ES2864765T3 - Proteína de unión a biotina modificada, proteínas de fusión de la misma y aplicaciones - Google Patents

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Abstract

Una proteína de unión a biotina recombinante soluble, que consiste en la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 1.

Description

DESCRIPCIÓN
Proteína de unión a biotina modificada, proteínas de fusión de la misma y aplicaciones
Campo técnico
La presente divulgación se refiere a proteínas de unión a biotina y las proteínas/composiciones de fusión que comprenden dichas proteínas de unión a biotina. También se describen en el presente documento métodos para expresar proteínas de unión a biotina y/o las proteínas de fusión de las mismas con alto rendimiento y solubles en bacterias.
Antecedentes
La proteína de unión a biotina y sus derivados se pueden utilizar ampliamente en diversas aplicaciones. Sin embargo, la producción o purificación de proteínas de unión a biotina recombinantes puede ser muy difícil. Cuando se expresan en E. coli, la mayoría de las proteínas de unión a biotina tienden a acumularse en cuerpos de inclusión, la desnaturalización, el replegamiento y el laborioso procesamiento posterior son necesarios en la preparación de proteínas activas. Se prefiere la expresión en E. coli debido al bajo coste de producción y al potencial de modificación por ingeniería adicional; por tanto, las proteínas de unión a biotina que se pueden producir de manera eficaz en E. coli están muy buscadas. Asimismo, la expresión en E. coli también ofrece la posibilidad de generar proteínas de fusión recombinantes que contienen proteína de unión a biotina para diversas aplicaciones.
Por consiguiente, existe una necesidad en la técnica de proteínas de unión a biotina y proteínas de fusión que contengan proteínas de unión a biotina que puedan expresarse en forma soluble con altos rendimientos en E. coli. Hytonen et al. (Biochem J. 1 de diciembre de 2004; 384 (Pt 2): 385-90) informan de un método para producir proteína avidina en el espacio periplásmico de E. coli en la forma activa. Se informa que el método implica reemplazar la secuencia señal natural de la proteína con una señal de secreción de OmpA bacteriana.
Sumario
Un objetivo de la presente divulgación es proporcionar una proteína de unión a biotina recombinante, que se pueda expresar en forma soluble con altos rendimientos en E. coli. La invención proporciona proteína de unión a biotina recombinante soluble, proteínas de fusión y proteínas de fusión para su uso en un método para inducir una respuesta inmunitaria en un sujeto, todas ellas tal y como se establece en las reivindicaciones. La presente divulgación también establece una serie de aspectos y casos diferentes como se analiza a continuación en el presente documento que pueden facilitar la comprensión de la presente invención, que se define por las reivindicaciones.
En el presente documento se divulgan casos en los que la proteína de unión a biotina recombinante comprende una secuencia señal de E. coli fusionada al extremo N de una secuencia de aminoácidos que comprende los aminoácidos 45-179 (FDASNFKDFSSIASASSSWQNQSGSTMIIQVDSFGNVSGQYVNRAQGTGCQNSPYPLTGRVNGTFIAFSVGWNNST ENCNSATGWTGYAQVNGNNTEIVTSWNLAYEGGSGPAIEQGQDTFQYVPTTENKSLLKD, SEQ ID NO: 1) de rizavidina de tipo silvestre (rhavi). En algunos casos, la secuencia señal de E. coli es MKKIWLALAGLVLAFSASA (SEQ ID NO: 2). La secuencia señal se puede fusionar con la secuencia que comprende los aminoácidos 45-179 de rhavi de tipo silvestre mediante un enlazador peptídico flexible.
En el presente documento también se divulga un método para expresar una proteína de unión a biotina en forma soluble con alto rendimiento en E. coli. En algunos casos, el método comprende expresar una proteína de unión a biotina en E. coli, en donde la secuencia señal natural de la proteína de unión a biotina se ha reemplazado por una secuencia señal de E. coli. En algunos casos, la secuencia señal es MKKIWLALAGLVLAFSASA (SEQ ID NO: 2) En otro aspecto más, la invención proporciona una proteína de fusión de unión a biotina que comprende un dominio de unión a biotina y una proteína o un péptido antigénicos, como se establece en las reivindicaciones.
También se divulga en el presente documento una proteína de unión a biotina lipidada. Como se usa en el presente documento, la expresión "proteína de unión a biotina lipidada" se refiere a una proteína de unión a biotina que está unida de manera covalente con un lípido. Las proteínas de unión a biotina lipidadas son ligandos o agonistas del receptor 2 de tipo Toll. Por consiguiente, en el presente documento también se divulgan métodos para inducir una respuesta inmunitaria en un sujeto. El método divulgado comprende administrar al sujeto una composición que comprende una proteína de unión a biotina lipidada.
En el presente documento también se divulga un método para expresar una proteína de unión a biotina lipidada en E. coli. En algunos casos, el método comprende expresar una proteína de unión a biotina lipidada en E. coli, en donde la secuencia señal natural de la proteína de unión a biotina se ha reemplazado por una secuencia señal de E.
coli que contiene un motivo de lipidación. En algunos casos, la secuencia señal es MKKVAAFVALSLLMAGC (SEQ ID NO: 3)
También se divulga en el presente documento un derivado no hemolítico de alfa-hemolisina (Hla) de Staphylococcal aureus. El derivado de Hla descrito en el presente documento puede estar en forma de proteína de fusión, en donde la proteína de fusión comprende tanto el dominio derivado de Hla como un dominio de unión a biotina. En algunos casos, el dominio de unión a biotina es una proteína de unión a biotina descrita en el presente documento.
Como las proteínas de unión a biotina lipidadas, las variantes de Hla o sus proteínas de fusión con proteínas de unión a biotina descritas en el presente documento también son ligandos o agonistas de receptores de tipo Toll u otros receptores de reconocimiento de patrones (PRR, por sus siglas en inglés). Por consiguiente, en el presente documento también se divulgan métodos para inducir una respuesta inmunitaria en un sujeto. En algunos casos, el método comprende administrar al sujeto una composición que comprende variantes de Hla no hemolíticas o sus proteínas de fusión con la proteína de unión a biotina descrita en el presente documento.
También se divulga una composición inmunogénica o composición de vacuna que comprende una proteína de unión a biotina, una proteína de unión a biotina lipidada, una proteína de fusión de unión a biotina que comprende un dominio de unión a biotina y una proteína o péptido antigénicos. En algunos casos, la proteína antigénica es un derivado no hemolítico de Hla descrito en el presente documento.
Además, en el presente documento también se divulga un método para vacunar a un sujeto, p. ej., un mamífero, p. ej., un ser humano con las composiciones inmunogénicas como se divulga en el presente documento, comprendiendo el método administrar una composición de vacuna como se divulga en el presente documento al sujeto.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 es una representación esquemática de una proteína de unión a biotina modificada de acuerdo con un ejemplo divulgado en el presente documento.
La figura 2 es una s DS-PAGE de una proteína de unión a biotina recombinante purificada descrita en el presente documento.
La figura 3 es una representación esquemática de una proteína de fusión que comprende una proteína de unión a biotina y un antígeno X
La figura 4 es un ejemplo de SDS-PAGE de proteínas de fusión de rizavidina purificadas
La figura 5 es una representación esquemática de la proteína de unión a biotina lipidada de acuerdo con un ejemplo divulgado en el presente documento.
La figura 6 es una SDS-PAGE de una proteína de unión a biotina lipidada descrita en el presente documento. La figura 7 es un gráfico de barras que muestra la actividad de TLR2 dependiente de la dosis de la proteína de unión a biotina lipidada.
La figura 8 es una representación esquemática de alfa-hemolisina (Hla) de S. aureus TS recombinante o mutante y sus proteínas de fusión de rizavidina descritas en el presente documento. En la Hla no hemolítica, las mutaciones puntuales se realizaron de la siguiente manera: (i) resto 205 W a A; (ii) resto 213 W a A; o (iii) restos 209-211 de DRD a AAA.
La figura 9 es una SDS-PAGE de Hla de tipo silvestre purificada o variantes no hemolíticas de la misma.
La figura 10 es SDS-PAGE de proteínas de fusión de unión a biotina purificadas de Hla de tipo silvestre o variantes no hemolíticas de la misma.
La figura 11 es un gráfico de líneas que muestra la actividad hemolítica de Hla TS y variantes no hemolíticas de la misma.
La figura 12 es un gráfico de líneas que muestra la actividad hemolítica de Hla de tipo silvestre, variantes no hemolíticas de Hla y proteínas de fusión de unión a biotina de Hla de tipo silvestre y variantes no hemolíticas de la misma.
La figura 13 es un gráfico de barras que muestra que la estimulación de macrófagos con la proteína de fusión de unión a biotina (rhavi-Hla209) induce múltiples citocinas proinflamatorias.
La figura 14 es un gráfico de barras que muestra que el complejo del sistema presentador de antígenos múltiples (MAPS, por sus siglas en inglés) que contiene rizavidina lipidada o rhavi-Hla209 induce respuestas de linfocitos T más fuertes a los antígenos.
Descripción detallada
Debe entenderse que la presente invención no se limita a la composición, metodología, protocolos y reactivos, etc., particulares, descritos en el presente documento y, como tal, pueden variar. La terminología utilizada en el presente documento tiene el propósito de describir realizaciones particulares solamente y no pretende limitar el alcance de la presente invención, que se define únicamente por las reivindicaciones.
Sin desear quedar ligados a teoría alguna, la baja expresión de una proteína de unión a biotina en la técnica puede deberse a un mal plegamiento causado por el enlace disulfuro en cada monómero de la proteína de unión a biotina que no se forma, o se forma en niveles muy bajos, en el citoplasma de E. coli. Ahora los inventores han descubierto que se puede lograr un plegamiento correcto mediante el transporte al espacio periplásmico de E. coli. Por tanto, el plegamiento correcto de las proteínas de unión a biotina recombinantes se puede mejorar reemplazando la secuencia señal natural completa de una proteína de unión a biotina con una secuencia señal de secreción de E. coli. Sin desear quedar ligados a teoría alguna, esto facilita la translocación de la proteína recombinante al espacio periplásmico de células de E. coli. La translocación de la proteína recombinante en el espacio periplásmico de E. coli puede proporcionar después el enlace disulfuro funcionalmente importante en la proteína de unión a biotina (p. ej., en rizavidina) y la proteína puede plegarse correctamente en forma soluble y con altos rendimientos.
En un aspecto, en el presente documento se proporciona una proteína de unión a biotina que se puede expresar en forma soluble y con alto rendimiento en E. coli. La proteína de unión a biotina recombinante soluble de la invención se establece en las reivindicaciones. Se proporciona adicionalmente en el presente documento una proteína de fusión que comprende una proteína de unión a biotina soluble, como se establece también en las reivindicaciones. Como se usa en el presente documento, la expresión "proteína de unión a biotina" se refiere a una proteína, que se une de forma no covalente a biotina o un análogo o derivado de la misma. Alto rendimiento significa que la proteína se puede expresar en forma soluble en E. coli en una cantidad de aproximadamente 10mg/l, 11 mg/l, 12 mg/l, 13 mg/l, 14 mg/l, 15 mg/l, 20 mg/l, 25 mg/l, 30 mg/l, 35 mg/l, 30 mg/l, 35 mg/l, 40 mg/l, 45 mg/l, 50 mg/lo más.
La secuencia codificante de la proteína de unión a biotina se puede optimizar utilizando codones de expresión de E. coli, para evitar cualquier dificultad durante la expresión en E. coli debido a codones raros presentes en el gen original.
Generalmente, la proteína de unión a biotina comprende un dominio de unión a biotina. Como se usa en el presente documento, un "dominio de unión a biotina" se refiere a una secuencia polipeptídica que se une a biotina. Si bien se puede utilizar una proteína de unión a biotina completa como dominio de unión a biotina, solamente se puede utilizar la porción de unión a biotina de la proteína. En algunas realizaciones, el dominio de unión a biotina es de rizavidina.
En algunas realizaciones relacionadas con la proteína de fusión que comprende la proteína de unión a biotina, el dominio de unión a biotina consiste en la secuencia de aminoácidos correspondiente a los aminoácidos 45-179 de la rizavidina de tipo silvestre. La secuencia de aminoácidos de la rizavidina de tipo silvestre es:
MIITSLYATFGTIADGRRTSGGKTMIRTNAVAALVFAVATSALAFDASNFKDFSSIASASSSWQN
QSGSTMIIQVDSFGNVSGQYVNRAQGTGCQNSPYPLTGRVNGTFIAFSVGWNNSTENCNSATG
WTGYAQVNGNNTETVTSWNLAYEGGSGPATEQGQDTFQYVPTTENKSLLKD (SEQ ID NO: 4)
En otras palabras, el dominio de unión a biotina no comprende (es decir, carece) carece de los aminoácidos 1-44 (MIITSLYATFGTIADGRRTSGGKTMIRTNAVAALVFAVATSALA, SEQ ID NO: 5). de la rizavidina de tipo silvestre. En algunas realizaciones relacionadas con la proteína de fusión que comprende la proteína de unión a biotina, el dominio de unión a biotina consiste en la secuencia de aminoácidos
FDASNFKDFSSIASASSSWQNQSGSTMIIQVDSFGNVSGQYVNRAQGTGCQNSPYPLTGRVNGTF
IAFSVGWNNSTENCNSATGWTGYAQVNGNNTEIVTSWNLAYEGGSGPAIEQGQDTFQYVPTTE
NKSLLKD (SEQ ID NO: 1).
En algunas realizaciones relacionadas con la proteína de fusión que comprende la proteína de unión a biotina, el dominio de unión a biotina consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90 % de identidad, al menos un 95 % de identidad, al menos un 96 % de identidad, al menos un 97 % de identidad, al menos un 98 % de identidad, o al menos un 99 % de identidad, y más preferentemente al menos un 99,3 % de identidad con el SEQ ID NO: 1).
Mientras que, Helppolainen et al. (Biochem J., 2007, 405: 397-405) describen la eliminación solamente de los primeros 24 restos de la rizavidina de longitud completa, los presentes inventores han descubierto que los primeros 44 restos de rizavidina de longitud completa son innecesarios para la estructura y función principales de rizavidina. Asimismo, inesperadamente, los aminoácidos 25-44 (MIRTNa Va ALVFAVATSAlA, SEQ iD NO: 6) de la rizavidina de longitud completa reducen la solubilidad y secreción de rizavidina expresada en E. coli ya que el reemplazo de los primeros 44 restos de rizavidina de longitud completa con un péptido señal de E. coli condujo a un aumento en la solubilidad y secreción en E. coli de las proteínas de biotina descritas en el presente documento.
En la proteína de unión a biotina descrita en el presente documento, el dominio de unión a biotina puede extenderse en el extremo N o C en uno o más aminoácidos con la condición de que el extremo N del dominio de unión a biotina no comprenda una secuencia de aminoácidos correspondiente a una secuencia de los aminoácidos 1-44 de la rizavidina de tipo silvestre. Los inventores han descubierto que truncar los primeros 44 aminoácidos en el extremo N de la rizavidina de tipo silvestre puede aumentar drásticamente la expresión de la proteína de unión a biotina en forma soluble en E. coli. Por tanto, la proteína de unión a biotina descrita en el presente documento puede comprender la secuencia X1-X2-X3, en donde X2 es un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos correspondiente a los aminoácidos 45-179 de la rizavidina de tipo silvestre y X1 y X3 están independientemente ausentes o son un péptido de 1 a aproximadamente 100 aminoácidos con la condición de que el extremo N de X1 no comprenda una secuencia de aminoácidos correspondiente al extremo N de los aminoácidos 1-44 de la rizavidina de tipo silvestre.
Además, en el presente documento se divulgan casos en los que las proteínas de unión a biotina pueden comprender un péptido señal conjugado al extremo N de la proteína de unión a biotina, es decir, X1 puede comprender un péptido señal. El péptido señal también se llama péptido líder en el extremo N, que puede o no escindirse después de la translocación a través de la membrana. Los péptidos de secreción/señal se describen con más detalle a continuación. En algunos casos, la secuencia señal es MKKIWLALAGLVLAFSASA (SEQ ID NO: 2), MAPFEPLASGILLLLWLIAPSRA (SEQ ID NO: 7), MKKVAAFVALSLLMAGC (SEQ ID NO: 3), o un derivado o porción funcional de las mismas.
El péptido señal se puede unir al extremo N del dominio de unión a biotina ya sea directamente (p. ej., mediante un enlace) o indirectamente (p. ej., mediante un enlazador). En algunos casos, el péptido señal se puede unir al extremo N del dominio de unión a biotina mediante un enlazador peptídico. La secuencia del enlazador peptídico puede tener cualquier longitud. Por ejemplo, la secuencia del enlazador peptídico puede tener uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince o más aminoácidos de longitud. En algunos casos, el enlazador peptídico tiene una longitud de cuatro aminoácidos.
La secuencia del enlazador peptídico puede comprender cualquier secuencia de aminoácidos. Por ejemplo, el enlazador peptídico puede comprender una secuencia de aminoácidos que puede escindirse mediante una peptidasa señal. En algunos casos, el enlazador peptídico comprende la secuencia de aminoácidos AQDP (SEQ ID NO: 8) o VSDP (SEQ ID NO: 9).
En la proteína de unión a biotina divulgada en el presente documento, el dominio de unión a biotina se puede conjugar en su extremo C con un péptido de 1-100 aminoácidos. Dichos péptidos en el extremo C pueden utilizarse para etiquetas de purificación, enlazadores a otros dominios y similares.
En algunos casos, la proteína de unión a biotina divulgada en el presente documento comprende en su extremo N o C uno o más (p. ej., una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez o más) etiquetas de purificación. Ejemplos de etiquetas de purificación incluyen, pero sin limitación, una etiqueta de histidina, una etiqueta c-my, una etiqueta Halo, una etiqueta Flag y similares. En algunos casos, la proteína de unión a biotina comprende en su extremo C una etiqueta de histidina, por ejemplo, una (His)6 (SEC ID NO: 10).
Se puede conjugar una etiqueta de purificación con la proteína de unión a biotina mediante un enlazador peptídico para potenciar la probabilidad de que la etiqueta se exponga al exterior. La longitud del enlazador puede ser al menos uno (p. ej., uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce o quince) aminoácidos. El péptido enlazador puede comprender cualquier secuencia de aminoácidos sin limitaciones. En algunos casos, el péptido enlazador comprende la secuencia de aminoácidos VDKLAAALE (SEQ ID NO: 11) o GGGGSSSVDKLAAALE (SEQ ID NO: 12).
En algunos casos, la proteína de unión a biotina divulgada en el presente documento comprende en su extremo C la secuencia de aminoácidos VDKLAAALEHHHHH (SEQ ID NO: 13) o GGGGSSSVDKLAAALEHHHHHH (SEQ ID NO: 14).
En algunos casos, la proteína de unión a biotina divulgada en el presente documento comprende la secuencia de aminoácidos:
MKKIWLALAGLVLAFSASAAQDPFDASNFKDFSSIASASSSWQNQSGSTMIIQVDSFGNVSGQY
VNRAQGTGCQNSPYPLTGRVNGTFIAFSVGWNNSTENCNSATGWTGYAQVNGNNTEIVTSWNL
AYEGGSGPAIEQGQDTFQYVPTTENKSLLKDGGGGSSSVDKLAAALEHHHHHH (SEQ ID NO:
15).
En comparación con las proteínas de unión a biotina conocidas que forman tetrámeros, la proteína de unión a biotina descrita en el presente documento forma un dímero. Sin desear quedar ligados a teoría alguna, la formación de un dímero puede mejorar adicionalmente la expresión de la proteína de unión a biotina descrita en el presente documento como una proteína soluble en E. coli.
Aunque las proteínas de unión a biotina se conocen en la técnica, la proteína de unión a biotina descrita en el presente documento comprende diferencias significativas con respecto a avidina y a proteínas similares a avidina actualmente conocidas en la técnica. En primer lugar, las avidinas actualmente conocidas son bastante difíciles de expresar como proteínas solubles en E. coli. Sin embargo, como han demostrado los presentes inventores, la proteína de unión a biotina descrita en el presente documento se puede expresar como una proteína soluble en E. coli con alto rendimiento.
Las proteínas de unión a biotina descritas en el presente documento se pueden obtener en forma soluble con altos rendimientos, p. ej., más de 30 mg por litro de cultivo, mediante expresión en E. coli. Por tanto, las proteínas de unión a biotina descritas en el presente documento son más solubles que las descritas en la técnica y reflejan diferencias subyacentes. Sin desear quedar ligados a teoría alguna, la diferencia de solubilidad se puede atribuir a diferencias físicas y/o químicas y/o estructurales subyacentes entre las proteínas de unión a biotina descritas en el presente documento y otras proteínas de unión a biotina conocidas en la técnica.
En segundo lugar, la proteína de unión a biotina descrita en el presente documento comprende un dominio de unión a biotina que consiste en los aminoácidos 45-179 de rizavidina de tipo silvestre. Mientras que, la rizavidina de tipo silvestre y una porción parcialmente truncada de la misma se conocen en la técnica, no hay ninguna enseñanza o sugerencia en la técnica de que una proteína de unión a biotina que comprende la secuencia de aminoácidos de los aminoácidos 45-179 de la rizavidina de tipo silvestre y que tiene una secuencia señal de E. coli conduciría a una proteína soluble que se puede obtener con alto rendimiento en E. coli. De acuerdo con Helppolainen et al. (Biochem J., 2007, 405: 397-405) los aminoácidos 25-44 de la rizavidina de tipo silvestre comprenden una supuesta secuencia señal. Sin embargo, como se analiza en el presente documento, los presentes inventores han descubierto y demostrado que el reemplazo de la supuesta secuencia señal con una secuencia señal de E. coli conduce a un aumento en forma soluble de la expresión de la proteína de unión a biotina en E. coli.
En tercer lugar, la proteína de unión a biotina descrita comprende un péptido de la secuencia de aminoácidos GGGGSSSVDKLAAALEHHHHHH (SEQ ID NO: 14). Este péptido en el extremo C proporciona una etiqueta de histidina para la purificación y un lugar para la inserción de otros dominios, por ejemplo, dominios antigénicos, en la proteína de biotina. Asimismo, mientras Helppolainen et al. (Biochem J., 2007, 405: 397-405) describen la expresión de rizavidina en E. coli, no hay enseñanza o sugerencia en Helppolainen et al. para conjugar un péptido adicional al extremo C del dominio de unión a biotina de rizavidina.
En cuarto lugar, La rizavidina tiene una menor homología de secuencia con la avidina de huevo (22,4 % de identidad de secuencia y 35,0 % de similitud) en comparación con otras proteínas similares a avidina. Por tanto, la proteína de unión a biotina descrita en el presente documento es diferente a avidina y a otras proteínas similares a avidina.
En quinto lugar, la proteína de unión a biotina descrita en el presente documento tiene un punto isoeléctrico (pI) bajo en comparación con la avidina y otras moléculas similares a avidina. El punto isoeléctrico de la rizavidina de tipo silvestre es 4,0 (Helppolainen et al., Biochem J., 2007, 405: 397-405). El punto isoeléctrico de otras proteínas de unión a biotina conocidas es generalmente superior a 6,1 (véase Helppolainen et al., Biochem J., 2007, 405: 397­ 405). En comparación, el pI de la proteína de unión a biotina descrita en el presente documento es 5,4. El pI ácido de la proteína de unión descrita en el presente documento conduce a una unión no específica reducida. Un problema en el uso de avidina y péptidos similares a avidina actualmente conocidos es la unión no específica de los mismos. La avidina y los péptidos similares a la avidina conocidos actualmente pueden unirse de manera no específica no solamente a las células sino también a los ADN, proteínas y materiales biológicos tales como membranas. Por ejemplo, en la detección de un material que utiliza la unión avidina-biotina, la avidina se une de forma no específica a materiales distintos del material objeto a detectar para aumentar el fondo. Una de las razones de la alta unión no específica de la avidina incluye su alto punto isoeléctrico. La avidina es una proteína fuertemente básica, que tiene un punto isoeléctrico significativamente alto de 10 o más, y está cargada positivamente en su conjunto. Por consiguiente, se cree que la avidina se une fácilmente a materiales biológicos, que tienen carga negativa en muchos casos. Por tanto, el pI bajo de la proteína de unión a biotina descrita en el presente documento es ventajoso sobre la avidina y los péptidos similares a avidina actualmente conocidos.
En sexto lugar, el tamaño de la proteína de unión a biotina descrita en el presente documento es relativamente pequeño en comparación con la avidina y las proteínas similares a avidina conocidas actualmente. La proteína de unión a biotina es menor de 28 kDa (tamaño del dímero). Sin embargo, la mayoría de avidina y proteínas similares a avidina conocidas actualmente tienen tamaños superiores a 60 kDa (tamaño del tetrámero). Se dice que la rizavidina de tipo silvestre tiene un tamaño de aproximadamente 29 kDa (tamaño del dímero). Puede utilizarse un tamaño pequeño de la proteína de unión a biotina para aumentar la carga de unión de la conjugación entre las moléculas de interés. Por ejemplo, la proteína de unión a biotina se puede utilizar para conjugar la primera molécula de interés con una segunda molécula de interés. Una de las moléculas de interés se puede unir a una o más moléculas de biotina o similares a biotina y la segunda molécula se puede unir, conjugar o fusionar con la proteína de unión a biotina. Dado el pequeño tamaño de la proteína de biotina descrita en el presente documento, las moléculas de biotina o similares a biotina se pueden colocar espacialmente más juntas para permitir la unión de más con respecto a si la segunda molécula fuera una avidina o una molécula similar a avidina más grande actualmente conocida.
En séptimo lugar, la proteína de unión a biotina descrita en el presente documento es un dímero. La formación de un dímero puede mejorar adicionalmente la expresión de la proteína de unión a biotina descrita en el presente documento como una proteína soluble en E. coli. Adicionalmente, debido a que la proteína de unión a biotina forma un dímero en lugar de un tetrámero como todas las demás proteínas de tipo avidina conocidas, 1) se reduce la complejidad estructural de los antígenos de fusión; 2) se reduce, de manera similar, la dificultad de expresar proteínas de fusión de proteínas de unión a biotina recombinantes, 3) se minimiza el impedimento estérico de las manipulaciones de las fusiones de proteínas de unión a biotina, lo cual es ventajoso para manipulaciones posteriores con, por ejemplo, pero sin limitación, biotina, miméticos de biotina o derivados de biotina, y 4) se potencia enormemente la solubilidad de las fusiones de proteínas de unión a biotina. Demostrando, por tanto, diferencias subyacentes entre las proteínas de unión a biotina descritas en el presente documento y las conocidas en la técnica. En octavo lugar, la proteína de unión a biotina descrita en el presente documento reduce el riesgo de que una composición inmunogénica que la comprende induzca una reacción alérgica relacionada con el huevo en un sujeto. Además, el anticuerpo contra el dominio de unión a biotina descrito en el presente documento no tiene reactividad cruzada aparente con la avidina de huevo (y viceversa).
Asimismo, una proteína de unión a biotina descrita en el presente documento puede tener propiedades mejoradas, tal como una reducción en la unión inespecífica o una mejora adicional en la unión a biotina, conservando las características de la rizavidina de tipo silvestre. El uso de la proteína de unión a biotina descrita en el presente documento para la detección, por ejemplo, en inmunoensayo o ensayo de hibridación de ácidos nucleicos, para medir un analito que utiliza la unión avidina-biotina puede reducir el fondo, aumentar la sensibilidad y mantener la propiedad de unión con biotina en condiciones estrictas.
Este estudio demuestra claramente las ventajas y diferencias de las proteínas de unión a biotina descritas en el presente documento sobre la avidina y otras proteínas similares a avidina. Por tanto, las proteínas de unión a biotina descritas en el presente documento tienen el potencial de ser una herramienta potente y versátil en una amplia gama de aplicaciones que utilizan tecnología avidina-biotina.
Sin limitaciones, una proteína de unión a biotina se puede utilizar en cualquier metodología, composición o sistema que requiera el uso de un sistema avidina-biotina. Como bien sabe un experto habitual, el sistema avidina-biotina se puede utilizar para numerosos métodos de laboratorio, tal como la bioconjugación; detección de moléculas diana; aislamiento, purificación o enriquecimiento de moléculas diana a partir de una muestra; detección de proteínas; detección de ácidos nucleicos; aislamiento, purificación o enriquecimiento de proteínas; aislamiento, purificación o enriquecimiento de ácidos nucleicos; ELISA; citometría de flujo; y similares.
Por consiguiente, usos ilustrativos de las proteínas de unión a biotina recombinantes descritas en el presente documento incluyen, pero sin limitación, bioconjugación; detección de moléculas diana; aislamiento, purificación o enriquecimiento de moléculas diana a partir de una muestra; detección de proteínas; detección de ácidos nucleicos; aislamiento, purificación o enriquecimiento de proteínas; aislamiento, purificación o enriquecimiento de ácidos nucleicos; ELISA; citometría de flujo; y similares.
En algunos casos, la proteína de unión a biotina descrita en el presente documento se puede utilizar como parte del par de afinidad en el sistema presentador de antígenos múltiples (MAPS) como se describe en la solicitud provisional de EE. UU. N.° 61/48.934, presentada el 11 de mayo de 2012; N.° 61/608.168, presentada el 8 de marzo de 2012; y N.° 61/609.974, presentada el 13 de marzo de 2012 y la solicitud PCT número PCT/US12/37412, presentada el 11 de mayo de 2012. El MAPS también se describe con más detalle en el presente documento a continuación. Sin desear quedar ligados a teoría alguna, el uso de una proteína de unión a biotina descrita en el presente documento reduce el riesgo de que el MAPS induzca una reacción alérgica relacionada con el huevo en un sujeto. Además, el anticuerpo contra la rizavidina modificada recombinante no tiene una reactividad cruzada aparente con la avidina de huevo (y viceversa).
Proteína de unión a biotina lipidada
También se divulga en el presente documento una proteína de unión a biotina lipidada. Como se usa en el presente documento, la expresión "proteína de unión a biotina lipidada" se refiere a una proteína de unión a biotina que está conjugada de manera covalente con un lípido. Los residuos lipídicos podrían ser un lípido diacilo o triacilo.
La proteína de unión a biotina lipidada se puede preparar usando una secuencia de lipidación. Como se usa en el presente documento, la expresión "secuencia de lipidación" se refiere a una secuencia de aminoácidos que facilita la lipidación en una bacteria, p. ej., E. coli, de un polipéptido que lleva la secuencia lipidante. La secuencia de lipidación puede estar presente en el extremo N o en el extremo C de la proteína. La secuencia de lipidación se puede unir a la proteína de unión a biotina recombinante para formar una proteína de fusión, que está en forma lipidada cuando se expresa en E. coli mediante tecnología recombinante convencional. En algunos casos, una secuencia de lipidación se localiza en el extremo N de la proteína de unión a biotina.
Puede utilizarse cualquier secuencia de lipidación conocida por un experto en la materia. En algunos casos, la secuencia lipidante es MKKVAAFVALSLLMAGC (SEQ ID NO: 3) o un derivado o porción funcional de la misma. Otras secuencias de lipidación ilustrativas incluyen, pero sin limitación, MNSKKLCCICVLFSLLAGCAS (SEQ ID NO: 16), MRYSKLTMLIPCALLLSAC (SEQ ID NO: 17), MFVTSKKMTAAVLAITLAMSLSAC (SEQ ID NO: 18), MIKRVLVVSMVGLSLVGC (SEQ ID NO: 19), y derivados o porciones funcionales de las mismas.
En algunos casos, la secuencia de lipidación se puede fusionar con la proteína de unión a biotina a través de un enlazador peptídico, en donde el enlazador peptídico fija la secuencia lipidante a la proteína de unión a biotina.
En algunos casos, el enlazador peptídico comprende la secuencia de aminoácidos VSDP (SEQ ID NO: 9).
En un ejemplo, la proteína lipídica de unión a biotina comprende la secuencia de aminoácidos
MKKVAAFVALSLLMAGCVSDPFDASNFKDFSSIASASSSWQNQSGSTMIIQVDSFGNVSGQYVN
RAQGTGCQNSPYPLTGRVNGTFIAFSVGWNNSTENCNSATGWTGYAQVNGNNTEIVTSWNLAY
EGGSGPAIEQGQDTFQYVPTTENKSLLKD (SEQ ID NO: 20).
Las proteínas de unión a biotina lipidadas son ligandos para los receptores de tipo Toll (TLR, por sus siglas en inglés). Como tal, las proteínas de unión a biotina lipidadas descritas en el presente documento pueden utilizarse como ligandos de TLR. Por ejemplo, la proteína de unión a biotina lipidada se puede utilizar en composiciones para inducir la estimulación de TLR2. Esto puede ser útil para inducir inmunogenicidad frente a otros antígenos/patógenos. Por tanto, las lipoproteínas de unión a biotina se pueden utilizar en composiciones inmunogénicas como factor de coestimulación o adyuvante de un antígeno.
Como se usa en el presente documento, la expresión "receptor de tipo Toll" se refiere en general a cualquier receptor de tipo Toll de cualquier especie de organismo. Un TLR puede ser de cualquier especie de mamífero. Se han identificado TLR en varias especies de mamíferos que incluyen, pero sin limitación, por ejemplo, seres humanos, conejillos de indias y ratones. Se puede identificar un TLR específico con referencia adicional a la especie de origen (p. ej., humano, murino, etc...), un receptor particular (p. ej., TLR2, TLR3, TLR9, etc...), o ambos. En algunos casos, la proteína de unión a biotina lipidada es un ligando de TLR2.
Los receptores de tipo Toll (TLR) son una familia de proteínas transmembrana codificadas en la línea germinal que facilitan el reconocimiento de patógenos y la activación del sistema inmunitario innato. Los receptores de tipo Toll (TLR) son receptores de reconocimiento de patrones (PRR) y se expresan por células del sistema inmunitario innato, incluyendo macrófagos, células dendríticas y células NK. Ejemplos de ligandos conocidos para TLR incluyen bacterias gram positivas (TLR-2), endotoxina bacteriana (TLR-4), proteína flagelina (TLR-5), ADN bacteriano (TLR-9), ARN bicatenario y poli I:C ( TLR-3) y levadura (TLR-2). Otros ligandos que se unen a un receptor de reconocimiento de patrones endocítico, un receptor eliminador o un receptor de unión a manosa también pueden estar contemplados mediante la presente divulgación. Los TLR conectan con ligandos derivados de patógenos conservados y posteriormente activan la vía de transducción de señales de TLR/IL-1R para inducir varios genes efectores. Los receptores de tipo Toll (TLR) representan un grupo importante de PRR que pueden detectar patrones moleculares asociados a patógenos o microbios. Se expresan ampliamente en sangre, bazo, pulmón, músculos e intestinos por muchos tipos de células, especialmente células dendríticas (CD), pero también macrófagos, células epiteliales y linfocitos.
Mientras que algunos TLR ubicados en la superficie celular son específicos para lípidos y proteínas microbianos, otros asociados con compartimentos endosómicos dentro de las células son específicos de ácidos nucleicos. La unión de los TLR por sus ligandos específicos da como resultado cambios conformacionales en los receptores, conduciendo a la transducción de señales aguas abajo que implica principalmente vías dependientes de MyD88 y TRIF. Excepto por TLR3, todos los demás TLR pueden enviar señales a través de la vía de MyD88 para inducir citocinas proinflamatorias que implican la activación de cascadas de proteínas cinasas intracelulares, incluida la cinasa IB (IKK)-NF-B y la proteína cinasa regulada por señal extracelular (ERK, por sus siglas en inglés), cinasa c-Jun N-terminal (JNK, por sus siglas en inglés) y proteínas cinasas de activación por mitógeno p38 (MAPK, por sus siglas en inglés). La vía de TRIF, independiente de MyD88, se utiliza tanto por TLR3 como por TLR4 y media la inducción de interferones de tipo I.
Las lipoproteínas de unión a biotina recombinantes descritas en el presente documento tienen inmunogenicidad potenciada. Sin desear quedar ligados a teoría alguna, los residuos de lípidos en los extremos N de las lipoproteínas o lipopéptidos contribuyen a la actividad adyuvante. Por consiguiente, casos adicionales proporcionan composiciones inmunogénicas o de vacuna para inducir una respuesta inmunitaria, que comprende la lipoproteína de unión a biotina aislada, o un vector adecuado para la expresión in vivo de la misma, o ambos, y un transportador adecuado, así como a métodos para provocar una respuesta inmunitaria o protectora que comprenden administrar a un hospedador la lipoproteína de unión a biotina recombinante aislada, el vector que expresa la lipoproteína de unión a biotina recombinante, o una composición que contiene la lipoproteína recombinante o el vector, en una cantidad suficiente para provocar la respuesta.
Una composición inmunológica o inmunogénica que comprende la lipoproteína de unión a biotina provoca una respuesta inmunitaria, local o sistémica. La respuesta puede, pero no necesariamente, ser protectora. Se ha de señalar que, tal como se usa en el presente documento, las expresiones "composición inmunológica" y "composición inmunogénica" incluyen una "composición de vacuna" (ya que las dos expresiones anteriores pueden ser composiciones protectoras). Sin limitaciones, una proteína de unión a biotina lipidada descrita en el presente documento se puede utilizar como un antígeno, adyuvante, o un coestimulador en una composición inmunológica, inmunogénica o de vacuna. Asimismo, debido a que la proteína de unión a biotina lipidada comprende un dominio de unión a biotina, la proteína lipidada se puede ensamblar a la estructura polimérica del MAPS. En consecuencia, en el presente documento también se proporcionan métodos para inducir una respuesta inmunitaria en un mamífero hospedador. El método comprende administrar al hospedador una composición inmunogénica, inmunitaria o de vacuna que comprende una proteína de unión a biotina lipidada descrita en el presente documento y un transportador o diluyente farmacéuticamente aceptable.
En algunos casos, la proteína de unión a biotina lipidada es una proteína de fusión que comprende una proteína de unión a biotina lipidada y una proteína o péptido.
Hla no hemolítica
Las hemolisinas son exotoxinas producidas por bacterias que provocan la lisis de los glóbulos rojos. Si bien son altamente inmunogénicas, su uso en vacunas es limitado porque provocan la lisis de los glóbulos rojos. Por consiguiente, en el presente documento se divulgan variantes de alfa-hemolisina (Hla) de staphylococcal aureus, su construcción de fusión con la proteína de unión a biotina y sus usos. Estas variantes, designadas en el presente documento como "mHla", tienen actividad sustancialmente no hemolítica, es decir, tienen una actividad hemolítica sustancialmente baja. Como se usa en el presente documento, la expresión "sustancialmente no hemolítica" significa una incapacidad para lisar glóbulos rojos a títulos equivalentes de Hla de tipo silvestre. La expresión "Hla de tipo silvestre" recibe la definición habitual asociada con dicha expresión, es decir, la Hla que se secreta de manera natural por una fuente bacteriana capaz. "Hla de tipo silvestre", por definición, no incluye, p. ej., productos de fusión Hla derivados mediante técnicas de ADN recombinante. En algunos casos, la actividad hemolítica de mHla es al menos un 5 %, al menos un 10 %, al menos un 15 %, al menos un 20 %, al menos un 25 %, al menos un 30 %, al menos un 35 %, al menos un 40 %, al menos un 45 %, al menos un 50 %, al menos un 55 %, al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 % más baja que la de los títulos equivalentes de Hla de tipo silvestre. En algunos casos, la mHla no tiene actividad hemolítica detectable. Los inventores también han descubierto que la actividad hemolítica de mHla puede reducirse adicionalmente uniendo la mHla con una proteína de unión a biotina. Por consiguiente, la presente divulgación también describe proteínas de fusión que comprenden una proteína mHla y una proteína de unión a biotina.
Tal como se proporciona en el presente documento, se puede crear una Hla no hemolítica en donde el resto W205 o W213 está sustituido con alanina (A) o el tripéptido DRD209-211 está sustituido con un tripéptido de alanina (AAA) en la Hla de tipo silvestre. La proteína Hla mutada puede expresarse y purificarse en un sistema de expresión de E. coli. Los mutantes se pueden producir mediante mutación puntual utilizando mutagénesis de cambio rápido. Por ejemplo, la secuencia de nucleótidos de un ácido nucleico que codifica la Hla de tipo silvestre se puede cambiar para reemplazar un aminoácido dado en la Hla de tipo silvestre por otro aminoácido.
En algunos casos, la mHla es una proteína de fusión que comprende la mHla y una proteína de unión a biotina. En algunos casos, la proteína de fusión de unión a biotina mHla comprende la secuencia de aminoácidos
MKKIWLALAGLVLAFSASAAQDPFDASNFKDFSSIASASSSWQNQSGSTMIIQVDSFGNVSGQY
VNRAQGTGCQNSPYPLTGRVNGTFIAFSVGWNNSTENCNSATGWTGYAQVNGNNTEIVTSWNL
AYEGGSGPAIEQGQDTFQYVPTTENKSLLKDGGGGSSSADSDINIKTGTTDIGSNTTVKTGDLVT
YDKENGMHKKVFYSFIDDKNHNKKLLVIRTKGTIAGQYRVYSEEGANKSGLAWPSAFKVQLQL
PDNEV AQISDYYPRN SIDTKEYMSTLTY GFNGNVTGDDTGKIGGLIGAN V SIGHTLKYVQPDFKT
ILESPTDKKV GWKVIFNNMVN QNW GPY A A AS WNP VY GN QLFMKTRN GS MKAADNFLD PNKA
SSLLSSGFSPDFATVITMDRKASKQQTNIDVIYERVRDDYQLHWTSTNWKGTNTKDKWIDRSSE
RYKIDWEKEEMTN (SEQ ID NO: 21).
Las variantes de Hla descritas en el presente documento son ligandos para receptores de tipo Toll (TLR). Como tal, las variantes de Hla descritas en el presente documento pueden utilizarse como ligandos de TLR. Por ejemplo, las variantes de Hla se pueden utilizar en composiciones para inducir la estimulación de TLR2. Esto puede ser útil para inducir inmunogenicidad frente a otros antígenos/patógenos. Por tanto, las variantes de Hla descritas en el presente documento se pueden utilizar en composiciones inmunogénicas como factor de coestimulación o adyuvante de un antígeno. Asimismo, cuando la mHla se fusiona con una proteína de unión a biotina, la proteína de fusión se puede conjugar con la estructura polimérica del MAPS.
En algunos casos, la mHla se puede utilizar como factor coestimulador en una composición inmunogénica o de vacuna.
Asimismo, debido a que la mHla induce una respuesta inmunitaria en el sujeto, la mHla puede utilizarse como en una composición inmunogénica o de vacuna para vacunar a un sujeto contra S. aureus.
La mHla descrita en el presente documento tiene una inmunogenicidad potenciada. Por consiguiente, en el presente documento se divulgan composiciones inmunogénicas o de vacuna para inducir una respuesta inmunitaria, que comprende la mHla, o un vector adecuado para la expresión in vivo de la misma, o ambos, y un transportador adecuado, así como a métodos para provocar una respuesta inmunitaria o protectora que comprenden administrar a un hospedador la mHla aislada, el vector que expresa la mHla, o una composición que contiene la mHla o el vector, en una cantidad suficiente para provocar la respuesta.
Una composición inmunológica o inmunogénica que comprende la mHla puede provocar una respuesta inmunitaria, local o sistémica. La respuesta puede, pero no necesariamente, ser protectora. Por consiguiente, un mutante no hemolítico de Hla descrito en el presente documento puede ser como un antígeno, adyuvante, o un coestimulador en una composición inmunológica, inmunogénica o de vacuna.
Asimismo, también se divulgan métodos para inducir una respuesta inmunitaria en un mamífero hospedador. El método comprende administrar al hospedador una composición inmunogénica, inmunológica o de vacuna que comprende un mutante de Hla no hemolítico descrito en el presente documento y un transportador o diluyente farmacéuticamente aceptable.
En otro aspecto, en el presente documento se proporcionan proteínas de fusión que comprenden una proteína de unión a biotina descrita en el presente documento unida a una proteína o péptido antigénicos, como se establece en las reivindicaciones. Estas proteínas de fusión también se denominan, en el presente documento, proteínas de fusión de unión a biotina y proteínas de fusión antigénicas. La proteína de unión a biotina y la proteína o péptido antigénicos pueden unirse en cualquier configuración, p. ej., la proteína de unión a biotina puede estar en el extremo N y el péptido antigénico en el extremo C de la proteína de fusión o viceversa.
En algunas realizaciones, la proteína de unión a biotina y la proteína o péptido antigénicos se unen entre sí mediante un enlazador peptídico. Sin limitaciones, el enlazador peptídico puede comprender cualquier secuencia de aminoácidos y puede tener cualquier longitud. Por ejemplo, la secuencia del enlazador peptídico puede tener uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince o más aminoácidos de longitud. En algunas realizaciones, el enlazador peptídico que une el dominio antigénico al dominio de unión a biotina tiene una longitud de ocho aminoácidos.
En algunas realizaciones, el enlazador peptídico que une el dominio antigénico al dominio de unión a biotina tiene la secuencia de aminoácidos GGGGSSS (s Eq ID NO: 22).
También se divulgan en el presente documento casos en los que la proteína antigénica es una Hla no hemolítica descrita en el presente documento.
En algunos casos, la proteína Hla no hemolítica es una proteína de fusión que comprende una proteína de unión a biotina y una Hla no hemolítica descrita en el presente documento.
En algunos casos, la proteína Hla no hemolítica es una proteína de fusión que comprende una proteína de unión a biotina lipidada y una Hla no hemolítica descrita en el presente documento.
Composiciones inmunogénicas
En el presente documento se divulgan composiciones inmunogénicas que comprenden una proteína de fusión antigénica, una de unión a biotina lipidada o una variante no hemolítica de Hla descrita en el presente documento. Además, en el presente documento también se divulgan composiciones inmunogénicas y composiciones de vacuna que comprenden un complejo inmunogénico que comprende al menos una proteína de fusión antigénica, o proteínas de fusión de múltiples antígenos, fijadas a un armazón de polímero para su uso en la provocación de una respuesta inmunitaria a cada uno de los antígenos fijados al polímero y, opcionalmente, al propio polímero, cuando se administra a un sujeto. Sin desear quedar ligados a teoría alguna, la composición inmunogénica descrita en el presente documento estimula una respuesta inmunitaria humoral y celular: puede generar anticuerpos y las respuestas Th1/Th17 a múltiples antígenos proteicos utilizando una única construcción inmunogénica de MAPS. Una combinación de inmunidad de linfocitos B y T frente al organismo representa una estrategia de vacuna óptima contra muchas enfermedades, incluida la infección invasiva asociada a la enfermedad neumocócica y el transporte nasofaríngeo. En algunos casos, la composición inmunogénica es una vacuna o está incluida en una vacuna.
Por consiguiente, en el presente documento se divulga una composición inmunogénica y métodos útiles para generar una respuesta inmunitaria en un sujeto, que se puede utilizar sola o junto o mezclada con esencialmente cualquier enfoque de vacuna existente.
En algunos casos, una composición inmunogénica como se divulga en el presente documento comprende al menos 2 antígenos, o al menos 3 antígenos, o al menos 5 antígenos, o entre 2-10 antígenos, o entre 10-15 antígenos, o entre 15-20 antígenos, o entre 20-50 antígenos, o entre 50-100 antígenos, o más de 100 antígenos, ambos inclusive. En algunos casos, cuando una composición inmunogénica como se divulga en el presente documento comprende al menos 2 antígenos, los antígenos pueden ser el mismo antígeno o al menos 2 antígenos diferentes. En algunos casos, los antígenos pueden ser del mismo patógeno o de diferentes patógenos, o pueden ser diferentes epítopos o partes de la misma proteína antigénica, o pueden ser el mismo antígeno que es específico para diferentes serotipos o variaciones estacionales del mismo patógeno (p. ej., virus de la gripe A, B, y C).
En algunos casos, una composición inmunogénica como se divulga en el presente documento comprende un antígeno de un organismo patógeno o un tejido anormal. En algunos casos, el antígeno es un antígeno tumoral. En algunos casos, un antígeno puede ser al menos un antígeno seleccionado de antígenos de patógenos o parásitos, tal como antígenos de Streptococcus pneumoniae, Mycobacterium tuberculosis o M. tetanus, Bacillus anthracis, VIH, antígenos de gripe estacional o epidémica (tales como H1N1 o H5N1), Bordetella pertussis, Staphylococcus aureus, Neisseria meningitides o N. gonorrhoeae, VPH, Chlamydia trachomatis, VHS u otros virus del herpes, o Plasmodia sp. Estos antígenos pueden incluir péptidos, proteínas, glicoproteínas o polisacáridos. En algunos casos, el antígeno es un toxoide o porción de una toxina.
En algunos casos, una composición inmunogénica como se divulga en el presente documento comprende un polisacárido antigénico, por ejemplo, tal como el antígeno Vi (polisacárido capsular de Salmonella typhi), polisacáridos capsulares neumocócicos, polisacárido de la pared celular neumocócica, polisacárido capsular Hib (Haemophilus influenzae tipo B), polisacáridos capsulares meningocócicos y otros polisacáridos capsulares o de pared celular bacterianos, o cualquier combinación de los mismos. El polisacárido puede tener un componente proteico, p. ej., una glicoproteína tal como las de los virus.
En algunos casos, una composición inmunogénica como se divulga en el presente documento comprende además al menos un factor de coestimulación asociado con el polímero o polisacárido, donde el factor de coestimulación puede estar asociado directa o indirectamente. Por ejemplo, en algunos casos, un factor de coestimulación puede fijarse de manera covalente al polímero. Por ejemplo, en algunos casos, se puede fijar de manera covalente un factor de coestimulación a la primera molécula de afinidad, que después se reticula con el polímero. Por ejemplo, en algunos casos, se puede fijar un factor de coestimulación a una molécula de afinidad complementaria, que se asocia con una primera molécula de afinidad para unir el factor coestimulador al polímero. En algunos casos, un factor de coestimulación es un adyuvante. En casos alternativos, un factor coestimulador puede ser cualquiera conocido por un experto en la materia, e incluye cualquier combinación, por ejemplo, sin limitación, agonistas de receptores de tipo Toll (agonistas para TLR2, 3, 4, 57, 8, 9, etc. ), agonistas de NOD, o agonistas del inflamasoma.
En algunos casos, el factor coestimulador puede ser una proteína de unión a biotina lipidada o una variante no hemolítica de alfa-hemolisina o la proteína de fusión de mHla con la proteína de unión a biotina descrita en el presente documento.
También se divulga en el presente documento el uso de la composición inmunogénica como se divulga en el presente documento para administrar a un sujeto para provocar una respuesta inmunitaria en el sujeto. En algunos casos, la respuesta inmunitaria es una respuesta de anticuerpos/linfocitos B, una respuesta de linfocitos T CD4+ (incluidos los linfocitos Th1, Th2 y Th17) y/o una respuesta de linfocitos T CD8+. En algunos casos, se administra al menos un adyuvante junto con la composición inmunogénica.
También se divulga un método para inducir una respuesta inmunitaria en un sujeto a al menos un antígeno, que comprende administrar al sujeto la composición inmunogénica como se divulga en el presente documento.
También se divulga un método para vacunar a un animal, p. ej., un ave, un mamífero o un ser humano, contra al menos un antígeno que comprende administrar una composición de vacuna que comprende la composición inmunogénica como se divulga en el presente documento.
En todos los aspectos como se divulga en el presente documento, un animal o un sujeto puede ser un ser humano. En algunas realizaciones, el sujeto puede ser un animal de granja o no doméstico, o un animal doméstico. En algunos casos divulgados en el presente documento, una composición de vacuna que comprende la composición inmunogénica como se divulga en el presente documento se puede administrar mediante inyección subcutánea, intranasal, oral, sublingual, vaginal, rectal, intradérmica, intraperitoneal o intramuscular.
En todos los aspectos como se divulga en el presente documento, una respuesta inmunitaria es una respuesta de anticuerpos/linfocitos B, una respuesta de linfocitos T CD4+ (incluidas las respuestas Th1, Th2 y Th17) o una respuesta de linfocitos T CD8+ contra antígeno o antígenos de proteína/péptido. En algunas realizaciones, una respuesta inmunitaria es una respuesta de anticuerpos/linfocitos B contra el polímero, p. ej., un polisacárido neumocócico. En algunos casos, se administra al menos un adyuvante junto con la composición inmunogénica. También se divulga en el presente documento el uso de la composición inmunogénica como se divulga en el presente documento para su uso en un diagnóstico de exposición a un agente patógeno o inmunógeno.
Sistema presentador de antígenos múltiples
También se divulga en el presente documento un sistema presentador de antígenos múltiples inmunogénico (MAPS), útil para la producción de composiciones inmunogénicas, tal como aquellos útiles en vacunas. En particular, la presente divulgación se refiere a composiciones que comprenden un complejo inmunogénico que comprende al menos un tipo de polímero, p. ej., un polisacárido, que puede, opcionalmente, ser antigénico; al menos una proteína o péptido antigénicos; y al menos un par de moléculas de afinidad complementaria que comprende (i) una primera molécula de afinidad que se asocia con el polímero, y (ii) una molécula de afinidad complementaria que se asocia con la proteína o péptido; de manera que las moléculas de afinidad primera y complementaria sirven como enlace indirecto entre el polímero y la proteína o péptido antigénicos. Por consiguiente, el polímero puede fijar al menos 1, o al menos 2, o una pluralidad de antígenos proteicos o peptídicos iguales o diferentes. En algunos casos, el polímero es antigénico, p. ej., el polímero es un polisacárido capsular neumocócico. En algunos casos, los antígenos proteicos o peptídicos son antígenos proteicos o peptídicos recombinantes.
Las composiciones inmunogénicas divulgadas en el presente documento pueden provocar respuestas tanto humorales como celulares a uno o múltiples antígenos al mismo tiempo. Las composiciones inmunogénicas proporcionan una respuesta de memoria duradera, protegiendo potencialmente a un sujeto de futuras infecciones. Esto permite una composición inmunogénica única que eleva un título alto de anticuerpo contra polisacáridos funcional y es similar o se compara de manera favorable con el nivel de anticuerpos inducido por la vacuna conjugada convencional. Además, no hay restricción para la proteína transportadora específica, y se pueden utilizar varias proteínas antigénicas en la construcción de MAPS para generar una respuesta fuerte de anticuerpos contra polisacáridos.
Adicionalmente, la fuerte respuesta de anticuerpos y las respuestas Th17/Th1 son específicas de múltiples antígenos proteicos presentados a través de la composición de MAPS. Esto presenta una gran ventaja, como un medio para provocar dos formas de inmunidad con una construcción. Además de una respuesta inmunitaria más convencional a un polisacárido antigénico conjugado con una proteína transportadora, la presente divulgación proporciona una respuesta de linfocitos T y, de manera más específica, respuestas Th17 y Th1 a proteínas inyectadas de manera sistemática. Además, la presente composición inmunogénica puede incorporar ligandos en la estructura polimérica. Esto proporciona un potencial para potenciar las respuestas específicas de linfocitos B o linfocitos T modificando la relación proteína/polímero, el tamaño del complejo, o incorporando un factor coestimulador específico, tal como ligandos de TLR2/4, etc., en la composición.
En comparación con la tecnología de conjugación habitual, que implica un tratamiento severo de las proteínas, los presentes métodos evitan el riesgo de desnaturalización de otras modificaciones del antígeno peptídico. Esto proporciona una ventaja sustancial de conservar la antigenicidad de las proteínas incluidas y aumenta la probabilidad de que la propia proteína sirva como antígeno (en lugar de simplemente como transportador). De forma análoga, los presentes métodos evitan modificaciones/daños innecesarios de la estructura del polisacárido, porque no hay reticulación química pesada: la biotinilación se puede controlar con precisión para que reaccione con grupos funcionales específicos del polisacárido, y el nivel de biotinilación se puede ajustar fácilmente. Esto es ventajoso para evitar el proceso habitual de conjugación, que da como resultado daños en las cadenas laterales o epítopos esenciales, que pueden causar inmunogenicidad y protección reducidas.
El presente ensamblaje basado en afinidad proporciona una preparación fácil y muy flexible de la composición inmunogénica. Es muy específica y estable; puede permanecer en frío durante meses y conservar su potencia. El proceso de ensamblaje es lo suficientemente simple como para garantizar una alta reproducibilidad; solamente se precisan pocas etapas, que reduce el riesgo de variación de un lote a otro, de gran ventaja industrial. El ensamblaje de MAPS es altamente eficaz (más del 95 %), incluso a bajas concentraciones de proteína y polisacárido (tal como 0,1 mg/ml); esta es una gran ventaja, porque las ineficacias en la fabricación de conjugados (por lo general, las eficacias están en el intervalo <50 %) representan un obstáculo importante y la razón del alto coste de las vacunas. Para formulación: es fácil ajustar la composición y las propiedades físicas del producto final. La relación proteína: polímero en el complejo es ajustable; con biotinilación moderada del polímero, la proteína:polímero puede ser 10:1 (p/p) o más; por el contrario, la relación puede ser 1:10 o menos si tal es el interés basado en objetivos inmunitarios. Adicionalmente, el tamaño de la composición de MAPS inmunogénica se puede ajustar mediante la elección del tamaño del polímero. Los métodos de elaboración de MAPS facilitan la combinación de proteínas y polímeros con pocas modificaciones. La posible multivalencia del producto final mediante la carga de múltiples antígenos proteicos, del mismo o diferentes patógenos (p. ej., neumococo y tuberculosis), en una única construcción inmunogénica, proporciona una composición que puede utilizarse para disminuir el número de vacunas necesarias para inmunizar a un sujeto contra más de una enfermedad. Además, la composición de MAPS es muy estable; comienza a disociarse únicamente al hervir y mantener la inmunogenicidad incluso después de muchos meses a 4 °C. La inmunogenicidad del complejo de MAPS puede estar limitada por la estabilidad del componente proteico o peptídico antigénicos, cuya estabilidad puede ampliarse mediante la inclusión en el complejo de MAPS. Los antígenos específicos utilizados en el presente documento, mostraron estabilidad a temperatura ambiente y después de al menos un ciclo de congelación-descongelación. Esto proporciona una ventaja importante sobre las vacunas actuales que se ven comprometidas si la "cadena de frío" no se mantiene con cuidado.
Por consiguiente, se divulga una composición inmunogénica que comprende un polímero, al menos un antígeno proteico o peptídico, y al menos un par de moléculas de afinidad complementaria, donde el par de moléculas de afinidad complementaria comprende una primera molécula de afinidad que se asocia con el polímero y una molécula de afinidad complementaria que se asocia con el antígeno proteico o peptídico, de modo que cuando la primera molécula de afinidad se asocia con la molécula de afinidad complementaria, indirectamente une el antígeno al polímero.
En algunos casos, la primera molécula de afinidad se reticula con el polímero con un reactivo de reticulación, por ejemplo, un reactivo de reticulación seleccionado de CDAP (tetrafluoroborato de 1-ciano-4-dimetilaminopiridinio), EDC (clorhidrato de 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil]carbodiimida), cianoborohidruro sódico; bromuro de cianógeno; o bicarbonato de amonio/ácido yodoacético. En algunos casos, la primera molécula de afinidad está reticulada con grupos funcionales carboxilo, hidroxilo, amino, fenoxilo, hemiacetal y mercapto del polímero. En algunos casos, la primera molécula de afinidad está unida de manera covalente al polímero.
En algunos casos, la primera molécula de afinidad es biotina o un derivado de la misma, o una molécula con estructura o propiedad física similar a la biotina, por ejemplo, una amina-PEG3-biotina ((+)-biotinilación-3-6,9-trixaundecanodiamina) o un derivado de la misma.
En algunos casos, el antígeno proteico o peptídico de la composición inmunogénica es una proteína de fusión que comprende la proteína o péptido antigénicos fusionados a la molécula de unión por afinidad complementaria. La fusión puede ser una construcción genética, es decir, un péptido o proteína de fusión recombinantes. En algunos casos, un antígeno puede fijarse de manera covalente como una proteína de fusión a la molécula de afinidad complementaria. En casos alternativos, el antígeno está fijado de forma no covalente a la molécula de afinidad complementaria.
En algunos casos, la molécula de afinidad complementaria es una proteína de unión a biotina o un derivado o una porción funcional de la misma. En algunos casos, una molécula de afinidad complementaria es una proteína similar a avidina o un derivado o una porción funcional de la misma, por ejemplo, pero sin limitación, rizavidina o un derivado de la misma. En algunos casos, una molécula de afinidad complementaria es avidina o estreptavidina o un derivado o una porción funcional de las mismas.
En algunos casos, un péptido señal de secreción se encuentra en el extremo N de la proteína similar a avidina. Puede utilizarse cualquier secuencia señal conocida por personas expertas en la materia; y en algunos casos, la secuencia señal es MKKIWLALAGLVLAFSASA (SEQ ID No : 2) o un derivado o porción funcional de la misma. En algunos casos, el antígeno se puede fusionar con una molécula de afinidad complementaria a través de un péptido enlazador flexible, donde el péptido enlazador flexible fija el antígeno a la molécula de afinidad complementaria.
En algunos casos, el componente polimérico del inmunógeno comprende un polímero derivado de un organismo vivo, p. ej., un polisacárido. En algunos casos, un polímero se puede purificar y aislar de una fuente natural, o se puede sintetizar con una composición/estructura natural, o puede ser un polímero sintético (p. ej., con una composición/estructura artificial). En algunos casos, un polímero deriva de un organismo seleccionado del grupo que consiste en: bacterias, arqueas, o células eucariotas como hongos, insectos, plantas, o quimeras de los mismos. En algunos casos, el polímero es un polisacárido derivado de una bacteria patógena. En casos específicos, el polisacárido es un polisacárido capsular neumocócico, un polisacárido de la pared celular neumocócica, o un polisacárido Vi de Salmonella typhi.
En algunos casos, un polímero de la composición inmunogénica como se divulga en el presente documento es un polímero de cadena ramificada, p. ej., un polisacárido ramificado, o como alternativa, puede ser un polímero de cadena lineal, p. ej., un polímero de cadena simple, p. ej., polisacárido. En algunos casos, el polímero es un polisacárido, por ejemplo, dextrano o un derivado del mismo. En algunos casos, un polímero, p. ej., el polisacárido dextrano puede tener un peso molecular medio de 425 kD-500 kDa, ambos inclusive, o en algunos casos, mayor de 500kDa. En algunos casos, un polímero, p. ej., el polisacárido dextrano puede tener un peso molecular medio de 60 kD-90 kDa, ambos inclusive, o en algunos casos, menor de 70 kDa. El polímero dextrano puede derivar de una bacteria, tal como Leuconostoc mesenteroides.
En algunos casos, una composición inmunogénica como se divulga en el presente documento comprende al menos 2 antígenos, o al menos 3 antígenos, o al menos 5 antígenos, o entre 2-10 antígenos, o entre 10-15 antígenos, o entre 15-20 antígenos, o entre 20-50 antígenos, o entre 50-100 antígenos, o más de 100 antígenos, ambos inclusive. En algunos casos, cuando una composición inmunogénica como se divulga en el presente documento comprende al menos 2 antígenos, los antígenos pueden ser el mismo antígeno o al menos 2 antígenos diferentes. En algunos casos, los antígenos pueden ser del mismo patógeno o de diferentes patógenos, o pueden ser diferentes epítopos o partes de la misma proteína antigénica, o pueden ser el mismo antígeno que es específico para diferentes serotipos o variaciones estacionales del mismo patógeno (p. ej., virus de la gripe A, B, y C).
En algunos casos, una composición inmunogénica como se divulga en el presente documento comprende un antígeno de un organismo patógeno o un tejido anormal. En algunos casos, el antígeno es un antígeno tumoral. En algunos casos, un antígeno puede ser al menos un antígeno seleccionado de antígenos de patógenos o parásitos, tal como antígenos de Streptococcus pneumoniae, Mycobacterium tuberculosis o M. tetanus, Bacillus anthracis, VIH, antígenos de gripe estacional o epidémica (tales como H1N1 o H5N1), Bordetella pertussis, Staphylococcus aureus, Neisseria meningitides o N. gonorrhoeae, VPH, Chlamydia trachomatis, VHS u otros virus del herpes, o Plasmodia sp. Estos antígenos pueden incluir péptidos, proteínas, glicoproteínas o polisacáridos. En algunos casos, el antígeno es un toxoide o porción de una toxina.
En algunos casos, una composición inmunogénica como se divulga en el presente documento comprende un polisacárido antigénico, por ejemplo, tal como el antígeno Vi (polisacárido capsular de Salmonella typhi), polisacáridos capsulares neumocócicos, polisacárido de la pared celular neumocócica, polisacárido capsular Hib (Haemophilus influenzae tipo B), polisacáridos capsulares meningocócicos, el polisacárido de Bacillus Anthracis (el agente causante del ántrax) y otros polisacáridos capsulares o de la pared celular bacterianos o cualquier combinación de los mismos. El polisacárido puede tener un componente proteico, p. ej., una glicoproteína tal como las de los virus.
En algunos casos, una composición inmunogénica como se divulga en el presente documento comprende además al menos un factor de coestimulación asociado con el polímero o polisacárido, donde el factor de coestimulación puede estar asociado directa o indirectamente. Por ejemplo, en algunos casos, un factor de coestimulación puede fijarse de manera covalente al polímero. Por ejemplo, en algunos casos, se puede fijar de manera covalente un factor de coestimulación a la primera molécula de afinidad, que después se reticula con el polímero. Por ejemplo, en algunos casos, se puede fijar un factor de coestimulación a una molécula de afinidad complementaria, que se asocia con una primera molécula de afinidad para unir el factor de coestimulación al polímero. En algunos casos, un factor de coestimulación es un adyuvante. En casos alternativos, un factor coestimulador puede ser cualquiera conocido por un experto en la materia, e incluye cualquier combinación, por ejemplo, sin limitación, agonistas de receptores de tipo Toll (agonistas para TLR2, 3, 4, 5, 7,8, 9, etc.), agonistas de NOD, o agonistas del inflamasoma.
También se divulga el uso de la composición inmunogénica como se divulga en el presente documento para administrarse a un sujeto para provocar una respuesta inmunitaria en el sujeto. En algunos casos, la respuesta inmunitaria es una respuesta de anticuerpos/linfocitos B, una respuesta de linfocitos T CD4+ (incluidos los linfocitos Th1, Th2 y Th17) y/o una respuesta de linfocitos T CD8+. En algunos casos, se administra al menos un adyuvante junto con la composición inmunogénica.
También se divulga un método para inducir una respuesta inmunitaria en un sujeto a al menos un antígeno, que comprende administrar al sujeto la composición inmunogénica como se divulga en el presente documento.
También se divulga un método para vacunar a un animal, p. ej., un ave, un mamífero o un ser humano, contra al menos un antígeno que comprende administrar una composición de vacuna que comprende la composición inmunogénica como se divulga en el presente documento.
En todos los aspectos como se divulga en el presente documento, un animal o un sujeto puede ser un ser humano. En algunos casos, el sujeto puede ser un animal de granja o no doméstico, o un animal doméstico. En algunos casos, una composición de vacuna que comprende la composición inmunogénica como se divulga en el presente documento se puede administrar mediante inyección subcutánea, intranasal, oral, sublingual, vaginal, rectal, intradérmica, intraperitoneal, intramuscular, o mediante parche cutáneo para inmunización transcutánea.
En todos los aspectos como se divulga en el presente documento, una respuesta inmunitaria es una respuesta de anticuerpos/linfocitos B, una respuesta de linfocitos T CD4+ (incluidas las respuestas Th1, Th2 y Th17) o una respuesta de linfocitos T CD8+ contra antígeno o antígenos de proteína/péptido. En algunos casos, una respuesta inmunitaria es una respuesta de anticuerpos/linfocitos B contra el polímero, p. ej., un polisacárido neumocócico. En algunos casos, se administra al menos un adyuvante junto con la composición inmunogénica.
También se divulga el uso de la composición inmunogénica como se divulga en el presente documento para su uso en un diagnóstico de exposición a un agente patógeno o inmunógeno.
También se divulga un método para vacunar a un sujeto, p. ej., un mamífero, p. ej., un ser humano con las composiciones inmunogénicas como se divulga en el presente documento, comprendiendo el método administrar una composición de vacuna como se divulga en el presente documento al sujeto.
Generalmente, las composiciones inmunogénicas y las composiciones que comprenden un complejo inmunogénico pueden comprender al menos un antígeno, o múltiples antígenos, fijados a un armazón de polímero para su uso en la provocación de una respuesta inmunitaria a cada uno de los antígenos fijados al polímero y, opcionalmente, al propio polímero, cuando se administra a un sujeto. Este sistema presentador de antígenos múltiples (MAPS), estimula una respuesta inmunitaria humoral y celular: puede generar anticuerpos contra polisacáridos y las respuestas de linfocitos B/Th1/Th17 a múltiples antígenos proteicos utilizando una única construcción inmunogénica de MAPS. Una combinación de inmunidad de linfocitos B y T frente al organismo puede representar una estrategia de vacuna óptima contra muchas enfermedades, incluida la infección invasiva asociada a la enfermedad neumocócica y el transporte nasofaríngeo. En algunos casos, la composición inmunogénica es una vacuna o está incluida en una vacuna.
Por consiguiente, un aspecto divulgado en el presente documento se refiere a una composición inmunogénica (sistema presentador de antígenos múltiples, o MAPS) que comprende al menos un polímero, p. ej., un polisacárido, al menos un antígeno proteico o peptídico, y al menos un par de moléculas de afinidad complementaria que comprende (i) una primera molécula de afinidad asociada con el polímero, y (ii) una molécula de afinidad complementaria asociada con el antígeno, que sirve para fijar indirectamente el antígeno al polímero (p. ej., la primera molécula de afinidad se asocia con la molécula de afinidad complementaria para unir el antígeno al polímero). Por consiguiente, el polímero se puede utilizar como un armazón para fijar al menos 1, o al menos 2, o más (p. ej., una pluralidad) de los mismos o diferentes antígenos. Las composiciones inmunogénicas como se divulga en el presente documento se pueden utilizar para provocar inmunidad tanto humoral como celular frente a múltiples antígenos al mismo tiempo.
Por consiguiente, los casos en el presente documento proporcionan una composición inmunogénica y métodos útiles para generar una respuesta inmunitaria en un sujeto, que se puede utilizar sola o junto o mezclada con esencialmente cualquier enfoque de vacuna existente.
El MAPS es una composición flexible y versátil que se puede diseñar y fabricar para provocar un amplio espectro o variedad de dianas antigénicas en particular. La Tabla 1 proporciona una guía de ejemplo simple para visualizar la flexibilidad de los casos de MAPS:
Tabla 1. Versatilidad de la plataforma MAPS
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Polímeros
Un componente de MAP consiste en una "estructura", normalmente un polímero. El polímero puede ser antigénico o no antigénico. Puede estar hecho de una amplia variedad de sustancias, como se describe en el presente documento, con la salvedad de que el polímero sirve como medio para presentar el o los antígenos asociados al sistema inmunitario de forma inmunogénica. En algunos casos, el polímero es un polímero sintético. En algunos casos, el polímero es un polímero de origen natural, p. ej., un polisacárido derivado o purificado de células bacterianas. En algunos casos, el polisacárido deriva o se purifica a partir de células eucariotas, p. ej., células de hongos, de insectos o vegetales. En otros casos más, el polímero deriva de células de mamíferos, tal como células infectadas por virus o células cancerosas. En general, dichos polímeros son bien conocidos en la técnica y se incluyen para su uso en los métodos y composiciones como se divulga en el presente documento.
En algunos casos, un polímero es un polisacárido seleccionado de cualquiera de los siguientes, dextrano, polisacárido Vi de Salmonella typhi, polisacárido capsular neumocócico, polisacárido de la pared celular neumocócica (CWPS, por sus siglas en inglés), polisacárido meningocócico, polisacárido de tipo b de Haemophilus influenzae o cualquier otro polisacárido de origen vírico, procariota o eucariota.
En algunos casos, el polisacárido consiste en o comprende un resto de azúcar antigénico. Por ejemplo, en algunos casos, un polisacárido para su uso en los métodos y composiciones inmunogénicas como se divulga en el presente documento es un polisacárido Vi de Salmonella typhi. El polisacárido capsular Vi se ha formulado contra infecciones entéricas bacterianas, tal como la fiebre tifoidea. Robbins et al., 150 J. Infect. Dis. 436 (1984); Levine et al., 7 Baillieres Clin. Gastroenterol. 501 (1993). Vi es un polímero de ácido a-1^4-galacturónico con un N acetilo en la posición C-2 y O-acetilación variable en C-3. La virulencia de S. typhi se correlaciona con la expresión de esta molécula. Sharma et al., 101 PNAS 17492 (2004). La vacuna de polisacárido Vi de S. typhi tiene varias ventajas: Los efectos secundarios son poco frecuentes y leves, una sola dosis produce inmunogenicidad y eficacia coherentes. El polisacárido Vi puede normalizarse de forma fiable mediante métodos fisicoquímicos verificados para otras vacunas de polisacáridos, Vi es estable a temperatura ambiente y puede administrarse simultáneamente con otras vacunas sin afectar la inmunogenicidad y la tolerabilidad. Azze et al., 21 Vaccine 2758 (2003).
Por tanto, el polisacárido Vi de S. typhi puede estar reticulado a una primera molécula de afinidad como se divulga en el presente documento, para fijar al menos un antígeno al polisacárido. En algunos casos, el antígeno puede ser del mismo organismo o de otro, de manera que la composición inmunogénica resultante confiera al menos algún nivel de inmunidad contra un patógeno o dos patógenos diferentes: si el antígeno confiere protección frente al neumococo, una composición inmunogénica en la que el armazón del polímero es un polisacárido Vi puede generar una respuesta inmunogénica tanto contra S. typhi como contra neumococos. Otros ejemplos incluyen la combinación de azúcares de bacterias encapsuladas (tal como antígenos de meningococo, S. aureus, neumococo, Hib, etc.) y de tuberculosis, para proporcionar una composición inmunogénica que genere una respuesta inmunitaria contra dos patógenos diferentes.
Otros residuos de polisacáridos (PS, por sus siglas en inglés) que pueden utilizarse en la presente divulgación como alternativa al dextrano, polisacáridos de la pared celular bacteriana (CWPS), etc., incluyen antígenos de hidratos de carbono de cánceres.
Además, en lo que respecta a los polisacáridos neumocócicos, el polisacárido puede derivar de cualquiera de los más de 93 serotipos de neumococo que se han identificado hasta la fecha, por ejemplo, incluidos, pero sin limitación, los serotipos 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 6C, 6D, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F y 33F. Se pueden identificar e incluir serotipos adicionales en la presente composición inmunogénica como se describe en el presente documento. Puede incluirse más de un polisacárido neumocócico tal como la estructura polimérica de las presentes composiciones inmunogénicas o en una vacuna que comprende las presentes composiciones de MAPS.
El polisacárido también puede derivar de la divulgación, la composición inmunogénica comprende polisacáridos capsulares de N. meningitidis de al menos uno, dos, tres o cuatro de los serogrupos A, C, W, W135 o Y.
Un ejemplo adicional comprende el tipo 5, tipo 8, o cualquiera de los polisacáridos u oligosacáridos de Staphylococcus aureus.
En algunos casos, el polímero es un polímero quimérico que comprende más de un tipo de polímero. Por ejemplo, un polímero de la composición inmunogénica como se divulga en el presente documento puede comprender una porción del polímero A y la porción restante del polímero B. No hay límite para la cantidad de diferentes tipos de polímeros que se pueden utilizar en una única entidad estructural de MAPS. En algunos casos, donde el polímero es un polímero ramificado, el polímero de cadena puede ser el polímero A, y las ramificaciones pueden ser al menos 1 o al menos 2 o al menos 3 o más polímeros diferentes.
En algunos casos, el polímero es un polímero ramificado. En algunos casos, el polímero es un polímero de cadena sencilla.
En algunos casos, el polímero es un polisacárido que comprende al menos 10 unidades de repetición de hidratos de carbonos, o al menos 20, o al menos 50, o al menos 75, o al menos 100, o al menos 150, o al menos 200, o al menos 250, o al menos al menos 300, o al menos 350, o al menos 400, o al menos 450, o al menos 500, o más de 500 unidades de repetición, ambos inclusive.
Divulgado en el presente documento, el polisacárido (PS) puede tener una masa molecular de < 500 kDa o > 500 kDa. También divulgado en el presente documento, el PS tiene una masa molecular superior de <70 kDa.
En algunos casos, un polímero es un polímero de gran peso molecular, p. ej., un polímero puede tener un peso molecular medio de entre aproximadamente 425-500 kDa, ambos inclusive, por ejemplo, al menos 300 kDa, o al menos 350 kDa, o al menos 400 kDa, o al menos 425 kDa, o al menos 450 kDa, o al menos 500 kDa o más de 500 kDa, ambos inclusive, pero normalmente menos de 500 kDa.
En algunos casos, un polímero puede ser un polímero de pequeño peso molecular, p. ej., un polímero puede tener un peso molecular medio de entre aproximadamente 60 kDA y aproximadamente 90 kDa, por ejemplo, al menos 50 kDa, o al menos 60 kDa, o al menos 70 kDa, o al menos 80 kDa, o al menos 90 kDa, o al menos 100 kDa, o más de 100 kDa, ambos inclusive, pero generalmente menos de aproximadamente 120 kDa.
En algunos casos, el polímero se recoge y purifica a partir de una fuente natural; y en otros casos, el polímero es sintético. Los expertos en la materia conocen métodos para producir polímeros sintéticos, incluyendo polisacáridos sintéticos, y se incluyen en las composiciones y métodos como se divulga en el presente documento.
En la Tabla 2 se ejemplifican solamente algunos de los polímeros de polisacáridos que pueden servir como estructura para uno o más antígenos o tipos de antígenos:
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Polímeros adicionales que se pueden utilizar en las composiciones inmunogénicas de MAPS descritas en el presente documento incluyen polímeros basados en polietilenglicol, polímeros de poli(ortoéster), transportadores de poliacrilo, PLGA, polietilenimina (PEI), dendrímeros de poliamidoamina (PAMAM), polímeros de p-aminoéster, polifosfoéster (PPE), liposomas, polimerosomas, ácidos nucleicos, oligonucleótidos fosforotioados, quitosano, seda, micelas poliméricas, polímeros de proteínas, partículas de virus, partículas similares a virus (VLP) u otras micropartículas. Véase, p. ej., El-Sayed et al., Smart Polymer Carriers for Enhanced Intracellular Delivery of Therapeutic Molecules, 5 Exp. Op. Biol. Therapy, 23 (2005). Los polímeros biocompatibles formulados para el suministro de ácidos nucleicos pueden adaptarse para su uso como estructura en el presente documento. Véase, p. ej., BIOCOMPATIBLE POL. NUCL. ACID. DELIV. (Domb et al., eds., John Wiley & Sons, Inc. Hoboken, NJ, 2011). Por ejemplo, Las VLP se parecen a los virus, pero no son infecciosas porque no contienen ningún material genético vírico. La expresión, incluida la expresión recombinante, de proteínas estructurales víricas, tal como componentes de envoltura o cápside, puede dar como resultado el autoensamblaje de VLP. Las VLP se han producido a partir de componentes de una amplia variedad de familias de virus que incluyen Parvoviridae (p. ej., virus adenoasociado), Retroviridae (p. ej., VIH) y Flaviviridae (p. ej., virus de la hepatitis B o C). Las VLP se pueden producir en varios sistemas de cultivo celular que incluyen líneas celulares de mamíferos, líneas celulares de insectos, levaduras y células vegetales. Las VLP recombinantes son particularmente ventajosas porque el componente vírico se puede fusionar con antígenos recombinantes como se describe en el presente documento.
Antígenos
Las proteínas de fusión y las composiciones inmunogénicas como se divulga en el presente documento pueden comprender cualquier antígeno que provoque una respuesta inmunitaria en un sujeto. En algunos casos, al menos uno o más antígenos están asociados con el polímero de la composición. En algunos casos, al menos 2, o al menos 3, o al menos 5, o al menos 10, o al menos 15, o al menos 20, o al menos 50, o al menos 100, o más de 100 antígenos pueden estar asociados con el polímero como se divulga en el presente documento. En algunos casos, donde la composición inmunogénica comprende más de un antígeno, los antígenos pueden ser el mismo antígeno o pueden ser varios diferentes antígenos asociados con el polímero. En algunos casos, donde la composición inmunogénica comprende más de un antígeno, los antígenos pueden ser antígenos del mismo patógeno o de diferentes patógenos, o como alternativa, pueden ser diferentes antígenos del mismo patógeno o antígenos similares de diferentes serotipos de patógenos.
Un antígeno para su uso en las proteínas de fusión y en las composiciones inmunogénicas y en los métodos descritos en el presente documento puede ser cualquier antígeno, incluyendo, pero sin limitación, péptidos, toxinas, toxoides patógenos, subunidades de los mismos, o combinaciones de los mismos (p. ej., toxina del cólera, toxoide tetánico).
En algunos casos, un antígeno, que puede fusionarse con la molécula de afinidad complementaria, puede ser cualquier antígeno asociado con una enfermedad infecciosa, o cáncer o enfermedad inmunitaria. En algunos casos, un antígeno puede ser un antígeno expresado por cualquiera de varios agentes infecciosos, incluyendo virus, bacteria, hongo o parásito.
En algunos casos, un antígeno deriva (p. ej., se obtiene) de un organismo patógeno. En algunos casos, el antígeno es un antígeno canceroso o tumoral, p. ej., un antígeno derivado de una célula tumoral o cancerosa.
En algunos casos, un antígeno derivado de un organismo patógeno es un antígeno asociado con una enfermedad infecciosa; puede derivar de cualquiera de varios agentes infecciosos, incluyendo virus, bacteria, hongo o parásito. En algunos casos, un antígeno diana es cualquier antígeno asociado con una patología, por ejemplo, una enfermedad infecciosa o patógeno, o cáncer o una enfermedad inmunitaria tal como una enfermedad autoinmunitaria. En algunos casos, un antígeno puede expresarse por cualquiera de varios agentes infecciosos, incluyendo virus, bacteria, hongo o parásito. Un antígeno diana para su uso en los métodos y composiciones que se divulga en el presente documento también puede incluir, por ejemplo, péptidos, toxinas, toxoides patógenos, subunidades de los mismos, o combinaciones de los mismos (p. ej., toxina del cólera, toxoide tetánico).
Ejemplos no limitantes de virus infecciosos incluyen: Retroviridae; Picomaviridae (por ejemplo, virus de la polio, virus de la hepatitis A; enterovirus, virus coxsackie humanos, rinovirus, echovirus); Calciviridae (tal como cepas que causan gastroenteritis); Togaviridae (por ejemplo, virus de la encefalitis equina, virus de la rubéola); Flaviridae (por ejemplo, virus del dengue, virus de encefalitis, virus de la fiebre amarilla); Coronaviridae (por ejemplo, coronavirus); Rhabdoviridae (por ejemplo, virus de la estomatitis vesicular, virus de la rabia); Filoviridae (por ejemplo, virus del ébola); Paramyxoviridae (por ejemplo, virus de la paragripe, virus de las paperas, virus del sarampión, virus sincitial respiratorio); Orthomyxoviridae (por ejemplo, virus de la gripe); Bungaviridae (por ejemplo, virus Hantaan, virus bunga, flebovirus y virus de Nairo); Arena viridae (virus de la fiebre hemorrágica); Reoviridae (p.ej, reovirus, orbivirus y rotavirus); Birnaviridae; Hepadnaviridae (virus de la hepatitis B); Parvoviridae (parvovirus); Papovaviridae (virus del papiloma, virus del polioma); Adenoviridae (la mayoría de los adenovirus); Herpesviridae (virus del herpes simple (VHS) 1 y VHS-2, virus de la varicela zóster, citomegalovirus (CMV), virus de la enfermedad de Marek, virus del herpes); Poxviridae (variola virus, virus vaccinia, virus de la viruela); e Iridoviridae (tal como el virus de la peste porcina africana); y virus no clasificados (por ejemplo, los agentes etiológicos de las encefalopatías espongiformes, el agente de la hepatitis delta (se cree que es un satélite defectuoso del virus de la hepatitis B), los agentes de hepatitis no A, no B (clase 1 = transmitido por vía interna; clase 2 = transmitidos por vía parenteral (es decir, hepatitis C); virus de Norwalk y relacionados y astrovirus). Las composiciones y métodos descritos en el presente documento se contemplan para su uso en el tratamiento de infecciones con estos agentes víricos.
casos de infecciones fúngicas que pueden tratarse mediante la inclusión de antígenos en los casos anteriores incluyen aspergilosis; aftas (causadas por Candida albicans); criptococosis (causada por Cryptococcus); e histoplasmosis. Por tanto, ejemplos de hongos infecciosos incluyen, pero sin limitación, Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum, Coccidioides immitis, Blastomyces dermatitidis, Chlamydia trachomatis, Candida albicans. Los componentes de estos organismos pueden incluirse como antígenos en los MAPS descritos en el presente documento.
Divulgado en el presente documento, un antígeno deriva de un microbio infeccioso tal como Bordatella pertussis, Brucella, Enterococci sp., Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrheae, Moraxella, Haemophilus tipificable o no tipificable, Pseudomonas, Salmonella, Shigella, Enterobacter, Citrobacter, Klebsiella, E. coli, Helicobacter pylori, Clostridia, Bacteroides, Chlamydiaceae, Vibrio cholera, Mycoplasma, Treponemes, Borelia burgdorferi, Legionella pneumophilia, Mycobacteria sps (tal como M. tuberculosis, M. avium, M. intracellulare, M. kansaii, M. gordonae, M. leprae), Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Streptococcus pyogenes (estreptococo del grupo A), Streptococcus agalactiae (estreptococo del grupo B), Streptococcus (grupo viridans), Streptococcus faecalis, Streptococcus bovis, Streptococcus (especies anaerobias), Streptococcus pneumoniae, Campylobacter sp. patógenas, Enterococcus sp., Haemophilus influenzae, Bacillus anthracis, Corynebacterium diphtheriae, Corynebacterium sp., Erysipelothrix rhusiopathiae, Clostridium perfringens, Clostridium tetani, Enterobacter aerogenes, Klebsiella pneumoniae, Leptospira sps., Pasturella multocida, Bacteroides sp., Fusobacterium nucleatum, Streptobacillus moniliformis, Treponema pallidium, Treponema pertenue y Actinomyces israelli. Las composiciones y métodos descritos en el presente documento se contemplan para su uso en el tratamiento o prevención de infecciones contra estos agentes bacterianos.
Patógenos parásitos adicionales de los que pueden derivar antígenos incluyen, por ejemplo: Entamoeba histolytica, Plasmodium falciparum, Leishmania sp., Toxoplasma gondii, Rickettsia, y el Helminths.
También divulgado en el presente documento, un antígeno es una proteína PsaA neumocócica truncada, serina/treonina proteína cinasa (StkP) neumocócica de toxoide de neumolisina, unidad de repetición de serina/treonina proteína cinasa (StkPR) neumocócica, proteína PcsB neumocócica, alfa hemolisina estafilocócica, proteína mtb ESAT-6 de Mycobacterium tuberculosis, antígeno del núcleo de la pared celular de M. tuberculosis, polipéptidos CT144, CT242 o CT812 de Chlamydia, o fragmentos de estos, subunidad B de ADN girasa de Chlamydia, fosfatasa de síntesis de sulfito/bifosfato de Chlamydia, proteína de división celular FtsY de Chlamydia, metionil-ARNt sintetasa de Chlamydia, ADN helicasa (uvrD) de Chlamydia, subunidad I de la ATP sintasa (atpI) de Chlamydia, o hidrolasa dependiente de metales de Chlamydia.
Se divulga una composición inmunogénica dirigida al patógeno. Mycobacterium tuberculosis (TB), un parásito bacteriano intracelular. Un ejemplo de antígeno de TB es TbH9 (también conocido como Mtb 39A). Otros antígenos de TB incluyen, pero sin limitación, DPV (también conocido como Mtb8.4), 381, Mtb41, Mtb40, Mtb32A, Mtb64, Mtb83, Mtb9.9A, Mtb9.8, Mtb16, Mtb72f, Mtb59f, Mtb88f, Mtb71f, Mtb46f y Mtb31f, en donde "f" indica que es una fusión o dos o más proteínas.
Como se indica anteriormente, un antígeno puede derivar de una especie de Chlamydia para su uso en las composiciones inmunogénicas de la presente divulgación. Chlamydiaceae(que consiste en Chlamydiae y Chlamydophila), son bacterias gramnegativas intracelulares obligadas. Las infecciones por Chlamydia trachomatis se encuentran entre las infecciones bacterianas de transmisión sexual más prevalentes, y cada año se producen, tal vez 89 millones de nuevos casos de infecciones genitales por. Chlamydia. La Chlamydia de la presente divulgación incluye, por ejemplo, C. trachomatis, Chlamydophila pneumoniae, C. muridarum, C. suis, Chlamydophila abortus, Chlamydophila psittaci, Chlamydophila caviae, Chlamydophila felis, Chlamydophila pecorum, y C. pneumoniae. Los modelos animales de infección por clamidia han establecido que los linfocitos T desempeñan un papel fundamental tanto en la eliminación de la infección inicial como en la protección contra la reinfección de hospedadores susceptibles. Por lo tanto, las composiciones inmunogénicas como se divulgan en el presente documento pueden utilizarse para proporcionar un valor particular provocando respuestas inmunitarias celulares contra la infección por clamidia.
De manera más específica, antígenos de Chlamydia útiles en la presente divulgación incluyen la subunidad B de la ADN girasa, fosfatasa de síntesis de sulfito/bifosfato, proteína de división celular FtsY, metionil-ARNt sintetasa, ADN helicasa (uvrD); subunidad I de ATP sintasa (atpI) o una hidrolasa dependiente de metales (publicación de solicitud de patente de EE. UU. n.° 20090028891). Antígenos adicionales de Chlamydia trachomatis incluyen el polipéptido CT144, un péptido que tiene los restos de aminoácidos 67-86 de CT144, un péptido que tiene los restos de aminoácidos 77-96 de CT144, proteína CT242, un péptido que tiene los aminoácidos 109-117 de CT242, un péptido que tiene los aminoácidos 112-120 del polipéptido CT242, proteína CT812 (del gen pmpD), un péptido que tiene los restos de aminoácidos 103-111 de la proteína CT812; y varios péptidos antigénicos diferentes de C. trachomatis: NVTQDLTSSTAKLECTQDLI (SEQ ID NO: 29), AKLECTQDLIAQGKLIVTNP (SEQ ID NO: 30), SNLKRMQKI (SEQ ID NO: 31), AALYSTEDL (SEQ ID NO: 32), FQEKDADTL (SEQ ID NO: 33), QSVNELVYV (SEQ ID NO: 34), LEFASCSSL (SEQ ID NO: 35), SQAEGQYRL (SEQ ID NO: 36), GQSVNELVY (SEQ ID NO: 37) y QAVLLLDQI (SEQ ID NO: 38). Véase el documento WO 2009/020553. Adicionalmente, se pueden utilizar antígenos de Chlamydia pneumoniae que incluyen homólogos de los polipéptidos anteriores (véase la patente de Estados Unidos N.° 6,919,187) en las composiciones inmunogénicas y en los métodos como se divulga en el presente documento.
Los antígenos fúngicos pueden derivar de especias de Candida y otras levaduras; u otros hongos (aspergillus, otros hongos ambientales). Respecto a otros parásitos, la malaria, así como los gusanos y las amebas, pueden proporcionar el antígeno antigénico para su uso en las composiciones inmunogénicas y en los métodos como se divulga en el presente documento.
En algunos casos, cuando el antígeno debe generar un inmunógeno contra la gripe, las glicoproteínas de superficie hemaglutinina (HA) y neuraminidasa (NA) son generalmente los antígenos de elección. Tanto el polipéptido de nucleoproteína (NP) como la matriz (M) son proteínas víricas internas y, por lo tanto, no se suelen considerar en el diseño de vacunas para la inmunidad basada en anticuerpos. Las vacunas contra la gripe se usan de manera habitual en seres humanos e incluyen vacunas derivadas del virus de la gripe completos inactivados, virus de la gripe vivos atenuados o materiales purificados e inactivados de cepas víricas. Por ejemplo, se puede fabricar una vacuna tradicional contra la gripe utilizando tres cepas potencialmente peligrosas del virus de la gripe. Estas cepas generalmente se cultivan en huevos de gallina fertilizados, que requiere un procesamiento extenso que incluye la inoculación e incubación de huevos, recogida de huevos, purificación e inactivación de virus, procesamiento y agrupación de virus o componentes víricos en la formulación final de la vacuna y el llenado aséptico en los recipientes apropiados. Normalmente, este ciclo de producción basado en huevos dura más de 70 semanas. En caso de una gran epidemia de gripe, la disponibilidad de una vacuna potente y segura es una preocupación importante. Adicionalmente, existen riesgos asociados con las impurezas en los huevos, tales como antibióticos y contaminantes, que repercuten negativamente en la esterilidad de la vacuna. Además, las vacunas contra la gripe derivadas de huevo están contraindicadas para las personas con alergias graves a las proteínas del huevo y las personas con antecedentes del síndrome de Guillain-Barré. La presente divulgación proporciona una alternativa a las vacunas contra la gripe basadas en huevos, no solo evitando las secuelas relacionadas con el huevo, sino proporcionando una plataforma para el uso de múltiples antígenos de gripe en una plataforma altamente controlada.
En algunos casos, un antígeno para su uso en las composiciones inmunogénicas como se divulga en el presente documento también puede incluir los que se usan en guerras biológicas, tales como ricina, lo que puede provocar una respuesta CMI.
Adicionalmente, en el presente documento se divulgan composiciones inmunogénicas que comprenden antígenos que provocan una respuesta inmunitaria contra el cáncer. En estos conjugados, un antígeno es un antígeno expresado por un cáncer o tumor, o derivado de un tumor. En algunos casos, dichos antígenos se denominan en el presente documento "antígeno canceroso" y son normalmente una proteína expresada de manera predominante en las células cancerosas, de modo que el conjugado provoque tanto una potente inmunidad humoral como una potente inmunidad celular a esta proteína. Se ha identificado una gran cantidad de antígenos asociados al cáncer, varios de las cuales se están utilizando ahora para producir vacunas experimentales para el tratamiento del cáncer y, por tanto, son adecuadas para su uso en los presentes casos. Los antígenos asociados con más de un tipo de cáncer incluyen el antígeno carcinoembrionario (CEA, por sus siglas en inglés); antígenos de cáncer/testículo, tal como NY-ESO-1; mucina-1 (MUC1) tal como Sialil Tn (STn); gangliósidos, tales como GM3 y GD2; proteína p53; y proteína HER2/neu (también conocida como ERBB2). Los antígenos exclusivos de un tipo específico de cáncer incluyen una forma mutante del receptor del factor de crecimiento epidérmico, llamado EGFRvIII; antígenos de diferenciación de melanocitos/melanoma, tal como la tirosinasa, MARTI, gp100, el linaje relacionado con cáncer de testículos (MAGE) y los antígenos relacionados con la tirosinasa; antígeno específico de próstata; antígenos asociados a la leucemia (LAA, por sus siglas en inglés), tal como la proteína de fusión BCR-ABL, Proteína del tumor de Wilms y proteinasa 3; y anticuerpos de idiotipo (Id). Véase, p. ej., Mitchell, 3 Curr. Opin. Investig. Drugs 150 (2002); Dao & Scheinberg, 21 Best Pract. Res. Clin. Haematol. 391 (2008).
Otro enfoque para generar una respuesta inmunitaria contra el cáncer emplea antígenos de microbios que causan o contribuyen a la aparición de cáncer. Estas vacunas se han utilizado contra cánceres, incluido el carcinoma hepatocelular (virus de la hepatitis B, virus de la hepatitis C, Opisthorchis viverrin), linfoma y carcinoma nasofaríngeo (virus de Epstein-Barr), cáncer colorrectal, cáncer de estómago (Helicobacter pylori), cáncer de vejiga (Schisosoma hematobium), leucemia de linfocitos T (virus linfotrópico de linfocitos T humanos), cáncer de cuello uterino (virus del papiloma humano) y otros. Hasta la fecha, se han realizado ensayos clínicos de vacunas dirigidas contra el cáncer de vejiga, tumores cerebrales, cáncer de mama, cáncer de cuello uterino, cáncer de riñón, melanoma, mieloma múltiple, leucemia, cáncer de pulmón, cáncer de páncreas, cáncer de próstata y tumores sólidos. Véanse Pardoll et al., ABELOFF'S CLIN. ONCOL. (4a ed., Churchill Livingstone, Philadelphia 2008); Sioud, 360 Methods Mol. Bio. 277 (2007); Pazdur et al., 30 J. Infusion Nursing 30(3): 173 (2007); Parmiani et al., 178 J. Immunol. 1975 (2007); Lollini et al., 24 Trends Immunol. 62 (2003); Schlom et al., 13 Clin. Cancer Res. 3776 (2007); Banchereau et al., 392 Nature 245 (1998); Finn, 358 New Engl. J. Med. 2704 (2008); Curigliano et al., 7 Exp. Rev. Anticancer Ther. 1225 (2007). El virus de la enfermedad de Marek, un virus del herpes que causa tumores en las aves de corral, se ha manejado durante mucho tiempo para vacunas. Por tanto, los presentes casos abarcan tanto composiciones inmunogénicas contra el cáncer preventivas o profilácticas como vacunas de tratamiento/terapéuticas contra el cáncer.
Las enfermedades proliferativas y los cánceres contemplados incluyen cánceres relacionados con el SIDA, neuroma acústico, leucemia linfocítica aguda, leucemia mieloide aguda, carcinoma adenoquístico, cáncer adrenocortical, metaplasia mieloide angiogénica, alopecia, sarcoma alveolar de las partes blandas, cáncer de ano, angiosarcoma, astrocitoma, ataxia-telangiectasia, carcinoma de células basales (piel), cáncer de vejiga, cánceres óseos, cáncer de intestino, tumores cerebrales y del SNC, cáncer de mama, tumores carcinoides, cáncer de cuello de útero, tumores cerebrales infantiles, cánceres infantiles, leucemia infantil, sarcoma de tejidos blandos infantil, condrosarcoma, coriocarcinoma, leucemia linfocítica crónica, leucemia mieloide crónica, cánceres colorrectales, linfoma cutáneo de linfocitos T, dermatofibrosarcoma protuberans, tumor desmoplásico de células pequeñas y redondas, carcinoma ductal, cánceres endocrinos, cáncer de endometrio, ependimoma, cáncer de esófago, sarcoma de Ewing, cáncer del conducto biliar extrahepático, cáncer ocular, incluyendo, p. ej., melanoma ocular y retinoblastoma, cáncer de las trompas de falopio, anemia de fanconi, fibrosarcoma, cáncer de vesícula biliar, cáncer gástrico, cánceres gastrointestinales, tumor carcinoide gastrointestinal, cánceres urogenitales, tumores de células germinales, enfermedad trofoblástica gestacional, glioma, cánceres ginecológicos, neoplasias hematológicas, leucemia de células pilosas, cáncer de cabeza y cuello, cáncer hepatocelular, cáncer de mama hereditario, enfermedad de Hodgkin, cáncer de cuello uterino relacionado con el virus del papiloma humano, mola hidatiforme, cáncer de la hipofaringe, cáncer de células de los islotes, sarcoma de Kaposi, cáncer de riñón, cáncer de laringe, leiomiosarcoma, leucemia, síndrome de Li-Fraumeni, cáncer de labios, liposarcoma, cáncer de pulmón, linfedema, linfoma, linfoma no Hodgkin, cáncer de mama masculino, tumor rabdoide maligno de riñón, meduloblastoma, melanoma, cáncer de células de Merkel, mesotelioma, cáncer metastásico, cáncer de boca, neoplasia endocrina múltiple, micosis fungoide, síndromes mielodisplásicos, mieloma, trastornos mieloproliferativos, cáncer nasal, cáncer nasofaríngeo, nefroblastoma, neuroblastoma, neurofibromatosis, síndrome de rotura de Nijmegen, cáncer de piel no melanoma, cáncer de pulmón no microcítico (NSCLC), cáncer de la cavidad oral, cáncer de orofaringe, osteosarcoma, ostomía por cáncer de ovario, cáncer de páncreas, cáncer paranasal, cáncer paratiroideo, cáncer de glándula parótida, cáncer de pene, tumores neuroectodérmicos periféricos, cáncer de la hipófisis, policitemia vera, cáncer de próstata, carcinoma de células renales, retinoblastoma, rabdomiosarcoma, síndrome de Rothmund-Thomson, cáncer de las glándulas salivales, sarcoma, schwannoma, síndrome de Sezary, cáncer de piel, cáncer de pulmón microcítico (CPM), cáncer de intestino delgado, sarcoma de tejidos blandos, tumores de la médula espinal, carcinoma de células escamosas (piel), cáncer de estómago, sarcoma sinovial, cáncer testicular, cáncer de timo, cáncer de tiroides, cáncer de células transicionales (vejiga), cáncer de células transicionales (pelvis renal/uréter), cáncer trofoblástico, cáncer de uretra, cáncer del sistema urinario, sarcoma de útero, cáncer de útero, cáncer vaginal, cáncer de vulva, macroglobulinemia de Waldestrom y tumor de Wilms.
En algunos casos, un antígeno para su uso en las composiciones inmunogénicas como se divulga en el presente documento puede incluir antígenos de enfermedades autoinmunitarias, p. ej., pueden ser "autoantígenos". Las enfermedades autoinmunitarias contempladas para el diagnóstico de acuerdo con los ensayos descritos en el presente documento incluyen, pero sin limitación, alopecia areata, espondilitis anquilosante, síndrome antifosfolípido, enfermedad de Addison, anemia aplásica, esclerosis múltiple, enfermedad autoinmunitaria de las glándulas suprarrenales, anemia hemolítica autoinmunitaria, hepatitis autoinmunitaria, ooforitis y orquitis autoinmunitarias, enfermedad de Behcet, penfigoide ampolloso, miocardiopatía, esprúe celiaco-dermatitis, síndrome de fatiga crónica, síndrome desmielinizante inflamatorio crónico (CFIDS, por sus siglas en inglés), polineuropatía inflamatoria crónica, síndrome de Churg-Strauss, penfigoide cicatricial, síndrome CREST, enfermedad de las aglutininas frías, enfermedad de Crohn, dermatitis herpetiforme, lupus discoide, crioglobulinemia mixta esencial, fibromialgia, glomerulonefritis, enfermedad de Graves, enfermedad de Guillain-Barre, tiroiditis de Hashimoto, fibrosis pulmonar idiopática, púrpura trombocitopénica idiopática (ITP, por sus siglas en inglés), nefropatía por IgA, diabetes insulinodependiente (tipo I), liquen plano, lupus, enfermedad de Meniere, enfermedad mixta del tejido conjuntivo, miastenia grave, miocarditis, pénfigo vulgar, anemia perniciosa, poliarteritis nodosa, policondritis, síndromes poliglandulares, polimialgia reumática, polimiositis y dermatomiositis, agammaglobulinemia primaria, cirrosis biliar primaria, psoriasis, fenómeno de Raynaud, síndrome de Reiter, fiebre reumática, artritis reumatoide, sarcoidosis, esclerodermia, síndrome de Sjogren, síndrome del hombre rígido, arteritis de Takayasu, arteritis temporal/arteritis de células gigantes, colitis ulcerosa, uveítis, síndrome de Wegener, vasculitis y vitíligo. En general, es importante evaluar la capacidad de respuesta CMI posible o real en sujetos que tienen o se sospecha que tienen o son susceptibles a una enfermedad autoinmunitaria.
En algunos casos, un antígeno para su uso en las composiciones inmunogénicas como se divulga en el presente documento puede ser un antígeno que está asociado con una enfermedad o afección inflamatoria. Ejemplos de patologías inflamatorias en las que los antígenos pueden ser útiles incluyen, pero sin limitación, acné, angina, artritis, neumonía por aspiración, empiema, gastroenteritis, enterocolitis necrosante, enfermedad inflamatoria pélvica, faringitis, pleuresía, polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica, polirradiculoneuropatía desmielinizante inflamatoria crónica y polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica, entre otras.
En algunos casos, un antígeno puede ser un antígeno intacto (es decir, uno entero o completo) o una porción funcional de un antígeno que comprende más de un epítopo. En algunos casos, un antígeno es una porción funcional peptídica de un antígeno. Por "intacto" en este contexto se entiende que el antígeno es el antígeno de longitud completa, ya que ese polipéptido antigénico se encuentra en la naturaleza. Esto contrasta directamente con el suministro de solamente una pequeña porción o péptido del antígeno. El suministro de un antígeno intacto a una célula permite o facilita la provocación de una respuesta inmunitaria a una gama completa de epítopos del antígeno intacto, en lugar de un solo epítopo peptídico o unos pocos seleccionados. Por consiguiente, los métodos y composiciones inmunogénicas descritos en el presente documento abarcan antígenos intactos asociados con el polímero para una respuesta inmunitaria más sensible y tienen mayor especificidad en comparación con el uso de un antígeno basado en péptidos de un solo epítopo.
Como alternativa, en algunos casos, un antígeno intacto se puede dividir en muchas partes, dependiendo del tamaño del antígeno inicial. Normalmente, cuando un antígeno completo es un polipéptido multimérico, la proteína completa se puede dividir en subunidades y/o dominios donde cada subunidad o dominio individual del antígeno se puede asociar con el polímero de acuerdo con los métodos divulgados en el presente documento. Como alternativa, en algunos casos, un antígeno intacto se puede dividir en fragmentos o partes funcionales, de todo el antígeno, por ejemplo, al menos dos, o al menos 3, o al menos 4, o al menos 5, o al menos 6, o al menos 7, o al menos 8, o al menos 9, o al menos 10, o al menos 11, o al menos 12, o al menos 13, o al menos 15, o al menos 20, o al menos 25, o más de 25 porciones (p. ej., piezas o fragmentos), inclusive, y donde cada fragmento funcional individual del antígeno puede asociarse con el polímero de acuerdo con los métodos divulgados en el presente documento.
La fragmentación o división de un polipéptido antigénico de longitud completa puede ser una división en partes iguales del polipéptido antigénico de longitud completa, o como alternativa, en algunos casos, la fragmentación es asimétrica o desigual. Como ejemplo no limitante, cuando un antígeno se divide en dos fragmentos solapantes, un antígeno se puede dividir en fragmentos de aproximadamente el mismo (igual) tamaño, o como alternativa un fragmento puede ser aproximadamente el 45 % del antígeno total y el otro fragmento puede ser aproximadamente el 65 %. Como ejemplos no limitantes adicionales, un antígeno completo se puede dividir en una combinación de fragmentos de diferentes tamaños, por ejemplo, cuando un antígeno se divide en dos fragmentos, los fragmentos se pueden dividir en aproximadamente el 40 % y aproximadamente el 70 %, o aproximadamente el 45 % y aproximadamente el 65 %; o aproximadamente el 35 % y aproximadamente el 75 %; o aproximadamente el 25 % y aproximadamente el 85 %, ambos inclusive, del antígeno completo. Cualquier combinación de fragmentos solapantes de un antígeno completo de longitud completa se incluye para su uso en la generación de un panel de polipéptidos solapantes de un antígeno. Solamente como ejemplo ilustrativo, cuando un antígeno se divide en 5 porciones, las porciones se pueden dividir por igual (es decir, cada fragmento solapante es aproximadamente del 21 % al 25 % de la longitud total si el antígeno) o de manera desigual (es decir, un antígeno se puede dividir en los siguientes cinco fragmentos solapantes; el fragmento 1 es aproximadamente el 25 %, el fragmento 2 es aproximadamente el 5 %, el fragmento 3 es aproximadamente el 35 %, el fragmento 4 es aproximadamente el 10 % y el fragmento 5 es aproximadamente el 25 % del tamaño del antígeno de longitud completa, siempre que cada fragmento se solape con al menos otro fragmento).
Normalmente, un panel de porciones antigénicas puede cubrir sustancialmente toda la longitud del polipéptido antigénico completo (o intacto). Por consiguiente, en algunos casos, una composición inmunogénica comprende un polímero con muchos fragmentos diferentes y/o solapantes del mismo antígeno intacto. Los fragmentos proteicos solapantes de un antígeno se pueden producir de forma mucho más rápida y económica, y con mayor estabilidad en comparación con el uso de antígenos peptídicos solos. Además, en algunos casos, se prefieren antígenos que son polipéptidos más grandes que los péptidos simples ya que la conformación es importante para el reconocimiento de epítopos, y los polipéptidos o fragmentos antigénicos más grandes proporcionarán un beneficio sobre los fragmentos peptídicos.
Un experto en la materia puede dividir un antígeno completo en proteínas solapantes de un antígeno para crear un panel de polipéptidos del antígeno. Solamente a modo de ejemplo ilustrativo, el antígeno TB1 específico de TB (CFP también conocido como filtrado de cultivo 10 o CFP-10) se puede dividir en, por ejemplo, al menos diecisiete porciones para generar un panel de diecisiete polipéptidos diferentes, comprendiendo cada uno un fragmento de antígeno TB1 (CFP) específico de TB diferente pero solapante. La proteína del filtrado de cultivo (CFP-10) (Genbank AAC83445) es de 10 kDa, fragmento de proteína de 100 restos de aminoácidos de M. tuberculosis. También se conoce como proteína homóloga del antígeno L45 (LHP, por sus siglas en inglés).
Un antígeno diana para su uso en los métodos y composiciones descritos en el presente documento puede expresarse por medios recombinantes y, opcionalmente, puede incluir una etiqueta de afinidad o de epítopo para facilitar la purificación, cuyos métodos son bien conocidos en la técnica. Puede utilizarse síntesis química de un oligopéptido, ya sea libre o conjugado con proteínas transportadoras, para obtener el antígeno de la divulgación. Los oligopéptidos se consideran un tipo de polipéptido. Un antígeno se puede expresar como una fusión con una molécula de afinidad complementaria, p. ej., pero sin limitación, rizavidina o un derivado o fragmento funcional de la misma. Como alternativa, también es posible preparar el antígeno diana y después conjugarlo con una molécula de afinidad complementaria, p. ej., pero sin limitación, rizavidina o un derivado o fragmento funcional de la misma. Los polipéptidos también se pueden sintetizar como estructuras ramificadas tales como las divulgadas en las patentes de Estados Unidos N.° 5.229.490 y N.° 5.390.111. Los polipéptidos antigénicos incluyen, por ejemplo, epítopos de linfocitos B y linfocitos T sintéticos o recombinantes, epítopos de linfocitos T universales y epítopos de linfocitos T mixtos de un organismo o enfermedad y epítopos de linfocitos B de otro.
Un antígeno puede obtenerse mediante métodos recombinantes o síntesis química de polipéptidos, así como el antígeno obtenido de fuentes naturales o extractos, se puede purificar mediante las características físicas y químicas del antígeno, tal como por fraccionamiento o cromatografía. Estas técnicas son bien conocidas en la técnica.
En algunos casos, un antígeno se puede solubilizar en agua, en un disolvente tal como metanol o en un tampón. Los tampones adecuados incluyen, pero sin limitación, solución salina tamponada con fosfato sin Ca2+/Mg2+ (PBS), solución salina normal (NaCl 150 mM en agua) y tampón Tris. El antígeno no soluble en tampón neutro puede solubilizarse en ácido acético 10 mM y después diluirse al volumen deseado con un tampón neutro tal como PBS. En el caso del antígeno soluble solamente a pH ácido, se puede utilizar acetato-PBS a pH ácido como diluyente después de la solubilización en ácido acético diluido. El glicerol puede ser un disolvente no acuoso adecuado para usar las composiciones, métodos y kits descritos en el presente documento.
Normalmente, al diseñar una vacuna proteica contra un patógeno, una proteína extracelular o una expuesta al entorno en un virus es con frecuencia el candidato ideal como componente antigénico de la vacuna. Los anticuerpos generados contra esa proteína extracelular se convierten en la primera línea de defensa contra el patógeno durante la infección. Los anticuerpos se unen a la proteína del patógeno para facilitar la opsonización del anticuerpo y marcar el patógeno para la ingestión y destrucción por un fagocito tal como un macrófago. La opsonización de anticuerpos también puede destruir al patógeno por citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos. El anticuerpo desencadena una liberación de productos de lisis de células tales como monocitos, neutrófilos, eosinófilos y linfocitos citolíticos naturales.
Los antígenos divulgados en el presente documento para su uso en las composiciones como se divulgan en el presente documento, son todos proteínas de tipo silvestre, ya que los restos de aminoácidos, tienen las secuencias que se encuentran en los virus de origen natural y no han sido alteradas por condiciones de crecimiento selectivo o métodos biológicos moleculares.
En un ejemplo, las composiciones inmunogénicas descritas en el presente documento pueden comprender antígenos que son proteínas glicosiladas. En otras palabras, cada uno de los antígenos de interés puede ser una proteína glicosilada. En un ejemplo de las composiciones inmunogénicas como se describe en el presente documento, los antígenos o polipéptidos de fusión de antígenos están glicosilados ligados a O. En otro ejemplo de las composiciones inmunogénicas como se describe en el presente documento, los antígenos o polipéptidos de fusión de antígenos están glicosilados ligados a N. En otro ejemplo más de las composiciones inmunogénicas como se describe en el presente documento, los antígenos o la fusión de antígenos están glicosilados ligados tanto a O como a N. En otros casos, son posibles otros tipos de glucosilaciones, p. ej., C-manosilación. La glicosilación de proteínas se produce predominantemente en células eucariotas. La N-glicosilación es importante para el plegamiento de algunas proteínas eucariotas, proporcionando un mecanismo de modificación cotraduccional y postraduccional que modula la estructura y función de las proteínas de membrana y secretadas. La glicosilación es el proceso enzimático que une los sacáridos para producir glucanos y los fija a proteínas y lípidos. En la N-glicosilación, los glucanos se fijan al nitrógeno amídico de la cadena lateral de la asparagina durante la traducción de la proteína. Los tres sacáridos principales que forman los glucanos son glucosa, manosa y moléculas de N-acetilglucosamina. El consenso de N-glucosilaciones es Asn-Xaa-Ser/Thr, donde Xaa puede ser cualquiera de los aminoácidos conocidos. La glicosilación ligada a O se produce en una etapa posterior durante el procesamiento de proteínas, probablemente en el aparato de Golgi. En la glicosilación ligada a O, se añade N-acetil glucosamina, O-fucosa, O-glucosa y/o N-acetilglucosamina a los restos de serina o treonina. Un experto en la materia puede utilizar un programa informático de bioinformática tal como NetNGlyc 1.0 y programas informáticos de predicción NetOGlyc de la Universidad Técnica de Dinamarca para encontrar los sitios de N y O-glicosilación en un polipéptido en la presente divulgación. El servidor NetNglyc predice sitios de N-glicosilación en proteínas utilizando redes neuronales artificiales que examinan el contexto de secuencia de sequones Asn-Xaa-Ser/Thr. Se puede acceder al programa informático de predicción NetNGlyc 1.0 y NetOGlyc 3.1 en el sitio web de EXPASY. En un ejemplo, la N-glicosilación se produce en el polipéptido antigénico diana del polipéptido de fusión descrito en el presente documento.
Pares de moléculas de afinidad
Como se divulga en el presente documento, en algunos casos, un antígeno está conectado a un polímero mediante pares de afinidad complementaria. Esta conexión del antígeno al polímero está mediada por la conexión del polímero a una primera molécula de afinidad, que asocia una segunda molécula de afinidad (p. ej., complementaria), que está fijada al antígeno. Un ejemplo de par de afinidad complementaria es la proteína de unión biotina/biotina. Ejemplos ilustrativos de pares de afinidad complementaria incluyen, pero sin limitación, proteínas de unión a biotina o proteínas similares a avidina que se unen a la biotina. Por ejemplo, cuando la primera molécula de unión por afinidad es biotina (que se asocia con el polímero), la molécula de afinidad complementaria puede ser una proteína de unión a biotina o una proteína similar a avidina o un derivado de la misma, p. ej., pero sin limitación, avidina, rizavidina, estreptavidina o variantes, derivados o porciones funcionales de las mismas.
En algunos casos, la primera molécula de unión por afinidad es biotina, un derivado de biotina, o un mímico de biotina, por ejemplo, pero sin limitación, amina-PEG3-biotina (((+)-biotinilación-3-6,9-trixaundecanodiamina) o un derivado o fragmento funcional de la misma. Un mimético de biotina específico tiene un motivo peptídico específico que contiene una secuencia de DXaAXbPXc (SEQ ID NO: 39), o CDXaAXbPXcCG (SEQ ID NO: 40), donde Xa es R o L, Xb es S o T, y Xc es Y o W. Estos motivos pueden unirse a avidina y neutravidina, pero estreptavidina. Véase, p. ej., Gaj et al., 56 Prot. Express. Purif. 54 (2006).
El enlace de la primera molécula de afinidad al polímero y la molécula de afinidad complementaria al antígeno puede ser un enlace no covalente o un mecanismo químico, por ejemplo, unión covalente, unión por afinidad, intercalación, enlace coordinado y formación de complejos. La unión covalente proporciona una unión muy estable y es particularmente adecuada para los presentes casos. La unión covalente se puede lograr mediante la condensación directa de las cadenas laterales existentes o mediante la incorporación de moléculas puente externas.
Por ejemplo, en algunos casos, un antígeno puede unirse de forma no covalente a uno de los pares en un par de fijación complementario. En casos alternativos, un antígeno puede unirse o fusionarse de manera covalente a uno de los pares en un par de fijación complementario. Los métodos para la generación de proteínas de fusión son bien conocidos en la técnica y se analizan en el presente documento.
En otros casos, una primera molécula de unión por afinidad se une al polímero mediante un enlace no covalente o mediante un enlace covalente. En algunos casos, se usa un reactivo de reticulación para unir de manera covalente la primera molécula de unión por afinidad al polímero como se divulga en el presente documento.
En algunos casos, la primera molécula de unión por afinidad se asocia con la molécula de afinidad complementaria mediante asociación de enlace no covalente como se conoce en la técnica, incluyendo, pero sin limitación, interacción electroestática, unión al hidrógeno, interacción hidrófoba (es decir, fuerzas de van der Waals), interacciones hidrófilas y otras interacciones no covalentes. También se contemplan otras interacciones de orden superior con residuos intermedios.
En algunos casos, la molécula de afinidad complementaria es un polipéptido relacionado con avidina. En casos específicos, la molécula de afinidad complementaria es rizavidina, tal como rizavidina recombinante. En particular, la rizavidina recombinante es una rizavidina modificada que puede expresarse en E. coli con un alto rendimiento. El rendimiento habitual es> 30 mg por litro de cultivo de E. coli. La rizavidina tiene una menor homología de secuencia con la avidina de huevo (22,4 % de identidad de secuencia y 35,0 % de similitud) en comparación con otras proteínas similares a avidina. El uso de la rizavidina modificada reduce el riesgo de que MAPS induzca una reacción alérgica relacionada con el huevo en un sujeto. Además, el anticuerpo contra la rizavidina modificada recombinante no tiene una reactividad cruzada aparente con la avidina de huevo (y viceversa).
De manera más específica, algunos casos comprenden una rizavidina modificada diseñada para expresión recombinante en E. coli. La secuencia codificante del gen de la rizavidina se optimizó utilizando codones de expresión de E. coli, para evitar cualquier dificultad durante la expresión en E. coli debido a codones raros presentes en el gen original. Para simplificar la construcción, después de un análisis bioinformático y basado en la estructura, se eliminaron los primeros 44 restos de rizavidina de longitud completa, ya que se consideró que eran innecesarios para la estructura y función principales. El plegamiento correcto de la proteína recombinante se mejoró mediante la adición de una secuencia de señal de secreción de E. coli al extremo N de la rizavidina acortada (45-179), para facilitar la translocación de la proteína recombinante al espacio periplásmico de las células de E. coli donde el enlace disulfuro funcionalmente importante en la rizavidina se puede formar correctamente. La rizavidina recombinante modificada forma un dímero, en comparación con proteínas conocidas similares a avidina que forman tetrámeros, mejorando adicionalmente la expresión de la fusión rizavidina-antígeno recombinante como proteína soluble en E. coli.
Además, como se analiza con más detalle en otras partes del presente documento, para mejorar la expresión y solubilidad de los antígenos de fusión en E. coli, se añadió una región enlazadora flexible entre la rizavidina y la proteína antigénica. Adicionalmente, basándose en la bioinformática y el análisis estructural, se clonaron y expresaron diferentes construcciones de antígenos: ya sea antígeno de longitud completa, o el dominio funcional importante, o las proteínas quimeras que comprendían dos antígenos diferentes.
Los pares de afinidad adicionales que pueden ser útiles en los métodos y composiciones descritos en el presente documento incluyen antígeno-anticuerpo, metal/ion-metal/proteína de unión a iones, proteína de unión a lípidos/lípido, proteína de unión a sacáridos/sacárido, aminoácidos/péptido/proteína de unión a aminoácidos o péptidos, sustrato enzimático o inhibidor enzimático, ligando-agonista/receptor, o mimético de biotina. Cuando se utilizan pares de afinidad alternativos, también se pueden emplear medios alternativos para fijar el correspondiente polímero y antígeno, tal como reacciones enzimáticas in vitro en lugar de fusión genética. De manera más específica, el par de afinidad antígeno-anticuerpo proporciona una interacción muy fuerte y específica. El antígeno puede ser cualquier epítopo, incluyendo proteína, péptido, ácido nucleico, lípido, poli/oligosacárido, ion, etc. El anticuerpo puede ser cualquier tipo de inmunoglobulina, o la porción de unión a Ag de una inmunoglobulina, tal como un fragmento Fab. Con respecto a metal/ion-metales/proteína de unión a iones, los ejemplos incluyen Ni NTA frente a proteína etiquetada con histidina, o proteína de unión de Zn frente a Zn. Con respecto a la proteína de unión de lípidos/lípido, los ejemplos incluyen colesterol frente a proteína de unión a colesterol. Con respecto a la proteína de unión de sacáridos/sacárido, los ejemplos incluyen maltosa frente a proteína de unión a maltosa, manosa/glucosa/oligosacárido frente a lectina. Los sustratos/inhibidores enzimáticos incluyen sustratos de una amplia gama de sustancias, incluyendo proteína, péptido, aminoácido, lípido, azúcar o iones. El inhibidor puede ser el análogo del sustrato real que generalmente se puede unir a las enzimas de forma más estrecha e incluso irreversible. Por ejemplo, tripsina frente a inhibidor de tripsina de soja. El inhibidor puede ser una molécula natural o sintética. Con respecto a otro ligando/agonista-receptor, el ligando puede ser de una amplia gama de sustancias, incluyendo proteína, péptido, aminoácido, lípido, azúcar, ion, el agonista puede ser el análogo del ligando real. Los ejemplos incluyen la interacción con LPS frente a TLR4.
Reactivos de reticulación:
Muchos agentes de enlace bivalentes o polivalentes son útiles para acoplar moléculas proteicas a otras moléculas. Por ejemplo, agentes de acoplamiento representativos pueden incluir compuestos orgánicos tales como tioésteres, carbodiimidas, ésteres de succinimida, disocianatos, glutaraldehídos, diazobencenos y hexametilendiaminas. Este listado no pretende ser exhaustivo de las diversas clases de agentes de acoplamiento conocidos en la técnica, sino, más bien, es ilustrativo de los agentes de acoplamiento más comunes. Véanse Killen y Lindstrom, 133 J. Immunol.
1335 (1984); Jansen et al., 62 Imm. Rev. 185 (1982); Vitetta et al.
En algunos casos, los agentes reactivos de reticulación descritos en la bibliografía se incluyen para su uso en los métodos, composiciones inmunogénicas y kits como se divulga en el presente documento. Véase, p. ej., Ramakrishnan, et al., 44 Cancer Res. 201 (1984) (que describe el uso de MBS (éster de M-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida)); Umemoto et al., Patente de Estados Unidos N° 5.030.719 (que describe el uso de un derivado de acetilhidrazida halogenado acoplado a un anticuerpo por medio de un enlazador oligopeptídico). Los enlazadores particulares incluyen: (a) EDC (clorhidrato de 1-etil-3-(3-dimetilamino-propil)carbodiimida); (b) SMPT (4-succinimidiloxicarbonil-alfa-metil-alfa- (2-piridil-ditio)-tolueno (Pierce Chem. Co., Cat. (21558G); (c) SPDP (succinimidil-6 [3-(2-piridilditio) propionamido] hexanoato (Pierce Chem. Co., N.° Cat. 21651G); (d) Sulfo-LC-SPDP (sulfosuccinimidil 6 [3-(2-piridilditio)-propianamida] hexanoato (Pierce Chem. Co. N.° Cat. 2165-G); y (f) sulfo-NHS (N-hidroxisulfo-succinimida: Pierce Chem. Co., N.° Cat 24510) conjugado con EDC.
Los enlaces o agentes de enlace descritos anteriormente contienen componentes que tienen diferentes atributos, conduciendo así a conjugados con diferentes propiedades fisicoquímicas. Por ejemplo, los ésteres sulfo-NHS de carboxilatos de alquilo son más estables que los ésteres sulfo-NHS de carboxilatos aromáticos. Los enlazadores que contienen ésteres NHS son menos solubles que los ésteres sulfo-NHS. Asimismo, el enlazador SMPT contiene un enlace disulfuro impedido estéricamente y puede formar conjugados con mayor estabilidad. Los enlaces disulfuro, son, en general, menos estables que otros enlaces porque el enlace disulfuro se puede escindir in vitro, dando como resultado menos conjugado disponible. Sulfo-NHS, en particular, puede potenciar la estabilidad de los acoplamientos de carbodimida. Los acoplamientos de carbodimida (tal como EDC) cuando se utilizan junto con sulfo-NHS, forman ésteres que son más resistentes a la hidrólisis que la reacción de acoplamiento de carbodimida sola.
Moléculas de reticulación ilustrativas para su uso en los métodos y composiciones inmunogénicas que se divulgan en el presente documento incluyen, pero sin limitación los enumerados en las Tablas 3 y 4.
T l . E m l r i l r h m if n i n l *
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T l 4. E m l r i l r h r if n i n l *
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continuación
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Factor coestimulador
En algunos casos, la composición inmunogénica como se divulga en el presente documento comprende al menos una molécula coestimuladora. En algunos casos, el factor coestimulador está reticulado con el polímero. En algunos casos, el factor coestimulador está asociado al polímero por un par de afinidad complementario similar a como un antígeno está asociado con el polímero. En algunos casos, cuando el par de afinidad complementario que une el factor coestimulador al polímero es el mismo, o un par de afinidad complementario diferente que une el antígeno al polímero.
En algunos casos, se pueden asociar al menos uno, o al menos 2, o al menos 3, o al menos 5, o al menos 10, o al menos 15, o al menos 20, o al menos 50, o al menos 100, o más de aproximadamente 100, ambos inclusive, factores coestimuladores con el polímero como se divulga en el presente documento. En algunos casos, los factores coestimuladores pueden ser el mismo factor coestimulador, o pueden ser varios factores coestimuladores diferentes asociados con el polímero.
En algunos casos, el factor coestimulador es un ligando/agonista de receptores de tipo Toll, p. ej., pero sin limitación, TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, TLR11, etc. En algunos casos, un factor coestimulador es un ligando/agonista de NOD, o un activador/agonista del inflamasoma. Sin desear quedar ligados a la teoría, el inflamasoma es un oligómero multiproteico que consiste en caspasa 1, PYCARD, NALP y, a veces, caspasa 5 o caspasa 11 y promueve la maduración de las citocinas inflamatorias interleucina 1-p e interleucina 18. En algunos casos, un factor coestimulador es una citocina. En algunos casos, una citocina se selecciona del grupo que consiste en: GM-CSF; IL-1a; IL-1P; IL-2; IL-3; IL-4; IL-5; IL-6; IL-7; IL-8; IL-10; IL-12; IL-23; IFN-a; IFN-P; IFN-P; IFN-y; MIP-1a; MIP-1p; TGF-p; TNFa y TNFp. En algunos casos, el factor coestimulador es un adyuvante, que puede estar asociado con el polímero, como se acaba de analizar, o puede añadirse a la composición de MAPS antes o al mismo tiempo que la administración a un sujeto. Los adyuvantes se describen adicionalmente en otra parte en el presente documento.
Producción de proteínas recombinantes
Las proteínas recombinantes pueden expresarse y purificarse convenientemente por una persona experta en la materia, o usando kits disponibles comercialmente, por ejemplo, el sistema de purificación PROBOND™ (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA). En algunos casos, los antígenos recombinantes pueden sintetizarse y purificarse mediante métodos de purificación de proteínas utilizando sistemas de expresión bacteriana, sistemas de expresión de levaduras, sistema de expresión de baculovirus/células de insectos, sistemas de expresión de células de mamífero, o sistemas de plantas o animales transgénicos como los conocen los expertos en la materia.
Las proteínas, polipéptidos y polipéptidos de fusión descritos en el presente documento pueden sintetizarse y purificarse mediante métodos proteicos y moleculares que son bien conocidos por los expertos en la materia. Se utilizan métodos de biología molecular y sistemas de expresión de proteínas heterólogas recombinantes. Por ejemplo, la proteína recombinante se puede expresar en células de bacterias, de mamífero, de insectos, de levaduras o vegetales; o en hospedadores animales o vegetales transgénicos.
En un ejemplo, en el presente documento se divulga un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido de fusión o un polipéptido no de fusión descrito en el presente documento. Pueden utilizarse técnicas de clonación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) convencionales para construir una secuencia codificante de fusión o quimérica que codifique un polipéptido de fusión como se describe en el presente documento. Se puede clonar una secuencia codificante en un vector de clonación de uso general tal como vectores pUC19, pBR322, pBLUESCRIPT® (Stratagene, Inc.) o pCR TOPO® (Invitrogen). El vector recombinante resultante que lleva el ácido nucleico que codifica un polipéptido como se describe en el presente documento puede utilizarse después para manipulaciones biológicas moleculares adicionales tales como mutagénesis dirigida para crear un polipéptido de fusión variante como se describe en el presente documento o puede subclonarse en vectores de expresión de proteínas o vectores víricos para síntesis de proteínas en varios sistemas de expresión de proteínas utilizando células hospedadoras seleccionadas del grupo que consiste en líneas celulares de mamíferos, líneas celulares de insectos, células de levaduras, bacterias y vegetales.
Cada cebador de PCR debe tener al menos 15 nucleótidos solapantes con sus correspondientes plantillas en la región a amplificar. La polimerasa utilizada en la amplificación por PCR debe tener una alta fidelidad tal como la polimerasa PfuULTRA® (Stratagene) para reducir los errores de secuencia durante el proceso de amplificación por PCR. Para facilitar la unión de varios fragmentos de PCR separados, por ejemplo, en la construcción de un polipéptido de fusión, y posteriormente insertando en un vector de clonación, los cebadores de PCR también deben tener sitios de digestión por restricción distintos y exclusivos en sus extremos flanqueantes que no se hibridan con la plantilla de ADN durante la amplificación por PCR. La elección de los sitios de digestión por restricción para cada par de cebadores específicos debe ser tal que la secuencia de ADN que codifica el polipéptido de fusión esté en marco y codifique el polipéptido de fusión de principio a fin sin codones de parada. Al mismo tiempo, los sitios de digestión por restricción elegidos no deben encontrarse dentro de la secuencia de ADN codificante del polipéptido de fusión. La secuencia de ADN codificante del polipéptido previsto se puede unir en el vector de clonación pBR322 o en uno de sus derivados, para amplificación, verificación de la fidelidad y autenticidad de la secuencia codificante quimérica, sustituciones/o mutagénesis dirigida específica para mutaciones y sustituciones específicas de aminoácidos en el polipéptido.
Como alternativa, la secuencia de ADN codificante del polipéptido puede clonarse por PCR en un vector usando, por ejemplo, el método de clonación TOPO® que comprende vectores TA asistidos por topoisomerasa tal como pCR®-TOPO, pCR®-Blunt II-TOPO, pENTR/D-TOPO® y pENTR/SD/D-TOPO®.(Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA). Tanto pENTR/D-TOPO® como pENTR/SD/D-TOPO® son vectores de entrada TOPO direccionales que permiten la clonación de la secuencia de ADN en la orientación 5 '^3 ' en un vector de expresión GATEWAY®. La clonación direccional en la orientación 5 '^3 ' facilita la inserción unidireccional de la secuencia de ADN en un vector de expresión de proteínas de manera que el promotor está cadena arriba del codón de inicio 5' ATG de la secuencia de a Dn que codifica el polipéptido de fusión, permitiendo la expresión de proteínas impulsada por promotores. El vector recombinante que lleva la secuencia de a Dn codificante del polipéptido de fusión se puede transfectar y propagar en E. coli de clonación regular tal como células XLIBlue, SURE® (St Ra TAGENE®) y TOP-10 (Invitrogen).
Un experto en la materia podría clonar y unir la región codificante del antígeno de interés con la región codificante de la molécula de afinidad complementaria para construir una secuencia quimérica codificante de un polipéptido de fusión que comprende el antígeno o un fragmento del mismo y la molécula de afinidad complementaria de un derivado del mismo usando sondas de oligonucleótidos especialmente diseñadas y metodologías de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) que son bien conocidas en la técnica. Un experto en la materia también podría clonar y unir la secuencia quimérica codificante de una proteína de fusión en un vector seleccionado, p. ej., un vector de expresión en bacterias, un vector de expresión en insectos o un vector de expresión de baculovirus. Las secuencias codificantes del antígeno y el polipéptido del antígeno diana o fragmento del mismo deben unirse en marco y la secuencia codificante quimérica debe unirse cadena abajo del promotor, y entre el promotor y el terminador de la transcripción. Posteriormente a eso, el vector recombinante se transfecta en E. coli de clonación regular, tal como XL 1 Blue. Después se selecciona E. coli recombinante que alberga el ADN de vector de transferencia mediante resistencia a antibióticos para eliminar cualquier E. coli que albergue ADN plasmídico no recombinante. Se cultivan E. coli transformantes seleccionadas y el ADN del vector recombinante se puede purificar posteriormente para la transfección en células de S. frugiperda.
En algunos casos, los antígenos como se divulga en el presente documento pueden comprender un péptido señal para la translocación al espacio periplásmico de bacterias. El péptido señal también se llama péptido líder en el extremo N, que puede o no escindirse después de la translocación a través de la membrana. Un ejemplo de un péptido señal es MKKIWLALAGLVLAFSASA (SEQ ID NO: 2) como se divulga en el presente documento. Otra secuencia señal es MAPFEPLASGILLLLWLIa Ps RA (SEQ ID No : 7). Otros ejemplos de péptidos señal se pueden encontrar en SPdb, una base de datos de péptidos de señal, que se encuentra en el sitio web mundial de "proline.bic.nus.edu.sg/spdb/".
En algunos casos, cuando el antígeno se fusiona con una proteína de unión a biotina, la secuencia señal puede ubicarse en el extremo N de la proteína de unión a biotina. En algunos casos, la secuencia señal se escinde de la proteína de unión a biotina después de la translocación al espacio periplásmico de E. coli.
En algunos casos, cuando el antígeno se fusiona con una proteína de afinidad complementaria, la secuencia señal puede ubicarse en el extremo N de la proteína de afinidad complementaria. Por ejemplo, si un antígeno se fusiona con una proteína similar a avidina, la secuencia señal puede ubicarse en el extremo N de la proteína de afinidad complementaria. En algunos casos, la secuencia señal se escinde de la proteína de afinidad complementaria antes de que la proteína de afinidad complementaria se asocie con la primera molécula de afinidad.
En algunos casos, un antígeno y/o una proteína de afinidad complementaria como se describe en el presente documento carece de una secuencia señal.
Los polipéptidos descritos en el presente documento se pueden expresar en varias células de expresión hospedadoras, p. ej., bacterias, levaduras, células de mamífero, células de insecto, células vegetales, células de algas tales como Chlamydomonas, o en sistemas de expresión sin células. En algunos casos, el ácido nucleico puede subclonarse a partir del vector de clonación en un vector de expresión recombinante que sea apropiado para la expresión del polipéptido de fusión en células de bacterias, mamíferos, insectos, levaduras, o vegetales o en un sistema de expresión sin células tal como un sistema de expresión de reticulocitos de conejo. Algunos vectores están diseñados para transferir ácidos nucleicos codificantes para su expresión en células de mamífero, células de insecto y levadura en una sola reacción de recombinación. Por ejemplo, algunos de los vectores de destino GATEWAY® (Invitrogen) están diseñados para la construcción de baculovirus, adenovirus, virus adenoasociado (AAV, por sus siglas en inglés), retrovirus y lentivirus, que, al infectar sus correspondientes células hospedadoras, permiten la expresión heteróloga de polipéptidos de fusión en las células hospedadoras apropiadas. La transferencia de un gen a un vector de destino se logra en tan solo dos etapas de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Existen vectores de expresión GATEWAY® para la expresión de proteínas en células de insectos, células de mamíferos y levadura. Tras la transformación y selección en E. coli, el vector de expresión está listo para su uso para la expresión en el hospedador apropiado.
Ejemplos de otros vectores de expresión y células hospedadoras son los vectores pcDNA3.1 (Invitrogen) y pCINEO (Promega) basados en el promotor de CMV potente para la expresión en líneas celulares de mamíferos tal como CHO, COS, HEK-293, Jurkat y MCF-7; vectores de vectores adenovíricos de replicación incompetente vector pADENO-X™, pAd5F35, pLP-ADENO™-X-CMV (CLONTECH®), pAd/CMV/V5-DEST, pAd-DEST (Invitrogen) para la transferencia y expresión génica mediada por adenovirus en células de mamífero; vectores de retrovirus pLNCX2, pLXSN y pLAPSN para su uso con el sistema RETRO-X™ de Clontech para la transferencia génica mediada por retrovirus y expresión en células de mamífero; pLenti4/V5-DEST™, pLenti6/V5-DEST™ y pLenti6.2/V5-GW/lacZ (Invitrogen) para la transferencia de genes mediada por lentivirus y la expresión en células de mamífero; vectores de expresión de virus asociados a adenovirus tales como vector pAAV-MCS, pAAV-IRES-hrGFP y pAAV-RC (Stratagene) para la transferencia de genes mediada por virus adenoasociados y la expresión en células de mamífero; baculovirus BACpak6 (Clontech) y pFASTBAC™ HT (Invitrogen) para la expresión en las líneas celulares de insecto S. frugiperda 9 (Sf9), Sf1 1, Tn-368 y BTI-TN-5B4-1; pMT/BiP/V5-His (Invitrogen) para la expresión en células de Drosophila schneider S2; vectores de expresión en Pichia pPICZa, pPICZ, pFLDa y pFLD (Invitrogen) para la expresión en P. pastoris y vectores pMETa y pMET para la expresión en P. methanolica; vectores pYES2/GS y pYD1 (Invitrogen) para expresión en levadura S. cerevisiae.
Se describen avances recientes en la expresión a gran escala de proteínas heterólogas en Chlamydomonas reinhardtii. Griesbeck., 34 Mol. Biotechnol. 213 (2006); Fuhrmann, 94 Methods Mol Med. 191 (2006). Se insertan secuencias codificantes heterólogas extrañas en el genoma del núcleo, cloroplasto y mitocondrias por recombinación homóloga. El vector de expresión en cloroplastos p64 que lleva el marcador seleccionable de cloroplasto más versátil, aminoglucósido adenil transferasa (aadA), que confieren resistencia a espectinomicina o estreptomicina, se puede utilizar para expresar proteínas extrañas en el cloroplasto. El método de pistola genética biolística se puede utilizar para introducir el vector en las algas. Tras su entrada en los cloroplastos, el ADN extraño se libera a partir de las partículas de la pistola genética y se integra en el genoma del cloroplasto mediante recombinación homóloga.
También se divulgan moléculas de afinidad complementarias fusionadas a un antígeno. En algunos casos, la construcción de fusión también puede comprender opcionalmente etiquetas de purificación y/o péptidos señal de secreción. Estas proteínas de fusión se pueden producir mediante cualquier método convencional. Por ejemplo, para la producción de una línea celular estable que exprese una proteína de fusión antígeno-molécula de afinidad complementaria, los ácidos nucleicos antigénicos amplificados por PCR pueden clonarse en el sitio de restricción de un derivado de un vector de expresión de mamíferos. Por ejemplo, KA, que es un derivado de pcDNA3 (Invitrogen), contiene un fragmento de ADN que codifica una etiqueta de hemaglutinina (HA) del virus de la gripe. Como alternativa, se pueden utilizar derivados de vectores que codifican otras etiquetas, tal como etiquetas c-myc o poli histidina. La construcción de expresión de fusión de la fusión antígeno-molécula de afinidad complementaria puede transfectarse junto con un plásmido marcador, en una línea celular de mamífero apropiada (p. ej., células COS, HEK293T o NIH 3T3) utilizando, por ejemplo, LIPOFECTAMINE™ (Gibco-BRL, Gaithersburg, Md ) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, o cualquier otra técnica de transfección adecuada conocida en la técnica. Marcadores de transfección adecuados incluyen, por ejemplo, plásmidos de expresión de p-galactosidasa o proteína verde fluorescente (GFP) o cualquier plásmido que no contenga el mismo marcador detectable que la proteína de fusión antígeno-molécula de afinidad complementaria. Las células que expresan la proteína de fusión se pueden clasificar y cultivar adicionalmente, o se puede purificar la proteína de fusión antígeno-molécula de afinidad complementaria etiquetada. En algunos casos, una proteína de fusión antígeno-molécula de afinidad complementaria se amplifica con un péptido señal. En casos alternativos, un ADNc que codifica una proteína de fusión antígeno-molécula de afinidad complementaria puede amplificarse sin el péptido señal y subclonarse en un vector (pSecTagHis) que tiene un péptido señal de secreción fuerte. En otro ejemplo, la proteína de fusión antígenomolécula de afinidad complementaria puede tener una etiqueta de fosfatasa alcalina (AP, por sus siglas en inglés) o una etiqueta de histidina (His) para la purificación. Cualquier método conocido por los expertos en la materia para la purificación de proteínas del antígeno y/o la proteína de fusión antígeno-molécula de afinidad complementaria se incluye para su uso en los métodos divulgados en el presente documento.
En algunos casos, cualquiera de los polipéptidos descritos en el presente documento se produce mediante expresión a partir de un vector de baculovirus recombinante. En otro ejemplo, cualquiera de los polipéptidos descritos en el presente documento se expresa por una célula de insecto. En otro ejemplo más, cualquiera de los polipéptidos descritos en el presente documento se aísla de una célula de insecto. Existen varios beneficios de la expresión de proteínas con baculovirus en células de insectos, incluyendo altos niveles de expresión, facilidad de ampliación, producción de proteínas con modificaciones postraduccionales y crecimiento celular simplificado. Las células de insectos no necesitan CO2 para el crecimiento y se pueden adaptar fácilmente al cultivo en suspensión de alta densidad para la expresión a gran escala. Muchas de las rutas de modificación postraduccionales presentes en los sistemas de mamíferos también se utilizan en células de insectos, permitiendo la producción de proteína recombinante que es antigénica, inmunogénica y funcionalmente similar a la proteína de mamífero natural.
Los baculovirus son virus de ADN en la familia Baculoviridae. Se sabe que estos virus tienen una gama estrecha de hospedadores que se limita principalmente a especies de insectos lepidópteros (mariposas y polillas). El baculovirus virus de la poliedrosis nuclear Autographa californica (AcNPV, por sus siglas en inglés), que se ha convertido en el prototipo de baculovirus, se replica eficazmente en células de insectos cultivadas susceptibles. El AcNPV tiene un genoma de ADN circular cerrado de doble hebra de aproximadamente 130.000 pares de bases y está bien caracterizado con respecto a la gama de hospedadores, biología molecular y genética. El sistema de vectores de expresión en baculovirus (BEVS, por sus siglas en inglés) es un método seguro y rápido para la producción abundante de proteínas recombinantes en células de insectos e insectos. Los sistemas de expresión en baculovirus son sistemas potentes y versátiles para la expresión de proteínas recombinantes de alto nivel, en células de insectos. Se han informado niveles de expresión de hasta 500 mg/l utilizando el sistema de expresión de baculovirus, lo que lo convierte en un sistema ideal para la expresión de alto nivel. Los baculovirus recombinantes que expresan genes extraños se construyen mediante recombinación homóloga entre ADN de baculovirus y plásmidos quiméricos que contienen la secuencia génica de interés. Los virus recombinantes se pueden detectar en virtud de su morfología de placa distinta y se pueden purificar en placa hasta homogeneidad.
Las proteínas de fusión recombinantes descritas en el presente documento se pueden producir en células de insectos que incluyen, pero sin limitación, células derivadas de la especie de lepidópteros S. frugiperda. Otras células de insectos que pueden infectarse por baculovirus, tales como las de la especie Bombyx mori, Gallería mellanoma, Trichplusia ni, o Lamanthria dispar, también se puede utilizar como un sustrato adecuado para producir proteínas recombinantes descritas en el presente documento. La expresión en baculovirus de proteínas recombinantes es bien conocida en la técnica. Véanse las Patentes de Estados Unidos N.° 4.745.051; n.° 4.879.236; n.° 5.179.007; n.° 5.516.657; n.° 5.571.709; n.° 5.759.809. Los expertos en la materia entenderán que el sistema de expresión no se limita a un sistema de expresión en baculovirus. Lo importante es que el sistema de expresión dirige la N-glicosilación de proteínas recombinantes expresadas. Las proteínas recombinantes descritas en el presente documento también se pueden expresar en otros sistemas de expresión tales como los virus Entomopox (los poxvirus de insectos), virus de la poliedrosis citoplasmática (CPV, por sus siglas en inglés), y la transformación de células de insectos con la expresión constitutiva del gen o genes recombinantes. Un buen número de vectores de transferencia de baculovirus y las correspondientes células hospedadoras debidamente modificadas están disponibles comercialmente, por ejemplo, pAcGP67, pAcSECG2TA, pVL1392, pVL1393, pAcGHLT y pAcAB4 de BD Biosciences; pBAC-3, pBAC-6, pBACgus-6 y pBACsurf-1 de NOVAGEN®, y pPolh-FLAG y pPolh-MAT de SIGMA ALDRICH®.
La región entre el promotor y el terminador transcripcional puede tener múltiples sitios de digestión con enzimas de restricción para facilitar la clonación de la secuencia codificante extraña, en este ejemplo, la secuencia de ADN codificante de un polipéptido antigénico y una molécula de afinidad complementaria. Se pueden incluir secuencias adicionales, p. ej., péptidos señal y/o secuencias codificantes de etiquetas, tal como His-tag, etiqueta MAT, etiqueta FLAG, secuencia de reconocimiento de enterocinasa, señal de secreción de melitina de abeja, beta-galactosidasa, etiqueta de glutatión S-transferasa (GST) cadena arriba del MCS para facilitar la secreción, identificación, inserción adecuada, selección positiva de virus recombinante y/o purificación de la proteína recombinante.
En algunos casos, la proteína de fusión puede comprender una secuencia señal en el extremo N como se divulga en el presente documento. En algunos casos, la secuencia señal está fijada al extremo N de la molécula de afinidad complementaria como se divulga en el presente documento.
En algunos casos, un polipéptido de fusión como se describe en el presente documento tiene un péptido espaciador, p. ej., un espaciador de 14 restos (GSPGISGGGGGILE) (SEQ ID NO: 41) que separa el antígeno de la molécula de afinidad complementaria. La secuencia codificante de un espaciador tan corto se puede construir hibridando un par complementario de cebadores. Un experto en la materia puede diseñar y sintetizar oligonucleótidos que codificarán el espaciador seleccionado. Los péptidos espaciadores generalmente deben tener restos de aminoácidos no polares, tales como glicina y prolina.
Se pueden utilizar técnicas convencionales conocidas por los expertos en la materia para introducir mutaciones (para crear sustituciones de aminoácidos en una secuencia polipeptídica de antígeno del polipéptido de fusión descrito en el presente documento, p. ej., en el antígeno en la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de fusión descrito en el presente documento, incluyendo, por ejemplo, mutagénesis dirigida y mutagénesis mediada por PCR. Preferentemente, el polipéptido de fusión variante tiene sustituciones de menos de 50 aminoácidos, sustituciones de menos de 40 aminoácidos, sustituciones de menos de 30 aminoácidos, sustituciones de menos de 25 aminoácidos, sustituciones de menos de 20 aminoácidos, sustituciones de menos de 15 aminoácidos, sustituciones de menos de 10 aminoácidos, sustituciones de menos de 5 aminoácidos, sustituciones de menos de 4 aminoácidos, sustituciones de menos de 3 aminoácidos, o sustituciones de menos de 2 aminoácidos, ambos inclusive, con respecto a los polipéptidos de fusión descritos en el presente documento.
También se pueden realizar ciertas mutaciones silenciosas o neutrales sin sentido en la secuencia codificante de ADN que no cambian la secuencia de aminoácidos codificada o la capacidad de promover el suministro transmembrana. Estos tipos de mutaciones son útiles para optimizar el uso de codones o para mejorar la expresión y producción de proteínas recombinantes.
Puede utilizarse mutagénesis dirigida específica de una secuencia codificante para el polipéptido de fusión en un vector para crear mutaciones y sustituciones de aminoácidos específicas. La mutagénesis dirigida se puede llevar a cabo usando, p. ej., el kit de mutagénesis dirigida QUICKCHANGe® de Stratagene de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
En un ejemplo, en el presente documento se describen vectores de expresión que comprenden la secuencia de ADN codificante de los polipéptidos descritos en el presente documento para la expresión y purificación del polipéptido recombinante producido a partir de un sistema de expresión de proteínas utilizando células hospedadoras seleccionadas de, p. ej., células de bacterias, mamíferos, insectos, levadura o vegetales. El vector de expresión debe tener los elementos reguladores necesarios 5' cadena arriba y 3' cadena abajo tales como secuencias promotoras, reconocimiento de ribosomas y caja TATA, y la secuencia de terminación de la transcripción 3' UTR AAUAAA para una transcripción y traducción génicas eficaces en su correspondiente célula hospedadora. El vector de expresión es, preferentemente, un vector que tiene el promotor de la transcripción seleccionado de un grupo que consiste en el promotor de CMV (citomegalovirus), promotor del RSV (virus del sarcoma de Rous), el promotor de pactina, promotor de SV40 (virus de simio 40) y promotor de creatina cinasa muscular, y el terminador de la transcripción seleccionado de un grupo que consiste en terminador BGH y poli(A) se SV40; más preferentemente, un vector de expresión que tiene la secuencia promotora/potenciadora temprana de citomegalovirus y la secuencia líder/intrón tripartita de adenovirus y que contiene el origen de replicación y la secuencia poli (A) de SV40. El vector de expresión puede tener regiones codificantes adicionales, tal como las que codifican, por ejemplo, 6X-histidina, V5, tiorredoxina, glutatión-S-transferasa, c-Myc, VSV-G, HSV, FLAG, péptido de unión a maltosa, péptido de unión a metales, HA y señales de "secreción" (melitina de abeja, factor □ a, PHO, Bip), que pueden incorporarse en el polipéptido de fusión expresado. Además, puede haber sitios de digestión enzimática incorporados después de estas regiones codificantes para facilitar su eliminación enzimática si no son necesarias. Estos ácidos nucleicos adicionales son útiles para la detección de la expresión de polipéptidos de fusión, para la purificación de proteínas mediante cromatografía de afinidad, para la solubilidad potenciada de la proteína recombinante en el citoplasma del hospedador, y/o para secretar el polipéptido de fusión expresado en el medio de cultivo o el esferoplasto de las células de levadura. La expresión del polipéptido de fusión puede ser constitutiva en las células hospedadoras o puede inducirse, p. ej., con sulfato de cobre, azúcares tales como galactosa, metanol, metilamina, tiamina, tetraciclina, infección con baculovirus e (isopropil-beta-D-tiogalactopiranósido) IPTG, un análogo sintético estable de lactosa.
En otro ejemplo, el vector de expresión que comprende un polinucleótido descrito en el presente documento es un vector vírico, tales como adenovirus, virus adenoasociado (AAV, por sus siglas en inglés), vectores de retrovirus y lentivirus, entre otros. Los virus recombinantes proporcionan un sistema versátil para estudios de expresión génica y aplicaciones terapéuticas.
En algunos casos, los polipéptidos de fusión descritos en el presente documento se expresan a partir de una infección vírica de células de mamífero. Los vectores víricos pueden ser, por ejemplo, adenovirus, virus adenoasociado (AAV, por sus siglas en inglés), retrovirus y lentivirus. Se presenta un sistema simplificado para generar adenovirus recombinantes en He et al., 95 PNAS 2509 (1998). El gen de interés se clona primero en un vector lanzadera, p. ej., pAdTrack-CMV. El plásmido resultante se linealiza mediante la digestión con endonucleasa de restricción. Pmel, y posteriormente se transforma de manera conjunta en células de E. coli. BJ5183 con un plásmido de estructura adenovírica, por ejemplo, pADEASY-1 del sistema de vectores adenovíricos ADEASY™ de Stratagene. Los vectores de adenovirus recombinantes se seleccionan por su resistencia a la kanamicina y la recombinación se confirma mediante análisis de endonucleasas de restricción. Por último, el plásmido recombinante linealizado se transfecta en líneas celulares de empaquetamiento de adenovirus, por ejemplo, células HEK 293 (células de riñón embrionarias humanas transformadas con E1) o 911 (células retinianas embrionarias humanas transformadas con E1). Fallaux, et al. 7 Human Gene Ther. 215 (1996). Los adenovirus recombinantes se generan dentro de las células HEK 293.
El lentivirus recombinante tiene la ventaja de suministrar y expresar polipéptidos de fusión en células de mamífero en división y no en división. El lentivirus basado en VIH-1 puede transducir eficazmente una gama de hospedadores más amplia que los sistemas retrovíricos basados en el virus de la leucemia de Moloney (MoMLV, por sus siglas en inglés). La preparación del lentivirus recombinante se puede lograr usando, por ejemplo, los vectores pLenti4/V5-DEST™, pLenti6/V5-DEST™ o pLenti junto con los sistemas de expresión lentivíricos v IrAPOWER ™ de Invitrogen, Inc.
Los vectores de virus adenoasociados recombinantes (rAAV, por sus siglas en inglés) son aplicables a una amplia gama de células hospedadoras que incluyen muchas líneas celulares o tejidos humanos y no humanos diferentes. Los rAAV son capaces de transducir una amplia gama de tipos de células y la transducción no depende de la división activa de la célula hospedadora. Se obtienen fácilmente títulos altos, > 108 partícula vírica/ml, en el sobrenadante y 1011-1012 partícula vírica/ml con mayor concentración. El transgén está integrado en el genoma del hospedador, por lo que la expresión es estable y a largo plazo.
La preparación a gran escala de vectores AAV se realiza mediante una transfección conjunta de tres plásmidos de una línea celular de empaquetamiento: vector AAV que lleva el ácido nucleico codificante, vector AAV RC que contiene genes rep y cap de AAV, y el plásmido auxiliar de adenovirus pDF6, en placas de 50 x 150 mm de células 293 subconfluentes. Las células se recogen tres días después de la transfección y los virus se liberan mediante tres ciclos de congelación-descongelación o mediante sonicación.
Los vectores AAV se pueden purificar mediante dos métodos diferentes dependiendo del serotipo del vector. El vector AAV2 se purifica mediante el método de purificación en columna de flujo por gravedad de una sola etapa en función de su afinidad por heparina. Auricchio et. al., 12 Human Gene Ther. 71 (2001); Summerford & Samulski, 72 J. Virol. 1438 (1998); Summerford & Samulski, 5 Nat. Med. 587 (1999). Los vectores AAV2/1 y AAV2/5 se purifican actualmente mediante tres gradientes secuenciales de CsCl.
Sin desear quedar ligados a la teoría, cuando las proteínas se expresan por una célula, incluyendo una célula bacteriana, las proteínas se dirigen a una parte particular de la célula o se secretan a partir de la célula. Por tanto, el direccionamiento de proteínas o la clasificación de proteínas es el mecanismo biológico por el cual una célula transporta proteínas a las posiciones apropiadas en la célula o fuera de ella. Las dianas de clasificación pueden ser el espacio interior de un orgánulo, cualquiera de varias membranas interiores, la membrana externa de la célula, o su exterior a través de la secreción. Este proceso de suministro se lleva a cabo basándose en la información contenida en la propia proteína. La clasificación correcta es fundamental para la célula; los errores pueden provocar enfermedades.
Con algunas excepciones, las bacterias carecen de orgánulos unidos a la membrana como los que se encuentran en eucariotas, pero pueden ensamblar proteínas en varios tipos de inclusiones, tales como vesículas de gas y gránulos de almacenamiento. Además, dependiendo de la especie de bacteria, las bacterias pueden tener una sola membrana plasmática (bacterias grampositivas), o tanto una membrana interna (plasmática) como una membrana de pared celular externa, con un espacio acuoso entre las dos llamado periplasma (bacterias gramnegativas). Las proteínas pueden secretarse al entorno, en función de si hay o no membrana exterior. El mecanismo básico de la membrana plasmática es similar al eucariota. Además, las bacterias pueden dirigirse a proteínas dentro o a través de la membrana externa. Los sistemas para secretar proteínas a través de la membrana externa bacteriana pueden ser bastante complejos y desempeñar funciones clave en la patogénesis. Estos sistemas pueden describirse como secreción de tipo I, secreción de tipo II, etc.
En la mayoría de las bacterias Gram positivas, determinadas proteínas se dirigen a la exportación a través de la membrana plasmática y la posterior fijación covalente a la pared celular bacteriana. Una enzima especializada, sortasa, escinde la proteína diana en un sitio de reconocimiento característico cerca del extremo C de la proteína, tal como un motivo LPXTG (SEQ ID NO: 42) (donde X puede ser cualquier aminoácido), después transfiere la proteína a la pared celular. Se propone que un sistema análogo a sortasa/LPXTG, que tiene el motivo PEP-CTERM (SEQ ID NO: 43), denominado exosortasa/PEP-CTERM, existe en una amplia gama de bacterias Gramnegativas.
Las proteínas con señales de direccionamiento en el extremo N apropiadas se sintetizan en el citoplasma y después se dirigen a una ruta de transporte de proteínas específica. Durante, o poco después de su translocación a través de la membrana citoplasmática, la proteína se procesa y se pliega en su forma activa. Después, la proteína translocada se conserva en el lado periplásmico de la célula o se libera al entorno. Debido a que los péptidos señal que dirigen las proteínas a la membrana son determinantes clave para la especificidad de la vía de transporte, estos péptidos señal se clasifican de acuerdo con la vía de transporte a la que dirigen las proteínas. La clasificación del péptido señal se basa en el tipo de peptidasa señal (SPasa) que es responsable de la eliminación del péptido señal. La mayoría de las proteínas exportadas se exportan del citoplasma a través de la "vía secretora (Sec)" general. Los factores de virulencia más conocidos (p. ej., exotoxinas de Staphylococcus aureus, antígeno protector de Bacillus anthracis, listeriolisina O de Listeria monocytogenes) que son secretados por patógenos grampositivos tienen un péptido señal en el extremo N típico que los conduciría a la vía Sec. Las proteínas que se secretan a través de esta vía se traslocan a través de la membrana citoplasmática en un estado desplegado. El procesamiento y el plegamiento posteriores de estas proteínas tienen lugar en el entorno de la pared celular en el lado trans de la membrana. Además del sistema Sec, algunas bacterias Grampositivas también contienen el sistema Tat que es capaz de traslocar proteínas plegadas a través de la membrana. Las bacterias patógenas pueden contener determinados sistemas de exportación para fines especiales que están específicamente implicados en el transporte de solamente unas pocas proteínas. Por ejemplo, se han identificado varios grupos de genes en micobacterias que codifican proteínas que se secretan al entorno a través de vías específicas (ESAT-6) y son importantes para la patogénesis de las micobacterias. Los transportadores específicos del casete de unión a ATP (ABC) dirigen la exportación y el procesamiento de pequeños péptidos antibacterianos llamados bacteriocinas. Los genes de las endolisinas que son responsables del inicio de la lisis bacteriana con frecuencia se encuentran cerca de los genes que codifican proteínas similares a holinas, lo que sugiere que estas holinas son responsables de la exportación de endolisina a la pared celular. Wooldridge, BACT. SECRETED PROTS: SECRETORY MECHS. & ROLE IN PATHOGEN. (Caister Academic Press, 2009)
En algunos casos, la secuencia señal útil en la presente divulgación es la secuencia señal OmpA, sin embargo, cualquier secuencia señal comúnmente conocida por los expertos en la materia que permita el transporte y la secreción de agentes antimicrobianos fuera de la célula infectada con bacteriófagos se incluye para su uso en la presente divulgación.
La secuencia señal que dirige la secreción de proteínas de las células bacterianas es bien conocida en la técnica, por ejemplo, como se divulga en la solicitud internacional WO 2005/071088. Por ejemplo, se pueden utilizar algunos de los ejemplos no limitantes de péptido señal que mostrados en la Tabla 5, que se pueden unir al extremo amino terminal o carboxilo terminal del péptido antimicrobiano (Amp) o del polipéptido antimicrobiano para expresarse por el bacteriófago modificado por ingeniería con agente antimicrobiano, p. ej., bacteriófago modificado por ingeniería con AMP. La fijación puede ser mediante fusión o composición de quimera con antígeno seleccionado o proteína de fusión antígeno-molécula de afinidad complementaria que da como resultado la secreción de la bacteria infectada con el bacteriófago modificado por ingeniería con agente antimicrobiano, por ejemplo, bacteriófago modificado por ingeniería con AMP.
Tabla 5: Ejemplo de péptidos señal para dirigir la secreción de una proteína o antígeno peptídico o proteína de fusión antí eno-molécula de afinidad com lementaria de una célula bacteriana
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continuación
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Los polipéptidos como se describe en el presente documento, p. ej., los antígenos o la proteína de fusión antígenomolécula de afinidad complementaria pueden expresarse y purificarse mediante varios métodos conocidos por los expertos en la materia, por ejemplo, los polipéptidos de fusión descritos en el presente documento pueden purificarse a partir de cualquier sistema de expresión adecuado. Los polipéptidos de fusión se pueden purificar hasta una pureza sustancial mediante técnicas convencionales, incluyendo la precipitación selectiva con sustancias tales como sulfato de amonio; cromatografía en columna, métodos de inmunopurificación y otros; que son bien conocidos en la técnica. Véase, p. ej., Scopes, PROTEIN PURIFICATION: PRINCIPLES & PRACTICE (1982); la patente de Estados Unidos n.° 4.673.641.
Se pueden emplear varios procedimientos cuando se purifican proteínas recombinantes. Por ejemplo, las proteínas que tienen propiedades de adhesión molecular establecidas pueden fusionarse de manera reversible a la proteína de elección. Con el ligando apropiado, la proteína puede adsorberse selectivamente en una columna de purificación y después liberarse de la columna en una forma relativamente pura. Después, la proteína fusionada se elimina mediante actividad enzimática. Por último, la proteína de elección se puede purificar usando columnas de afinidad o inmunoafinidad.
Después de que la proteína se exprese en las células hospedadoras, las células hospedadoras se pueden lisar para liberar la proteína expresada para su purificación. Los métodos de lisis de las diversas células hospedadoras se describen en "Sample Preparation-Tools for Protein Research" de EMD Bioscience y en Current Protocols in Protein Sciences (CPPS). Un ejemplo de método de purificación es la cromatografía por afinidad, tal como el cromatógrafo de afinidad de iones metálicos que utiliza resinas de afinidad de níquel, cobalto o zinc para polipéptidos de fusión marcados con histidina. Los métodos para purificar proteínas recombinantes etiquetadas con histidina se describen por Clontech utilizando su resina de cobalto TALON® y por NOVAGEN® en su manual del sistema pET, 10a edición. Otra estrategia de purificación preferida es la cromatografía por inmunoafinidad, por ejemplo, la resina conjugada con anticuerpo anti-myc puede utilizarse para purificar por afinidad polipéptidos de fusión etiquetados con myc. Cuando están presentes secuencias de reconocimiento de proteasas apropiadas, los polipéptidos de fusión se pueden escindir de la etiqueta de histidina o myc, liberando el polipéptido de fusión de la resina de afinidad mientras que las etiquetas de histidina y las etiquetas myc se dejan fijadas a la resina de afinidad.
Las técnicas convencionales de separación de proteínas para purificar proteínas recombinantes y de origen natural son bien conocidas en la técnica, p. ej., fraccionamiento por solubilidad, filtración en gel de exclusión por tamaño y varias cromatografías en columna.
Fraccionamiento por solubilidad: Con frecuencia, como etapa inicial, particularmente si la mezcla de proteínas es compleja, un fraccionamiento con sales inicial puede separar muchas de las proteínas de células hospedadoras no deseadas (o proteínas derivadas de los medios de cultivo celular) de la proteína de interés. La sal preferida es sulfato de amonio. El sulfato de amonio precipita las proteínas al reducir de manera eficaz la cantidad de agua en la mezcla de proteínas. A continuación, las proteínas precipitan en función de su solubilidad. Cuanto más hidrófoba es una proteína, es más probable que precipite a concentraciones más bajas de sulfato de amonio. Un protocolo habitual incluye añadir sulfato de amonio saturado a una solución de proteínas de modo que la concentración de sulfato de amonio resultante esté entre 20-30 %. Esta concentración precipitará la más hidrófoba de las proteínas. A continuación, se desecha el precipitado (a menos que la proteína de interés sea hidrófoba) y se añade sulfato de amonio al sobrenadante hasta una concentración que se sabe que precipita la proteína de interés. A continuación, el precipitado se solubiliza en tampón y el exceso de sal se elimina si es necesario, ya sea mediante diálisis o diafiltración. Otros métodos que se basan en la solubilidad de las proteínas, tal como la precipitación con etanol frío, son bien conocidas por los expertos en la materia y pueden utilizarse para fraccionar mezclas de proteínas complejas.
Filtración por exclusión de tamaño: El peso molecular de la proteína de elección se puede utilizar para aislarla de proteínas de mayor y menor tamaño mediante ultrafiltración a través de membranas de diferente tamaño de poro (por ejemplo, membranas AMICON® o MILLIPORE®). Como primera etapa, la mezcla de proteínas se ultrafiltra a través de una membrana con un tamaño de poro que tiene un límite de peso molecular más bajo que el peso molecular de la proteína de interés. El retenido de la ultrafiltración se ultrafiltra después contra una membrana con un límite molecular mayor que el peso molecular de la proteína de interés. La proteína recombinante pasará a través de la membrana al filtrado. A continuación, el filtrado se puede cromatografiar como se describe a continuación.
Cromatografía en columna: La proteína de elección también se puede separar de otras proteínas en función de su tamaño, carga superficial neta, hidrofobicidad y afinidad por ligandos. Además, los anticuerpos generados contra proteínas recombinantes o de origen natural pueden conjugarse con matrices de columna y las proteínas inmunopurificadas. Todos estos métodos son bien conocidos en la técnica. Será evidente para un experto que las técnicas cromatográficas se pueden realizar a cualquier escala y utilizando equipos de muchos fabricantes diferentes (p. ej., Pharmacia Biotech). Por ejemplo, se puede purificar un polipéptido antigénico utilizando una columna de afinidad con heptámero PA63. Singh et al., 269, J. Biol. Chem. 29039 (1994).
En algunos casos, puede utilizarse una combinación de etapas de purificación que comprende, por ejemplo: (a) cromatografía de intercambio iónico, (b) cromatografía con hidroxiapatita, (c) cromatografía de interacción hidrófoba, y (d) cromatografía de exclusión por tamaño para purificar los polipéptidos de fusión descritos en el presente documento.
También se contemplan los sistemas de expresión sin células. Los sistemas de expresión sin células ofrecen varias ventajas sobre los métodos de expresión tradicionales basados en células, incluyendo la fácil modificación de las condiciones de reacción para favorecer el plegamiento de proteínas, la disminución de la sensibilidad a la toxicidad del producto y la idoneidad para estrategias de alto rendimiento, como la exploración de expresión rápida o la producción de grandes cantidades de proteínas debido a la reducción de los volúmenes de reacción y el tiempo de los procesos. El sistema de expresión sin células puede utilizar ADN plásmido o lineal. Además, las mejoras en la eficacia de la traducción han dado como resultado rendimientos que superan un miligramo de proteína por mililitro de mezcla de reacción. Los sistemas de expresión sin células disponibles comercialmente incluyen los sistemas de lisado de reticulocitos acoplados a TNT (Promega) que utilizan un sistema basado en reticulocitos de conejo in vitro.
Formulaciones de una composición inmunológica y métodos de uso
Los casos específicos de la presente divulgación proporcionan el uso de las composiciones inmunogénicas como se divulga en el presente documento para provocar una respuesta inmunitaria en un animal. De manera más específica, las composiciones provocan inmunidad tanto humoral como celular y, en muchos casos, inmunidad de las mucosas. Los casos de la presente divulgación proporcionan al menos una protección parcial o una mejora parcial después de la infección por, en particular, neumococo. Los neumococos causan una serie de enfermedades, tales como meningitis, neumonía, bacteriemia y otitis media. Casi un millón de niños mueren cada año por enfermedades neumocócicas en todo el mundo. S. pneumoniae se ha estudiado extensamente y se han secuenciado al menos algunos de los genomas. Véase, p. ej., la patente de Estados Unidos n.° 7.141.418. Aunque los anticuerpos contra los polisacáridos capsulares, que definen los serotipos conocidos, confieren protección específica de serotipo, se han descrito otros mecanismos protectores de la inmunidad. Véase Malley et al., 88 J. Mol. Med. 135 (2010). Estos otros mecanismos protectores incluyen, pero sin limitación, anticuerpos contra antígenos no capsulares y respuestas de linfocitos T a componentes neumocócicos. La aplicación de la vacuna conjugada de proteína-polisacárido, PCV7, ha reducido significativamente las enfermedades. Black et al., 24(S2) Vaccine 79 (2006); Hansen et al., 25 Pediatr. Infect. Dis. J. 779 (2006)). Sin embargo, estudios recientes han demostrado que la falta de otros serotipos en PCV7 ha dado como resultado serotipos neumocócicos de reemplazo emergentes. Pichichero & Casey, 26(S10) Pediatr. Infect. Dis. J. S12 (2007).
Se ha demostrado que determinados antígenos neumocócicos comunes a todos los serotipos de la especie tienen potencial inmunoprotector a pesar de la encapsulación, p. ej., las proteínas de superficie PspA, PspC, PsaA y la citotoxina neumolisina o mutantes neumolisoides (Basset et al., 75 Infect. Immun. 5460 (2007); Briles et al., 18 Vaccine 1707 (2000)); el uso de bibliotecas genómicas y mutacionales ha identificado varias docenas de proteínas adicionales de especies comunes (Hava & Camilli, 45 Mol. Microbiol. 1389 (2002); Wizemann et al., 60 Infect. Immun. 1593 (2001)). La inmunidad se ha inducido por antígenos individuales en modelos animales (Alexander et al., 62 Infect. Immun. 5683 (1994); Balachandran et al., 70 Infect. Immun. 2526 (2002); Chung et al., 170 J. Immunol.
1958 (2003); Glover et al., 76 Infect. Immun. 2767 (2008); Wu et al., 175 J. Infect. Dis. 839 (1997)), pero hasta la fecha no se ha aprobado ninguna vacuna basada en un antígeno común para uso humano.
En el presente documento se divulga un método para vacunar a un mamífero que comprende administrar la composición inmunogénica que comprende al menos uno o múltiples antígenos unidos a al menos un tipo de armazón polimérico, p. ej., un polímero de polisacárido o hidrato de carbono para su uso en la provocación de una respuesta inmunitaria al uno o más antígenos fijados al polímero cuando se administra a un sujeto. En algunos casos, la respuesta inmunitaria es una respuesta inmunitaria humoral y/o celular.
Se divulgan métodos para provocar una respuesta inmunitaria en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una composición inmunogénica que comprende al menos un tipo del polímero, p. ej., un polisacárido, al menos un antígeno, y al menos un par de moléculas de afinidad complementaria que comprende (i) una primera molécula de afinidad que se asocia con el polímero, p. ej., un polisacárido, y (ii) una molécula de afinidad complementaria que se asocia con el antígeno, para fijar el antígeno al polímero, p. ej., un polisacárido, (p. ej., la primera molécula de afinidad se asocia con la molécula de afinidad complementaria para unir el antígeno al polímero, p. ej., polisacárido).
En el presente documento se divulgan métodos para provocar una inmunidad humoral y/o celular a múltiples antígenos al mismo tiempo, p. ej., donde la composición inmunogénica administrada al sujeto comprende un polímero que comprende al menos 1, o al menos 2, o más, p. ej., una pluralidad de antígenos iguales o diferentes.
En el presente documento se divulga un método de inmunización o vacunación de un sujeto, p. ej., un pájaro o un mamífero, p. ej., un ser humano contra un patógeno comprende administrar una composición inmunológica como se divulga en el presente documento que comprende al menos un antígeno derivado de uno o más patógenos. En algunos casos, un sujeto puede inmunizarse contra al menos 1, o al menos 2, o al menos 2, o al menos 3, o al menos 5, o al menos 10, o al menos 15, o al menos aproximadamente 20, o al menos 50, o al menos alrededor de 100, o más de 100 patógenos diferentes al mismo tiempo, cuando el polímero de la composición inmunogénica se fija a los diferentes antígenos correspondientes.
En algunos casos, a un sujeto se le pueden administrar varias composiciones inmunogénicas diferentes como se divulga en el presente documento, por ejemplo, a un sujeto se le puede administrar una composición que comprende un polímero con un antígeno, o una pluralidad de antígenos, p. ej., antígenos A, B, C, D, etc., y también administrar una composición que comprende un polímero que comprende un antígeno diferente, o un conjunto diferente de antígenos, p. ej., antígenos W, X, Y y Z, etc. Como alternativa, a un sujeto se le puede administrar una composición que comprende un polímero A con un antígeno, o una pluralidad de antígenos, p. ej., antígenos A, B, C y D, etc., y también administrar una composición que comprende un polímero B que comprende el mismo antígeno, p. ej., antígenos A, B, C y D, etc., o un conjunto diferente de antígenos. Se prevé que la presente divulgación proporcione métodos para la inmunización de un sujeto con tantos antígenos como se desee, p. ej., con varios diferentes complejos inmunogénicos como se describe en el presente documento, para permitir la inmunización con hasta 100 o más antígenos.
En un ejemplo, las composiciones inmunogénicas como se describe en el presente documento comprenden un transportador farmacéuticamente aceptable. En otro ejemplo, la composición inmunogénica descrita en el presente documento está formulada para la administración a un ave, mamífero o ser humano, como o en una vacuna. Las formulaciones adecuadas se pueden encontrar en, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences (2006), o en Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms (4a ed., Lea & Febiger, Filadelfia, 1985).
En un ejemplo, las composiciones inmunogénicas como se describe en el presente documento comprenden transportadores farmacéuticamente aceptables que son inherentemente no tóxicos y no terapéuticos. Ejemplos de tales transportadores incluyen intercambiadores de iones, alúmina, estearato de aluminio, lecitina, proteínas séricas, tales como seroalbúmina humana, sustancias tamponantes tales como fosfatos, glicina, ácido sórbico, sorbato potásico, mezclas de glicéridos parciales de ácidos grasos vegetales saturados, agua, sales o electrolitos, tales como sulfato de protamina, hidrogenofosfato disódico, hidrogenofosfato potásico, cloruro de sodio, sales de cinc, sílice coloidal, trisilicato de magnesio, polivinilpirrolidona, sustancias basadas en celulosa y polietilenglicol. Para todas las administraciones, se utilizan adecuadamente formas de depósito convencionales. Dichas formas incluyen, por ejemplo, microcápsulas, nanocápsulas, liposomas, emplastos, formas de inhalación, aerosoles nasales, comprimidos sublinguales y preparaciones de liberación sostenida. Para ejemplos de composiciones de liberación sostenida, véanse las patentes de Estados Unidos n.° 3.773.919, N.° 3.887.699, EP 58,481A, EP 158,277A, la patente canadiense n.° 1176565; Sidman et al., 22 Biopolymers 547 (1983); Langer et al., 12 Chem. Tech. 98 (1982). Las proteínas se formularán normalmente a una concentración de aproximadamente 0,1 mg/ml a 100mg/ml por aplicación por paciente.
En un ejemplo, se pueden añadir otros ingredientes a las formulaciones de vacuna, incluyendo antioxidantes, p. ej., ácido ascórbico; polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente diez restos), p. ej., poliarginina o tripéptidos; proteínas, tales como seroalbúmina, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos, tales como glicina, ácido glutámico, ácido aspártico o arginina; monosacáridos, disacáridos y otros hidrato de carbono, incluida la celulosa o sus derivados, glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; y alcoholes de azúcar, tales como manitol o sorbitol.
En algunos casos, las presentes composiciones inmunogénicas de MAPS se administran con al menos un adyuvante. Los adyuvantes son un grupo heterogéneo de sustancias que potencian la respuesta inmunitaria contra un antígeno que se administra simultáneamente. En algunos ejemplos, los adyuvantes mejoran la respuesta inmunitaria, por lo que se necesita menos vacuna. Los adyuvantes sirven para poner en contacto el antígeno, la sustancia que estimula la respuesta inmunitaria protectora específica, con el sistema inmunitario e influir en el tipo de inmunidad producida, así como en la calidad de la respuesta inmunitaria (magnitud o duración). Los adyuvantes también pueden disminuir la toxicidad de determinados antígenos; y proporcionan solubilidad a algunos componentes de la vacuna. Casi todos los adyuvantes que se utilizan hoy en día para potenciar la respuesta inmunitaria contra antígenos son partículas o forman partículas junto con el antígeno. En el libro VACCINE DESIGN -SUBUNIT & ADJUVANT APPROACH (Powell & Newman, Eds., Plenum Press, 1995), se describen muchos adyuvantes conocidos tanto con respecto a su actividad inmunitaria como con respecto a sus características químicas. El tipo de adyuvantes que no forman partículas son un grupo de sustancias que actúan como sustancias de señal inmunitarias y que en condiciones normales consisten en sustancias que se forman por el sistema inmunitario como consecuencia de la activación inmunitaria tras la administración de sistemas adyuvantes particulados.
Los adyuvantes para composiciones inmunogénicas y vacunas son bien conocidos en la técnica. Ejemplos incluyen, pero sin limitación, monoglicéridos y ácidos grasos (por ejemplo, una mezcla de monooleína, ácido oleico y aceite de soja); sales minerales, p. ej., geles de hidróxido de aluminio y fosfato de aluminio o calcio; emulsiones oleosas y formulaciones basadas en tensioactivos, p. ej., MF59 (emulsión de aceite en agua estabilizada con detergente microfluidizado), QS21 (saponina purificada), AS02 [SBAS2] (emulsión de aceite en agua+ MPL+ QS-21), MPL-SE, Montanide ISA-51 e ISA-720 (emulsión de agua en aceite estabilizada); adyuvantes particulados, p. ej., virosomas (vehículos liposómicos unilaminares que incorporan hemaglutinina de gripe), AS04 ([SBAS4] sal de Al con MPL), ISCOMS (complejo estructurado de saponinas y lípidos), polilactida co-glicólido (PLG); derivados microbianos (naturales y sintéticos), p. ej., monofosforil lípido A (MPL, por sus siglas en inglés), Detox (MPL+ esqueleto de la pared celular de M. Phlei), AGP [Rc -529] (monosacárido acilado sintético), Detox-PC, DC_Chol (inmunoestimuladores lipoidales capaces de autoorganizarse en liposomas), OM-174 (derivado del lípido A), motivos CpG (oligonucleótidos sintéticos que contienen motivos CpG inmunoestimuladores) u otras estructuras de ADN, LT y CT modificados (toxinas bacterianas modificadas genéticamente para proporcionar efectos adyuvantes no tóxicos); inmunomoduladores humanos endógenos, p. ej., hGM-CSF o hIL-12 (citocinas que pueden administrarse como proteínas o plásmidos codificados), imudaptina (matriz en tándem C3d), MoGM-CSF, TiterMax-G, CRL-1005, GERBU, TERamida, PSC97B, Adjumer, PG-026, GSK-I, GcMAF, B-aletina, MPC-026, Adjuvax, CpG ODN, Betafectina, Alumbre y MF59 y vehículos inertes, tal como partículas de oro. En la técnica se conocen adyuvantes adicionales, véanse, p. ej., la patente de Estados Unidos n.° 6.890.540; la publicación de patente de Estados Unidos n.° 2005/0244420; PCT/SE97/01003.
En algunos casos, un adyuvante es una partícula y puede tener la característica de ser lentamente biodegradable. Se debe tener cuidado para asegurarse de que el adyuvante no forme metabolitos tóxicos. Preferentemente, en algunos casos, estos adyuvantes pueden ser matrices utilizadas que son principalmente sustancias que se originan en un organismo. Estos incluyen polímeros de ácido láctico, poliaminoácidos (proteínas), hidratos de carbono, lípidos y polímeros biocompatibles de baja toxicidad. También se pueden utilizar combinaciones de estos grupos de sustancias que se originan en un organismo o combinaciones de sustancias que se originan en un organismo y polímeros biocompatibles. Los lípidos son las sustancias preferidas ya que presentan estructuras que los hacen biodegradables, así como el hecho de que son un elemento fundamental en todas las membranas biológicas.
En un ejemplo, las composiciones inmunogénicas descritas en el presente documento para su administración deben ser estériles para su administración a un sujeto. La esterilidad se logra fácilmente mediante filtración a través de membranas de filtración estériles (p. ej., membranas de 0,2 micras) o mediante irradiación gamma.
En algunos casos, las composiciones inmunogénicas descritas en el presente documento comprenden además excipientes farmacéuticos que incluyen, pero sin limitación, aceites biocompatibles, soluciones salinas fisiológicas, conservantes, hidrato de carbono, proteína, aminoácidos, agentes de control de la presión osmótica, gases portadores, agentes que controlan el pH, disolventes orgánicos, agentes hidrófobos, inhibidores enzimáticos, polímeros absorbentes de agua, tensioactivos, promotores de la absorción y agentes antioxidantes. Ejemplos representativos de hidratos de carbono incluyen azúcares solubles tal como hidropropilcelulosa, carboximetil celulosa, carboxilcelulosa de sodio, ácido hialurónico, quitosano, alginato, glucosa, xilosa, galactosa, fructosa, maltosa, sacarosa, dextrano, sulfato de condroitina, etc. Ejemplos representativos de proteínas incluyen albúmina, gelatina, etc. Ejemplos representativos de aminoácidos incluyen glicina, alanina, ácido glutámico, arginina, lisina y sus sales. Dichos excipientes farmacéuticos son bien conocidos en la técnica.
En algunos casos, la composición inmunogénica de MAPS se administra en combinación con otros ingredientes terapéuticos que incluyen, p. ej., Y-interferón, citocinas, agentes quimioterapéuticos, o agentes antiinflamatorios o antivíricos. En algunos casos, la composición inmunogénica como se divulga en el presente documento se puede administrar con una o más moléculas coestimuladoras y/o adyuvantes como se divulga en el presente documento.
En algunos casos, la composición inmunogénica se administra en forma pura o sustancialmente pura, pero puede administrarse como una composición, formulación o preparación farmacéutica. Tal formulación comprende MAPS descrito en el presente documento junto con uno o más transportadores farmacéuticamente aceptables y opcionalmente otros ingredientes terapéuticos. Otros ingredientes terapéuticos incluyen compuestos que potencian la presentación de antígenos, p. ej., interferón gamma, citocinas, agentes quimioterapéuticos o agentes antiinflamatorios. Las formulaciones pueden presentarse de manera conveniente en una forma farmacéutica unitaria y se pueden preparar mediante métodos bien conocido en la técnica de farmacia. Por ejemplo, Plotkin y Mortimer, in VACCINES (2a ed., W.B. Saunders Co., 1994) describe la vacunación de animales o seres humanos para inducir una respuesta inmunitaria específica para patógenos particulares, así como los métodos para preparar antígenos, determinar una dosis adecuada de antígeno y ensayar la inducción de una respuesta inmunitaria.
Formulaciones adecuadas para administración intravenosa, intramuscular, intranasal, oral, sublingual, vaginal, rectal, subcutánea o intraperitoneal comprenden convenientemente soluciones acuosas estériles del principio activo con soluciones que son preferentemente isotónicas con la sangre del receptor. Tales formulaciones se pueden preparar convenientemente disolviendo el principio activo sólido en agua que contenga sustancias fisiológicamente compatibles tales como cloruro de sodio (p. ej., 0,1 M - 2,0 M), glicina y similares, y que tengan un pH tamponado compatible con las condiciones fisiológicas para producir una solución acuosa y produciendo la solución estéril. Estas pueden estar en envases unitarios o multidosis, por ejemplo, ampollas o viales sellados.
También pueden utilizarse suspensiones liposómicas como transportadores farmacéuticamente aceptables. Estos pueden prepararse de acuerdo con métodos conocidos por los expertos en la materia, por ejemplo, como se describe en la Patente de Estados Unidos n.° 4.522.811.
Las formulaciones para un suministro intranasal se describen en las Patentes de Estados Unidos n.° 5.427.782; n.° 5.843.451; n.° 6.398.774.
Las formulaciones de las composiciones inmunogénicas pueden incorporar un estabilizador. Estabilizadores ilustrativos son polietilenglicol, proteínas, sacáridos, aminoácidos, ácidos inorgánicos y ácidos orgánicos que pueden utilizarse solos o como aditivos. Pueden utilizarse dos o más estabilizadores en soluciones acuosas a la concentración y/o pH apropiados. La presión osmótica específica en dicha solución acuosa está generalmente en el intervalo de 0,1 -3,0 osmosis, preferentemente en el intervalo de 0,80-1,2. El pH de la solución acuosa se ajusta para que esté dentro del intervalo de pH 5,0-9,0, preferentemente dentro del intervalo de pH 6-8.
Cuando se desean preparaciones orales, las composiciones inmunogénicas se pueden combinar con transportadores habituales, tales como lactosa, sacarosa, almidón, estearato de magnesio talco, celulosa cristalina, metilcelulosa, carboximetil celulosa, glicerina, alginato de sodio o goma arábiga entre otros.
En algunos casos, las composiciones inmunogénicas como se describe en el presente documento se pueden administrar por vía intravenosa, intranasal, intramuscular, subcutánea, intraperitoneal, sublingual, vaginal, rectal u oral. En algunos casos, la vía de administración es oral, intranasal, subcutánea o intramuscular. En algunos casos, la vía de administración es administración intranasal.
La vacunación se puede realizar mediante métodos convencionales. Por ejemplo, se pueden utilizar composiciones inmunogénicas en un diluyente adecuado tal como solución salina o agua, o adyuvantes completos o incompletos. La composición inmunogénica se puede administrar por cualquier vía apropiada para provocar una respuesta inmunitaria. La composición inmunogénica se puede administrar una vez o a intervalos periódicos hasta que se desencadene una respuesta inmunitaria. Las respuestas inmunitarias pueden detectarse mediante varios métodos conocidos por los expertos en la materia, incluyendo, pero sin limitación, producción de anticuerpos, ensayo de citotoxicidad, ensayo de proliferación y ensayos de liberación de citocinas. Por ejemplo, se pueden extraer muestras de sangre del mamífero inmunizado y analizar para determinar la presencia de anticuerpos contra los antígenos de la composición inmunogénica mediante ELISA. (véase de Boer et. al., 115 Arch Virol. 147 (1990) y el título de estos anticuerpos se puede determinar mediante métodos conocidos en la técnica.
La dosis exacta que se va a emplear en la formulación también dependerá de la vía de administración y debe decidirse de acuerdo con el criterio del facultativo y las circunstancias de cada paciente. Por ejemplo, se puede administrar un intervalo de 25 jg-900 |jg de proteína total mensualmente durante tres meses.
Finalmente, el médico tratante decidirá la cantidad de composición inmunogénica o composición de vacuna a administrar a individuos particulares. Como con todas las composiciones inmunogénicas o vacunas, las cantidades inmunológicamente eficaces de los inmunógenos deben determinarse empíricamente. Factores a considerar incluyen la inmunogenicidad, si el inmunógeno estará o no formando complejos o fijado covalentemente a un adyuvante o a una proteína transportadora u otro transportador, las vías de administración y el número de dosificaciones inmunizantes a administrar. Tales factores son conocidos en la técnica de las vacunas y está dentro de la habilidad de los inmunólogos realizar tales determinaciones sin una experimentación indebida.
En un ejemplo, una composición inmunogénica o composición de vacuna como se describe en el presente documento, cuando se administra a ratones, puede provocar una respuesta inmunitaria que previene un síntoma de enfermedad en al menos el 20 % de los animales expuestos con 5 DL50 de la composición inmunogénica que comprende antígenos para los que se previene el síntoma de la enfermedad. Los expertos en la materia conocen métodos de vacunación y exposición a un animal inmunizado. Por ejemplo, se puede preparar una alícuota de 10 pg de una composición inmunogénica o composición de vacuna como se divulga en el presente documento en 100 pl de PBS y/o con la adición de adyuvante incompleto de Freund e inyectar por vía intramuscular por ratón por vacunación. Como alternativa, se pueden utilizar inyecciones parenterales, intraperitoneales y en la almohadilla del pie. Los volúmenes de inyecciones en la almohadilla del pie se reducen a 50 pl. Los ratones se pueden inmunizar con una composición inmunogénica o composición de vacuna como se divulga en el presente documento en tres ocasiones distintas con intervalo de varios días, p. ej., de 14 días en medio.
La eficacia de la vacunación puede probarse exponiendo al patógeno. Siete días después de la última dosis de una composición inmunogénica, los ratones inmunizados se exponen por vía intranasal con un organismo patógeno del que deriva el antígeno. Los ratones anestesiados con éter (10 g a 12 g) se pueden infectar por vía intranasal con 50 pl de líquido alantoideo diluido en PBS que contiene 5 DL50 del organismo patógeno. La protección se puede medir monitorizando la supervivencia de los animales y el peso corporal, que se evalúa a lo largo de un período de observación de 21 días. Los ratones gravemente afectados se sacrifican. Una DL50 de A/Mallard/Pennsylvania/10218/84 es igual a 100-1000 del ensayo Tissue Culture Infectious Dose50 (TCID50).
En otros casos, los ratones inmunizados pueden exponerse con varios diferentes organismos patógenos, p. ej., diferentes organismos patógenos de los que derivan cada uno de los antígenos fijados al polímero. Por ejemplo, de una composición inmunogénica que comprende cinco antígenos diferentes unidos al polímero, p. ej., polisacárido, donde cada antígeno deriva de cinco organismos patógenos diferentes, los ratones inmunizados pueden exponerse con cada uno de los cinco organismos patógenos diferentes, ya sea secuencialmente (en cualquier orden) o simultáneamente. Un experto en la materia podrá determinar la DL50 para cada organismo patógeno utilizado para la exposición de los ratones inmunizados mediante métodos conocidos en la técnica. Véase, p. ej., LaBarre & Lowy, 96 J. Virol. Meths. 107 (2001); Golub, 59J. Immunol. 7 (1948).
Kits
También se divulgan kits para producir una composición inmunogénica como se divulga en el presente documento que es útil para que un investigador adapte una composición inmunogénica con sus antígenos preferidos, p. ej., con fines de investigación para evaluar el efecto de un antígeno o una combinación de antígenos sobre la respuesta inmunitaria. Estos kits se pueden preparar a partir de materiales y reactivos fácilmente disponibles. Por ejemplo, dichos kits pueden comprender uno cualquiera o más de los siguientes materiales: un recipiente que comprende un polímero, p. ej., un polisacárido, reticulado con una pluralidad de primeras moléculas de afinidad; y un recipiente que comprende una molécula de afinidad complementaria que se asocia con la primera molécula de afinidad, en donde la molécula de afinidad complementaria se asocia con un antígeno.
En otro ejemplo, el kit puede comprender un recipiente que comprende un polímero, p. ej., un polisacárido, un recipiente que comprende una pluralidad de primeras moléculas de afinidad y un recipiente que comprende un reactivo de reticulación para reticular las primeras moléculas de afinidad con el polímero.
En algunos casos, el kit comprende además un medio para fijar la molécula de afinidad complementaria al antígeno, donde los medios pueden ser un reactivo de reticulación o alguna proteína de fusión intermedia. En algunos casos, el kit puede comprender al menos un factor de coestimulación que se puede añadir al polímero. En algunos casos, el kit comprende un reactivo de reticulación, por ejemplo, pero sin limitación, CDAP (tetrafluoroborato de 1-ciano-4-dimetilaminopiridinio), EDC (clorhidrato de 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil]carbodiimida), cianoborohidruro sódico; bromuro de cianógeno; bicarbonato de amonio/ácido yodoacético para unir el cofactor al polímero.
Se pueden preparar varios kits y componentes para su uso en los métodos descritos en el presente documento, dependiendo del uso previsto del kit, el antígeno diana particular y las necesidades del usuario.
Algunas definiciones seleccionadas
Por conveniencia, determinados términos empleados en toda la solicitud (incluyendo la memoria descriptiva, ejemplos y reivindicaciones adjuntas) se recopilan aquí. A menos que definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que el entendido comúnmente por un experto habitual en la materia a la que pertenece esta invención.
Tal como se usa en el presente documento y en las reivindicaciones, las formas singulares incluyen la referencia en plural y viceversa a menos que el contexto indique claramente lo contrario. El término "o" es inclusivo a menos que se modifique, por ejemplo, por "o bien". Aparte de los ejemplos operativos, o cuando se indique lo contrario, todos los números que expresan cantidades de ingredientes o condiciones de reacción usados en el presente documento deben entenderse modificados en todos los ejemplos por el término "aproximadamente".
La expresión "composición inmunogénica" utilizada en el presente documento se define como una composición capaz de provocar una respuesta inmunitaria, tal como una respuesta de anticuerpos o inmunitaria celular, cuando se administra a un sujeto. Las composiciones inmunogénicas de la presente divulgación pueden ser o no inmunoprotectoras o terapéuticas. Cuando las composiciones inmunogénicas de la presente divulgación previenen, mejoran, palian o eliminan la enfermedad del sujeto, entonces la composición inmunogénica puede denominarse opcionalmente vacuna. Como se usa en el presente documento, sin embargo, no se pretende que la expresión composición inmunogénica se limite a vacunas.
Como se usa en el presente documento, el término "antígeno" se refiere a cualquier sustancia que provoque una respuesta inmunitaria dirigida contra la sustancia. En algunos casos, un antígeno es un péptido o un polipéptido y, en otros casos, puede ser cualquier sustancia química o residuo, p. ej., un hidrato de carbono, que provoca una respuesta inmunitaria dirigida contra la sustancia.
El término "asociados", como se usa en el presente documento, se refiere al enlace de dos o más moléculas mediante enlaces covalentes o no covalentes. En algunos casos, cuando la unión de dos o más moléculas se produce por un enlace covalente, las dos o más moléculas pueden fusionarse o reticularse juntas. En algunos casos, cuando la unión de dos o más moléculas se produce por un enlace no covalente, las dos o más moléculas pueden formar un complejo.
El término "complejo" como se usa en el presente documento se refiere a una colección de dos o más moléculas, conectadas espacialmente por medios distintos a una interacción covalente; por ejemplo, pueden estar conectados por interacciones electrostáticas, enlaces de hidrógeno o por interacciones hidrófobas (es decir, fuerzas de van der Waals).
Como se usa en el presente documento, el término "fusionado" significa que al menos una proteína o péptido está asociado físicamente con una segunda proteína o péptido. En algunos casos, la fusión es normalmente un enlace covalente, sin embargo, otros tipos de enlaces se abarcan en el término "fusionado" e incluyen, por ejemplo, enlace a través de una interacción electrostática, o una interacción hidrófoba y similares. El enlace covalente puede abarcar el enlace como una proteína de fusión o un enlace acoplado químicamente, por ejemplo, mediante un enlace disulfuro formado entre dos restos de cisteína.
Como se usa en el presente documento, la expresión "polipéptido de fusión" o "proteína de fusión" significa una proteína creada uniendo dos o más secuencias polipeptídicas juntas. Los polipéptidos de fusión abarcados en esta invención incluyen productos de traducción de una construcción génica quimérica que se une a las secuencias de ADN que codifican uno o más antígenos, o fragmentos o mutantes de los mismos, con la secuencia de ADN que codifica un segundo polipéptido para formar un único marco de lectura abierto. En otras palabras, un "polipéptido de fusión" o "proteína de fusión" es una proteína recombinante de dos o más proteínas que están unidas por un enlace peptídico. En algunos casos, la segunda proteína a la que se fusionan los antígenos es una molécula de afinidad complementaria que es capaz de interaccionar con una primera molécula de afinidad del par de afinidad complementaria.
Los términos "polipéptido" y "proteína" pueden utilizarse indistintamente para referirse a un polímero de restos de aminoácidos unidos por enlaces peptídicos, y para los fines de la invención reivindicada, tienen una longitud mínima típica de al menos 25 aminoácidos. El término "polipéptido" y "proteína" pueden abarcar una proteína multimérica, p. ej., una proteína que contiene más de un dominio o subunidad. El término "péptido", como se usa en el presente documento, se refiere a una secuencia de aminoácidos unidos por enlaces peptídicos que contiene menos de 25 aminoácidos, p. ej., entre aproximadamente 4 aminoácidos y 25 aminoácidos de longitud. Las proteínas y los péptidos pueden estar compuestos de aminoácidos dispuestos linealmente unidos por enlaces peptídicos, ya sea producidos de forma biológica, de forma recombinante o de forma sintética y ya sea que estén compuestos de aminoácidos de origen natural o de origen no natural, se incluyen en esta definición. La definición de proteína abarca tanto las proteínas de longitud completa como los fragmentos de las mismas de más de 25 aminoácidos. Los términos también incluyen polipéptidos que tienen modificaciones cotraduccionales (p. ej., escisión del péptido señal) y modificaciones postraduccionales del polipéptido, tales como, por ejemplo, formación de enlaces disulfuro, glicosilación, acetilación, fosforilación, lipidación, escisión proteolítica (p. ej., escisión por metaloproteasas) y similares. Asimismo, como se usa en el presente documento, un "polipéptido" se refiere a una proteína que incluye modificaciones, tales como eliminaciones, adiciones y sustituciones (generalmente de naturaleza conservativa como sería conocido por una persona en la técnica) a la secuencia natural, siempre que la proteína mantenga la actividad deseada. Estas modificaciones pueden ser deliberadas, como mediante mutagénesis dirigida, o pueden ser accidentales, tal como a través de mutaciones de hospedadores que producen las proteínas, o errores debidos a la amplificación por PCR u otros métodos de ADN recombinante.
Por "secuencia señal" se entiende una secuencia de un ácido nucleico que, cuando está operativamente unido a una molécula de ácido nucleico, facilita la secreción del producto (p. ej., proteína o péptido) codificado por la molécula de ácido nucleico. En algunos casos, la secuencia señal se localiza preferentemente en 5' con respecto a la molécula de ácido nucleico.
Como se usa en el presente documento, el término "N-glicosilado" o "N-glicosilación" se refiere a la fijación covalente de un residuo de azúcar a restos de asparagina en un polipéptido. Los restos de azúcares pueden incluir, pero sin limitación, glucosa, manosa y N-acetilglucosamina. También se incluyen modificaciones de los glicanos, p. ej., siailación.
Una "célula presentadora de antígenos" o "APC" es una célula que expresa las moléculas del complejo principal de histocompatibilidad (MHC, por sus siglas en inglés) y puede presentar un antígeno extraño en forma de complejo con MHC en su superficie. Ejemplos de células presentadoras de antígenos son células dendríticas, macrófagos, linfocitos B, fibroblastos (piel), células epiteliales tímicas, células epiteliales tiroideas, células gliales (cerebro), células beta pancreáticas y células endoteliales vasculares.
La expresión "porción funcional" o "fragmento funcional" como se usa en el contexto de una "porción funcional de un antígeno" se refiere a una porción del antígeno o polipéptido antigénico que media el mismo efecto que el residuo antigénico completo, p. ej., provoca una respuesta inmunitaria en un sujeto, o media una asociación con otra molécula, p. ej., comprende al menos un epítopo.
Una "porción" de un antígeno diana, como se usa ese término en el presente documento, tendrá al menos 3 aminoácidos de longitud y puede tener, por ejemplo, al menos 6, al menos 8, al menos 10, al menos 14, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19, al menos 20 o al menos 25 aminoácidos o más, ambos inclusive.
La expresión "linfocito T citotóxico" o "CTL" se refieren a linfocitos que inducen apoptosis en células diana. Los CTL forman conjugados específicos de antígeno con las células diana mediante la interacción de los TCR con el antígeno (Ag) procesado en las superficies de las células diana, dando como resultado la apoptosis de la célula diana. Los cuerpos apoptóticos se eliminan mediante los macrófagos. La expresión "respuesta CTL" se usa para referirse a la respuesta inmunitaria primaria mediada por células CTL.
La expresión "inmunidad mediada por células" o "CMI" como se usa en el presente documento se refiere a una respuesta inmunitaria que no implica anticuerpos o complemento, sino que implica la activación de, por ejemplo, macrófagos, linfocitos citolíticos naturales (NK), linfocitos T citotóxicos específicos de antígeno (células T) y la liberación de diversas citocinas en respuesta a un antígeno diana. Dicho de otra manera, CMI se refiere a las células inmunitarias (tal como los linfocitos T y otros linfocitos) que se unen a la superficie de otras células que muestran un antígeno diana (tal como las células presentadoras de antígenos (APS)) y desencadenan una respuesta. La respuesta puede implicar otros linfocitos y/o cualquiera de los otros glóbulos blancos (leucocitos) y la liberación de citocinas. La inmunidad celular protege el organismo mediante: (i) la activación de linfocitos T citotóxicos (CTL) específicos de antígeno que pueden destruir células del organismo que muestran epítopos de antígenos extraños en su superficie, tales como células infectadas por virus y células con bacterias intracelulares; (2) la activación de macrófagos y células NK, permitiéndoles destruir patógenos intracelulares; y (3) la estimulación las células para que secreten varias citocinas que influyen en la función de otras células implicadas en las respuestas inmunitarias adaptativas y en las respuestas inmunitarias innatas.
La expresión "célula inmunitaria", como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier célula que pueda liberar una citocina en respuesta a una estimulación antigénica directa o indirecta. En la expresión "células inmunitarias" en el presente documento se incluyen linfocitos, incluyendo linfocitos citolíticos naturales (NK), linfocitos T (células CD4+ y/o CD8+), linfocitos B, macrófagos y monocitos, células Th; células Th1; células Th2; leucocitos; células dendríticas; macrófagos; mastocitos y monocitos y cualquier otra célula que sea capaz de producir una molécula de citocina en respuesta a la estimulación antigénica directa o indirecta. Normalmente, una célula inmunitaria es un linfocito, por ejemplo, un linfocito de linfocitos T.
El término "citocina", como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula liberada por una célula inmunitaria en respuesta a la estimulación con un antígeno. Ejemplos de tales citocinas incluyen, pero sin limitación: GM-CSF; IL-1a; IL-1P; IL-2; IL-3; IL-4; IL-5; IL-6; IL-7; IL-8; IL-10; IL-12; IL-17A, IL-17F u otros miembros de la familia IL-17, IL-22, IL-23, IFN-a; IFN-P; IFN-y; MIP-1a; MIP-1P; TGF-p; TNFa o TNFp. El término "citocina" no incluye anticuerpos
El término "sujeto", como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier animal en el que sea útil provocar una respuesta inmunitaria. El sujeto puede ser un animal salvaje, doméstico, comercial o de compañía, tal como un pájaro o un mamífero. El sujeto puede ser un ser humano. Aunque en un ejemplo se contempla que las composiciones inmunogénicas como se divulga en el presente documento también pueden ser adecuadas para el tratamiento terapéutico o preventivo en seres humanos, también es aplicable a vertebrados de sangre caliente, p. ej., mamíferos, tales como primates no humanos, (particularmente primates superiores), ovejas, perros, roedores (p. ej., ratón o rata), conejillos de Indias, cabras, cerdos, gatos, conejos, vacas y no mamíferos tales como pollos, patos o pavos. En otro ejemplo, el sujeto es un animal silvestre, por ejemplo, un pájaro para el diagnóstico de gripe aviar. En algunos casos, el sujeto es un animal de experimentación o un animal sustituto como modelo de enfermedad. El sujeto puede ser un sujeto que necesite tratamiento veterinario, donde provocar una respuesta inmunitaria a un antígeno es útil para prevenir una enfermedad y/o para controlar la propagación de una enfermedad, por ejemplo, SIV, STL1, SFV, o en el ejemplo de ganado, fiebre aftosa, o en el ejemplo de las aves, enfermedad de Marek o gripe aviar, y otras enfermedades similares.
Como se usa en el presente documento, el término "patógeno" se refiere a un organismo o molécula que causa una enfermedad o trastorno en un sujeto. Por ejemplo, los patógenos incluyen, pero sin limitación, virus, hongos, bacterias, parásitos y otros organismos infecciosos o moléculas de los mismos, así como organismos macroscópicos taxonómicamente relacionados dentro de las categorías de algas, hongos, levaduras, protozoos o similares.
Una "célula cancerosa" se refiere a una célula cancerosa, precancerosa o transformada, ya sea in vivo, ex vivo, o en cultivo de tejidos, que tiene cambios fenotípicos espontáneos o inducidos que no implican necesariamente la captación de nuevo material genético. Aunque la transformación puede surgir de la infección con un virus transformante y de la incorporación de nuevo ácido nucleico genómico o de la captación de ácido nucleico exógeno, también puede surgir espontáneamente o después de la exposición a un carcinógeno, mutando de este modo, un gen endógeno. La transformación/cáncer está asociado con, p. ej., cambios morfológicos, inmortalización de células, control de crecimiento anormal, formación de focos, independencia de anclaje, malignidad, pérdida de inhibición por contacto y limitación de la densidad del crecimiento, factor de crecimiento o independencia del suero, marcadores tumorales específicos, invasividad o metástasis, y crecimiento tumoral en hospedadores animales adecuados tales como ratones atímicos. Véase, p. ej., Freshney, CULTURE ANIMAL CELLS: MANUAL BASIC TECH. (3a ed., 1994).
La expresión "tipo silvestre" se refiere a la secuencia polinucleotídica normal de origen natural, que codifica una proteína, o una porción de la misma, o secuencia de proteína, o porción de la misma, respectivamente, como normalmente existe in vivo.
El término "mutante" se refiere a un organismo o célula con algún cambio en su material genético, en particular un cambio (es decir, eliminación, sustitución, adición, o alteración) con respecto a una secuencia polinucleotídica de tipo silvestre o cualquier cambio con respecto a una secuencia proteica de tipo silvestre. El término "variante" puede utilizarse indistintamente con "mutante". Aunque con frecuencia se asume que un cambio en el material genético da como resultado un cambio en la función de la proteína, los términos "mutante" y "variante" se refieren a un cambio en la secuencia de una proteína de tipo silvestre independientemente de si ese cambio altera la función de la proteína (p. ej., aumenta, disminuye, imparte una nueva función), o si ese cambio no tiene ningún efecto sobre la función de la proteína (p. ej., la mutación o variación es silenciosa).
La expresión "farmacéuticamente aceptable" se refiere a compuestos y composiciones que pueden administrarse a mamíferos sin una toxicidad indebida. La expresión "transportadores farmacéuticamente aceptables" excluye el medio de cultivo de tejidos. Sales farmacéuticamente aceptables ilustrativas incluyen, pero sin limitación, sales de ácidos minerales tales como clorhidratos, bromhidratos, fosfatos, sulfatos y similares, y las sales de ácidos orgánicos tales como acetatos, propionatos, malonatos, benzoatos y similares. Los transportadores farmacéuticamente aceptables son muy conocidos en la técnica.
Se apreciará que las proteínas o polipéptidos contienen con frecuencia aminoácidos distintos a los 20 aminoácidos comúnmente denominados 20 aminoácidos de origen natural, y que muchos aminoácidos, incluidos los aminoácidos terminales, pueden modificarse en un polipéptido dado, ya sea por procesos naturales tales como glicosilación y otras modificaciones postraduccionales, o por técnicas de modificación química que son bien conocidas en la técnica. Las modificaciones conocidas que pueden estar presentes en los polipéptidos de la presente invención incluyen, pero sin limitación, acetilación, acilación, ADP-ribosilación, amidación, fijación covalente de flavina, fijación covalente de un resto hemo, fijación covalente de un polinucleótido o derivado de polinucleótido, fijación covalente de un lípido o derivado de lípido, fijación covalente de fosfatidilinositol, reticulación, ciclación, formación de enlaces disulfuro, desmetilación, formación de reticulaciones covalentes, formación de cistina, formación de piroglutamato, formulación, gamma-carboxilación, glicación, glicosilación, formación de anclaje a GPI, hidroxilación, yodación, metilación, miristoilación, oxidación, procesamiento proteolítico, fosforilación, prenilación, racemización, selenoilación, sulfatación, adición mediada por ARN de transferencia de aminoácidos a proteínas tal como arginilación y ubiquitinación.
Como se usa en el presente documento, los términos "homólogo" u "homólogos" se usan indistintamente, y cuando se usan para describir un polinucleótido o polipéptido, indican que dos polinucleótidos o polipéptidos, o secuencias designadas de los mismos, cuando se alinean óptimamente y se comparan, por ejemplo, usando BLAST, versión 2.
2. 14 con los parámetros predeterminados para una alineación son idénticos, con inserciones o eliminaciones de nucleótidos apropiadas o inserciones o eliminaciones de aminoácidos, en al menos el 70 % de los nucleótidos, generalmente entre aproximadamente el 75 % y 99 %, tal como al menos aproximadamente del 98 al 99 % de los nucleótidos. Para un polipéptido, debe haber al menos un 50 % de identidad de aminoácidos en el polipéptido. El término "homólogo" u "homólogos" como se usa en el presente documento también se refiere a homología con respecto a la estructura. La determinación de homólogos de genes o polipéptidos puede determinarse fácilmente por un experto en la materia. Cuando en el contexto con un porcentaje definido, el porcentaje de homología definido significa al menos ese porcentaje de similitud de aminoácidos. Por ejemplo, el 85 % de homología se refiere al menos al 85 % de similitud de aminoácidos.
Como se usa en el presente documento, el término "heterólogo" en referencia a secuencias de los ácidos nucleicos, proteínas o polipéptidos significa que estas moléculas no se encuentran de manera natural en esa célula. Por ejemplo, la secuencia del ácido nucleico que codifica un polipéptido antigénico de fusión descrito en el presente documento que se inserta en una célula, por ejemplo, en el contexto de un vector de expresión de proteínas, es una secuencia del ácido nucleico heteróloga.
Para la comparación de secuencias, normalmente una secuencia actúa como secuencia de referencia, con la que se comparan las secuencias de prueba. Cuando se usa un algoritmo de comparación de secuencias, las secuencias de prueba y de referencia se introducen en un ordenador, se designan las coordenadas de subsecuencia, si fuera necesario, y se designan los parámetros del programa del algoritmo de secuencias. El algoritmo de comparación de secuencias calcula entonces el porcentaje de identidad de secuencia para la o las secuencias de prueba respecto a la secuencia de referencia, basándose en los parámetros del programa designados. Cuando sea necesario o se desee, la alineación óptima de secuencias para la comparación se puede realizar mediante cualquier variedad de enfoques, ya que estos son bien conocidos en la técnica.
El término "variante" como se usa en el presente documento puede referirse a un polipéptido o ácido nucleico que difiere del polipéptido o ácido nucleico de origen natural en una o más eliminaciones, adiciones, sustituciones o modificaciones de aminoácidos o ácidos nucleicos de la cadena lateral, pero que conserva una o más funciones específicas o actividades biológicas de la molécula de origen natural. Las sustituciones de aminoácidos incluyen alteraciones en las que un aminoácido se reemplaza con un resto de aminoácido diferente de origen natural o no convencional. Tales sustituciones pueden clasificarse como "conservativas", en cuyo caso, un resto de aminoácido que se encuentra en un polipéptido se reemplaza por otro aminoácido de origen natural de carácter similar, ya sea en relación con la polaridad, funcionalidad o tamaño de la cadena lateral. Las sustituciones abarcadas por variantes como se describe en el presente documento también pueden ser "no conservativas", en las que un resto de aminoácido que está presente en un péptido se sustituye con un aminoácido que tiene diferentes propiedades (p. ej., sustituyendo un aminoácido cargado o hidrófobo con alanina), o como alternativa, en las que un aminoácido de origen natural se sustituye por un aminoácido no convencional. También se abarcan en el término "variante", cuando se usa con referencia a un polinucleótido o polipéptido, variaciones en la estructura primaria, secundaria o terciaria, en comparación con un polinucleótido o polipéptido de referencia, respectivamente (p. ej., en comparación con un polinucleótido o polipéptido de tipo silvestre).
La expresión "sustancialmente similar', cuando se usa en referencia a una variante de un antígeno o un derivado funcional de un antígeno en comparación con el antígeno original significa que una secuencia objeto particular varía de la secuencia del polipéptido antigénico en una o más sustituciones, eliminaciones o adiciones, pero conserva al menos el 50% o más, p. ej., al menos un 60%, 70%, 80%, 90% o más, ambos inclusive, de la función del antígeno para provocar una respuesta inmunitaria en un sujeto. Al determinar las secuencias polinucleotídicas, todas las secuencias polinucleotídicas objeto capaces de codificar secuencias de aminoácidos sustancialmente similares se consideran sustancialmente similares a una secuencia polinucleotídica de referencia, independientemente de las diferencias en la secuencia de codones. Una secuencia de nucleótidos es "sustancialmente similar" a una secuencia de un ácido nucleico de un antígeno dada si: (a) la secuencia de nucleótidos se hibrida con las regiones codificantes de la secuencia del antígeno natural, o (b) la secuencia de nucleótidos es capaz de hibridar con la secuencia de nucleótidos del antígeno natural en condiciones moderadamente rigurosas y tiene una actividad biológica similar a la proteína antigénica natural; o (c) las secuencias de nucleótidos están degeneradas como resultado del código genético con respecto a las secuencias de nucleótidos definidas en (a) o (b). Las proteínas sustancialmente similares serán normalmente más de aproximadamente un 80 % similares a la secuencia correspondiente de la proteína natural.
Las variantes pueden incluir cambios de aminoácidos conservativos o no conservativos, como se describe a continuación. Los cambios de polinucleótidos pueden dar como resultado sustituciones, adiciones, eliminaciones, fusiones y truncamientos de aminoácidos en el polipéptido codificado por la secuencia de referencia. Las variantes también pueden incluir inserciones, eliminaciones o sustitución de aminoácidos, incluyendo inserciones y sustituciones de aminoácidos y otras moléculas) que normalmente no se producen en la secuencia peptídica que es la base de la variante, por ejemplo, pero sin limitación, la inserción de ornitina que normalmente no se encuentra en proteínas humanas. Las "sustituciones conservativas de aminoácidos" son el resultado del reemplazo de un aminoácido por otro que tiene una estructura y/o propiedades químicas similares. Las tablas de sustituciones conservativas que proporcionan aminoácidos funcionalmente similares son bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, cada uno de los siguientes seis grupos contienen aminoácidos que son sustituciones conservativas entre sí: (1) Alanina (A), Serina (S), Treonina (T); (2) Ácido aspártico (D), Ácido glutámico (E); (3) Asparagina (N), Glutamina (q ); (4) Arginina (R), Lisina (K); (5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V); y (6) fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptófano (W). Véase, p. ej., Creighton, PROTEINS (W. H. Freeman & Co.,1984).
La elección de los aminoácidos conservativos se puede seleccionar en función de la ubicación del aminoácido que se sustituirá en el péptido, por ejemplo, si el aminoácido está en el exterior del péptido y expuesto a disolventes, o en el interior y no expuesto a disolventes. La selección de tales sustituciones conservativas de aminoácidos está dentro del conocimiento de un experto en la materia. Por consiguiente, se pueden seleccionar sustituciones de aminoácidos conservativas adecuadas para los aminoácidos en el exterior de una proteína o péptido (es decir, aminoácidos expuestos a un disolvente). Estas sustituciones incluyen, pero sin limitación, las siguientes: sustitución de Y por F, T con S o K, P con A, E con D o Q, N con D o G, R con K, G con N o A, T con S o K, D con N o E, I con L o V, F con Y, 5 con T o A, R con K, G con N o A, K con R, A con S, K o P.
Como alternativa, también se pueden seleccionar sustituciones de aminoácidos conservativas adecuadas para los aminoácidos en el interior de una proteína o péptido (es decir, los aminoácidos no están expuestos a un disolvente). Por ejemplo, se pueden utilizar las siguientes sustituciones conservativas: donde Y se sustituye con F, T con A o S, I con L o V, W con Y, M con L, N con D, G con A, T con A o S, D con N, I con L o V, F con Y o L, S con A o T y A con S, G, T o V. En algunos casos, los polipéptidos LF que incluyen sustituciones de aminoácidos no conservativas también se incluyen dentro del término "variantes". Como se usa en el presente documento, la expresión sustitución "no conservativa" se refiere a la sustitución de un resto de aminoácido por un resto de aminoácido diferente que tiene diferentes propiedades químicas. Ejemplos no limitantes de sustituciones no conservativas incluyen el reemplazo del ácido aspártico (D) por glicina (G); el reemplazo de asparagina (N) por lisina (K); y el reemplazo de alanina (A) por arginina (R).
El término "derivado" como se usa en el presente documento se refiere a péptidos que han sido modificados químicamente, por ejemplo, por ubiquitinación, marcado, pegilación (derivatización con polietilenglicol) o adición de otras moléculas. Una molécula también es un "derivado" de otra molécula cuando contiene restos químicos adicionales que normalmente no forman parte de la molécula. Dichos residuos pueden mejorar la solubilidad, absorción, semivida biológica de la molécula, etc. Los residuos pueden, como alternativa, disminuir la toxicidad de la molécula, o eliminar o atenuar un efecto secundario indeseable de la molécula, etc. Los residuos capaces de mediar tales efectos se divulgan en REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES (21a ed., Tory, ed., Lippincott Williams 6 Wilkins, Baltimore, MD, 2006).
El término "funcional" cuando se usa junto con "derivado" o "variante" se refiere a una molécula de proteína que posee una actividad biológica que es sustancialmente similar a una actividad biológica de la entidad o molécula de la que es un derivado o variante. "Sustancialmente similar" en este contexto significa que la actividad biológica, p. ej., antigenicidad de un polipéptido, es al menos un 50 % tan activa como una referencia, p. ej., un polipéptido de tipo silvestre correspondiente, p. ej., al menos el 60 % tan activa, 70 % tan activa, 80 % tan activa, 90 % tan activa, 95 % tan activa, 100% tan activa o incluso más alta (es decir, la variante o derivado tiene mayor actividad que el tipo silvestre), p. ej., 110 % tan activa, 120 % tan activa, o más, ambos inclusive.
El término "recombinante" cuando se usa para describir una molécula de un ácido nucleico, significa un polinucleótido de origen genómico, ADNc, vírico, semisintético y/o sintético, que, en virtud de su origen o manipulación, no está asociado con la totalidad o una porción de las secuencias polinucleotídicas con las que está asociado en la naturaleza. El término recombinante como se usa con respecto a un péptido, polipéptido, proteína, o proteína de fusión recombinante, significa un polipéptido producido por expresión de un polinucleótido recombinante. El término recombinante, tal como se utiliza con respecto a una célula hospedadora, significa una célula hospedadora en la que se ha introducido un polinucleótido recombinante. Recombinante también se usa en el presente documento para referirse a, con referencia al material (p. ej., una célula, un ácido nucleico, una proteína o un vector) que el material se ha modificado mediante la introducción de un material heterólogo (p. ej., una célula, un ácido nucleico, una proteína o un vector).
El término "vectores" se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar o mediar la expresión de un ácido nucleico heterólogo al que se ha unido a una célula hospedadora; un plásmido es una especie del género abarcado por el término "vector". El término "vector" se refiere normalmente a una secuencia de un ácido nucleico que contiene un origen de replicación y otras entidades necesarias para la replicación y/o mantenimiento en una célula hospedadora. Los vectores capaces de dirigir la expresión de los genes y/o de la secuencia del ácido nucleico a los que están unidos operativamente se denominan "vectores de expresión" en el presente documento. En general, Los vectores de expresión de utilidad se encuentran con frecuencia en forma de "plásmidos" que se refieren a moléculas circulares de ADN bicatenario que, en su forma de vector no se unen al cromosoma y normalmente comprenden entidades para la expresión estable o transitoria del ADN codificado. Otros vectores de expresión que se pueden utilizar en los métodos divulgados en el presente documento incluyen, pero sin limitación, plásmidos, episomas, cromosomas artificiales bacterianos, cromosomas de levadura artificiales, bacteriófagos o vectores víricos, y dichos vectores pueden integrarse en el genoma del hospedador o replicarse de forma autónoma en la célula particular. Un vector puede ser un vector de ADN o ARN. También se pueden utilizar otras formas de vectores de expresión conocidas por los expertos en la materia que cumplen funciones equivalentes, por ejemplo, vectores extracromosómicos autorreplicantes o vectores que se integran en un genoma del hospedador. Los vectores preferidos son aquellos capaces de realizar la replicación autónoma y/o la expresión de ácidos nucleicos a los que están unidos.
El término "reducido" o "reducir" o "disminuir" como se usa en el presente documento generalmente significa una disminución en una cantidad estadísticamente significativa con respecto a una referencia. Para evitar dudas, "reducido" significa una disminución estadísticamente significativa de al menos un 10 % en comparación con un nivel de referencia, por ejemplo, una disminución de al menos un 20 %, al menos un 30 %, al menos un 40 %, al menos un 50 %, o al menos un 60 %, o al menos un 70 %, o al menos un 80 %, al menos un 90 % o más, hasta e incluyendo una disminución del 100% (es decir, nivel ausente en comparación con una muestra de referencia), o cualquier disminución entre el 10-100 % en comparación con un nivel de referencia, tal y como se define ese término en el presente documento.
El término "bajo" como se usa en el presente documento generalmente significa más bajo en una cantidad estadísticamente significativa; para evitar dudas, "bajo": un valor estadísticamente significativo al menos un 10% más bajo que el nivel de referencia, por ejemplo, un valor al menos un 20 % más bajo que un nivel de referencia, al menos un 30 % más bajo que un nivel de referencia, al menos un 40 % más bajo que un nivel de referencia, al menos un 50 % más bajo que un nivel de referencia, al menos un 60 % más bajo que un nivel de referencia, al menos un 70 % más bajo que un nivel de referencia, al menos un 80 % más bajo que un nivel de referencia, al menos un 90% más bajo que un nivel de referencia, hasta e incluyendo un 100% más bajo que un nivel de referencia (es decir, nivel ausente en comparación con una muestra de referencia).
Los términos "aumentado" o "aumento", como se usan en el presente documento, generalmente significan un aumento en una cantidad estadísticamente significativa; tal como un aumento estadísticamente significativo de al menos un 10 % en comparación con un nivel de referencia, incluyendo un aumento de al menos un 20 %, al menos un 30 %, al menos un 40 %, al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 90 %, al menos un 100 % o más, ambos inclusive, incluyendo, por ejemplo un aumento de al menos 2 veces, al menos 3 veces, al menos 4 veces, al menos 5 veces, al menos 10 veces o más en comparación con un nivel de referencia, tal y como se define ese término en el presente documento.
El término "alto" como se usa en el presente documento generalmente significa que es más alto en una cantidad estadísticamente significativa con respecto a una referencia; tal como un valor estadísticamente significativo al menos un 10 % más alto que un nivel de referencia, por ejemplo, al menos un 20 % más alto, al menos un 30 % más alto, al menos un 40 % más alto, al menos un 50 % más alto, al menos un 60 % más alto, al menos un 70 % más alto, al menos un 80% más alto, al menos un 90% más alto, al menos un 100% más alto, ambos inclusive, tal como al menos 2 veces más alto, al menos 3 veces más alto, al menos 4 veces más alto, al menos 5 veces más alto, al menos 10 veces más alto o más, en comparación con un nivel de referencia.
Como se usa en el presente documento, el término "que comprende" significa que también pueden estar presentes otros elementos además de los elementos definidos presentados. El uso de "que comprende" indica inclusión en lugar de limitación.
El término "que consiste en" se refiere a composiciones, métodos, y componentes correspondientes de los mismos como se describe en el presente documento, que son exclusivos de cualquier elemento no mencionado en esa descripción de la realización.
Como se usa en el presente documento la expresión "que consiste esencialmente en" se refiere a los elementos requeridos para una realización dada. La expresión permite la presencia de elementos adicionales que no afectan materialmente a las características básicas y novedosas o funcionales de esa realización de la invención.
Se entiende además que todos los tamaños de bases o los tamaños de aminoácidos y todos los valores de pesos moleculares o masas moleculares, proporcionados para los ácidos nucleicos o polipéptidos son aproximados, y se proporcionan para la descripción. Aunque pueden utilizarse métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento a la hora de poner en práctica o probar la presente divulgación, en el presente documento se describen métodos y materiales adecuados.
Como se usa en el presente documento el término "biotina" se refiere al compuesto biotina en sí y análogos, derivados y variantes de la misma. Por tanto, el término "biotina" incluye biotina (ácido cis-hexahidro-2-oxo-1H-tieno [3,4] imidazol-4-pentanoico) y cualquier derivado y análogo de la misma, incluyendo compuestos de tipo biotina. Dichos compuestos incluyen, por ejemplo, biotina-e-N-lisina, hidrazida de biocitina, derivados amino o sulfhidrilo de 2-iminobiotina y éster de N-hidroxisuccinimida del ácido biotinil-E-aminocaproico, sulfosuccinimidaiminobiotina, biotinbromoacetilhidrazida, p-diazobenzoil biocitina, 3-(N-maleimidopropionil)biocitina, destiobiotina y similares. El término "biotina" también comprende variantes de biotina que pueden unirse específicamente a uno o más residuos de rizavidina, avidina, estreptavidina, tamavidina u otros péptidos similares a avidina.
Ejemplos
Ejemplo 1: Expresión de proteína de unión a biotina recombinante soluble y de alto rendimiento y proteínas de fusión de la misma en E. coli
La rizavidina recombinante (rRhavi) utilizada en estos estudios es una versión modificada en el extremo N que contiene solamente los restos 45 a 179 de la proteína de tipo silvestre. Para optimizar el nivel de expresión de rRhavi en E. coli, la secuencia génica que codifica los polipéptidos de rizavidina (45-179) se diseñó de nuevo utilizando codones de expresión preferidos de E. coli, después se sintetizó y se clonó en el vector PET21b. Para facilitar el correcto plegamiento y obtener un alto rendimiento de proteína recombinante soluble, una secuencia de ADN que codifica una secuencia señal de localización periplásmica de E. coli (19 aminoácidos, MKKIWLALAGLVLAFSASA, SEQ ID NO: 2) se introdujo en el extremo 5' del gen sintético de rRhavi. Se predice que esta secuencia señal se eliminará automáticamente de la proteína recombinante después de su direccionamiento al periplasma de E. coli durante el proceso de expresión.
Una secuencia de ADN que codifica una región enlazadora flexible y una etiqueta His (GGGGSSSVDKLAAALEHHHHHH, SEQ ID NO: 14) se insertó directamente en el extremo 3' del gen sintético de rRhavi. Esto ayuda a la purificación de la proteína de unión a biotina recombinante. Asimismo, se puede insertar un antígeno en el enlazador que tiene un enlazador flexible en ambos lados, p. ej., el antígeno se puede insertar entre los aminoácidos S y V del enlazador. Como el antígeno está separado de la proteína de unión a biotina por el enlazador peptídico (GGGGSSS, SEQ ID NO: 22) y de la etiqueta His por el enlazador peptídico (VDKLAAALE, SEQ ID NO: 11) esto puede estabilizar la proteína de fusión.
Para construir proteínas de fusión rizavidina-antígeno, una secuencia de ADN que codifica una región enlazadora flexible que consiste en siete aminoácidos (GGGGSSS, SEQ ID NO: 22) se puede insertar directamente en el extremo 3' del gen de rRhavi sintético, para ayudar a estabilizar la proteína de fusión. Los genes que codifican antígenos candidatos (longitud completa o fragmento deseado) se amplificaron a partir del ADN genómico de los patógenos interesados mediante procedimientos de PCR de rutina y se insertaron en el vector de expresión rRhavi justo después de la región enlazadora.
Para la expresión de proteínas, los plásmidos que contenían construcciones diana se transformaron en E. coli, cepa BL21 (DE3) usando el procedimiento convencional de choque térmico. Se recogió una única colonia recién sacada de la placa (o se utilizó una solución madre de glicerol más tarde) y se inoculó en 30 ml de medio Luria-Bertani (LB) que contenía ampicilina (Amp+) para un cultivo durante la noche a 37 °C. El día 2, se inoculó un cultivo de partida de 5 ml en 1 litro de medio LB/Amp+ y se cultivó a 37 °C hasta que se alcanzó una DO600= 1. Después de enfriar el medio a 16 °C, se añadió a los cultivos una concentración final 0,2 mM de IPTG para una inducción durante la noche.
Las proteínas se purificaron a partir de la fracción periplásmica usando un protocolo de choque osmótico modificado. Brevemente, las células bacterianas del cultivo de 6 litros se recogieron y se resuspendieron en 120 ml de tampón que contenía Tris 30 mM (pH 8,0), sacarosa al 20% y EDTA I mM. Después de agitar a temperatura ambiente durante 20 min, las células se volvieron a sedimentar mediante centrifugación a 10.000 rpm durante 10 min. El sobrenadante se recogió como fracción 1 y las células se resuspendieron en 80 ml de una solución helada que contenía MgCl2 5 mM, inhibidor de proteinasa y DNasa. Después de agitar a 4° durante 20 min, la mezcla se sometió a centrifugación a 13.000 rpm durante 20 min y el sobrenadante se recogió como fracción 2. Después de añadir una concentración final de NaCl 150 mM, MgCh 10 mM, e imidazol 10 mM, el sobrenadante que combinaba la fracción 1 y la fracción 2 se aplicó a una columna de Ni-NTA. Las proteínas eluidas de la columna Ni-NTA se purificaron adicionalmente mediante filtración en gel utilizando una columna superdex 200 que funcionaba con el purificador AKTA. Las fracciones de los picos que contenían la proteína diana se agruparon y concentraron. La concentración de proteína se midió usando un kit de ensayo de proteínas BCA de Bio-Rad. Las proteínas purificadas se dividieron en alícuotas, se congelaron instantáneamente en nitrógeno líquido y se mantuvieron a -80 °C para uso posterior.
La construcción de la proteína de unión a biotina se muestra esquemáticamente en la figura 1, y la SDS-PAGE de la proteína de unión a biotina purificada se muestra en la figura 2.
La construcción de proteínas de fusión que comprende la proteína de unión a biotina se muestra esquemáticamente en la figura 3, y el ejemplo de SDS-PAGE de las proteínas de fusión purificadas se muestra en la figura 4.
Ejemplo 2: Derivado lipidado de proteínas de unión a biotina
Se produjo un derivado lipidado de la proteína de unión a biotina recombinante usando un método similar al descrito en el ejemplo 1. El derivado lipidado utilizado en este estudio es una versión modificada en el extremo N de rizavidina de tipo silvestre que contiene solamente los restos 45 a 179 de la proteína de tipo silvestre. Para optimizar el nivel de expresión de rRhavi en E. coli, la secuencia génica que codifica los polipéptidos de rizavidina (45-179) se diseñó de nuevo utilizando codones de expresión preferidos de E. coli, después se sintetizó y se clonó en el vector PET21b. Para facilitar la lipidación, el correcto plegamiento y obtener un alto rendimiento de proteína recombinante soluble, una secuencia de ADN que codifica la secuencia de lipidación (19 aminoácidos, MKKVAAFVALSLLMAGC, SEQ ID NO: 3) se introdujo en el extremo 5' del gen sintético de rRhavi. La lipidación se añadirá al resto Cys de la secuencia de lipidación mediante bacterias, p. ej., E. coli, durante el proceso de expresión.
Para la expresión de proteínas, el plásmido que contenía construcciones diana se transformó en E. coli, cepa BL21 (DE3) usando el procedimiento convencional de choque térmico. Se recogió una única colonia recién sacada de la placa (o se utilizó una solución madre de glicerol más tarde) y se inoculó en 30 ml de medio Luria-Bertani (LB) que contenía ampicilina (Amp+) para un cultivo durante la noche a 37 °C. El día 2, se inoculó un cultivo de partida de 5 ml en 1 litro de medio LB/Amp+ y se cultivó a 37 °C hasta que se alcanzó una DO600= 1. Después de enfriar el medio a 16 °C, se añadió a los cultivos una concentración final 0,2 mM de IPTG para una inducción durante la noche.
La rizavidina lipidada se purificó a partir de la fracción de la membrana de E. coli. Se recogieron células de E. coli y se resuspendieron en tampón de lisis (Tris 20 mM, NaCl 500 mM, pH 8.0) que contenía inhibidores de proteasa, Dnasa, Mg2+ 10 mM y lisozima. Las células se rompieron mediante un ciclo de congelación-descongelación y el sobrenadante se eliminó después de la centrifugación a 13.000 rpm durante 45 min. A continuación, se resuspendieron los sedimentos celulares en tampón de lisis que contenía SDOC al 0,5 % y se homogeneizaron mediante un batidor de perlas. A continuación, se aplicaron los lisados para centrifugación a 13.000 rpm durante 45 min y se recogió el sobrenadante para purificación por afinidad. La rhavi lipidada se eluyó con tampón de lisis que contenía SDOC al 0,5 % e Im 300 mM.
Las proteínas eluidas de la columna Ni-NTA se purificaron adicionalmente mediante filtración en gel utilizando una columna superdex 200 que funcionaba con el purificador AKTA. Las fracciones de los picos que contenían la proteína diana se agruparon y concentraron. La concentración de proteína se midió usando un kit de ensayo de proteínas BCA de Bio-Rad. Las proteínas purificadas se dividieron en alícuotas, se congelaron instantáneamente en nitrógeno líquido y se mantuvieron a -80 °C para uso posterior.
La proteína de unión a biotina lipidada producida se muestra esquemáticamente en la figura 5, y la SDS-PAGE de la proteína de unión a biotina lipidada purificada se muestra en la figura 6.
Ejemplo 3: Actividad TLR2 de la proteína de unión a biotina lipidada
Se probó la actividad TLR2 de la proteína de unión a biotina lipidada en células HEK TLR2. Las células HEK TLR2 se sembraron en placas de 24 pocillos a 5x105 células/pocillo en un volumen de 500 pl. Se añadió proteína de unión a biotina lipidada a diferentes concentraciones para la estimulación a 37 °C durante la noche. Los sobrenadantes se recogieron el segundo día para la medición de IL-8 mediante ELISA. Como control, se utilizaron células HEK 293 para la estimulación en las mismas condiciones.
Se determinó la actividad TLR2 de la proteína de unión a biotina lipidada. Los resultados mostraron que la proteína de unión a biotina lipidada inducía la producción de IL-8 a partir de células HEK TLR2, pero no a partir de células HEK 293. (figura 7).
Ejemplo 4: Mutantes no hemolíticos de Hla y proteínas de fusión
La secuencia de ADN que codifica el polipéptido maduro Hla de tipo silvestre (aminoácidos 27 a 319) se clonó a partir del genoma de Staphylococcus aureus. Todos los mutantes no hemolíticos de Hla se generaron mediante mutagénesis dirigida usando cambio rápido. Para producir proteínas de fusión de unión a biotina-Hla, la secuencia de ADN que codifica Hla de tipo silvestre o Hla mutante se insertó después de la región enlazadora seguida del gen de la proteína de unión a biotina. Todas las construcciones se clonaron en PET21b y se transformaron en E. coli para la expresión como se describe anteriormente.
Se produjeron mutantes no hemolíticos de Hla. Las variantes no hemolíticas de Hla ilustrativas se muestran esquemáticamente en la figura 8. La SDS-PAGE de las variantes de Hla purificadas de tipo silvestre o no hemolíticas y la proteína de fusión se muestra en las figuras 9 y 10.
Ejemplo 5: Actividad hemolítica de Hla de tipo silvestre, Hla mutante y proteínas de fusión
La actividad hemolítica de Hla de tipo silvestre, Hla mutante y sus proteínas de fusión con la proteína de unión a biotina se analizaron utilizando células sanguíneas de conejo. Se sedimentaron glóbulos rojos de 250 pl de sangre de conejo, se lavaron con PBS dos veces y después se resuspendieron en 10 ml de PBS. Hla de tipo silvestre, Hla mutante y las proteínas de fusión se diluyeron con PBS a las concentraciones indicadas y después se añadieron a una placa de 96 pocillos a razón de 100 pl por pocillo. Se añadieron células sanguíneas a una placa de 96 pocillos que contenía Hla o proteínas de fusión a 25 pl por pocillo y después se incubaron a 37 °C durante 30 min. Los sobrenadantes se recogieron después de centrifugar a 2000 rpm durante 5 min y se analizaron mediante un lector ELISA a una DO450.
Se ensayó la actividad hemolítica de Hla de tipo silvestre, Hla mutante y sus proteínas de fusión. Los resultados demuestran que la Hla mutante tiene una actividad hemolítica mucho menor con respecto a la Hla de tipo silvestre.
(figura 11). Asimismo, las proteínas de fusión de Hla que comprenden una proteína de unión a biotina tenían una actividad hemolítica incluso menor con respecto a la proteína Hla mutante no de fusión (figura 12).
Ejemplo 6: Actividad estimuladora de la proteína de fusión de Hla mutante
Se estimularon macrófagos C57 TS con proteína de fusión mutante de Hla no hemolítica. Las células se sembraron en placas de 24 pocillos a 5x 105 células por pocillo. La proteína de fusión de Hla mutante se diluyó con medio de crecimiento y se añadió a los pocillos a la concentración indicada para la estimulación a 37 °C durante la noche. Los sobrenadantes se recogieron el segundo día después de la centrifugación a 2000 rpm durante 5 min y después se analizaron para determinar la secreción de citocinas mediante ELISA.
Se analizó la actividad estimuladora de la proteína de fusión de Hla mutante. Los resultados mostraron que la proteína de fusión de mutante Hla (rhavi-Hla209) inducía la producción de múltiples citocinas proinflamatorias, incluyendo TNF-a, IL-6, Il-23, IL-ip e IL-17 (figura 13).
Ejemplo 7. Las proteínas de unión a biotina lipidadas y las proteínas de fusión de Hla mutante facilitan la respuesta inmunitaria a otros antígenos.
Las construcciones de vacunas basadas en MAPS se hicieron a partir de polisacárido capsular neumocócico de serotipo 1 biotinilado, antígenos de TB fusionados con rizavidina y uno de rizavidina no lipidada, rizavidina lipidada o rhavi-Hla209. Los ratones se inmunizaron con diferentes construcciones de MAPS y las respuestas de los linfocitos T contra los antígenos de TB en diferentes grupos de inmunización se analizaron y compararon después de 3 inmunizaciones. Brevemente, la sangre completa de diferentes grupos de ratones se estimuló con proteínas de TB purificadas in vitro a 37 °C durante 6 días y la concentración de citocinas en el sobrenadante se detectó mediante ELISA.
Los resultados mostraron que los grupos de ratones que recibieron el complejo de MAPS que contenía rizavidina lipidada o que contenía rhavi-Hla209 generaron mejores respuestas de células Th17 (IL-17A) y Thl (IFN-y) a los antígenos de TB. (figura 14). Esto indicó que la rizavidina lipidada y rhavi-Hla209 pueden actuar como coestimulantes/adyuvantes en la formulación de la vacuna de MAPS.

Claims (13)

REIVINDICACIONES
1. Una proteína de unión a biotina recombinante soluble, que consiste en la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 1.
2. Una proteína de fusión que comprende:
una proteína de unión a biotina soluble que consiste en una secuencia de aminoácidos de al menos un 90 % de identidad con el SEQ ID NO: 1 o con el SEQ ID NO: 15, y
una proteína o péptido antigénicos.
3. La proteína de fusión de la reivindicación 2, en donde se fusiona la proteína o el péptido antigénicos con las proteínas de unión a biotina solubles mediante un enlazador peptídico.
4. La proteína de fusión de la reivindicación 3, en donde el enlazador peptídico comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14 o SEQ ID NO: 22.
5. La proteína de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 2-4, en donde la proteína o el péptido antigénicos son un antígeno seleccionado del grupo que consiste en: antígenos neumocócicos, antígenos de tuberculosis, antígenos de ántrax, antígenos HIV, antígenos de gripe estacional o epidémica, antígenos de Pertussis, antígenos de Staphylococcus aureus, antígenos meningocócicos, antígenos de Haemophilus, antígenos HPV, antígenos de E. coli, antígenos de Salmonella, antígenos de Enterobacter, antígenos de Pseudomonas, antígenos de Klebsiella, antígenos de Citrobacter, antígenos de Clostridia, antígenos de Shigella, antígenos patógenos de Campylobacter, antígenos de Vibrio cholera, antígenos cancerosos o tumorales, toxoides, toxinas, o porciones de toxinas, o combinaciones de los mismos.
6. La proteína de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 2-5, en donde la proteína o el péptido antigénicos comprende una variante de alfa-hemolisina de S. aureus.
7. La proteína de fusión de la reivindicación 6, en donde la variante de alfa-hemolisina de S. aureus tiene una actividad hemolítica menor que un título equivalente de alfa-hemolisina (Hla) de tipo silvestre.
8. La proteína de fusión de las reivindicaciones 6 o 7, en donde la variante de alfa-hemolisina de S. aureus comprende:
(i) una mutación en los restos de aminoácido 205, 213 o 209-211 de alfa-hemolisina de S. aureus de tipo silvestre; o
(ii) una de las siguientes mutaciones en la alfa-hemolisina de S. aureus de tipo silvestre:
(a) resto 205 W a A;
(b) resto 213 W a A; o
(c) restos 209-211 DRD a AAA; o
(iii) la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en el SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25; o
(iv) la secuencia de aminoácidos de los aminoácidos 27-319 de alfa-hemolisina de S. aureus de tipo silvestre.
9. La proteína de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 2-8, en donde la proteína de fusión comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27 o SEQ ID NO: 28.
10. La proteína de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 6-9, en donde la proteína de fusión que comprende una alfa-hemolisina de S. aureus variante tiene al menos un 25 % menos de actividad hemolítica que un título equivalente de alfa-hemolisina (Hla) de tipo silvestre.
11. La proteína de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 2-10, para su uso en un método para inducir una respuesta inmunitaria en un sujeto, comprendiendo el método administrar al sujeto una composición farmacéuticamente aceptable que comprende la proteína de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 2-10.
12. La proteína de fusión para su uso de acuerdo con la reivindicación 11, en donde la respuesta inmunitaria se selecciona de;
(i) una respuesta de anticuerpos o de linfocitos B; o
(ii) una respuesta de linfocitos T CD4+, preferentemente una respuesta Th1, Th2 o Th17; o
(iii) una respuesta de linfocitos T CD8+ o una respuesta de linfocitos T CD4+/CD8+; o
(iv) una respuesta de anticuerpos o de linfocitos B y una respuesta de linfocitos T.
13. La proteína de fusión para su uso de acuerdo con la reivindicación 12, en donde la respuesta inmunitaria es una respuesta de anticuerpos o de linfocitos B y una respuesta de linfocitos T.
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