ES2260445T3 - Formas mugtantes de etxb y de ctxb y su utilizacion como portadores. - Google Patents
Formas mugtantes de etxb y de ctxb y su utilizacion como portadores.Info
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Abstract
Utilización de una forma mutante de EtxB o de CtxB, en la que el mutante comprende una mutación en la región que comprende los residuos aminoácidos E51-I58 del bucle beta4-alfa2 y presenta una actividad de unión a GM-1 peroactividades inmunogénica e inmunomoduladora reducidas respecto a la forma de tipo salvaje de EtxB o de CtxB, en la preparación de un medicamento para suministrar un péptido exógeno en la ruta de procesamiento de antígenos de MHC de clase I de una célula presentadora de antígeno para inducir una respuesta de CTL para tratar y/o para prevenir una infección vírica o un cáncer.
Description
Formas mutantes de EtxB y de CtxB y su
utilización como portadores.
La presente invención se refiere a vehículos de
suministro/reconocimiento mejorados.
Más particularmente, la presente invención se
refiere a la utilización de formas mutantes de EtxB o de CtxB como
vehículos para suministrar y/o para dirigir un agente hasta un sitio
diana.
En particular, la presente invención se refiere
a la utilización de formas mutantes de EtxB o de CtxB como vehículos
para suministrar un agente a un sitio diana para el tratamiento de
una enfermedad o condición en un sujeto que lo necesita.
La enterotoxina lábil al calor de Escherichia
coli (E. coli) y su homólogo estrechamente relacionado,
la toxina del cólera (Ctx) de Vibrio cholerae, son ejemplos
de toxinas proteicas que se unen a receptores glucolipídicos en la
superficie de las células huésped. Cada toxina está constituida por
seis cadenas polipeptídicas unidas no covalentemente, incluyendo una
sola subunidad A (27 kDa) y cinco subunidades B idénticas (11,6 kDa)
que se unen a receptores gangliósidos GM-1 que se
encuentran sobre la superficie de las células de mamífero (Nashar
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 93:226-230,
1996). La subunidad A es responsable de la toxicidad, al poseer
actividad adenosina difosfato
(ADP)-ribosiltransferasa, mientras que las
subunidades B (EtxB y CtxB) son oligómeros no tóxicos que se unen y
entrecruzan con un gangliósido glucolipídico ubicuo de superficie
celular llamado GM-1, facilitando de esta manera la
entrada de la subunidad A en la célula.
En contraste con la pobre inmunogenicidad de la
subunidad A por sí sola, tanto EtxB como CtxB son inmunógenos
excepcionalmente potentes, y sus holotoxinas respectivas, Etx y Ctx
(que comprenden las subunidades A y B) son conocidas como potentes
adyuvantes cuando se administran oralmente en combinación con
antígenos no relacionados (Ruedl et al., Vaccine
14:792-798, 1996; Nashar et al., Vaccine
11:235, 1993; Nashar e Hirst, Vaccine 13:803, 1995; Elson y Ealding,
J. Immunol. 133:2892, 1984; Lycke y Holmgren, Immunology 59:301,
1986). Debido a su inmunogenicidad, tanto EtxB como CtxB han sido
utilizadas como portadores para otros epítopos y antígenos (Nashar
et al., ibid., 1993) y se han utilizado como
componentes de vacunas contra el cólera y contra enfermedades
diarreicas mediadas por E. coli (Jetborn et al.,
Vaccine 10:130, 1992).
Los presentes inventores han demostrado el hecho
inesperado de que la subunidad EtxB es capaz asimismo de actuar como
un inmunomodulador en los trastornos inmunológicos. A este respecto,
los presentes inventores han dado a conocer en el documento WO nº
97/02045 que EtxB se une a receptores gangliósidos
GM-1 que se encuentran sobre la superficie de las
células de mamífero y que esta unión induce efectos diferenciales
sobre las poblaciones de linfocitos, incluyendo un agotamiento
específico de células T CD8+ y una activación asociada de las
células B.
Uno de los efectos más inesperados y
sorprendentes de las subunidades B es su capacidad de desencadenar
la apoptosis selectiva de las células T CD8+, así como de alterar la
diferenciación de las células T CD4+, de activar las células B y de
modular el procesamiento y presentación de los antígenos por parte
de los macrófagos (Williams, N.A., Hirst, T.R. y Nashar, T.O.,
Immunol. Today 20:95-101, 1999). Estas potentes
propiedades inmunológicas han conducido a someter a ensayo las
subunidades B como adyuvantes para estimular las respuestas
mucosales y sistémicas frente a antígenos coadministrados (Verweij,
W.R., de Haan, L., Holtrop, M., Agsteribbe, E., Brands, R., van
Scharrenburg, G.J.M. y Wilschut, J., Vaccine
16:2069-2076, 1998; Richards, C.M., Aman, A.T.,
Hirst, T.R., Hill, T.J. y Williams, N.A., Journal of Virology
75:1664-1671, 2001) y como agentes para la
regulación negativa de enfermedades autoinmunológicas
proinflamatorias, tales como la artritis reumatoide y la diabetes
(Williams, N.A., Stasiuk, L.M., Nashar, T.O., Richards, C.M., Lang,
A.K., Day, M.J. e Hirst, T.R., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA)
94:5290-5295, 1997).
Estos efectos se encuentran ausentes cuando se
utiliza una proteína mutante EtxB (G33D) (sin actividad de unión a
GM-1). En consecuencia, estos resultados
experimentales sugieren que todas las funcionalidades asociadas con
EtxB y con CtxB son atribuibles a la capacidad de las subunidades
EtxB y CtxB de unirse al receptor GM-1 y que la
inmunomodulación y otros efectos de Etx y de Ctx se encuentran
mediados a través de la unión de GM-1 debido a que
los mutantes que carecen de la capacidad de unirse a
GM-1 (tal como EtxB (G33D)) no consiguen actuar como
adyuvantes ni como inmunomoduladores.
Es bien conocido que CtxB y EtxB contienen un
extenso segmento conservado que comprende los residuos 45 a 74, que
contiene un bucle descubierto entre Val-52 (V52) e
Ile-58 (I58) situado en la superficie enrollada
inferior de la molécula (Hirst, T.R., en: The Comprehensive
Sourcebook of Bacterial Protein Toxins, editores Freer, J.E.A. y J.
H., Academic Press, London, páginas 104-129, 1999).
Este bucle se encuentra normalmente orientado hacia la membrana
celular y forma parte de la superficie de unión a GM1, estando
implicados los residuos Gln-56,
His-57 e Ile-58 en una red de
puentes de hidrógeno mediados por el solvente, que se conserva en
presencia de GM1-pentasacárido unido (Merritt, E.A.,
Sixma, T.K., Kalk, K.H., Van Zanten, B.A.M. y Hol, W.G.J., Mol.
Microbiol. 13:745-753, 1994).
Los presentes inventores han demostrado en el
documento WO nº 00/14114 que las moléculas de CtxB con mutaciones
puntuales en tres sitios separados dentro del bucle
\beta4-\alpha2 (posiciones 51, 56 y 57)
conservan la actividad de unión a GM-1, pero carecen
de otras actividades, tales como toxicidad y la capacidad para
regular positivamente CD25 y de desencadenar la apoptosis de las
células T positivas para CD8. Los presentes inventores han
demostrado asimismo que las moléculas de EtxB con mutaciones
puntuales en la posición H57 de EtxB mostraban una pérdida similar
de capacidad de desencadenamiento/modulación de las poblaciones de
células inmunológicas. Además, las holotoxinas Ctx que comprenden
subunidades B con mutaciones mostraban asimismo un defecto en una
capacidad para desencadenar la secreción de cloruro electrogénico,
el suceso secretorio principal responsable de mediar en la diarrea.
Estos resultados demostraron claramente que las moléculas CtxB y
EtxB con mutaciones puntuales dentro del bucle
\beta4-\alpha2 eran capaces de unirse al
receptor GM-1 pero que carecían de un efecto
inmunomodulador, sugiriendo que no todos los efectos de Etx y de
Ctx, y en particular los efectos inmunomoduladores, estaban mediados
a través, aunque no exclusivamente, de la unión de
GM-1.
En particular, el documento WO nº 00/14114
confirmó la importancia del bucle E51-I58 de la
subunidad B, y en particular de H57, en la mediación de las
propiedades inmunomoduladoras de la molécula. Las enseñanzas en el
documento WO nº 00/14114 demostraron que el bucle
\beta4-\alpha2 de EtxB/CtxB es responsable de
una segunda actividad de unión y, por lo tanto, la utilización de
este bucle aisladamente del resto de la molécula de EtxB/CtxB (por
ejemplo como péptido), podría permitir que se produjese la segunda
actividad de unión en ausencia de la primera. De esta manera, la
mutación selectiva del bucle \beta4-\alpha2, o
de un péptido derivado del mismo, podría explotarse con el fin de
incrementar la afinidad de la actividad secundaria de unión.
Mediante el incremento de la afinidad de la actividad secundaria de
unión, podría evitarse además la interacción con
GM-1. En resumen, las enseñanzas del documento WO nº
00/14114 demostraron que la actividad "secundaria" de unión de
un péptido "bucle" aislado no es necesariamente dependiente de
un suceso primario de unión de GM-1, tal como se
observa en las CtxB y EtxB de longitud completa, para que medie en
la respuesta inmunomoduladora.
De esta manera, resulta evidente a partir de los
estudios anteriores que la subunidad B de tipo salvaje es un potente
inmunógeno y un potente inmunomodulador, mientras que las mutaciones
en la subunidad B pueden resultar o en la falta de unión de
GM-1 y la falta de inmunomodulación, o la
conservación de la unión de GM-1 pero sin capacidad
inmunomoduladora.
La capacidad de la subunidad B de modular la
respuesta inmunológica es dependiente de su capacidad de modular la
actividad de las células T, de las células B y de las poblaciones de
células presentadoras de antígeno. Cada uno de estos tipos celulares
desempeña un papel crítico en el desarrollo de la respuesta
inmunológica. En la respuesta normal a un organismo foráneo, los
antígenos resultan internalizados por células presentadoras de
antígeno, de las que las células presentadoras de antígenos
profesionales, tales como las células dendríticas, son las más
importantes. Estas células se encuentran especializadas en degradar
las proteínas formando secuencias cortas de aminoácidos (péptidos)
que se asocian con moléculas del complejo mayor de
histocompatibilidad (MHC) que después se transportan hasta la
superficie celular. Los péptidos foráneos unidos a moléculas MHC de
clase II resultan reconocidas por células T ayudantes (células T
CD4+) que, como resultado, se activan y empiezan a dividirse, a
diferenciarse y a secretar mensajeros similares a hormonas llamados
citoquinas. Las células T ayudantes seguidamente coordinan y
mantienen la respuesta inmunológica.
Las respuestas posteriores pueden implicar la
activación de: i) células B, que maduran para formar células
plasmáticas capaces de producir anticuerpos, ii) macrófagos y
neutrófilos, que entran en los sitios de infección e ingieren
material foráneo, conduciendo a su destrucción, e iii) otros tipos
de célula T (células T CD8+), que pueden reconocer células
corporales infectadas por virus y eliminarlas. La mayoría de las
respuestas inmunológicas normales implican la activación de todos
estos componentes en algún grado. Sin embargo, resulta evidente que
determinados factores pueden afectar qué componentes particulares
son dominantes.
Además, en determinadas circunstancias resulta
claramente beneficioso poder crear a medida el tipo de respuesta que
se induce. A título de ejemplo, es bien conocido que los linfocitos
T citotóxicos (CTL) desempeñan un papel central en la vigilancia
inmunológica mediante el reconocimiento de los péptidos antigénicos
foráneos unidos a moléculas de MHC de clase I y la eliminación de
células infectadas por virus y las potencialmente cancerosas. De
esta manera, resultaría ventajoso crear a medida la respuesta
inmunológica en el sentido de crear respuestas de células T
citotóxicas con el fin de facilitar la eliminación de los agentes
infecciosos que residen dentro de las células del cuerpo, tales
como virus y determinadas bacterias.
La inducción efectiva de respuestas de células T
citotóxicas requiere la entrada de antígenos en el citosol de las
células presentadoras de antígenos, donde pueden introducirse en la
ruta endógena de procesamiento y presentación del MHC de clase I.
Sin embargo, las estrategias de inmunización actuales, con antígenos
péptidos o proteínas, no consiguen inducir generalmente una
respuesta CTL debido a que estos antígenos son incapaces, o son sólo
parcialmente capaces, de acceder a los compartimientos
intracelulares donde se produce la carga de las moléculas de clase
I. De esta manera, se requiere un sistema eficiente de suministro
que resulte en el envío de los antígenos hasta el citosol.
Es conocido que pueden utilizarse EtxB o CtxB de
tipo salvaje como vehículos para el suministro de péptidos unidos
hacia el interior de las células, tales como las células que portan
el MHC de clase I o las APCs profesionales, con el fin de conseguir
la presentación de dichos determinantes antigénicos por las
moléculas MHC de clase I. Las enseñanzas del documento WO nº
99/58145 indican asimismo que el EtxB o CtxB de tipo salvaje libre
de la toxina completa puede utilizarse en un conjugado con un
péptido o con un determinante antigénico para dirigir su suministro
a una célula.
Una desventaja potencial asociada a la
utilización de EtxB o de CtxB de tipo salvaje es que las potentes
respuestas inmunológicas producidas por estas moléculas podrían
evitar su utilización repetida como vehículos farmacológicos. Otra
desventaja potencial de la utilización de EtxB o de CtxB de tipo
salvaje es que sus capacidades inmunomoduladoras regulan
negativamente o suprimen determinadas respuestas de células T
ayudantes, que en otras circunstancias podrían resultar beneficiosas
para producir una respuesta inmunológica preferida o beneficiosa. De
esta manera, resulta deseable encontrar nuevas maneras de
suministrar un agente a un compartimiento intracelular de una célula
diana sin desencadenar una potente respuesta inmunomoduladora o una
potente respuesta inmunológica, tal como la inducida por moléculas
CtxB o EtxB de tipo salvaje.
El documento WO nº 01/27144 se refiere a una
proteína de subunidad AB_{5} B que comprende por lo menos una
mutación que altera el número de residuos aminoácidos disponibles
para la modificación química en comparación con la proteína de
subunidad AB_{5} B de tipo salvaje, conservando la proteína
recombinante una actividad efectiva de unión al ligando diana.
La presente invención proporciona la utilización
de una forma mutante de EtxB o de CtxB en la que el mutante
comprende una mutación en la región que comprende los residuos
aminoácidos E51-I58 del bucle
\beta4-\alpha2 y presenta una actividad de unión
a GM-1, pero en la que el mutante presenta una
actividad inmunogénica e inmunomoduladora reducida en comparación
con la forma de tipo salvaje de EtxB o de CtxB, para la preparación
de un medicamento para el suministro de un péptido exógeno en la
ruta de procesamiento del antígeno MHC de clase I de una célula
presentadora de antígeno para inducir una respuesta CTL con el fin
de tratar y/o prevenir una infección vírica o un cáncer.
Se presentan otros aspectos de la presente
invención en las reivindicaciones adjuntas y en la descripción y
comentario siguientes. Estos aspectos se presentan en secciones
separadas. Sin embargo, debe interpretarse que las enseñanzas en
cada sección no se encuentran necesariamente limitadas al título
particular de cada sección.
Los presentes inventores han descubierto ahora
formas mutantes de CtxB y de EtxB que se unen a receptores
GM-1 que son capaces de actuar como vehículos de
suministro que no desencadenan ni una potente respuesta
inmunomoduladora ni una potente respuesta inmunológica antiportador
(es decir, una potente respuesta inmunogénica). Las formas/derivados
mutantes de CtxB y de EtxB de la presente invención pueden unirse a
GM-1 y entrar en las células de mamífero, aunque
presentan una inmunogenicidad reducida y una capacidad de
inmunomodulación reducida.
Aunque los expertos en la materia conocían que
el receptor GM-1 actúa como receptor funcional para
Ctx/CtxB y para Etx/EtxB, no se ha informado ni se ha sugerido en la
técnica anterior la posibilidad de que las formas mutantes de CtxB o
de EtxB que se unen a GM-1 pero que no presentan
ningún efecto potente inmunogénico o inmunomodulador, puedan
utilizarse como vehículos para el suministro de agentes en el
interior de las células de mamífero sin inducir ningún posible
efecto secundario no deseable que podría impedir la utilización
repetida del grupo portador.
La presente invención resulta ventajosa debido a
que la capacidad de las formas mutantes de CtxB y de EtxB de entrar
en las células de mamífero sin inducir una potente respuesta
antisubunidad B ni una respuesta inmunomoduladora implica que los
mutantes son mejores vehículos de administración de fármaco o de
péptido para agentes, tales como fármacos o péptidos antigénicos,
que las moléculas EtxB o CtxB de tipo salvaje correspondientes.
La presente invención resulta asimismo ventajosa
debido a que el mutante de la presente invención, que presenta un
efecto sobre la internalización vesicular mediada por la unión de
GM1, puede encontrarse unido, mediante, por ejemplo, conjugación con
un agente, tal como un antígeno o un determinante antigénico,
regulando positivamente la presentación del antígeno o del
determinante antigénico, o del determinante antigénico derivado de
dicho antígeno, por parte de moléculas de MHC de clase I,
estimulando respuestas CTL.
La administración de agentes, tales como
antígenos o determinantes antigénicos, resulta ventajosa debido a
que la administración permite la presentación de agentes, tales como
antígenos o determinantes antigénicos sobre las moléculas de MHC de
clase I, que pueden conducir a la inducción de respuestas de células
T restringidas por el MHC de clase I. Tal como se ha indicado
anteriormente, estas repuestas resultan beneficiosas en que
proporcionan protección frente a enfermedades y a condiciones, tales
como infecciones víricas y cánceres.
El suministro de agentes, tales como
profármacos, utilizando las formas mutantes de CtxB y de EtxB
resulta especialmente ventajosa si el profármaco resulta activado
por su entrada en endosomas ácidos. Además, la presente invención
resulta ventajosa debido a que las formas mutantes de CtxB o de EtxB
pueden manipularse para suministrar selectivamente uno o más agentes
hasta el citosol y/o al núcleo de una célula diana de mamífero.
Se comentan y ponen de manifiesto otras ventajas
mediante el comentario siguiente.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el
término "Ctx" se refiere a la toxina del cólera, y "CtxB"
se refiere a la subunidad B de la toxina del cólera. En otros
textos, dichas toxinas en ocasiones pueden identificarse como
"CT" o "Ct" y como "CTB" o "CtB",
respectivamente.
El término "Etx" en la presente memoria se
refiere a la enterotoxina de E. coli lábil al calor, y
"EtxB" es la subunidad B de Etx. En otros textos, dichas
moléculas en ocasiones pueden identificarse como "LT" o
"Lt" y como "LTB" o "LtB", respectivamente.
Tal como se utiliza en la presente memoria, la
expresión "CtxB o EtxB de tipo salvaje" se refiere a una
molécula de CtxB o de EtxB con una actividad que es sustancialmente
la misma que la de moléculas nativas de CtxB o de EtxB. Es decir, la
expresión incluye moléculas que conservan la capacidad de unirse a
GM1 y/o la capacidad de imitar los efectos de unión a GM1 y que
conservan la capacidad inmunomoduladora de estas subunidades B.
Tal como se utiliza en la presente memoria, la
expresión "forma mutante de CtxB y de EtxB" se refiere a una
subunidad de CtxB o de EtxB y a variantes o derivados de la misma,
así como a variantes y/o derivados de la secuencia nucleótida
codificante de estas moléculas de proteína, que conservan la
capacidad de unirse a GM1 y/o la capacidad de imitar los efectos de
unión a GM1 pero que no conservan las potentes propiedades
inmunogénicas e inmunomoduladoras observadas en las subunidades EtxB
o CtxB de tipo salvaje, o que presentan una actividad inmunogénica e
inmunomoduladora sustancialmente reducida respecto a las subunidades
EtxB o CtxB de tipo salvaje. Puede surgir naturalmente una forma
mutante de CtxB o de EtxB o puede crearse artificialmente (por
ejemplo mediante mutagénesis sitio-dirigida o
mediante adiciones, sustituciones o deleciones en el bucle
\beta4-\alpha2 de CtxB o de EtxB).
En los mutantes utilizados en la presente
invención, la mutación se encuentra en la región que comprende los
residuos aminoácidos E51-I58 del bucle
\beta4-\alpha2 de CtxB o de EtxB.
Preferentemente, la mutación se encuentra en los
residuos aminoácidos 51, 56 y/o 57 del bucle
\beta4-\alpha2 de CtxB o de EtxB.
Preferentemente, la mutación es una mutación
puntual en el aminoácido His57. Preferentemente, la mutación se
encuentra en un aminoácido alanina (A) o en una serina (S) (en
adelante denominada mutación H57A o H57S).
Los términos "variante" o "derivado"
en relación a las subunidades mutantes de EtxB y de CtxB de la
presente invención incluyen cualquier sustitución, variación,
modificación, sustitución, deleción o adición de uno (o más)
aminoácidos o de la secuencia aminoácida que comprende la molécula
de tipo salvaje de EtxB o de CtxB, o cualquier sustitución,
variación o modificación de la secuencia nucleótida que codifica las
subunidades de tipo salvaje de EtxB o de CtxB, con la condición de
que la entidad resultante comprenda una mutación en la región que
comprende los residuos aminoácidos E51-I58 del bucle
\beta4-\alpha2 y conserve la actividad de unión
a GM-1 pero sin conservar un grado igual o similar
de las potentes propiedades inmunogénicas e inmunomoduladoras de las
subunidades de tipo salvaje de CtxB o EtxB. La variante o derivado
no procede necesariamente del tipo salvaje de EtxB o de CtxB. A
título de ejemplo, la variante o derivado puede expresarse y/o
sintetizarse a partir de, o mediante la utilización de, productos
iniciales adecuados, de manera que el producto final imite la
actividad de la forma mutante de CtxB y/o de EtxB.
La expresión "forma mutante de CtxB y de
EtxB" puede utilizarse de manera intercambiable con "forma
mutante" de la subunidad B a lo largo del texto, o simplemente
utilizarse el "mutante" de la presente invención.
Para evitar dudas, la expresión "forma mutante
de CtxB y de EtxB" no incluye la forma de tipo salvaje de CtxB y
de EtxB.
Las formas mutantes de CtxB y de EtxB, tal como
se utiliza en la presente memoria incluyen formas naturales de la
molécula que se han aislado y formas recombinantes y/o sintéticas de
las moléculas.
Preferentemente, las formas mutantes de CtxB y
de EtxB se preparan utilizando medios recombinantes.
Las formas mutantes recombinantes de CtxB y de
EtxB pueden producirse mediante un procedimiento en el que el gen o
genes que codifican la cadena (o cadenas) polipeptídicas a partir de
las que se forma la subunidad B mutante, se insertan en un vector
adecuado y se utilizan después para transfectar un huésped adecuado.
Por ejemplo, el gen que codifica la cadena polipeptídica de la
subunidad EtxB puede insertarse en, por ejemplo, un vector plásmido
pMMB66EH para generar pMMB68 que se utiliza después para transfectar
células huésped, tales como Vibrio sp. 60. La proteína se
purifica y se aisla de una manera conocida per se. Los
agentes mutantes que expresan las subunidades mutantes activas CtxB
y EtxB pueden producirse mediante procedimientos conocidos a partir
de los genes de tipo salvaje de las subunidades CtxB y EtxB.
Preferentemente, las formas mutantes de CtxB y
de EtxB se han aislado sustancialmente y/o son sustancialmente puras
y/o se encuentran sustancialmente libres de toxinas.
Tal como se utiliza en la presente memoria, los
términos "aislado" y "purificado" se refieren a moléculas,
sea secuencias nucleicas o aminoácidas, que se extraen de su
ambiente natural y/o se aislan o se separan de por lo menos otro
componente con el que se encuentran asociadas naturalmente. Puede
mezclarse una proteína con portadores o diluyentes que no
interfieran con el fin pretendido de la sustancia y todavía
considerarse como sustancialmente aislada.
El receptor gangliósido GM1 es un miembro de la
familia de los gangliósidos que comprende glucolípidos que contienen
ácido siálico (también llamados glucoesfingolípidos), que están
formados de una parte hidrofóbica, la ceramida, y una parte
hidrofílica, que es la cadena oligosacárida. Los gangliósidos se
definen como cualquier oligosacárido ceramida que porta, además de
otros residuos sacáridos, uno o más residuos siálicos (Oxford
Dictionary of biochemistry and molecular biology. Oxford University
Press, 1997, editores: Smith, A.D., Datta, S.P., Howard Smith, G.,
Campbell, P.N., Bentley, R. y McKenzie, H.A.). Aunque descrito por
primera vez en tejido neural, varios estudios han demostrado que los
gangliósidos son moléculas casi ubicuas que se expresan en todos los
tejidos de vertebrado. Dentro de las células, los gangliósidos
habitualmente se encuentran asociados a las membranas plasmáticas,
donde pueden actuar como receptores para una diversidad de moléculas
y participar en interacciones célula-célula y en la
transducción de señales. Además, los gangliósidos se expresan en
membranas del citosol, tales como las de gránulos secretorios de
algunas células endocrinas, tales como los islotes pancreáticos y la
médula adrenal.
Los gangliósidos contienen en sus grupos
oligosacáridos de cabeza, uno o más residuos de un ácido siálico que
proporciona a la cabeza polar de los gangliósidos una carga neta
negativa a pH 7,0. El ácido siálico que se encuentra habitualmente
en los gangliósidos humanos es el ácido
N-acetilneuramínico. Se han identificado más de 20
tipos diferentes de gangliósidos, diferentes por el número y
posición relativa de la hexosa y de los residuos siálicos,
constituyendo la base de su clasificación. Prácticamente la
totalidad de los gangliósidos conocidos presentan un residuo glucosa
en enlace glucosídico con la ceramida, encontrándose presentes
también D-galactosa y
N-acetil-D-galactosamina.
En la nomenclatura de los gangliósidos, diseñada
por Svennerholm (Biochemistry, Lehninger, 2a edición, Worth
Publishers Inc., páginas 294-295, 1975), los
subíndices indican el número de grupos siálicos. M es monosialo, D
es disialo y T es trisialo.
Uno de los miembros mejor estudiados de la
familia de los gangliósidos es el monosialosilgangliósido, GM1, que
se ha demostrado que es el receptor natural de la toxina del cólera.
El gangliósido soluble GM1 se une a la toxina con elevada afinidad y
la inactiva (Svennerholm, Adv. Exp. Med. Biol.
71:191-204, 1976).
La fórmula química de GM1 puede representarse
como:
Gal
\beta3GalNAc \beta4(NeuAc \alpha3)Gal
\beta4Glc \beta1
Cer
en la que Glc es
D-glucosa, Gal es D-galactosa,
GalNAc es
N-acetil-D-galactosamina;
NeuAc es ácido N-acetilneuramínico, Cer es
ceramida.
La fórmula química de GM1 también puede
representarse como:
galactosil-N-acetilgalactosaminil{sialosil}lactosil
ceramida
o
como:
galactosil-N-acetil-galactosaminil-(sialil)-galactosilglucosilceramida
Las estructuras de difracción de rayos X de Etx
unido a lactosa (Sixma et al., Nature (London)
355:561-564, 1992) y de CtxB unido al pentasacárido
de GM1 (Merritt et al., Protein Sci.
3:166-175, 1994) revelaron que CtxB y EtxB se unen a
los grupos de galactosa terminal y de ácido siálico de GM1 y que
esta unión no induce ningún cambio notable en la conformación de la
subunidad B.
La expresión "actividad de unión de GM1" se
refiere a una entidad, tal como una subunidad de CtxB o de EtxB o
una forma mutante de la misma, que es capaz de interaccionar con un
receptor gangliósido GM1.
Resultaría fácil determinar un ensayo para la
determinación de la actividad de unión de GM-1 para
los expertos en la materia. Por ejemplo, el ensayo puede utilizar
GM-1 unido a un soporte sólido y en el que la
sustancia seguidamente se pasa a través del GM-1
unido. La no elución de la forma mutante es indicativa de que no se
une a GM-1. En un aspecto más preferente, el ensayo
es el descrito en la patente WO nº 97/02045.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el
término "inmunogénico" se refiere a una respuesta antisubunidad
B (denominada asimismo respuesta antiportador). El término
"inmunogénico" no se refiere a una respuesta contra ningún
antígeno asociado a la subunidad B y/o contra cualquier antígeno que
pueda portar la subunidad B.
El término "inmunomodulador" o "molécula
inmunomoduladora" o "factor o factores inmunomoduladores"
se refiere a moléculas o factores que, cuando son producidos por una
o más células implicadas en una respuesta inmunológica o
inflamatoria, o que, cuando se añaden exógenamente a las células,
provocan que la respuesta inmunológica o inflamatoria sea diferente
en calidad o en potencia a la que se habría producido en ausencia
del factor.
Un inmunomodulador puede modular la respuesta
inmunológica mediante la alteración, por ejemplo, de la reactividad
específica o los mecanismos no específicos del huésped asociados a
efectores. A título de ejemplo, un inmunomodulador puede
desencadenar sucesos de señalización celular o inducir potentes
respuestas inmunológicas antisubunidad B o ser capaz de inducir, por
ejemplo, un efecto diferencial sobre células, tales como las células
linfocitarias, conduciendo preferentemente a la inducción de la
apoptosis de las células T CD8+ y/o a la activación incrementada de
las células CD4+ y/o a la activación policlonal de las células B y/o
a una modulación de la expresión y/o de los niveles de las moléculas
inmunoestimulatorias, tales como las citoquinas, linfoquinas y/o
cofactores inmunológicos. La expresión "efecto diferencial sobre
las células leucocitarias" puede incluir, aunque sin limitarse a
ellas, un agotamiento específico de las células CD8+ (a través de,
por ejemplo, apoptosis), la activación incrementada de las células T
CD4+ (las células T ayudantes (Th)) y/o una activación asociada de
las células B. El inmunomodulador también puede ser capaz de regular
negativamente la respuesta patológica de las respuestas
inmunológicas asociadas a Th1 y/o a Th2 y de regular positivamente
la producción de anticuerpos en las superficies mucosales.
Los efectos inmunomoduladores observados con el
EtxB o el CtxB de tipo salvaje pueden ser un efecto de señalización
intracelular mediado por GM-1 que puede
desencadenarse con la unión de GM-1. Sin
restringirse a ninguna teoría en particular, la unión de las
subunidades B a receptores, tales como GM1, desencadena una
transducción de señales e induce la internalización de toxinas. El
entrecruzamiento pentamérico del receptor GM1 causa alteraciones
locales en la dinámica membranal y en el ambiente microlipídico, que
a su vez influyen sobre la actividad de las proteínas integrales de
membrana que participan en la señalización celular, o pueden
alternativamente permitir la interacción directa o indirecta de
moléculas de CtxB o de EtxB unidas a moléculas asociadas a membrana
responsables de desencadenar la señalización resultante en
inmunomodulación.
Un ensayo para la determinación de si una forma
mutante de EtxB o de CtxB presenta propiedades inmunomoduladores
resultaría fácilmente determinable para los expertos en la materia.
Por ejemplo, el ensayo puede medir y/o determinar un efecto sobre
las poblaciones celulares, tales como las poblaciones de células
linfocitarias. Entre estos efectos puede incluirse, aunque sin
limitarse a ellos, una inducción de la apoptosis de las células T
CD8+, la activación incrementada de las células T CD4+ (células Th)
y la activación policlonal de las células B. Además, o
alternativamente, el ensayo podría basarse en determinar y/o en
medir uno o más marcadores particulares de superficie celular
indicativos de activación de determinados sucesos intracelulares
(por ejemplo medir un incremento de la expresión de CD25). La
calidad o la potencia de una respuesta puede medirse mediante una
diversidad de otros ensayos conocidos por un experto en la materia.
Entre estos ensayos pueden incluirse, aunque sin limitarse a ellos,
estudios in vivo, tales como estudios de animales completos
para respuestas inmunogénicas y/o inmunomoduladoras o estudios in
vitro para medir las mismas.
Pueden utilizarse formas mutantes de CtxB o de
EtxB para suministrar un agente a una célula diana de mamífero. El
agente puede ser un péptido de interés o una secuencia proteica de
interés (POI), un antígeno, un determinante antigénico, un
anticuerpo y una secuencia nucleótida de interés (NOI). El término
"agente" puede incluir uno o más agentes. A título de ejemplo,
pueden utilizarse agentes para transportar uno o más POIs, uno o más
antígenos y/o uno o más determinantes antigénicos y/o uno o más NOIs
hasta una célula diana de mamífero. El agente puede ser un agente
terapéutico y/o diagnóstico.
En la presente invención, la forma mutante de
EtxB o de CtxB se utiliza para suministrar un péptido exógeno a la
ruta de procesamiento de antígeno del MHC de clase I de una célula
presentadora de antígeno.
La expresión "péptido translocador de membrana
o fusigénico" se utiliza en la presente memoria para referirse a
cualquier péptido que interacciona y/o penetra en una membrana de
célula de mamífero. A título de ejemplo, puede derivarse un péptido
translocador de membrana o un péptido fusigénico a partir de una
proteína viral y puede comprender elementos del segmento
Pol-bucle, derivado de un dominio en la región
C-terminal de la polimerasa de
HSV-1.
HSV-1.
Preferentemente, el antígeno puede derivarse de
un antígeno asociado a tumor (TAA).
La expresión "antígeno asociado a tumor
(TAA)" se utiliza en la presente memoria para referirse a
cualquier TAA o péptido antígeno del mismo. El antígeno es uno
expresado por el tumor mismo o por las células asociadas con el
tumor, tales como las células parenquimatosas o de la vasculatura
asociada. La expresión "antígeno asociado a tumor (TAA)"
incluye los antígenos que distinguen a las células tumorales de sus
contrapartidas celulares normales, en las que pueden encontrarse
presentes en cantidades traza.
Alternativamente, el antígeno puede derivarse
asimismo de agentes patogénicos derivados de células tumorales que
se multiplican sin restricción en un organismo y que de esta manera
puede conducir a tumores patológicos. Se describen ejemplos de estos
agentes patogénicos en Davis, B.D. et al. (Microbiology, 3a
edición, Harper International Edition). Entre estos antígenos pueden
incluirse los antígenos asociados a tumor (TAA), que pueden servir
como dianas para el sistema inmunológico del huésped y provocar
respuestas que resultan en la destrucción del tumor. Entre los
ejemplos de estos antígenos se incluyen, aunque sin limitarse ellos,
MART-1 (antígeno de melanoma reconocido por las
células T-1), MAGE-1,
MAGE-3, 5T4, gp100, antígeno carcinoembrionario
(CEA), antígeno específico de próstata (PSA), mucina
(MUC-1) y tirosinasa.
Preferentemente, el antígeno es derivable de un
agente infeccioso.
Preferentemente, el antígeno es derivable de un
antígeno vírico.
En una forma de realización de la presente
invención, el antígeno puede derivarse de virus patogénicos. Entre
estos se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, el virus de la
inmunodeficiencia humana (VIH) (antígenos GP-120,
p17 y GP-160), influenza (antígenos NP y HA), herpes
simplex (antígeno HSVdD), virus del papiloma humano, virus de la
encefalitis equina, hepatitis (antígeno de superficie HepB), virus
de la leucemia felina, enfermedad de Carré, virus de la rabia, virus
de Epstein-Barr (EBV) y virus influenza.
En otra forma de realización de la presente
invención, el determinante antigénico puede derivarse a partir de
bacterias patogénicas, que incluyen, aunque sin limitarse a ellas,
clamidias, micobacterias, Plasmodium falciparum y Legionella.
Entre los protozoos patogénicos se incluyen, aunque sin limitarse a
ellos, malaria, Babesia, esquistosoma, Toxiplasma y
Toxocara canis. Entre las levaduras patogénicas se incluyen
Aspergillus y las Candida invasivas. En una forma de
realización preferida, el microorganismo patogénico es un organismo
intracelular.
Si el agente infeccioso se selecciona de entre
el grupo constituido por E. coli enteropatogénica,
enterotoxigénica, enteroinvasiva, enterohemorrágica y
enteroagregativa, el determinante antigénico puede ser un
determinante antigénico de una toxina o factor de adhesión
bacterianos.
Existen varios procedimientos conocidos mediante
los que resulta posible aislar un antígeno de interés. Por ejemplo,
puede extraerse un agente antigénico que comprende uno o más
antígenos protectores a partir del agente, o partir de células
infectadas por el agente, mediante la utilización de procedimientos
que permiten la recuperación de los antígenos. Ello puede incluir la
utilización de técnicas de disrupción celular para lisar las
células, tales como la sonicación y/o la extracción con detergente.
Pueden utilizarse la centrifugación, la ultrafiltración o la
precipitación con preparaciones de antígeno recolectado. La
preparación de antígeno que contiene glucoproteínas
HSV-1 descrita en Richards et al., J. Infect.
Dis. 177:1451-7, 1998, ejemplifica este
procedimiento.
Además, pueden extraerse antígenos de un agente
antigénico, o de células infectadas por uno de dichos agentes
mediante una diversidad de procedimientos, incluyendo, aunque sin
limitarse a ellos, la extracción con urea, la extracción con álcali
o con ácido, o la extracción con detergente, y someterse a
continuación a separación cromatográfica. Los materiales recuperados
vacíos o en picos de elución que comprenden uno o más antígenos
protectores potenciales pueden utilizarse en formulaciones de
vacuna.
Alternativamente, pueden clonarse genes que
codifican uno o más antígenos protectores potenciales en una
diversidad de vectores de expresión adecuados para la producción de
antígenos. Entre los mismos pueden incluirse los sistemas de
expresión bacterianos o eucarióticos, por ejemplo Escherichia
coli, Bacillus spp., Vibrio spp., Saccharomyces
cerevisiae, líneas celulares de mamífero y de insecto. Los
antígenos pueden recuperarse mediante procedimientos convencionales
de extracción, de separación y/o de cromatografía.
Preferentemente el agente es un determinante
antigénico.
La expresión "determinante antigénico", tal
como se utiliza en la presente memoria, se refiere a un sitio en un
antígeno que resulta reconocido por un receptor de células T o por
un anticuerpo. Preferentemente es un péptido corto derivado de un
antígeno proteico o como parte del mismo. Sin embargo, el término
pretende asimismo incluir péptidos con epítopos glucopéptido y
carbohidrato. El término incluye asimismo secuencias modificadas de
aminoácidos o carbohidratos que estimulan respuestas que reconocen
el organismo completo.
Resulta ventajoso que el determinante antigénico
proceda de un agente infeccioso (tal como una bacteria o un virus)
que causa la enfermedad infecciosa.
El determinante antigénico puede derivarse de
virus patogénicos. Entre los mismos se incluyen, aunque sin
limitarse a ellos, el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH)
(antígenos GP-120, p17 y GP-160),
influenza (antígenos NP y HA), herpes simplex (antígeno HSVdD),
virus del papiloma humano, virus de la encefalitis equina, hepatitis
(antígeno de superficie HepB), virus de la leucemia felina,
enfermedad de Carré, virus de la rabia, virus de
Epstein-Barr (EBV) y virus influenza.
A título de ejemplo, si el agente infeccioso es
EBV, el determinante antigénico puede ser uno de entre gp340 o
gp350, o de una proteína latente, tal como, por ejemplo, EBNAs 1, 2,
3A, 3B, 3C y -LP, LMP-1, -2A y 2B o un EBER.
Si el agente infeccioso es un virus influenza,
el determinante antigénico puede derivarse de una proteína interna
(por ejemplo una nucleoproteína) o el determinante antigénico puede
derivarse de una proteína de cubierta viral, tal como, por ejemplo,
hemaglutinina y neuraminidasa.
Preferentemente el determinante antigénico es un
producto génico temprano inmediato, temprano, o tardío de un virus,
tal como el virus herpes.
Preferentemente el determinante antigénico puede
derivarse de una proteína interna (por ejemplo una nucleoproteína) o
de una proteína de cubierta viral, tal como, por ejemplo,
hemaglutinina y neuraminidasa.
Si el agente infeccioso se selecciona de entre
el grupo constituido por E. coli enteropatogénico,
enterotoxigénico, enteroinvasivo, enterohemorrágico y
enteroagregativo, el determinante antigénico puede ser de una toxina
bacteriana o de un factor de adhesión.
El determinante antigénico puede derivarse
asimismo de bacterias patogénicas, incluyendo, aunque sin limitarse
a ellas, clamidias, micobacterias, Plasmodium falciparum y
Legionella. Entre los protozoos patogénicos se incluyen,
aunque sin limitarse a ellos, malaria, Babesia, esquistosoma,
Toxiplasma y Toxocara canis.
Alternativamente, el determinante antigénico
puede derivarse asimismo de agentes patogénicos derivados de células
tumorales que se multiplican sin restricción en un organismo y de
esta manera pueden conducir a tumores patológicos. Se describen
ejemplos de estos agentes patogénicos en Davis, B.D. et al.
(Microbiology, 3a edición, Harper International Edition). Entre
estos determinantes antigénicos pueden incluirse los antígenos
asociados a tumores (TAA), que pueden servir como dianas para el
sistema inmunológico del huésped e inducir respuestas que resultan
en la destrucción del tumor. Entre los ejemplos de estos antígenos
se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, MART-1
(antígeno del melanoma reconocido por las células
T-1), MAGE-1,
MAGE-3, 5T4, gp100, antígeno carcinoembrionario
(CEA), antígeno específico de la próstata (PSA), mucina
(MUC-1) y tirosinasa.
Existen varios procedimientos conocidos por los
que resulta posible identificar los determinantes antigénicos para
un agente antigénico dado. Por ejemplo, pueden identificarse
antígenos protectores potenciales elevando las respuestas
inmunológicas en pacientes infectados o convalecientes, en animales
infectados o convalecientes, o mediante el seguimiento in
vitro de las respuestas inmunológicas a preparaciones que
contienen antígeno.
Pueden identificarse, aislarse y clonarse otros
TAAs mediante procedimientos conocidos de la técnica, tales como
aquellos dados a conocer en la patente US nº 4.514.506.
El mutante y el agente de la presente invención
pueden encontrarse ligados formando una entidad única.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el
término "ligado", que es sinónimo del término "acoplado",
se refiere a que el mutante y el agente puede ligarse mediante una
diversidad de procedimientos para facilitar la traslocación del
agente a la célula diana, preferentemente hasta el citosol y/o hasta
el núcleo de la célula diana de mamífero.
El término "ligado" o "ligamiento"
incluye, aunque sin limitación, el ligamiento genético y la
conjugación química. El ligamiento del mutante con el agente incluye
asimismo, aunque sin limitación, el ligamiento directo (tal como
mediante un enlace iónico o covalente) o indirecto, por ejemplo
mediante la provisión de grupos espaciadores adecuados. A título de
ejemplo, el agente y el mutante puede ligarse covalentemente,
formando un solo grupo/entidad activa. El mutante y/o agente pueden
ligarse asimismo a otra entidad.
En una forma de realización de la presente
invención, el mutante de la presente invención se encuentra
químicamente conjugado con el agente. Preferentemente el mutante se
conjuga con el agente utilizando un reactivo reticulante
bifuncional, tal como un reactivo reticulante heterobifuncional. Más
preferentemente, el agente reticulante es
N-\gamma(maleimido-butiroxil)-succinimida
éster (GMBS) o
N-succinimidil-(3-piridil-ditio)-propionato
(SPDP).
Todavía más preferentemente, el agente se
conjuga a EtxB mediante la utilización del reticulante bifuncional
químico
N-(gamma-maleimido-butiril-oxi)-succinimida
(GMBS) (Pierce).
En otra forma de realización de la presente
invención, el mutante y el agente se encuentran genéticamente
ligados, sea directamente formando una proteína de fusión, o
indirectamente, mediante, por ejemplo, espaciadores o aislantes.
Preferentemente el agente, tal como un antígeno o un determinante
antigénico, se encuentra genéticamente ligado al extremo
amino-terminal o C-terminal de la
forma mutante de la subunidad B.
Preferentemente, la proteína de fusión comprende
un antígeno o un determinante antigénico que se encuentra fusionado
con el mutante de la presente invención. El antígeno o determinante
antigénico puede unirse al extremo amino-terminal o
carboxi-terminal del mutante.
En una forma de realización preferida de la
presente invención, el mutante de la presente invención, que
presenta como diana la internalización vesicular mediada por la
unión de GM1, puede ligarse mediante, por ejemplo, conjugación con
un agente, tal como un antígeno o un determinante antigénico,
regulando positivamente la presentación del antígeno o del
determinante antigénico, o del determinante antigénico derivado de
dicho antígeno, por las moléculas de MHC de clase I, estimulando las
respuestas apropiadas de CTL. La estimulación de las respuestas de
CTL resulta particularmente útil en la prevención y el tratamiento
de las infecciones víricas, tales como, por ejemplo, influenza, y en
la estimulación de respuestas a un antígeno asociado a tumor
(TAA).
Tal como se utiliza en la presente memoria, la
expresión "linfocitos T citotóxicos (CTL)" se utiliza para
referirse a los CTL que resultan típicamente inducidos o estimulados
por la expresión de una estructura de reconocimiento de superficie
celular, tal como un péptido procesado específico de un patógeno,
conjuntamente con el MHC de clase I sobre una célula presentadora de
antígeno que porta MHC de clase I (APC). Los CTL pueden funcionar de
más de una manera. La función mejor conocida es la eliminación o
lisis de las células diana que portan el péptido antígeno en el
contexto de una molécula de MHC de clase I. De aquí el motivo de que
estas células se denominen linfocitos T citotóxicos (CTL). Sin
embargo, otra función, quizás de mayor relevancia protectora en
determinadas infecciones, es la capacidad de los CTL de secretar
interferón gamma (IFN-\gamma). De esta manera, los
ensayos de actividad de lisis y de liberación de
IFN-\gamma resultan ambos valiosos para medir los
CTL como indicador de la respuesta inmunológica celular.
Tal como se utiliza en la presente memoria, la
expresión "célula presentadora de antígeno" se refiere a
cualquier célula que sea una célula que porta un MHC de clase I.
Entre los ejemplos de APCs se incluyen, aunque sin limitarse a
ellos, las células madre hematopoyéticas, linfocitos, células
vasculares endoteliales, células epiteliales respiratorias,
queratinocitos, células musculares esqueléticas y cardíacas,
neuronas, células cancerosas, células epiteliales de las vías
respiratorias, hepatocitos, células musculares, miocitos cardíacos,
sinoviocitos, células epiteliales mamarias primarias y células no
replicantes postmitóticas terminalmente diferenciadas, tales como
macrófagos o neuronas y células presentadoras de antígenos (APC)
profesionales, tales como las células dendríticas o los
macrófagos.
Tal como se utiliza en la presente memoria, la
expresión "célula presentadora de antígenos profesional" se
refiere a una célula, tal como una célula dendrítica o un macrófago,
que reconoce un antígeno que será la diana para la neutralización.
La APC une al antígeno y lo procesa, incorporando los fragmentos de
antígeno en su propia membrana y presentándolos en asociación con
moléculas de complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) de clase I
o de clase II a los linfocitos T, tales como los CTL o las células T
ayudantes (Th), que resultan entoncecs estimuladas para iniciar una
respuesta.
El mutante de la presente invención puede
utilizarse para transportar uno o más agentes a una célula diana de
mamífero.
La expresión "célula diana" incluye, aunque
sin limitarse a ellos, macrófagos, células endoteliales o
combinaciones de los mismos. Entre los ejemplos adicionales se
incluyen, aunque sin limitarse a ellos, las células presentadoras de
antígeno (APCs), tales como las células madre hematopoyéticas,
linfocitos, células vasculares endoteliales, células epiteliales
respiratorias, queratinocitos, células musculares esqueléticas y
cardíacas, neuronas, células cancerosas, células epiteliales de las
vías respiratorias, hepatocitos, células musculares, miocitos
cardiacos, sinoviocitos, células epiteliales mamarias primarias y
células no replicantes postmitóticamente terminalmente
diferenciadas, tales como los macrófagos o las neuronas y las
células presentadoras de antígenos (APC) profesionales, tales como
las células dendríticas o los macrófagos.
En una forma de realización preferida, la célula
diana es una célula de vertebrado.
En una forma de realización preferida, la célula
diana es una célula de mamífero.
En una forma de realización altamente preferida,
la célula diana es una célula humana.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el
término "mamífero" incluye, aunque sin limitarse a ellos, seres
humanos, primates, ratas, ratones, cobayas, conejos, caballos,
vacas, ovejas, cerdos, cabras y similares.
El medicamento de la presente invención puede
ser una composición farmacéutica que comprende una cantidad
terapéuticamente efectiva de la sustancia del mutante, y agente, y
un portador, diluyente o excipientes farmacéuticamente aceptables
(incluyendo las combinaciones de los mismos).
Las composiciones farmacéuticas pueden ser para
el uso humano o animal en medicina humana o veterinaria y
típicamente comprenden cualquiera de entre uno o más de un
diluyente, portador o excipiente farmacéuticamente aceptable. Los
portadores o diluyentes aceptables para la utilización terapéutica
son bien conocidos en la técnica farmacéutica, y se describen, por
ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co.
(A.R. Gennaro, editor, 1985). El portador, excipiente o diluyente
farmacéutico puede seleccionarse con respecto a la vía de
administración pretendida y a la práctica farmacéutica estándar. Las
composiciones farmacéuticas pueden comprender como portador,
excipiente o diluyente, o además de ellos, cualquier
ligante(s), lubricante(s), agente(s) de
suspensión, agente(s) de recubrimiento y agente(s) de
solubilización adecuados.
Pueden proporcionarse en la composición
farmacéutica conservantes, estabilizantes, pigmentos e incluso
agentes saborizantes. Entre los ejemplos de conservantes se incluyen
el benzoato sódico, el ácido sórbico y los ésteres del ácido
p-hidroxibenzoico. Pueden utilizarse asimismo
antioxidantes y agentes de suspensión.
Pueden existir diferentes requisitos de
composición/formulación dependiendo de los diferentes sistemas de
administración. A título de ejemplo, la composición farmacéutica de
la presente invención puede formularse para su administración con
una minibomba o mediante una vía mucosal, por ejemplo, en forma de
spray nasal o de aerosol para la inhalación, o de solución
ingerible, o parenteralmente, en la que la composición se formula en
una forma inyectable para la administración por vía, por ejemplo,
intravenosa, intramuscular o subcutánea. Alternativamente, la
formulación puede diseñarse para su administración por ambas
vías.
En el caso de que el agente deba administrarse
mucosalmente a través de la mucosa gastrointestinal, debe ser capaz
de mantener la estabilidad durante el tránsito a través del tracto
gastrointestinal; por ejemplo, debe ser resistente a la degradación
proteolítica, estable a pH ácido y resistente a los efectos
detergente de la bilis.
En caso apropiado, las composiciones
farmacéuticas pueden administrarse mediante inhalación, en forma de
un supositorio o un pesario, típicamente en la forma de una loción,
solución, crema, pomada o polvos sueltos, mediante la utilización de
un parche en la piel, oralmente en forma de comprimidos que
contienen excipientes, tales como almidón o lactosa, o en cápsulas u
óvulos, sea solos o en mezcla con excipientes, o en forma de
elixires, soluciones o suspensiones que contienen agentes
saborizantes o colorantes, o pueden inyectarse parenteralmente, por
ejemplo intravenosamente, intramuscularmente o subcutáneamente. Para
la administración parenteral, las composiciones pueden utilizarse
mejor en forma de una solución acuosa estéril que puede contener
otras sustancias, por ejemplo suficientes sales o monosacáridos para
que la solución sea isotónica con la sangre. Para la administración
bucal o sublingual, las composiciones pueden administrarse en forma
de comprimidos o de pastillas que pueden formularse de una manera
convencional.
Típicamente, un médico determinará la dosis
actual que resultará más adecuada para un sujeto individual, y
variará según edad, peso y respuesta del paciente particular. Las
dosis posteriores son ejemplares del caso medio. Evidentemente
pueden existir casos individuales que merezcan dosis más elevadas o
más reducidas.
Las composiciones de la presente invención
pueden administrarse mediante inyección directa. La composición
puede formularse para la administración parenteral, mucosal,
intramuscular, intravenosa, subcutánea, intraocular o
transdérmica.
El término "administrado" incluye el
transporte mediante técnicas no víricas. Los mecanismos de
transporte no víricos incluyen la transfección mediada por lípidos,
los liposomas, los inmunoliposomas, la lipofectina, los anfífilos
faciales catiónicos (CFAs) y las combinaciones de los mismos. Entre
las vías para estos mecanismos de transporte se incluyen las vías
mucosal, nasal, oral, parenteral, gastrointestinal, tópica o
sublingual.
El término "administrado" incluye, aunque
sin limitación, el suministro por una vía mucosal, por ejemplo, en
forma de spray o aerosol para la inhalación o como una solución
ingerible, una vía parenteral en la que el suministro es mediante
una forma inyectable, tal como, por ejemplo, una vía intravenosa,
intramuscular o subcutánea.
El medicamento de la invención puede ser un kit
que comprende el mutante y el péptido exógeno. En una forma de
realización de la presente invención, el mutante y el péptido se
presentan como un solo grupo activo. Estos kits pueden utilizarse
para tratar enfermedades y condiciones de la presente invención.
En una forma de realización preferida de la
presente invención, el kit puede comprender un adyuvante separado
para la coadministración con dicha composición.
En la presente invención, el mutante se utiliza
para suministrar un péptido exógeno para tratar infecciones víricas
y/o cáncer.
Debe apreciarse que todas las referencias en la
presente memoria a "tratamiento" incluyen uno o más de entre
tratamiento curativo, paliativo y profiláctico. En particular, el
término "tratamiento" incluye, aunque sin limitación, el
tratamiento previo a la enfermedad y el tratamiento posterior a la
enfermedad. A título de ejemplo, un sujeto en un estado previo a la
enfermedad puede tratarse para prevenir la aparición y/o la
progresión de dicha enfermedad.
Preferentemente, el término "tratamiento"
incluye por lo menos el tratamiento curativo y/o el tratamiento
paliativo.
El tratamiento puede estar destinado a tratar
condiciones asociadas con un estado de enfermedad particular.
Al igual que con el término "tratamiento",
el término "terapia" incluye los efectos curativos, los efectos
de alivio y los efectos profilácticos.
La terapia puede aplicarse a seres humanos o a
animales.
La terapia puede estar destimada al tratamiento
de condiciones asociadas al cáncer.
Entre los ejemplos de enfermedades infecciosas
de la presente invención se incluyen, aunque sin limitarse a ellas,
HSV-1, HSV-2, EBV, VZV, CMV,
HHV-6, HHV-7 y
HHV-8, hepatitis A, B, C, D y E, Neisseria
meningitides, Haemophilus influenzae tipo B y Streptococcus
pneumoniae, Legionella pneumophila y Mycobacterium
tuberculosis, Neisseria gonnorheae, VIH-1,
VIH-2 y Chlamydia trachomatism, E.
coli, rotavirus, Salmonella enteritidis, Salmonella typhi,
Helicobacter pylori, Bacillus cereus, Campylobacter jejuni y
Vibrio cholerae, Staphylococcus aureus, Streptococcus
pyogenes y Streptococcus mutans, malaria,
Trypanasoma spp., Taxoplasma gondii, Leishmania
donovani y Oncocerca spp.
El mutante y el agente de la presente invención
pueden introducirse en un mamífero previamente a cualquier evidencia
de cánceres tales como melanoma o para mediar en la regresión de la
enfermedad en un mamífero que padece un cáncer, tal como un
melanoma. Entre los cánceres de mamífero que pueden tratarse
utilizando la composición de la presente invención se incluyen,
aunque sin limitarse a ellos, melanoma, metástasis, adenocarcinoma,
timoma, linfoma, sarcoma, cáncer de pulmón, cáncer de hígado, cáncer
de colon, linfoma no de Hodgkin, linfoma de Hodgkin, leucemias,
cáncer uterino, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de
ovario, cáncer cervical, cáncer de vejiga, cáncer de riñón, cáncer
pancreático y similares.
Si el mamífero que debe tratarse ya padece
cáncer o cáncer metastásico, el mutante y el agente pueden
administrarse conjuntamente con otros tratamientos terapéuticos. En
este contexto, la presente invención comprende la terapia de
combinación. La expresión "terapia de combinación" se refiere a
que el mutante y el agente de la presente invención se administran
al paciente en combinación con otras moléculas inmunomoduladores o
inmunoestimulantes exógenas, fármacos quimioterapéuticos,
antibióticos, fármacos antifúngicos, fármacos antivíricos y
similares, solos o en combinaciones de los mismos. Entre los
ejemplos de otros agentes añadidos exógenamente se incluyen, aunque
sin limitarse a ellos, IL-2, IL-6,
interferón, factor de necrosis tumoral, ciclofosfamida y cisplatino,
ganciclovir y anfotericina B.
En una forma de realización preferida, el agente
se libera de la subunidad B tras su transporte hasta la célula.
En otra forma de realización preferida,
preferentemente el ligamiento del conjugado
mutante-agente puede seleccionarse de manera que el
agente se suministre específicamente al núcleo de una célula
diana.
En otra forma de realización preferida, la
combinación simultánea, separada o secuencia de la subunidad B
mutante puede utilizarse para suministrar un agente a una célula
diana y puede utilizarse una subunidad B de tipo salvaje para
suministrar un agente a una célula diana.
La presente invención se describirá a
continuación únicamente a título de ejemplo, haciendo referencia a
las figuras siguientes:
a este respecto:
la Figura 1 es un gráfico;
la Figura 2 es un gráfico;
la Figura 3A es una representación
pictórica;
la Figura 3B es un gráfico;
la Figura 4A es una representación
pictórica;
la Figura 4B es un gráfico;
la Figura 4C es un gráfico;
la Figura 5 es una representación pictórica;
las Figuras 6A, 6B, 6C son representaciones
pictóricas;
las Figuras 6D y 6E son gráficos;
las Figuras 7A y 7B son gráficos;
las Figuras 8A y 8B son gráficos;
las Figuras 9A, 9B, 9C, 9D, 9E, 9F, 9G y 9H son
gráficos;
las Figuras 10A-10T son
gráficos; y
la Figura 11 es una representación
pictórica;
la Figura 12 es un gráfico.
En más detalle:
Fig. 1 Ctx(H57A) muestra un defecto
severo de toxicidad. Curso temporal de secreción de Cl^{-}
electrogénico inducida por la adición de Ctx (\boxempty) o de
Ctx(H57A) (\blacklozenge) 2 nM a la superficie apical de
monocapas de células T84 (representando los puntos de datos, medias
\pm S.E., donde n = 2 monocapas independientes). Tres experimentos
independientes proporcionaron resultados similares.
Fig. 2 CtxB(H57A) conserva la capacidad
de unirse a GM1. CtxB (\blacksquare), CtxB(H57A) (5) o
EtxB(G33D) (\bullet) a una concentración de 1 \mug/ml se
diluyeron seriadamente 3 veces en placas de microtitulación
recubiertas con GM-1 y las subunidades B unidas se
detectaron mediante inmunoensayo, tal como se describe en la sección
de Procedimientos. Tres experimentos independientes proporcionaron
resultados similares.
Fig. 3 Interacción de CtxB(H57A) con
células T CD8+. Las células T CD8+ aisladas derivadas de las MLN se
incubaron en hielo durante 1 hora en ausencia (control de PBS) o
presencia de CtxB, CtxB(H57A) o EtxB(G33D) 100 nM, se
marcaron a continuación con anticuerpos antiCtxB o antiEtxB, seguido
de un conjugado secundario de IgG de cabra
antirratón-FITC. Las células se analizaron mediante
microscopía de fluorescencia (A) o citometría de flujo (B). La señal
de citometría de flujo obtenida para las células tratadas con PBS se
muestra en rojo y la señal obtenida para células tratadas con las
diversas subunidades B se encuentra superpuesta en negro.
Fig. 4 CtxB(H57A) es defectivo en la
activación de la apoptosis de las células T CD8+. A. Se cultivaron
células MLN durante 48 horas en ausencia (control de PBS) o
presencia de CtxB, CtxB(H57A) o EtxB(G33D) 100 nM, se
tiñeron a continuación con anticuerpos antiCD8(PE) y
antiCD4(FITC) y se analizaron mediante citometría de flujo.
Se muestra el porcentaje de células T CD8+ en el cuadrante inferior
derecho. B. Se cultivaron células MLN en presencia de CtxB o de
CtxB(H57A) a concentraciones comprendidas entre 10 nM y 2,5
\muM, y se marcaron y se analizaron tal como se ha indicado
anteriormente. Se calculó el porcentaje de células T CD8+
supervivientes, en comparación con las células de control tratadas
con PBS. C. Se cultivaron células T CD8+ aisladas que se habían
derivado de MLN, durante 18 horas en la ausencia (control de PBS) o
con CtxB, CtxB(H57A) o EtxB(G33D) 3,45 \muM, se
tiñeron a continuación con yoduro de propidio y se analizaron
mediante citometría de flujo para determinar el porcentaje de
células que contenía ADN subdiploide.
Fig. 5 Estructuras cristalinas superpuestas de
CtxB y CtxB(H57A) de tipo salvaje. (A) Superposición de la
estructura cristalina de CtxB de tipo salvaje (verde) acomplejado
con GM1-OS (azul) sobre la estructura del mutante
CtxB(H57A) (amarillo) acomplejada con galactosa (rojo). Se
muestra un solo sitio de unión a receptor (sitio H) de los cinco
sitios independientes. Se muestra la densidad electrónica de la
molécula de galactosa en isolíneas de 2\sigma en un mapa
(mF_{obs}-F_{calc}) omit. El punto de diferencia
máxima entre los esqueletos peptídicos de las toxinas de tipo
salvaje y mutantes se encuentra en el residuo Gln 56, donde las
posiciones respectivas del átomo C^{\alpha} difieren en
7\ring{A}. (B) Superposición del pentámero B de la toxina del
cólera de tipo salvaje acomplejado con el receptor oligosacárido y
el pentámero B mutante CtxB(H57A). La superficie molecular
del CTB de tipo salvaje se muestra en verde (bucle
50-60) y en azul. El oligosacárido de GM1 se muestra
en rojo. La superficie molecular del mutante H57A se muestra en
amarillo (bucle 50-60). El residuo galactosa
terminal del oligosacárido de GM1 no resulta visible detrás de la
superficie molecular del bucle 50-60, que forma un
lado de su sitio de unión en la proteína. En uno de los cinco sitios
de unión no se muestra la superficie molecular de este bucle de
manera que resulte posible observar la conformación subyacente de la
proteína.
Figura 6: producción y caracterización del
conjugado EtxB-26mero. Panel A: análisis de
SDS-PAGE del conjugado EtxB-26mero.
Carriles: 1, EtxB no calentado; 2, EtxB hervido; 3,
EtxB-26mero, no calentado; 4,
EtxB-26mero, sometido a ebullición. Se indican los
estándares de peso molecular en kDa y monómero y pentámero de EtxB
(flechas superior e inferior, respectivamente). Paneles B y C:
análisis de transferencia western de las mismas muestras sondeadas
con mAb 118-8 específico para EtxB (panel B) o un
antisuero policlonal específico del péptido SIINFEKL (panel C).
Paneles D y E: propiedades de unión de GM1 del conjugado
EtxB-26mero. Se llevó a cabo una dilución seriada de
EtxB y de EtxB-26mero a placas ELISA recubiertas con
GM1 y se detectaron utilizando mAb 118-8 (panel D) o
antiSIINFEKL (panel E), tal como se ha indicado anteriormente. Las
absorbancias se representaron frente al factor de dilución y se
proporciona como medias \pm S.D.
Figura 7: transporte mediado por EtxB del
péptido 26mero hasta la ruta de presentación de clase I. Panel A: se
evaluó el grado de presentación de péptido mediante análisis de la
liberación de IL-2 por el hibridoma RF33.70 de
células T. Se incubaron células dendríticas JAWSII con diversas
concentraciones de péptido 8mero o de péptido 26mero solos, de EtxB
y péptido 26mero mezclados, o de conjugado de
EtxB-26mero, durante 2 horas. Las concentraciones
ensayadas eran equivalentes a las concentraciones molares de péptido
en cada muestra de 1 pM, 10 pM, 100 pM, 1 nM, 20 nM, 40 nM, 60 nM,
80 nM y 100 nM, respectivamente. Se utilizó PBS como control. A
continuación, las células se fijaron con paraformaldehído al 1%
(p/v) y se incubaron durante la noche con células RF33.70. Se
determinó el contenido de IL-2 del medio recolectado
mediante ELISA. Se sometieron a ensayo muestras duplicadas y los
datos se proporcionan como medias \pm S.D. Panel B: detección de
complejos MHC-1/SIINFEKL según evaluación mediante
análisis FACS con mAb 25D1.16. Las células JAWSII se trataron con
péptido 8mero 100 nM (curva discontinua negra), conjugado
EtxB-26mero (curva continua negra) o PBS (curva de
color gris) durante 2 horas y se incubaron a continuación
secuencialmente con mAb 25D1.16 y un anticuerpo secundario marcado
con FITC seguido de análisis de citometría de flujo.
Figura 8: transporte de péptidos mediado por
EtxB: optimización y cinética de presentación. Panel A: efecto de
truncar o extender el péptido 26mero sobre el grado y eficiencia de
la presentación mediada por EtxB del epítopo de clase I. Las células
JAWSII se incubaron durante 2 horas con los péptidos indicados
solos, o mezclados o conjugados con EtxB a concentraciones de
péptido equivalentes de 100 nM. A continuación, las células se
fijaron con paraformaldehído al 1% (p/v) y se evaluó la presentación
de antígeno mediante incubación de las células con hibridoma RF33.70
de células T y determinando el contenido de IL-2 del
medio recolectado mediante ELISA. Panel B: evaluación de la cinética
de presentación de péptidos de clase I. Las células JAWSII se
incubaron con conjugados de EtxB durante los intervalos de tiempo
indicados, se fijaron con paraformaldehído al 1% (p/v) y se evaluó
la presentación de antígeno tal como se ha indicado anteriormente.
Se sometieron a ensayo muestras duplicadas y los datos se
proporcionan como medias \pm S.D.
Figura 9: efecto de inhibidores sobre el
transporte mediado por EtxB y sobre la presentación de péptidos de
clase I. Se evaluaron los efectos de bafilomicina A1 (BafA1) 200 nM,
brefeldina A (BFA) 10 \muM, y epoxomicina 10 \muM sobre el
transporte mediado por EtxB de los péptidos 19meros y 31meros en
ambos ensayos de liberación de IL-2 (paneles
A-D) y análisis FACS utilizando el anticuerpo
25D1.16 (paneles E-H). Se utilizó el péptido 8mero
no conjugado y PBS como controles positivos y negativos,
respectivamente. Los datos de liberación de IL-2 se
proporcionan como medias \pm S.D. En los paneles
D-F, se muestran EtxB-19mero (curva
continua negra), EtxB-31mero (curva discontinua
negra) y PBS (curva de color gris).
Figura 10: transporte mediado por EtxB de los
péptidos de clase I: evidencia de tráfico hacia el compartimiento de
Golgi e implicación de proteosomas. Panel A: análisis microscópico
confocal de la localización celular de EtxB y complejos
MHC-1/SIINFEKL tras el tratamiento de células JAWSII
con EtxB-19mero durante 1 minuto (imágenes
e-g) o 120 minutos (imágenes i-k) o
con EtxB-31mero durante 1 minuto (imagen h) o 120
minutos (imagen i). Las células de control se trataron con PBS
durante 120 minutos (imágenes a-d). Todas las
células se fijaron con paraformaldehído, y se tiñeron con un
antisuero policlonal de conejo específico para EtxB, y el mAb
25D1.16 específico para los complejos
MHC-1/SIINFEKL, seguido de anticuerpos secundarios
conjugados con FITC o con TRITC, tal como se describe en la sección
de materiales y procedimientos. Los núcleos celulares se tiñeron con
DAPI (azul). Para el EtxB-19mero, se muestran
imágenes tanto separadas como superpuestas, mientras que para el
EtxB-31mero sólo se muestra la imagen superpuesta.
Panel B: colocalización de los complejos
MHC-1/SIINFEKL con aglutinina de germen de trigo
(WGA) el efecto de la epoxomicina, un inhibidor de proteosoma sobre
la carga de MHC-1. Las células se trataron durante
120 minutos con EtxB-19mero (imágenes
a-c) o con EtxB-31mero (imagen d),
tal como anteriormente, se fijaron con paraformaldehído seguido de
incubación con WGA marcado con rodamina y mAb 25D1.16 y un
anticuerpo secundario marcado con FITC. Para
EtxB-19mero, se muestran imágenes tanto separadas
como superpuestas, mientras que para el EtxB-31mero
sólo se muestra la imagen superpuesta. Se llevó a cabo un
experimento idéntico al mostrado en las imágenes a-d
anteriormente con adición de epoxomicina 10 \muM a las células 60
minutos antes de la adición de los conjugados de EtxB (imagen
e-h).
Figura 11: la figura 11 muestra la incorporación
de EtxB de tipo salvaje y dos mutantes EtxB(H57A) y
EtxB(H57S) en células T Jurkat. Además, y como control, se
sometió a ensayo un mutante que no se une a GM1 en absoluto,
EtxB(G33D). Las células se tiñeron con un anticuerpo contra
la subunidad B (antiEtxB) o con aglutinina de germen de trigo
marcada con rodamina (un marcador para el
Golgi-antiGolgi), con la tinción nuclear DAPI, y las
imágenes se superpusieron (lado derecho). Resulta evidente que EtxB,
EtxB(H57A) y EtxB(H57S) entran en las células en un
compartimiento perinuclear que se colocaliza con el marcador de
Golgi aglutinina de germen de trigo. De esta manera, resulta
evidente que EtxB(H57A) y EtxB(H57S) resultan capaces
de funcionar como moléculas de reconocimiento farmacológico aunque
ya no conserven sus propiedades inmunomoduladoras.
Figura 12: se utilizó EtxB(H57A) como
vehículo de suministro de péptidos. Se incubaron células dendríticas
JAWSII durante 2 horas con un péptido 19mero solo
(CAVGAGATAEESIINFEKL), el péptido 19mero mezclado con EtxB de tipo
salvaje, EtxB(H57A) o EtxB(G33D) no ligante, o
conjugados que comprendían EtxB-19mero,
EtxB(H57A)-19mero o
EtxB(G33D)-19mero a concentraciones
equivalentes de péptido de 100 nM. Se utilizó PBS y el péptido
8-mero (SIINFEKL) solos como controles negativos y
positivos. A continuación, las células se fijaron con
paraformaldehído al 1% y se incubaron durante la noche con células
RF33.70 y se evaluó el grado de presentación de péptido mediante
análisis de la liberación de IL-2 en el medio de
cultivo. Se sometieron a ensayo muestras duplicadas, y los datos se
proporcionan como medias \pm S.E.M.
Se introdujeron sustituciones de Ala en el bucle
V52 a I58 de CtxB mediante mutagénesis por PCR (20). Se utilizó como
molde para PCR, el plásmido pATA14 (21), un derivado pBluescript
IIKS que contiene un operón ctxAB reconstruido con un sitio EcoRI
introducido en el extremo 3' del gen ctxA. Los fragmentos de PCR,
con sustituciones apropiadamente introducidas en ctxB, se ligaron en
los sitios EcoRI-SpeI de pATA14, sustituyendo de
esta manera el gen ctxB de tipo salvaje con un alelo mutante. Los
plásmidos resultantes, pATA16 a pATA22, se confirmó mediante
secuenciación de ADN que codificaban sustituciones de Ala en los
residuos 52 a 58 en CtxB, respectivamente.
Se construyó el plásmido pCDR3 mediante
subclonación del fragmento EcoRV-SpeI que contenía
el operón ctxAB completo de pATA14, en el vector de expresión
controlada pTTQ18 (21).
Para facilitar la posterior purificación y
caracterización de las subunidades B de tipo salvaje y mutante
(carente de subunidad A), se subclonaron el gen ctxB de pATA14 y el
alelo ctxB mutante de pATA21 en el plásmido pTRH64 (13) digerido con
EcoRI-SpeI, un vector de expresión controlada de
amplio espectro de huéspedes derivado de pMMB66EH (22). Los
plásmidos resultantes se denominaron pATA13 (codificante de CtxB de
tipo salvaje) y pATA29 (codificante de la subunidad B mutante,
CtxB(H57A)).
Se prepararon extractos periplásmicos de E.
coli XL1-Blue (Stratagene) que albergaban los
plásmidos pATA14, o pATA16 a pATA22, tal como se describe en (23) y
se dializaron inmediatamente frente a solución salina equilibrada de
Hank (HBSS; Sigma, MO) que contenía HEPES 10 mM, pH 7,4, y después
se congelaron instantáneamente y se almacenaron a -80ºC previamente
al análisis electrofisiológico.
Los plásmidos pCDR3 y pATA21 codificantes de
holotoxina Ctx y holotoxina Ctx (con una mutación H57A en la
subunidad B (Ctx(H57A)), respectivamente, se electroporaron
en V. cholerae 0395NT (que contiene una deleción cromosómica
ctxAB producida artificialmente) y las toxinas se purificaron tal
como se ha informado anteriormente (21). Los plásmidos pATA13 y
pATA29 codificantes de CtxB de tipo salvaje y de CtxB(H57A),
respectivamente, se movilizaron en la cepa 60 no patogénica de
Vibrio sp., y las subunidades B se purificaron a partir del medio de
cultivo utilizando el procedimiento informado en (7). Se purificó
EtxB(G33D) a partir de Vibrio sp 60 (pTRH64) tal como se ha
informado anteriormente (13). Se aplicaron las preparaciones
purificadas de subunidad B a una columna detoxigel (Pierce) y las
fracciones eluidas se agruparon y se dializaron frente a PBS. Las
concentraciones de proteína se determinaron tal como se informa en
(24) y se demostró que el contenido de LPS era >30 EU mg^{-1}
proteína (BioWhittaker).
Se cultivaron cristales de CtxB(H57A) a
partir del equilibrio de difusión de vapor en gota colgante frente a
una solución tamponadora para pocillos que contenía NaCl 50 mM,
Tris-HCl 100 mM, pH 8,4 y 32% (p/v) de PEG 5000. Las
gotas consistían en 1 \mul de proteína a 3 mg/ml en
Tris-HCl 100 mM, pH 7,5, 1 \mul de galactosa 300
mM (\beta-d-galactopiranósido) y 1
\mul de tampón de pocillo. Los cristales formados en el grupo de
espacio P2_{I}2_{I}2 (a = 101,4\ring{A}, b = 114,7 \ring{A},
c = 45,6 \ring{A}) con un pentámero por unidad asimétrica. Las
intensidades de difracción a una resolución de 2,0\ring{A} se
midieron a partir de un solo cristal congelado instantáneamente
utilizando radiación de 12 keV procedente de un rayo APS 19ID y un
detector CCD 3Kx3K en modo de almacenamiento. El modelo
cristalográfico inicial consistía en la estructura de
CtxB(H94R) determinada anteriormente ((25); código de acceso
PDB 3chb) posicionado mediante sustitución molecular. Tras el
afinado por dominios rígidos de los monómeros constituyentes, el
modelo para los residuos 50-62 de cada subunidad se
reconstruyó manualmente. El afinado posicional iterativo y del
factor B, alternando con el reajuste manual, proporcionó los
residuales cristalográficos R = 0,253, Rlibre = 0,317. En este
punto, la diferencia de densidad para la galactosa unida resultaba
evidente en 2 de las 5 subunidades. El afinado continuado con la
adición gradual de moléculas discretas de agua y 2 molécula
adicionales de galactosa proporcionó un modelo con R = 0,191, Rlibre
= 0,252. Las etapas finales de afinado incluían 446 moléculas
discretas de agua, 4 moléculas de galactosa y un modelo
"riding" para el hidrógeno, proporcionando los residuales
cristalográficos finales: R = 0,179, Rlibre = 0,239, con una
excelente estereoquímica. La incertidumbre estándar media estimada
de coordenadas atómicas basada en el índice DPI de Cruickshank era
de 0,19\ring{A}. Los datos de intensidad se combinaron y se
escalaron utilizando los programas Denzo, Scalepack y Truncate (26,
27). El ajuste del modelo y la optimización de espacio real se
realizó utilizando el programa Xfit (28), mientras que el afinado
restante utilizó el programa Refmac (27). Las figuras se prepararon
utilizando los programas MSMS (29) y Raster3D (30). El modelo final
se ha depositado en el Protein Data Bank, número de acceso lg8z.
Se cultivaron células T84 (del subcultivo nº 80)
procedentes de ATCC y se subcultivaron tal como se ha descrito (31).
Las toxinas se diluyeron en solución salina equilibrada de Hank
precalentada (HBSS; Sigma, MO) y HEPES 10 mM, pH 7,4, y se aplicaron
sobre la superficie apical de monocapas confluyentes de células T84
en inserciones Transwell (Costar, Cambridge, MA) seguido de la
incubación a 37ºC. Se llevaron a cabo mediciones de corriente de
cortocircuito (I_{sc}) y de resistencia (R) tal como se ha
informado anteriormente (31).
Ensayo de inmunosorción ligada a
enzima-GM1. Se realizó un seguimiento de la
interacción de subunidad de toxina B con GM1 en placas de
microtitulación (Immulon 1, Dynatech, USA) recubiertas con 1,5
\mug/ml GM1 (Sigma) en PBS tal como se ha informado anteriormente
(13), utilizando LT39 (32), un anticuerpo monoclonal que detecta
tanto CtxB como EtxB, o 118-8, un anticuerpo
monoclonal que detecta EtxB (33).
Se prepararon liposomas a partir de 2 ml de 5%
molar de GM1: 95% molar de
1-palmitoil-2-oleil-sn-glicero-3-fosfocolina
(POPC) en cloroformo-metanol (2:1). Se dejó que la
mezcla glucolípido:lípido se evaporase bajo vacío y después se
disolvió en PBS y se pasó a través de un filtro de policarbonato
(tamaño de poro: 50 nm) utilizando el sistema LipoFast Basic System
(Avesting Inc., Glen Crestón Ltd., Middlesex, Inglaterra) según
recomendaciones del fabricante y según describen Kuziemko et
al. (1996). Se utilizó un BIAcore 1000 (Pharmacia) para recubir
un chip sensor HPA (Biocore, Herts, Inglaterra) con liposomas que
contenían GM1, y se obtuvieron mediciones de unión Kd de la
subunidad B tal como se ha informado anteriormente (34).
Se extrajeron nódulos linfáticos mesentéricos y
bazos de ratones NIH de 6 a 10 semanas de edad cultivados bajo
condiciones SPF (Universidad de Bristol) y los tejidos se trituraron
con malla de alambre. A continuación, las células se lavaron tres
veces con medio de Hank sin calcio ni magnesio (Gibco BRL) + HEPES
20 mM (Sigma-Aldrich). Se lisaron los glóbulos rojos
mediante la adición de 0,5 ml de tampón de lisado Ack (BioWhittaker)
durante 30 segundos. Para la purificación de poblaciones específicas
de linfocitos, las células se lavaron en PBS que contenía BSA al
0,5% (p/v) y EDTA 5 mM (suministros de laboratorio BDH, Poole),
previamente a la adición de anticuerpos específicos conjugados con
microperlas MACS (Miltenyi Biotec, Alemania) durante 35 minutos en
hielo. Las células T CD8+ se seleccionaron negativamente utilizando
antiCD4 y antiB220. Las células B se seleccionaron negativamente
utilizando antiCD43. Las suspensiones celulares marcadas se
aplicaron a columnas de selección VS (Miltenyi Biotec) y las
fracciones negativas se eluyeron con BSA-PBS al 0,5%
(p/v) que contenía EDTA 5 mM y se utilizaron inmediatamente.
Las células MLN, las células T CD8+ y las
células B purificadas se cultivaron a 37ºC en 5% de CO_{2} a una
concentración de 2 x 10^{6}/ml en medio de Eagles
\alpha-modificado (Gibco) para células MLN y
células T CD8+ y medio RPMI 1640 Gibco) para células B, ambos
suplementados con HEPES 20 mM, L-glutamina 4 mM, 100
IU/ml de penicilina, 100 \mug/ml de estreptomicina,
2-mercaptoetanol 5 x 10^{-5} M y suero de feto
bovino al 5% (v/v) (Sigma). Las células MLN y células B se
cultivaron durante 48 horas, o las células T CD8+ durante 18 horas,
en ausencia o en presencia de subunidades B de tipo salvaje o
mutantes a las concentraciones especificadas. En algunos
experimentos, las células tratadas se resuspendieron en medio de
Hank suplementado con HEPES 20 mM, azida sódica al 0,02% (p/v),
suero de rata al 10% (v/v) y se incubaron durante 30 minutos en
hielo con CD8\alpha-PE de rata antirratón
(PharMingen) o con CD4-FITC de rata antirratón
(PharMingen) o se tiñeron con yoduro de propidio (Sigma) y se
analizaron a continuación mediante citometría de flujo, tal como se
ha descrito anteriormente (14).
Se incubaron células T CD8+ aisladas (2 x
10^{6}) sobre hielo en PBS con 100 nM de subunidades B de tipo
salvaje o mutantes durante 1 hora. Las células tratadas se
analizaron mediante microscopía de inmunofluorescencia y citometría
de flujo para detectar las subunidades B unidas. Para la microscopía
de inmunofluorescencia, las células tratadas se lavaron en PBS
helado, se depositaron sobre cubreobjetos prerecubiertos con
poli-L-lisina (Sigma), se fijaron
con formaldehído (al 3,7% (v/v)), 4ºC, 4 minutos; metanol, -20ºC, 5
minutos, y se marcaron con anticuerpos antiEtxB o antiCtxB, seguido
de IgG de cabra-FITC antirratón (DAKO A/S Denmark).
Los cubreobjetos se montaron utilizando medio de montaje Mowiol +
DABCO al 2,5%(p/v) (Sigma) y se analizaron utilizando microscopía
fluorescencia Zeiss Axioscop. En un experimento paralelo, las
células se marcaron con los mismos anticuerpos y se analizaron
mediante citometría de flujo.
Las respuestas antiCtxB en ratones NIH tras la
inmunización subcutánea con 2 x 30 \mug de subunidad B o tras la
inmunización intranasal con 3 x 10 \mug de subunidad B se
determinaron mediante la utilización de placas de
microtitulación-GM1 recubiertas con 1 \mug/ml de
CtxB tal como se ha informado anteriormente (13).
\newpage
Ejemplo
1(a)
Los residuos V52 a I58 de la subunidad B de la
toxina del cólera se sometieron a mutagénesis por sustitución por
alaninas con el fin de evaluar si esta región, que comprende un
bucle flexible conservado, desempeña un papel importante en la
acción de la toxina del cólera. Para facilitar la construcción y
análisis de las diversas proteínas Ctx mutantes, en primer lugar se
amplificaron por PCR los genes ctxA y ctxB como cistrones separados
y se ligaron a continuación para reconstruir un operón ctx con un
sitio EcoRI convenientemente situado en el sitio de fusión. En
consecuencia, se introdujo una sustitución de Lys por Arg en el
residuo 237 en la subunidad madura de CtxA, resultando en una
alteración en la secuencia -KDEL C-terminal,
rindiendo -RDEL (que es idéntico al extremo
C-terminal que se encuentra normalmente en la
subunidad A de la enterotoxina de E. coli).
Dicha sustitución en CtxA se demostró que no
alteraba la actividad ADP-ribosiltransferasa
intrínseca de la subunidad A o la cinética y la magnitud de la
secreción de Cl^{-} inducida por la toxina en células epiteliales
T84 polarizadas (21).
Ejemplo
1(b)
El plásmido pATA14, codificante de
CtxA^{(RDEL)}CtxB (en adelante denominado "Ctx") se sometió a
mutagénesis sitio-dirigida para introducir
sustitución individuales de Ala en los residuos entre V52 e I58 en
CtxB, tal como se describe en la sección de materiales y
procedimientos.
Al evaluar extractos periplásmicos crudos de
cepas de E. coli que expresaban estas toxinas mutantes de Ctx
para su capacidad para inducir la secreción de Cl^{-} por células
T84, se descubrió que uno de los mutantes que contenía una
sustitución de His por Ala en el residuo 57 presentaba un aparente
defecto severo de toxicidad (ver a continuación).
Ejemplo
1(c)
Para investigar con mayor detalle lo anterior, y
en particular para evaluar el impacto de la mutación H57A sobre la
función de la subunidad B, se purificaron tanto la holotoxina
mutante, Ctx(H57A), como las subunidades B recombinantes,
CtxB(H57A), carentes de subunidad A contaminante, y se
confirmó su identidad mediante espectrometría de masas.
Previamente a la evaluación de las propiedades
funcionales de los mutantes, los presentes inventores demostraron
que la estabilidad intrínseca de los pentámeros CtxB(H57A)
eran, al igual que el CtxB de tipo salvaje, notablemente estables,
conservando su estructura oligomérica a pH de tan sólo 3,0, o al
incubarlos en presencia de 1% (p/v) del detergente iónico, dodecil
sulfato sódico (datos no representados).
Ejemplo
2
Se sometieron a ensayo preparaciones purificadas
de Ctx de tipo salvaje y de Ctx(H57A) para su capacidad para
activar la salida de cloruro de células epiteliales (T84)
intestinales humanas polarizadas (Fig. 1).
La adición de Ctx 2 nM a la superficie apical de
células T84 resultó en un periodo característico de retardo de 40
minutos seguido de una salida rápida y máxima de Cl^{-}, según el
seguimiento de cambios en la corriente de cortocircuito a través de
la monocapa celular. En contraste, la adición de una concentración
equimolar de Ctx(H57A) a células T84 no activó la salida de
Cl^{-}, sugiriendo que el residuo His-57 desempeña
un papel crucial en la acción de la toxina del cólera (Fig. 1). El
mutante mostró una falta prácticamente completa de toxicidad incluso
a concentraciones de 1.000 nM (datos no representados).
\newpage
Ejemplo
3
Ejemplo
3(a)
Dado que la mutación es contigua a la cavidad de
unión a receptor en la subunidad B, una posible explicación para el
defecto de toxicidad era que el mutante había perdido la capacidad
de unirse con afinidad elevada al gangliósido GM1.
La unión de CtxB(H57A) a GM1 se evaluó
mediante ELISA y resonancia de plasmón superficial.
Se incubaron placas de microtitulación
recubiertas con GM1 con diversas concentraciones de CtxB,
CtxB(H57A) y EtxB(G33D) y proteína unida detectada
utilizando anticuerpos monoclonales antisubunidad B (Fig. 2). CtxB y
CtxB(H57A) se unieron a placas de microtitulación recubiertas
con GM1 en un grado similar, encontrándose la sensibilidad de
detección de ambas subunidades comprendida en el intervalo de 1 a 2
ng/ml (equivalentes a 1,6 a 3,2 x 10^{-11} M). La KD para la
interacción con GM1 se determinó mediante resonancia de plasmón
superficial utilizando el procedimiento de Kuziemko et al.
(1996) y se encontró que era de 1,9 (\pm0,9) x 10^{-10} M para
CtxB y de 5,0 (\pm3,7) x 10^{-10} M para CtxB(H57A). Por
lo tanto, los presentes inventores concluyen que CtxB(H57A)
conserva una avidez muy elevada para la interacción con GM1.
Ejemplo
3(b)
Para investigar con mayor detalle aspectos de la
función de CtxB(H57A), los presentes inventores evaluaron si
podía unirse a células de mamífero. Con este fin, seleccionaron
células T CD8+ murinas, debido a que en éstas se había demostrado
previamente que resultaban adecuadas para evaluar los efectos sobre
las células inmunológicas mediados por CtxB y por EtxB (14). Se
incubaron células T CD8+ altamente purificadas procedentes de nódulo
linfático mesentérico (MLN) de ratones NIH, en hielo con 100 nM de
CtxB, de CtxB(H57A) o de EtxB(G33D) y se detectaron
las subunidades B unidas utilizando anticuerpos antisubunidad B y un
anticuerpo secundario FITC, previamente al análisis mediante
microscopía de fluorescencia (Fig. 3A) o la citometría de flujo
(Fig. 3B).
La microscopía reveló un halo claro de
fluorescencia alrededor de las células incubadas tanto con CtxB como
con CtxB(H57A), pero no con EtxB(G33D), o de las
células incubadas con PBS. La citometría de flujo permitió realizar
una estimación semicuantitativa de la unión de la subunidad B a las
células, debido a que la fluorescencia detectada por el FACscan es
directamente proporcional a la cantidad de anticuerpo secundario
unido. Al analizar mediante FACScan las muestras de control, de
células incubadas en PBS, se detectó un nivel bajo de fluorescencia
de fondo y se muestra como la línea roja en la Fig. 3B. La
incubación con CtxB, CtxB(H57A), pero no con
EtxB(G33D), resultó en un marcado incremento de la intensidad
de fluorescencia, indicando la unión de la subunidad B a las células
T CD8+ (Fig. 3B; línea negra). Además, al someter a ensayo
concentraciones de tan sólo 1 a 10 nM, no se observó ninguna
diferencia en los cambios de fluorescencia relativa entre CtxB de
tipo salvaje y CtxB(H57A). Por lo tanto, los presentes
inventores concluyeron que CtxB(H57A) conserva una afinidad
elevada por GM1 y demuestra un nivel de unión a las células de
mamífero como el de CtxB de tipo salvaje.
Ejemplo
4
Ejemplo
4(a)
Una propiedad inesperada de CtxB y de EtxB es su
capacidad de inducir la apoptosis selectiva de las células T CD8+
murinas, implicando una ruta dependiente de NF\kappaB y de
caspasa-3 (14); anteriormente se había propuesto que
dependía de la interacción de la subunidad B con GM1, debido a que
EtxB(G33D) no induce este efecto (14). Por lo tanto, se
sometió a ensayo CtxB(H57A) para evaluar si había conservado
la capacidad de inducir la apoptosis de las células T CD8+. Las
células MLN se cultivaron durante 48 horas en presencia o en
ausencia de 100 nM de CTxB, de CtxB(H57A) o de
EtxB(G33D), después las células T CD4+ y CD8+ se tiñeron con
anticuerpos marcados fluorescentemente y se detectaron mediante
citometría de flujo.
La Fig. 4A muestra que, tras 48 horas, las
células cultivadas con PBS o con el mutante EtxB(G33D) no
ligante, contenían aproximadamente entre 17% y 18% de células T
CD8+, mientras que el tratamiento con CtxB de tipo salvaje redujo la
proporción de células T CD8+ a <6%. Inesperadamente,
CtxB(H57A) no indujo ninguna reducción de células T CD8+
superior a la observada en los controles negativos.
Ejemplo
4(b)
Con el fin de investigar lo anterior con mayor
detalle, se trataron cultivos de células MLN con concentraciones de
subunidad B comprendidas entre 10 nM y 2,5 \muM y se evaluó la
reducción del número de células T CD8+ tal como anteriormente (Fig.
4B).
Esto reveló que 100 nM de CtxB resultaba en la
reducción máxima de las células T CD8+, mientras que incluso a la
concentración más alta de 2,5 \muM, CtxB(H57A) mostraba
sólo una capacidad modesta de inducir la reducción.
Ejemplo
4(c)
Se sometieron asimismo a ensayo dosis elevadas
de las subunidades B (3,45 \muM) para su capacidad de inducir la
apoptosis en células T CD8+ derivadas de las MLN. Las células se
cultivaron durante 18 horas en presencia o en ausencia de las
subunidades B, y a continuación se tiñeron con yoduro de propidio,
revelando niveles de ADN subdiploide indicativos de la presencia de
células apoptóticas.
La Fig. 4C muestra que el CtxB de tipo salvaje,
pero no CTxB(H57A) o EtxB(G33D) incrementaron el
porcentaje de células apoptóticas por encima del nivel de fondo. Por
lo tanto, los presentes inventores concluyen que, aunque
CtxB(H57A) se une a las células T CD8+, sigue mostrando un
defecto severo en la inducción de su apoptosis.
Ejemplo
4(d)
Además, se investigó el efecto de CtxB y de las
subunidades B mutantes sobre la activación de las células B, debido
a que se ha informado de que CtxB y EtxB causan la regulación
positiva del MHC de clase II y de las células CD25 (11, 12).
Tal como se esperaba, el tratamiento de 48 horas
de células B esplénicas aisladas con CtxB 1,75 \muM incrementó la
expresión en superficie del MHC de clase II y de las células CD25,
mientras que CtxB(H57A) o EtxB(G33D) no lo hizo.
Ejemplo
4(e)
Para investigar si el defecto en la modulación
de las células inmunológicas in vitro se correlacionaba con
una pérdida correspondiente de la potente inmunogenicidad in
vivo, se inmunizaron ratones subcutánea o intranasalmente con
CtxB o con CtxB(H57A), tal como se ha descrito en la sección
de materiales y procedimientos.
La inmunización subcutánea con 30 \mug de CtxB
o de CtxB(H57A) en PBS en dos ocasiones separadas por 10 días
resultó en una diferencia de 78 veces en la media de títulos séricos
de IgG antisubunidad B de 7.000 \pm 1.800 y de 90 \pm 90,
respectivamente. Si se administraban a los ratones tres dosis
intranasales de 10 \mug de CtxB o de CtxB(H57A) en PBS, en
tres ocasiones separadas por 7 días, los títulos séricos medios de
antisubunidad B eran de 125.000 \pm 64.000 y de 11.000 \pm
3.000, respectivamente. Por lo tanto, los presentes inventores
concluyen que la mutación H57A causa una marcada reducción de la
inmunogenicidad de la subunidad B.
Ejemplo
5
Para obtener una mejor comprensión de las
consecuencias estructurales de la sustitución de
His-57, se cocristalizó CtxB(H57A) con
galactosa.
Esto reveló una estructura de difracción por
rayos X notable en varios aspectos. La alteración más llamativa es
la conformación del bucle V52-I58 en
CtxB(H57A), que es bastante diferente de la observada en la
toxina de tipo salvaje (Figs. 5A y 5B). El átomo C\alpha del
residuo mutado 57 se desplaza \sim4\ring{A}, y la diferencia en
la posición del esqueleto se incrementa en \sim7\ring{A} en el
residuo Gln-56 en comparación con la estructura de
CtxB de tipo salvaje acomplejado con
oligosacárido-GM1 (GM1-OS) (18, 25).
Además, el desplazamiento se observa en la totalidad de las 5
subunidades, aunque la galactosa se encuentra unida sólo a 4 de
ellas. El efecto neto del cambio de conformación es el
desplazamiento de los residuos 52-58 hacia el poro
central del pentámero B de la toxina, con el resultado de que la
superficie accesible del pentámero de la toxina queda
sustancialmente alterado en esta región (Fig. 5B). En el complejo de
CtxB de tipo salvaje:GM1-OS, ambos residuos,
E-51 y Q-61, forman enlaces de
hidrógenos directos con la galactosa terminal de GM1, mientras que
el residuo Q-56 forma enlaces de hidrógeno mediados
por el solvente tanto con la galactosa terminal como con el ácido
siálico de GM1. Dado lo anterior, resulta bastante inesperado que un
cambio tan grande de la conformación del bucle no impida, o por lo
menos altere, la unión del sacárido. Sin embargo, la localización
observada de la galactosa en el presente complejo difiere por sólo
0,4\ring{A} r.m.s. respecto a la observada para la galactosa
terminal en el complejo GM1-OS (Fig. 5A). Por lo
tanto, los presentes inventores predicen que, con independencia del
desplazamiento del bucle, el modo de unión global de GM1 no resulta
esencialmente alterado por la mutación (Fig. 5B), lo que es
consistente con las mediciones biofísicas de afinidad de GM1 de los
presentes inventores.
Además del desplazamiento de posición del bucle,
los residuos 52-58 se encuentran bien ordenados en
cada una de las cinco subunidades de la estructura de
CtxB(H57A). En un conjunto de grandes dimensiones de
estructuras anteriores determinadas para CtxB y EtxB acomplejados
con diversos análogos de receptor, se ha encontrado una correlación
prácticamente perfecta de orden con la unión del sacárido (19). Esto
se ha interpretado como que implica que el bucle es relativamente
flexible en la toxina no unida, adquiriendo un buen orden al
envolverse alrededor del sacárido terminal galactosa durante la
unión de un receptor. En la estructura de CtxB(H57A) mutante,
se pierde esta correlación, implicando que la transición del bucle
de una estructura desordenada a una fija, que se produce cuando los
pentámeros B de tipo salvaje se unen a receptores, ya se ha
producido en el mutante H57 en ausencia de sacárido unido.
Se expresó EtxB recombinante en un vibrio no
toxicogénico, Vibrio sp. 60, y se purificó tal como se ha
informado anteriormente (15). Se redujeron los LPS de EtxB
utilizando columnas detoxi-gel (Pierce, Rockford),
resultando en \leq50 unidades de endotoxina (EU) por mg de EtxB,
según se determinó en un ensayo de lisado del amebocito
Limulus (BioWhittaker, Walkersville). Los péptidos se
sintetizaron mediante síntesis en fase sólida y se purificaron
mediante HPLC en fase reversa por el Dr. G. Bloomberg (Department of
Biochemistry, University of Bristol). La masa molecular de cada
péptido se confirmó mediante espectrometría de masas. Las secuencias
aminoácidas y pesos moleculares de los péptidos utilizados en este
estudio se indican en la Tabla 1.
| Péptido | Secuencia | P_{M} | |
| 8mero | SIINFEKL | 945 | |
| 9mero | CSIINFEKL | 1.048 | |
| 16mero | CEKLAGFGSIINFEKL | 1.751 | |
| 19mero | CAVGAGATAEESIINFEKL | 1.905 | |
| 26mero | CEKLAGFGAVGAGATAEESIINFEKL | 2.608 | |
| 26mero* | CEKLAGFGARGAGATAEESIINFEKL | 2.665 | |
| 31mero | CEKLAGFGAVGAGATAEESIINFEKLTEWTS | 3.212 |
Para la conjugación de los péptidos con EtxB, se
utilizó el reticulante bifuncional químico
N-(gamma-maleimido-butiril-oxi)succinimida
(GMBS) (Pierce). En resumen, en primer lugar se hizo reaccionar EtxB
con GMB en una proporción molar 1:4 durante 1 hora a temperatura
ambiente y se extrajo el GMBS en exceso mediante filtración en gel
en una columna Sephadex G-25 (Pharmacia, Uppsala,
Suecia). Las fracciones que contenían EtxB-GMBS se
agruparon y se hicieron reaccionar con péptido a una proporción
molar de 1:2 durante 2 horas a temperatura ambiente. Cada péptido
contenía una cisteína N-terminal para permitir la
reacción directa entre la cisteína libre y el segundo grupo reactivo
en la molécula de GMBS. Los grupos de GMBS no reaccionados se
refrescaron mediante la adición de 2-mercaptoetanol
(2-ME) (Sigma, Poole, UK) hasta una concentración
final de 50 mM y se incubaron a temperatura ambiente durante 30
minutos. Finalmente, se separaron los conjugados de
EtxB-péptido del péptido en exceso en una columna
Sephadex G-50 (Pharmacia). Para todos los péptidos,
se alcanzó una proporción de pentámero EtxB:péptido de
aproximadamente 1:5, según estimación mediante filtración en gel en
una columna de Superdex 200 conectada a un sistema SMART (Pharmacia)
utilizando estándares de peso molecular. Se determinó la
concentración de conjugado utilizando el ensayo de la proteína Dc
(BioRad, Richmond) y la concentración molar equivalente estimada a
partir de la proporción EtxB:péptido. Los conjugados se analizaron
hervidos o sin hervir en geles de SDS-poliacrilamida
seguido de tinción con Coomassie. La inmunorreactividad de los
conjugados se examinó mediante transferencia western utilizando un
anticuerpo monoclonal (mAb) (118-8) específico para
los pentámeros EtxB y un antisuero policlonal específico para el
péptido SIINFEKL (cortesía del Dr. Y. Reiss, Tel Aviv University,
Israel). Se evaluaron las propiedades de unión a GM1 de EtxB y de
los conjugados de EtxB en un ELISA sándwich con GM1, esencialmente
tal como se ha descrito anteriormente (15).
Se adquirió JAWSII, una línea C57BL/6
inmortalizada de células dendríticas derivada de la médula ósea
(patente US nº 5.648.219) de la American Type Culture Collection
(Manassas) y se cultivó en medio RP10 (RPMI 1640 que contenía
Glutamax-1, 100 \mug/ml de
penicilina/estreptomicina y suero de feto bovino al 10% (FBS) (todos
de GIBCO BRL, Paisley, UK)) suplementados con 2 ng/ml de
GM-CSF recombinante de ratón (Sigma) a 37ºC en un
incubador humidificado de CO_{2}. El hibridoma RF33.70 de células
T (16) que reconocía el péptido
OVA(257-264)SIINFEKL en el contexto
del MHC-1 H-2 K^{b}, fue una
amable donación del Dr. K.L. Rock (University of Massachusetts) y se
cultivó tal como anteriormente en medio RP10 que contenía HEPES 20
mM, 1 mM de aminoácidos no esenciales, indometacina 25 \muM, 0,25
\mug/ml de fungizona uno (todos de GIBCO) y 2-ME 5
x 10^{-5} M.
Se examinó la presentación de péptidos por
MHC-1 mediante el seguimiento de la liberación de
IL-2 por el hibridoma RF33.70 de las células T (16).
Se sembraron células dendríticas JAWSII en placas de 96 pocillos a 2
x 10^{5} células/ml y se cultivaron durante la noche. A
continuación, las células se incubaron con muestras de ensayo
duplicadas a las concentraciones y durante los intervalos de tiempo
indicados. En todos los experimentos se utilizaron cantidades
equivalentes de péptido libre o conjugado. Tras la incubación con
antígeno, las células se fijaron con paraformaldehído al 1% durante
10 minutos a temperatura ambiente, se lavaron 5x con medio y se
incubaron durante la noche con hibridoma RF33.70 de células T (5 x
10^{5} células/ml). Se utilizó péptido 8mero SIINFEKL libre y PBS
como controles positivos y negativo, respectivamente. Tras la
incubación durante la noche, se determinó la secreción de
IL-2 inducida por la presentación utilizando un kit
ELISA de IL-2 disponible comercialmente (Pharmingen,
San Diego). Los niveles de IL-2 se proporcionan como
media (U/ml) \pm desviación estándar (SD). Los datos presentados
son representativos de por lo menos 3 experimentos
independientes.
Un procedimiento alternativo basado en FACS para
una evaluación directa de la presentación de antígeno por las
células JAWSII, que implica la utilización del mAb 25D1.16 contra el
complejo MHC-1/SIINFEKL (17) (amable donación de los
Drs. C. Reis e Sousa, Imperial cáncer Research Fund, UK), se utilizó
asimismo para evaluar la presentación de clase I mediada por EtxB.
En resumen, se trataron 2-4 x 10^{6} células
JAWSII con péptido o con EtxB solo o mezclado, o con conjugado de
EtxB a la concentración equivalente de 100 nM de péptido, durante 2
horas en un matraz de cultivo de tejidos de 25 cm^{2}. A
continuación, las células se tripsinizaron, se centrifugaron (5
minutos, 1.000 rpm), se lavaron con PBS/FBS/azida (PBS que contenía
FBSA al 5%, y azida sódica al 0,02%) y se incubaron con mAb 25D1.16
(1:200) durante 30 minutos a 4ºC. Después, las células se lavaron
con PBS/azida, y se incubaron con un anticuerpo de cabra marcado con
FITC específico para la IgG de ratón (1:500) (DAKO, Cambs., UK)
durante 30 minutos a 4ºC. Finalmente, las células se lavaron con un
flujo de FACS (Becton Dickinson, San Jose) y se analizaron mediante
citometría de flujo (FACScan, Becton Dickinson). Se utilizaron como
controles células tratadas con péptido SIINFEKL y no tratadas.
Se estudiaron asimismo los efectos de inhibición
de la bafilomicina A1 (BafA1), la brefeldina A (BFA) (ambos de
Sigma) y de la epoxomicina (Calbiochem, Nottingham, UK) sobre el
suministro mediado por EtxB. En estos experimentos, se preincubaron
células JAWSII con inhibidores durante 1 hora a las concentraciones
indicadas. Posteriormente, las células se incubaron con conjugados
de EtxB o con EtxB y con péptido solo o mezclado, durante 2 horas y
se procesaron tal como anteriormente.
Para el análisis microscópico, las células
JAWSII en primer lugar se cultivaron durante 48 horas sobre
cubreobjetos estériles recubiertos con colágeno de tipo II de rata
(Sigma). Posteriormente, las células se trataron durante los
periodos de tiempo indicados con conjugados de EtxB, se fijaron con
paraformaldehído al 4% durante 10 minutos y después se
permeabilizaron mediante una incubación de 15 minutos en
paraformaldehído al 4% que contenía Tritón X-100 al
0,5% (Sigma). Tras el lavado repetido con PBS, las células se
incubaron con mAb 25D1.16, específico para el complejo
MHC-1/SIINFEKL (1:200) o con un antisuero policlonal
de conejo específico de EtxB (1:500) (proporcionado amablemente por
el Dr. M. Pizza) diluido en PBS/BSA (PBS que contenía albúmina de
suero bovino al 3%, fracción V, Sigma) durante 1 hora a temperatura
ambiente. A continuación, las células se lavaron con PBS, y se
incubaron con anticuerpos secundarios marcados con FITC o con TRITC
dirigidos contra IgG de ratón o de conejo (1:100) (Jackson Immuno
Research Laboratories, West Grove). En algunos experimentos, se
pretrataron células fijadas con aglutinina de germen de trigo (WGA,
Sigma) marcada con rodamina, para visualizar las membranas
plasmáticas y de Golgi. A continuación, se montaron cubreobjetos
lavados sobre portaobjetos de vidrio para examen con gotas de
Mowiol que contenía
1,4-diazabiciclo[2.2.2]octano al 2,5%
(DABCO) protector de fluorescencia y dihidrocloruro de
4',6-diamidino-2-fenilindol
(DAPI) (1 mg/ml) para la tinción del núcleo (todos de Sigma) y
después se examinaron utilizando un microscopio invertido confocal
Leica DH1RBE (Leica, Buffalo) en la MRC Cell Imaging Facility del
Department of Biochemistry, University of Bristol.
\newpage
Ejemplo
6
Basándose en el descubrimiento anterior de los
presentes inventores de que la fusión a EtxB de un péptido
C-terminal de 27 aminoácidos de la ADN polimerasa
(Pol) de HSV-1 permitía la introducción del péptido
en las células eucarióticas (14), se decidió evaluar si podía
utilizarse la subunidad B como vehículo genérico para el envío de
epítopos hacia la ruta de presentación de clase I. Debido a que el
péptido Pol contiene varias características que se especula que se
encuentran implicadas en la liberación de péptidos y en la
traslocación endosómica, es decir un sitio putativo de corte y
empalme de la catepsina D (EKL\downarrowAG\downarrowF) y un
segmento de bucle de aminoácidos hidrofóbicos y con carga
(AGFGAVGAGATAEE), estos elementos se incorporaron contiguamente al
epítopo bien caracterizado de clase I (SIINFEKL) de la ovoalbúmina.
De esta manera, se diseñó un péptido 26mero sintético que contenía
un residuo cisteína N-terminal adecuado para la
conjugación química, y el sitio putativo de corte y empalme, el
segmento Pol-bucle y el epítopo de clase I de modelo
(Tabla 1) y después se conjugó químicamente con EtxB tal como se
describe en la sección de materiales y procedimientos.
El conjugado resultante conservaba las
propiedades características de estabilidad de EtxB, migrando en
forma de especie pentamérica de elevado peso molecular en geles de
SDS-poliacrilamida si no se calentaba previamente al
análisis, y disociándose en monómeros al someterlo a ebullición
(Fig. 6A, carriles 3 y 4). El conjugado no calentado presentaba una
movilidad electroforética que era más lenta y presentaba una
apariencia más difusa que el pentámero nativo EtxB, sugiriendo la
unión de varios péptidos 26meros por molécula de EtxB (comparar los
carriles 1 y 3). Al hervir, resultaron evidentes especies de
conjugado monomérico con uno, dos o más péptidos conjugados por
monómero de EtxB (carril 4). El análisis de transferencia western de
EtxB y del conjugado EtxB-26mero demostró el
reconocimiento de EtxB pentamérico y de conjugado
EtxB-26mero por un mAb 118-8
específico para el pentámero EtxB (Fig. 6B), y el reconocimiento de
EtxB-26mero monomérico y pentamérico por un
antisuero policlonal específico para SIINFEKL (Fig. 6C). En las
ELISAs de unión a GM1, el conjugado EtxB-26mero
podía detectarse fácilmente con anticuerpos específicos tanto para
EtxB como para SIINFEKL, confirmando su capacidad para unirse a GM1
(Figs. 6D y E). La proporción péptido:pentámero EtxB del conjugado
estimada mediante cromatografía de filtración en gel, junto con la
concentración de conjugado, se utilizó para determinar la
concentración aparente de péptido en el conjugado tal como se
describe en la sección materiales y procedimientos.
Ejemplo
7
La capacidad del conjugado
EtxB-26mero de dirigir el epítopo SIINFEKL derivado
de OVA al MHC-1 se investigó en ensayos de
presentación de antígeno utilizando células JAWSII como células
presentadoras de células, y la liberación de IL-2
por el hibridoma RF33.70 de células T específico para SIINFEKL, como
indicador de la presentación del antígeno.
La Fig. 7A muestra que el conjugado
EtxB-26mero, pero no el péptido solo ni EtxB
mezclado con péptido, estimulaban la presentación de antígeno
restringida por clase I de una manera
dosis-dependiente. El transporte mediado por EtxB
alcanzó niveles de saturación al equivalente de 100 nM de péptido, y
los niveles de IL-2 eran comparables a los
observados si las células se incubaban con un péptido 8mero SIINFEKL
libre (Fig. 7A). Para una evaluación más directa de la presentación
de antígeno, se utilizó un ensayo basado en FACS que implicaba la
utilización de mAb 25D1.16 específico para complejos
MHC-1/SIINFEKL. Los resultados obtenidos eran
totalmente consistentes con los datos de liberación de
IL-2. De acuerdo con ello, el conjugado
EtxB-26mero y el péptido SIINFEKL libre indujo un
desplazamiento claro y similar de la fluorescencia (Fig. 7B),
mientras que EtxB y el péptido 26mero solos o mezclados no indujeron
un desplazamiento de fluorescencia (datos no representados). Este
incremento de la presentación de antígeno no se debía a la
regulación positiva inducida por EtxB de la expresión de
MHC-1, debido a que los niveles de expresión de
MHC-1 no cambiaron tras el tratamiento con
conjugados de EtxB (datos no representados). De esta manera, la
liberación observada de IL-2 era el resultado de la
aparición de complejos MHC-1/SIINFEKL sobre la
superficie celular y el posterior reconocimiento y producción de
IL-2 por el hibridoma RF33.70 de células T.
Ejemplo
8
En un intento de confirmar que los elementos
estructurales en el péptido 26mero eran responsables de facilitar el
transporte del péptido, se diseñaron 4 péptidos adicionales: un
péptido 9mero, uno 16mero, uno 19mero y uno 26mero* para investigar
la contribución de la región putativa de corte y empalme y el
segmento Pol-bucle (Tabla 1). Todos los péptidos se
conjugaron a EtxB y se confirmó su capacidad de unirse a GM1
mediante ELISA sándwich-GM1 tal como anteriormente
(datos no representados).
La Fig. 8A muestra que la totalidad de los
conjugados de EtxB-péptido, cuando se utilizaron a
100 nM de equivalentes de péptido, eran capaces de activar la
presentación de antígeno. Al igual que el 8mero, el péptido 9mero
CSHNFEKL estimuló significativamente la presentación de clase I al
someterlo a ensayo solo o en mezcla con EtxB, indicando que era
capaz de cargarse directamente sobre las moléculas de
MHC-1 presentes sobre la superficie celular. Resulta
interesante que el grado de suministro de péptido al utilizar el
EtxB-9mero era inferior que el conseguido con el
péptido 9mero libre (Fig. 8A). Los péptidos de mayor tamaño no
pudieron cargarse directamente sobre MHC-1 y eran
dependientes del suministro mediado por EtxB para su presentación.
El grado de suministro mediado por EtxB del péptido 16mero, que
contiene la región putativa de corte y empalme contigua al epítopo
SIINFEKL, era muy similar al del conjugado
EtxB-9mero. Esto indica que la inclusión del sitio
putativo de corte y empalme de la catepsina D no contribuye
significativamente al grado de suministro de epítopo. En contraste,
la conjugación a EtxB de los péptidos 19mero y 26mero, conteniendo
ambos el segmento Pol-bucle, resultó en un
suministro incrementado de péptido, comparable a la carga máxima
conseguida con el péptido 8mero SIINFEKL libre (Fig. 8A). Por lo
tanto, los presentes inventores concluyen que la incorporación del
segmento Pol-bucle contiguamente al epítopo de clase
I causa un marcado incremento del grado de presentación de epítopo
mediada por EtxB.
Para evaluar la cinética de la aparición de los
complejos MHC-1/SIINFEKL sobre la superficie
celular, se fijaron células en diversos puntos del tiempo tras la
incubación con los conjugados de EtxB. Tras 5 minutos de incubación
con los conjugados no resultaba evidente presentación de péptido,
mientras que tras 15 minutos la totalidad de los conjugados había
alcanzado niveles máximos de presentación (Fig. 8B). Tal como se
esperaba, la adición del péptido 8mero SIINFEKL libre resultó en
presentación de péptido en el primer punto del tiempo ensayado.
Para investigar con mayor detalle si las
propiedades intrínsecas del segmento Pol-bucle
contribuían al suministro de péptido, se diseñó un péptido 26mero*
(Tabla 1). Este contenía una sola sustitución Val por Arg que
debería alterar la hidrofobicidad relativa del segmento
Pol-bucle. Al someterlo a ensayo, el conjugado
EtxB-26mero* mostraba una marcada alteración de la
cinética del suministro del epítopo SIINFEKL, no resultando evidente
ninguna presentación dentro de los primeros 10 minutos, y sólo
alcanzando la presentación máxima tras 120 minutos (fig. 8B). Por lo
tanto, la inclusión del segmento nativo Pol-bucle
aparentemente contribuye a la eficiencia de suministro de epítopo
mediado por EtxB en la ruta de presentación de
MHC-1.
Ejemplo
9(a)
La ruta de transporte por la que EtxB actúa como
mediador en el suministro de los péptidos conjugados en la ruta
MHC-1 se investigó utilizando bafilomicina A1
(BafA1), un inhibidor de la V-ATPasa responsable de
la acidificación de orgánulos de la ruta endocítica (18) y la
brefeldina A (BFA), un fármaco disruptor de Golgi e inhibidor de la
secreción mediada por vesículas (19).
El tratamiento de células JAWSII durante 60
minutos con BafA1 o con BFA, previamente a la adición de los
conjugados EtxB-9mero, -16mero, -19mero, -26mero y
-26mero*, condujo a la inhibición total del suministro de epítopo
mediado por EtxB, según evaluación mediante el ensayo de liberación
de IL-2 y la detección con FACS de los complejos
MHC-1/SIINFEKL. Debido a que los resultados
obtenidos con la totalidad de los conjugados anteriores eran
idénticos, sólo se muestran los datos con
EtxB-19mero (Figs. 9B-C y
F-G). Cabe destacar que el tratamiento de las
células JAWSII con BafA1 o con BFA no inhibió la carga directa y la
presentación del péptido 8mero libre (Figs. 9B-C).
Además, al someter a ensayo la monensina, un inhibidor
Na^{+}-yonóforo de la acidificación endosómica, se
bloqueó el suministro de epítopo mediado por EtxB, mientras que la
presentación del péptido 8mero libre no se vio afectada (datos no
representados). Conjuntamente estos resultados sugieren que la
presentación de péptido mediada por EtxB depende de la entrada del
conjugado en endosomas ácidos y el transporte hasta la red de
Golgi.
Golgi.
Ejemplo
9(b)
Para evaluar el posible requisito del
procesamiento mediado por proteosoma de los péptidos suministrados
por EtxB, se sometió a ensayo el efecto de los inhibidores
proteosómicos bien caracterizados.
Al añadir epoxomicina, un inhibidor proteosómico
específico (20), a células JAWSII 60 minutos antes de la adición de
EtxB-19mero o de 8mero libre, no se observó
inhibición de la presentación de epítopo (Figs. 9D y H). De manera
similar, la lactacisina y MG132, dos inhibidores adicionales de la
actividad proteosómica, no pudieron impedir la presentación de
epítopo mediada por EtxB o libre (datos no representados). Se
obtuvieron resultados similares al someter a ensayo la totalidad del
resto de conjugados EtxB-péptido en presencia de
epoxomicina, lactacisina o MG132 (datos no representados). Aunque
estos resultados sugieren una falta de implicación proteosómica en
la ruta del suministro y presentación de epítopo mediada por EtxB,
Rock y colaboradores han demostrado que el corte y empalme
proteosómico de la ovoalbúmina crean el extremo
C-terminal apropiado en el epítopo SIINFEKL,
mientras que peptidasas diferentes en el citosol o en el ER generan
el extremo N-terminal apropiado a partir de péptidos
extendidos (21,22). En consecuencia, debido a que la totalidad de
los péptidos sometidos a ensayo por los presentes inventores
contenía el epítopo SIINFEKL en su extremo
C-terminal, resulta altamente improbable que la ruta
de suministro de estos epítopos dependa del corte y empalme mediado
por proteosoma. Por lo tanto, con el fin de investigar directamente
si el proteosoma podría ser un participante, se diseñó un péptido
31mero adicional, que comprendía una extensión de cinco aminoácidos
en el 26mero, creando de esta manera un epítopo SIINFEKL interno
(Tabla 1). La incubación de las células JAWSII con el
EtxB-31mero resultó en la presentación eficiente del
epítopo SIINFEKL, según evaluación mediante el ensayo de liberación
de IL-2 y mediante FACS (Figs. 9A y E). Tal como
anteriormente, previamente al tratamiento con BafA1 o BFA evitó la
presentación de epítopo mediada por EtxB-31mero
(Figs 9B-C y F-G). Sin embargo, en
contraste con el comportamiento de los demás conjugados, el
transporte de epítopo por EtxB-31mero resultó
completamente bloqueado por la adición de epoxomicina (Figs. 9D y
H), lactacistina y MG132 (datos no representados). Esto demuestra
que el corte y empalme mediado por proteosoma del péptido 31mero
resulta necesario para que entre en la ruta de presentación de clase
I.
Ejemplo
10
Para visualizar la ruta del tráfico de los
conjugados de EtxB y para determinar la localización de los
complejos MHC-1, las células se trataron con
EtxB-19mero o con EtxB-31mero y se
tiñeron con anticuerpos dirigidos contra EtxB o
MHC-1/SIINFEKL y se examinaron a continuación
mediante microscopía confocal.
Tras 1 minuto de incubación con los conjugados,
el grupo ETXb podía observarse claramente en la superficie celular,
mientras que los complejos MHC-1/SIINFEKL eran
indetectables (Fig. 10A, imágenes e-h). Tras 120
minutos, tanto EtxB-19mero como
EtxB-31mero habían sido internalizados prácticamente
por completo y la tinción perinuclear era evidente tanto con
anticuerpos específicos para EtxB como para los específicos para
MHC-1/SIINFEKL, con considerable colocalización
(Fig. 10A, imágenes i-l).
Esta tinción perinuclear era indicativa de
localización de tanto EtxB como de los complejos
MHC-I/SIINFEKL en el ER o en la red de Golgi, en
consistencia con la ruta de tráfico de EtxB (23) y la localización
celular normal de las moléculas de MHC-1 de nueva
síntesis (6). Con el fin de identificar la localización celular de
los complejos MHC-1/SIINFEKL con mayor exactitud, se
trataron células fijadas con aglutinina de germen de trigo marcada
(WGA) marcada con rodamina, específica para la
N-acetil-\beta-D-acetilglucosamina
presente en las membranas de Golgi/ER y plasmáticas (24), seguido de
anticuerpos antiMHC-1/SIINFEKL y secundarios (Fig.
10B). Se descubrió que los complejos WGA y
MHC-1/SIINFEKL se colocalizaban, confirmando que
estos complejos se encontraban presentes en el Golgi (Fig. 10B,
imágenes a-d). Además, cuando las células se
preincubaron con epoxomicina para inhibir la actividad proteosómica,
no se observó tinción con los anticuerpos específicos para
MHC-1/SIINFEKL al tratar las células con
EtxB-31mero (Fig. 10B, imágenes d frente a h),
mientras que se observó una colocalización normal de WGA y
MHC-1/SIINFEKL al tratar las células con
EtxB-19mero (Fig. 10B, imágenes c frente a g).
Además, no se observaron complejos MHC-1/SIINFEKL
detectables al tratar las células con BafA1 o BFA, previamente a la
adición de los conjugados EtxB-19mero o
EtxB-31mero (datos no representados). Los
resultados anteriores sobre los efectos del tráfico y los
inhibidores proteosómicos están totalmente de acuerdo con los
resultados obtenidos en los ensayos de presentación de antígeno. Por
lo tanto, los presentes inventores concluyen que EtxB es un vehículo
de suministro efectivo capaz de enviar epítopos unidos desde una
localización exógena hasta la ruta endógena de presentación y
procesamiento de antígeno de clase I dependiente de proteosoma.
Ejemplo
11(a)
La Fig. 11 muestra un curso temporal de entrada
del mutante EtxB(H57S) en células T Jurkat en comparación con
la subunidad B de tipo salvaje.
EtxB(H57S), al igual que
CtxB(H57A) descrita en los Ejemplos 1 a 5 anteriormente,
conserva su capacidad de unión a GM1, pero carece de la capacidad de
desencadenar sucesos de señalización en los leucocitos. Tal como
muestra la figura 11, tanto EtxB de tipo salvaje como el mutante se
suministran en el interior de las células T Jurkat con cinética y
distribución celular similares. De esta manera, los datos que
indican que los mutantes conservan su potencial de transporte
dirigido de fármacos aunque han perdido sus potentes propiedades
inmunomoduladoras.
\newpage
Ejemplo
12
Para establecer que los mutantes EtxB H57
conservan su capacidad de servir como vehículos de suministro de
péptido, las células JAWS II se trataron con un conjugado
EtxB(H57A)-19mero y se evaluó la presentación
de epítopo tal como se describe en el Ejemplo 7.
La Fig. 12 muestra que el conjugado
EtxB(H57A)-19mero era capaz de estimular la
presentación de antígeno restringida por MHC de clase I hasta un
nivel comparable al conseguido con el conjugado
EtxB-19mero de tipo salvaje y con péptido SIINFEKL
8mero libre que es capaz de la carga directa sobre moléculas de
MHC-1 presentes sobre la superficie celular. Cabe
destacar que virtualmente no se produjo presentación en el ensayo
del péptido 19mero libre o del péptido 19mero mezclado con
EtxB(H57A). La conjugación del péptido 19mero con
EtxB(G33D), un mutante no ligante, tampoco pudo conducir a la
presentación de péptido restringida por MHC de clase I. Por lo
tanto, los presentes inventores concluyeron que EtxB(H57A)
conservaba las capacidades de transporte de la molécula EtxB de tipo
salvaje.
Para investigar si esta región de las
subunidades B resulta importante para la acción de la toxina en la
enfermedad y en la inmunomodulación mediada por la subunidad B, se
sustituyeron secuencialmente los residuos individuales del bucle por
Ala. En la presente memoria se muestra que uno de los mutantes, con
una sustitución de His por Ala en la posición 57 (CtxB(H57A))
es severamente defectivo como inmunomodulador, y que la holotoxina
correspondiente, Ctx(H57A) muestra toxicidad nula, aunque
estas moléculas conservan su capacidad de unirse con afinidad
elevada a GM1. El análisis cristalográfico de rayos X de
CtxB(H57A) reveló que la región del bucle había experimentado
un sorprendente desplazamiento de 7\ring{A}, bloqueando
parcialmente la región de poro en la superficie enrollada inferior
de la molécula, aunque sin alterar la capacidad de la cavidad del
receptor de cocristalizar con la galactosa. Esto indica que el bucle
define un sitio importante sobre la toxina del cólera que resulta
esencial para sus diversas actividades, y que la unión de GM1 por sí
sola no resulta suficiente para desencadenar la acción de la
toxina.
En la presente memoria, los presentes inventores
demuestran que, cuando un epítopo de clase I se encuentra unido a
EtxB o a un mutante EtxB(H57), puede suministrarse en la ruta
de presentación de MHC de clase I. Además, los presentes inventores
demuestran que la eficiencia del suministro de péptidos mediado por
EtxB puede aumentarse mediante la incorporación de un segmento de 10
aminoácidos del péptido Pol contiguo al epítopo de clase I. La
adición de una extensión C-terminal a estos
constructos de epítopo condujo a que la presentación de MHC de clase
I fuese completamente dependiente de la actividad proteosómica.
Estos resultados, conjuntamente con las observaciones de que la
presentación era dependiente de la acidificación endosómica y de la
presencia de un compartimiento de Golgi intacto, indican que EtxB y
los mutantes EtxB H57 son capaces de actuar como moléculas
reguladoras del tráfico que facilitan el suministro de los epítopos
exógenos hasta la ruta endógena de presentación y procesamiento de
antígenos de clase I.
La unión de receptor de gangliósido GM1 por la
subunidad B de la toxina del cólera (CtxB) se acepta ampliamente que
inicia la acción de la toxina al desencadenar la incorporación y el
suministro de la subunidad A de la toxina en el interior de las
células. Más recientemente, la unión de GM1 por CtxB aislado, o la
subunidad B relacionada de la enterotoxina lábil al calor de E.
coli (EtxB) se ha descubierto que modula la función
leucocitaria, resultando en la regulación negativa de las respuestas
inmunológicas proinflamatorias que causan trastornos
autoinmunológicos, tales como la artritis reumatoide y la
diabetes.
La presente invención demuestra que la unión de
GM1, al contrario de lo que se esperaba, no resulta suficiente para
iniciar la potente acción tóxica o inmunomoduladora de la toxina.
Los datos de estudios llevados a cabo sobre la manipulación y
estructura cristalográfica de una toxina del cólera mutante, con una
sustitución de His por Ala en la subunidad B en la posición 57
demostró que el mutante conservaba estabilidad pentamérica y una
unión de elevada afinidad al gangliósido GM1, pero que había perdido
su actividad inmunomoduladora y, cuando formaba parte del complejo
holotoxina, mostraba la desaparición de la toxicidad.
\newpage
Resulta posible que la mutación H57A altere
sutilmente la naturaleza de la interacción con GM1, de manera que
los sucesos putativos, y hasta el momento mal definidos, que se
producen después no pueden activarse. Los estudios cristalográficos
anteriores han revelado que el único cambio estructural que se
produce cuando los pentámeros B interaccionan con el pentasacárido
de GM1, o con otros carbohidratos, tales como la galactosa, es que
la región de bucle adquiere más rigidez (4). Aunque no se ha explora
la significación de ello, resulta posible que la transición desde
una estructura flexible a una rígida contribuya a la manera en la
que los grupos GM1 unidos se encuentran restringidos en la membrana.
A este respecto, la cristalografía de rayos X reveló que el bucle de
la cavidad del receptor del mutante H57A, al carecer de carbohidrato
unido, aparentemente ya había adoptado una estructura más rígida.
Por lo tanto, ello bloquearía la posibilidad de que este tipo de
transición estructural contribuya a la unión cruzada con GM1 de
maneras que pueden resultar en la activación de sucesos
posteriores.
Alternativamente, la toxina del cólera puede
requerir la interacción no sólo con GM1, sino también con otra
molécula de superficie celular para poder ejercer su actividad
biológica. Resulta concebible que, tras la unión a GM1, los bucles
en el pentámero B se posicionen para interaccionar directamente con
otros componentes membranales, posiblemente con una proteína
transmembranal. En consecuencia, la alteración de la posición de los
bucles en los mutantes de la subunidad B podría evitar que ello
ocurriese, aunque la molécula se encontrase restringida en la
membrana por GM1. Cabe destacar que GM1 se localiza preferentemente
en microdominios membranales ricos en colesterol e insolubles en
detergente denominados "balsas", que contienen numerosas
proteínas implicadas en la señalización celular (17). Para los
presentes inventores resulta concebible que la unión de CtxB de tipo
salvaje a GM1 en balsas lo posicione para que interaccione con las
moléculas de señalización en la superficie de la membrana que
participan en el tráfico y en la modulación de células inmunológicas
mediados por la toxina.
Los datos de la presente invención proporcionan
la evidencia de que la mutación H57 no interfiere con la
incorporación o tráfico de una diversidad de tipos celulares,
sugiriendo que los mutantes son defectivos en la transducción de
señales.
Los linfocitos T citotóxicos CD8+ (CTL)
representan un componente importante de la respuesta inmunológica
protectora y terapéutica frente a las infecciones víricas y los
tumores por su capacidad para reconocer péptidos foráneos que se han
unido a las moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad de
clase (MHC-1) (1,2). La mayoría de los péptidos
presentados se derivan de proteínas sintetizadas endógenamente o
localizadas en el citoplasma que corta y empalma el proteosoma (3,4)
formando fragmentos peptídicos de tamaño reducido. Estos fragmentos
se transportan seguidamente a través del transportador de péptidos
antigénicos (TAP) al lumen del retículo endoplásmico (ER), donde se
unen a moléculas de MHC-1 recién sintetizadas (5,6).
Estos complejos de MHC-1-péptido se
envían a la superficie celular, donde resultan reconocidos por los
receptores de células T presentes sobre los CTL. Esto conduce a la
activación de los CTL y la posterior lisis mediada por CTL de la
célula presentadora de péptido (1,2).
Dada la importancia de los CTL para la
eliminación de células infectadas en el huésped, resulta de gran
interés desarrollar nuevas estrategias de vacunación capaces de
inducir respuestas efectivas de los CTL. Sin embargo, en las vacunas
compuestas de antígenos proteicos solubles, la inmunización resulta
en la incorporación de antígeno en una ruta de procesamiento exógena
que conduce a que los fragmentos de péptidos se carguen sobre las
moléculas de MHC de clase II (MHC-II) y no sobre las
MHC-1 (7). De esta manera, con el fin de que los
antígenos solubles induzcan respuestas de CTL restringidas por
MHC-1, los antígenos necesitan acceder a los
compartimientos intracelulares, donde podrán entrar en la ruta
endógena de presentación y procesamiento de clase I (7).
Las toxinas proteicas bacterianas son moléculas
que combinan una capacidad única de unión a células con eficientes
propiedades de suministro citosólico (8). Por lo tanto,
aparentemente resultan idóneas para el suministro de proteínas y
péptidos antigénicos en la ruta de presentación de clase I, con la
condición de que pueda conseguirse la destoxificación sin pérdida
aparente de su capacidad de suministro. En efecto, los derivados
toxoides de la toxina adenilato ciclasa de Bordetella
pertussis (9), la toxina pertussis (10), la toxina del ántrax
(11,12) y la subunidad B de la toxina Shiga (13) se han investigado
como vehículos potenciales para el suministro de péptidos o
proteínas en la ruta de presentación de clase I. La subunidad B de
unión a GM1 no tóxica de la enterotoxina lábil al calor de E.
coli (EtxB) también se ha demostrado recientemente que resulta
un vehículo adecuado para el suministro de péptidos en
compartimientos intracelulares específicos (14). En particular,
cuando un péptido 27mero derivado del extremo
C-terminal de la ADN polimerasa (Pol) del virus
herpes simplex de tipo 1 (HSV-1) se fusionó
genéticamente con el extremo C-terminal de EtxB, se
descubrió que la proteína de fusión entraba en las células, y que el
péptido se liberaba de EtxB y se traslocaba hacia el interior del
compartimiento nuclear. Aunque las características estructurales
presentes en el péptido Pol se conjeturó que se encontraban
implicadas en la facilitación de su liberación de EtxB y en su
traslocación desde compartimientos endosómicos, su contribución al
suministro de péptidos continúa sin estar clara. En la presente
memoria, los presentes inventores investigaron: (i) si EtxB (o el
mutante con una mutación H57) podía utilizarse como un vehículo para
el suministro de los péptidos exógenos en la ruta de presentación de
clase I, e (ii) si la incorporación de elementos del péptido Pol
contiguos al epítopo de clase I podían mejorar la eficiencia del
suministro de
péptidos.
péptidos.
Los presentes inventores han demostrado que
tanto EtxB como un mutante EtxB con una sustitución de His por Ala
en el residuo 57, resultan vehículos efectivos para el suministro de
epítopos en la ruta MHC-1. La capacidad de EtxB y de
EtxB(H57A) de unirse a células resulta esencial para el
suministro de epítopos, ya que los conjugados que comprenden
péptidos ligados a un mutante no ligante de EtxB,
EtxB(G33D)(25), no consiguieron desencadenar la presentación
de péptido. El descubrimiento de que el proteosoma puede participar
en la ruta de presentación de epítopo mediada por EtxB implica que
los péptidos conjugados resultan liberados de EtxB y se traslocan
hasta el citosol para ser procesados por el proteosoma.
Las propiedades intrínsecas de los péptidos
conjugados se descubrió que contribuían al grado y eficiencia de
presentación de los epítopos. A este respecto, los péptidos
conjugados que eran capaces de conseguir niveles de presentación
comparables a la carga directa por el péptido SIINFEKL libre,
contenían todos el segmento Pol-bucle, ejemplificado
por el conjugado EtxB-19mero. Este segmento se
derivó de un dominio dentro de la región C-terminal
de la HSV-1 polimerasa y es parte de una estructura
similar a una horquilla de 36 aminoácidos que consiste en dos
regiones helicoidales interrumpidas por una región de bucle flexible
que contiene dos residuos glutamato (26,27). El segmento Pol
utilizado en el estudio actual contiene los dos glutamatos y la
región flexible compuesta de aminoácidos hidrofóbicos y no polares,
y demuestra un grado de similitud con los péptidos de fusión
procedentes de glucoproteínas víricas (28). Por lo tanto, una
explicación para el suministro mejorado del epítopo SIINFEKL por
péptidos que contienen el segmento Pol-bucle podría
ser que este segmento presenta una tendencia intrínseca a penetrar
en las bicapas lipídicas. Además, es conocido que para la
traslocación dependiente del pH, la protonación de los residuos
ácidos en horquillas helicoidales permite la inserción de dominios
hidrofóbicos en las bicapas lipídicas (29). De esta manera, la
liberación de EtxB, seguido de la protonación de los glutamatos y a
continuación la traslocación a través de una membrana vesicular
hacia el interior del citosol debería permitir una entrada altamente
eficiente en la ruta endógena de presentación de clase I.
En apoyo de esta hipótesis, el péptido 26mero
mutado, 26mero*, con una sustitución de Arg en el medio del segmento
Pol-bucle, mostraba una cinética de suministro más
lenta, posiblemente debido a una reducción de la eficiencia de
traslocación. Además, el resultado de que BafA1 y monensina inhibían
la presentación de epítopos mediada por EtxB indica que la entrada
en un endosoma ácido resulta esencial para el suministro de
péptidos. Dado que el tráfico y la toxicidad de la toxina del cólera
son refractarios a los agentes caotrópicos (30), esto implicaría que
resulta necesaria la entrada en un ambiente ácido para el suministro
eficiente de los epítopos y no para el tráfico del portador. En
consecuencia, un ambiente ácido podría permitir la protonación de
los residuos glutamato de Pol-bucle para la
traslocación posterior. También resulta posible que la entrada en
endosomas ácidos resulte necesaria para la liberación del péptido de
EtxB como resultado de la actividad de las proteasas
ácido-dependientes, tales como las catepsinas. Sin
embargo, al evaluar la presentación del péptido 26mero mediada por
EtxB en presencia de pepstatina, un inhibidor de las proteasas
ácidas, no presentó ningún efecto sobre el grado de presentación de
SIINFEKL. Además, no se produjo ninguna diferencia en el grado de
presentación de los epítopos mediada por los conjugados
EtxB-26mero, EtxB-19mero y
EtxB(H57A)-19mero, el primero de los cuales
carece de los sitios putativos de corte y empalme de la catepsina D.
Los inhibidores de las metalo-aminopeptidasas y las
serina y cisteína-proteasas, la bestatina y la
leupeptina tampoco presentaron efectos significativos sobre la
presentación de epítopos mediada por EtxB. Sin embargo, se descubrió
que el inhibidor de metaloproteasa 1,10-fenantrolina
inhibía la presentación de antígenos inducida por EtxB, sugiriendo
que podría estar implicada una metaloproteasa en la liberación y/o
el procesamiento de los péptidos conjugados con EtxB.
La capacidad de EtxB (y de los mutantes H57 del
mismo) y del segmento Pol-bucle para suministrar
eficientemente los epítopos restringidos por clase I en la ruta
endógena de MHC-1 debe permitir la apertura de
nuevas oportunidades para el diseño de vacunas capaces de estimular
respuestas protectoras de las células T citotóxicas. Dado que la
eficiencia de la eliminación mediada por CTL está directamente
relacionada con el número de complejos específicos de
MHC-1-péptido sobre la superficie
celular (31), es un dato positivo que el grado de suministro de
péptidos mediado por EtxB alcanzase niveles comparables a la carga
directa de péptidos sobre la superficie de las moléculas de
MHC-1.
Aunque la invención se ha descrito en referencia
a formas de realización preferidas específicas, debe entenderse que
la invención según las reivindicaciones no debe limitarse únicamente
a estas formas de realización específicas. En efecto, las diversas
modificaciones de los modos descritos para poner en práctica de la
invención que resultan evidentes para los expertos en biología
molecular o campos relacionados, se pretende que se encuentren
dentro del alcance de las reivindicaciones siguientes.
1. Hirst, T. R. (1999) in The
Comprehensive Sourcebook of Bacterial Protein Toxins, ed. Freer, J.
E. A. a. J. H. (Academic Press, London), págs.
104-129.
2. Lencer, W. I., Hirst, T. R.
& Holmes, R. K. (1999) Biochim. Biophys.
Acta 1450, 177-190.
3. Holmgren, J., Lönnroth, I.
& Svennerholm, L. (1973) Infect. Immun. 8,
208-214.
4. Sixma, T. K., Kalk, K. H., van
Zanten, B. A. M., Dauter, Z., Kingma, J.,
Witholt, B. & Hol, W. G. J. (1993) J.
Mol. Biol. 230, 890-918.
5. Williams, N. A., Hirst, T. R.
& Nashar, T. O. (1999) Immunol. Today 20,
95-101.
6. Verweij, W. R., de Haan, L.,
Holtrop, M., Agsteribbe, E., Brands, R., van
Scharrenburg, G. J. M. & Wilschut, J.
(1998) Vaccine 16, 2069-2076.
7. Richards, C. M., Aman, A. T.,
Hirst, T. R., Hill, T. J. & Williams, N. A.
(2001) Journal of Virology 75,
1664-1671.
8. Sun, J. B., Rask, C.,
Olsson, T., Holmgren, J. & Czerkinsky, C.
(1996) Proc. Natl. Acad Sci. ( USA) 93,
7196-7201.
9. Williams, N. A., Stasiuk, L.
M., Nashar, T. O., Richards, C. M., Lang, A.
K., Day, M. J. & Hirst, T. R. (1997)
Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 94,
5290-5295.
10. Bergerot, I., Ploix, C.,
Petersen, J., Moulin, V., Rask, C.,
Fabien, N., Lindblad, M., Mayer, A.,
Czerkinsky, C., Holmgren, J. & Thivolet, C.
(1997) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 94,
4610-4614.
11. Francis, M. L., Ryan, J.,
Jobling, M. G., Holmes, R. K., Moss, J. &
Mond, J. J. (1992) J. Immunol. 148,
1999-2005.
12. Nashar, T. O., Hirst, T. R.
& Williams, N. A. (1997) Immunology 91,
572-578.
13. Nashar, T. O., Webb, H. M.,
Eaglestone, S., Williams, N. A. & Hirst, T.
R. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 93,
226-230.
14. Nashar, T. O., Williams, N. A.
& Hirst, T. R. (1996) Int. Immunol. S,
731-736.
15. Wolf, A. A., Jobling, M. G.,
Wimer-Mackin, S.,
Ferguson-Maltzman, M., Madara, J. L.,
Holmes, R. K. & Lencer, W. I. (1998) J.
Cell Biol. 141, 917-927.
16. Olandi, P. A. & Fishman,
P. H. (1995) J. Cell Biol. 141,
905-915.
17. Parton, R. G., Joggerst, B.
& Simons, K. (1994) J. Cell Biol. 127,
1199-1215.
18. Merritt, E. A., Sarfaty, S.,
van den Akker, F., Lhoir, C., Martial, J. A.
& Hol, W. G. J. (1994) Protein Sci. 3,
166-175.
19. Merritt, E. A., Sixma, T. K.,
Kalk, K. H., Van Zanten, B. A. M. & Hol, W.
G. J. (1994) Mol. Microbiol. 13,
745-753.
20. Higuchi, R., Krummel, B. &
Saiki, R. K. (1988) Nucleic Acids Res. 16,
7351-7367.
21. Rodighiero, C., Aman, A. T.,
Kenny, M. J., Moss, J., Lencer, W. I. &
Hirst, T. R. (1999) J. Biol. Chem. 274,
3962-3969.
22. Furste, J. P., Pansegrau, W.,
Frank, R., Blocker, H., Scholz, P.,
Bagdasarian, M. & Lanka, E. (1986)
Gene 48, 119-131.
23. Hirst, T. R., Randall, L. L.
& Hardy, S. J. S. (1984) Journal of
Bacteriology 157, 637-642.
24. Ruddock, L. W., Ruston, S. P.,
Kelly, S. M., Price, N. C., Freedman, R. B.
& Hirst, T. R. (1995) J. Biol. Chem. 270,
29953-29958.
25. Merritt, E. A., Kuhn, P.,
Sarfaty, S., Erbe, J. L., Holmes, R. K. &
Ho, W. G. J. (1998) J. Mol. Biol. 282,
1043-1059.
26. Otwinowski, Z. & Minor, W.
(1997) Meth. Enzymol. 276,
307-326.
27. Bailey, S. (1994) Acta
Crystallogr. Sect. D-Biol. Crystallogr. 50,
760-763.
28. McRee, D. (1993) Practical
Protein Crystallography (Academic Press, San Diego).
29. Sanner, M. F., Olson, A. J.
& Spehner, J. C. (1996) Biopolymers 38,
305-320.
30. Merritt, E. A. & Bacon, D.
J. (1997) Meth. Enzymol. 277,
505-524.
31. Lencer, W. I., Delp, C.,
Neutra, M. R. & Madara, J. L. (1992) J
Cell Biol. 117, 1197-1209.
32. Hardy, S. J. S., Holmgren, J.,
Johansson, S., Sanchez, J. & Hirst, T. R.
(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 85,
7109-7113.
33. Sandkvist, M., Hirst, T. R.
& Bagdasarian, M. (1990) J Biol. Chem. 265,
15239-15244.
34. Kuziemko, G. M., Stroh, M.
& Stevens, R. C. (1996) Biochemistry 35,
6375-6384.
35. Badizadegan, K., Wolf, A.,
Rodighiero, C., Jobling, M. G., Hirst, T. R.,
Holmes, R. K. & Lencer, W. I. (2000)
Int. J. Med. Microbiol. 290, 403-408.
1. Townsend, A. & Bodmer, H.
(1989) Annu. Rev. Immunol. 7,
601-624.
2. Long, E. O. & Jacobsen, S.
(1989) Immunol. Today 10,
45-48.
3. Rock, K. L. & Goldberg, A.
L. (1999) Annu. Rev. Immunol. 17,
739-779.
4. Reits, E. A., Vos, J. C.,
Gromme, M. & Neefjes, J. (2000)
Nature 404, 774-778.
5. Hill, A. & Ploegh, H.
(1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92,
341-343.
6. Heemels, M. T. & Ploegh, H.
(1995) Annu. Rev. Biochem. 64,
463-491.
7. Raychaudhuri, S. & Rock, K.
L. (1998) Nal. Biotechnol. 16,
1025-1031.
8. Burnette, W. N. (1994)
Structure 2, 151-158.
9. Sebo, P., Fayolle, C.,
d'Andria, O., Ladant, D., Leclerc, C. &
Ullmann, A. (1995) Infert. Immun. 63,
3551-3557.
10. Carbonetti, N. H., Irish, T.
J., Chen, C. H., O'Connell, C. B., Hadley, G.
A., McNamara, U., Tuskan, R. G. & Lewis, G.
K. (1999) Infect. Immun. 67,
602-607.
11. Ballard, J. D., Collier, R. J.
& Starnbach, M. N. (1996) Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 93, 12531-12534.
12. Goletz, T. J., Klimpel, K. R.,
Arora, N., Leppla, S. H., Keith, J. M. &
Bcrzofsky, J. A. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 94, 12059-12064.
13. Lee, R. S., Tartour, E., van
der Bruggen, P., Vantomme, V., Joyeux, I.,
Goud, B., Fridman, W. H. & Johannes, L.
(1998) Eur. J Immunol. 28,
2726-2737.
14. Loregian, A., Papini, E.,
Satin, B., Marsden, H. S., Hirst, T. R. &
Palu, G. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA
96, 5221-5226.
15. Amín, T. & Hirst, T. R.
(1994) Prot. Expr. Purif. 5,
198-204.
16. Rock, K. L., Rothstein, L.
& Gamble, S. (1990) J. Immunol. 145,
804-811.
17. Porgador, A., Yewdell, J. W.,
Deng, Y., Bennink, J. W. & Germain, R. N.
(1997) Immunity 6, 715-726.
18. Bowman, E. J., Siebers, A.
& Altendorf, K. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 85, 7972-7976.
19. Lippincott-Schwartz,
J., Yuan, L. C., Bonifacino, J. S. &
Klausner, R. D. (1989) Cell 56,
801-813.
20. Meng, L., Mohan, R.,
Kwok, B. H., Elofsson, M.,Sin, N. &
Crews, C. M. (1999) Proc Natl. Acad. Sci. USA
96, 10403-10408.
21. Craiu, A., Akopian, T.,
Goldberg, A. & Rock, K. L. (1997) Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 94, 10850-10855.
22. Cascio, P., Hilton, C.,
Kisselev, A. F., Rock, K. L. & Goldberg, A.
L. (2001) EMBO J 20,
2357-2366.
23. Lencer, W. I., Delp, C.,
Neutra, M. R. & Madara, J. L. (1992) J
Cell Biol. 117,1197-1209.
24. Tartakoff, A. M. &
Vassalli, P. (1953) J. Cell Biol. 97,
1243-1248.
25. Nashar, T. O., Webb, H. M.,
Eaglestone, S., Williams, N. A. & Hirst, T.
R. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93,
226-230.
26. Bridges, K. G., Hua, Q.,
Brigham-_Burke, M. R., Martín, J. D.,
Hensley, P., Dahl, C. E., Digard, P.,
Weiss, M. A. & Coen, D. M. (2000) J.
Biol. Chem. 275, 472-478.
27. Digard, P., Williams, K. P.,
Hensley, P., Brooks, I. S., Dahl, C. E. &
Coen, D. M. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA
92, 1456-1460.
28. Samuel, O. & Shai, Y.
(2001) Biochemistry 40,
1340-1349.
29. Kaul, P., Silverman, J.,
Shen, W. H., Blanke, S. R., Huynh, P. D.,
Finkelstein, A. & Collier, R. J. (1996)
Prot. Sci. 5, 687-692.
30. Lencer, W. I., Strohmeier, G.,
Moe, S., Carlson, S. L., Constable, C. T. &
Madara, J. L. (1995) Am. J Physiol. 32,
G548-_G557.
31. Wherry, E. J., Puorro, K. A.,
Porgador, A. & Eisenlohr, L. C. (1999)
J. Immunol. 163, 3735-3745.
Claims (7)
1. Utilización de una forma mutante de EtxB o
de CtxB, en la que el mutante comprende una mutación en la región
que comprende los residuos aminoácidos E51-I58 del
bucle \beta4-\alpha2 y presenta una actividad de
unión a GM-1 pero actividades inmunogénica e
inmunomoduladora reducidas respecto a la forma de tipo salvaje de
EtxB o de CtxB, en la preparación de un medicamento para suministrar
un péptido exógeno en la ruta de procesamiento de antígenos de MHC
de clase I de una célula presentadora de antígeno para inducir una
respuesta de CTL para tratar y/o para prevenir una infección vírica
o un cáncer.
2. Utilización según la reivindicación 1, en la
que el péptido exógeno es, o es derivable de, una proteína de
interés (POI) o un antígeno.
3. Utilización según la reivindicación 2, en la
que el antígeno es seleccionado de entre el grupo constituido por un
antígeno vírico, un antígeno bacteriano, un antígeno parasítico, y
un antígeno asociado a tumor (TAA).
4. Utilización según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en la que el péptido exógeno puede
encontrarse unido a un péptido traslocador de membrana o
fusigénico.
5. Utilización según la reivindicación 4, en la
que el péptido traslocador de membrana o fusigénico pueden
comprender elementos del segmento Pol-bucle
correspondientes a un dominio en la región
C-terminal de la HSV-1
polimerasa.
6. Utilización según cualquier reivindicación
anterior, en la que el mutante comprende una mutación en los
residuos aminoácidos 51, 56 y/o 57 del bucle
\beta4-\alpha2.
7. Utilización según la reivindicación 6, en la
que el mutante comprende una mutación H57A o H57S.
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| CN113388008B (zh) * | 2021-06-25 | 2023-04-28 | 太原师范学院 | 一种细胞内质网靶向的自释放型蛋白运输载体lca2及其应用 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| GB9819484D0 (en) * | 1998-09-07 | 1998-10-28 | Univ Bristol | Therapeutic agents |
| JP2003511061A (ja) * | 1999-10-08 | 2003-03-25 | アクティブ バイオテック エイビー | 変更された化学結合体化特性を有するａｂ５毒素ｂサブユニット変異体 |
-
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