MX2013013112A - Proteina que enlaza biotina modificada, proteinas de fusion de la misma y aplicaciones. - Google Patents

Proteina que enlaza biotina modificada, proteinas de fusion de la misma y aplicaciones.

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Fan Zhang
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Abstract

La descripción proporciona proteínas que enlazan biotina modificadas que se pueden expresar en forma soluble en alto rendimiento en bacterias. También se proporcionan proteínas de fusión que comprenden la proteína que enlaza biotina modificada y un antígeno. La descripción además proporciona variantes no hemolíticas de alfa-hemolisina del S. aureus y proteína de fusión que comprende la variante no hemolítica de alfa-hemolisina y un dominio que enlaza biotina. También se describen composiciones inmunogénicas que comprenden las proteínas y también se describe el uso de tales composiciones inmunogénicas para inducir una respuesta inmune o para vacunar a un sujeto.

Description

PROTEÍNA QUE ENLAZA BIOTINA MODIFICADA, PROTEÍNAS DE FUSIÓN DE LA MISMA Y APLICACIONES CAMPO TÉCNICO La presente descripción se relaciona a proteínas que enlazan biotina y las proteínas de fusión/composiciones que comprenden tales proteínas que enlazan biotina. También se describen en la presente métodos para expresar proteínas que enlazan biotina y/o las proteínas de fusión de las mismas en alto rendimiento y en forma soluble en bacterias.
ANTECEDENTES La proteína que enlaza biotina y sus derivados se pueden utilizar ampliamente en varias aplicaciones. Sin embargo, la producción o purificación de proteínas que enlazan biotina recombinantes puede ser muy difícil. Cuando se expresan en E. coli, la mayoría de proteínas que enlazan biotina tienden a acumularse en cuerpos de inclusión, por lo que se requieren desnaturalización, replegamiento y procesamiento corriente abajo tedioso en la preparación de proteínas activas. La expresión en E. coli es preferible debido al bajo costo de producción y el potencial para ingeniería adicional; de esta manera, las proteínas que enlazan biotina que se pueden producir ' eficientemente en E. coli son altamente buscadas. Además, la expresión en E. coli también proporciona la posibilidad para generar proteínas de fusión recombinantes que contienen proteína que enlaza biotina para varias aplicaciones.
Por consiguiente, hay una necesidad en la técnica por proteínas que enlazan biotina y proteínas de fusión que contienen proteínas que enlazan biotina que se puedan expresar en forma soluble en altos rendimientos en E. coli .
BREVE DESCRIPCIÓN Un objetivo de la presente descripción es proporcionar una proteína que enlaza biotina recombinante, que se puede expresar en forma soluble en altos rendimientos en E. coli. Por consiguiente, la presente descripción proporciona proteínas que enlazan biotina y composiciones que comprenden las mismas. En algunas modalidades, la proteína que enlaza biotina recombinante comprende una secuencia de señal de E. coli fusionada al N-terminal de una secuencia de aminoácidos que comprende los aminoácidos 45-179 (FDASNF DFSSIASASSSWQNQSGSTMIIQVDSFGNVSGQYVNRAQGTGCQNSPYPLTGR VNGTFIAFSVGWNNSTENCNSATGWTGYAQVNGNNTEIVTSWNLAYEGGSGPAIEQGQDTF QYVPTTENKSLLKD, SEC ID No: 1) de Rhizavidina (rhavi) de tipo silvestre. En algunas modalidades, la secuencia de señal de E. coli es MKKIWLALAGLVLAFSASA (SEC ID No: 2). La secuencia de señal se puede fusionar con la secuencia que comprende los aminoácidos 45-179 de rhavi de tipo silvestre mediante un enlazador de péptido flexible.
También se proporciona en la presente un método para expresar una proteína que enlaza biotina en forma soluble en alto rendimiento en E. coli. En algunas modalidades, el método comprende expresar una proteína que enlaza biotina en E. coli, en donde la secuencia de señal nativa de la proteína que enlaza biotina se ha reemplazado por una secuencia de señal de E. coli. En algunas modalidades, la secuencia de señal es MKKIWLALAGLVLAFSASA (SEC ID No: 2) .
En todavía otro aspecto, la invención proporciona proteína de fusión que enlaza biotina que comprende un dominio que enlaza biotina y una proteína o un péptido.
En otro aspecto se proporciona en la presente una proteína que enlaza biotina lipidada. Como se utiliza en la presente, el término "proteína que enlaza biotina lipidada" se refiere a una proteína que enlaza biotina que se enlaza covalentemente con un lípido. Las proteínas que enlazan biotina lipidadas son ligandos o agonistas del receptor similar a Toll 2. Por consiguiente, también se proporcionan en la presente métodos para inducir una respuesta inmune en un sujeto. El método que comprende administrar al sujeto una composición que comprende una proteína que enlaza biotina lipidada .
También se proporciona en la presente un método para expresar una proteína que enlaza biotina lipidada en E. coli. En algunas modalidades, el método comprende expresar una proteina que enlaza biotina lipidada en E. coli, en donde la secuencia de señal nativa de la proteina que enlaza biotina se ha reemplazado por una secuencia de señal de E. coli que contiene un motivo de lipidación. En algunas modalidades, la secuencia de señal es MKKVAAFVALSLLMAGC (SEC ID No: 3) .
En todavía otro aspecto, se proporciona en la presente un derivado no hemolítico de alfa-hemolisina (HLA) de Staphylococcal aureus. El derivado de Hla descrito en la presente puede estar en la forma de una proteína de fusión, en donde la proteína de fusión comprende tanto el dominio derivado de Hla como un dominio que enlaza biotina. En algunas modalidades de este aspecto, el dominio que enlaza biotina es una proteína que enlaza biotina descrita en la presente.
Similar a las proteínas que enlazan biotina lipidadas, las variantes de Hla o sus proteínas de fusión con proteínas que enlazan biotina descritas en la presente también son ligandos o agonistas de receptores similares a Toll u otros receptores de reconocimiento de patrón (PRRs) . Por consiguiente, también se proporcionan en la presente métodos para inducir una respuesta inmune en el sujeto. En algunas modalidades, el método comprende administrar al sujeto una composición que comprende una variante de Hla no hemolítica o sus proteínas de fusión con la proteína que enlaza biotina descrita en la presente.
En aun todavía otro aspecto, se proporciona en la presente una composición inmunogénica o composición de vacuna que comprende una proteína que enlaza biotina, una proteína que enlaza biotina lipidada, una proteína de fusión que enlaza biotina que comprende un dominio que enlaza biotina y una proteína o péptido antigénico. En algunas modalidades de este aspecto, la proteína antigénica es un derivado no hemolítico de Hla descrito en la presente.
También se proporciona en la presente un método para vacunar a un sujeto, por ejemplo, un mamífero, por ejemplo, un humano con las composiciones inmunogénicas como se describen en la presente, el método que comprende administrar una composición de vacuna como se describe en la presente al sujeto.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 es una representación esquemática de una proteína que enlaza biotina modificada de acuerdo con una modalidad descrita en la presente.
La Figura 2 es un SDS-PAGE de una proteína que enlaza biotina recombinante purificada descrita en la presente .
La Figura 3 es una representación esquemática de una proteína de fusión que comprende una proteína que enlaza biotina y un antígeno X.
La Figura 4 es un SDS-PAGE ejemplar de proteínas de fusión de rhizavidina purificadas.
La Figura 5 es una representación esquemática de la proteína que enlaza biotina lipidada de acuerdo con una modalidad descrita en la presente.
La Figura 6 es un SDS-PAGE de una proteína que enlaza biotina lipidada descrita en la presente.
La Figura 7 es una gráfica de barras que muestra la actividad de TLR2 dependiente de dosis de la proteína que enlaza biotina lipidada.
La Figura 8 es una representación esquemática de alfa-hemolisina (Hla) de S. aureus WT o mutante recombinante y sus proteínas de fusión de rhizavidina descritas en la presente. En la Hla no hemolítica, las mutaciones puntuales se hicieron como sigue: (i) residuo 205 W a A; (ii) residuo 213 W a A; o (iii) residuos 209-211 desde DRD a AAA.
La Figura 9 es un SDS-PAGE de Hla de tipo silvestre • purificada o variantes no hemolíticas de la misma.
La Figura 10 es un SDS-PAGE de proteínas de fusión que enlazan biotina purificadas de Hla de tipo silvestre o variantes no hemolíticas de la misma.
La Figura 11 es una gráfica de línea que muestra la actividad hemolítica de Hla WT y variantes no hemolíticas de la misma.' La Figura 12 es una gráfica de línea que muestra la actividad hemolítica de Hla de tipo silvestre, variantes no hemoliticas de Hla, y proteínas de fusión que enlazan biotina de Hla de tipo silvestre y variantes no hemoliticas de la misma.
La Figura 13 es una gráfica de barras que muestra que la estimulación de los macrófagos con la proteína de fusión que enlaza biotina (rhavi-Hla209) induce múltiples citoquinas pro-inflamatorias.
La Figura 14 es una gráfica de barras que muestra que el complejo de sistema que presenta antígeno múltiple (MAPS) que contiene rhizavidina lipidada o rhavi-Hla209 induce respuestas de célula T más fuertes a los antígenos.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE MODALIDADES EJEMPLARES Se debe entender que esta invención no está limitada a la composición, metodología, protocolos y reactivos particulares, etc., descritos en la presente y como tales pueden variar. La terminología utilizada en la presente es para el propósito de describir modalidades particulares únicamente, y no se propone para limitar el alcance de la presente invención, que se define solamente por las reivindicaciones .
Sin desear que sea limitado por una teoría, la baja expresión de una proteína que enlaza biotina en la técnica puede ser debido al mal plegamiento causado por el enlace de disulfuro en cada monómero de la proteína que enlaza biotina que no se forma, o se forma en niveles muy bajos, en el citoplasma de E. coli. Ahora los inventores han descubierto que el plegamiento correcto se puede lograr mediante el transporte en el espacio periplásmico de E. coli. Asi, el plegamiento correcto de las proteínas que enlazan biotina recombinantes se puede mejorar al reemplazar la secuencia de señal nativa completa de una proteína que enlaza biotina con una secuencia de señal de secreción de E. coli. Sin desear que sea limitado por una teoría, esto facilita la translocación de la proteína recombinante en el espacio periplásmico de las células de E. coli. La translocación de la proteína recombinante en el espacio periplásmico de E. coli luego puede proporcionar el enlace de disulfuro funcionalmente importante en la proteína que enlaza biotina (por ejemplo, en Rhizavidina) y la proteína puede plegarse correctamente en una forma soluble y en altos rendimientos.
En un aspecto, se proporciona en la presente una proteína que enlaza biotina que se puede expresar en una forma soluble y en alto rendimiento en E. coli. Como se utiliza en la presente, el término "proteína que enlaza biotina" se refiere a una proteína, que enlaza no covalentemente a biotina o un análogo o derivado de la misma. Alto rendimiento significa que la proteína se puede expresar en una forma soluble en E. coli en una cantidad de aproximadamente 10 mg/L, 11 mg/L, 12 mg/L, 13 mg/L, 14 mg/L, 15 mg/L, 20 mg/L, 25 mg/L, 30 mg/L, 35 mg/L, 30 mg/L, 35 mg/L, 40 rag/L, 45 mg/L, 50 mg/L o mayor.
En algunas modalidades, la proteina que enlaza biotina puede ser una proteina recombinante . La secuencia de codificación para la proteina que enlaza biotina se puede optimizar utilizando codones de expresión de E. coli, para evitar cualquier dificultad durante la expresión en E. coli debido a codones raros presentes en el gen original.
Generalmente, la proteina que enlaza biotina comprende un dominio que enlaza biotina. Como se utiliza en la presente, un "dominio que enlaza biotina" se refiere a una secuencia de polipéptido que enlaza a biotina. Mientras que una proteina que enlaza biotina completa se puede utilizar como un dominio que enlaza biotina, solamente se puede utilizar la porción que enlaza biotina de la proteina. En algunas modalidades, el dominio que enlaza biotina es de Rhizavidina .
En algunas modalidades, el dominio que enlaza biotina consiste de, o consiste esencialmente de, la secuencia de aminoácidos correspondiente a los aminoácidos 45-179 de la Rhizavidina de tipo silvestre. La secuencia de aminoácidos de la Rhizavidina de tipo silvestre es: MIITSLYATFGTIADGRRTSGGKTMIRTNAVAALVFAVATSALAFDASNFKDFSSIASASS SWQNQSGSTMIIQVDSFGNVSGQYVNRAQGTGCQNSPYPLTGRVNGTFIAFSVGWNNSTEN CNSATG TGYAQVNGNNTEIVTSWNLAYEGGSGPAIEQGQDTFQYVPTTENKSLLKD (SEC ID NO: 4) .
En otras palabras, el dominio que enlaza biotina no comprende (es decir, carece) de los aminoácidos 1-44 (MITI SLYATFGTIADGRRTSGGKTMIRTNAVAALVFAVATSALA, SEC ID NO: 5) de la Rhizavidina de tipo silvestre. En algunas modalidades, el dominio que enlaza biotina comprende la secuencia de aminoácidos FDASNFKDFSSIASASSSWQNQSGSTMIIQVDSFGNVSGQYVNRA QGTGCQNSPYPLTGRVNGTFIAFSVGWNNSTENCNSATG TGYAQVNGNNTEIVTSWNLAY EGGSGPAIEQGQDTFQYVPTTEN SLLKD (SEC ID NO: 1) .
En algunas modalidades, el dominio que enlaza biotina comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 50% de identidad, por lo menos 55% de identidad, por lo menos 60% de identidad, por lo menos 65% de identidad, por lo menos 70% de identidad, por lo menos 75% de identidad, por lo menos 80% de identidad, de preferencia por lo menos 85% de identidad, por lo menos 90% de identidad, por lo menos 95% de identidad, por lo menos 96% de identidad, por lo menos 97% de identidad, por lo menos 98% de identidad, o por lo menos 99% de identidad, y más de preferencia por lo menos 9.93% de identidad a la SEC ID NO: 1) .
Mientras que, Helppolainen y colaboradores (Biochem J., 2007, 405:397-405) describen la remoción de solamente los primeros 24 residuos de la Rhizavidina de longitud completa, los inventores han descubierto que los primeros 44 residuos de la Rhizavidina de longitud completa son innecesarios para la estructura de núcleo y la función de Rhizavidina. Además, inesperadamente, los aminoácidos 25-44 (MIRTNAVAALVFAVATSALA, SEC ID NO: 6) de la Rhizavidina de longitud completa reducen la solubilidad y secreción de Rhizavidina expresada en E. coli como el reemplazo de los primeros 44 residuos de la Rhizavidina de longitud completa con un péptido de señal de E. coli condujo a un incremento en la solubilidad y secreción en E. coli de proteínas de biotina descritas en la presente.
En la proteína que enlaza biotina descrita en la presente, el dominio que enlaza biotina se puede extender en el N- o C-terminal por uno o más aminoácidos con la condición de que el N-terminal del dominio que enlaza biotina no comprenda una secuencia de aminoácidos correspondiente a una secuencia de aminoácidos 1-44 de la Rhizavidina de tipo silvestre. Los inventores han descubierto que el truncamiento de los primeros 44 aminoácidos en el N-terminal de la Rhizavidina de tipo silvestre puede incrementar notablemente la expresión de la proteína que enlaza biotina en forma soluble en E. coli. De esta manera, la proteína que enlaza biotina descrita en la presente puede comprender la secuencia X1-X2-X3, en donde X2 es un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos correspondiente a los aminoácidos 45-179 de la Rhizavidina de tipo silvestre y X1 y X3 están independientemente ausentes o un péptido de 1 a aproximadamente 100 aminoácidos con la condición de que el N-terminal de X1 no comprenda una secuencia de aminoácidos correspondiente al N-terminal de aminoácidos 1-44 de la Rhizavidina de tipo silvestre.
En algunas modalidades, las proteínas que enlazan biotina pueden comprender un péptido de señal conjugado al N-terminal de la proteína que enlaza biotina, es decir, X1 puede comprender un péptido de señal. El péptido de señal también es llamado un péptido de guía en el N-terminal, que puede o no puede ser segmentado después de la translocación a través de la membrana. Los péptidos de secreción/señal se describen en más detalle enseguida. En algunas modalidades, la secuencia de señal es MKKIWLALAGLVLAFSASA (SEC ID NO: 2), MAPFEPLASGILLLLWLIAPSRA (SEC ID NO: 7), M KVAAFVALSLLMAGC (SEC ID NO: 3) , o derivado o porción funcional de la misma.
El péptido de señal se puede enlazar al N-terminal del dominio que enlaza biotina, ya sea directamente (por ejemplo, por la vía de un enlace) o indirectamente (por ejemplo, mediante un enlazador) . En algunas modalidades, el péptido de señal se puede enlazar al N-terminal del dominio que enlaza biotina mediante un enlazador de péptido. La secuencia de enlazador de péptido puede ser de cualquier longitud. Por ejemplo, la secuencia de enlazador de péptido puede ser uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince o más aminoácidos en longitud. En algunas modalidades, el enlazador de péptido es de cuatro aminoácidos en longitud.
La secuencia de enlazador de péptido puede comprender cualquier secuencia de aminoácidos. Por ejemplo, el enlazador de péptido puede comprender una secuencia de aminoácidos que se puede segmentar mediante una peptidasa de señal. En algunas modalidades, el enlazador de péptido comprende una secuencia de aminoácidos AQDP (SEC ID NO: 8) o VSDP (SEC ID NO: 9) .
En la proteina que enlaza biotina, el dominio que enlaza biotina se puede conjugar en su C-terminal a un péptido de 1-100 aminoácidos. Tales péptidos en el C-terminal se pueden utilizar para etiquetas de purificación, enlazadores a otros dominios, y los similares.
En ' algunas modalidades, la proteina que enlaza biotina comprende en su N- o C-terminal una o más (por ejemplo, uno, de dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez o más) etiquetas de purificación. Ejemplos de etiquetas de purificación incluyen, pero no están limitadas a una etiqueta de histidina, una etiqueta c-my, una etiqueta Halo, una etiqueta Flag, y las similares. En algunas modalidades, la proteina que enlaza biotina comprende en su C-terminal una etiqueta de histidina, por ejemplo, un (His)6 (SEC ID NO: 10) .
Una etiqueta de purificación se puede conjugar con la proteina que enlaza biotina mediante un enlazador de péptido para aumenta la probabilidad de que la etiqueta se exponga al exterior. La longitud del enlazador puede ser por lo menos uno (por ejemplo, uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, o quince) aminoácidos. El péptido enlazador puede comprender cualquier secuencia de aminoácidos sin limitaciones. En algunas modalidades, el péptido enlazador comprende la secuencia de aminoácidos VDKLAAALE (SEC ID NO: 11) o GGGGSSSVDKLAAALE (SEC ID NO: 12) .
En algunas modalidades, la proteina que enlaza biotina comprende en su C-terminal la secuencia de aminoácidos VDKLAAALEHHHHH (SEC ID NO: 13) o GGGGSSSVDKLAAALEHHHHHH (SEC ID NO: 14).
En algunas modalidades, la proteina que enlaza biotina comprende la secuencia de aminoácidos: MKKIWLALAGLVLAFSASAAQDPFDASNFKDFSSIASASSSWQNQSGSTMIIQVDSFGNVS GQYVNPAQGTGCQNSPYPLTGRVNGTFIAFSVG NNSTENCNSATGWTGYAQVNGNNTEIV TSWNLAYEGGSGPAIEQGQDTFQYVPTTENKSLLKDGGGGSSSVDKLAAALEHHHHHH (SEC ID NO: 15) .
Comparado con las proteínas que enlazan biotina conocidas que forman tetrámeros, la proteína que enlaza biotina descrita en la presente forma un dímero. Sin desear que sea limitado por una teoría, la formación de un dímero además puede mejorar la expresión de la proteína que enlaza biotina descrita en la presente como una proteína soluble en E. coli.
Aunque las proteínas que enlazan biotina son conocidas en la técnica, la proteína que enlaza biotina descrita en la presente comprende diferencias significantes de la avidina y las proteínas similares a avidina actualmente conocidas en la técnica. Primero, las avidinas actualmente conocidas son muy difíciles de expresar como proteínas solubles en E. coli. Sin embargo, como los inventores han demostrado, la proteína que enlaza biotina descrita en la presente se puede expresar como una proteína soluble en E. coli en alto rendimiento.
Las proteínas que enlazan biotina descritas en la presente se pueden obtener en una forma soluble en altos rendimientos, por ejemplo, arriba de 30 mg por litro de cultivo, mediante la expresión en E. coli. De esta manera, las proteínas que enlazan biotina descritas en la presente son más solubles que aquellas descritas en la técnica y reflejan diferencias implícitas. Sin desear que sea limitado por una teoría, la diferencia en la solubilidad se puede atribuir a las diferencias físicas y/o químicas y/o o estructurales implícitas entre las proteínas que enlazan biotina descritas en la presente y proteínas que enlazan biotina conocidas en la técnica.
Segundo, la proteína que enlaza biotina descrita en la presente comprende un dominio que enlaza biotina que consiste de los aminoácidos 45-179 de Rhizavidina de silvestre. Mientras que, la Rhizavidina de tipo silvestre y una porción parcialmente truncada de la misma son conocidas en la técnica, no hay enseñanza o sugerencia en la técnica de que una proteina que enlaza biotina que comprende la secuencia de aminoácido de los aminoácidos 45-179 de Rhizavidina de tipo silvestre y que tiene una secuencia de señal de E. coli conduciría a una proteína soluble que se puede obtener en alto rendimiento en E. coli. De acuerdo con Helppolainen y colaboradores, (Biochem J., 2007, 405:397-405) los aminoácidos 25-44 de la Rhizavidina de tipo silvestre comprenden una secuencia de señal putativa. Sin embargo, como se discute en la presente, los inventores han descubierto y demostrado que el reemplazo de la secuencia de señal putativa con una secuencia de señal de E. coli conduce a un incremento en la forma soluble de la expresión de proteína que enlaza biotina en E. coli.
Tercero, la proteína que enlaza biotina descrita comprende un péptido de secuencia de aminoácidos GGGGSSSVD LAAALEHHHHHH (SEC ID NO: 14). Este péptido en el C-terminal proporciona una etiqueta de histidina para la purificación y un lugar para la inserción de otros dominios, por ejemplo, dominios antigénicos, en la proteína de biotina. Además, mientras que Helppolainen y colaboradores, (Biochem J. , 2007, 405:397-405) describen la expresión de Rhizavidina en E. coli, no hay enseñanza o sugerencia en Helppolainen y colaboradores, para conjugar un péptido adicional al C-terminal del dominio que enlaza biotina de la Rhizavidina .
Cuarto, la Rhizavidina tiene una homología de secuencia inferior a la avidina de huevo (22.4% de identidad de secuencia y 35.0% de similitud) comparada con otras proteínas similares a avidina. Así, la proteína que enlaza biotina descrita en la presente es diferente de la avidina y otras proteínas similares a avidina.
Quinto, la proteína que enlaza biotina descrita en la presente tiene un bajo punto isoeléctrico (pl) comparado con la avidina y otras moléculas similares a avidina. El punto isoeléctrico de la Rhizavidina de tipo silvestre es 4.0 (Helppolainen y colaboradores, Biochem J. , 2007, 405:397-405) . El punto isoeléctrico de otras proteínas que enlazan biotina conocidas está generalmente arriba de 6.1 (ver Helppolainen y colaboradores, Biochem J., 2007, 405:397-405). En comparación, el pl de la proteína que enlaza biotina descrita en la presente es 5.4. El pl acídico de la proteína de enlace descrita en la presente conduce al enlace no específico reducido. Un problema en el uso de la avidina y péptidos similares a avidina actualmente conocidos es el enlace no específico de los mismos. La avidina y péptidos similares a avidina actualmente conocidos no pueden enlazar específicamente a únicamente células, sino también DNAs, proteínas y materiales biológicos, tales como membranas. Por ejemplo, en la detección de un material utilizando el enlace de avidina-biotina, la avidina no enlaza específicamente a materiales del material objetivo que es detectado para incrementar el fondo. Una razón para el alto enlace no específico de la avidina incluye su alto punto isoeléctrico. La avidina es una proteína fuertemente básica, que tiene un punto isoeléctrico significativamente alto de 10 o más, y es positivamente cargada como un conjunto. Por consiguiente, se cree que la avidina fácilmente enlaza a materiales biológicos, que se cargan negativamente en muchos casos. Así, el bajo pl de la proteína que enlaza biotina descrita en la presente es ventajoso sobre la avidina y péptidos similares a avidina actualmente conocidos.
Sexto, el tamaño de la proteína que enlaza biotina descrita en la presente es relativamente pequeño comparado con la avidina y proteínas similares a avidina actualmente conocidas. La proteína que enlaza biotina es más pequeña que 28 kDa (tamaño de dímero) . Sin embargo, la mayoría de la avidina y proteínas similares a avidina actualmente conocidas todas tienen tamaños más grandes que 60 kDa (tamaño de tetrámero) . La Rhizavidina de tipo silvestre se dice que es de aproximadamente 29 kDa (tamaño de dímero) en tamaño. El tamaño pequeño de la proteína que enlaza biotina se puede utilizar para incrementar la carga de la conjugación del enlace entre moléculas de interés. Por ejemplo, la proteína que enlaza biotina se puede utilizar para conjugar la primera molécula de interés con una segunda molécula de interés. Una de las moléculas de interés se puede enlazar a una o más biotinas o moléculas similares a biotina y la segunda molécula se puede enlazar, conjugar o fusionar a la proteina que enlaza biotina. Dado el tamaño pequeño de la proteína de biotina descrita en la presente, la biotina o moléculas similares a biotina se pueden espaciar más cercanas conjuntamente para permitir el enlace más relativo a si la segunda molécula fue una avidina o molécula similares a avidina actualmente conocida más grande.
Séptimo, la proteína que enlaza biotina descrita en la presente es un dímero. La formación de un dímero además puede mejorar la expresión de la proteína que enlaza biotina descrita en la presente como una proteína soluble en E. coli. Adicionalmente, debido a que la proteína que enlaza biotina forma un dímero antes que tetrámero similar a todas las otras proteínas similares a avidina conocidas, 1), la complejidad estructural de los antígenos de fusión se reduce; 2) la dificultad de expresar proteínas de fusión de proteína que enlaza biotina recombinantes se reduce de manera similar; 3) el impedimento estérico de manipulaciones de las fusiones de proteína que enlaza biotina se minimiza, que es ventajoso para manipulaciones adicionales con, por ejemplo, pero no limitados a, biotina, miméticos de biotina o derivados de biotina, y 4) la solubilidad de las fusiones de proteína que enlazan biotina se aumenta grandemente. De esta manera, la demostración de las diferencias implícitas entre las proteínas que enlazan biotina descritas en la presente y aquellas conocidas en la técnica.
Octavo, la proteína que enlaza biotina descrita en la presente reduce el riesgo de una composición inmunogénica que comprende la misma inducción de una reacción alérgica relacionada con el huevo en un sujeto. Por otra parte, el anticuerpo al dominio que enlaza biotina descrito en la presente no tiene reactividad cruzada aparente a la avidina de huevo (y viceversa) .
Además, una proteína que enlaza biotina descrita en la presente puede tener propiedades mejoradas, tal como una reducción en el enlace no específico o un mejoramiento adicional en el enlace de biotina, mientras que retiene las características de la Rhizavidina de tipo silvestre. El uso de la proteína que enlaza biotina descrita en la presente para la detección, por ejemplo, en inmunoensayo o ensayo de hibridación de ácido nucleico, para medir un analito utilizando el enlace de avidina-biotina puede reducir el fondo, incrementar la sensibilidad, y mantener la propiedad del enlace con biotina en condiciones severas.
Este estudio claramente demuestra las ventajas y diferencias de las proteínas que enlazan biotina descritas en la presente sobre la avidina y otras proteínas similares a avidina. De esta manera, las proteínas que enlazan biotina descritas en la presente tienen un potencial como una herramienta poderosa y versátil en una amplia gama de aplicaciones que utilizan la tecnología de avidina-biotina .
Sin limitaciones, una proteína que enlaza biotina se puede utilizar en cualquier metodología, composición, o sistema que requiere el uso de un sistema de avidina-biotina. Como uno de habilidad ordinaria está bien consciente, el sistema de avidina-biotina se puede utilizar para numerosos métodos de laboratorio, tal como bioconjugación; detección de molécula objetivo; aislamiento de molécula objetivo, purificación, o enriquecimiento de una muestra; detección de proteína; detección de ácido nucleico; aislamiento de proteínas, purificación o enriquecimiento; aislamiento de ácido nucleico, purificación o enriquecimiento; ELISA; citometría de flujo; y similares.
Por consiguiente, los usos ejemplares para las proteínas que enlazan biotina recombinantes descritas en la presente incluyen, pero no están limitados a, bioconjugación; detección de molécula objetivo; aislamiento de molécula objetivo, purificación o enriquecimiento de una muestra; detección de proteína; detección de ácido nucleico; aislamiento de proteína, purificación o enriquecimiento; aislamiento de ácido nucleico, purificación o enriquecimiento; ELISA; citometría de flujo; y los similares.
En algunas modalidades, la proteína que enlaza biotina descrita en la presente se puede utilizar como parte del par de afinidad en un sistema que presenta antígeno múltiple (MAPS) como es descrito en la solicitud provisional de los Estados Unidos No. 61/48,934, presentada el 11 de mayo del 2012; No. 61/608,168, presentada el 08 de marzo del 2012, y No. 61/609,974, presentada el 13 de marzo del 2012, y la solicitud de PCT No. PCT/US12/37412, presentada el 11 de mayo del 2012, el contenido de todas las cuales se incorpora en la presente por referencia en su totalidad. MAPS también se describe en más detalle enseguida en la presente. Sin desear que sea limitado por una teoría, el uso de una proteína que enlaza biotina descrita en la presente reduce el riesgo del MAPS que inducen una reacción alérgica relacionada con el huevo en un sujeto. Por otra parte, el anticuerpo a la Rhizavidina modificada recombinante no tiene reactividad cruzada aparente a la avidina de huevo (y viceversa) .
Proteína que enlaza biotina lipidada En otro aspecto se proporciona en la presente una proteína que enlaza biotina lipidada. Como se utiliza en la presente, el término "proteína que enlaza biotina lipidada" se refiere a una proteína que enlaza biotina que se conjuga covalentemente con un lípido. Las porciones de lipido podrían ser un diacil o triacil lipido.
La proteina que enlaza biotina lipidada se puede hacer utilizando una secuencia de lipidacion. Como se utiliza en la presente, el término "secuencia de lipidacion" se refiere a una secuencia de aminoácidos que facilita la lipidacion en una bacteria, por ejemplo, E. coli, de un polipéptido que lleva la secuencia de lapidación. La secuencia de lipidacion puede estar presente en el N-terminal o C-terminal de la proteina. La secuencia de lipidacion se puede enlazar a la proteina que enlaza biotina recombinante para formar una proteina de fusión, que está en forma lipidada cuando se expresa en E. coli mediante la tecnología recombinante convencional. En algunas modalidades, una secuencia de lipidacion se ubica en el N-terminal de la proteína que enlaza biotina.
Cualquier secuencia de lipidacion conocida para uno de habilidad ordinaria en la técnica puede ser utilizada. En algunas modalidades, la secuencia de lipidacion es M KVAAFVALSLLMAGC (SEC ID NO: 3) o un derivado o porción funcional de la misma. Otras secuencias de lipidacion ejemplares incluyen, pero no están limitadas a, MNSKKLCCICVLFSLLAGCAS (SEC ID NO: 16), MRYSKLTMLIPCALLLSAC (SEC ID NO: 17), MFVTSKKMTAAVLAITLAMSLSAC (SEC ID NO: 18), MIKRVLVVSMVGLSLVGC (SEC ID NO: 19) y derivados o porciones funcionales de las mismas.
En algunas modalidades, la secuencia de lipidación se puede fusionar a la proteina que enlaza biotina por la vía de un enlazador de péptido, en donde el enlazador de péptido une la secuencia de lipidación a la proteina que enlaza biotina .
En alguna modalidad, el enlazador de péptido comprende la secuencia de aminoácidos VSDP (SEC ID NO: 9) .
En una modalidad, la proteina de lipido que enlaza biotina comprende la secuencia de aminoácidos MKKVAAFVALSLLMAGCVSDPFDASNF DFSSIASASSS QNQSGSTMIIQVDSFGNVSGQ YVNRAQGTGCQNSPYPLTGRVNGTFIAFSVGWNNSTENCNSATGWTGYAQVNGNNTEIVTS WNLAYEGGSGPAIEQGQDTFQYVPTTENKSLLKD (SEC ID NO: 20) .
Las proteínas que enlazan biotina lipidadas son ligandos para los Receptores Similares a Toll (TLRs) . Como tal, las proteínas que enlazan biotina lipidadas descritas en la presente se pueden utilizar como ligandos de TLR. Por ejemplo, la proteína que enlaza biotina lipidada se puede utilizar en composiciones para inducir la estimulación de TLR2. Esto puede ser útil para inducir inmunogenicidad a otros antígenos/patógenos . Así, las lipoproteínas que enlazan biotina se pueden utilizar en composiciones inmunogénicas como un factor de co-estimulación o adyuvante para un antígeno.
Como se utiliza en la presente, el término "receptor similar a Toll" se propone para referirse en general a cualquier receptor similar a Toll de cualquier especie de organismo. Un TLR puede ser de cualquier especie mamifera. Los TLRs se han identificado en varias especies mamiferas, incluyendo, pero no limitadas a, por ejemplo, humanos, conejillos de indias y ratones. Un TLR especifico se puede identificar con referencia o adicionar a la especie de origen (por ejemplo, humano, murino, etc.), un receptor particular (por ejemplo, TLR2, TLR3, TLR9, etc.), o ambos. En algunas modalidades, la proteina que enlaza biotina lipidada es un ligando para TLR2.
Los receptores similares a Toll (TLRs) son una familia de proteínas de transmembrana codificadas de línea germinal que facilitan el reconocimiento de patógeno y la activación del sistema inmune innato. Los receptores similares a Toll (TLRs) son receptores de reconocimiento de patrón (PRRs), y se expresan por células del sistema inmune innato, incluyendo macrófagos, células dendríticas y células NK. Ejemplos de ligandos conocidos para TLR incluyen bacterias gram positivas (TLR-2) , endotoxina bacteriana (TLR-4), proteína de flagelina (TLR-5), DNA bacteriano (TLR-9), RNA de doble hebra y poli I:C (TLR-3) , y levadura (TLR-2). Otros ligandos que enlazan un receptor de reconocimiento de patrón endocítico, un receptor depurador o un receptor que enlaza mañosa también se pueden contemplar por la presente invención. Los TLRs acoplan los ligandos derivados de patógeno conservados y subsecuentemente activan la ruta de transducción de señal TLR/IL-1R para inducir una variedad de genes efectores. Los receptores similares a Toll (TLRs) representan un grupo importante de PRRs que pueden detectar patrones moleculares asociados con patógeno o microbio. Se expresan ampliamente en la sangre, bazo, pulmón, músculo e intestino por muchos tipos de células, notablemente células dendríticas (DCs), pero también macrófagos, células epiteliales y linfocitos.
Mientras que algunos TLRs ubicados en la superficie celular son específicos para lipidos y proteínas microbianas, otros asociados con células interiores de compartimientos endosomales son específicos para ácidos nucleicos. La ligación de los TLRs por sus ligandos específicos da por resultado cambios conformacionales en los receptores, conduciendo a la transducción de señal corriente abajo que principalmente involucra las rutas dependientes de MyD88 y TRIF. Excepto para TLR3, todos los otros TLRs pueden señalizar a través de la ruta MyD88 para inducir citoquinas pro-inflamatorias que involucran la activación de cascadas de proteína quinasa intracelulares, incluyendo IB quinasa (IKK)-NF-,B y la proteína quinasa regulada de señal extracelular (ERK) , c-Jun N-terminal quinasa (JNK) y proteínas quinasas de activación de mitógeno p38 (MAPKs) . La ruta de TRIF, independiente de MyD88, se utiliza por tanto TLR3 como TLR4 y media la inducción de interferonas tipo I.
Las lipoproteinas que enlazan biotina recombinantes descritas en la presente tienen inmunogenicidad aumentada. Sin desear que sea limitado por una teoría, las porciones de lípido en las N-terminales de las lipoproteinas o lipopéptidos contribuyen a la actividad adyuvante. Por consiguiente, modalidades adicionales proporcionan composiciones inmunogénicas o de vacuna para inducir una respuesta inmunológica, que comprenden la lipoproteína que enlazan biotina aislada, o un vector adecuado para la expresión in vivo de la misma, o ambos, y un portador, así como métodos para inducir una respuesta inmunológica o protectora que comprende administrar a un hospedero la lipoproteína que enlazan biotina recombinante aislada, el vector que expresa la lipoproteína que enlazan biotina recombinante, o una composición que contiene la lipoproteína recombinante o vector, en una cantidad suficiente para inducir la respuesta.
Una composición inmunológica o inmunogénica que comprende la lipoproteína que enlazan biotina induce una respuesta inmunológica - local o sistémica. La respuesta puede, pero no necesita, ser protectora. Se debe observar que como se utiliza en la presente, los términos "composición inmunológica" y "composición inmunogénica" incluyen una "composición de vacuna" ya que los dos primeros términos pueden ser composiciones protectoras) . Sin limitaciones, una proteina que enlaza biotina lipidada descrita en la presente también se puede utilizar como un antigeno, adyuvante o un co-estimulador en una composición inmunológica, inmunogénica, o de vacuna. Además, puesto que la proteina que enlaza biotina lipidada comprende un dominio que enlaza biotina, la proteina lipidada se puede ensamblar a la cadena principal de polímero del MAPS. Por consiguiente, se también se proporciona en la presente métodos para inducir una respuesta inmunológica en un mamífero hospedero. El método que comprende administrar al hospedero una composición inmunogénica, inmunológica o de vacuna que comprende una proteína que enlaza biotina lipidada descrita en la presente y un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable.
En algunas modalidades, la proteína que enlaza biotina lipidada es una proteína de fusión que comprende una proteína que enlaza biotina lipidada y una proteína o péptido .
Hla no hemolítica Las hemolisinas son exotoxinas producidas por bacterias que causan lisis de glóbulos rojos. Mientras que altamente inmunogénicas, su uso en vacunas está limitado debido a que causa lisis de glóbulos rojos. Por consiguiente, en otro aspecto, se proporcionan en la presente variantes de alfa-hemolisina (HLA) de staphylococcal aureus, su constructo de fusión con proteina que enlaza biotina y sus usos. Estas variantes, designadas en la presente como "mHla", tienen sustancialmente actividad no hemolitica, es decir, tienen · sustancialmente baja actividad hemolitica. Como se utiliza en la presente, la frase "sustancialmente no hemolitica" significa una incapacidad para lisar glóbulos rojos en títulos equivalentes de Hla de tipo silvestre. El término "Hla de tipo silvestre" está acorde a la definición usual asociada con tal frase, es decir, Hla que es naturalmente secretada por una fuente bacteriana capaz. "Hla de tipo silvestre", por definición, no incluye, por ejemplo, productos de fusión de Hla derivados por la vía de técnicas de DNA recombinantes . En algunas modalidades, la actividad hemolitica de mHla es por lo menos 5%, por lo menos 10%, por lo menos 15%, por lo menos 20%, por lo menos 20%, por lo menos 30%, por lo menos 30%, por lo menos 35%, por lo menos 40%, por lo menos 45%, por lo menos 50%, por lo menos 55%, por lo menos 60%, por lo menos 65%, por lo menos .70%, por lo menos 75%, por lo menos 80%, por lo menos 85%, por lo menos 90%, por lo menos un 95% inferior que en títulos equivalentes de Hla de tipo silvestre. En algunas modalidades, la mHla no tiene actividad hemolitica detectable. Los inventores también han descubierto que la actividad hemolitica de mHla además se puede reducir al enlazar la mHla con una proteína que enlaza biotina. Por consiguiente, la presente descripción también describe proteínas de fusión que comprenden una proteína mHla y una proteína^ que enlaza biotina.
Como se proporciona en la presente, una Hla no hemolítica se puede crear en donde el residuo W205 o W213 es sustituido con alanina (A) o el tripéptido DRD209-211 es sustituido con un péptido de tri-alanina (AAA) en la Hla de tipo silvestre. La proteína Hla mutada se puede expresar y purificar en un sistema de expresión de E. coli. Los mutantes se pueden hacer mediante la mutación puntual utilizando mutagénesis de cambio rápido. Por ejemplo, la secuencia de nucleótidos de un ácido nucleico que codifica la Hla de tipo silvestre se puede cambiar para reemplazar un aminoácido dado en la Hla de tipo silvestre a otro aminoácido.
En algunas modalidades, la mHla es una proteína de fusión que comprende la mHla y una proteína que enlaza biotina. En algunas modalidades, la proteína de fusión de mHla que enlaza biotina comprende la secuencia de aminoácidos MKKIWLALAGLVLAFSASAAQDPFDASNF DFSSIASASSSWQNQSGSTMIIQVDSFGNVS GQYVNRAQGTGCQNSPYPLTGRVNGTFIAFSVG NNSTENCNSATG TGYAQVNGNNTEIV TSWNLAYEGGSGPAIEQGQDTFQYVPTTENKSLLKDGGGGSSSADSDINI TGTTDIGSNT TV TGDLVTYD ENGMHKKVFYSFIDDKNHN KLLVIRTKGTIAGQYRVYSEEGANKSGLA WPSAFKVQLQLPDNEVAQISDYYPRNSIDTKEY STLTYGFNGNVTGDDTGKIGGLIGANV SIGHTLKYVQPDFKTILESPTDKKVG KVIFNNMVNQNWGPYAAASWNPVYGNQLFMKTRN GSMKAADNFLDPNKASSLLSSGFSPDFATVITMDRKASKQQTNIDVIYERVRDDYQLHWTS TNWKGTNTKDKWIDRSSERYKIDWEKEEMTN (SEC ID NO: 21) .
Las variantes de Hla descritas en la presente son ligandos para los receptores similares a Toll (TLRs) . Como tales, las variantes de Hla descritas en la presente se pueden utilizar como ligandos de TLR. Por ejemplo, las variantes de Hla se pueden utilizar en composiciones para inducir la estimulación de TLR2. Esto puede ser útil para inducir inmunogenicidad a otros antigenos/patógenos. De esta manera, las variantes de Hla descritas en la presente se pueden utilizar en composiciones inmunogénicas como un factor de co-estimulación o adyuvante para un antigeno. Además, cuando la mHla se fusiona con una proteina que enlaza biotina, la proteina de fusión se puede conjugar a la cadena principal del polímero del MAPS.
En algunas modalidades, la mHla se puede utilizar como un factor co-estimulador en una composición inmunogénica o de vacuna.
Además, puesto que la mHla induce una respuesta inmune en el sujeto, la mHla se puede utilizar como en una composición inmunogénica o de vacuna para vacunar a un sujeto contra S. aureus.
La mHla descrita en la presente tiene inmunogenicidad aumentada. Por consiguiente, las modalidades adicionales proporcionan composiciones inmunogénicas o de vacuna para inducir una respuesta inmunológica, que comprende la mHIa, o un vector adecuado para la expresión in vivo de la misma, o ambos, y un portador adecuado, asi como métodos para inducir una respuesta inmunologica o protectora que comprende administrar a un hospedero la mHIa aislada, el vector que expresa la mHIa, o una composición que contiene el mHIa o vector, en una cantidad suficiente para inducir la respuesta.
Una composición inmunologica o inmunogénica que comprende la mHIa puede inducir una respuesta inmiunológica-local o sistémica. La respuesta puede, pero no necesita, ser protectora. Por consiguiente, un mutante no hemolitico de Hla descrito en la presente puede ser como un antigeno, adyuvante, o un co-estimulador en una composición inmunologica, inmunogénica, o de vacuna.
Además, se proporcionan en la presente métodos para inducir una respuesta inmunologica en un mamífero hospedero. El método que comprende administrar al hospedero una composición inmunogénica, inmunologica o de vacuna que comprende un mutante no hemolitico de Hla descrito en la presente y un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable.
En otro aspecto, se proporcionan proteínas de fusión que comprende una proteína que enlaza biotina descrita en la presente enlazada a una proteína o péptido antigénico. Estas proteínas de fusión también son referidas como proteínas de fusión que enlaza biotina y como proteínas de fusión de antigeno en la presente. La proteina que enlaza biotina y la proteina o péptido antigénico se pueden enlazar en cualquier configuración, por ejemplo, una proteina que enlaza biotina puede estar en el N-terminal y el péptido antigénico en el C-terminal de la proteina de fusión o viceversa .
En algunas modalidades, la proteina que enlaza biotina y la proteina o péptido antigénico se enlazan entre si mediante un enlazador de péptido. Sin limitaciones, el enlazador de péptido puede comprender cualquier secuencia de aminoácidos y puede ser de cualquier longitud. Por ejemplo, el enlazador de péptido puede ser uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince o más aminoácidos en longitud. En algunas modalidades, el enlazador de péptido que enlaza el dominio de antigeno al dominio que enlaza biotina es de ocho aminoácidos en longitud.
En algunas modalidades, el enlazador de péptido que enlaza el dominio de antigeno al dominio que enlaza biotina tiene la secuencia de aminoácidos GGGGSSS (SEC ID NO: 22) .
En algunas modalidades, la proteina antigénica es una Hla no hemolitica descrita en la presente.
En algunas modalidades, la proteina Hla no hemolitica es una proteina de fusión que comprende una proteina que enlaza biotina y una Hla no hemolitica descrita en la presente.
En algunas modalidades, la proteína Hla no hemolítica es una proteína de fusión que comprende una proteína que enlaza biotina lipidada y una Hla no hemolítica descrita en la presente.
Composiciones inmunogénicas En otro aspecto, se proporcionan en la presente composiciones inmunogénicas que comprenden una proteína de fusión de antígeno, una proteína que enlaza biotina lipidada, o una variante no hemolítica de Hla descrita en la presente. Además, también se proporcionan en la presente composiciones inmunogénicas y composiciones de vacuna que comprenden un complejo inmunogénico que comprende por lo menos una proteína de fusión de antígeno, o múltiples proteínas de fusión de antígeno, unidas a una estructura polímero para el uso en inducir una respuesta inmune a cada uno de los antígenos unidos al polímero, y opcionalmente al polímero mismo, cuando se administra a un sujeto. Sin desear que sea limitado por una teoría, la composición inmunogénica descrita en la presente estimula una respuesta inmune humoral y celular; puede generar anticuerpo y las respuestas de Thl/Thl7 a múltiples antígenos de proteína utilizando un solo constructo inmunogénico de APS . Una combinación de inmunidad de célula B y T al organismo representa una estrategia de vacuna óptima contra muchas enfermedades, incluyendo enfermedad neumocócica asociada con infección invasiva y acarreo nasofaríngeo. En algunas modalidades, la composición inmunogénica es una vacuna o se incluye en una vacuna.
Por consiguiente, las modalidades en la presente proporcionan una composición inmunogénica y métodos útiles para elevar una respuesta inmune en un sujeto, que se puede utilizar en su propia cuenta o en conjunción o mezcla con esencialmente cualquiera de los procedimientos de vacuna existentes.
En algunas modalidades, una composición inmunogénica como se describe en la presente comprende por lo menos 2 antígenos, o por lo menos 3 antígenos, o por lo menos 5 antígenos, o entre 2-10 antígenos, o entre 10-15 antígenos, o entre 15-20 antígenos, o entre 20-50 antígenos, o entre 50-100 antígenos, o más de 100 antígenos, inclusive. En algunas modalidades, donde una composición inmunogénica como se describe en la presente comprende por lo menos 2 antígenos, los antígenos pueden ser el mismo antígeno o por lo menos 2 diferentes antígenos. En algunas modalidades, los antígenos pueden ser de los mismos o diferentes patógenos, o pueden ser diferentes epítopes o parte de la misma proteína antigénica, o pueden ser el mismo antígeno que es específico a diferentes serotipos o variaciones estacionales del mismo patógeno (por ejemplo, virus de influenza A, B, y C) .
En algunas modalidades, una composición inmunogénica como se describe en la presente comprende un antigeno de un organismo patogénico o un tejido anormal. En algunas modalidades, el antigeno es un antigeno de tumor. En algunas modalidades, un antigeno puede ser por lo menos un antigeno seleccionado de antigenos de patógenos o parásitos, tales como antigenos de Streptococcus pneumoniae, Mycobacterium tuberculosis o M. tetanus, Bacillus anthracis, HIV, antigenos de influenza estacional o epidémica (tales como H1N1 o H5N1), Bordetella pertussis, Staphylococcus aureus, Neisseria meningitidis o N. gonorrhoeae, VPH, Chlamydia trachomatis, HSV u otros virus de herpes, o Plasmodia sp. Estos antigenos pueden incluir péptidos, proteínas, glicoproteínas, o polisacáridos . En algunas modalidades, el antígeno es un toxoide o porción de una toxina.
En algunas modalidades, una composición inmunogénica como se describe en la presente comprende un polisacárido antigénico, por ejemplo, tal como el antígeno Vi (polisacárido capsular de Salmonella typhi) , polisacáridos capsulares neumocócicos, polisacárido de pared celular neumocócica, polisacárido capsular Hib (Haemophilus influenzas tipo B) , polisacáridos capsulares meningocócicos, y otros polisacáridos capsulares o de pared celular bacterianos, o cualquiera de las combinaciones de los mismos. El polisacárido puede tener un componente de proteína, por ejemplo, una glicoproteina, tal como aquellas de virus.
En algunas modalidades, una composición inmunogénica como se describe en la presente además comprende por lo menos un factor de co-estimulación asociado con el polímero o polisacárido, donde el factor de co-estimulación se puede asociar directamente o indirectamente. Por ejemplo, en algunas modalidades, un factor de co-estimulación se puede unir covalentemente al polímero. Por ejemplo, en algunas modalidades, un factor de co-estimulación se puede unir covalentemente a la primera molécula de afinidad, que luego se retícula al polímero. Por ejemplo, en algunas modalidades, un factor de co-estimulación se puede unir a una molécula de afinidad complementaria, que se asocia con una primera molécula de afinidad para enlazar el factor co-estimulador al polímero. En algunas modalidades, un factor de co-estimulación es un adyuvante. En modalidades alternativas, un factor co-estimulatorio puede ser cualquier conocido para uno de habilidad ordinaria en la técnica, e incluye cualquier combinación, por ejemplo, sin limitación, de agonistas del receptor similar a Toll (agonistas para TLR2, 3, 4, 5 7, 8, 9, etc.), agonistas NOD, o agonistas de la inflamasoma.
En algunas modalidades, el factor co-estimulatorio puede ser una proteína que enlaza biotina lipidada o una variante no hemolítica de alfa-hemolisina o la proteína de fusión de mHla con la proteína que enlaza biotina descrita en la presente.
Otro aspecto de la presente invención se relaciona al uso de la composición inmunogénica como se describe en la presente para ser administrada a un sujeto para inducir una respuesta inmune en el sujeto. En algunas modalidades, la respuesta inmune es una respuesta de anticuerpo/célula B, una respuesta de célula T CD4+ (incluyendo células Thl, Th2 y Thl7) y/o una respuesta de células T CD8+. En algunas modalidades, por lo menos un adyuvante se administra en conjunción con la composición inmunogénica.
Otro aspecto de la presente invención se relaciona a un método para inducir una respuesta inmune en un sujeto a por lo menos un antigeno, que comprende administrar al sujeto la composición inmunogénica como se describe en la presente.
Otro aspecto de la presente invención se relaciona a un método para vacunar a un animal, por ejemplo, un ave, un mamífero o un humano, contra por lo menos un antígeno que comprende administrar una composición de vacuna que comprende la composición inmunogénica como se describe en la presente.
En todos los aspectos como son descritos en la presente, un animal o un sujeto puede ser un humano. En algunas modalidades, el sujeto puede ser un animal agrícola o no doméstico, o un animal doméstico. En algunas modalidades, una composición de vacuna que comprende la composición inmunogénica como se describe en la presente se puede administrar por la vía de la inyección subcutánea, intranasal, oral, sublingual, vaginal, rectal, intradérmica, intraperitoneal o intramuscular.
En todos los aspectos como se describen en la presente, una respuesta inmune es una respuesta de anticuerpo/célula B, una respuesta de células T CD4+ (incluyendo respuestas de Thl, Th2 y Thl7) o una respuesta de células T CD8+ contra antigeno (s) de proteina/péptido . En algunas modalidades, una respuesta inmune es una respuesta de anticuerpo/célula B contra el polímero, por ejemplo, un polisacárido neumocócico. En algunas modalidades, por lo menos un adyuvante se administra en conjunción con la composición inmunogénica .
Otro aspecto de la presente invención se relaciona al uso de la composición inmunogénica como se describe en la presente para el uso en un diagnóstico para la exposición a un patógeno o agente inmunogénico.
Sistema que presenta antígeno múltiple También se proporciona en la presente un sistema que presenta antígeno múltiple inmunogénico (MAPS) , útil para la producción de composiciones inmunogénicas, tales como aquellos útiles en vacunas. En particular, la presente invención se relaciona a composiciones que comprenden un complejo inmunogénico que comprende por lo menos un tipo de polímero, por ejemplo, un polisacárido, que puede, opcionalmente, ser antigénico; por lo menos una proteina o péptido antigénico; y por lo menos un par de afinidad complementaria-molécula que comprende (i) una primera molécula de afinidad que se asocia con el polímero, y (ii) una molécula de afinidad complementaria que se asocia con la proteína o péptido, tal que primera y la molécula de afinidad complementaria sirven como un vínculo indirecto entre el polímero con la proteína o péptido antigénico. Por consiguiente, el polímero puede unir por lo menos 1, o por lo menos 2, o una pluralidad de los mismos o diferentes antígenos de proteína o péptido. En algunas modalidades, el polímero es antigénico, es decir, el polímero es un polisacárido capsular neumocócico. En algunas modalidades, los antígenos de proteína o péptido son antígenos de proteína o péptido recombinantes .
Las composiciones inmunogénicas como se describen en la presente pueden inducir respuestas tanto humorales como celulares a uno o múltiples antígenos al mismo tiempo. Las composiciones inmunogénicas proporcionan una respuesta de memoria de larga duración, potencialmente protegiendo a un sujeto de una infección futura. Esto permite que una sola composición inmunogénica que eleva un alto título de anticuerpo anti-polisacárido funcional, y es similar o se compara favorablemente con el nivel de" anticuerpo inducido por la vacuna conjugada convencional. Por otra parte, no restricción a la proteina portadora especifica, y varias proteínas de antígeno se pueden utilizar en el constructo MAPS para generar una respuesta de anticuerpo anti-polisacárido robusta.
Adicionalmente, la fuerte respuesta de anticuerpo y las respuestas de Thl7/Thl son específicas a múltiples antígenos de proteína presentados por la vía de la composición MAPS. Esto presenta una ventaja mayor, como un medio para inducir dos formas de inmunidad con un constructo. Además de una respuesta inmune más convencional a un polisacárido antigénico conjugado con un portador de proteína, la presente invención proporciona una respuesta de células T y, más específicamente, respuestas de Thl7 y Thl a proteínas inyectadas sistémicamente . Por otra parte, la presente composición inmunogénica puede incorporar ligandos sobre a cadena principal del polímero. Esto proporciona un potencial para aumentar las respuestas de células B o células T específicas al modificar de relación de proteína/polímero, el tamaño del complejo, o al incorporar el factor co-estimulatorio específico, tales como ligandos de TLR2/4, etc., en la composición.
Comparado con la tecnología de conjugación típica, que involucra el tratamiento severo de proteínas, los presentes métodos evitan el riesgo de desnaturalización de otra modificación del antígeno de péptido. Esto proporciona una ventaja sustancial de preservar la antigenicidad de las proteínas incluidas e incrementa la probabilidad de que la proteína misma servirá como un antígeno (antes que solo como un portador) . De manera similar, los presentes métodos evitan la modificación/daño innecesario de la cadena principal de polisacárido, debido a que no hay reticulación química pesada: la biotinilación se puede controlar precisamente para reaccionar con grupos funcionales específicos del polisacárido, y el nivel de biotinilación se puede ajustar fácilmente. Esto es ventajoso en evitar el proceso típico de conjugación, que da por resultado daño a las cadenas laterales críticas o epítopes, que pueden causar inmunogenicidad y protección reducidas.
El presente ensamblaje a base de afinidad proporciona una preparación fácil y altamente flexible de la composición inmunogénica . Es altamente específica y estable, puede permanecer en el frío durante meses y retener su potencia. El proceso de ensamblaje es bastante simple para asegurar alta reproductibilidad, hay solamente unas pocas etapas requeridas, que reduce el riesgo de variación de lote a lote, de gran ventaja industrial. El ensamblaje de MAPS es altamente eficiente (arriba de 95%), aun en bajas concentraciones de proteína y polisacárido (tales como 0.1 mg/ml) ; esto es una ventaja mayor, debido a que las ineficiencias en la fabricación del conjugado (típicamente las eficiencias están en el intervalo de <50%) representan una mayor carga y razón para el alto costo a las vacunas. Para formulación: es fácil ajustar la composición y propiedades físicas del producto final. La relación de proteína : polímero en el complejo es ajustable; con biotinilación moderada del polímero; la proteína : polímero puede ser 10:01 (p/p) o mayor; a la inversa, la relación puede ser 1:10 o menor, si tal es el interés en base a los objetivos inmunológicos . Adicionalmente, el tamaño de la composición de MAPS inmunogénica se puede ajustar mediante la elección del tamaño del polímero. Los métodos para hacer el MAPS proporcionan facilidad en combinar proteínas y polímeros con poca modificación. La posible multivalencia del producto final al cargar múltiples antígenos de proteína, de los mismos o diferentes patógenos (por ejemplo, neumococo y tuberculosis) , en un solo constructo inmunogénico, proporciona una composición que se puede utilizar para disminuir el número de vacunas requeridas para inmunizar a un sujeto contra más de una enfermedad. Por otra parte, la composición MAPS es altamente estable; llegando a ser disociada solamente de la ebullición y al mantener la inmunogenicidad aun después de muchos meses a 4°C. La inmunogenicidad del complejo MAPS puede ser limitada por la estabilidad del componente de proteína o péptido antigénico, la estabilidad que puede ser prolongada mediante la inclusión en el complejo MAPS. Los antigenos específicos utilizados en la presente exhibieron estabilidad a temperatura ambiente y después de por lo menos un ciclo de congelación-descongelación. Esto proporciona una ventaja importante sobre las vacunas actuales que son comprometidas si la "cadena fría" no se mantiene cuidadosamente.
Por consiguiente, un aspecto de la presente invención se relaciona a una composición inmunogénica que comprende un polímero, por lo menos una antígeno de proteína o péptido, y por lo menos un par de afinidad complementaria-molécula, donde el par de afinidad complementaria-molécula comprende una primera molécula de afinidad que se asocia con el polímero y una molécula de afinidad complementaria que se asocia con el antígeno de proteína o péptido, de modo que cuando la primera molécula de afinidad se asocia con la molécula de afinidad complementaria, esta indirectamente enlaza el antígeno al polímero.
En algunas modalidades, la primera molécula de afinidad se retícula al polímero con un reactivo de reticulación, por ejemplo, un reactivo de reticulación seleccionado de CDAP (tetrafluoroborato de l-ciano-4-dimetilaminopiridinio) , EDC (clorhidrato de l-etil-3-[3-dimetilaminopropil ] carbodiimida) , cianoborohidruro de sodio, bromuro de cianógeno, o bicarbonato de amonio/ácido yodoacético. En algunas modalidades, la primera molécula de afinidad se retícula a los grupos funcionales carbóxilo, hidroxilo, amino, fenoxilo, hemiacetal, y mecapto del polímero. En algunas modalidades, la primera molécula de afinidad se enlaza covalentemente al polímero.
En algunas modalidades, la primera molécula de afinidad es biotina o un derivado de la misma, o una molécula con estructura o propiedad física similar como la biotina, por ejemplo, una amina-PEG3-biotina ( (+) -biotinilación-3-6, 9-trixaundecanodiamina) o derivado de la misma.
En algunas modalidades, el antígeno de proteína o péptido de la composición inmunogénica es una proteína de fusión que comprende la proteína o péptido antigénico fusionado a la molécula de enlace de afinidad complementaria. La fusión puede ser un constructo genético, es decir, un péptido o proteína de fusión recombinante . En algunas modalidades, un antígeno se puede unir covalentemente como una proteína de fusión de la molécula de afinidad complementaria. En modalidades alternativas, el antígeno no se une covalentemente a la molécula de afinidad complementaria.
En algunas modalidades, la molécula de afinidad complementaria es una proteína que enlaza biotina o un derivado o una porción funcional de la misma. En algunas modalidades, una molécula de afinidad complementaria es una proteína similar a avidina o un derivado o una porción funcional de la misma, por ejemplo, pero no limitada a, rhizavidina o un derivado de la misma. En algunas modalidades, una molécula de afinidad complementaria es avidina o estreptavidina o un derivado o una porción arte funcional de la misma.
En algunas modalidades, un péptido de señal de secreción se ubica en el N-terminal de la proteina similar a avidina. Cualquier secuencia de señal conocida para personas de habilidad ordinaria en la técnica se puede utilizar; y en algunas modalidades, la secuencia de señal es M KIWLALAGLVLAFSASA (SEC ID NO: 2) o un derivado o porción funcional de la misma. En algunas modalidades, el antigeno se puede fusionar a una molécula de afinidad complementaria por la via de un péptido enlazador flexible, en donde el péptido enlazador flexible une el antigeno a la molécula de afinidad complementaria .
En algunas modalidades, el componente de polímero del inmunogeno comprende un polímero derivado de un organismo viviente, por ejemplo, un polisacárido . En algunas modalidades, un polímero se puede purificar y aislar de una fuente natural, o se puede sintetizar con una composición/ estructura natural, o puede ser un polímero sintético (por ejemplo, con una composición/estructura artificial) . En algunas modalidades, un polímero se deriva de un organismo seleccionado del grupo que consiste de: bacterias, archaea, o células eucariotas similares a hongos, insectos, plantas, o quimeras de las mismas. En algunas modalidades, el polímero es un polisacárido derivado de una bacteria patogénica. En modalidades especificas, el polisacárido es un polisacárido capsular neumocócico, un polisacárido de pared celular neumocócico, o un polisacárido Vi de Salmonella typhi.
En algunas modalidades, un polímero de la composición inmunogénica como se describe en la presente es polímero de cadena ramificada, por ejemplo, un polisacárido ramificado, o alternativamente, puede ser un polímero de cadena recta, por ejemplo, un polímero de una sola cadena, por ejemplo, polisacárido. En algunas modalidades, el polímero es un polisacárido, por ejemplo, dextrano o un derivado del mismo. En algunas modalidades, un polímero, por ejemplo, polisacárido de dextrano puede ser de peso molecular promedio de 425kD-500 kDa, inclusive, o en algunas modalidades, mayor que 500 kDa. En algunas modalidades, un polímero, por ejemplo, polisacárido de dextrano puede ser de peso molecular promedio 60kD-90kDa, inclusive, o en algunas modalidades, más pequeño que 70 kDa. El polímero de dextrano se puede derivar de una bacteria, tal como Leuconostoc mesenteroides.
En algunas modalidades, una composición inmunogénica como se describe en la presente comprende por lo menos 2 antígenos, o por lo menos 3 antígenos, o por lo menos 5 antigenos, o entre 2-10 antigenos, o entre 10-15 antigenos, o entre 15-20 antigenos, o entre 20-50 antigenos, o entre 50 a 100 antigenos, o más de 100 antigenos, inclusive. En algunas modalidades, donde una composición inmunogénica como se describe en la presente comprende por lo menos 2 antigenos, los antigenos pueden ser el mismo antigeno o por lo menos 2 diferentes antigenos. En algunas modalidades, los antigenos pueden ser de los mismos o diferentes patógenos, o pueden ser diferentes epitopes o parte de la misma proteina antigénica, o puede ser el mismo antigeno que es especifico a diferentes serotipos o variaciones estacionales del mismo patógeno (por ejemplo, virus de influenza A, B, y C) .
En algunas modalidades, una composición inmunogénica como se describe en la presente comprende un antigeno de un organismo patogénico o un tejido anormal. En algunas modalidades, el antígeno es un antigeno de tumor. En algunas modalidades, un antigeno puede ser por lo menos un antigeno seleccionado de antigenos de patógenos o parásitos, tales como antigenos de Streptococcus pneumoniae, Mycobacteriu tuberculosis o M. tetanus, Bacillus anthracis, HIV, antigeno de influenza estacional o epidémica (tales como H1N1 o H5N1), Bordetella pertussis, Staphylococcus aureus, Neisseria meningitidis o N. gonorrhoeae, VPH, Chlamydia trachomatis, HSV u otros virus de herpes, o Plasmodia sp. Estos antigenos pueden incluir péptidos, proteínas, glicoproteínas, o polisacáridos . En algunas modalidades, el antígeno es un toxoide o porción de una toxina.
En algunas modalidades, una composición inmunogénica como se describe en la presente comprende un polisacárido antigénico, por ejemplo, tal como el antigeno Vi (polisacárido capsular de Salmonella typhi) , polisacáridos capsulares neumocócicos, polisacárido de pared celular neumocócico, polisacárido capsular Hib {Haemophilus influenzae tipo B) polisacáridos capsulares meningocócicos, el polisacárido de Bacillus anthracis (el agente causativo de ántrax) , y otros polisacáridos capsulares o de pared celular bacterianos, o cualquiera de las combinaciones de los mismos. El polisacárido puede tener un contenido de proteina, por ejemplo, una glicoproteina , tal como de aquellas de virus.
En algunas modalidades, una composición inmunogénica como se describe en la presente además comprende por lo menos un factor de co-estimulación asociado con el polímero o polisacárido, donde el factor de co-estimulación se puede asociar directamente o indirectamente. Por ejemplo, en algunas modalidades, un factor de co-estimulación se puede unir covalentemente al polímero. Por ejemplo, en algunas modalidades, un factor de co-estimulación se puede unir covalentemente a la primera molécula de afinidad, que luego se retícula al polímero. Por ejemplo, en algunas modalidades, un factor de co-estimulación se puede unir a una molécula de afinidad complementaria, que se asocia con una primera molécula de afinidad para enlazar el factor de co-estimulación al polímero. En algunas modalidades, un factor de co-estimulación es un adyuvante. En modalidades alternativas, un factor co-estimulatorio puede ser cualquier conocido para uno de habilidad ordinaria en la técnica, e incluye cualquier combinación, por ejemplo, sin limitación, agonistas del receptor similar a Toll (agonistas para TLR2, 3, 4, 5 7,8, 9, etc.), agonistas de NOD, o agonistas de la inflamasoma.
Otro aspecto de la presente invención se relaciona al uso de la composición inmunogénica como se describe en la presente para ser administrada a un sujeto para inducir una respuesta inmune en el sujeto. En algunas modalidades, la respuesta inmune es una respuesta de anticuerpo/célula B, una respuesta de células T CD4+ (incluyendo células Thl, Th2 y Thl7) y/o una respuesta de células T CD8+. En algunas modalidades, por lo menos un adyuvante se administra en conjunción con la composición inmunogénica.
Otro aspecto de la presente invención se relaciona a un método para inducir una respuesta inmune en un sujeto a por lo menos un antígeno, que comprende administrar al sujeto la composición inmunogénica como se describe en la presente .
Otro aspecto de la presente invención se relaciona a un método para vacunar a un animal, por ejemplo, un ave, un mamífero o un humano, contra por lo menos un antígeno que comprende administrar una composición de vacuna que comprende la composición inmunogénica como se describe en la presente.
En todos los aspectos como se describe en la presente, un animal o un sujeto puede ser un humano. En algunas modalidades, el sujeto puede ser un animal agrícola o no doméstico, o un animal doméstico. En algunas modalidades, una composición de vacuna que comprende la composición inmunogénica como se describe en la presente se puede administrar por la vía de la inyección subcutánea, intranasal, oral, sublingual, vaginal, rectal, intradérmica, intraperitoneal, intramuscular, o por la vía del parche en piel para inmunización transcutánea .
En todos los aspectos como se describen en la presente, una respuesta inmune es una respuesta de anticuerpo/célula B, una respuesta de célula T CD4+ (incluyendo respuestas de Thl, Th2 y Thl7) o una respuesta de célula T CD8+ contra antígeno (s) de proteína/péptido. En algunas modalidades, una respuesta inmune es una respuesta de anticuerpo/célula B contra el polímero, por ejemplo, un polisacárido neumocócico. En algunas modalidades, por lo menos un adyuvante se administra en conjunción con la composición inmunogénica.
Otro aspecto de la presente invención se relaciona al uso de la composición inmunogénica como se describe en la presente para el uso en un diagnóstico para la exposición a un patógeno o agente inmunogénico .
También se proporciona en la presente un método para vacuna a un sujeto, por ejemplo, un mamífero, por ejemplo, un humano con las composiciones inmunogénicas, como se describe en la presente, el método que comprende administrar una composición de vacuna como se describe en la presente al sujeto.
Generalmente, las composiciones inmunogénicas y composiciones que comprenden un complejo inmunogénico pueden comprender por lo menos un antígeno, o múltiples antígenos, unidos a una estructura de polímero para el uso en inducir una respuesta inmune a cada uno de los antigenos unidos al polímero, y opcionalmente al polímero mismo, cuando se administra a un sujeto. Este sistema que presenta antígeno múltiple (MAPS) , estimula una respuesta inmune humoral y celular: puede generar anticuerpo anti-polisacárido y las respuestas de célula B/Thl/Thl7 a múltiples antígenos de proteína utilizando un solo constructo inmunogénico de MAPS. Una combinación de inmunizar de célula B y T al organismo podría representar una estrategia de vacuna óptima contra muchas enfermedades, incluyendo la enfermedad neumocócica asociada con la infección invasiva y el acarreo nasofaríngeo. En algunas modalidades, la composición inmunogénica es una vacuna o se incluye en una vacuna.
Por consiguiente, un aspecto de la presente invención se relaciona a una composición inmunogénica (sistema que presenta antígeno múltiple, o MAPS) que comprende por lo menos un polímero, por ejemplo, un polisacárido, por lo menos una antígeno de proteína o péptido, y por lo menos una par de afinidad complementaria-molécula que comprende (i) una primera molécula de afinidad asociada con el polímero, y (ii) una molécula de afinidad complementaria asociada con el antígeno, que sirve para unir indirectamente el antígeno al polímero (por ejemplo, la primera molécula de afinidad se asocia con la molécula de afinidad complementaria para enlazar el antígeno al polímero) . Por consiguiente, como el polímero se puede utilizar como una estructura a para unir por lo menos 1, o por lo menos 2, o más (por ejemplo, una pluralidad) de los mismos o diferentes antígenos. Las composiciones inmunogénicas como se describen en la presente se pueden utilizar para inducir inmunidad tanto humoral como celular a múltiples antígenos al mismo tiempo.
Por consiguiente, las modalidades proporcionan en la presente una composición inmunogénica y métodos útiles para elevar una respuesta inmune en un sujeto, que se puede utilizar por su propia cuenta o en conjunción o mezcla con esencialmente cualquiera de los procedimientos de vacuna existentes .
El MAPS es una composición flexible y versátil que se puede diseñar y fabricar para inducir una variedad particular, de amplio espectro y objetivos antigénicos. La Tabla 1 proporciona una guia de ejemplo simple para contemplar la flexibilidad de las modalidades de MAPS: Tabla 1. Versatilidad de la plataforma de MAPS Otro polímero ácido nucleico, PEG. proteina. liposoma. nanopartfcula, partículas similares a virales, virus ¦ Cadena principal PS capsular Pneumocócaco (varios serotpos) Poliscéndo PS de pared celular Pneumocóccico de patógenos PS Vi de Salmonete typ i MAPS PS capsular Staphylococcus aureus PS Hib, otro HaemophÉ PS de Gp A streptococcus PS de Gp A streptococcus Protelnsa bacterianas/toxinas PS de meningococcus Proteínas virales Antígeno PS de Antrax Anbgenos de cáncer Patógenos entéricos Toxinas de planta Pseudomonas Patógenos lungales (ciYptococcus, otro) Glicoproteinas de virus Polímeros Un componente del MAP consiste en una "cadena principal", típicamente un polímero. El polímero puede ser antigénico o no antigénico. Este se puede hacer de una amplia variedad de sustancias, como es descrito en la presente, con la advertencia de que el polímero sirve como un medio para presentar el antígeno(s) asociado al sistema inmune en el aspecto inmunogénico. En algunas modalidades, el polímero es un polímero sintético. En algunas modalidades, el polímero es un polímero que ocurre naturalmente, por ejemplo, un polisacárido derivado o purificado de células bacterianas. En algunas modalidades, el polisacárido se deriva o se purificar de células eucarióticas, por ejemplo, células de hongo, de insecto o de plantas. En todavía otras modalidades, el polímero se deriva de células mamíferas, tales como células infectadas con virus o células de cáncer. En general, tales polímeros son bien conocidos en la técnica y están abarcados para el uso en los métodos y composiciones como se describe en la presente.
En algunas modalidades, un polímero es un polisacárido seleccionado de cualquiera de lo siguiente, dextrano, polisacárido Vi de Salmonella typhi, polisacárido capsular neumocócico, polisacárido de pared celular neumocócico (C PS) , polisacárido meningocócico, polisacárido de Haemophilus influenzae tipo b, o cualquier otro polisacárido de origen viral, procariótico o eucariótico.
En algunas modalidades, el polisacárido consiste de o comprende una porción de azúcar antigénica. Por ejemplo, en algunas modalidades, un polisacárido para el uso en los métodos y composiciones inmunogénicas como es descrito en la presente es un polisacárido Vi de Salmonella typhi. El polisacárido capsular Vi se ha desarrollado contra infecciones entéricas bacterianas, tal como la fiebre tifoide. Robbins y colaboradores, 150 J. Infect. Dis. 436 (1984); Levine y colaboradores, 7 Baillieres Clin. Gastroenterol . 501 (1993). Vi es un polímero de un ácido oí-l-»4-galacturónico con un N acetilo en la posición C-2 y O-acetilación variable de C-3. La virulencia de S. typhi se correlaciona con la expresión de esta molécula. Sharma y colaboradores, 101 PNAS 17492 (2004) . La vacuna de polisacárido Vi de S. typhi tiene varias ventajas: Los efectos secundarios son infrecuentes y leves, y una sola dosis produce inmunogenicidad consistente y eficacia. El polisacárido Vi se puede estandarizar confiablemente mediante métodos fisicoquímicos verificados para otras vacunas de polisacárido, Vi es estable a temperatura ambiente y se puede administrar simultáneamente con otras vacunas sin afectar la inmunogenicidad y tolerabilidad. Azze y colaboradores, 21 Vaccine 2758 (2003) .
Así, el polisacárido Vi de S. typhi se puede reticular con una primera molécula de afinidad como es descrito en la presente, para unir por lo menos un antígeno al polisacárido. En algunas modalidades, el antígeno puede ser del mismo o de otro organismo, tal que la composición inmunogénica resultante confiere por lo menos algún nivel de inmunidad contra un patógeno, o dos diferentes patógenos: si el antigeno confiere protección contra neumococo, una composición inmunogénica donde la estructura de polímero es un polisacárido Vi puede elevar una respuesta inmunogénica contra tanto S. typhi como neumococos. Otros ejemplos incluyen la combinación de azúcares de bacterias encapsuladas (tal como, meningococcus , S. aureus, neumococcus, Hib, etc.) y antígenos de tuberculosis, para proporcionar una composición inmunogénica que eleva una respuesta inmune contra dos diferentes patógenos.
Otras porciones de polisacáridos (PS) que se pueden utilizar en la presente invención, en alternativo a dextrano, polisacáridos de pared celular bacterianos (CWPS) , etc., incluyen antígenos de carbohidrato de cánceres.
Además, con respecto a polisacáridos neumocócicos, el polisacárido se puede derivar de cualquiera de los 93 serotipos de neumococcus que han sido identificado hasta la fecha, por ejemplo, incluyendo pero no limitado a los serotipos 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 6C, 6D, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F y 33F. Serotipos adicionales se pueden identificar e incluir en la presente composición inmunogénica como es descrita en la presente. Más de un polisacárido neumocócico se puede incluir como la cadena principal del polímero de las presentes composiciones inmunogénicas o en una vacuna que comprende las presentes composiciones APS.
El polisacárido también se puede derivar de la invención, la composición inmunogénica comprende polisacáridos capsulares de N. meningitidis de por lo menos uno, dos, tres o cuatro de los serogrupos A, C, W, W135 o Y.
Una modalidad adicional comprende el Tipo 5, Tipo 8, o cualquiera de los polisacáridos u oligosacáridos de Staphylococcus aureus.
En algunas modalidades, el polímero es un polímero quimérico que comprende más de un tipo de polímero. Por ejemplo, un polímero de la composición inmunogénica como se describe en la presente puede comprender una porción del polímero A, y la porción restante del polímero B. No hay límite a la cantidad de diferentes tipos de polímeros que se pueden utilizar en una sola entidad de cadena principal de MAPS. En algunas modalidades, donde el polímero es un polímero ramificado, el polímero de cadena puede ser el polímero A, y las ramificaciones puede ser por lo menos 1 o por lo menos 2 o por lo menos 3 o más polímeros diferentes.
En algunas modalidades, el polímero es un polímero ramificado. En algunas modalidades, el polímero es un polímero de una sola cadena.
En algunas modalidades, el polímero es un polisacárido que comprende por lo menos 10 unidades de repetición de carbohidrato, o por lo menos 20, o por lo menos 50, o por lo menos 75, o por lo menos 100, o por lo menos 150, o por lo menos 200, o por lo menos 250, o por lo menos 300, o por lo menos 350, o por lo menos 400, o por lo menos 450, o por lo menos 500, o más de 500 unidades de repetición, inclusive .
En un aspecto de la invención, el polisacárido (PS) puede tener una masa molecular de <5000 kDa o >500 kDa. En otro aspecto de la invención, el PS tiene una masa molecular de <70 kDa.
En algunas modalidades, un polímero es un polímero de peso molecular grande, por ejemplo, un polímero puede ser de un peso molecular promedio de entre aproximadamente 425-500 kDa, inclusive, por ejemplo, por lo menos 300kDa, o por lo menos 350kDa, o por lo menos 400kDa, o por lo menos 425kDa, o por lo menos 450kDa, o por lo menos 500 kDa o mayor que 500 kDa, inclusive, pero típicamente menor que 500 kDa.
En algunas modalidades, un polímero puede ser un polímero de peso molecular pequeño, por ejemplo, un polímero puede ser de un peso molecular promedio de entre aproximadamente 60 kDa a aproximadamente 90 kDa, por ejemplo, por lo menos 50 kDa, o por lo menos 60 kDa, o por lo menos 70 kDa, o por lo menos 80 kDa, o por lo menos 90 kDa, o por lo menos lOOkDa, o mayor que lOOkDa, inclusive, pero generalmente menor que aproximadamente 120 kDa.
En algunas modalidades, el polímero se recolecta y se purifica de una fuente natural, y en otras modalidades, el polímero es sintético. Métodos para producir polímeros sintéticos, incluyendo polisacáridos sintéticos, son conocidos para las personas de habilidad ordinaria y están abarcadas en las composiciones y métodos como se describe en la presente.
Solamente unos cuantos de los polímeros de polisacárido que pueden servir como cadena principal para uno o más antígenos o tipos de antígeno se ejemplifican en la Tabla 2: Tabla 2. Cadena principal de MAPS de polímero de polisacárido de ejemplo y antígenos de ejemplo asociados Polímeros adicionales que se pueden utilizar en las composiciones de APS inmunogénicas descritas en la presente incluyen polímeros a base de polietilenglicol, polímeros de poli (orto éster) , portadores poliacrílicos, PLGA, polietilenimina (PEI), dendrímeros de poliamidoamina (PAMAM) , polímeros de ß-amino éster, polifosfoéster (PPE) , liposomas, polimerosomas, ácidos nucleicos, oligonucleótidos fosforotioatados, quitosan, seda, micelas poliméricas, polímeros de proteína, partículas de virus, partículas similares a virus (VLP) u otras micro-partículas. Ver, por ejemplo, El-Sayed y colaboradores, Smart Polymer Carriers for Enhanced Intracellúlar Delivery oí Therapeutic Molecules, 5 Exp. Op. Biol. Therapy, 23 (2005). Los polímeros biocompatibles desarrollados para el suministro de ácido nucleico se pueden adaptar para el uso como una cadena principal de la presente. Ver, por ejemplo, BIOCOMPATIBLE POL. NUCL. ACID. DELIV. (Domb y colaboradores, .eds., John Wiley & Sons, Inc. Hoboken, NJ, 2011) .
Por ejemplo, las VLPs se asemejan a virus, pero no son infecciosas debido a que no contienen cualquier material genético viral. La expresión, incluyendo la expresión recombinante, de proteínas estructurales virales, tal como componentes de envoltura o cápsida, pueden dar por resultado el auto-ensamblaje de VLPs. Las VLPs se han producido de componentes de una amplia variedad de familias de virus que incluyen Parvoviridae (por ejemplo, virus adeno-asociados) , Retroviridae (por ejemplo, HIV) , y Flaviviridae (por ejemplo, virus de hepatitis B o C) . Las VLPs se pueden producir en una variedad de sistemas de cultivo celular, que incluyen líneas de células mamíferas, líneas de células de insecto, levadura y células de plantas. Las VLPs recombinantes son particularmente ventajosas debido a que el componente viral se puede fusionar a los antígenos recombinantes como es descrito en la presente.
Antígenos Las proteínas de fusión y composiciones inmunogénicas como se describen en la presente pueden comprender cualquier antígeno que induce una respuesta inmune en un sujeto. En algunas modalidades, por lo menos uno o más antígenos están asociados con el polímero de la composición. En algunas modalidades, por lo menos 2, o por lo menos 3, o por lo menos 5, o por lo menos 10, o por lo menos 15, o por lo menos 20, o por lo menos 50, o por lo menos 100, o más de 100 antígenos se pueden asociar con el polímero como es descrito en la presente. En algunas modalidades, donde la composición inmunogénica comprende más de un antigeno, los antigenos pueden ser el mismo antigeno o pueden ser una variedad de diferentes antigenos asociados con el polímero. En algunas modalidades, donde la composición inmunogénica comprende más de un antígeno, los antígenos pueden ser antígenos del mismo patógeno o de diferentes patógenos, o alternativamente, pueden ser diferentes antígenos del mismo patógeno, o antígenos similares de diferentes serotipos de patógenos.
Un antígeno para el uso en las proteínas de fusión y composiciones inmunogénicas y métodos descritos en la presente puede ser cualquier antígeno, que incluye, pero no limitado a péptidos patogénicos, toxinas, toxoides, subunidades de los mismos, o combinaciones de los mismos (por ejemplo, toxina de cólera, toxoide de tétanos) .
En algunas modalidades, un antígeno, que se puede fusionar a la molécula de afinidad complementaria, puede ser cualquier antígeno asociado con una enfermedad infecciosa, o cáncer o enfermedad inmune. En algunas modalidades, un antígeno puede ser un antígeno expresado por cualquiera de una variedad de agentes infecciosos, incluyendo virus, bacteria, hongo o parásito.
En algunas modalidades, un antígeno se deriva (por ejemplo, se obtiene) de un organismo patogénico. En algunas modalidades, el antigeno es un antigeno de cáncer o de tumor, por ejemplo, un antigeno derivado de una célula de tumor o de cáncer.
En algunas modalidades, un antigeno derivado de un organismo patogénico es un antigeno asociado con una enfermedad infecciosa, este se puede derivar de cualquiera de una variedad de agentes infecciosos, incluyendo virus, bacteria, hongo o parásito.
En algunas modalidades, un antigeno objetivo es cualquier antigeno asociado con una patología, por ejemplo una enfermedad infecciosa o patógeno, o cáncer o una enfermedad inmune tal como una enfermedad autoinmune. En algunas modalidades, un antígeno se puede expresar mediante cualquiera de una variedad de agentes infecciosos, incluyendo virus, bacteria, hongo o parásito. Un antígeno objetivo para el uso en los métodos y composiciones como es descrito en la presente también puede incluir, por ejemplo, péptidos patogénicos, toxinas, toxoides, subunidades de los mismos, o combinaciones de los mismos (por ejemplo, toxina de cólera, toxoide de tétanos) .
Ejemplos no limitantes de virus infecciosos incluyen: Retroviridae; Picornaviridae (por ejemplo, virus de polio, virus de hepatitis A, enterovirus, virus coxsackie humano, rinovirus, ecovirus) ; Calciviridae (por ejemplo, tales como cepas que causan gastroenteritis); Togaviridae (por ejemplo, virus de encefalitis equina, virus de rubéola); Flaviridae (por ejemplo, virus de dengue, virus de encefalitis, virus de fiebre amarilla) ; Coronaviridae (por ejemplo, coronavirus) ; Rhabdoviridae (por ejemplo, virus de estomatitis vesicular, virus de rabia); Filoviridae (por ejemplo, virus de ébola) ; Paramyxoviridae (por ejemplo, virus de parainfluenza, virus de paperas, virus de sarampión, virus sincitial respiratorio); Orthomyxoviridae (por ejemplo, virus de influenza) ; Bungaviridae (por ejemplo, virus Hanta, virus bunga, flebovirus y virus Nairo) ; Arena viridae (virus de fiebre hemorrágica) ; Reoviridae (por ejemplo, reovirus, orbivirus y rotavirus); Birnaviridae; Hepadnaviridae (virus de hepatitis B) ; Parvoviridae (parvovirus) ; Papovaviridae (virus de papiloma, virus de polioma) ; Adenoviridae (la mayoría de adenovirus); Herpesviridae (virus de herpes simple (HSV) 1 y HSV-2, virus de varicela zoster, citomegalovirus (CMV) , virus de enfermedad de Marek, virus de herpes) ; Poxviridae (virus de viruela, virus vaccinia, virus de viruela) ; e Iridoviridae (tal como el virus de fiebre porcina africana) , y virus no clasificados (por ejemplo, los agentes etiológicos de encefalopatías Espongiformes, el agente de delta hepatitis (aunque es un satélite defectuoso del virus de hepatitis B) , los agentes de hepatitis no de A, no de B (clase 1 = internamente transmitido, clase 2 = parenteralmente transmitido (es decir, hepatitis C) ; virus Norwalk y relacionados y astrovirus) . Las composiciones y métodos descritos en la presente se contemplan para el uso en el tratamiento de infecciones con estos agentes virales.
Ejemplos de infecciones fúngales que se pueden dirigir mediante la inclusión de antigenos en las presentes modalidades incluyen aspergilosis ; afta (causada por Candida albicans) , criptococosis (causado por Cryptococcus) , e histoplasmosis . Asi, ejemplos de hongos infecciosos incluyen, pero no están limitados a, Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum, Coccidioides immitis, Blastomyces dermatitidis, Chlamydia trachomatis, Candida albicans. Los componentes de estos organismos se pueden incluir como antigenos en el MAPS descrito en la presente.
En un aspecto de la invención, un antigeno se deriva de un microbio infeccioso tales como Bordatella pertussis, Brucella, Enterococci sp. , Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrheae, Moraxella , tipeable o no tipeable Haemophilus, Pseudomonas, Salmonella , Shigella , Enterobacter, Citrobacter, Klebsiella , E. coli, Helicobacter pylori, Clostridia, Bacteroides, Chlamydiaceae, Vibrio cholera, Mycoplasma, Treponemes, Borelia burgdorferi, Legionella pneumophilia , Mycobacteria sps (tal como M. tuberculosis, M. avium, M. intracellulare, M. kansaii, M. gordonae, M. leprae) , Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Streptococcus pyogenes (Streptococcus de Grupo A) , Streptococcus agalactiae (Streptococcus de Grupo B) , Streptococcus (grupos viridans) , Streptococcus faecalis, Streptococcus bovis, Streptococcus (anaerobio sps.), Streptococcus pneumoniae, pathogenic Campylobacter sp., Enterococcus sp. , Haemophilus influenzae, Bacillus anthracis, Corynebacterium diphtheriae, Corynebacterium sp. , Erysipelothrix rhusiopathiae, Clostridium perfringensr Clostridium tetani, Enterobacter aerogenes, Klebsiella pneumoniae, Leptospira sps.f Pasturella multocida, Bacteroides sp. , Fusobacterium nucleatum, Streptobacillus moniliformis, Treponema pallidium, Treponema pertenue y Actinomyces israelii. Las composiciones y métodos descritos en la presente se contemplan para el uso en el tratamiento o prevención de infecciones contra estos agentes bacterianos.
Los patógenos de parásitos adicionales de los cuales se pueden derivar los antigenos incluyen, por ejemplo: Entamoeba histolytica , Plasmodium falciparum, Leishmania sp., Toxoplasma gondii, Rickettsia y el Helminths.
En otro aspecto de la invención, un antigeno es una proteina PsaA neumocócica truncada, serina/treonina proteina quinasa neumocócica de toxoide de neumolisina (StkP) , unidad de repetición de serina/treonina proteina quinasa neumocócica (StkPR) , proteina PcsB neumocócica, alfa hemolisina estafilocócica, proteína mtb de Mycobacterium tuberculosis ESAT-6, antígeno de núcleo de pared celular M. tuberculosis, polipéptidos o CT144, CT242 y CT812 de Chlamydia o fragmentos de estos, subunidad B de DNA girasa de Chlamydia, síntesis de sulfito/fosfatasa de bifosfato de Chlamydia, proteín de división celular de Chlamydia FtsY, metionil-tRNA-sintetasa de Chlamydia, DNA helicasa de Chlamydia (uvrD) , subunidad de ATP sintasa de Chlamydia (atpl), o hidrolasa dependiente de metal de Chlamydia.
Una modalidad de la presente invención proporciona una composición inmunogénica dirigida al patógeno Myocobacterium tuberculosis (TB) , un parásito bacteriano intracelular . Un ejemplo de un antígeno TB es TbH9 (también conocido como Mtb 39A) . Otros antígenos TB incluyen, pero no están limitados a, DPV (también conocido como Mtb8.4), 381, Mtb41, Mtb40, tb32A, tb64, Mtb83, tb9.9A, Mtb9.8, Mtbl6, Mtb72f, Mtb59f, Mtb88f, Mtb71f, Mtb46f y Mtb31f, en donde "f" indica que es una fusión de dos o más proteínas.
Como se mencionó en lo anterior, un antígeno se puede derivar de una especie de Chlamydia para el uso en las composiciones inmunogénicas de la presente invención. Chlamydiaceae (que consiste de Chlamydiae y Chlamydophila) , son bacterias gram-negativas intracelulares obligatorias. Las infecciones de Chlamydia trachomatis están entre las infecciones sexualmente transmitidas bacterianas más prevalentes, y quizás 89 millones de nuevos casos de infección clamidial genital ocurren cada año. La Chlamydia de la presente invención incluyen, por ejemplo, C. trachomatis, Chlamydophila pneumoniae, C. muridarum, C. suis, Chlamydophila abortus, Chlamydophila psittaci, Chlamydophila caviae, Chlamydophila felis, Chlamydophila pecorum y C. pneumoniae. Los modelos de animales de la infección clamidial han establecido que las células T desempeñan una función crítica tanto en la evacuación de la infección inicial y en la protección de re-infección de hospederos susceptibles. Por consiguiente, las composiciones inmunogénicas como se describen en la presente se pueden utilizar para proporcionar valor particular al inducir respuestas inmunes celulares contra la infección clamidial.
Más específicamente, los antígenos clamidiales útiles en la presente invención incluyen la subunidad B del DNA girasa, síntesis de sulfito/fosfatasa de bifosfato, proteína de división celular FtsY, metionil-tRNA-sintetasa, DNA helicasa (uvrD) ; subunidad I de ATP sintasa (atpl) o un hidrolasa dependiente de metal (Solicitud de Patente de los Estados Unidos No. 20090028891) . Los antígenos de Chlamydia trachomatis adicionales incluyen polipéptidos CT144, un péptido que tiene los residuos de aminoácidos 67-86 de CT144, un péptido que tiene los residuos de aminoácidos 77-96 de CT144, proteína CT242, un péptido que tiene los aminoácidos 109-117 de CT242, un péptido que tiene los aminoácidos 112-120 de polipéptido CT242, una proteína CT812 (del gen pmpD) , un péptido que tiene los residuos de aminoácido 103-111 de la proteína CT812, y varios de otros péptidos antigénicos de C. trachomatis: NVTQDLTSSTA LECTQDLI (SEC ID NO: 29), A LECTQDLIAQGKLIVTNP (SEC ID NO: 30), SNL RMQKI (SEC ID NO: 31), AALYSTEDL (SEC ID NO: 32), FQEKDADTL (SEC ID NO: 33), QSVNELVYV (SEC ID NO: 34), LEFASCSSL (SEC ID NO: 35), SQAEGQYRL (SEC ID NO: 36), GQSVNELVY (SEC ID NO: 37) y QAVLLLDQI (SEC ID NO: 38). Ver WO 2009/020553. Adicionalmente, los antígenos de Chlamydia pneumoniae incluyen homólogos de los polipéptidos foráneos (ver la Patente de los Estados Unidos No. 6,919,187), se puede utilizar como antígenos en las composiciones inmunogénicas y métodos como es descrito en la presente.
Los antígenos fúngales se pueden derivar de la especie de Candida y otra levadura; u otros hongos; (aspergillus, otros hongos ambientales) . Considerando otros parásitos, la malaria así como gusanos y amibas pueden proporcionar el antígeno antigénico para el uso en las composiciones inmunogénicas y métodos como es descrito en la presente.
En algunas modalidades, donde el antígeno es para genera un inmunógeno de anti-influenza, la hemaglutinina de glicoproteína de superficie (HA) y neuraminidasa (NA) son generalmente los antígenos de elección. Tanto el polipéptido de nucleoproteína (NP) como la matriz (M) son proteínas virales internas, y por lo tanto no consideran usualmente en el diseño de vacuna para la inmunidad a base de anticuerpo. Las vacunas de influenza se utilizan rutinariamente en humanos, e incluyen vacunas derivadas del virus de influenza completo inactivado, virus de influenza atenuado vivo, o materiales purificados inactivados de cepas virales. Por ejemplo, la vacuna la influenza tradicional se puede fabricar utilizando tres cepas potencialmente amenazantes del virus de gripe. Estas cepas usualmente se cultivan en huevos de pollo fertilizados, que requiere procesamiento extensivo incluyendo la inoculación e incubación del huevo, recolección del huevo, o purificación e inactivación del virus, procesamiento y acumulación del virus o componentes virales a la formulación de vacuna final, y llenado aséptico en los recipientes apropiados. Típicamente, este ciclo de producción a base de huevo toma arriba de 70 semanas. En el caso de una influenza mayor epidémica, la disponibilidad de una vacuna potente y segura es un problema mayor. Adicionalmente, hay riesgos asociados con las impurezas en los huevos, tal como antibióticos y contaminantes, que impactan negativamente la esterilidad de la vacuna. Por otra parte, las vacunas de gripe derivadas de huevo están contraindicadas para aquellos con varias alergias a las proteínas de huevo y las personas con una historia de síndrome de Guillain-Barre . La presente invención proporciona una alternativa a las vacunas de influenza a base de huevo, no solamente al evitar las secuelas relacionadas con el huevo, sino proporcionar una plataforma para el uso de múltiples antigenos de influenza en una plataforma altamente controlada.
En algunas modalidades, un antigeno para el uso en las composiciones inmunogénicas como es descrito en la presente también puede incluir aquellas utilizadas en guerras biológicas, tal como ricina, que pueden provocar una respuesta CMI .
Adicionalmente, la presente invención también proporciona composiciones inmunogénicas, que comprenden antigenos que elevan una respuesta inmune contra el cáncer. En estos conjugados, un antigeno es un antigeno expresado por un cáncer o tumor, o derivado de un tumor. En algunas modalidades, tales antigenos son referidos en la presente como un "antigeno de cáncer" y son típicamente una proteína expresada predominantemente en las células de cáncer, tal que el conjugado induce inmunidad tanto humoral potente como celular potente a esta proteína. Un gran número de antígenos asociados con cáncer se han identificado, varios de los cuales ahora están siendo utilizados para hacer vacunas de tratamiento de cáncer experimentales y de esta manera son adecuados para el uso en las presentes modalidades. Los antígenos asociados con más de un tipo de cáncer incluyen antígeno Carcinoembriónico (CEA) ; antígenos de cáncer/testículo, tal como NY-ESO-1; mucina 1 (MüCl) , tal como Sialil Tn (STn) ; gangliósidos, tal como · GM3 y GD2; proteína p53, y proteina HER2/neu (también conocida como ERBB2) . Los antígenos únicos a un tipo específico de cáncer incluyen una forma mutante del receptor de factor de crecimiento epidérmico, llamado EGFRvIII; antígenos de diferenciación de Melanocito/melanoma, tal como tirosinasa, MARTI, gplOO, el grupo de cáncer-testículo relacionado con linaje (MAGE) y antígenos relacionados con tirosinasa; antígeno específico de próstata, antígenos asociados con leucemia (LAAs), tal como la proteína de fusión BCR-ABL, proteína de tumor de Wilms y proteinasa 3; y anticuerpo de Idiotipo (Id). Ver, por ejemplo, Mitchell, 3 Curr. Opin. Investig. Drogas 150 (2002) ; Dao y Scheinberg, 21 Best Pract. Res. Clin. Haematol. 391 (2008).
Otro procedimiento en la generación de una respuesta inmune contra el cáncer emplea antígenos de microbios que causan o contribuyen al desarrollo de cáncer. Estas vacunas se han utilizado contra cánceres que incluyen carcinoma hepatocelular (virus de hepatitis B, virus de hepatitis C, Opisthorchis viverrin) , carcinoma de linfoma y nasofaríngeo (virus de Epstei-Barr) , cáncer colorrectal, cáncer de estómago {Helicobacter pylori), cáncer de vejiga (Schisosoma hematobium) , leucemia de célula T (virus linfotrópico de célula T humana), cáncer cervical (papilomavirus humano), y otros. Hasta la fecha, han existido experimentos clínicos para vacunas dirigidas al Cáncer de Vejiga, Tumores de Cerebro, Cáncer de Mama, Cáncer Cervical, Cáncer de Riñon, Melanoma, Mieloma Múltiple, Leucemia, Cáncer de Pulmón, Cáncer Pancreático, Cáncer de Próstata y Tumores Sólidos. Ver Pardoll y colaboradores, ABELOFF' S CLIN . ONCOL . (4- edición., Churchill Livingstone, Philadelphia 2008); Sioud, 360 Methods Mol. Bio. 277 (2007); Pazdur y colaboradores, J. Infusión Nursing 30(3): 173 (2007); Parmiani y colaboradores, 178 J. Immunol . 1975 (2007); Lollini y colaboradores, 24 Trends Immunol. 62 (2003); Schlom y colaboradores, 13 Clin. Cáncer Res. 3776 (2007); Banchereau y colaboradores, 392 Nature 245 (1998); Finn, 358 New Engl . J. Med. 2704 (2008); Curigliano y colaboradores, 7 Exp. Rev. Anticancer Ther. 1225 (2007). El virus de enfermedad de Marek, un virus de herpes que causa tumores en aves de corral, ha sido manejado por largo tiempo mediante vacuna. Así, las presentes modalidades abarcan composiciones inmunogénicas anti-cáncer tanto preventivas como profilácticas y vacunas de cáncer de tratamiento/ terapéuticas .
Las enfermedades proliferativas y cánceres contemplados incluyen cánceres relacionados con SIDA, neuroma acústico, leucemia linfocítica aguda, leucemia mieloide aguda, carcinoma adenocístico, cáncer adrenocortical, metaplasia mieloide agnogénica, alopecia, sarcoma de parte blanda alveolar, cáncer anal, angiosarcoma, astrocitoma, ataxia-telangiectasia, carcinoma de célula basal (piel) , cáncer de vejiga, cánceres del hueso, cáncer del intestino, tumores de cerebro y del CNS, cáncer de mama, tumores carcinoides, cáncer cervical, tumores de cerebro infantil, cáncer infantil, leucemia infantil, sarcoma de tejido blando infantil, condrosarcoma, coriocarcinoma, leucemia linfocitica crónica, leucemia mieloide crónica, cánceres colorectales, linfoma de célula T cutáneo, dermatofibrosarcoma-protuberans, tumor de célula redonda pequeña desmoplástica, carcinoma ductal, cánceres endocrinos, cáncer endometrial, ependimoma, cáncer esofágico, sarcoma de E ing, cáncer de conducto biliar extra-hepático, cáncer del ojo, incluyendo, por ejemplo, melanoma del ojo y retinoblastoma, cáncer de trompa de falopio, anemia Fanconi, fibrosarcoma, cáncer de vesícula biliar, cáncer gástrico, cáncer gastrointestinal, tumor carcinoide gastrointestinal, cánceres genitourinarios, tumores de célula germinal, enfermedad trofoblástica gestacional, glioma, cáncer ginecológico, malignidades hematológicas, leucemia de célula pilosa, cáncer de cabeza y de cuello, cáncer hepatocelular, cáncer de mama hereditario, enfermedad de Hodgkin, cáncer cervical relacionado con el papilomavirus humano, lunar hidatiforme, cáncer hipofaringe, cáncer de célula de isleta, sarcoma de Kaposi, cáncer de riñon, cáncer laríngeo, leipmiosarcoma, leucemia, síndrome de Li-Fraumeni, cáncer de labio, liposarcoma, cáncer de pulmón, linfedema, linfoma, linfoma no de Hodgkin, cáncer de mama masculino, tumo rhabdoide maligno de riñon, meduloblastoma, melanoma, cáncer de célula de Merkel, el mesotelioma, cáncer metastástico, cáncer de boca, neoplasia endocrina múltiple, fungoides de micosis, síndromes mielodisplásicos, mieloma, trastornos mieloproliferativos, cáncer nasal, cáncer nasofaríngeo, nefroblastoma, neuroblastoma, neurofibromatosis, síndrome de ruptura de Nijmegen, cáncer de piel no de melanoma, cáncer de pulmón de célula no pequeñas, cáncer de cavidad oral, cáncer orofaríngeo, osteosarcoma, cáncer ovárico de ostomía, cáncer de páncreas, cáncer paranasal, cáncer de paratiroides, cáncer de glándula parótida, cáncer de pene, tumores neuroectodérmicos periféricos, cáncer pituitaria, policitemia vera, cáncer de próstata, carcinoma de células renales, retinoblastoma, rabdomiosarcoma, síndrome de Rothmund-Thomson, cáncer de glándula salival, sarcoma, Schwannoma, síndrome de Sezary, cáncer de piel, cáncer de pulmón de célula pequeña (SCLC) , cáncer de intestino delgado, sarcoma de tejido blando, tumores de médula espinal, carcinoma de célula escamosa (piel), cáncer de estómago, sarcoma sinovial, cáncer testicular, cáncer de timo, cáncer de tiroides, cáncer de células transicional (vejiga), cáncer de células transicional (renal-pelvis/uretra) , cáncer trofoblástico, cáncer de la uretra, cáncer del sistema urinario, sarcoma uterino, cáncer de útero, cáncer vaginal, cáncer de vulva, macroglobulinemia de Waldenstrom, y tumor de ilms.
En algunas modalidades, un antígeno para uso en las composiciones inmunogénicas como se describe en la presente pueden incluir antigenos de enfermedades autoinmunes, por ejemplo, pueden ser "auto-antigenos". Las' enfermedades autoinmunes contempladas para la diagnosis de acuerdo con los ensayos descritos en la presente incluyen, pero no están limitados a alopecia areata, espondilitis anquilosante, síndrome antifosfolípido, enfermedad de Addison, anemia aplástica, esclerosis múltiple, enfermedad autoinmune de la glándula adrenal, anemia hemolítica autoinmune, hepatitis autoinmune, ooforitis autoinmune y orquitis, enfermedad de Behcet, pemfigoide buloso, cardiomiopatía, esprue celiaca-dermatitis, síndrome de fatiga crónica, síndrome desmielinizante inflamatorio crónico (CFIDS), polineuropatía inflamatoria crónica, síndrome de Churg-Strauss, penfigoide cicatricial, síndrome de CREST, enfermedad de aglutinina fría, enfermedad de Crohn, herpetiformis de dermatitis, lupus discoide, crioglobulinemia mezclada esencial, fibromialgia, glomerulonefritis, enfermedad de Grave, Guillain-Barre, tiroiditis de Hashimoto, fibrosis pulmonar idiopática, púrpura de trombocitopenia idiopática (ITP) , nefropatía IgA, diabetes dependiente de insulina (Tipo I) , Liquen plano, lupus, enfermedad de Meniere, enfermedad de tejido conectivo mezclado, miastenia grave, miocarditis, pénfigo vulgaris, anemia perniciosa, poliarteritis nodosa, policondritis, síndromes poliglandulares, polimialgia reumática, polimiositis y dermatomiositis, agamaglobulinemia primaria, cirrosis biliar primaria, psoriasis, fenómeno de Raynaud, síndrome de Reiter, fiebre reumática, artritis reumatoide, sarcoidosis, escleroderma, síndrome de Sjogren, síndrome de hombre rígido, arteritis de Takayasu, arteritis temporal/ arteritis de célula gigante, colitis ulcerativa, uveítis, síndrome de Wegener, vasculitis y vitíligo. Es general importante estimar la responsividad de CMI potencial o real en sujetos que tienen, o se sospecha de tener o que son susceptibles a una enfermedad autoinmune.
En algunas modalidades, un antígeno para el uso en las composiciones inmunogénicas como se describen en la presente puede ser un antígeno que está asociado con una enfermedad o condición inflamatoria. Ejemplos de condiciones de enfermedad inflamatoria, donde los antígenos pueden ser útiles incluyen pero no están limitados a acné, angina, artritis, neumonía de aspiración, empiema, gastroenteritis, enterocolitis necrotizante, enfermedad inflamatoria pélvica, faringitis, pleuresía, polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica, polirradiculoneuropatía desmielinizante inflamatoria crónica y polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica, entre otros.
En algunas modalidades, un antigeno puede ser un antígeno intacto (es decir, un entero o completo) , o una porción funcional de un antígeno que comprende más de un epítope. En algunas modalidades, un antígeno es una porción funcional de péptido de un antígeno. Por "intacto" en este contexto se propone que el antígeno es el antígeno de longitud completa como ese polipéptido de antígeno que ocurre en la naturaleza. Esto está en contraste directo al suministro de solamente una porción pequeña o péptido del antígeno. El suministro de un antígeno intacto a una célula permite o facilita inducir una respuesta inmune a un intervalo completo de epítopes del antígeno intacto, antes que solamente uno solo o pocos epítopes de péptidos seleccionados. Por consiguiente, los métodos y composiciones inmunogénicas descritas en la presente abarcar antígenos intactos asociados con el polímero para una especificidad más sensible y más alta de respuesta inmune como es comparada con el uso de un antígeno a base de péptido de un solo epítope.
Alternativamente, en algunas modalidades, un antígeno intacto se puede dividir en muchas partes, dependiendo del tamaño del antígeno inicial. Típicamente, donde un antígeno completo es un polipéptido de multímero, la proteína completa se puede dividir en sub-unidades y/o dominios donde cada sub-unidad individual o dominio del antígeno se puede asociar con el polímero de acuerdo a los métodos como se describen en la presente. Alternativamente, en algunas modalidades, un antígeno intacto se puede dividir en fragmentos funcionales, o partes, del antígeno completo, por ejemplo, por lo menos dos, o por lo menos 3, o por lo menos 4, o por lo menos 5, o por lo menos 6, o por lo menos 7, o por lo menos 8, o por lo menos 9, o por lo menos 10, o por lo menos 11, o por lo menos 12, o por lo menos 13, o por lo menos 15, o por lo menos 20, o por lo menos 25, o más de 25 porciones (por ejemplo, piezas o fragmentos) , inclusive, y donde cada fragmento funcional individual del antígeno se puede asociar con el polímero de acuerdo con los métodos como se describen en la presente.
La fragmentación o división de un polipéptido de antígeno de longitud completa puede ser una división igual del polipéptido de antígeno de longitud completa, o alternativamente, en algunas modalidades, la fragmentación es asimétrica o no igual. Como un ejemplo no limitante, donde un antígeno se divide en dos fragmentos sobrepuestos, un antígeno se puede dividir en fragmentos de aproximadamente el mismo (igual) tamaño, o alternativamente, un fragmento puede ser aproximadamente 45% del antígeno completo y el otro fragmento puede ser aproximadamente 65%. Como ejemplos no limitante adicionales, un antígeno completo se puede dividir en una combinación de fragmentos de diferente tamaño, por ejemplo, donde un antigeno se divide en dos fragmentos, los fragmentos se pueden dividir en aproximadamente 40% y aproximadamente 70%, o aproximadamente 45% y aproximadamente 65%, o aproximadamente 35% y aproximadamente 75%, o aproximadamente 25% y aproximadamente 85%, inclusive, del antigeno completo. Cualquier combinación de fragmentos completos de un antigeno completo de longitud completa esta abarcado para el uso en la generación de un panel de polipéptidos sobrepuestos de un antigeno. Como un ejemplo ilustrativo solamente, donde un antígeno se divide en 5 porciones, las porciones se pueden dividir igualmente (es decir, cada fragmento sobrepuesto es aproximadamente 21% a 25% de la longitud completa y entera si el antigeno) o no igualmente (es decir, un antigeno se puede dividir en los siguientes cinco fragmentos sobrepuestos; fragmento 1 es aproximadamente 25%, fragmento 2 es aproximadamente 5%, fragmento 3 es aproximadamente 35%, fragmento 4 es aproximadamente 10% y fragmento 5 es aproximadamente 25% del tamaño del antigeno de longitud completa, con la condición de que cada fragmento se sobreponga con por lo menos otro fragmento) .
Típicamente, un panel de porciones de antígeno puede sustancialmente cubrir la longitud entera del polipéptido de antígeno completo (o intacto) . Por consiguiente, en algunas modalidades, una composición inmunogénica comprende un polímero con muchos fragmentos diferentes, y/o sobrepuestos del mismo antígeno intacto. Los fragmentos de proteina sobrepuestos de un antígeno se pueden producir mucho más rápido y más económicamente, y con estabilidad incrementada como es comparado con el uso de antígenos de péptido solos. Además, en algunas modalidades, los antígenos que son polipéptidos más grandes que los péptidos simples son preferidos ya que la conformación es importante para el reconocimiento de epítope, y los polipéptidos de antígeno más grandes o fragmento proporcionarán un beneficio sobre los fragmentos de péptido.
Uno de habilidad ordinaria en la técnica puede dividir un antígeno completo en proteínas sobrepuestas de un antígeno para crear un panel de polipéptido del antígeno. A manera de un ejemplo ilustrativo únicamente, el antígeno TBl específico de TB (CFP también conocido como filtrante de cultivo-10 o CFP-10) se puede dividir en, por ejemplo por lo menos diecisiete porciones para generar un panel de diecisiete polipéptidos diferentes, cada uno que comprende un fragmento de antígeno TBl específico de TB (CFP) diferente pero sobrepuesto. La proteína de filtrado de cultivo (CFP-10) (GenBank AAC83445) es un fragmento de proteína de 100 residuos de aminoácido, de 10 kDa, de M. tuberculosis . También es conocido como proteína homologa de antígeno L45 (LHP) .
Un antígeno objetivo para el uso en los métodos y composiciones descritas en la presente se puede expresar por medios recombinantes, y opcionalmente puede incluir una etiqueta de afinidad o de epítope para facilitar la purificación, los métodos que son bien conocidos en la técnica. La síntesis química de un oligopéptido, ya sea libre o conjugado con proteínas portadoras, se puede utilizar para obtener el antígeno de la invención. Los oligopéptidos se consideran un tipo de polipéptido. Un antígeno se puede expresar como una fusión con una molécula de afinidad complementaria, por ejemplo, pero no limitado a rhizavidina o un derivado o fragmento funcional de la misma. Alternativamente, también es posible preparar antígeno objetivo y luego conjugarlo con una molécula de afinidad complementaria, por ejemplo, pero no limitado a rhizavidina o un derivado o fragmento funcional de la misma.
Los polipéptidos también se pueden sintetizar como estructuras ramificadas tales como aquellos descritos en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,229.490 y No. 5,390,111. Los polipéptidos antigénicos incluyen, por ejemplo, epítopes de célula B y de célula T sintéticos o recombinantes, epítopes de célula T universales, y epítopes de célula T mezclados de un organismo o enfermedad y epítopes de célula B de otro.
Un antígeno se puede obtener a través de medios recombinantes o síntesis de polipéptido química, así como un antígeno obtenido de fuentes o extractos naturales, se puede purificar por medio de las características físicas y químicas del antígeno, tal como mediante fraccionamiento o cromatografía. Estas técnicas son bien conocidas en el arte.
En algunas modalidades, un antígeno se puede solubilizar en agua, un solvente tal como metanol, o una solución amortiguadora. Las soluciones amortiguadoras adecuadas incluyen, pero no están limitadas a, solución salina amortiguada con fosfato libre de Ca2+/Mg2+ (PBS), solución salina normal (150 mM de NaCl en agua), y solución amortiguadora Tris. El antígeno no soluble en solución reguladora neutra se puede solubilizar en ácido acético 10 mM y luego diluir al volumen deseado con una solución amortiguadora neutra tal como PBS. En el caso de antígeno soluble únicamente a pH ácido, se puede utilizar acetato-PBS en pH ácido como un diluyente después de la solubilización en ácido acético diluido. El glicerol puede ser un solvente no acuoso adecuado para el uso en las composiciones, métodos y equipos descritos en la presente.
Típicamente, cuando se diseña una vacuna de proteína contra un patógeno, una proteína extracelular o una expuesta al medio ambiente en un virus es frecuentemente el candidato ideal como el componente de antígeno en la vacuna.
Los anticuerpos generados contra esa proteína extracelular llegan a ser la primera linea de defensa contra el patógeno durante la infección. Los anticuerpos que enlazan a la proteína sobre el patógeno para facilitar la opsonizacion del anticuerpos y marcar el patógeno para la ingestión y destrucción mediante un fagocito tal como un macrófago. La opsonizacion de anticuerpo también puede exterminar al patógeno mediante la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo. El anticuerpo activa una liberación de productos de lisis de las células tales como monocitos, neutrófilos, eosinófilos y células exterminadoras naturales.
En una modalidad de a invención descrita en la presente, los antígenos para el uso en las composiciones como se describen en la presente son todas proteínas de tipo silvestre, como en los residuos de aminoácido que tienen las secuencias encontradas en virus que ocurren naturalmente y no se han alterado mediante condiciones de crecimiento selectivas o métodos biológicos moleculares.
En una modalidad, las composiciones inmunogénicas descritas en la presente pueden comprender antígenos que son proteínas glicosiladas . En otras palabras, un antígeno de interés cada una puede ser una proteína glicosilada. En una modalidad de las composiciones inmunogénicas como se describe en la presente, los antígenos, o polipéptidos de antígeno-fusión son glicosilados O-enlazados. En otra modalidad de las composiciones inmunogénicas, como se describen en la presente, los antígenos o polipéptidos de antigeno-fusión son glicosilados N-enlazados. En todavía otra modalidad de las composiciones inmunogénicas como se describen en la presente, los antígenos, o antígeno-fusión son ambos glicosilados O-enlazados y N-enlazados. En otras modalidades, otros tipos de glicosilaciones son posibles, por ejemplo, C-manosilación. La glicosilación de proteínas ocurre predominantemente en células eucarióticas. La N-glicosilación es importante para el plegamiento de algunas proteínas eucarióticas, que proporcionan un mecanismo de modificación co-traduccional y post-traduccional que modulan la estructura y función de la membrana y proteínas secretadas. La glicosilación es el proceso enzimático que enlaza sacáridos para producir glicanos, y los une a proteínas y lípidos. En la N-glicosilación, los glicanos se unen a nitrógeno de amida de la cadena lateral de asparagina durante la traducción de proteína. Los tres sacáridos mayores que forman glicanos son moléculas de glucosa, mañosa y N-acetilglucosamina . La N-glicosilación consensual es Asn-Xaa-Ser/Thr, donde Xaa puede ser cualquiera de los aminoácidos conocidos. La glicosilación O-enlazada ocurre en una etapa posterior durante el procesamiento de la proteína, de preferencia en el aparato de Golgi. En la glicosilación O-enlazada, N-acetil-galactosamina, 0-fucosa, O-glucosa y/o N-acetilglucosamina se adiciona a residuos de serina o treonina. Un experto en la técnica puede utilizar el software bioinformático tal como los softwares de predicción NetNGlyc 1.0 y NetOGlyc de la Universidad Técnica de Dinamarca para encontrar los sitios de N- y O-glicosilación en un polipéptido de la presente invención. El servidor NetNGlyc predice los sitios de N-glicosilación en proteínas utilizando redes neuronales artificiales que examinan el contexto de secuencia de las secuencias Asn-Xaa-Ser/Thr. El software de predicción NetNGlyc 1.0 y NetOGlyc 3.1 se puede accesar en el sitio de la red EXPASY. En una modalidad, la N-glicosilación ocurre en el polipéptido de antígeno objetivo de polipéptido de fusión descrito en la presente.
Pares de moléculas de afinidad Como describe en la presente, en algunas modalidades, un antígeno se conecta a un polímero por la vía de pares de afinidad complementaria. Esta conexión del antígeno al polímero es mediada por el polímero que es conectado a una primera molécula de afinidad, que se asocia a una segunda molécula de afinidad (por ejemplo, complementaria), que se une al antígeno. Un par de afinidad complementaria de ejemplo es la biotina/proteína que enlaza biotina.
Ejemplos ejemplares de los pares de afinidad complementaria de afinidad incluyen, pero sin limitación, proteínas que enlaza biotina o proteínas similares a avidina que enlazan a biotina. Por ejemplo, donde la primera molécula que enlaza afinidad es biotina (que se asocia con el polímero) , la molécula de afinidad complementaria puede ser una proteína que enlaza biotina o una proteína similar a avidina o un derivado de la misma, por ejemplo, pero no limitada a, avidina, rhizavidina o estreptavidina o variantes, derivados o porciones funcionales de las mismas.
En algunas modalidades, la primera molécula de enlace de afinidad es biotina, un derivado de biotina, o una imitación de biotina, por ejemplo, pero no limitada a, amina-PEG3-biotina ( ( (+) -biotinilación-3-6, 9-trixaundecanodiamina) o un derivado o fragmento funcional de la misma. Un mimético de biotina específico tiene un motivo de péptido específico que contiene la secuencia de DXaAXbPXc (SEC ID NO: 39), o CDXaAXbPXcCG (SEC ID NO: 40), donde Xa es R o L, Xb es S o T, y Xc es Y o W. Estos motivos pueden enlazar avidina y Neutravidina, solo estreptavidina. Ver, por ejemplo, Gaj y colaboradores, 56 Prot. Express. Purif. 54 (2006).
El enlace de la primera molécula de afinidad al polímero, y la molécula de afinidad complementaria al antígeno puede ser un enlace no covalente, o un mecanismo químico, por ejemplo, enlace covalente, enlace de afinidad, intercalación, enlace coordinado y formación de complejo. El enlace covalente proporciona el enlace muy estable, y es particularmente bien adecuado para las presentes modalidades. El enlace covalente se puede lograr ya sea mediante la condensación directa de cadenas laterales existentes o mediante la incorporación de moléculas de puente externas.
Por ejemplo, en algunas modalidades, un antigeno puede ser enlazado no covalentemente a uno de los pares en un par de fijación complementario. En modalidades alternativas, un antigeno se puede enlazar covalentemente o fusionar a uno de los pares en un par fijación complementario. Métodos para generación de proteínas de fusión son bien conocidos en la técnica, y se discuten en la presente.
En otra modalidad, una primera molécula de enlace de afinidad se enlaza al polímero mediante un enlace no covalente, o mediante un enlace covalente. En algunas modalidades, un reactivo de reticulación se utiliza para enlazar covalentemente la primera molécula de enlace de afinidad al polímero como es descrito en la presente.
En algunas modalidades, la primera molécula de enlace de afinidad se socia con molécula la molécula de afinidad complementaria mediante la asociación de enlace no covalente como es conocido en la técnica, que incluye, pero no limitado a, interacción electrostática, enlace de hidrógeno, interacción hidrofóbica (es decir, fuerzas de van der Waals), interacciones hidrofílicas, y otras interacciones no covalentes . También se contemplan otras interacciones de orden más alto con porciones intermedias.
En algunas modalidades, la molécula de afinidad complementaria es un polipéptido relacionado con avidina. En modalidades especificas, la molécula de afinidad complementaria es rhizavidina, tal como rhizavidina recombinante. En particular, la rhizavidina recombinante es una rhizavidina modificada que se puede expresar en E. coli con un alto rendimiento. El rendimiento típico es >30 mg por litro de cultivo de E. coli. La rhizavidina tiene una homología de secuencia inferior a la avidina de huevo (22.4% de identidad de secuencia y 35.0% de similitud) comparada con otras proteínas similares a avidina. El uso de la rhizavidina modificada reduce el riesgo de los MAPS que inducen una reacción alérgica relacionada con el huevo en un sujeto. Por otra parte, el anticuerpo a la rhizavidina modificada recombinante no tiene reactividad cruzada aparente a la avidina de huevo (y viceversa) .
Más específicamente, algunas modalidades comprenden una rhizavidina modificada diseñada para la expresión recombinante en E. coli. La secuencia de codificación para el gen de rhizavidina se optimizó utilizando de codones de expresión de E. coli, para evitar cualquier dificultad durante la expresión en E. coli debido a codones raros presentes en el gen original. Para simplificar el constructo, después de un análisis bioinformático y a base de estructura, los primeros 44 residuos de la rhizavidina de longitud completa se removieron, ya que se encontraron que son innecesarios para la estructura de núcleo y la función. El plegamiento correcto de la proteina recombinante se mejoró al adicionar una secuencia de señal de secreción de E. coli al N-terminal de la rhizavidina acortada (45-179) , para facilitar la translocación de la proteina recombinante en el espacio periplásmico de las células de E. coli, donde el enlace de disulfuro funcionalmente importante en rhizavidina se puede formar correctamente. La rhizavidina recombinante modificada forma un dimero, comparado con las proteínas similares a avidina conocidas que forman tetrámeros, además mejora la expresión de la fusión de rhizavidina recombinante-antígeno como una proteina soluble en E. coli.
Por otra parte, como se discute en detalle adicional en otra parte en la presente, para mejorar la expresión y solubilidad de antígenos de fusión en E. coli, se adicionó una región enlazadora flexible entre la . rhizavidina y la proteína de antígeno. Adicionalmente, en base del análisis de bioinformática y estructural, diferentes constructos de antígeno se clonaron y expresaron: ya sea antígeno de longitud completa, o el dominio funcional importante, o proteínas quimeras estuvieron comprendiendo dos antígenos diferentes.
Los pares de afinidad adicionales que pueden ser útiles en los métodos y composiciones descritos en la presente incluyen antigeno-anticuerpo, metal/ion-metal/proteína que enlaza ion, lípido/proteina que enlaza lipido, sacárido/proteina que enlaza sacárido, aminoácido/péptido/ proteina que enlaza aminoácido o péptido, enzima-sustrato o enzima-inhibidor, ligando-agonista/receptor, o mimético de biotina. Cuando se utilizan pares de afinidad alternativos, los medios alternativos para unir el polímero respectivo y el antígeno también se pueden emplear, tal como la reacción enzimática in vitro antes que la fusión genética. Más específicamente, el par de afinidad de antígeno-anticuerpo proporciona una interacción muy fuerte y específica. El antígeno puede ser cualquier epítope que incluye proteína, péptido, ácido nucleico, lipido, poli/oligosacárido, ion, etc. El anticuerpo puede ser cualquier tipo de inmunoglobulina, o la porción que enlaza a Ag de inmunoglobulina, tal como un fragmento de Fab. Considerando el metal/ion-metal/proteína que enlaza ion, ejemplos incluyen Ni NTA contra proteína etiquetada con histidina, o Zn contra proteína que enlaza Zn. Considerando el lípido/proteina que enlaza de lipido, ejemplos incluyen colesterol contra proteína que enlaza colesterol . Considerando sacárido/proteina que enlaza sacárido, ejemplos incluyen maltosa contra proteína que enlaza maltosa, manosa/glucosa/oligosacárido contra lectina. El sustrato de enzima/inhibidores incluyen sustratos de una amplia gama de sustancias, que incluyen proteina, péptido, aminoácido, lipido, azúcar o iones. El inhibidor puede ser el análogo del sustrato real, que generalmente puede enlazar a las enzimas más herméticamente y aun irreversiblemente. Por ejemplo, tripsina contra el inhibidor de tripsina de soja. El inhibidor puede ser una molécula natural o sintética. Considerando otro ligando/agonista-receptor, ligando puede ser de una amplia gama de sustancias, incluyendo proteina, péptido, aminoácido, lipido, azúcar, ion, agonista que puede ser el análogo del ligando real. Ejemplos incluyen la interacción LPS contra TLR4.
Reactivos de reticulación: Muchos agentes de enlace bivalentes o polivalentes son útiles en acoplar moléculas de proteina a otras moléculas. Por ejemplo, los agentes de acoplamiento representativos pueden incluir compuestos orgánicos tales como tioésteres, carbodiimidas, ésteres de succinimida, disocianatos , glutaraldehidos, diazobencenos y hexametilen diamina. Este listado no propone para ser exhaustivo de las diversas clases de agentes de acoplamiento conocidos en la técnica, sino, más bien, es ejemplar de los agentes de acoplamiento más comunes. Ver Killen & Lindstrom, 133 J. Immunol. 1335 (1984); Jansen y colaboradores, 62 Imm. Rev. 185 (1982); Vitetta y colaboradores.
En algunas modalidades, los agentes de reactivos de reticulación descritos en la literatura están abarcados para el uso en los métodos, composiciones inmunogénicas y equipos como se describen en la presente. Véase, por ejemplo, Ramakrishnan, y colaboradores, Cáncer Res. 44. 201 (1984) (que describe el uso de MBS (éster de M-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida) ) ; Umemoto y colaboradores, Patente de los Estados Unidos No. 5,030, 719 (que describe el uso de un derivado de acetil hidrazida halogenado acoplado a un anticuerpo por medio de un enlazador de oligopéptido) . Los enlazadores particulares incluyen: '(a) EDC (clorhidrato de l-etil-3- (3-dimetilamino-propil) carbodiimida; (b) SMPT (4-succinimidiloxicarbonil-alfa-metil-alfa- (2-piridil-ditio) -tolueno (Pierce Chem. Co. , Cat #21558G) ; (c) SPDP hexanoato de (succinimidil-6 [3- (2-piridilditio) propionamido] (Pierce Chem. Co., Cat #21651G);. (d) Sulfo-LC-SPDP hexanoato de (sulfosuccinimidil-6 [3- (2-piridilditio) -propianamida] (Pierce Chem. Co. Cat. #2165-G) , y (f) sulfo-NHS (N-N-hidroxisulfo-succinimida: Pierce Chem. Co., cat. #24510) conjugado a EDC.
Los enlaces o agentes de enlace descritos en lo anterior contienen componentes que tienen diferentes atributos, para conducir de esta manera a conjugados con diferentes propiedades fisico-quimicas . Por ejemplo, los ésteres de sulfo-NHS de carboxilatos de alquilo son más estables que los ésteres de sulfo-NHS de carboxilatos aromáticos. Los enlazadores que contienen NHS-éster son menos solubles que los ásteres de sulfo-NHS. Además, el enlazador SMPT contiene un enlace de disulfuro estéricamente impedido, y puede formar conjugados con estabilidad incrementada. Los enlaces de disulfuro, son en general, menos estables que otros enlaces debido a que el enlace de disulfuro se puede segmentar in vitro, dando por resultado menos conjugado disponible. Sulfo-NHS, en particular, puede aumentar la estabilidad de los acoplamientos de carbodimida. Los acoplamientos de carbodimida (tal como EDC) cuando se utilizan en conjunción con sulfo-NHS, forman ásteres que son más resistentes a la hidrólisis que la reacción de acoplamiento de carbodimida sola.
Las moléculas de reticulación ejemplares para el uso en los métodos y composiciones inmunogénicas como se describe en la presente incluyen, pero no están limitadas a aquellas listadas en las Tablas 3 y 4.
Tabla 3. Reticuladores homobifuncionales ejemplares* extremo. Los reactivos se clasifican por lo que los grupos químicos se enlazan (columna izquierda) y su composición química (columna de en medio) . Los productos se listan én orden de longitud incrementada dentro de cada célula.
Factor co-estimulatorio En algunas modalidades, la composición inmunogénica como se describe en la presente comprende por lo menos una molécula co-estimulatoria. En algunas modalidades, el factor co-estimulatorio se retícula al polímero. En algunas modalidades, el factor co-estimulatorio se asocia al polímero mediante un par de afinidad complementaria similar como un antígeno se asocia con el polímero. En algunas modalidades, donde el par de afinidad complementaria que enlaza el factor co-estimulatorio al polímero es el mismo, o un diferente par de afinidad complementaria que enlaza el antígeno al polímero.
En algunas modalidades, por lo menos uno, o por lo menos 2, o por lo menos 3, o por lo menos 5, o por lo menos 10, o por lo menos 15, o por lo menos 20, o por lo menos 50, o por lo menos 100, o más de aproximadamente 100, inclusive, factores co-estimulatorios se pueden asociar con el polímero como es descrito en la presente. En algunas modalidades, los factores co-estimulatoríos pueden ser el mismo factor co-estimulador , o pueden ser una variedad de diferentes factores co-estimulatorios asociados con el polímero.
En algunas modalidades, el factor co-estimulador es un ligando/agonista de receptores similares a Toll, por ejemplo, pero no limitado a TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, TLRll , etc. En algunas modalidades, un factor co-estimulador es un ligando/agonista de NOD, o un activador/agonista de la inflamasoma. Sin desea que sea limitado por la teoría, la inflamasoma es un oligómero de multiproteína que consiste de caspasa 1, PYCARD, NALP y algunas veces caspasa 5 o caspasa 11 y promueve la maduración de las citoquinas inflamatorias, interleucina l-ß e interleucina 18.
En algunas modalidades, un factor co-estimulador es una citoquina. En algunas modalidades, una citoquina se selecciona del grupo que consiste de: GM-CSF; IL-la; IL-?ß; IL-2; IL-3; IL-4; IL-5; IL-6; IL-7; IL-8; IL-10; IL-12; IL-23; IFN-a; IFN-ß; IFN-ß; IFN-?; MIP-l ; ???-1ß; TGF-ß; TNFa y ???ß. En algunas modalidades, el factor co-estimulatorio es un adyuvante, que se puede asociar con el polímero, como precisamente se discutió, o se puede adicionar a la composición de MAPS antes de o concurrente a la administración a un sujeto. Los adyuvantes además se describen en otra parte en la presente.
Producción de proteínas recombinantes Las proteínas recombinantes se pueden expresan convenientemente y purificar por una persona experta en la técnica, o al utilizar equipos comercialmente disponibles, por ejemplo, el sistema de purificación PROBONDMR (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA) . En algunas modalidades, los antigenos recombinantes se pueden sintetizar y purificar mediante métodos de purificación de proteina utilizando sistemas de expresión bacteriana, sistemas de expresión de levadura, sistemas de expresión de baculovirus/células de insecto, sistemas de expresión de célula mamifera, o sistemas de planta o animal transgénico como es conocido para personas de habilidad ordinaria en la técnica.
Las proteínas, polipéptidos y polipéptidos de fusión descritas en la presente todos se pueden sintetizar y purificar mediante métodos de proteína y moleculares que son bien conocidos para un experto en la técnica. Los métodos de biología molecular y los sistemas de expresión de proteína heteróloga recombinantes son utilizados. Por ejemplo, la proteína recombinante se puede expresar en bacterias, células mamíferas, de insecto, de levadura o de plantas; o en hospederos de plantas o animales transgénicos .
En una modalidad, se proporciona en la presente un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido de fusión o un polipéptido no de fusión descrito en la presente. Las técnicas de clonación de reacción en cadena de polimerasa (PCR) convencionales se pueden utilizar para construir una secuencia de codificación quimérica o de fusión que codifica un polipéptido de fusión como es descrito en la presente. Una secuencia de codificación se puede clonar en un vector de clonación de propósito general, tales como los vectores pUC19, pBR322, pBLUESCRIPT® (Stratagene, Inc.) o pCR TOPO® (Invitrogen) . El vector recombinante resultante que lleva el ácido nucleico que codifica un polipéptido como es descrito en la presente luego se puede utilizar para manipulaciones biológicas moleculares adicionales tal como la mutagénesis dirigida al sitio para crear un polipéptido de fusión variante como es descrito en la presente o se puede subclonar en vectores de expresión de proteina o vectores virales para síntesis de proteína en una variedad de sistemas de expresión de proteína utilizando células hospederas seleccionadas del grupo que consiste en líneas de células mamíferas, líneas de células de insecto, levadura, bacterias, y células de plantas.
Cada cebador de P-CR debe tener por lo menos 15 nucleótidos sobrepuestos con sus plantillas correspondientes a la región que es amplificada. La polimerasa utilizada en la amplificación de PCR debe tener alta fidelidad tal como polimerasa PfuULTRA® (Stratagene) para reducir los errores de secuencia durante el proceso de amplificación de PCR. Para facilitar de ligar varios fragmentos de PCR separados conjuntamente, por ejemplo, en la construcción de un polipéptido de fusión, y subsecuentemente la inserción en un vector de clonación, los cebadores de PCR también deben tener sitios de digestión de restricción distintos y únicos en sus extremos flanqueantes que no recosen a la plantilla de DNA durante la amplificación por PCR. La elección de los sitios de digestión de restricción para cada par de cebadores específicos debe ser tal que el polipéptido de fusión que codifica la secuencia de DNA está en la estructura y codificará el polipéptido de fusión desde el inicio hasta el final sin codones de detención. Al mismo tiempo, los sitios de digestión de restricción elegidos no se deben encontrar dentro de la secuencia de DNA de codificación para el polipéptido de fusión. La secuencia de DNA de codificación para el polipéptido propuesto se puede ligar en el vector de clonación pBR322 o uno de sus derivados, para amplificación, verificación de fidelidad y autenticidad de la secuencia de codificación quimérica, sustituciones/o mutagénesis dirigida al sitio específica para mutaciones y sustituciones de aminoácidos específicas en el polipéptido.
Alternativamente, la secuencia de DNA de codificación para el polipéptido puede ser clonada en PCR en un vector utilizando, por ejemplo, el método de clonación TOPO® que comprende vectores TA asistidos con topoisomerasa, tales como pCR®-TOPO, pCR®-Blunt II-TOPO, pENTR/D-TOPO® y pENTR/SD/D-TOPO® (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA) . Tanto pENTR/D-TOPO® como pENTR/SD/D-TOPO® con vectores de entrada TOPO direccionales que permiten la clonación de la secuencia de DNA en la orientación 5'? 3' en un vector de expresión GATEWAY®. La clonación direccional en la orientación 5'-+3' facilita la inserción unidireccional de la secuencia de DNA en un vector de expresión de proteina tal que el promotor está corriente arriba del codón de inicio 5' ATG del polipéptido de fusión que codifica la secuencia de DNA, permitiendo la expresión de proteina impulsada por el promotor. El vector recombinante que lleva la secuencia de DNA de codificación para el polipéptido de fusión se puede transfectar en y propagar en E. coli de clonación general tal como XLIBlue, SURE® (Stratagene®) y células TOP-10 (Invitrogen) .
Un experto en la técnica seria capaz de clonar y ligar la región de codificación del antigeno de interés con la región de codificación de la molécula de afinidad complementaria para construir una secuencia de codificación quimérica para un polipéptido de fusión que comprende el antígeno o un fragmento del mismo y la molécula de afinidad complementaria de un derivado del mismo utilizando sondas de oligonucleótido especialmente diseñadas y metodologías en reacción en cadena de polimerasa (PCR) que son bien conocidas en la técnica. Un experto en la técnica también sería capaz de clonar y ligar la secuencia de codificación quimérica para una proteína de fusión en un vector seleccionado, por ejemplo, vector de expresión bacteriano, un vector de expresión de insecto o vector de expresión de baculovirus . Las secuencias de codificación del antigeno y el polipéptido de antigeno objetivo o fragmento del mismo deben ser ligadas en la estructura y la secuencia de codificación quimérica debe ser ligada corriente abajo del promotor, y entre el promotor y el terminador de transcripción. Subsecuente a eso, el vector recombinante se transfecta en E. coli de clonación regular, tal como XLlBlue. JET. coli recombinante que alberga el DNA de vector de transferencia luego se selecciona mediante la resistencia a antibiótico para remover cualquier E. coli que alberga DNA de plásmido no recombinante. El E. coli transformante seleccionado se cultiva y el DNA de vector recombinante se puede purificar subsecuentemente para la transfección en células de S. frugiperda .
En algunas modalidades, los antigenos como se describen en la presente pueden comprender un péptido de señal para la translocación en el espacio periplásmico de las bacterias. El péptido de señal también es llamado un péptido de guia en el N-terminal, que puede o no puede ser segmentado después de la translocación .a través de la membrana. Un ejemplo de un péptido de señal es MKKIWLALAGLVLAFSASA (SEC ID NO: 2) como se describe en la presente. Otra secuencia de señal es MAPFEPLASGILLLLWLIAPSRA (SEC ID NO: 7). Otros ejemplos de péptido de señal se pueden encontrar en SPdb, una base de datos de péptido de señal, que se encuentra en el sitio de la red mundial de "proline.bic.nus.edu.sg/SPDB/".
En algunas modalidades, donde el antigeno se fusiona a una proteina que enlaza biotina, la secuencia de señal se puede ubicar en el N-terminal de la proteina que enlaza biotina. En algunas modalidades, la secuencia de señal se segmenta de la proteina que enlaza biotina después de la translocación en el espacio periplásmico de E. coli.
En algunas modalidades, donde el antígeno se fusiona a una proteina de afinidad complementaria, la secuencia señal se puede ubicar en el N-terminal de la proteina de afinidad complementaria. Por ejemplo, si un antigeno se fusiona a una proteina similar a avidina, la secuencia de señal se puede ubicar en el N-terminal de la proteina de afinidad complementaria. En algunas modalidades, la secuencia de señal se segmenta de la proteina de afinidad complementaria antes de que la proteina de afinidad complementaria se asocie con la primera molécula de afinidad.
En algunas modalidades, un antigeno y/o proteina de afinidad complementaria como es descrito en la presente carece de una secuencia de señal.
Los polipéptidos descritos en la presente se pueden expresar en una variedad de células hospederas de expresión, por ejemplo, bacterias, levaduras, células mamiferas, células de insecto, células de plantas, células de algas tal como Chlamadomonas, o en sistemas de expresión libres de células.
En algunas modalidades, el ácido nucleico se puede subclonar del vector de clonación en un vector de expresión recombinante que es apropiado para la expresión del polipéptido de fusión en bacterias, células mamiferas, de insecto, levadura, o de plantas o un sistema de expresión libre de células tal como el sistema de expresión de reticulocito de conejo. Algunos vectores se diseñan para transferir el ácido nucleico de codificación para la expresión en células mamiferas, células de insecto y levadura en una sola reacción de recombinación. Por ejemplo, algunos de los vectores de destino Gateway® (Invitrogen) se diseñan para la construcción de baculovirus, adenovirus, virus adeno-asociado (AAV) , retrovirus, y lentivirus, que en la infección de sus células hospederas respectivas, permiten la expresión heteróloga de polipéptidos de fusión en las células hospederas apropiadas. La transferencia de un gen en un vector de destino se realiza en solo dos pasos de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Hay vectores de expresión GATEWAY® para la expresión de proteina en células de insecto, células mamiferas, y levadura. Después de la transformación y selección en E. coli, el vector de expresión está listo para ser utilizado para la expresión en el hospedero apropiado.
Ejemplos de otros vectores de expresión y células hospederas son los vectores pcDNA3.1 a base de promotor CMV fuertes (Invitrogen) y pCINEO (Promega) para la expresión en lineas de células mamiferas tales como CHO, COS, HEK-293, Jurkat, y MCF-7; vectores de vector adenoviral incompetente de replicación pADENO-X™, pAd5F35, pLP-ADENOm-X-CMV (CLONTECH®) , pAd/C V/V5-DEST, vector pAd-DEST (Invitrogen) para la transferencia de gen mediada por adenovirus y la expresión en células mamiferas; vectores de retrovirus pLNCX2, pLXSN y pLAPSN para el uso con el sistema RETRO-X™ de Clontech para transferencia de gen mediada por retroviral y expresión en células mamiferas: pLenti4/V5-DEST™, pLenti6/V5-DEST™ y pLenti6.2/V5-G /lacZ (Invitrogen) para transferencia de gen mediada por lentivirus y la expresión en células mamiferas; vectores de expresión de virus asociado con adenovirus tal como el vector pAAV-MCS, pAAV-IRES-hrGFP, y pAAV-RC (Stratagene) para la transferencia de gen mediada por virus adeno-asociado y la expresión en células mamiferas; baculovirus BACpak6 (Clontech) y pFASTBAC™ HT (Invitrogen) para la expresión en lineas de células de insecto S. frugiperda 9 (Sf9) , Sfll, Tn-368 y BTI-TN-5B4-1 ; pMT/BiP/V5-His (Invitrogen) para la expresión en células S2 de Drosophila schneider; vectores de expresión de Pichia pPICZa, pPICZ, pFLDa y pFLD (Invitrogen) para la expresión en P. pastoris y vectores pMETa y pMET para la expresión en P. methanolica; vectores pYES2/GS y pYDl (Invitrogen) para la expresión en levadura S. cerevisiae.
Avances recientes en las proteínas heterólogas de expresión a gran escala en Chlamydomonas reinhardtii son descritos. Griesbeck., 34 Mol. Biotechnol. 213 (2006); Fuhrmann, 94 Methods Mol Med. 191 (2006). Las secuencias de codificación heterólogas foráneas se insertan en el genoma del núcleo, cloroplasto y mitocondrios mediante la recombinación homologa. El vector de expresión de cloroplasto p64 que lleva el marcador seleccionable de cloroplasto más versátil aminoglicósido adenil transferasa (aadA) , que confiere resistencia a espectinomicina o estreptomicina, se puede utilizar para expresar proteina foránea en el cloroplasto. El método de pistola génica biolistica se puede utilizar para introducir el vector en las algas. En su entrada en los cloroplastos, el DNA foráneo se libera de las partículas de la pistola génica y se integra en el genoma de cloroplasto a través de recombinación homologa.
También incluida en la invención está la molécula de afinidad complementaria fusionada a un antígeno. En algunas modalidades, el constructo de fusión también puede comprender opcionalmente etiquetas de purificación y/o péptidos de señal de secreción. Estas proteínas de fusión se pueden producir mediante cualquier método estándar. Por ejemplo, para la producción de una línea de células estable que expresa una proteína de fusión de antígeno-molécula de afinidad complementaria, los ácidos nucleicos de antígeno amplificados por PCR se pueden clonar en el sitio de restricción de un derivado de un vector de expresión mamífero. Por ejemplo, KA, que es un derivado de pcDNA3 (Invitrogen) contiene un fragmento de DNA que codifica una etiqueta de hemaglutinina (HA) del virus de influenza. Alternativamente, los derivados de vector que codifican otras etiquetas, tales como las etiquetas c-myc o polihistidina, se pueden utilizar. El constructo de expresión de fusión de antígeno-molécula de afinidad complementaria se puede co-transfectar con un plásmido marcador, en una línea de células mamíferas apropiada (por ejemplo, células COS, HEK293T o NIH 3T3) utilizando, por ejemplo, LIPOFECTAMINE™ (Gibco-BRL, Gaithersburg, MD) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, o cualquier otra técnica de transfeccion adecuada conocida en el arte. Los marcadores de transfeccion adecuados incluyen, por ejemplo, ß-galactosidasa o plásmidos de expresión de proteína fluorescente verde (GFP) o cualquier plásmido que no contiene el mismo marcador detectable como la proteína de fusión de antígeno-molécula de afinidad complementaria. Las células que expresan proteínas de fusión pueden ser clasificadas y además cultivadas, o la proteína de fusión de antígeno-molécula de afinidad complementaria etiquetada se puede purificar. En algunas modalidades, una proteína de fusión de antígeno-molécula de afinidad complementaria se amplifica con un péptido de señal. En modalidades alternativas, un cDNA que codifica una proteína de fusión de antigeno-molécula de afinidad complementaria se puede amplificar sin el péptido de señal y subclonar en un vector (pSecTagHis) que tiene un péptido de señal de secreción fuerte. En otro ejemplo, la proteína de fusión de antígeno-molécula de afinidad complementaria puede tener una etiqueta de fosfatase alcalina (AP) o una etiqueta de histidina (His) para purificación. Cualquier método conocido por personas de habilidad ordinaria en la técnica para la purificación de proteína del antígeno y/o proteína de fusión de antígeno-molécula de afinidad complementaria está abarcado para el uso en los métodos de la invención.
En algunas modalidades, cualquiera de los polipéptidos descritos en la presente se produce mediante la expresión de un vector de baculovirus recombinante . En otra modalidad, cualquiera de los polipéptidos descritos en la presente se expresa mediante una célula de insecto. En todavía otra modalidad, cualquiera de los polipéptidos descritos en la presente se aisla de una célula de insecto. Hay varios beneficios de la expresión de proteína con baculovirus en células de insecto, incluyendo altos niveles de expresión, facilidad de escalación, producción de proteínas con modificación pos-traduccional y crecimiento celular simplificado. Las células de insecto no requieren CO2 para el crecimiento y se pueden adaptar fácilmente al cultivo de suspensión de alta densidad para la expresión a gran escala. Muchas de las rutas de modificación post-traduccionales presentes en sistemas mamíferos también se utilizan en células de insecto, que permite la producción de proteina recombinante que es antigénicamente, inmunogénicamente y funcionalmente similar a la proteína mamífera nativa.
Los baculovirus son virus de DNA en la familia Baculoviridae. Estos virus se conocen que tienen un intervalo de hospedero reducido que es limitado principalmente a la especies de insectos de Lepidpoteran (mariposas y polillas) . El Virus de Polihedrosis Nuclear de Autographa californica de baculovirus (AcNPV) , que ha llegado a ser el baculovirus prototipo, se replica eficientemente en células de insecto cultivadas susceptibles. AcNPV tiene un genoma de DNA circular cerrado de doble hebra de aproximadamente 130,000 pares de bases y es bien caracterizado con respecto al intervalo de hospedero, biología molecular y genética. El Sistema de Vector de Expresión de Baculovirus (BEVS) es un método seguro y rápido para la producción abundante de proteínas recombinantes en células de insecto e insectos. Los sistemas de expresión de baculovirus son sistemas potentes y versátiles para la expresión de proteína recombinante de alto nivel en células de insecto. Niveles de expresión de hasta 500 mg/1 se han reportado utilizando el sistema de expresión de baculovirus, haciéndolo un sistema ideal para la expresión de alto nivel. Los baculovirus recombinantes que expresan genes foráneos se construyen por medio de la recombinación homologa entre el DNA de baculovirus y plásmidos quiméricos que contienen la secuencia de gen de interés. Los virus recombinantes se pueden detectar en virtud de su morfología de placa distinta y purificar en placa hasta la homogeneidad.
Las proteínas de fusión recombinantes descritas en la presente se pueden producir en células de insectos que incluyen, pero no limitadas a, células derivadas de la especie Lepidopteran, S. frugiperda. Otras células de insecto que pueden ser infectadas por baculovirus, tales como aquellas de las especies Bombyx mori, Gallería mellanoma, Trichplusia ni o Lamanthria dispar, también se pueden utilizar como un sustrato adecuado para producir proteínas recombinantes descritas en la presente. La expresión de baculovirus de proteínas recombinantes es bien conocida en la técnica. Ver las Patentes de los Estados Unidos No. 4,745,051; No. 4,879,236; No. 5,179,007; No 5,516,657; No. 5,571,709; No. 5,759,809. Será entendido por aquellos expertos en la técnica que el sistema de expresión no está limitado a un sistema de expresión de baculovirus. Lo que es importante es que el sistema de expresión dirija la N-glicosilacióñ de las proteínas recombinantes expresadas. Las proteínas recombinantes descritas en la presente también se pueden expresar en otros sistemas de expresión tales como virus Entomopox (los poxvirus de insectos), virus de polihedrosis citoplásmica (CPV) y transformación de células de insecto con el gen recombinante o la expresión constitutiva de genes. Un buen número de vectores de transferencia de baculovirus y las células hospederas apropiadamente modificadas correspondiente son comercialmente disponibles, por ejemplo, pAcGP67, pAcSECG2TA, pVLl392, pVL1393, pAcGHLT, y pAcAB4 de BD Biosciences; pBAC-3, pBAC-6, pBACgus-6, y pBACsurf-1 de Novagen® y pPolh-FLAG y pPolh-MAT de SIGMA ALDRICH®.
La región entre el promotor y el terminador de transcripción puede tener múltiples sitios de digestión de enzimas de restricción para facilitar la clonación de la secuencia de codificación foránea, en este caso, la secuencia de DNA de codificación para un polipéptido de antigeno, y una molécula de afinidad complementaria. Secuencias adicionales se pueden incluir, por ejemplo, péptidos de señal y/o secuencias de codificación de etiquetas, tales como His-etiqueta, MAT-Etiqueta, FLAG etiqueta, secuencia de reconocimiento para enteroquinasa, señal de secreción de melitina de abejas, beta-galactosidasa, etiqueta de glutationa S-transferasa (GST) corriente arriba del MCS para facilitar la secreción, identificación, inserción apropiada, selección positiva del virus recombinante y/o purificación de la proteina recombinante .
En algunas modalidades, la proteina de fusión puede comprender una secuencia de señal N-terminal como se describe en la presente. En algunas modalidades, la secuencia de señal se une al N-terminal de la molécula de afinidad complementaria como se describe en la presente.
En algunas modalidades, un polipéptido de fusión como se describe en la presente tiene un péptido espaciador, por ejemplo, un espaciador de 14 residuos (GSPGISGGGGGILE) (SEC ID NO: 41) que separan el antigeno de la molécula de afinidad complementaria. La secuencia de codificación de tal espaciador corto se puede construir al recocer un par complementario de cebadores. Uno de habilidad en la técnica puede diseñar y sintetizar oligonucleótidos que codificarán para el espaciador seleccionado. Los péptidos espaciadores generalmente deben tener residuos de aminoácidos no polares, tales como glicina y prolina.
Técnicas estándares conocidas para aquellos de habilidad en el arte se pueden utilizar para introducir mutaciones (para crear sustituciones¦ de aminoácidos en una secuencia de polipéptido de antigeno del polipéptido de fusión descrito en la presente), por ejemplo, en el antigeno en la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de fusión descrito en la presente, que incluye, por ejemplo, la mutagénesis dirigida al sitio y la mutagénesis mediada por PCR. De preferencia, el polipéptido de fusión variante tiene menor que 50 sustituciones de aminoácidos, menor que 40 sustituciones de aminoácidos, menor que 30 sustituciones de aminoácidos, menor que 25 aminoácidos sustituciones de aminoácidos, menor que 20 sustituciones de aminoácidos, menor que 15 sustituciones de aminoácidos, menor que 10 sustituciones de aminoácidos, menor que 5 sustituciones de aminoácidos, menor que 4 sustituciones de aminoácidos, menor que 3 sustituciones de aminoácidos, o menor que 2 amino sustituciones de aminoácidos, inclusive, con relación a los polipéptidos de fusión descritos en la presente.
Ciertas mutaciones de mal sentido silenciosas o neutras también se pueden hacer en la secuencia de codificación del DNA que no cambian la secuencia de aminoácidos codificada o la capacidad para promover el suministro de transmembrana. Estos tipos de mutaciones son útiles para optimizar la utilización de codón, o para mejorar la expresión de proteina recombinante y la producción.
La mutagénesis dirigida al sitio especifica de una secuencia de codificación para el polipéptido de fusión en un vector se puede utilizar para crear mutaciones y sustituciones de aminoácidos especificas. La mutagénesis dirigida al sitio se puede llevar a cabo utilizando, por ejemplo el equipo de mutagénesis dirigida al sitio QUIC CHANGE® de Stratagene de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
En una modalidad, se describen en la presente vectores de expresión que comprenden la secuencia de DNA de codificación para los polipéptidos descritos en la presente para la expresión y la purificación del polipéptido recombinante producido de un sistema de expresión de proteína utilizando células hospederas seleccionadas de, por ejemplo, bacterias, células mamíferas, de insecto, levadura o de plantas. El vector de expresión debe tener los elementos reguladores corriente arriba 5' y corriente abajo 3' necesarios tales como secuencias de promotor, reconocimiento de ribosoma y la caja TATA y la secuencia de terminación de transcripción UTR AAUAAA para la transcripción de gen eficiente y la traducción en su célula hospedera respectiva. El vector de expresión es, de preferencia, un vector que tiene el promotor de transcripción seleccionado de un grupo que consiste del promotor de CMV (citomegalovirus) , promotor de RSV (virus del sarcoma de Rous), promotor de ß-actina, promotor de SV40 (virus 40 de simio) y el promotor de creatina quinasa de músculo, y el terminador de transcripción seleccionado de un grupo que consiste del terminador SV40 poli (A) y BGH; más de preferencia, un vector de expresión que tiene la secuencia de promotor/aumentador temprana de citomegalovirus y la secuencia de guía tripartita de adenovirus/intrón y que contiene el origen de replicación y la secuencia poli (A) de SV40. El vector de expresión puede tener regiones de codificación adicionales, tales como aquellas que codifican, por ejemplo, 6X-histidina, V5 tiorredoxina, glutationa-S-transferasa c-Myc, VSV-G, HSV, FLAG, péptido de enlace de maltosa, péptido que enlaza metal, HA y señales de "secreción" (melitina de Abejas, a-factor, PHO, Bip) , que se pueden incorporar en el polipéptido de fusión expresado, Además, puede haber sitios de digestión de enzimas incorporados después de estas regiones de codificación para facilitar su remoción enzimática si no son necesarios. Estos ácidos nucleicos adicionales son útiles para la detección de la expresión del polipéptido de fusión, para la purificación de proteína mediante la cromatografía de afinidad, solubilidad aumentada de la proteína recombinante en el citoplasma del hospedero y/o para secretar el polipéptido de fusión expresado fuera del medio de cultivo o el esferoplasto de las células de levadura. La expresión del polipéptido de fusión puede ser constitutiva en las células hospederas o se puede inducir, por ejemplo, con sulfato de cobre, azúcares, tal como galactosa, metanol, metilamina, tiamina, tetraciclina, infección con baculovirus e (isopropil-beta-D-tiogalactopiranósido) IPTG, un análogo sintético estable de lactosa.
En otra modalidad, el vector de expresión que comprende un polinucleótido descrito en la presente es un vector viral, tal como adenovirus, virus adeno-asociado (AAV) , retrovirus y vectores de lentivirus, entre otros. Los virus recombinantes proporcionan un sistema versátil para los estudios de expresión de gen y aplicaciones terapéuticas.
En algunas modalidades, los polipéptidos de fusión descritos en la presente se expresan de la infección viral de células mamiferas. Los vectores virales pueden ser, por ejemplo, adenovirus, virus adeno-asociado (AAV) , retrovirus y lentivirus. Un sistema simplificado para generar adenovirus recombinantes se presenta por He y colaboradores., 95 PNAS 2509 (1998) . El gen de interés primero se clona en un vector de lanzadera, por ejemplo pAdTrack-CMV. El plásmido resultante se linealiza al digerir con endonucleasa de restricción Pmel, y subsecuentemente se cotransforma en células BJ5183 de E. coli. con un plásmido de cadena principal adenoviral, por ejemplo pAdEasy-1 del Sistema de Vector Adenoviral ADEASY™ de Stratagene. Los vectores de adenovirus recombinante se seleccionan para la resistencia a canamicina, y la recombinación confirmada mediante el análisis de endonucleasa de restricción. Finalmente, el plásmido recombinante linealizado se transfecta en lineas de células de empacamiento de adenovirus, por ejemplo, células HEK 293 (células de riñon embriónico humano transformadas con El) o 911 (células retínales embriónicas humanas transformadas con El). Fallaux, y colaboradores. 7 Human Gene Ther. 215 (1996). El adenovirus recombinante se genera dentro de las células HEK 293.
En lentivirus recombinante tiene la ventaja del suministro y expresión de polipéptidos de fusión en células mamíferas divisorias y no divisorias. El lentivirus a base de VIH-1 puede efectivamente transducir un intervalo de hospedero más amplio que los sistemas retrovirales a base del Virus de Leucemia Moloney ( MoMLV ) . La preparación del lentivirus recombinante se puede lograr utilizando, por ejemplo los vectores pLenti4/V5-DEST™, pLenti6/V5-DEST™ o pLenti junto con los sistemas de expresión Lentiviral ViraPower™ de Invitrogen, Inc.
Los vectores de virus adeno-asociado recombinante ( rAAV ) son aplicables a una amplio intervalo de células hospederas incluyendo muchas lineas de células o tejidos humanos y no humanos diferentes. Los rAAVs son capaces de transducir un amplio intervalo de tipos de células y la transducción no es dependiente de la división de célula hospedera activa. Altos títulos, > 108 partícula viral/ml, se obtienen fácilmente en el sobrenadante y 1011 -1012 de partícula viral/ml, con concentración adicional. El transgén se integra en el genoma hospedero de modo que la expresión es de largo plazo y estable.
La preparación a gran escala de los vectores AAV se hace mediante una co-transfección de tres plásmidos de una linea de células de empacamiento: vector de AAV que lleva el ácido nucleico de codificación, vector AAV RC que contiene los genes AAV rep y cap, y el plásmido ayudante de adenovirus pDF6, en placas de 50 x 150 mm de células 293 subconfluentes . Las células se recolectan tres días después de la transfección, y los virus se liberan mediante tres ciclos de congelación-descongelación o mediante sonicación.
Los vectores de AAV se pueden purificar mediante dos métodos diferentes dependiendo del serotipo del vector. El vector de AAV2 se purifica mediante el método de purificación en columna con flujo de gravedad de una sola etapa en base a su afinidad para eparina. Auricchio y colaboradores., 12 Human Gene Ther. 71 (2001); Summerford & Samulski, 72 J. Virol. 1438 (1998); Summerford & Samulski, 5 Nat. Med. 587 (1999). Los vectores AAV2/1 y AAV2/5 se purifican actualmente mediante tres gradientes de CsCl secuenciales .
Sin desear que sea limitado por la teoría, cuando las proteínas se expresan por una célula, incluyendo una célula bacteriana, las proteínas se dirigen a una parte particular en la célula o se secretan de la célula. Así, la dirección de proteína o clasificación de proteína es el mecanismo mediante el cual una célula transporta proteínas a las posiciones apropiadas en la célula o fuera de esta. Los objetivos de clasificación pueden ser el espacio interior de una organela, cualquiera de varias membranas interiores, la membrana exterior de la célula, o su exterior por la via de secreción. Este proceso de suministro se lleva a cabo en base a la información contenida en la proteina misma. La clasificación correcta es crucial para la célula; errores pueden conducir a enfermedades.
Con algunas excepciones, las bacterias carecen de organelas enlazadas a membrana como se encuentra en las eucariotas, pero pueden ensamblar proteínas en varios tipos de inclusiones tales como vesículas de gas y gránulos de almacenamiento. También, dependiendo de las especies de bacterias, las bacterias pueden tener una sola membrana de plasma (bacterias Gram-positivas) , o tanto una membrana interior (plasma) como una membrana de pared celular exterior, con un espacio acuoso entre las dos llamado el periplasma (bacterias Gram-negativas) . Las proteínas se pueden secretar en el ambiente, de acuerdo con si o no hay una membrana exterior. El mecanismo básico en la membrana de plasma es similar a la eucariótica. Además, las bacterias pueden dirigir las proteínas dentro o a través de la membrana exterior. Los sistemas para secretar proteínas a través de la membrana exterior bacteriana pueden ser muy complejos y desempeñan funciones claves en la patogénesis. Estos sistemas pueden ser descritos como secreción de tipo I, secreción de tipo II, etc.
En la mayoría de bacterias Gram-positivas, ciertas proteínas se dirigen para la exportación a través de la membrana de plasma y la unión covalente subsecuente a la pared celular bacteriana. Una enzima especializada, sortasa, segmenta la proteína objetivo en un sitio de reconocimiento característico cerca del C-terminal de la proteína, tal como un motivo LPXTG (SEC ID NO: 42) (donde X puede ser cualquier aminoácido) , luego transfiere la proteína en la pared celular. Un sistema análogo a sortasa/LPXTG, que tiene el motivo PEP-CTERM (SEC ID NO: 43) llamado exosortasa/PEP-CTERM, se propone para existir en una amplia gama de bacterias Gram-negativas .
Las proteínas con señales de dirección N-terminal apropiadas se sintetizan en el citoplasma y luego se dirigen a una ruta de transporte de proteínas específica. Durante, o poco tiempo después de su translocación a través de la membrana citoplasmática, la proteína se procesa y se pliega en su forma activa. Luego la proteína translocada es ya sea retenida en el lado periplásmico de la célula o liberada en el ambiente. Puesto que los péptidos de señal que dirigen las proteínas a la membrana son determinantes claves para la especificidad de ruta de transporte, estos péptidos de señal se clasifican de acuerdo a la ruta de transporte al cual se dirigen las proteínas. La clasificación de péptido de señal se basa en el tipo de peptidasa de señal (SPasa) que es responsable para la remoción del péptido de señal. La mayoría de las proteínas exportadas se exportan del citoplasma por la vía de la "ruta secretoria (Sec)" general. La mayoría de factores de virulencia bien conocidos (por ejemplo, exotoxinas de Staphylococcus aureus, antígeno protector de Bacillus anthracis, listeriolisina 0 de Listeria monocytogenes) que se secretan por patógenos Gram-positivos tienen un péptido de señal N-terminal típico que los conduciría a la ruta Sec. Las proteínas que se secretan por la vía de esta ruta se translocalizan a través de la membrana citoplasmática en un estado desplegado. El procesamiento subsecuente y el plegamiento de estas proteínas toma lugar en el ambiente de la pared celular en el lado trans de la membrana. Además del sistema Sec, algunas bacterias Gram-positivas también contienen el sistema Tat que es capaz de traslocalizar las proteínas plegadas a través de la membrana. Las bacterias patogénicas pueden tener ciertos sistemas de exportación de propósitos especiales que están específicamente involucrados en el transporte de solamente unas cuantas proteínas. Por ejemplo, varios agrupaciones de genes se han identificado en micobacterias que codifican proteínas que se secretan en el ambiente por la vía de rutas específicas (ESAT-6) y son importantes para la patogénesis micobacteriana . Los transportadores de cásete de enlace de ATP específicos (ABC) dirigen la exportación y el procesamiento de péptidos antibacterianos pequeños llamados bacteriocinas . Los genes para endolisinas que son responsables para el inicio de la lisis bacteriana frecuentemente se ubican cerca de los genes que codifican para proteínas similares a holina, sugiriendo que . estas holinas son responsables para la exportación de endolisina a la pared celular. Wooldridge, B¾CT . SEGRETED PROTS: SECRETORY MECHS . & ROLE IN PATHOGEN. (Caister Academic Press, 2009) .
En algunas modalidades, la secuencia de señal útil en la presente invención es la secuencia de Señal OmpA, sin embargo, cualquier secuencia de señal comúnmente conocida por las personas de habilidad ordinaria en la técnica que permite el transporte y secreción de agentes antimicrobianos, fuera de la célula infectada con bacteriófago están abarcadas para su uso en la presente invención.
Las secuencias de señal que dirigen la secreción de proteínas de las células bacterianas son bien conocidas en la técnica, por ejemplo como es descrito en la Solicitud Internacional WO 2005/071088. Por ejemplo, se puede utilizar algunos de los ejemplos no limitados del péptido de señal mostrados en la Tabla 5, que se pueden unir al amino-terminal o carboxilo-terminal del péptido antimicrobiano (Amp) o el polipéptido antimicrobiano que es expresado por el bacteriófago diseñado con agente antimicrobiano, por ejemplo, bacteriófago diseñado con AMP. La unión puede ser por la vía de la fusión o composición de quimera con antigeno seleccionado o proteina de fusión de antigeno-molécula de afinidad complementaria que da por resultado la secreción de la bacteria infectada con el bacteriófago diseñado con agente antimicrobiano, por ejemplo bacteriófago diseñado con AMP.
Tabla 5: Péptidos de señal de ejemplo para dirigir la secreción de un antigeno de proteina o de péptido o proteina de fusión de antigeno-molécula de afinidad complementaria de una célula bacteriana Los polipéptidos como son descritos en la presente, por ejemplo, antigenos o proteina de fusión de antigeno-molécula de afinidad complementaria se pueden expresar y purificar mediante una variedad de métodos conocidos para un experto en la técnica, por ejemplo, los polipéptidos de fusión descritos en la presente se puede purificar de cualquier sistema de expresión adecuado. Los polipéptidos de fusión se pueden purificar a la pureza sustancial mediante técnicas estándares, incluyendo la precipitación selectiva con tales sustancias como sulfato de amonio, cromatografía en columna, métodos de inmunopurificación y otros; que son bien conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, Scopes, PROTEIN PURIFICATION: Principies & Practice (1982), Patente de los Estados Unidos No. 4,673,641.
Un número de procedimientos se puede emplear cuando se purifican proteínas recombinantes . Por ejemplo, las proteínas que tienen propiedades de adhesión molecular establecidas se pueden fusionar reversiblemente a la proteína de elección. Con el ligando apropiado, la proteína se puede adsorber selectivamente a una columna de purificación y luego liberar de la columna en una forma relativamente pura. La proteína fusionada luego se remueve mediante actividad enzimática. Finalmente, la proteína de elección se puede purificar utilizando columnas de afinidad o inmunoafinidad.
Después de que la proteína se expresa en las células hospederas, las células hospederas se pueden lisar para liberar la proteína expresada para purificación. Métodos para lisar las diferentes células hospederas se presentan en "Sample Preparation-Tools for Protein Research" EMD Bioscience y en el Current Protocols in Protein Sciences (CPPS) . Un método de purificación de ejemplo es la cromatografía por afinidad tal como la cromatografía por afinidad de ión-metálico utilizando resinas de afinidad aníguel, cobalto o zinc para polipéptidos de fusión etiquetados con histidina. Métodos para purificar proteínas recombinantes etiquetadas con histidina son descritos por Clontech utilizando su resina de cobalto TALON® y por Novagen® en su manual de sistema pET, 10th edición. Otra estrategia de purificación preferida es la cromatografía de inmuno-afinidad, por ejemplo, la resina conjugada con anticuerpo anti-myc se puede utilizar para purificar por afinidad los polipéptidos de fusión etiquetados con myc. Cuando están presentes secuencias de reconocimiento de proteasas apropiadas, los polipéptidos de fusión se pueden segmentar de la histidina o etiqueta myc, liberando el polipéptido de fusión de la resina de afinidad mientras que las etiquetas de histidina y las etiquetas myc se dejan unidas a la resina de afinidad.
Las técnicas de separación de proteína estándares para purificar proteínas recombinantes y que ocurren naturalmente son bien conocidas en el arte, por ejemplo, el fraccionamiento por solubilidad, filtración de gel de exclusión de tamaño y varias cromatografías en columna.
Fraccionamiento por solubilidad: Frecuentemente como una etapa inicial, particularmente si la mezcla de proteínas es compleja, un fraccionamiento de sal inicial puede separar muchas de las proteínas de la célula hospedera indeseada (o proteínas derivadas del medios de cultivo celular) de la proteína de interés. La sal preferida es sulfato de amonio. El sulfato de amonio precipita las proteínas al reducir efectivamente la cantidad de agua en la mezcla de proteínas. Las proteínas luego precipitan en la base de su solubilidad. Entre más hidrofóbica es una proteína, más probable es que precipite en concentraciones de sulfato de amonio menores. Un protocolo típico incluye adicionar el sulfato de amonio saturado a una solución de proteína" de modo que la concentración de sulfato de amonio resultante está entre 20-30%. Esta concentración precipitará lo más hidrofóbico de las proteínas. El precipitado luego se desecha (a menos que la proteína de interés sea hidrofóbica) y sulfato de amonio se adiciona al sobrenadante a una concentración conocida para precipitar la proteína de interés. El precipitado luego se solubiliza en solución amortiguadora y la sal en exceso se remueve si es necesario, ya sea a través de diálisis o diafiltración . Otros métodos que dependen de la solubilidad de las proteínas, tal como precipitación con etanol frío, son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica y se pueden utilizar para fraccionar mezclas de proteínas complejas.
Filtración de exclusión de tamaño: El peso molecular de la proteina de elección se puede utilizar para aislarla de proteínas de mayor o menor tamaño utilizando la ultrafiltración a través de membranas de diferentes tamaños de poro (por ejemplo, membranas AMICON® o MILLIPORE®) . Como un primera etapa, la mezcla de proteína se ultra filtra a través de una membrana con un tamaño de poro que tiene un corte de peso molecular inferior que el peso molecular de la proteina de interés. El material retenido de la ultrafiltración luego se ultrafiltra contra una membrana con un corte molecular mayor que el peso molecular de la proteina de interés. La proteína recombinante pasará a través de la membrana en el filtrado. El filtrado luego se puede cromatografiar como es descrito enseguida.
Cromatografía en columna: La proteína de elección también se puede separar de otras proteínas en la base de su tamaño, carga de superficie neta, hidrofobicidad y afinidad para ligandos. Además, los anticuerpos criados contra proteínas recombinantes o que ocurren naturalmente se puede conjugar a matrices de columna y las proteínas inmunopurificadas . Todos estos métodos son bien conocidos en la técnica. Será evidente para uno de habilidad que las técnicas cromatográficas se pueden realizar en cualquier escala y utilizando equipo de muchos diferentes fabricantes (por ejemplo, Pharmacia Biotech) . Por ejemplo, un polipéptido de antigeno se puede purificar utilizando una columna de afinidad de heptámero PA63. Singh y colaboradores., 269, J. Biol. Chem. 29039 (1994).
En algunas modalidades, una combinación de etapas de purificación que comprenden, por ejemplo: (a) cromatografía de intercambio iónico (b) cromatografía con hidroxiapatita, (c) cromatografía de interacción hidrofóbica, y (d) cromatografía de exclusión de tamaño se pueden utilizar para purificar los polipéptidos de fusión descritos en la presente .
Los sistemas de expresión libres de células también se contemplan. Los sistemas de expresión libres de células ofrecen varias ventajas sobre los métodos de expresión a base de células tradicionales, incluyendo la modificación fácil de las condiciones de reacción para favorecer el plegamiento de proteínas, sensibilidad disminuida a la toxicidad del producto y adaptabilidad para estrategias de alto rendimiento tal como la clasificación de expresión rápida o la producción de proteínas de gran cantidad debido a los volúmenes de reacción reducidos y el tiempo del proceso. El sistema de expresión libre de células puede utilizar plásmido o DNA lineal. Por otra parte, los mejoramientos en la eficiencia de traducción han dado por resultado rendimientos que tienen un miligramo de proteína por mililitro de mezcla de reacción.
Los sistemas de expresión libres de células comercialmente disponibles incluyen los Sistemas de lisado de reticulocito acoplado a TNT (Promega) que utiliza el sistema in vitro a base de reticulocito de conejo.
Formulaciones de una composición inmune y métodos de uso Las modalidades especificas de la presente invención proporcionan el uso de las composiciones inmunogénicas como se describen en la presente para inducir una respuesta inmune en un animal. Más específicamente, las composiciones inducen una inmunidad tanto humoral como celular, y en muchos casos inmunidad mucosal. Las modalidades de la presente invención proporcionan por lo menos protección parcial de o mejoramiento parcial después de la infección mediante, en particular, neumococos. Los neumococos causan un número de enfermedades, tales como meningitis, neumonía, bacteriemia y otitis media. Casi un millón de niños mueren de enfermedades neumocócicas mundialmente en cada año. S. pneumoniae se ha estudiado extensivamente, y por lo menos algunos de los genomas secuenciados . Ver, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos No. 7,141,418. Aunque los anticuerpos a los polisacáridos capsulares, que definen los serotipos conocidos, confieren protección específica de serotipo, otros mecanismos protectores de inmunidad se han descrito. Ver Malley y colaboradores., 88 J. Mol. Med. 135 (2010). Estos mecanismos protectores incluyen, pero no están limitados a, a anticuerpos a antigenos no capsulares y respuestas de células T a constituyentes neumocócicos . La aplicación de la vacuna conjugada de proteína-polisacárido, PCV7, ha reducido las enfermedades significativamente. Black y colaboradores, 24 (S2) Vaccine 79 (2006),. Hansen y colaboradores, 25 Pediatr. Infect. Dis. J. 779 (2006)). Todavía, estudios recientes han mostrado que la falta de otros serotipos en PCV7 ha dado por resultado serotipos neumocócicos de reemplazo emergentes. Pichichero & Casey, 26(S10) Pediatr. Infect. Dis. J. S12 (2007).
Ciertos antígenos neumocócicos comunes a todos los serotipos de la especie se han mostrado que tienen potencial inmunoprotector a pesar de la encapsulacion, por ejemplo las proteínas de superficie PspA, PspC, PsaA y la neumolisina de citotoxina o imitantes neumolisoides (Basset y colaboradores., 75 Infect. Immun. 5460 (2007) ; Briles y colaboradores, 18 Vaccine 1707 (2000)); el uso de la genómicas y librerías mutacionales ha identificado varias docenas de proteínas comunes de especies adicionales (Hava & Camilla, 45 Mol Microbiol. 1389 (2002.)/ Wizemann y colaboradores, 60 Infect. Immun 1593 (2001)). La inmunidad se ha inducido mediante antígenos individuales en modelos animales (Alexander y colaboradores, 62 Infect. Immun. 5683 (1994); Balachandran y colaboradores, 70 Infect. Immun. 2526 (2002); Chung y colaboradores, 170 J. Immunol. 1958 (2003); Glover y colaboradores, 76 Infect. Immun. 2767 (2008). Wu y colaboradores, 175 J. Infect. Dis. 839 (1997)), pero ninguna vacuna en base a un antigeno común se ha aprobado para el uso humano hasta la fecha.
En una modalidad, se proporciona en la presente un método para vacunar a un mamífero, que comprende administrar la composición inmunogénica que comprende por lo menos uno, o múltiples antígenos unidos a por lo menos un tipo de estructura de polímero, por ejemplo, un polisacárido o polímero de carbohidrato para el uso en la inducción de una respuesta inmune al uno o más antígenos unidos al polímero cuando se administra a un sujeto. En algunas modalidades, la respuesta inmune es una respuesta inmune humoral y/o celular.
Por consiguiente, un aspecto de la presente invención se relaciona a métodos para inducir una respuesta inmune en un sujeto, que comprenden administrar al sujeto una composición inmunogénica que comprende por lo menos un tipo del polímero, por ejemplo, un polisacárido, por lo menos un antígeno, y por lo menos un par de moléculas de afinidad complementaria que comprenden (i) una primera molécula de afinidad que se asocia con el polímero, por ejemplo, un polisacárido y (ii) una molécula de afinidad complementaria que se asocia con el antígeno, para unir el antígeno al polímero, por ejemplo, un polisacárido, (por ejemplo, la primera molécula de afinidad se asocia con la molécula de afinidad complementaria para enlazar el antigeno al polímero, por ejemplo, polisacárido) .
Por consiguiente, un aspecto de la presente invención se relaciona a métodos para inducir una inmunidad humoral y/o celular a múltiples antígenos al mismo tiempo, por ejemplo donde la composición inmunogénica administrada al sujeto comprende un polímero que comprende por lo menos 1, o por lo menos 2, o mayor, por ejemplo, una pluralidad de los mismos o diferentes antígenos.
Un aspecto de la presente invención se relaciona a un método de inmunización o vacunación de un sujeto, por ejemplo, un ave o un mamífero, por ejemplo, un humano contra un patógeno que comprende administrar una composición inmune como se describe en la presente que comprende por lo menos un antígeno derivado de uno o más patógenos. En algunas modalidades, un sujeto se puede inmunizar contra por lo menos 1, o por lo menos 2, o por lo menos 2, o por lo menos 3, o por lo menos 5, o por lo menos 10, o por lo menos 15, o por lo menos aproximadamente 20, o por lo menos 50, o por lo por lo menos aproximadamente 100, o más de 100 patógenos diferentes al mismo tiempo, donde el polímero de la composición inmunogénica como los diferentes antígenos correspondientes se unen.
En algunas modalidades, a un sujeto se puede administrar varias composiciones inmunogénicas diferentes, como se describen en la presente, por ejemplo, a un sujeto se puede administrar una composición que comprende un polímero con un antígeno, o una pluralidad de antígenos, por ejemplo antígenos A, B, C, y D, etc., y también administrar una composición que comprende un polímero que comprende un antígeno diferente, o un conjunto diferente de antígenos, por ejemplo antígenos W, X, Y, y Z, etc. Alternativamente, a un sujeto se puede administrar una composición que comprende un polímero A con un antígeno, o una pluralidad de antígenos, por ejemplo antígenos A, B, C, y D, etc., y también administrar una composición que comprende un polímero B que comprende los mismos, por ejemplo, antigenos A, B, C, y D, etc., o un diferente conjunto de antígenos. Se contempla que la presente invención proporciona un método para la inmunización de un sujeto con tantos antígenos como sea deseado, por ejemplo, con una variedad de diferentes complejos inmunogénicos como son descritos en la presente, para permitir la inmunización con tantos como 100 o más antígenos .
En una modalidad, las composiciones inmunogénicas como se describen en la presente comprenden un portador farmacéuticamente aceptable. En otra modalidad, la composición inmunogénica descrita en la presente se formula para la administración a un ave, mamífero o humano, como se encuentra o en una vacuna. Las formulaciones adecuadas se pueden encontrar en, por ejemplo, Remington' s Pharmaceutical Sciences (2006) , o Introducción a Pharmaceutical Dosage Forms (4th ed., Lea & Febiger, Philadelphia, 1985).
En una modalidad, las composiciones inmunogénicas como se describen en la presente comprenden portadores farmacéuticamente aceptables que son inherentemente no tóxicos y no terapéuticos. Ejemplos de tales portadores incluyen intercambiadores iónicos, alúmina, estearato de aluminio, lecitina, proteínas del suero, tal como albúmina de suero humano, sustancias amortiguadoras, tales como fosfatos, glicina, ácido sórbico, sorbato de potasio, mezclas de glicéridos parciales de ácidos grasos vegetales saturados, agua, sales, o electrolitos tales como sulfato de protamina, hidrógeno fosfato de disódico, hidrógeno fosfato de potasio, cloruro de sodio, sales de zinc, sílice coloidal, trisilicato de magnesio, polivinilpirrolidona, sustancias a base de celulosa y polietilenglicol . Para todas las administraciones, se utilizan adecuadamente formas de depósito convencionales. Tales formas incluyen, por ejemplo, microcápsulas , nanocápsulas , liposomas, emplastos, formas de inhalación, rocíos para la nariz, tabletas sublinguales y preparaciones de liberación sostenida. Para ejemplos de composiciones de liberación sostenida, ver las Patentes de los Estados Unidos No. 3,773,919, No. 3,887,699, EP 58,481A, EP 158,277A, Patente Canadiense No. 1176565; Sidman y colaboradores, 22 Biopolimeros 547 (1983); Langer y colaboradores, 12 Chem. Tech. 98 (1982) . Las proteínas usualmente serán formuladas a una concentración de aproximadamente 0.1 mg/ml a 100 mg/ml por aplicación por paciente.
En una modalidad, se pueden adicionar otros ingredientes a las formulaciones de vacunas, incluyendo antioxidantes, por ejemplo, ácido ascórbico; polipéptidos de bajo peso molecular (menor que aproximadamente diez residuos) , por ejemplo, poliarginina o tripéptidos; proteínas, tal como albúmina de suero, gelatina o inmunoglobulinas, polímeros hidrofílicos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, ácido glutámico, ácido aspártico, o arginina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos que incluyen celulosa o sus derivados, glucosa, mañosa, o dextrinas; agentes quelantes tal como EDTA; y alcoholes de azúcar tales como manitol o sorbitol .
En algunas modalidades, las presentes composiciones de inmunógeno APS se administran con por lo menos un adyuvante. Los adyuvantes son un grupo heterogéneo de sustancias que aumentan la respuesta inmunológica contra un antígeno que se administra simultáneamente. En algunos casos, los adyuvantes mejoran la respuesta inmune de modo que es necesaria menos vacuna. Los adyuvantes sirven para llevar el antígeno - la sustancia que estimula la respuesta inmune protectora específica - en contacto con el sistema inmune e influencian el tipo de inmunidad producida, así como la calidad de la respuesta inmune (magnitud o duración) . Los adyuvantes también pueden disminuir la toxicidad de ciertos antígenos; y proporcionar solubilidad a algunos componentes de la vacuna. Casi todos los adyuvantes utilizados hoy en día para el aumento de la respuesta inmune contra antígenos son partículas o forman partículas junto con el antígeno. En el libro VACCINE DISIGN - SUBUNIT & ADJUVANT APPROACH (Powell & Newman, eds, Plenum Press, 1995) , muchos adyuvantes conocidos son descritos tanto considerando su actividad inmunologica como considerando sus características químicas. El tipo de adyuvantes que no forman partículas son un grupo de sustancias que actúan como sustancias de señal inmunologica y que bajo condiciones normales consisten de las sustancias que se forman por el sistema inmune como una consecuencia de la activación inmunologica después de la administración de los sistemas adyuvantes particulados.
Los adyuvantes para composiciones inmunogénicas y vacunas son bien conocidos en la técnica. Ejemplos incluyen, pero no están limitados a, monoglicéridos y ácidos grasos (por ejemplo, una mezcla de mono-oleína, ácido oleico, y aceite de soja), sales minerales, por ejemplo, hidróxido de aluminio y geles de fosfato de aluminio o de calcio; emulsiones aceitosas y formulaciones a base de surfactante, por ejemplo, MF59 (emulsión de aceite en agua estabilizada con detergente microfluidilizado) , QS21 (saponina purificada), AS02 [SBAS2] (emulsión de aceite-en-agua + MPL + QS-21), PL-SE, Montanide ISA-51 e ISA-720 (emulsión de agua-en-aceite estabilizada) ; adyuvantes particulados, por ejemplo, virosomas (vehículos liposomales unilaminares que incorporan hemaglutinina de influenza) sal AS04 ( [SBAS4 ] Al con MPL), ISCOMS (complejo estructurado de saponinas y lípidos) , polilactida-co-glicolida (PLG) ; derivados microbianos (naturales y sintéticos) , por ejemplo, monofosforil lipido A (MPL) , Detox (MPL + esqueleto de pared celular M.phlei), AGP [RC-529] (monosacárido acilado sintético) , Detox - PC_DC Chol (inmunoestimuladores lipoides capaces de auto-organizarse en liposomas) , OM-174 (derivado de lipido A) , motivos de CpG (oligonucleotidos sintéticos que contienen motivos de CpG inmunoestimuladores) u otras estructuras de DNA, LT y CT modificadas (toxinas bacterianas genéticamente modificadas que proporcionan efectos adyuvantes no tóxicos) ; inmunomoduladores humanos endógenos, por ejemplo, hGM-CSF o hIL-12 (citoquinas que se · pueden administrar ya sea como proteína o plásmido codificado) , Immudaptina (arreglo en tándem de C3d) , MoGM-CSF, TiterMax-G, CRL-1005, GERBU, TERamide, PSC97B, Adjumer, PG-026, GSK-I, GcMAF, B-aletina, MPC-026, Adjuvax, CpG ODN, Betafectina, alumbre y MF59 y vehículos inertes, tales como partículas de oro. Adyuvantes adicionales se conocen en la técnica, ver, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos. No. 6,890,540; la Publicación de Patente de los Estados Unidos No. 2005;0244420; PCT/SE97/01003.
En algunas modalidades, un adyuvante es un material particulado y puede tener una característica de ser lentamente biodegradable. Se debe tener cuidado de asegurar que el adyuvante no forme metabolitos tóxicos. De preferencia, en algunas modalidades, tales adyuvantes pueden ser matrices utilizadas que son principalmente sustancias que se originan de un cuerpo. Estos incluyen polímeros de ácido láctico, poli-aminoácidos (proteínas) , carbohidratos, lípidos y polímeros biocompatibles con baja toxicidad. Las combinaciones de estos grupos de sustancias que se originan de un cuerpo o combinaciones de sustancias que se originan de un cuerpo y polímeros biocompatibles también pueden ser utilizadas. Los lípidos son las sustancias preferidas puesto que exhiben estructuras que las hacen biodegradables así como el hecho de que son un elemento crítico en todas las membranas biológicas.
En una modalidad, las composiciones inmunogénicas como se describen en la presente para la administración deben ser estériles para la administración en un sujeto. La esterilidad fácilmente se realiza mediante filtración a través de membranas de filtración estériles (por ejemplo, membranas de 0.2 micrómetros) o mediante la irradiación gamma.
En algunas modalidades, las composiciones inmunogénicas descritas en la presente además comprenden excipientes farmacéuticos que incluyen, pero no limitados a aceites biocompatibles, soluciones salinas fisiológicas, conservadores, carbohidrato, proteina, aminoácido, agentes de control de presión osmótica, gases portadores, agentes de control del pH, solventes orgánicos, agentes hidrofóbicos, inhibidores de enzimas, polímeros absorbentes de agua, surfactantes, promotores de absorción y agentes anti-oxidantes . Ejemplos representativos de carbohidratos incluyen azúcares solubles, tales como hidropropil celulosa, carboximetil celulosa, carboxil celulosa de sodio, ácido hialurónico, quitosan, alginato, glucosa, xilosa, galactosa, fructosa, maltosa, sacarosa, dextrano, sulfato de condroitina, etc. Ejemplos representativos de proteínas incluir albúmina, gelatina, etc. Ejemplos representativos de aminoácidos incluyen glicina, alanina, ácido glutámico, arginina, lisina y sus sales. Tales excipientes farmacéuticos son bien conocidos en la técnica.
En algunas modalidades, la composición MAPS inmunogénica se administra en combinación con otros ingredientes terapéuticos que incluyen, por ejemplo, ?-interferona, citoquinas, agentes quimioterapéuticos o agentes anti-inflamatorio o anti-virales . En algunas modalidades, la composición inmunogénica como se describe en la presente se puede administrar con una o más moléculas co-estimulatorias y/o adyuvantes como se describe en la presente.
En algunas modalidades, la composición inmunogénica se administra en una forma pura o sustancialmente pura, pero se puede administrar como una composición, formulación o preparación farmacéutica. Tal formulación comprende MAPAS descritos en la presente junto con uno o más portadores farmacéuticamente aceptables y opcionalmente otros ingredientes terapéuticos. Otros ingredientes terapéuticos incluyen compuestos que aumentan la presentación de antigenos, por ejemplo, gamma interferona, citoquinas, agentes quimioterapéuticos o agentes anti-inflamatorios . Las formulaciones se pueden presentar convenientemente en forma de dosificación unitaria y se pueden preparar por métodos bien conocidos en la técnica farmacéutica. Por ejemplo, Plotkin y Mortimer, in VACCINES (2nd ed., WB Saunders Co. 1994) describe la vacunación de animales o humanos para inducir una respuesta inmune especifica para patógenos particulares, asi como métodos para preparar antígeno, determinar una dosis adecuada de antigeno y ensayar para la inducción de una respuesta inmune.
Las formulaciones adecuadas para administración intravenosa, intramuscular, intranasal, oral, sublingual, vaginal, rectal, subcutánea o intraperitoneal convenientemente comprenden soluciones acuosas estériles del ingrediente activo con soluciones que de preferencia isotónicas con la sangre del receptor. Tales formulaciones se pueden preparar convenientemente al disolver el ingrediente activo sólido en agua que contiene sustancias fisiológicamente compatibles tal como cloruro de sodio (por ejemplo, 0 . 1M-2 . 0 M) , glicina y los similares, y que tienen un pH amortiguado compatible con las condiciones fisiológicas para producir una solución acuosa, y volver a la solución estéril. Estos se pueden presentes en recipientes unitarios o de dosis múltiples, por ejemplo, ampolletas selladas o frasquitos.
Las suspensiones liposomales también se pueden utilizar como portadores farmacéuticamente aceptables. Estos se pueden preparar de acuerdo con métodos conocidos para aquellos de habilidad en la técnica, por ejemplo, como es descrito en la Patente de Estados Unidos No. 4 , 522 , 811 .
Las formulaciones para un suministro intranasal se describen en las Patentes de los Estados Unidos No. 5 , 427 , 782 ; No. 5 , 843 , 451 , No. 6 , 398 , 774 .
Las formulaciones de las composiciones inmunogénicas pueden incorporar un estabilizador. Los estabilizadores ilustrativos son polietilenglicol, proteínas, sacáridos, aminoácidos, ácidos inorgánicos y ácidos orgánicos que se pueden utilizar por su propia cuenta o como mezclas. Dos o más estabilizadores se pueden utilizar en soluciones acuosas en la concentración apropiada y/o pH. La presión osmótica específica en tal solución acuosa está generalmente en el intervalo de 0.1-3.0 osmosis, de preferencia en el intervalo de 0.80 y 1.2. El pH de la solución acuosa se ajusta para estar dentro del intervalo de pH 5.0-9.0, de preferencia dentro del intervalo de pH 6-8.
Cuando se desean preparaciones orales, las composiciones inmunogénicas se pueden combinar con portadores típicos, tales como lactosa, sacarosa, almidón, talco, estearato de magnesio, celulosa cristalina, metilcelulosa, carboximetilcelulosa, glicerina, alginato de sodio o goma arábiga entre otros.
En algunas modalidades, las composiciones inmunogénicas, como se describe en la presente se pueden administrar intravenosamente, intranasal, intramuscularmente, subcutáneamente, intraperitonealmente, sublingualmente, vaginalmente, rectalmente u oralmente. En algunas modalidades, la ruta de administración es oral, intranasal, subcutánea o intramuscular. En algunas modalidades, la ruta de administración es administración intranasal.
La vacunación se puede conducir por métodos convencionales. Por ejemplo, una composición inmunogénicas se puede utilizar en un diluyente adecuado tal como solución salina o agua, o adyuvantes completos o incompletos. La composición inmunogénica se puede administrar mediante cualquier ruta apropiada para inducir una respuesta inmune. En la composición inmunogénica se puede administrar una vez o en intervalos periódicos hasta que se induce una respuesta inmune. Las respuestas inmunes se pueden detectar mediante una variedad de métodos conocidos para aquellos expertos en la técnica, que incluyen pero no limitados a, producción de anticuerpos, ensayo de citotoxicidad, ensayo, de proliferación y ensayos de liberación de citoquina. Por ejemplo, muestras de sangre se pueden retirar del mamífero inmunizado, y analizar para la presencia de anticuerpos contra los antígenos de la composición inmunogénica mediante ELISA (ver de Boer y colaboradores, 115 Arch. Virol. 147 (1990) y el título de estos anticuerpos se puede determinar por métodos conocidos en la técnica.
La dosis precisa que es empleada en la formulación también dependerá de la ruta de administración y debe ser decidida de acuerdo con el buen criterio del profesional y las circunstancias de cada paciente. Por ejemplo, un intervalo de 25 pg-900 g de proteína total se administrar mensualmente durante tres meses.
Finalmente, el médico asistente decidirá la cantidad de composición inmunogénica o composición de vacuna a administrar a los individuos particulares. Como con todas las composiciones inmunogénicas o vacunas, las cantidades inmunológicamente efectivas de los inmunógenos se deben determinar empíricamente. Los factores que son considerados incluyen la inmunogenicidad, sí o no el inmunógeno será formado en complejo con o covalentemente unido a un adyuvante o proteína portadora u otro portador, las rutas de administración y el número de dosis inmunizantes que son administradas. Tales factores son conocidos en la técnica de vacunas y están bien dentro de la habilidad de los inmunólogos hacer tales determinaciones sin experimentación indebida .
En una modalidad, una composición inmunogénica o composición de vacuna como es descrito en la presente, cuando se administra a ratones, puede provocar una respuesta inmune que previene un síntoma de enfermedad en por lo menos 20% de los animales estimulados con 5 LD50 de la composición inmunogénica que comprende antígenos a la cual se previene el síntoma de enfermedad. Los métodos de vacunación y estimulación de un animal inmunizado son conocidos para un experto en la técnica. Por ejemplo, una alícuota de 10 g de una composición inmunogénica o composición de vacuna como se describe en la presente se puede preparar en 100 µ? de PBS y/o con la adición de adyuvante de Freund incompleto e inyecta intramuscular por ratón por vacunación.
Alternativamente, se pueden utilizar inyecciones parenterales, intraperitoneales y en la planta de la pata. Los volúmenes de inyecciones en la planta de la pata se reducen a 50 µ?. Los ratones se pueden inmunizar con una composición inmunogénica o composición de vacuna como se describe en la presente en tres ocasiones separadas con varios días, por ejemplo, intervalo de 14 días entre estos.
La eficacia de la vacunación se puede probar mediante la estimulación con el patógeno. Siete días después de la última dosis de una composición inmunogénica, los ratones inmunizados se estimulan intranasalmente con un organismo patogénico del cual se derivó el antigeno. Los ratones anestesiados con éter (10 g a 12 g) se pueden infectar intranasalmente con 50 µ? de fluido alantoico diluido con PBS que contiene 5 LD50 del organismo patogénico. La protección se puede medir al inspeccionar la supervivencia del animal y el peso corporal, que se estima por todo un periodo de observación de 21 días. Los ratones severamente afectados se cometen a eutanasia. Uno LD50 de A/Mallard/Pennsylvania/10218/84 es igual a 100-1000 el Ensayo de Dosis Infecciosa de Cultivo de Tejido 50 (TCID50) .
En otras modalidades, los ratones inmunizados se pueden estimular con una variedad de diferentes organismos patogénicos, por ejemplo, diferentes organismos patogénicos de los cuales se derivan cada uno de los antigenos unidos al polímero. Por ejemplo, de una composición inmunogénica que comprende cinco diferentes antígenos unidos al polímero, por ejemplo, polisacáridos, donde cada antígeno se deriva de cinco diferentes organismos patogénicos, los ratones inmunizados se pueden estimular con cada uno de los cinco organismos patogénicos diferentes, ya sea secuencialmente (en cualquier orden) o concurrentemente. Un experto en la técnica sería capaz de determinar la LD50 para cada organismo patogénico utilizado para estimular los ratones inmunizados mediante métodos conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, LaBarre & Lowy, 96 J. Virol. eths. 107 (2001); Golub, 59J. Immunol. 7 (1948) .
Equipos La presente invención también proporciona equipos para la producir de una composición inmunogénica como se describe en la presente que es útil para un investigador para ajustar una composición inmunogénica con sus antígenos preferidos, por ejemplo, para propósitos de investigación para estimar el efecto de un antígeno, o una combinación de antígenos en la respuesta inmune. Tales equipos se pueden preparar a partir de materiales fácilmente disponibles y reactivos. Por ejemplo, tales equipos pueden comprender cualquiera de uno o más de los siguientes materiales: un recipiente que comprende un polímero, por ejemplo, un polisacárido, reticulado con una pluralidad de primeras moléculas de afinidad; y un recipiente que comprende una molécula de afinidad complementaria que se asocia con la primera molécula de afinidad, en donde la molécula de afinidad complementaria se asocia con un antígeno.
En otra modalidad, el equipo puede comprender un recipiente que comprende un polímero, por ejemplo, un polisacárido, un recipiente que comprende una pluralidad de primeras moléculas de afinidad, y un recipiente que comprende un reactivo de reticulación para reticular las primeras moléculas de afinidad al polímero.
En algunas modalidades, el equipo además comprende un medio para unir la molécula de afinidad complementaria al antígeno, donde el medio puede ser un reactivo de reticulación o mediante alguna proteína de fusión intermediaria. En algunas modalidades, el equipo puede comprender por lo menos un factor de co-estimulación que puede ser adicionado al polímero. En algunas modalidades, el equipo comprende un reactivo de reticulación, por ejemplo, pero no limitado a, CDAP (tetrafluoroborato de l-ciano-4-dimetilaminopiridinio) , EDC (clorhidrato de l-etil-3-[3-dimetilaminopropil] carbodiimida) , cianoborohidruro de sodio, bromuro de cianógeno; bicarbonato de amonio/ácido yodoacético para enlazar en co-factor al polímero.
Una variedad de equipos y componentes se pueden preparar para el uso en los métodos descritos en la presente, dependiendo del uso propuesto del equipo, el antigeno objetivo particular y las necesidades del usuario.
La invención además se puede describir con cualquiera de las modalidades en los siguientes párrafos numerados: 1. Una proteina que enlaza biotina soluble, que comprende una secuencia de aminoácidos FDASNFKDFSSIASASSSWQNQSGSTMIIQVDSFGNVSGQYVNRAQGTGCQNSPYPLTGR VNGTFIAFSVGWNNSTENCNSATGWTGYAQVNGNNTEIVTS NLAYEGGSGPAIEQGQ DTFQYVPTTENKSLLKD (SEC ID NO: 1) y cualquiera de los derivados funcionales de la misma. 2. La proteina que enlaza biotina del párrafo 1, en donde la proteina que enlaza biotina se produce en forma soluble a un nivel de por lo menos 10 mg/1 de medio de cultivo en E. coli. 3. La proteina que enlaza biotina de cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en donde la proteina que enlaza biotina es un dimero. 4. La proteina que enlaza biotina de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde la proteina que enlaza biotina comprende una secuencia de señal bacteriana en el N-terminal . 5. La proteina que enlaza biotina del párrafo 4, en donde la secuencia de señal bacteriana es MKKIWLALAGLVLAFSASA (SEC ID NO: 2) . 6. La proteina que enlaza biotina de cualquiera de los párrafos 4 o 5, en donde la secuencia se señal se enlaza a la proteina que enlaza biotina mediante un enlazador de péptido . 7. La proteína que enlaza biotina del párrafo 6, en donde el enlazador de péptido comprende la secuencia de aminoácidos AQDP (SEC ID NO: 8) o VSDP (SEC ID NO: 9). 8. La proteína que enlaza biotina de cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde la proteína que enlaza biotina comprende una etiqueta de purificación en el C-terminal. 9. La proteína que enlaza biotina del párrafo 8, en donde la etiqueta de purificación se selecciona del grupo que consiste de etiqueta de histidina, una etiqueta de c-my, una etiqueta de Halo, una etiqueta de Flag, y cualquiera de las combinaciones de las mismos. 10. La proteína que enlaza biotina del párrafo 9, en donde la etiqueta de histidina comprende la secuencia de aminoácidos HHHHHH (SEC ID NO: 10) . 11. La proteína que enlaza biotina de cualquiera de las reivindicaciones 8-10, en donde la etiqueta de purificación se enlaza a la proteína que enlaza biotina por la vía de un enlazador de péptido. 12. La proteína que enlaza biotina del párrafo 11, en donde el enlazador de péptido comprende la secuencia de aminoácidos VDKLAAALE (SEC ID NO: 11) o GGGGSSSVDKLAAALE (SEC ID NO: 12) . 13. La proteina que enlaza biotina de cualquiera de los párrafos 1-12, en donde la proteína que enlaza biotina comprende la secuencia de aminoácidos MKKIWLALAGLVLAFSASAAQDPFDASNF DFSSIASASSSWQNQSGSTMIIQVDSFGNV SGQYVNRAQGTGCQNSPYPLTGRVNGTFIAFSVG NNSTENCNSATGWTGYAQVNGN NTEIVTS NLAYEGGSGPAIEQGQDTFQYVPTTENKSLLKDGGGGSSSVDKLAAALEHH HHHH (SEC ID NO: 15) . 14. Una composición que comprende una proteína que enlaza biotina de cualquiera de las reivindicaciones 1-13. 15. Una proteína de fusión que comprende una proteína que enlaza biotina y una proteína o un péptido. 16. La proteína de fusión del párrafo 15, en donde la proteína o péptido se fusiona a la proteína que enlaza biotina mediante un enlazador de péptido. 17. La proteína de fusión del párrafo 15, en donde el enlazador de péptido comprende la secuencia de aminoácidos GGGGSSS { SEC ID NO: 22). 18. La proteína de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 15-17, caracterizado porque la proteína o péptido es un antígeno seleccionado del grupo que consiste de: antígenos neumocócicos, antígenos de tuberculosis, antígenos de ántrax, antígenos de HIV, antígenos de gripe estacional o epidémica, antígenos de influenza, antígenos de Pertussis, antigenos de Staphylococcus aureus, antígenos meningocócicos, antígenos de Haemophilus, antígenos de HPV o combinaciones de los mismos. 19. La proteína de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 15-18, en donde el antígeno es una variante no-hemolítica de alfa-hemolisina de S. aureus. 20. La proteina de fusión del párrafo 19, en donde la variante no-hemolítica de alfa-hemolisina de S. aureus comprende una mutación en el residuo de aminoácido 205, 213 o 209-211 de alfa-hemolisina de S. aureus de tupo silvestre. 21. La proteína de fusión del párrafo 19, en donde la variante no hemolítica de alfa-hemolisina de S. aureus comprende una de las siguientes mutaciones en la alfa-hemolisina de S. aureus de tipo silvestre: (i) residuo 205 W a A; (ii) residuo 213 W a A, o (iii) residuos 209-211 DRD a AAA. 22. La proteína de fusión del párrafo 19, en donde la variante no hemolítica de alfa-hemolisina de S. aureus comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de: (i) W205a ADSDINIKTGTTDIGSNTTVKTGDLVTYDKENGMHKKVFYSFIDDKNHN KLLVIRTKGTI AGQYRVYSEEGANKSGLAWPSAFKVQLQLPDNEVAQISDYYPRNSIDTKEYMSTLTYGFNG NVTGDDTGKIGGLIGANVSIGHTLKYVQPDFKTILESPTDK VGWKVIFNNMVMQNAGPYD RDSWNPVYGNQLFMKTRNGSM AADNFLDPNKASSLLSSGFSPDFATVITMDR ASKQQTN IDVIYERVRDDYQLHWTSTNWKGTNTKDKWIDRSSERY IDWEKEEMTN (SEC ID NO: 23) ; (ii) W213A ADSDINIKTGTTDIGSNTTV TGDLVTYDKENGMHKKVFYSFIDDKNHNKKLLVIRTKGTI AGQYRVYSEEGANKSGLAWPSAFKVQLQLPDNEVAQISDYYPRNSIDTKEY STLTYGFNG NVTGDDTGKIGGLIGANVSIGHTLKYVQPDF TILESPTDKKVGWKVIFNN VNQNWGPYD RDSANPVYGNQLFM TRNGSMKAADNFLDPN ASSLLSSGFSPDFATVITMDR ASKQQTN IDVIYERVRDDYQLHWTSTNWKGTNTKDKWIDRSSERYKIDWEKEEMTN (SEC ID NO: 24) ; (iii) DRD209-211AAA ADSDINIKTGTTDIGSNTTVKTGDLVTYDKENGMHKKVFYSFIDDKHNKKLLVIRTKGTIA GQYRVYSEEGAN SGLAWPSAFKVQLQLPDNEVAQISDYYRNSIDTKEYMSTLTYGFNGNV TGDDTGKIGGLIGANVSIGHTLKYVQPDFKTILESPTDKKVGWKVIFNNMVNQNWGPYAAA SWNPVYGNQLFMKTRNGSMKAADNFLDPNKASSLLSSGFSPDFATVITMDRKASKQQTNID VIYERVRDDYQLHWTSTNWKGTNTKDKWIDRSSERYKIDWEKEEMTN (SEC ID NO: 25) , y variantes funcionales, porciones y derivados de las mismas . 23. La proteina de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 15-22, en donde la proteina de fusión comprende una secuencia de señal bacteriana en el N-terminal. 24. La proteina de fusión del párrafo 23, en donde la secuencia de señal bacteriana es MK IWLALAGLVLAFSASA (SEC ID NO: 2) . 25. La proteina de fusión de cualquiera de los párrafo 23 o 24, en donde la secuencia de señal se enlaza a la proteina que enlaza biotina mediante un enlazador de péptido. 26. La proteina de fusión del párrafo 25, en donde el enlazador de péptido comprende la secuencia de aminoácidos AQDP (SEC ID NO: 8) o VSDP (SEC ID NO: 9) . 27. La proteina de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 15-26, en donde la proteina de fusión comprende una etiqueta de purificación en el C-terminal. 28. La proteina de fusión del párrafo 27, en donde la etiqueta de purificación se selecciona del grupo que consiste de una etiqueta de histidina, una etiqueta de c-my, una etiqueta de Halo, una etiqueta Flag y cualquier combinación de las mismas. 29. La proteina de fusión del párrafo 27, en donde la etiqueta de histidina comprende la secuencia de aminoácidos HHHHHH (SEC ID NO: 10) . 30. La proteina de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 27-29, en donde la etiqueta de purificación se enlaza a la proteina que enlaza biotina por la via de un enlazador de péptido. 31. La proteina de fusión del párrafo 30, donde el enlazador de péptido comprende la secuencia de aminoácidos VD LAAALE (SEC ID NO: 11) . 32. La proteina de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 15-31, en donde la proteina que enlaza biotina es una proteina que enlaza biotina de cualquiera de las reivindicaciones 1-13. 33. La proteina de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 15-32, en donde la proteina de fusión comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de: (i) W205A MKKIWLALAGLVLAFSASAAQDPFDASNFKDFSSIASASSSWQNQSGSTMIIQVDSFGNVS GQYVNRAQGTGCQNSPYPLTGRVNGTFIAFSVG NNSTENCNSATGWTGYAQVNGNNTEIV TSWNLAYEGGSGPAIEQGQDTFQYVPTTENKSLLKDGGGGSSSADSDI IKTGTTDIGSNT TVKTGDLVTYDKENGMH KVFYSFIDDKNHNKKLLVIRTKGTIAGQYRVYSEEGANKSGLA WPSAFKVQLQLPDNEVAQISDYYPRNSIDTKEYMSTLTYGFNGNVTGDDTGKIGGLIGANV SIGHTLKYVQPDFKTILESPTDKKVGWKVIFNNMVNQNAGPYDRDSWNPVYGNQLF KTRN GSMKAAD FLDPNKASSLLSSGFSPDFATVITMDRKASKQQT IDVIYERVRDDYQLHWTS TN KGTNTKDKWIDRSSERYKIDWEKEE TNVDKLAAALEHHHHHH (SEC ID NO: 26) ; (ii) W213A MKKIWLALAGLVLAFSASAAQDPFDASNFKDFSSIASASSSWQNQSGSTMIIQVDSFGNVS GQYVNRAQGTGCQNSPYPLTGRVNGTFIAFSVGWNNSTENCNSATGWTGYAQVNGNNTEIV TSWNLAYEGGSGPAIEQGQDTFQYVPTTENKSLLKDGGGGSSSADSDINIKTGTTDIGSNT TV TGDLVTYDKENGMH KVFYSFIDD NHN KLLVIRTKGTIAGQYRVYSEEGANKSGLA WPSAFKVQLQLPDNEVAQISDYYPRNSIDTKEYMSTLTYGFNGNVTGDDTGKIGGLIGANV SIGHTLKYVQPDFKTILESPTDKKVGWKVIFNN VNQNWGPYDRDSANPVYGNQLFMKTRN GSMKAADNFLDPNKASSLLSSGFSPDFATVITMDRKASKQQTNIDVIYERVRDDYQLHWTS TNWKGTNTKDKWIDRSSERYKIDWEKEEMTNVDKLAAALEHHHHHH (SEC ID NO: 27) ; (iii) DRD209-211AA MKKIWLALAGLVLAFSASAAQDPFDASNFKDFSSIASASSSWQNQSGSTMIIQVDSFGNVS GQYVNRAQGTGCQNSPYPLTGRVNGTFIAFSVG NNSTENCNSATGWTGYAQVNGNNTEIV TSWNLAYEGGSGPAIEQGQDTFQYVPTTEN SLLKDGGGGSSSADSDINIKTGTTDIGSNT TVKTGDLVTYDKENGMHKKVFYSFIDDKNHNKKLLVIRTKGTIAGQYRVYSEEGAN SGLA WPSAFKVQLQLPDNEVAQISDYYPRNSIDTKEYMSTLTYGFNGNVTGDDTGKIGGLIGANV SIGHTL YVQPDFKTILESPTD KVGWKVIFNNMVNQNWGPYAAASWNPVYGNQLFM TRN GSMKAADNFLDPNKASSLLSSGFSPDFATVITMDRKASKQQTNIDVIYERVRDDYQLH TS TNWKGTNTKD IDRSSERY ID EKEE TNVDKLAAALEHHHHHH (SEC ID NO: 28) . 34. Una composición que comprende una proteina de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 15-33. 35. Una proteina de alfa-hemolisina (mHla) mutante, que comprende una mutación en el residuo de aminoácido 205, 213 o 209-211 del alfa-hemolisina de S. aureus de tipo silvestre, en donde alfa-hemolisina mutante tiene actividad hemolitica menor que un titulo equivalente del alfa-hemolisina (HLA) de tipo silvestre. 36. La alfa-hemolisina mutante del párrafo 35, en donde la actividad hemolitica del alfa-hemolisina mutante es por lo menos 25% menor que un titulo equivalente de Hla de tipo silvestre. 37. La alfa-hemolisina mutante del párrafo 35 o 36, en donde la alfa-hemolisina mutante comprende una de las siguientes mutaciones en la alfa-hemolisina de S. aureus de tipo silvestre: (i) residuo de 205 W a A; (ii) residuo 213 W a A, o (iii) residuos 209-211 de DRD a AAA. 38. La alfa-hemolisina mutante de cualquiera de las reivindicaciones 13-15, en donde la alfa-hemolisina mutante comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de: (i) W205A ADSDINIKTGTTDIGSNTTVKTGDLVTYDKENGMHKKVFYSFIDDKNHNKKLLVIRTKGTI AGQYRVYSEEGANKSGLA PSAFKVQLQLPDNEVAQISDYYPRNSIDTKEYMSTLTYGFNG NVTGDDTGKIGGLIGANVSIGHTLKYVQPDFKTILESPTDK VGWKVIFNMVNQNAGPYDR DS NPVYGNQLFMKTRNGSMKAADNFLDPNKASSLLSSGFSPDFATVITMDRKASKQQTNI DVIYERVRDDYQLHWTSTN KGTNTKDKWIDRSSERYKID E EEMTN (SEC ID NO: 23); (ii) 213A ADSDINIKTGTTDIGSNTTVKTGDLVTYDKENGMHKKVFYSFIDDKNHNK LLVIRTKGTI AGQYRVYSEEGANKSGLAWPSAFKVQLQLPDNEVAQISDYYPRNSIDT EYMSTLTYGFNG NVTGDDTGKIGGLIGANVSIGHTLKYVQPDFKTILESPTDKKVGWKVIFNNMVNQN GPYD RDSANPVYGNQLFMKTRNGSMKAADNFLDPNKASSLLSSGFSPDFATVITMDRKASKQQTN IDVIYERVRDDYQLHWTSTNWKGTNTKD WIDRSSERYKIDWEKEEMTN (SEC ID NO: 24) ; (iii) DRD209-211AAA ADSDINIKTGTTDIGSNTTVKTGDLVTYDKENGMHKKVFYSFIDDKNHN KLLVIRTKGTI AGQYRVYSEEGANKSGLAWPSAFKVQLQLPDNEVAQISDYYPNSIDTKEYMSTLTYGFNGN VTGDDTGKIGGLIGANVSIGHTLKYVQPDFKTLESPTDKKVGW VIFNNMVNQNWGPYAAA SWNPVYGNQLFMKTRNGSMKAADNFLDPNKASSLLSSGFSPDFATVITMDRKASKQQTNID VIYERVRDDYQLHWTSTNWKGTNTKDKWIDRSSERYKID EKEEMTN (SEC ID NO: 25), y variantes funcionales, porciones y derivados de las mismas . 39. Una composición que comprende una alfa-hemolisina mutante de cualquiera de las reivindicaciones 35-38. 40. Una proteina de fusión que comprende una alfa-hemolisina y un dominio que enlaza biotina, en donde la proteina de fusión tiene menor actividad hemolitica que un titulo equivalente de alfa-hemolisina (HLA) de tipo silvestre. 41. La proteina de fusión del párrafo 18, en donde la alfa-hemolisina es una hemolisina mutante de cualquiera de las reivindicaciones 35-38 o la alfa-hemolisina consiste en la secuencia de aminoácidos de los aminoácidos 27-319 del alfa-hemolisina de tipo silvestre de S. aureus. 42. La proteina de fusión del párrafo 19, en donde el dominio que enlaza biotina consiste de la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 1. 43. La proteina de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 40-42, en donde el dominio que enlaza biotina y la alfa-hemolisina mutante se enlazan mediante un enlazador de péptido. 44. La proteína de fusión del párrafo 43, en donde el enlazador de péptido comprende la secuencia de aminoácidos GGGGSSS (SEC ID NO: 22). 45. La proteína de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 40-44, en donde la proteína de fusión comprende una secuencia de señal bacteriana en el N-terminal. 46. La proteína de fusión del párrafo 45, en donde la secuencia de señal bacteriana es KKIWLALAGLVLAFSASA (SEC ID NO: 2) . 47. La proteína de fusión de cualquiera de los párrafos 45 o 46, en donde la secuencia de señal se enlaza a la proteína que enlaza biotina mediante un enlazador de péptido. 48. La proteína de fusión del párrafo 47, en donde el enlazador de péptido comprende la secuencia de aminoácidos AQDP (SEC ID NO: 8) o VSDP (SEC ID NO: 9). 49. La proteína de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 40-48, en donde la proteína de fusión comprende una etiqueta de purificación en el C-terminal. 50. La proteína de fusión del párrafo 49, en donde la etiqueta de purificación se selecciona del grupo que consiste de una etiqueta de histidina, una etiqueta de c-my, una etiqueta de Halo, una etiqueta Flag, y cualquier de las combinación de las mismas. 51. La proteína de fusión del párrafo 50, en donde la etiqueta de histidina comprende la secuencia de aminoácidos HHHHHH (SEC ID NO: 10). 52. La proteína de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 4,9-51, en donde la etiqueta de purificación se enlaza a la proteína que enlaza biotina por la vía de un enlazador de péptido. 53. La proteína de fusión del párrafo 52, en donde el enlazador de péptido comprende la secuencia de aminoácidos VDKLAAALE (SEC ID NO: 11). 54. La proteína de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 40-53, en donde el dominio que enlaza biotina es una proteína que enlaza biotina de cualquiera de las reivindicaciones 1-13. 55. La proteína de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 40-54, en donde la proteína de fusión comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO: 26, SEC ID NO: 27, y SEC ID NO: 28. 56. La proteína de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 40-55, en donde la actividad hemolítica de la proteína de fusión es por lo menos 25% menor que un título equivalente de Hla de tipo silvestre. 57. Una composición que comprende una proteína de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 40-56. 58. Un método que induce una respuesta inmune en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una composición del párrafo 14, 34, 39, o 57. 59. Un método para vacunar a un mamífero contra por lo menos un patógeno portador de antígeno, el método que comprende administrar una composición del párrafo 14, 34, 39, o 57. 60. El método de cualquiera de las reivindicaciones 58 o 59, en donde el sujeto es un humano. 61. El método de cualquiera de las reivindicaciones 58 o 59, en donde el sujeto es un animal agrícola o no doméstico . 62. El método de cualquiera de las reivindicaciones 58 o 59, en donde el sujeto es un animal doméstico. 63. El método de cualquiera de las reivindicaciones 58 o 59, en donde la administración es por la vía de inyección subcutánea, intranasal, intradérmica o intramuscular . 64. El método del párrafo 58, en donde la respuesta inmune es una respuesta de célula B de anticuerpo. 65. El método del párrafo 58, en donde la respuesta inmune es una respuesta de células T CD4+, que incluyendo la respuesta de Thl, Th2 o Thl7. 66. El método del apartado 58, en donde la respuesta inmune es una respuesta de células T CD8+. 67. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 14, 34, 39, o 57 para el uso en un diagnóstico para la exposición a un patógeno o amenaza inmune . 68. Una proteina que enlaza biotina lipidada, que comprende una secuencia de aminoácidos FDASNF DFSSIASASSSWQNQSGSTMIIQVDSFGNVSGQYVNRAQGTGCQNSPYPLTGR VNGTFIAFSVGWNSTENCNSATGWTGYAQVNGNTEIVTSWNLAYEGGSGPAIEQGQDTFQY VPTTENKSLL D (SEC ID NO: 1) y cualquiera de los derivados funcionales de la misma. 69. La proteina que enlaza biotina lipidada del párrafo 68, en donde la proteina que enlaza biotina se produce en forma soluble a un nivel de por lo menos 10 mg/1 de medio de cultivo en E. coli. 70. La proteina que enlaza biotina lipidada de cualquiera de las reivindicaciones 68-69, en donde la proteina que enlaza biotina es un dimero. 71. La proteina que enlaza biotina lipidada de cualquiera de las reivindicaciones 68-70, en donde la proteina que enlaza biotina comprende una secuencia de lipidación en el N-terminal. 72. La proteina que enlaza biotina lipidada del párrafo 71, en donde la secuencia de lipidación es MKKVAAFVALSLLMAGC (SEC ID NO: 3) . 73. La proteina que enlaza biotina de lipidada de cualquiera de los párrafo 71 o 72, en donde la lipidación se enlaza a la proteina que enlaza biotina mediante un enlazador de péptido. 74. La proteina que enlaza biotina lipidada del párrafo 73, en donde el enlazador de péptido comprende la secuencia de aminoácidos AQDP (SEC ID NO: 8) o VSDP (SEC ID NO: 9) . 75. La proteina que enlaza biotina lipidada de cualquiera de las reivindicaciones 68-74, en donde la proteina que enlaza biotina comprende una etiqueta de purificación en el C-terminal. 76. La proteina que enlaza biotina lipidada del párrafo 75, en donde la etiqueta de purificación se selecciona del grupo que consiste de una etiqueta de histidina, una etiqueta de c-my, una etiqueta de Halo, una etiqueta de Flag, y cualquier combinación de las mismas. 77. La proteina que enlaza biotina lipidada del párrafo 76, en donde la etiqueta de histidina comprende la secuencia de aminoácidos HHHHHH (SEC ID NO: 10) . 78. La proteina que enlaza biotina lipidada de cualquiera de las reivindicaciones 75-77, en donde la etiqueta de purificación se enlaza a la proteina que enlaza biotina por la vía de un enlazador de péptido. 79. La proteina que enlaza biotina lipidada del párrafo 78, donde el enlazador de péptido comprende la secuencia de aminoácidos VDKLAAALE (SEC ID NO: 11) o GGGGSSSVDKLAAALE (SEC ID NO: 12) . 80. La proteina que enlaza biotina lipidada de cualquiera de los párrafos 68-79, en donde la proteina que enlaza biotina comprende la secuencia de aminoácidos MKKVAAFVALSLLMAGCVSDPFDASNFKDFSSIASASSSWQNQSGSTMIIQVDSFGNVSGQ YVNRAQGTGCQNSPYPLTGRVNGTFIAFSVGWNNSTENCNSATGWTGYAQVNGNNTEIVTS WNLAYEGGSGPAIEQGQDTFQYVPTTEN SLLKD (SEC ID NO: 20). 81. Una composición que comprende una proteina que enlaza biotina lipidada de cualquiera de las reivindicaciones 68-80. 82. Una proteina de fusión que comprende una proteina que enlaza biotina lipidada y una proteina o un péptido. 83. La proteina de fusión del párrafo 82, en donde la proteína o péptido se fusiona a la proteína que enlaza biotina lipidada mediante un enlazador de péptido. 84. La proteína de fusión del párrafo 83, en donde el enlazador de péptido comprende la secuencia de aminoácidos GGGGSSS (SEC ID NO: 22). 85. La proteína de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 82-84, en donde la proteína o péptido es un antígeno seleccionado del grupo que consiste de: antígenos neumocócicos, antígenos de tuberculosis, antígenos de ántrax, antígenos del HIV, antígenos de gripe estacional o epidémica antigenos de influenza, antigenos de Pertussis, antigeno de Staphylococcus aureus, antígenos meningocócicos, antígenos de Haemofilus, antigenos de VPH o combinaciones de los mismos. 86. La proteina de fusión del párrafo 85, en donde el antigeno es una variante no hemolitica de alfa-hemolisina de S. aureus. 87. La proteina de fusión del párrafo 86, en donde la variante no hemolitica de alfa-hemolisina de S. aureus comprende una mutación en el residuo de aminoácido 205, 213 o 209-211 de alfa-hemolisina de S. aureus de tipo silvestre. 88. La proteina de fusión del párrafo 86, en donde la variante no hemolitica de alfa-hemolisina de S. aureus comprende una de las siguientes mutaciones en la alfa-hemolisina de S. aureus de tipo silvestre: (i) residuo 205 a A; (ii) residuo 213 W a A, o (iii) residuos 209-211 DRD a AAA. 89. La proteina de fusión del párrafo 86, en donde la variante no hemolitica de alfa-hemolisina de S. aureus comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de: (iv) W205A ADSDINI TGTTDIGSNTTVKTGDLVTYDKENGMHKKVFYSFIDDKNHNKKLLVIRTKGTI AGQYRVYSEEGANKSGLAWPSAFKVQLQLPDNEVAQISDYYPRNSIDTKEYMSTLTYGFNG NVTGDDTGKIGGLIGANVSIGHTLKYVQPDFKTILESPTDKKVGWKVIFNNMVNQNAGPYD RDSWNPVYGNQLFMKTRNGSMKAADNFLDPNKASSLLSSGFSPDFATVITMDRKASKQQTN IDVIYERVRDDYQLH TSTNWKGTNTKDKWIDRSSERYKIDWEKEEMTN (SEC ID NO: 23) ; (v) W213A ADSDINIKTGTTDIGSNTTVKTGDLVTYDKENGMHKKVFYSFIDDKNHNKKLLVIRTKGTI AGQYRVYSEEGANKSGLAWPSAFKVQLQLPDNEVAQISDYYPRNSIDTKEYMSTLTYGFNG NVTGDDTGKIGGLIGANVSIGHTLKYVQPDFKTILESPTDKKVG KVIFNNMVNQNWGPYD RDSANPVYGNQLFMKTRNGSMKAADNFLDPN ASSLLSSGFSPDFATVITMDRKASKQQTN IDVIYERVRDDYQLHWTSTN KGTNTKDKWIDRSSERYKID EKEEMTN (SEC ID NO: 24) ; (vi) DRD209-211AAA ADSDINIKTGTTDIGSNTTV TGDLVTYDKENG HKKVFYSFIDDKNHNKKLLVIRT GTI AGQYRVYSEEGANKSGLAWPSAFKVQLQLPDNEVAQISDYYPNSIDTKEYMSTLTYGFNGN VTGDDTGKIGGLIGANVSIGHTLKYVQPDFKTILESPTD VGWKVIFNNMVNQNWGPYAA AS NPVYGNQLFMKTRNGSMKAADNFLDPNKASSLLSSGFSPDFATVITMDRKASKQQTNI DVIYERVRDDYQLHWTSTN GTNT DKWIDRSSERYKIDWEKEEMTN (SEC ID NO: 25) ; y variantes funcionales, porciones y derivados de las mismas . 90. La proteina de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 82-89, en donde la proteina de fusión comprende una secuencia de lipidación en el N-terminal. 91. La proteina de fusión del párrafo 90, en donde la secuencia de lipidación es MKKVAAFVALSLLMAGC (SEC ID NO: 3) . 92. La proteína de fusión de cualquiera de los párrafo 90 o 91, en donde la secuencia de señal se enlaza a la proteina que enlaza biotina mediante un enlazador de péptido . 93. La proteína de fusión del párrafo 92, en donde el enlazador de péptido comprende la secuencia de aminoácidos AQDP secuencia (SEC ID NO: 8) o VSDP (SEC ID NO: 9). 94. La proteína de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 82-93, en donde la proteína de fusión comprende una etiqueta de purificación en el C-terminal. 95. La proteína de fusión del párrafo 94, en donde la etiqueta de purificación se selecciona del grupo que consiste en una etiqueta de histidina, una etiqueta de c-my, una etiqueta de Halo, una etiqueta Flag, y cualquier de las combinación de los mismos. 96. La proteína de fusión del párrafo 95, en donde la etiqueta de histidina comprende la secuencia de aminoácidos HHHHHH (SEC ID NO: 10). 97. La proteína de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 93-96, en donde la etiqueta de purificación se enlaza a la proteína que enlaza biotina por la vía de un enlazador de péptido. 98. La proteína de fusión del párrafo 97, en donde el enlazador de péptido comprende la secuencia de aminoácidos VDKLAAALE (SEC ID NO: 11). 99. La proteína de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 82-98, en donde la proteína que enlaza biotina lipidada es una proteína que enlaza biotina de cualquiera de las reivindicaciones 68-80. 100. La proteína de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 82-99, en donde la proteína de fusión comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de (i) SEC ID NO: 53 MKKVAAFVALSLLMAGCVSPDFDASNFKDFSSIASASSSWQNQSGSTMIIQVDSFGNVSGQ YVNRAQGTGCQNSPYPLTGRVNGTFIAFSVGWNNSTENCNSATG TGYAQVNGNNTEIVTS WNLAYEGGSGPAIEQGQDTFQYVPTTENKSLLKDGGGGSSSADSDINIKTGTTDIGSNTTV TGDLVTYDKENGMHKKVFYSFIDDKNHNKKLLVIRTKGTIAGQYRVYSEEGAN SGLAWP SAFKVQLQLPDNEVAQISDYYPRNSIDTKEYMSTLTYGFNGNVTGDDTGKIGGLIGANVSI GHTLKYVQPDFKTILESPTDKKVGWKVIFNN VNQNAGPYDRDSWNPVYGNQLFMKTRNGS MKAADNFLDPNKASSLLSSGFSPDFATVITMDRKASKQQTNIDVIYERVRDDYQLHWTSTN WKGTNTKDKWIDRSSERYKID EKEEMTNVDKLAAALEHHHHHH (ii) SEC ID NO: 54 MKKVAAFVALSLLMAGCVSPDFDASNFKDFSSIASASSS QNQSGSTMIIQVDSFGNVSGQ YVNRAQGTGCQNSPYPLTGRVNGTFIAFSVGWNNSTENCNSATGWTGYAQVNGNTEIVTSW NLAYEGGSGPAIEQGQDTFQYVPTTENKSLLKDGGGGSSSADSDII TGTTDIGSNTTVKT GDLVTYDKENGMHKKVFYSFIDDKNHNK LLIRT GTIAGQYRVYSEEGANKSGLAWPSAF KVQLQLPDNEVAQISDYYPRNSIDTKEYMSTLTYGFNGNVTGDDTGKIGGLIGANVSIGHT L YVQPDFKTILESPTDKKVG KVIFNMVNQNWGPYDRDSA PVYGNQLFMKTRNGSM AA DNFLDPNKASSLLSSGFSPDFATVITMDRKASKQQTNIDVIYERVRDDYQLHWTSTN KG TNTKD WIDRSSERYKIDWEKEEMTNVDKLAAALEHHHHHH, y (iii) SEC ID NO: 55 M KVAAFVALSLLMAGCVSPDFDASNFKDFSSIASASSSWQNQSGSTMIIQVDSFGNVSGQ YVNRAQGTGCQNSPYPLTGRVNGTFIAFSVGWNNSTENCNSATGWTGYAQVNGNNTEIVTS WNLAYEGGSGPAIEQGQDTFQYVPTTENKSLLKDGGGGSSSADSDINIKTGTTDIGSNTTV KTGDLVTYDKENGMHKKVFYSFIDDKNHNKKLLVIRTKGTIAGQYRVYSEEGANKSGLAWP SAFKVQLQLPDNEVAQISDYYPRNSIDTKEYMSTLTYGFNGNVTGDDTG IGGLIGANVSI GHTLKYVQPDF TILESPTDKKVG KVIFNNMVNQNWGPYAAASWNPVYGNQLFMKTRNGS MKAADNFLDPNKASSLLSSGFSPDFATVITMDRKASKQQTNIDVIYERVRDDYQLHWTSTN WKGTNTKDK IDRSSERYKIDWEKEEMTNVDKLAAALEHHHHHH (SEC ID NO: 55) . 101. Una composición que comprende una proteina que enlaza biotina lipidada de cualquiera de las reivindicaciones 82-100. 102. Un método que induce una respuesta inmune en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una composición del párrafo 81 o 101. 103. Un método para vacunar a un mamífero contra por lo menos un patógeno portador de antigeno, el método que comprende administración una composición del párrafo 81 o 101. 104. El método de cualquiera de las reivindicaciones 102 o 103, en donde el sujeto es un humano. 105. El método de cualquiera de las reivindicaciones 102 o 103, en donde el sujeto es un animal agrícola o no doméstico. 106. El método de cualquiera de las reivindicaciones 102 o 103, en donde el sujeto es un animal doméstico. 107. El método de cualquiera de las reivindicaciones 102 o 103, en donde la administración es por la via de inyección subcutánea, intranasal, intradérmica o intramuscular . 108. El método del párrafo 102, en donde la respuesta inmune es una respuesta de células B de anticuerpo. 109. El método del párrafo 102, en donde la respuesta inmune es una respuesta de células T CD4+, que incluye la respuesta Thl, Th2, o Thl7. 110. El método del apartado 102, en donde la respuesta inmune es una respuesta de células T CD8+. 111. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 81 o 101 para el uso en un diagnóstico para la exposición a un patógeno o amenaza inmune.
Algunas definiciones seleccionadas Por conveniencia, ciertos términos empleados en la solicitud completa (incluyendo la especificación, ejemplos, y reivindicaciones adjuntas) se recolectan aquí. A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente tienen el mismo significado como es comúnmente entendido por uno de habilidad ordinaria en la técnica a la cual esta invención pertenece.
Como se utiliza en la presente y en las reivindicaciones, las formas singulares incluyen la referencia plural y viceversa a menos que el contexto claramente lo indique de otra manera. El término "o" es inclusivo a menos que se modifique, por ejemplo, por "cualquiera". Diferente en los ejemplos de operación, o donde es indicado de otra manera, todos los números que expresan cantidades de ingredientes o condiciones de reacción utilizados en la presente deben ser entendidos como modificados en todos los casos por el término aproximadamente" .
El término "composición inmunogénica" utilizado en la presente se define como una composición capaz de inducir una respuesta inmune, tal como una respuesta inmune de anticuerpo o celular, cuando se administra a un sujeto. Las composiciones inmunogénicas de la presente invención pueden o no pueden ser inmunoprotectoras o terapéuticas. Cuando las composiciones inmunogénicas de la presente invención previenen, aminoran, mejoran o eliminan la enfermedad del sujeto, entonces la composición inmunogénica opcionalmente ser referida como una vacuna. Como se utiliza en la presente, sin embargo, el término composición inmunogénica no se propone para limitado a vacunas.
Como se utiliza en la presente, el término "antigeno" se refiere a cualquier sustancia que apresura una respuesta inmune dirigida contra la sustancia. En algunas modalidades, un antigeno es un péptido o un polipéptido, y en otras modalidades, puede ser cualquier químico o porción, por ejemplo, un carbohidrato, que induce una respuesta inmune dirigida contra la sustancia.
El término "se asocia" como se utiliza en la presente, se refiere al enlace de dos o más moléculas mediante enlaces no covalentes o covalentes. En algunas modalidades, donde ocurre el enlace de dos o más moléculas mediante un enlace covalente, las dos o más moléculas se pueden fusionar conjuntamente, o reticular conjuntamente. En algunas modalidades, donde el enlace de dos o más moléculas ocurre mediante un enlace no covalente, las dos o más moléculas pueden formar un complejo.
El término "complejo" como se utiliza en la presente se refiere a la colección de dos o más moléculas, conectadas espacialmente por medios diferentes de una interacción covalente, por ejemplo, se pueden conectar mediante interacciones electrostáticas, enlace de hidrógeno o mediante interacciones hidr'ofóbicas (es decir, fuerzas de van der Waals) .
Como se utiliza en la presente, el término "fusionado" significa que por lo menos una proteína o péptido se asocia físicamente con una segunda proteína o péptido. En algunas modalidades, la . fusión es típicamente un enlace covalente, sin embargo, otros tipos de enlaces están abarcados en el término "fusionado" que incluyen, por ejemplo, enlace por la vía de una interacción electrostática, o una interacción hidrofóbica y los similares. El enlace covalente puede abarcar el enlace como una proteina de fusión o enlace químicamente acoplado, por ejemplo por la vía de un enlace de disulfuro formado entre dos residuos de cisteína.
Como se utiliza en la presente, el término "polipéptido de fusión" o "proteína de fusión" significa una proteína creada al unir dos o más secuencias de polipéptido juntamente. Los polipéptidos de fusión abarcados en esta invención incluyen productos de traducción de un constructo de gen quimérico que une las secuencias del DNA que codifican uno o más antígenos, o fragmentos o mutantes de los mismos, con la secuencia de DNA que codifican un segundo polipéptido para formar una sola estructura de lectura abierta. En otras palabras, un "polipéptido de fusión" o "proteína de fusión" es una proteína recombinante de dos o más proteínas que se unen mediante un enlace de péptido. En algunas modalidades, la segunda proteína a la cual los antígenos se fusionan es una molécula de afinidad complementaria que es capaz de interaccionar con una primera molécula de afinidad del par de afinidad complementaria.
Los términos "polipéptido" y "proteína" se pueden utilizar intercambiablemente para referirse a un polímero de residuos de aminoácidos enlazados por enlace de péptido, y para los propósitos de la invención reclamada, tiene una longitud mínima típica de por, lo menos 25 aminoácidos. El término "polipéptido" y "proteína" puede abarcar una proteína multimérica, por ejemplo, una proteína que contiene más de un dominio o subunidades. El término "péptido" como se utiliza en la presente se refiere a una secuencia de aminoácidos enlazados con enlaces de péptidos que contiene menos de 25 aminoácidos, por ejemplo, entre aproximadamente 4 aminoácidos y 25 aminoácidos en longitud. Las proteínas y péptidos se pueden componer de aminoácidos linealmente arreglados enlazados mediante enlaces de péptidos, si se producen biológicamente, recombinantemente o sintéticamente o si se componen de aminoácidos que ocurren naturalmente o que no ocurren naturalmente, son incluidos dentro de esta definición. Tanto las proteínas de longitud completa como fragmentos de las mismas mayores que 25 aminoácidos están abarcadas por la definición de proteína. Los términos también incluyen polipéptidos que tienen modificaciones co-traduccionales (por ejemplo, segmentación de péptido señal) y post-traduccionales del polipéptido, tales como, por ejemplo, formación de enlaces de disulfuro, glicosilación, acetilación, fosforilación, lipidación, segmentación proteolítica (por ejemplo, segmentación mediante metaloproteasas ) y los similares. Además, como se utiliza en la presente, un "polipéptido" se refiere a una proteina que incluye modificaciones, tales como supresiones, adiciones y sustituciones (generalmente de naturaleza conservativa como seria conocido para una persona en la técnica) a la secuencia nativa, mientras que la proteina mantiene la actividad deseada. Estas modificaciones pueden ser deliberadas, como a través de mutagénesis dirigida al sitio, o pueden ser accidentales, tales como a través de mutaciones de hospederos que producen las proteínas o errores debidos a amplificación de PCR y otros métodos del DNA recombinante .
Por "secuencia de señal" se propone una secuencia de ácido nucleico que, cuando se enlaza operablemente a una molécula de ácido nucleico, facilita la secreción del producto (por ejemplo, proteína o péptido) codificado por la molécula de ácido nucleico. En algunas modalidades, la secuencia de señal es de preferencia ubicada 5' a la molécula de ácido nucleico.
Como se utiliza en la presente, el término "N-glicosilado" o "N-glicosilación" se refiere a la unión covalente de una porción de azúcar a residuos de asparagina en un polipéptido. Las porciones de azúcar pueden incluir, pero no están limitadas a glucosa, mañosa y N-acetilglucosamina . Las modificaciones de los glicanos también se incluyen, por ejemplo, siailación.
Una "célula que presenta antígeno" o "APC" es una célula que expresa las moléculas de complejo de histocompatibilidad mayor (MHC) y puede exhibir el antígeno foráneo formado en complejo con MHC sobre su superficie. Ejemplos de células que presentan antígeno son células dendríticas, macrófagos, células B, fibroblastos (piel), células epiteliales tímicas, células epiteliales de tiroides, células gliales (cerebro) , células beta pancreáticas y endoteliales vasculares.
El término "porción funcional" o "fragmento funcional" como se utiliza en el contexto de una "porción funcional de un antígeno" se refiere a una porción del antígeno o polipéptido de antígeno que media el mismo efecto como la porción de antígeno completa, por ejemplo, induce una respuesta inmune en un sujeto o media una asociación con otra molécula, por ejemplo, comprende por lo menos un epítope.
Una "porción" de un antígeno objetivo como es el término se utiliza en la presente será de por lo menos 3 aminoácidos en longitud, y puede ser, por ejemplo, por lo menos 6, por lo menos 8, por lo menos 10, por lo menos 14, por lo menos 16, por lo menos 17, por lo menos 18, por lo menos 19, por lo menos 20 o por lo menos 25 aminoácidos o más grande, inclusive.
Los términos "linfocitos T citotóxicos" o "CTL" se refieren a linfocitos que inducen apoptosis en células dirigidas. Los CTLs formar conjugados específicos de antígeno con las células objetivo por la via de interacción de los TCRs con el antigeno procesado (Ag) sobre superficies celulares objetivo, que da por resultado la apoptosis de la célula dirigida. Los cuerpos apoptóticos se eliminan mediante macrófagos. El término "respuesta de CTL" se utiliza para referirse a la respuesta inmune primaria mediada por células CTL.
El término "inmunidad mediada por células" o "CMI" como se utiliza en la presente se refiere a una respuesta inmune que no involucra anticuerpos o complemento sino más bien involucra la activación de, por ejemplo, macrófagos, células exterminadoras naturales (NK) , linfocitos T citotóxicos específicos de antígeno (células T) y la liberación de varias citoquinas en respuesta a un antígeno objetivo. Establecido de otra manera, CMI se refiere a células inmunes (tales como células T y otros linfocitos) que enlazan a la superficie de otras células que exhiben un antígeno objetivo (tales como células que presentan antígeno (APS) ) y activan una respuesta. La respuesta puede involucrar ya sea otros linfocitos y/o cualquiera de otros glóbulos blancos (leucocitos) y la liberación de citoquinas. La inmunidad celular protege al cuerpo a: (i) activar los linfocitos T citotóxicos específicos de antígeno (CTLs) que son capaces de destruir las células del cuerpo que exhiben epítopes de antígeno foráneo sobre su superficie, tales como células infectadas con virus y células con bacterias intracelulares; (2) activar los macrófagos y células NK, permitiéndoles destruir patógenos intracelulares, y (3) estimular las células para secretar una variedad de citoquinas que influencian la función de otras células involucradas en la respuesta inmune adaptativa y respuestas inmunes innatas.
El término "célula inmune" como se utiliza en la presente se refiere a cualquier célula que puede liberar una citoquina en respuesta a una estimulación antigénica directa o indirecta. Incluido en el término "células inmunes" en la presente están los linfocitos, incluyendo células exterminadoras natural (NK) , células T (células CD4+ y/o CD8+) , células B, macrófagos y monocitos, células Th, las células Thl, células Th2, leucocitos; células dendriticas, macrófagos; células de mastocito y monocitos y cualquier otra célula que es capaz de producir una molécula de citoquina en respuesta a la estimulación de antígeno directa o indirecta. Típicamente, una célula inmune es un linfocito, por ejemplo, un linfocito de célula T.
El término "citoquina" como se utiliza en la presente se refiere a una molécula liberada de una célula inmune en respuesta a la estimulación con un antígeno. Ejemplos de tales citoquinas incluyen, pero no están limitadas a: GM-CSF, IL-Ia; IL-?ß; IL-2; IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-12, IL-17A o IL-17F, u otros miembros de la familia IL-17, IL-22, IL-23, IFN-a, IFN-ß, IFN-?, MIP-la ; ???-1ß; TGF-ß; TNFa, o ???ß. El término "citoquina" no incluye anticuerpos.
El término "sujeto" como se utiliza en la presente se refiere a cualquier animal en el cual es útil inducir una respuesta inmune. El sujeto puede ser un animal silvestre, doméstico, comercial o de compañía tal como un ave o mamífero. El sujeto puede ser un humano. Aunque en una modalidad de la invención se contempla que las composiciones inmunogénicas como se describen en la presente también pueden ser adecuadas para el tratamiento terapéutico o preventivo en humanos, también es aplicable a vertebrados de sangre caliente, por ejemplo, mamíferos, tales como primates no humanos, (particularmente primates superiores), ovejas, perro, roedor (por ejemplo, ratón o rata), conejillo de indias, cabras, cerdo, gato, conejos, vacas y no mamíferos tales como pollos, patos o pavos. En otra modalidad, el sujeto el un animal silvestre, por ejemplo un ave tal como para la diagnosis de la gripe aviar. En algunas modalidades, el sujeto es un animal experimental o sustituto de animal como un modelo de enfermedad. El sujeto puede ser un sujeto en necesidad de tratamiento veterinario, donde la inducción de una respuesta inmune a un antígeno es útil para prevenir una enfermedad y/o controlar la dispersión de una enfermedad, por ejemplo SIV, STL1, SFV, o en el caso del ganado, la enfermedad de pata y boca, o en el caso de aves la enfermedad de Marek o influenza aviar y otras de tales enfermedades.
Como se utiliza en la presente, el término "patógeno" se refiere a un organismo o molécula que causa una enfermedad o trastorno en un sujeto. Por ejemplo, los patógenos incluyen, pero no están limitados a virus, hongos, bacterias, parásitos y otros organismos infecciosos o moléculas de los mismos, asi como organismos macroscópicos taxonómicamente relacionados dentro de las categorías de algas, hongos, levadura, protozoarios o los similares.
Una "célula de cáncer" se refiere a una célula cancerosa, pre-cancerosa o transformada, ya sea in vivo, ex vivo, o en cultivo de tejido, que tiene cambios fenotípicos espontáneos o inducidos que no necesariamente involucran la captación de nuevo material genético. Aunque la transformación puede surgir de una infección con un virus de transformación y la incorporación de nuevo ácido nucleico genómico, o captación de ácido nucleico exógeno, también puede surgir espontáneamente o después de la exposición a un carcinógeno, para de esta manera mutar un gen endógeno. La transformación/cáncer está asociado con, por ejemplo, cambios morfológicos, inmortalización de células, control de crecimiento aberrante, formación de focos, independencia de anclaje, malignidad, pérdida de inhibición de contacto y limitación de densidad de crecimiento, factor de crecimiento o independencia de suero, marcadores específicos de tumor, invasividad o metástasis, y crecimiento de tumor en hospederos animales adecuados, tales como ratones desnudos. Ver, por ejemplo, Freshney, CULTURA ANIMAL CELLS: MANUAL BASIC TECH. (3RD ed., 1994).
El término "tipo silvestre" se refiere a la, secuencia de polinucleótido normal que ocurre naturalmente que codifica una proteína, o una porción de la misma, o secuencia de proteína o porción de la misma, respectivamente, como normalmente existe in vivo.
El término "rautante" se refiere a un organismo o célula con cualquier cambio en su material genético, en particular un cambio (es decir, supresión, sustitución, adición o alteración) con relación a una secuencia de polinucleótidos de tipo silvestre o cualquier cambio con relación a una secuencia de proteína de tipo silvestre. El término "variante" se puede utilizar intercambiable con "mutante". Aunque frecuentemente se asume que un cambio en el materiales genético da por resultado un cambio de la función de la proteína, los términos "mutante" y "variante" se refieren a un cambio en la secuencia de una proteína de tipo silvestre sin considerar si ese cambio altera la función de la proteína (por ejemplo, incrementa, disminuye, imparte una nueva función) o si ese cambio no tiene efecto en la función de la proteina (por ejemplo, la mutación o variación es silenciosa) .
El término "farmacéuticamente aceptable" se refiere a compuestos y composiciones que se pueden administrar a mamíferos sin toxicidad indebida. El término "portadores" farmacéuticamente aceptables" excluye el medio de cultivo de tejido. Las sales farmacéuticamente aceptables ejemplares incluyen pero no están limitadas a sales de ácido mineral tales como clorhidratos, bromhidratos, fosfatos, sulfatos y los similares, y las sales de ácidos orgánicos tales como acetatos, propionatos, malonatos, benzoatos y los similares. Los portadores farmacéuticamente aceptables son bien conocidos en la técnica.
Será apreciado que las proteínas o polipéptidos frecuentemente contienen aminoácidos diferentes de los 20 aminoácidos comúnmente referidos como los 20 aminoácidos que ocurren naturalmente, y que muchos aminoácidos, incluyendo los aminoácidos terminales, se pueden modificar en un polipéptido dado, ya sea mediante procesos naturales, tal como glicosilación y otras modificaciones post-traduccionales, o mediante técnicas de modificación química que son bien conocidos en el arte. Las modificaciones conocidas que se pueden presentar en polipéptidos de la presente invención incluyen, pero no están limitados a, acetilación, acilación, ADP ribosilación, amidación, unión covalente de flavina, unión covalente de una porción heme, unión covalente de un polinucleótido o derivado de polinucleótido, unión covalente de un lipido o derivado de lipido, unión covalente de fosfotidilinositol, reticulación, ciclización, formación de enlaces de disulfuro, desmetilación, formación de reticulaciones covalentes, formación de cistina, formación de piroglutamato, formulación, gamma-carboxilación, glicación, glucosilación, formación fijadora de GPI, hidroxilación, yodación, metilación, miristoilación, oxidación, procesamiento proteolítico, fosforilación, prenilación, racemización, selenoilación, sulfatación, adición mediada por ARN de transferencia de aminoácidos a proteínas tal como arginilacion y ubiquitinación.
Como se utiliza en la presente, los términos "homólogo" u "homólogos" se utilizan intercambiablemente, y cuando se utilizan para describir un polinucleótido o polipéptido, indican que dos polinucleótidos o polipéptidos, o secuencias designadas de los mismos, cuando se alinean y se comparan óptimamente, por ejemplo, utilizando BLAST, versión 2. 2. 14 con parámetros de error para una alineación son idénticas, con inserciones o supresiones de nucleótidos apropiadas o inserciones o supresiones de aminoácidos, que por lo menos 70% de los nucleótidos, usualmente de aproximadamente 75% a 99%, tal como aproximadamente 98 a 99% de los nucleótidos. Para un polipéptido, debe ser por lo menos 50% de identidad de aminoácidos en el polipéptido. El término "homólogo" u "homólogo" como se utiliza en la presente también se refiere a la homología con respecto a la estructura. La determinación de homólogos de genes o polipéptidos se puede averiguar fácilmente por la persona experta. Cuando en el contexto con un porcentaje definido, la homología de porcentaje definido significa por lo menos que ese porcentaje de similitud de aminoácidos. Por ejemplo, 85% de homología se refiere a por lo menos 85% de similitud de aminoácidos .
Como se utiliza en la presente, el término "heterólogo" se refiere a secuencias de ácido nucleico, proteínas o polipéptidos que significan que estas moléculas no están moléculas no están ocurriendo naturalmente en esa célula. Por ejemplo, la secuencia de ácido nucleico que codifica para un polipéptido de antígeno de fusión descrito en la presente que se inserta en una célula, por ejemplo, en el contexto de un vector de expresión de proteína, es una secuencia de ácido nucleico heteróloga.
Para comparación de secuencias, típicamente una secuencia actúa como una secuencia de referencia, a la cual se comparan las secuencias de prueba. Cuando se utiliza un algoritmo de comparación de secuencia, secuencias de prueba y de referencia se ingresan en una computadora, se designan coordenadas de subsecuencia, si es necesario, y se designan parámetros del programa de algoritmo de secuencia. El algoritmo de comparación de secuencia luego calcula el por ciento de identidad de secuencia para la secuencia de prueba con relación a la secuencia de referencia, en base a los parámetros de programa designados. Donde es necesaria o deseada, la alineación óptima de secuencias para comparación se puede conducir mediante cualquier variedad de procedimientos, ya que estos son bien conocidos en la técnica.
El término "variante" como se utiliza en la presente puede referirse a un polipéptido o ácido nucleico que difiere del polipéptido o ácido nucleico que ocurren naturalmente mediante una o más supresiones de aminoácido o de ácido nucleico, adiciones, sustituciones o modificaciones de la cadena lateral, pero retiene una o más funciones especificas o actividades biológicas de la molécula que ocurre naturalmente. Las sustituciones de aminoácidos incluyen alteraciones en las cuales un aminoácido se reemplaza con un residuo de aminoácido que ocurre naturalmente o no-convencional diferente. Tales sustituciones se pueden clasificar como "conservativa" caso en el cual un residuo de aminoácido contenido en un polipéptido se reemplaza con otro aminoácido que ocurre naturalmente de carácter similar ya sea en relación a la polaridad, funcionalidad de cadena lateral o tamaño. Las sustituciones abarcadas por las variantes como es descrito en la presente también puede ser "no conservativas", en el cual un residuo de aminoácido que está presente en un péptido es sustituido un aminoácido que tiene diferentes propiedades (por ejemplo, sustitución de un aminoácido cargado o hidrofóbico con alanina) , o alternativamente, en el cual un aminoácido que ocurre naturalmente se sustituye con un aminoácido no convencional. También abarcado dentro del término "variante" cuando se utiliza con referencia a un polinucleótido o polipéptido, están las variaciones en la estructura primaria, secundaria o terciaria, como es comparado con un polinucleótido o polipéptido de referencia, respectivamente (por ejemplo, como es comparado a un polinucleótido o polipéptido de tipo silvestre) .
El término "sustancialmente similar", cuando se utiliza en referencia a una variante de un antigeno o un derivado funcional de un antigeno como se compara con el antigeno original, significa que una secuencia sujeto particular varia de la secuencia del polipéptido de antigeno mediante una o más sustituciones, supresiones o adiciones, pero retiene por lo menos 50%, o más alto, por ejemplo, por lo menos 60%, 70%, 80%, 90% o mayor, inclusive, de la función del antigeno para inducir una respuesta inmune en un sujeto. En la determinación de secuencias de polinucleótido, todas las presentes secuencias de polinucleótidos capaces de codificar secuencias de aminoácidos sustancialmente similares se consideran que son sustancialmente similares a una secuencia de polinucleótido de referencia, sin considerar las diferencias en la secuencia de codón. Una secuencia de nucleótidos es "sustancialmente similar" a una secuencia de ácido nucleico de antígeno dada si: (a) la secuencia de nucleótidos híbrida a las regiones de codificación de la secuencia de antígeno nativa, o (b) la secuencia de nucleótidos es capaz de hibridación a la secuencia de nucleótidos del antígeno nativo bajo condiciones moderadamente severas y tiene actividad biológica similar a la proteína de antígeno nativo, o (c) las secuencias de nucleótidos se degeneran como un resultado del código genético con relación a las secuencias de nucleótidos definidas en (a) o (b) . Las proteínas sustancialmente similares típicamente serán mayores que aproximadamente 80% similar a la secuencia correspondiente de la proteína nativa.
Las variantes pueden incluir cambios de aminoácido conservativos o no conservativos, como es descrito enseguida. Los cambios de polinucleótidos pueden dar por resultado sustituciones, adiciones, supresiones, fusiones y truncamientos de aminoácido en el polipéptido codificado por la secuencia de referencia. Las variantes también pueden incluir inserciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos, incluyendo inserciones y sustituciones de aminoácidos y otras moléculas que normalmente no ocurren en la secuencia de péptido que es la base de la variante, por ejemplo, pero no limitado a la inserción de ornitina que normalmente no ocurre en proteínas humanas. Las "sustituciones de aminoácidos conservativas" resultan del reemplazo de un aminoácido con otro que tiene propiedades estructurales y/o químicas similares. Las tablas de sustitución conservativa que proporcionan aminoácidos funcionalmente similares son bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, los siguientes seis grupos cada uno contiene aminoácidos que son sustituciones conservativas para el otro: (1) Alanina (A), Serina (S) , Treonina (T) ; (2) ácido Aspártico (D) , ácido Glutámico '(E); (3) Asparagina (N) , Glutamina (Q) ; (4) Arginina (R) , Lisina (K) ; (5) Isoleucina (I), Leucina (L) , etionina (M) , Valina (V); y .6) Fenilalanina (F) , Tirosina (Y), Triptófano (W) . Ver, por ejemplo, Creighton, PROTEINS (W. H. Freeman & Co., 1984).
La elección de aminoácidos conservativos se puede seleccionar en base a la ubicación del aminoácido que es sustituido en el péptido, por ejemplo si el aminoácido está en el exterior del péptido y expuesto a solventes, o en el interior y no expuesto a solventes. La selección de tales sustituciones de aminoácido conservativas está dentro de la habilidad de una persona ordinaria en la técnica. Por consiguiente, se pueden seleccionar sustituciones de aminoácido conservativas adecuadas para aminoácidos en el exterior de una proteina o péptido (es decir, aminoácidos expuestos a un solvente) . Estas sustituciones incluyen, pero no están limitadas a lo siguiente: sustitución de Y con F, T con S o K, P con A, E con D o Q, N con D o G, R con K, G con N o A, T con S o K, D con N o E, I con L o V, F con Y, S con T o A, R con , G con N o A, K con R, A con S, K o P.
Alternativamente, también se puede seleccionar sustituciones de aminoácido conservativas adecuadas para aminoácidos en el interior de una proteina o péptido (es decir, los aminoácidos no están expuestos a un solvente) . Por ejemplo, se pueden usar las siguientes sustituciones conservativas: en donde Y es sustituido con F, T con A o S, I con L o V, W con Y, M y L, N con D, G con A, T con A o S, D con N, I con L o V, F con Y o L, S con A o T y A con S, G, T o V. En algunas modalidades, los polipéptidos LF que incluyen sustituciones de aminoácido no conservativas también están abarcados dentro del término "variantes". Como se utiliza en la presente, el término sustitución "no conservativa" se refiere a la sustitución de un residuo de aminoácido con un diferente residuo de aminoácido que tiene diferentes propiedades químicas. Ejemplos químicos de sustituciones no conservativas incluyen ácido aspártico (D) que es reemplazado con glicina (G)7 asparagina (N) que es reemplazado con lisina (K) y alanina (A) que es reemplazado con arginina (R) .
El término "derivado", como se utiliza en presente se refiere a péptidos que se han modificado químicamente, por ejemplo mediante ubiquitinación, etiquetación, pegilación (derivación con polietilenglicol) o la adición de otras moléculas. Una molécula también es un "derivado" de otra molécula cuando contiene porciones químicas adicionales que no son normalmente una parte de la molécula. Tales porciones pueden mejorar la solubilidad, absorción, vida media biológica de la molécula, etc. Las porciones alternativamente pueden disminuir la toxicidad de la molécula, o eliminar o atenuar un efecto secundario indeseable de la molécula, etc. Las porciones capaces de mediar tales efectos se describen en EMINGTO'S PHARMACEUTICAL SCIENCES (21st ed., Tory, ed., Lippincott Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 2006) .
El término "funcional" cuando se utiliza en conjunción con "derivado" o "variante" se refiere a una molécula de proteína que posee una actividad biológica que es sustancialmente similar a una actividad biológica de la entidad o molécula de la cual es un derivado o variante. "Sustancialmente similares" en este contexto significa que la actividad biológica, por ejemplo, antigenicidad de un polipéptido, es por lo menos 50% tan activa como un polipéptido de referencia, por ejemplo, un polipéptido de tipo silvestre correspondiente, por ejemplo, por lo menos 60% tan activa, 70% tan activa, 80% tan activa, 90% tan activa, 95% tan activa, 100% tan activa o aún más alta (es decir, la variante o derivado tiene mayor actividad que el tipo silvestre), por ejemplo, 110% tan activa, 120% tan activa) o más, inclusive.
El término "recombinante" cuando se utiliza para describir una molécula de ácido nucleico, significa un polinucleótido de origen genómico, cDNA, viral, semisintético y/o sintético, que, en virtud de su origen o manipulación, no está asociado con toda o una porción de las secuencias de polinucleótido con las cuales se asocia en la naturaleza. El término recombinante como se utiliza con respecto a un péptido, polipéptido, proteina o proteina de fusión recombinante, significa un polipéptido producido mediante la expresión de un polinucleótido recombinante. El término recombinante como se utiliza con respecto a una célula hospederas significa una célula hospederas en la cual se ha introducido un polinucleótido recombinante. Recombinante también se utiliza en la presente para referirse a, con referencia al material (por ejemplo, una célula, un ácido nucleico, una proteina o un vector) que el material se ha modificado mediante la introducción de un material heterologo (por ejemplo, una célula, un ácido nucleico, una proteina o un vector) .
El término "vectores" se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar o mediar la expresión de un ácido nucleico heterólogo al cual se ha enlazado a una célula hospederas; un plásmido es una especie del género abarcado por el término "vector". El término "vector" típicamente se refiere a una secuencia de ácido nucleico que contiene un origen de replicación y otras entidades necesarias para la replicación y/o mantenimiento en una célula hospederas. Los vectores capaces de dirigir la expresión de genes y/o secuencia de ácido nucleico al cual se enlaza operativamente son referidos en la presente como "vectores de expresión". En general, los vectores de expresión de utilidad están frecuentemente en la forma de "plásmidos" que se refieren a moléculas del DNA de doble hebra circulares que, en su forma de vector no se enlazan al cromosoma, y típicamente comprenden entidades para la expresión estable o transiente o el DNA codificado. Otros vectores de expresión que se pueden utilizar en los métodos como se describe en la presente incluyen, pero no están limitados a plásmidos, episomas, cromosomas artificiales bacterianos, cromosomas artificiales de levadura, bacteriófagos o vectores virales, y tales vectores pueden integrarse en el genoma del hospedero o replicarse autónomamente en la célula particular. Un vector puede ser un vector de DNA o de RNA. Otras formas de vectores de expresión conocidas por aquellos os expertos en la técnica, que sirven para las funciones equivalentes también se pueden utilizar, por ejemplo, vectores extracromosómicos de auto-aplicación o vectores que se integran en el genoma del hospedero. Los vectores preferidos son aquellos capaces de la replicación autónoma y/o expresión de ácidos nucleicos a los cuales se enlazan.
El término "reducido" o "reducir" o "disminuir" como se utiliza en la presente generalmente significa una disminución por una cantidad estadísticamente significante con relación a una referencia. Para evitar alguna duda, "reducido" significa la disminución estadísticamente significante de por lo menos 10%, como es comparada con un nivel de referencia, por ejemplo, una disminución por al menos 20%, por al menos 30%, por al menos 40%, por al menos 50%, o por al menos 60%, o por al menos 70%, o por al menos 80%, por al menos 90% o más, hasta e incluyendo una disminución de 100%, (es decir, el nivel ausente como es comparado con una muestra de referencia) o cualquier disminución entre 10-100%, como es comparado a un nivel de referencia, como este término se define en la presente.
El término "bajo" como se utiliza en la presente generalmente significa menor por una cantidad estadísticamente significante, para evitar alguna duda, "bajo" significa un valor estadísticamente significante por lo menos 10% menor que un nivel de referencia, por ejemplo, un valor por lo menos 20% menor que un nivel de referencia, por lo menos 30% menor que un nivel de referencia, por lo menos 40% menor que un nivel de referencia, por lo menos 50% menor que un nivel de referencia, por lo menos 60% menor que un nivel de referencia, por lo menos 70% más bajo que un nivel de referencia, por lo menos 80% menor que un nivel de referencia, por lo menos 90% menor que un nivel de referencia, hasta e incluyendo 100% menor que un nivel de referencia (es decir, el nivel ausente como es comparado a una muestra de referencia) .
Los términos "incrementado" o "incrementar", como se utiliza en la presente generalmente significan un incremento por una cantidad estadísticamente significante; tal como un incremento estadísticamente significante de por lo menos 10% como se compara a un nivel de referencia, que incluyen un incremento de por lo menos 20%, por lo menos 30%, por lo menos 40%, por lo menos 50%, por lo menos 60%, por lo menos el 70%) , por lo menos 80%, por lo menos 90%, por lo menos 100% o más, inclusive, incluyendo, por ejemplo por lo menos 2 veces, por lo menos 3 veces, por lo menos 4 veces, por lo menos 5 veces, por lo menos 10 veces de incremento o más grande como es comparado con un nivel de referencia, como ese término se define en la presente.
El término "alto" como se utiliza en la presente generalmente significa más alto por una cantidad estadísticamente significante con relación a una referencia, tal como un valor estadísticamente significante por lo menos 10% más alto que un nivel de referencia, por ejemplo por lo menos 20% más alto, por lo menos 30% más alto, por lo menos 40% más alto, por lo menos 50% más alto, por lo menos el 60% más alto, por lo menos 70% más alto, por lo menos 80% más alto, por lo menos 90% más alto, por lo menos 100% más alto, inclusive, tal como por lo menos 2 veces más alto, por lo menos 3 veces más alto, por lo menos 4 veces más alto, por lo menos 5 veces más alto, por lo menos 10 veces más alto o más, como es comparado con un nivel de referencia.
Como se utiliza en la presente, el término "que comprende" significa que otros elementos también pueden estar presentes además de los elementos definidos presentados. El uso de "que comprende", indica inclusión antes que limitación.
El término "que consiste de" se refiere a composiciones, métodos y componentes respectivos de los mismos como es descrito en la presente, que son exclusivos de cualquier elemento no citado en esta descripción de la modalidad.
Como se utiliza en la presente, el término "que consiste esencialmente de" se refiere a aquellos elementos requeridos para una modalidad dada. El término permite la presencia de elementos que no afectan materialmente la característica (s) básicas y novedosas o funcional de esa modalidad de la invención.
Además se va a entender que todos los tamaños de base y tamaños de aminoácido, y todos los valores de peso molecular o masa molecular, dados para ácidos nucleicos o polipéptidos son aproximados, y se proporcionan para descripción. Aunque métodos y materiales similares o equivalentes a aquellos descritos en la presente se pueden utilizar en la práctica o la prueba de esta descripción, métodos y materiales adecuados se describen en la presente.
Como se utiliza en la presente el término "biotina" se refiere al compuesto de biotina por si mismo y análogos, derivados y variantes del mismos. Asi, el término "biotina" incluye biotina (ácido cis-hexahidro-2-oxo-lH-tieno [3, 4] imidazol-4-pentanóico) y cualquiera de los derivados y análogos de los mismos, incluyendo compuestos similares a biotina. Tales compuestos incluyen, por ejemplo, biotina-en-lisina, biocitina hidrazida, derivados de amino o de sulfhídrico de 2-iminobiotina y éster de N-hidroxisuccinimida, de ácido biotinil-E-aminocaproico, sulfosuccinimidaiminobiotina, biotinabromoacetilhidrazida, p-diazobenzoil biocitina, 3- (N-maleimidopropionil) biocitina, destiobiotina y los similares. El término "biotina" también comprende variantes de biotina que pueden enlazar específicamente a uno o más de una Rhizavidina, avidina, estreptavidina, porción de tamavidina, y otros péptidos similares a avidina.
Aunque la invención anterior se ha descrito en algún detalle a manera de ilustración y ejemplo para propósitos de claridad de entendimiento, será fácilmente evidente para uno de habilidad ordinaria en la técnica en vista de las enseñanzas de esta invención que ciertos cambios y modificaciones se pueden hacer a la misma sin apartarse del espíritu o alcance de las reivindicaciones adjuntas. Lo siguiente se propone para ser ilustrativo de la presente invención, sin embargo, la práctica de la invención no está limitada o restringida de ninguna manera por los ejemplos.
EJEMPLOS Ejemplo 1 : Expresión de proteina que enlaza biotina recombinante en alto rendimiento y soluble y proteínas de fusión de la misma en E. coli La Rhizavidina recombinante (rRhavi) utilizada en estos estudios es una versión modificada N-terminal que contiene solamente los residuos 45-179 de la proteína de tipo silvestre. Para optimizar el nivel de expresión de rRhavi en E. coli, la secuencia de gen que codifica polipéptidos de Rhizavidina (45-179) se re-diseñó al utilizar codones de expresión preferidos de E. coli, luego se sintetizó y se clonó en el vector pET21b. Para facilitar el plegamiento correcto y obtener un alto rendimiento de proteína recombinante soluble, una secuencia de DNA que codifica una secuencia de señal de localización periplásmica de E. coli (19 aminoácidos, MKKIWLALAGLVLAFSASA, SEC ID NO: 2) se introdujo en el extremo 5' del gen sintético de rRhavi. Esta secuencia de señal se predice que se suprime automáticamente de la proteina recombinante después de su dirección al periplasma de E. coli durante el proceso de expresión.
Una secuencia de DNA que codifica una región de enlazador flexible y His-etiqueta (GGGGSSSVDKLAAALEHHHHHH, SEC ID NO: 14) se insertó directamente en el extremo 3' del gen rRhavi sintético. Esto ayuda a la purificación de la proteina que enlaza biotina recombinante. Además, un antígeno se puede insertar en el enlazador que tiene un enlazador flexible sobre ambos lados, por ejemplo, el antigeno se puede insertar entre los aminoácidos S y V del enlazador. Como tal el antigeno se separa de la proteina que enlaza biotina mediante el enlazador de péptido (GGGGSSS, SEC ID NO: 22) y de la His-etiqueta mediante el enlazador de péptido (VD LAAALE, SEC ID NO: 11), esto puede estabilizar la proteina de fusión.
Para construir proteínas de fusión de antígeno de Rhizavidina, una secuencia de DNA que codifica una región de enlazador flexible que consiste de siete aminoácidos (GGGGSSS, SEC ID NO: 22) se pueden insertar directamente en el extremo 3' del gen rRhavi sintético, para ayudar estabilizar la proteína de fusión. Los genes que codifican antígenos candidatos (fragmento de longitud completa o deseado) se amplificaron del DNA genómico de patógenos interesados mediante procedimientos de PCR de rutina y se insertaron en el vector de expresión rRhavi precisamente más allá de la región de enlazador.
Para la expresión de proteina, los plásmidos que contienen constructos objetivo se transformaron en la cepa BL21 (DE3) de E. coli utilizando el procedimiento de choque térmico estándar. Una sola colonia se recolectó frescamente de la placa (o un extracto de glicerol se utilizó después) y se inoculó en 30 mi del medio de Luria-Bertani (LB) que contiene ampicilina (Amp+) para un cultivo durante la noche a 37 °C. En el día 2, un cultivo de partida de 5 mi se inoculó en 1 litro del medio LB/Amp+ y se cultivó a 37°C hasta que se alcanzó la OD6o0=l. Después del enfriamiento del medio a 16°C, se adicionó una concentración final de 0.2 mM de IPTG en los cultivos para una inducción durante la noche.
Las proteínas se purificaron de la fracción periplásmica utilizando un protocolo de choque osmótico modificado. Brevemente, las células bacterianas del cultivo de 6 litros se recolectaron y se re-suspendieron en 120 mi de solución amortiguadora que contiene Tris 30 mM (pH 8.0), sacarosa de 20% y EDTA lmM. Después de la agitación a temperatura ambiente durante 20 min, las células se volvieron formar en pelotillas mediante centrifugación a 10,000 rpm durante 10 min. El sobrenadante se recolectó como la fracción 1, y las células se re-suspendieron en 80 mi de solución enfriada con hielo que contiene MgC12 5 mM, inhibidor de proteinasa y DNasa. Después de la agitación a 4°C durante 20 min, la mezcla se sometió a centrifugación a 13,000 rpm durante 20 min y el sobrenadante se recolectó como la fracción 2. Después de la adición de una concentración final de NaCl 150 mM, MgCl de 10 mM e imidazol 10 mM, el sobrenadante que combina la fracción 1 y la fracción 2 se aplicó sobre una columna de Ni-NTA. Las proteínas eluidas de la columna de Ni-NTA además se purificaron mediante la filtración en gel utilizando la columna superdex 200 que funciona en el purificador de A TA. Las fracciones picos que contienen la proteína objetivo se acumularon y se concentraron. La concentración de proteína se midió al utilizar el equipo de ensayo de proteínas BCA de Bio-Rad. Las proteínas purificadas se formaron en alícuotas, se congelaron instantáneamente en nitrógeno líquido y se mantuvieron a -80°C para el uso futuro.
El constructo de proteína que enlaza biotina se muestra esquemáticamente en la Figura 1, y el SDS-PAGE de la proteína que enlaza biotina purificada se muestra en la Figura 2.
El constructo de proteínas de fusión que comprenden proteína que enlaza biotina se muestra esquemáticamente en la Figura 3, y el SDS-PAGE ejemplar de las proteínas de fusión purificadas se muestra en la Figura 4.
Ejemplo 2 : Derivado lipidado de proteínas que enlazas biotina Un derivado lipidado de proteína que enlaza biotina recombinante se produjo utilizando un método similar al descrito en el Ejemplo 1. El derivado lipidado utilizado en este estudio es una versión modificada N-terminal de la Rhizavidina de tipo silvestre que contiene solamente los residuos 45-179 de la proteína de tipo silvestre. Para optimizar el nivel de expresión de rRhavi en E. coli, la secuencia del gen que codifica polipéptidos de Rhizavidina (45-179) se re-diseñó al utilizar codones de expresión preferidos de E. coli, luego se sintetizó y se clonó en el vector pET21b. Para facilitar la lipidación, el plegamiento correcto y obtener un alto rendimiento de proteína recombinante soluble, una secuencia de lipidación que codifica la secuencia de DNA (19 aminoácidos, MKKVAAFVALSLLMAGC, SEC ID NO: 3) se introdujo en el extremo 5' del gen sintético de rRhavi. La lipidación será adicionada en el residuo Cys de la secuencia de lipidación mediante bacterias, por ejemplo, E. coli, durante el proceso de expresión .
Para la expresión de proteína, el plásmido que contiene constructos objetivo se transformó en la cepa BL21 (DE3) de E. coli utilizando el procedimiento de choque térmico estándar. Una sola colonia se recolectó frescamente de la placa (o una extracto de glicerol se utilizó después) y se inoculó en 30 mi del medio de Luria-Bertani (LB) que contiene ampicilina (Amp+) para un cultivo durante la noche a 37°C. En el día 2, un cultivo de partida de 5 mi se inoculó en 1 litro del medio LB/Amp+ y se cultivó a 37 °C hasta que se alcanzó la OD6oo=l · Después del enfriamiento del medio a 16°C, se adicionó en una concentración final de 0.2 mM de IPTG en los cultivos para una inducción durante la noche.
La rhizavidina lipidada se purificó de la fracción de membrana de E. coli. Las células de E. coli se recolectaron y se re-suspendieron en solución amortiguadora de lisis (Tris de 20 mM, NaCl 500 mM, pH 8.0) que contiene inhibidores de proteasa, DNasa, Mg2+ lOmM y lisozima. Las células se rompieron mediante un ciclo de congelación-descongelación y el sobrenadante se removió después de la centrifugación a 13,000 rpm durante 45 min. Las pelotillas de células luego se re-suspendieron en solución amortiguadora de lisis que contiene SDOC al 0.5%, y se homogeneizaron mediante el batidor de cuentas. Los lisados luego se aplicaron para centrifugación a 13,000 rpm durante 45 min, y el sobrenadante se recolectó para la purificación por afinidad. Rhavi lipidado se eluyó con solución amortiguadora de lisis que contiene SDOC al 5.0% e Im 300 mM.
Las proteínas eluidas de la columna de Ni-NTA además se purificaron mediante la filtración en gel utilizando la columna Superdex 200 que funciona en el purificador de AKTA. Las fracciones picos que contienen proteina objetivo se acumularon y se concentraron. La concentración de proteínas se midió al utilizar el equipo de ensayo de proteína BCA de Bio-Rad. Las proteínas purificadas se formaron en alícuotas, se congelaron instantáneamente nitrógeno líquido y se mantuvieron a -80°C para el uso futuro.
La proteína que enlaza biotina lipidada producida se muestra esquemáticamente en la Figura 5, y SDS-PAGE de la proteína que enlaza biotina lipidada purificada se muestra en la Figura 6.
Ejemplo 3 : Actividad de TLR2 de la proteina que enlaza biotina lipidada La actividad de TLR2 de la proteína que enlaza biotina lipidada se probó en células HEK TLR2. Las células HEK TLR2 se colocaron en una placa de 24 cavidades en 5 x 105 células por cavidad en volumen de 500 µ?. La proteína que enlaza biotina lipidada se adicionó en diferentes concentraciones para la estimulación a 37°C durante la noche. Los sobrenadantes se recolectaron el segundo día para la medición de IL-8 mediante ELISA. Como un control, se utilizaron células HEK 293 para la estimulación en la misma condición .
Se determinó la actividad de TLR2 de la proteína que enlaza biotina lipidada. Los resultados mostraron que la proteína que enlaza biotina lipidada indujo la producción de IL-8 de la HEK TLR2 pero no de las células HEK 293 (Figura 7) .
Ejemplo 4: Mutantes no hemoliticos de HLA y proteínas de fusión.
La secuencia de DNA que codifica el polipéptido maduro de Hla de tipo silvestre (aminoácidos 27-319) se clonó de genoma de Staphylococcus aureus. Todos los mutantes no hemoliticos de Hla se generaron mediante la mutagénesis dirigida al sitio utilizando el cambio rápido. Para hacer proteínas de fusión que enlazan biotina de Hla, la secuencia de DNA que codifica Hla de tipo silvestre o Hla mutante se insertó más allá de la región de enlazador seguido por el gen de proteína que enlaza biotina. Todos los constructos se clonaron en PET21b y se transformaron en E. coli para la expresión como es descrito en lo anterior.
Se produjeron mutantes no hemoliticos de Hla. Las variantes no hemolíticas ejemplares de Hla se muestran esquemáticamente en la Figura 8. SDS-PAGE de las variantes de tipo silvestre o no hemolítica de HLA y la proteína de fusión se muestra en las Figuras 9 y 10.
Ejemplo 5: Actividad hemolítica de Hla de tipo silvestre, Hla mutante y proteínas de fusión.
La actividad hemolítica de Hla de tipo silvestre, Hla mutante y sus proteínas de fusión con proteína que enlaza biotina se analizó utilizando glóbulos rojos de conejo. Los glóbulos rojos de 250 µ? de sangre de conejo se formaron en pelotillas, se lavaron con PBS dos veces y luego se re-suspendieron en 10 mi de PBS. Hla de tipo silvestre Hla, mutante y las proteínas de fusión se diluyeron con PBS en concentraciones indicadas y luego se adicionaron en una placa de 96 cavidades en 100 µ? por cavidad. Los glóbulos rojos se adicionaron en la placa de 96 cavidades que contiene Hla o proteínas de fusión en 25 µ? por cavidad y luego se incubaron a 37 °C durante 30 min. Los sobrenadantes se recolectaron después de la centrifugación a 2000 rpm durante 5 min y se analizaron mediante lector de ELISA en OD450.
Se ensayó la actividad hemolítica de Hla de tipo silvestre, Hla mutante y sus proteínas de fusión. Los resultados demuestran que HLA mutante tiene actividad hemolítica mucho menor con relación a Hla de tipo silvestre (Figura 11). Además, las proteínas de fusión de Hla que comprenden una proteína que enlaza biotina tuvieron una actividad hemolítica aún menor con relación a la proteína Hla mutante sin fusión (Figura 12) .
Ejemplo 6: Actividad estimulatoria de la proteina de fusión de Hla mutante.
Células de macrófago C57 WT se estimularon con la proteina de fusión mutante de Hla no hemolítica. Las células se sembraron en una placa de 24 cavidades en 5xl05 células por cavidad. La proteína de fusión de Hla mutante se diluyó con el medio de crecimiento y se adicionó en las cavidades en la concentración indicada para la estimulación a 37°C durante la noche. Los sobrenadantes se recolectaron el segundo día después de la centrifugación a 2000 rpm durante 5 min y luego se analizaron para la secreción de citoquina mediante ELISA.
Se analizó la actividad estimulatoria de la proteína de fusión de Hla mutante. Los resultados mostraron que la proteína de fusión de Hla mutante (rhavi-Hla209) indujo la producción de múltiples citoquinas pro-inflamatorias, que incluyen TNF-a, IL-6, 11-23, IL-?ß, y IL-17 (Figura 13) .
Ejemplo 7. Proteínas que enlazan biotina lipidadas y proteínas de fusión de Hla mutantes facilitan la respuesta inmune a otros antigenos .
Se hicieron constructos de vacuna a base de MAPSA a partir del polisacárido capsular neumocócico de serotipo-1 biotinilado, antígenos TB fusionados de rhizavidina y ya sea una de rhizavidina no lipidada, rhizavidina lipidada o rhavi-Hla209. Los ratones se inmunizaron con diferentes constructos de MAPS y las respuestas de célula T contra antígenos de TB en diferentes grupos de inmunización se analizaron y se compararon después de 3 inmunizaciones. Brevemente, la sangre entera de diferentes grupos de ratones se estimularon con proteínas TB purificadas in vitro a 37°C durante 6 días y la concentración de citoquinas en el sobrenadante se detectó mediante ELISA.
Los resultados mostraron que los grupos de ratones que recibieron el complejo MAPAS que contienen rhizavidina lipidada o que contiene rhavi-Hla209 generaron mejores respuesta de Thl7 (IL-17A) y de célula Thl (IFN-?) a los antígenos TB (Figura 14) . Esto indicó que la rhizavidina lipidada y rhavi-Hla209 pueden actuar como un co-estimulador/adyuvante en la formulación de vacuna de MAPAS .
Se entiende que la descripción detallada en lo anterior y los ejemplos son ilustrativos únicamente y no se van a tomar como limitaciones en el alcance de la invención. Varios cambios y modificaciones a las modalidades descritas, que serán evidentes para que aquellos expertos en la técnica, se pueden hacer sin apartarse del espíritu y alcance de la presente invención. Además, todas las patentes y otras publicaciones identificadas se incorporan expresamente en la presente por referencia para el propósito de describir y divulgar, por ejemplo, las metodologías descritas en tales publicaciones que podrían ser utilizadas en relación con la presente invención. Estas publicaciones se proporcionan solamente para su descripción antes de la fecha dé presentación de la presente solicitud. Nada a este respecto debe ser considerado como una admisión de que los inventores no están autorizados a la antefecha de tal descripción en virtud de la invención previa o por cualquier otra razón. Todas las declaraciones en cuanto a la fecha o representación en cuanto a los contenidos de estos documentos se basa en la información disponible a los solicitantes y no constituye cualquier admisión en cuanto a la precisión de las fechas o contenidos de estos documentos.
Todas las patentes y otras publicaciones identificadas en la especificación y los ejemplos se incorporan expresamente en la presente por referencia para todos los propósitos. Estas publicaciones se proporcionan solamente para su descripción antes de la fecha de presentación de la presente solicitud. Nada ha éste respecto debe ser considerado como una admisión de que los inventores no están autorizados a la antefecha de tal descripción en virtud de la invención previa o por cualquier otra razón. Todas las declaraciones en cuanto a la fecha o representación en cuanto a los contenidos de estos documentos se basa en la información disponible a los solicitantes y no constituye cualquier admisión en cuanto a la precisión de las fechas o contenidos de estos documentos.
Aunque modalidades preferidas se han representado y descrito en detalle en la presente, será evidente para aquellos expertos en la técnica relevante que varias modificaciones, adiciones, sustituciones y los similares se pueden hacer sin apartarse del espíritu de la invención y estos, por lo tanto, se consideran que están dentro del alcance de la invención como se define en las reivindicaciones que siguen.
Además, al grado ya no indicado, será entendido por aquellos de habilidad en la técnica que cualquiera de las diversas modalidades en la presente descritas e ilustradas, además se pueden modificar para incorporar características mostradas en cualquiera de las otras modalidades descritas en la presente.

Claims (67)

REIVINDICACIONES
1. Una proteína que enlaza biotina soluble, caracterizada porque comprende una secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 1 y cualquiera de los derivados funcionales de la misma.
2. La proteina que enlaza biotina de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la proteína que enlaza biotina se produce en forma soluble a un nivel de por lo menos 10 mg/1 del medio de cultivo en E. coli.
3. La proteína que enlaza biotina de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-2, caracterizada porque la proteína que enlaza biotina es un dimero.
4. La proteína que enlaza biotina de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizada porque la proteína que enlaza biotina comprende una secuencia de señal bacteriana en el N-terminal.
5. La proteína que enlaza biotina de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada porque la secuencia de señal bacteriana es la SEC ID NO: 2.
6. La proteína que enlaza biotina de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 4 o 5, caracterizada porque la secuencia señal se enlaza a la proteína que enlaza biotina mediante un enlazador de péptido.
7. La proteína que enlaza biotina de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque el enlazador de péptido comprende la secuencia el aminoácidos SEC ID NO: 8 o VSDP SEC ID NO: 9.
8. La proteina que enlaza biotina de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, caracterizada porque la proteína que enlaza biotina comprende una etiqueta de purificación en el C-terminal.
9. La proteína que enlaza biotina de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque la etiqueta de purificación se selecciona del grupo que consiste de un etiqueta de histidina, un etiqueta de c-my, una etiqueta de Halo, una etiqueta Flag y cualquiera de las combinación de las mismas.
10. La proteína que enlaza biotina de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada porque la etiqueta de histidina comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 10.
11. La proteína que enlaza biotina de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 8-10, caracterizada porque la etiqueta de purificación se enlaza a la proteína que enlaza biotina por la vía de un enlazador de péptido.
12. La proteína que enlaza biotina de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada porque el enlazador de péptido comprende la secuencia de aminoácidos VDKLAAALE SEC ID NO: 11 o GGGGSSSVDKLAAALE SEC ID NO: 12.
13. La proteína que enlaza biotina de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-12, caracterizada porque la proteína que enlaza biotina comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 15.
14. Una composición, caracterizada porque comprende una proteína que enlaza biotina de cualquiera de las reivindicaciones 1-13.
15. Una proteína de fusión, caracterizada porque comprende una proteína que enlaza biotina y una proteína o un péptido.
16. La proteína de fusión de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque la proteína o péptido se fusiona a la proteína que enlaza biotina mediante un enlazador de péptido.
17. La proteína de fusión de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque el enlazador de péptido comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 22.
18. La proteína de fusión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 15-17, caracterizada porque la proteína o péptido es un antígeno seleccionado del grupo que consiste de: antígenos neumocócicos, antígenos de tuberculosis, antígenos de ántrax, antígenos de HIV, antígenos de gripe estacional o epidémica, antígenos de influenza, antígenos de Pertussis, antígenos de Staphylococcus aureus, antígenos Meningocócicos, antígenos de Haemofilus, antígenos de HPV o combinaciones de los mismos.
19. La proteina de fusión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 15-18, caracterizada porque el antigeno es una variante no hemolitica de alfa-hemolisina de S. aureus.
20. La proteina de fusión de conformidad con la reivindicación 19, caracterizada porque la variante no hemolitica de alfa-hemolisina de S. aureus comprende una mutación en el residuo de aminoácido 205, 213 o 209-211 de alfa-hemolisina de S. aureus de tipo silvestre.
21. La proteina de fusión de conformidad con la reivindicación 19, caracterizada porque la variante no hemolitica de alfa-hemolisina de S. aureus comprende una de las siguientes mutaciones en la alfa-hemolisina de S. aureus de tipo silvestre: (i) residuo 205 W a A; (ii) residuo 213 a A; o (iii) residuos 209-211 DRD a AAA.
22. La proteina de fusión de conformidad con la reivindicación 19, caracterizada porque la variante no hemolitica de alfa-hemolisina de S. aureus comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO: 23, SEC ID NO: 24, SEC ID NO: 25, y variantes funcionales, porciones y derivados de las mismas.
23. La proteina de fusión de conformidad con cualquiera de las' reivindicaciones 15-22, caracterizada porque la proteina de fusión comprende una secuencia de señal bacteriana en el N-terminal.
24. La proteina de fusión de conformidad con la reivindicación 23, caracterizada porque la secuencia de señal bacteriana es SEC ID NO: 2.
25. La proteina de fusión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 23 o 24, caracterizada porque la secuencia de señal se enlaza a la proteina que enlaza biotina mediante un enlazador de péptido.
26. La proteina de fusión de conformidad con la reivindicación 25, caracterizada porque el enlazador de péptido comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 8 SEC ID NO: 9.
27. La proteina de fusión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 15-26, caracterizada porque la proteina de fusión comprende una etiqueta de purificación en el C-terminal.
28. La proteina de fusión de conformidad con la reivindicación 27, caracterizada porque la etiqueta de purificación se selecciona del grupo que consiste de una etiqueta de histidina, una etiqueta de c-my, una etiqueta de Halo, una etiqueta Flag y cualquiera de las combinaciones de las mismas.
29. La proteina de fusión de conformidad con la reivindicación 27, caracterizada porque la etiqueta de histidina comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 10.
30. La proteína de fusión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 27-29, caracterizada porque la etiqueta de purificación se enlaza a la proteína que enlaza biotina por la vía de un enlazador de péptido.
31. La proteína de fusión de conformidad con la reivindicación 30, caracterizada porque el enlazador de péptido comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 11.
32. La proteína de fusión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 15-31, caracterizada porque la proteína que enlaza biotina es una proteína que enlaza biotina de cualquiera de las reivindicaciones 1-13.
33. La proteína de fusión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 15-32, caracterizada porque la proteína de fusión comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO: 26, SEC ID NO: 27, y SEC ID NO: 28.
34. Una composición, caracterizada porque comprende una proteína de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 15-33.
35. Una proteína de alfa-hemolisina mutante (mHla), caracterizada porque comprende una mutación en el residuo de aminoácido 205, 213 o 209-211 de alfa-hemolisina de S. aureus de tipo silvestre, en donde la alfa-hemolisina mutante tiene menor actividad hemolítica que un título equivalente de alfa-hemolisina (HLA) de tipo silvestre.
36. La alfa-hemolisina mutante de conformidad con la reivindicación 35, caracterizada porque la actividad hemolitica de la alfa-hemolisina mutante es por lo menos 25% menor que un titulo equivalente de Hla de tipo silvestre.
37. La alfa-hemolisina mutante de conformidad con la reivindicación 35 o 36, caracterizada porque la alfa-hemolisina mutante comprende una de las siguientes mutaciones en la alfa-hemolisina de S. aureus de tipo silvestre: (i) residuo de 205 W a A; (ii) residuo de 213 W a A; o (iii) residuos 209-211 DRD a AAA.
38. La alfa-hemolisina mutante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15, caracterizada porque la alfa-hemolisina mutante comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO: 23, SEC ID NO: 24, SEC ID NO: 25, y variantes funcionales, porciones y derivados de las mismas.
39. Una composición, caracterizada porque comprende un alfa-hemolisina mutante de cualquiera de las reivindicaciones 35-38.
40. Una proteina de fusión, caracterizada porque comprende una alfa-hemolisina y un dominio que enlaza biotina, en donde la proteína de fusión tiene menor actividad hemolitica que un título equivalente de alfa-hemolisina (Hla) de tipo silvestre.
41. La proteína de fusión de conformidad con la reivindicación 18, caracterizada porque el alfa-hemolisina es una hemolisina mutante de cualquiera de las reivindicaciones 35-38 o la alfa-hemolisina consiste de la secuencia de aminoácidos de los aminoácidos 27-319 de alfa-hemolisina de tipo silvestre de S. aureus.
42. La proteina de fusión de conformidad con la reivindicación 19, caracterizada porque el dominio que enlaza biotina consiste en la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 1.
43. La proteina de fusión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 40-42, caracterizada porque el dominio que enlaza biotina y la alfa-hemolisina mutante se enlazan mediante un enlazador de péptido.
44. La proteina de fusión de conformidad con la reivindicación 43, caracterizada porque el enlazador de péptido comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 22.
45. La proteina de fusión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 40-44, caracterizada porque la proteína de fusión comprende una secuencia de señal bacteriana en el N-terminal.
46. La proteína de fusión de conformidad con la reivindicación 45, caracterizada porque la secuencia de señal bacteriana es SEC ID NO: 2.
47. La proteína de fusión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 45 o 46, caracterizada porque la secuencia de señal se enlaza a la proteína que enlaza biotina mediante un enlazador de péptido.
48. La proteína de fusión de conformidad con la reivindicación 47, caracterizada porque el enlazador de péptido comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 8 o SEC ID NO: 9.
49. La proteína de fusión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 40-48, caracterizada porque la proteína de fusión comprende una etiqueta de purificación en el C-terminal.
50. La proteína de fusión de conformidad con la reivindicación 49, caracterizada porque la etiqueta de purificación se selecciona del grupo que consiste de una etiqueta de histidina, una etiqueta de c-my, una etiqueta de Halo, una etiqueta Flag y cualquier de las combinación de los mismos .
51. La proteína de fusión de conformidad con la reivindicación 50, caracterizada porque la etiqueta de histidina comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 10.
52. La proteína de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 49-51, caracterizada porque la etiqueta de purificación se enlaza a la proteína que enlaza biotina por la vía de un enlazador de péptido.
53. La proteína de fusión de conformidad con la reivindicación 52, caracterizada porque el enlazador de péptido comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 11.
54. La proteína de fusión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 40-53, caracterizada porque el dominio que enlaza biotina es una proteína que enlaza biotina de cualquiera de las reivindicaciones 1-13.
55. La proteína de fusión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 40-54, caracterizada porque la proteína de fusión comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO: 26, SEC ID NO: 27 y SEC ID NO: 28.
56. La proteína de fusión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 40-55, caracterizada porque la actividad hemolítica de la proteína de fusión es por lo menos un 25% menor que un título equivalente de Hla de tipo silvestre.
57. Una composición, caracterizada porque comprende una proteína de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 40-56.
58. Un método para inducir una respuesta inmune en un sujeto, caracterizado porque comprende administrar al sujeto una composición de la reivindicación 14, 34, 39 o 57.
59. Un método para vacunar a un mamífero contra por lo menos un patógeno portador de antígeno, el método caracterizado porque comprende administración una composición de la reivindicación 14, 34, 39 o 57.
60. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 58 o 59, caracterizada porque el sujeto es un humano.
61. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 58 o 59, caracterizado porque el sujeto es un animal agrícola o no doméstico.
62. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 58 o 59, caracterizado porque el sujeto es un animal doméstico.
63. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 58 o 59, caracterizado porque la administración es por la vía de la inyección subcutánea, intranasal, intradérmica o intramuscular.
64. El método de conformidad con la reivindicación 58, caracterizado porque la respuesta inmune es una respuesta de anticuerpo/célula B.
65. El método de conformidad con la reivindicación 58, caracterizado . porque la respuesta inmune es una respuesta de célula T CD4+, que incluye respuesta de Thl, Th2 o Thl7.
66. El método de conformidad con la reivindicación 58, caracterizado porque la respuesta inmune es una respuesta de célula T CD8+.
67. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 14, 34, 39, o 57, caracterizada porque es para el uso en un diagnóstico para la exposición a un patógeno o amenaza inmune.
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