombinante en la que el fragmento B se sustituyó por un tercer segmento del homodominio antennapedia, un factor de transcripción de Drosophila. Se ha demostrado que este dominio transloca algunos péptidos al citoplasma y el núcleo de las células eucarióticas (Pérez, F. et al., J. Cell. Sci. (1992) 102:717-722). También dirigió al antígeno exógeno en la ruta de procesamiento por el MHC de clase I en algunos tipos celulares (Schutze-Redelmeier, M. P. et al., J. Immunol. (1996) 157:650-655). Como se muestra en la Figura 4A, no se pudo detectar presentación del péptido Mage 1 cuando se usó la proteína de fusión antp-Mage 1 para pulsar células B-VEB de HLA-A1. Cuando se sintetizaron células B-VEB con haplotipo HLA-A2 con la proteína Shiga B-Mage 1, no se pudo observar activación de LTC específicos de Mage 1 (Figura 4A). La especificidad de la activación también estaba apoyada por la ausencia de estimulación de clones de LTC específicos de Mart 1 cuando se pulsaron células B-VEB de HLA-A1 o A2 con proteína de fusión Shiga B-Mage 1 (Figura 4B). B-Glyc-KDEL sin el epítopo Mage 1 no fue reconocido por el clon de LTC específicos de Mage 1 (Figura 4A). En conjunto, estos datos demuestran una presentación restringida por HLA-A1 específica del péptido Mage 1 derivado de la proteína de fusión Shiga B-Mage 1.

Papel de la interiorización y procesamiento intracelular en la presentación por el MHC de clase I de la proteína de fusión Shiga B-Mage 1 soluble por líneas celulares linfoblastoides B

Se analizó la capacidad de la proteína de fusión Shiga B-Mage 1 recombinante para dirigir epítopos peptídicos internos a la ruta restringida de clase I y su dependencia de la interiorización de esta proteína.

Las células linfoblastoides B fijadas con paraformaldehído no permitieron la presentación del péptido Mage 1 derivado de Shiga B-Mage 1 al clon de LTC específico de Mage 1 restringido de clase 1, mientras el péptido Mage 1 sintético exógeno incubado con células B-ESBV fijadas activó estos LTC (Figura 5A). Esto excluyó el procesamiento de Shiga B-Mage 1 extracelular como explicación para la presentación de antígenos restringida de HLA de clase I exógena observada. Para demostrar adicionalmente que el transporte o procesamiento intracelular estuvo implicado en este modelo de presentación de antígenos, se usó Brefeldina A (BFA), que bloquea el trasporte de proteínas en la ruta biosintética/secretora, o Cloroquina, que eleva el pH de los endosomas y así inhibe la proteolisis endosómica. Ni cloroquina ni BFA interfirieron con la presentación del péptido Mage 1 sintético exógeno (Figura 5B). La capacidad de presentación del antígeno de estas células se mantuvo. Por contraste, la presencia de BFA durante la incubación de la proteína soluble de fusión Shiga B-Mage 1 evitó la presentación del epítopo de células T Mage 1 (Figura 5C). Este efecto no se observó con cloroquina. En los experimentos de control, la misma concentración de cloroquina fue eficaz para inhibir la presentación restringida por HLA de clase II de péptidos derivados de la toxina del tétanos (datos no mostrados).

Interiorización de la proteína de fusión Shiga B-Mage 1 en células B-VEB: Análisis de su localización con un marcador lisosómico

Para seguir el transporte intracelular de B-Mage 1-Glyc-KDEL en células B-VEB, la proteína se unió covalentemente al fluoróforo DTAF. Después de su unión a células en hielo e incubación posterior durante 1 hora a 37 °C, la proteína se interiorizó hacia las estructuras citoplásmicas con una tinción yuxtanuclear marcada (Figura 6A). Los patrones de tinción se correspondían con los compartimentos del aparato de Golgi y RE, consistente con los estudios previos en células HeLa (Johannes, L. et al., J. Biol. Chem. (1997) 272:19554-19561). Usando un anticuerpo contra la proteína de membrana asociada a lisosomas 2 (Lamp-2) (Figura 6B) en un experimento de inmunofluorescencia de doble marcado, la proteína de fusión Shiga B-Mage 1 se excluyó en gran medida de los compartimentos lisosómicos positivos para Lamp-2 (Figura 6C).

Aproximadamente el 10-20% de las células B-VEB mostraron tinción específica del fragmento B de intermedia a intensa después de la interiorización de B-Mage-Glyc-KDEL. Tal heterogeneidad entre células de una población dada se ha descrito previamente (Sandvig, K. et al. J. Cell Biol. (1994) 126:53-64) y se debe a variaciones en la expresión del receptor de la toxina en función del ciclo celular (Pudymaitis, A. y Lingwood, C. A., J. Cell. Physiol. (1992) 150:632-639).

Discusión

Se ha demostrado que un antígeno tumoral CD8 soluble fusionado con el fragmento B de la toxina Shiga se presenta de forma eficaz de una manera restringida por el HLA de clase I a LTC específicos. Aunque se observó cierta fragmentación proteolítica parcial de la proteína recombinante purificada, el procesamiento extracelular es poco probable debido a las siguientes razones: i) el epítopo Mage 1 de LTC es interno en la proteína de fusión Shiga B-Mage 1, y por lo tanto necesita dos o más fragmentaciones separadas y específicas para generar un péptido Mage 1 de unión a HLA-A1; ii) la ausencia de presentación de péptidos Mage 1 derivados de la proteína de fusión Shiga B-Mage 1 por las células T que en el mismo experimento mantuvieron la capacidad de unir y presentar péptidos Mage 1 sintéticos descarta la fragmentación extracelular (Figura 3); iii) las células presentadoras de antígenos fijadas con paraformaldehído fueron capaces de presentar péptidos Mage 1 exógenos sintéticos, aunque no procesaron proteínas de fusión Shiga B-Mage 1; y iv) Brefeldina A evitó la presentación del epítopo Mage 1 derivado de la proteína soluble Shiga B-Mage 1. Ya que Brefeldina A inhibe tanto el trasporte de Shiga B-Mage 1 al retículo endoplásmico (Johannes, L. et al., J. Biol. Chem. (1997) 272:19554-19561) como la asociación y transporte de los péptidos procesados con moléculas de clase I nacientes a la membrana plasmática (Monaco, J. J., Immunol. Today (1992) 13:173-179), su mecanismo exacto de inhibición permanece sin establecer. Sin embargo, los experimentos con BFA indican que la interiorización de la proteína de fusión Shiga B-Mage 1 es necesaria para la presentación eficaz restringida por HLA de clase I.

Equivalentes

Los expertos en la técnica reconocerán, o serán capaces de determinar usando nada más que la experimentación rutinaria, muchos equivalentes para las realizaciones específicas de la invención descritas aquí. Se pretende que tales equivalentes están abarcados por las siguientes reivindicaciones.

Claims (9)

1. El uso de un conjugado toxina-antígeno en el que la toxina del conjugado toxina-antígeno es la subunidad B de la toxina Shiga o la subunidad B de verotoxina, para la fabricación de un medicamento para estimular una respuesta inmunitaria contra el antígeno en un humano, en el que el medicamento que comprende el conjugado toxina-antígeno es para ser administrado a dicho humano de forma que se estimula una respuesta inmunitaria en dicho humano contra el antígeno.

2. El uso de la reivindicación 1, en el que dicho conjugado toxina-antígeno es para ser administrado a dicho humano de forma transcutánea a través de la piel o de una membrana mucosa; y opcionalmente

(a)

dicho conjugado toxina-antígeno se administra de forma transcutánea a través de la piel de dicho huma- no; o

(b)

dicha membrana mucosa está localizada en el tracto respiratorio, tracto gastrointestinal o tracto reproductivo de dicho humano; y además, opcionalmente

(i)

dicha membrana mucosa del tracto respiratorio se selecciona de las membranas mucosas de la nariz, garganta o pulmones de dicho humano, o

(ii)

dicha membrana mucosa del tracto gastrointestinal se selecciona de las membranas mucosas de la boca, garganta, estómago, intestino delgado, intestino grueso, colon, uretra o recto de dicho hu- mano.

3. El uso de la reivindicación 1, en el que dicho conjugado toxina-antígeno comprende un antígeno tumoral, un antígeno viral o un antígeno bacteriano; y opcionalmente

(a)

dicho antígeno tumoral deriva de un lisado tumoral; y además opcionalmente dicho antígeno tumoral deriva de tejido de pulmón, tejido de piel, tejido de mama, tejido de estómago, tejido de colon, tejido rectal o tejido de cerebro; o

(b)

dicho antígeno tumoral es un antígeno de melanoma.

4. El uso de la reivindicación 1, en el que dicho conjugado toxina-antígeno está asociado por medio de una interacción no covalente o un enlace covalente; y opcionalmente

(a)

dicho enlace covalente es un enlace de bromuro de cianógeno; o

(b)

dicha interacción no covalente es una interacción proteína-proteína, una interacción hidrofóbica, una interacción de Van der Waals o una interacción iónica.

5. El uso de la reivindicación 1, en el que:

(a)

dicho conjugado toxina-antígeno comprende además una señal de reenvío al retículo endoplásmico activa o inactiva;

(b)

el medicamento que comprende el conjugado toxina-antígeno se administra a dicho humano con un adyuvante;

(c)

dicho conjugado toxina-antígeno se produce de forma recombinante;

(d)

dicho conjugado toxina-antígeno comprende verotoxina B y un antígeno tumoral;

(e)

dicha respuesta inmunitaria implica la estimulación de las células dendríticas; y opcionalmente dichas células dendríticas incluyen células de Langerhans; y/o

(f)

dicho conjugado toxina-antígeno es para ser administrado a dicho mamífero de forma no invasiva.

6. El uso de un conjugado toxina-antígeno en el que la toxina del conjugado toxina-antígeno es la subunidad B de la toxina Shiga o la subunidad B de verotoxina, para la fabricación de un medicamento, en el que el medicamento que comprende el conjugado toxina-antígeno es para tratar un estado asociado a antígeno en un mamífero, que comprende administrar a dicho mamífero una cantidad efectiva de dicho conjugado toxina-antígeno, estimular una respuesta inmunitaria en dicho mamífero contra el antígeno, y por ello tratar dicho estado asociado a antígeno en dicho mamífero, en el que dicho estado asociado a antígeno es un tumor o una infección.

7. El uso de la reivindicación 6, en el que:

(a)

dicho conjugado toxina-antígeno es para ser administrado a dicho mamífero de forma transcutánea a través de la piel o de una membrana mucosa de dicho mamífero; y opcionalmente

(i)

dicho conjugado toxina-antígeno es para ser administrado de forma transcutánea a través de la piel de dicho mamífero, o

(ii)

dicha membrana mucosa está localizada en el tracto respiratorio, tracto gastrointestinal o tracto reproductivo de dicho mamífero;

(b)

dicho tumor es un tumor de piel, tumor de cerebro, tumor de pulmón, tumor de colon, tumor rectal o tumor de mama; y opcionalmente el tumor es un melanoma;

(c)

dicho conjugado toxina-antígeno comprende un antígeno tumoral de melanoma;

(d)

dicho mamífero es un humano;

(e)

adicionalmente comprende administrar un adyuvante;

(f)

dicho mamífero padece dicho estado asociado a antígeno;

(g)

dicho mamífero no padece dicho estado asociado a antígeno; y/o

(h)

dicho conjugado toxina-antígeno es para ser administrado de forma no invasiva.

8. Una composición farmacéutica que comprende un conjugado toxina-antígeno, en la que la toxina del conjugado toxina-antígeno es la subunidad B de verotoxina, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

9. La composición farmacéutica de la reivindicación 8, en la que:

(a)

dicha composición es adecuada para administración a un mamífero de forma transcutánea a través de la piel o de una membrana mucosa de dicho mamífero; y opcionalmente

(i)

dicha composición es adecuada para administración de forma transcutánea a través de la piel de dicho mamífero; o

(ii)

dicha membrana mucosa está localizada en el tracto respiratorio, tracto gastrointestinal o tracto reproductivo del mamífero;

(b)

dicho conjugado toxina-antígeno comprende un antígeno de melanoma;

(c)

dicho vehículo farmacéuticamente aceptable es adecuado para administración de forma oral, transdérmica o intrabronquial; y/o

(d)

dicho vehículo farmacéuticamente aceptable es adecuado para administración no invasiva.