KR102234933B1 - 다항원 제시 면역원성 조성물, 및 그 방법 및 용도 - Google Patents
다항원 제시 면역원성 조성물, 및 그 방법 및 용도 Download PDFInfo
- Publication number
- KR102234933B1 KR102234933B1 KR1020197025288A KR20197025288A KR102234933B1 KR 102234933 B1 KR102234933 B1 KR 102234933B1 KR 1020197025288 A KR1020197025288 A KR 1020197025288A KR 20197025288 A KR20197025288 A KR 20197025288A KR 102234933 B1 KR102234933 B1 KR 102234933B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- antigens
- antigen
- protein
- peptide
- polysaccharide
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/385—Haptens or antigens, bound to carriers
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K39/025—Enterobacteriales, e.g. Enterobacter
- A61K39/0275—Salmonella
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K39/09—Lactobacillales, e.g. aerococcus, enterococcus, lactobacillus, lactococcus, streptococcus
- A61K39/092—Streptococcus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
- A61K47/543—Lipids, e.g. triglycerides; Polyamines, e.g. spermine or spermidine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
- A61K47/555—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound pre-targeting systems involving an organic compound, other than a peptide, protein or antibody, for targeting specific cells
- A61K47/557—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound pre-targeting systems involving an organic compound, other than a peptide, protein or antibody, for targeting specific cells the modifying agent being biotin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
- A61K47/61—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule the organic macromolecular compound being a polysaccharide or a derivative thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/305—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Micrococcaceae (F)
- C07K14/31—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Micrococcaceae (F) from Staphylococcus (G)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55505—Inorganic adjuvants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
- A61K2039/572—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2 cytotoxic response
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
- A61K2039/575—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2 humoral response
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
- A61K2039/6031—Proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
- A61K2039/6093—Synthetic polymers, e.g. polyethyleneglycol [PEG], Polymers or copolymers of (D) glutamate and (D) lysine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/62—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the link between antigen and carrier
- A61K2039/625—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the link between antigen and carrier binding through the biotin-streptavidin system or similar
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/62—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the link between antigen and carrier
- A61K2039/627—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the link between antigen and carrier characterised by the linker
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/64—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the architecture of the carrier-antigen complex, e.g. repetition of carrier-antigen units
- A61K2039/645—Dendrimers; Multiple antigen peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/70—Multivalent vaccine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Oncology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
본 실시형태는 상보적 친화성 분자에 의해 항원이 결합된 폴리머를 포함하는 면역성 다항원 제시 시스템을 제공한다. 예를 들면, 상기 폴리머는 동일 또는 상이한 병원체로부터의 단백질 또는 펩티드 항원들이 간접적으로 연결된 폴리사커라이드, 또는 항원 폴리사커라이드일 수 있다. 본 면역성 조성물은 동시에 하나의 또는 복수의 항원에 대한 체액성 및 세포 면역 반응 둘다를 유발할 수 있다.
Description
정부 지원
본 발명은 미국 국립보건원(National Institutes of Health)에 의해 허여된 승인 번호 제AI067737-01호 및 제AI51526-01호 하에 정부 지원으로 이루어졌다. 미국 정부는 본 발명에 대해 소정의 권리를 갖는다.
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2011년 5월 11일자로 출원된 미국 가출원 제61/484,934호, 2012년 3월 8일자로 출원된 미국 가출원 제61/608,168호 및 2012년 3월 13일자로 출원된 미국 가출원 제61/609,974호의 35 U.S.C.§ 119(e) 하에서의 이득을 주장하며, 이들 각각의 내용은 본원에 그 전문이 참고로 포함된다.
분야
본 발명은 분자유전학, 면역학, 및 미생물학에 관한 것이다. 본원은 일반적으로 면역성 조성물의 제조를 위한 조성물과 방법에 관한 것이다. 더 구체적으로, 본 발명의 실시형태는, 자신도 항원일 수 있는 폴리머(예컨대 폴리사커라이드)에 부착된 적어도 하나의 단백질 또는 펩티드 항원을 포함하는, 면역성 마크로-복합체를 제공한다. 일부 실시형태에서, 이 복합체는, 상승적인 체액성 및 세포 면역 반응을 부여하는 면역성 조성물, 예컨대 백신으로서 사용될 수 있으며; 일부 실시형태에서, 병원체들, 예를 들면 그러한 병원체들의 치명적 감염과 점막 수송에 대한, 상승적인 항체- 및 세포-매개 방어를 끌어낸다.
백신은 마이크로유기체 감염, 바이러스 감염, 및 암을 포함하는 다양한 질환들에 대한 예방 및 치료를 가능하게 한다. 현재의 폴리사커라이드 기반 백신들은, 그러나 가장 취약한 개체군들에 있어서는 항상 효과적인 것은 아니다. 예를 들면, 폐렴연쇄구균(Streptococcus pneumonia)(폐렴구균(pneumococcus)) 및 장티푸스균(Salmonella typhi) 감염은 개발도상국의 아동들에 있어서의 두 가지 주요한 질환이다. 장티푸스에 대해서는, 허가받은 Vi 폴리사커라이드 백신들은 2세 미만의 아동들에 있어서는 효과가 없다. 그럼에도 불구하고, 콜로니화 또는 질환의 예방을 위한 폴리사커라이드-기반 백신들 및 수동적 면역 부여의 성공은 특히 폐렴연쇄구균에 의해 유발되는 질환을 제어함에 있어서 피막 항체(capsular antibody)의 중요성을 입증하였다. 나아가 동물과 인간 둘다에 있어서의 연구에 의해 폐렴구균 백신 접종으로부터 유발되는 항체가 폐렴구균 질환에 선행하는 비강인두(NP) 폐렴구균 콜로니화를 방어할 수 있음이 입증되었다.
현재의 폴리사커라이드 폐렴구균 백신들의 한계는 항피막항체(anticapsular antibody)에 의한 방어가 그 혈청형 특이성에 의해 제한된다는 것이다. 예를 들면, 7가(7-valent) 폐렴구균 콘쥬게이트 백신(PCV7)은 백신형(VT) 주들에 기인하는 침습성 폐렴구균 질환의 발생 정도를 유의하게 감소시켰지만, 최근의 연구에 의하면 비VT 혈청형이 점진적으로 VT 폐렴구균 개체군을 대체하고 있어 백신의 유용성을 잠재적으로 제한하고 있음이 밝혀졌다. 이는 폐렴구균 콜로니화가 보존 항원에 의한 면역 부여에 의해 방어될 수 있는지에 대한 평가로 이어졌다. 특히, 수개의 폐렴구균 단백질들이 폐렴구균 콜로니화의 동물 모델에서 백신 후보로서 평가되었다. 이들 단백질의 일부에 의한 점막 면역 부여는 전신적 및 점막 항체를 유발하여 폐렴구균 질환 및 콜로니화에 대한 방어를 부여하는 것으로 나타났다. 모든 폐렴구균 혈청형에 대해 강력한 세포 및 체액성 면역 반응 둘다를 일으킬 수 있는, 폐렴구균 폴리사커라이드 및 단백질 둘다를 포함하는 면역성 조성물에 대한 필요성이 여전히 있다.
또한, 선천적 면역 반응은 미생물 병원체들에 대해 신속하고 통상 유효한 방어를 제공한다. 이 반응에는, 염증 매개자의 생산 및 방출, 백혈구의 채용, 및 항미생물 효과자의 활성화를 촉발하는 병원체 관련 분자의 세포 인식이 관련된다. 톨-유사 수용체(TLR)는, 그 중 적어도 11개가 포유류에 대해 기술되었으며, 광범위한 병원체-관련 분자들을 구별하고 방어 반응을 끌어낼 수 있다. 예를 들면, TLR4는 그램 음성 세균으로부터의 산물, 호흡기 세포융합 바이러스의 F 단백질, 및 그램 양성 세균의 콜레스테롤-의존성 시톨리신들(CDC)을 포함하여, 많은 미생물 산물을 인식한다. 또한, TLR2는 다수의 미생물 및 합성 화합물을 인식한다. 따라서, 그러한 TLR 작용제(agonist)들의 포함은 백신들에 대한 면역 반응을 증진시킬 수 있다.
감염 예컨대 폐렴구균 콜로니화 및 질환에 대한 선천적 면역 반응(TLR-매개 또는 다른)을 끌어냄으로써 백신의 효능을 향상시킬 필요가 여전히 있다.
요약
본원은 면역성 조성물의 생산에 유용한, 예컨대 백신에 유용한 면역성 다항원 제시 시스템(MAPS)을 제공한다. 특히, 본 발명은, 적어도 1종의 폴리머(예: 폴리사커라이드)로서 임의로 항원성인 것; 적어도 하나의 항원성 단백질 또는 펩티드; 및 (i) 상기 폴리머와 결합하는(associate) 제1 친화성 분자, 및 (ii) 상기 단백질 또는 펩티드와 결합하는 상보적 친화성 분자를 포함하는 적어도 하나의 상보적 친화성-분자 쌍을 포함하며, 상기 제1 친화성 분자 및 상보적 친화성 분자가 상기 폴리머와 상기 항원성 단백질 또는 펩티드 간의 간접적 링크로서 기능하는, 면역성 복합체를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 따라서, 상기 폴리머는 적어도 1개, 또는 적어도 2개, 또는 다수의 동일 또는 상이한 단백질 또는 펩티드 항원들을 부착할 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 폴리머는 항원성이며, 예를 들면, 상기 폴리머는 폐렴구균 피막 폴리사커라이드이다. 일부 실시형태에서, 상기 단백질 또는 펩티드 항원들은 재조합 단백질 또는 펩티드 항원들이다.
본원에 개시된 면역성 조성물은 동시에 하나의 또는 다수의 항원에 대한 체액성 및 세포 반응 둘다를 끌어낼 수 있다. 상기 면역성 조성물은 장래의 감염으로부터 대상체를 잠재적으로 방어하는 장기 지속적 기억 반응을 제공한다. 이는, 고역가의 기능성 항-폴리사커라이드 항체를 일으키는 단일의 면역성 조성물을 허용하며, 통상의 접합체 백신에 의해 유도되는 항체 레벨과 유사하거나 또는 손색이 없다. 게다가, 특정 담체 단백질에 대한 제한이 없으며, 다양한 항원 단백질들이 MAPS 구성체에 사용되어 강력한 항-폴리사커라이드 항체 반응을 일으킬 수 있다.
또한, 강한 항체 반응 및 Th17/Th1 반응들은 MAPS 조성물을 통해 제시되는 다수의 단백질 항원에 특이적이다. 이는 하나의 구성체에 의해 2가지 형태의 면역을 끌어내는 수단으로서의 주요한 이점을 제공한다. 단백질 담체에 접합된 항원성 폴리사커라이드에 대한 보다 통상적인 면역 반응에 더하여, 본 발명은 전신적으로 주사된 단백질에 대해 T-세포 반응과, 더 구체적으로, Th17 및 Th1 반응을 가능하게 한다. 게다가, 본 면역성 조성물은 폴리머 골격에 대해 리간드들을 도입할 수 있다. 이는 단백질/폴리머 비율, 복합체 크기를 변형함으로써, 또는 그 조성물에 특이적 공자극인자, 예컨대 TLR2/4 리간드들 등을 도입함으로써, 특이적 B-세포 또는 T-세포 반응을 증진하는 잠재력을 제공한다.
단백질의 가혹한 처리를 수반하는 전형적인 접합 기술에 비해, 본 방법은 펩티드 항원의 다른 변형의 변성의 위험을 회피한다. 이는 포함된 단백질들의 항원성을 보존하는 실질적인 이점을 제공하며 그 단백질 자체가 항원으로서(단지 담체로서보다는) 기능할 가능성을 증가시킨다. 유사하게, 본 방법은 폴리사커라이드 골격의 불필요한 변형/손상을 회피하는데, 왜냐하면 화학적 가교가 많지 않기 때문이다; 폴리사커라이드의 특정 작용기들과 반응하도록 비오틴화를 정교하게 제어할 수 있으며, 비오틴화 수준은 용이하게 조정될 수 있다. 이는 면역성 및 방어의 감소를 일으킬 수 있는 결정적 측쇄들 또는 에피토프들에의 손상을 초래하는, 접합의 전형적인 프로세스를 회피함에 있어서 유용하다.
본 발명의 친화성-기반 어셈블리는 면역성 조성물의 용이하고 매우 플렉서블한 제제를 제공한다. 그것은 매우 특이적이며 안정하다; 그것은 냉소에서 수개월간 유지되어 그 능력을 보유할 수 있다. 상기 어셈블리는 높은 재현성을 보장하기에 충분한 정도로 단순하며; 단지 몇 단계만 요구되어, 로트(lot)별 차이를 감소시켜, 현저한 산업적 이점을 갖는다. 상기 MAPS 어셈블리는 저농도의 단백질 및 폴리사커라이드(예컨대 0.1 mg/ml)에 있어서도 고효율적이며(95% 초과), 이는 주요한 이점인데, 왜냐하면 접합체 제조에 있어서의 비효율성(전형적으로 효율이 50% 미만의 범위에 있음)은 주요한 장애(hurdle)와 백신의 비용을 높이는 이유이기 때문이다. 제제에 관해, 조성물 및 최종 제품의 물성을 조정하는 것은 용이하다. 복합체에서의 단백질:폴리머 비율은 조정 가능하며; 폴리머의 중등 정도의(moderate) 비오틴화에 의해, 단백질:폴리머는 10:1 (w/w) 또는 그 이상일 수 있으며; 역으로, 그 비율은 면역적 목표에 기초해 이익이 된다면 1:10 또는 그 이하일 수도 있다. 또한, 면역성 MAPS 조성물의 크기는 폴리머의 크기의 선택에 의해 조정될 수 있다. MAPS의 제조 방법은 변형을 거의 가하지 않고 단백질과 폴리머를 용이하게 조합할 수 있게 한다. 단일의 면역성 구성체에 있어서, 동일 또는 상이한 병원체들(예: 폐렴구균 및 결핵)로부터의 다수의 단백질 항원들을 로딩함에 의한 최종 산물의 가능한 다가성(multivalency)에 의하면 1 이상의 질환에 대해 대상체를 면역화하는데 요구되는 백신들의 수를 감소시키는데 사용될 수 있는 조성물이 가능하다. 게다가, 상기 MAPS 조성물은 고안정성이며; 끓여야만 분해되고 심지어 4℃에서 수개월후에도 면역성을 유지한다. MAPS 복합체의 면역성은 항원성 단백질 또는 펩티드 성분의 안정성에 의해 제한될 수 있으며, 그 안정성은 MAPS 복합체 내로의 포함에 의해 신장될 수 있다. 본원에 사용되는 특이적 항원들은 실온과 적어도 1 사이클의 동결 해동에 있어서 안정성을 나타내었다. 이는 "저온 유통 체계(cold chain)"가 조심스럽게 유지되지 않으면 위태로워지는 현재의 백신보다 나은 유리한 점을 제공한다.
따라서, 본 발명의 일 태양은 폴리머; 적어도 하나의 단백질 또는 펩티드 항원; 및 상기 폴리머와 결합하는 제1 친화성 분자, 및 상기 단백질 또는 펩티드 항원과 결합하는 상보적 친화성 분자를 포함하는 적어도 하나의 상보적 친화성-분자 쌍;을 포함하며, 상기 제1 친화성 분자가 상기 상보적 친화성 분자와 결합할 때, 간접적으로 상기 폴리머에 상기 항원을 연결하는, 면역성 조성물에 관한 것이다.
일부 실시형태에서, 상기 제1 친화성 분자는 상기 폴리머에 가교제에 의해 가교되며, 가교제는 예를 들면 CDAP(1-시아노-4-디메틸아미노피리디늄 테트라플루오로보레이트), EDC(1-에틸-3-[3-디메틸아미노프로필] 카보디이미드 하이드로클로라이드), 소듐 시아노보로하이드라이드; 시아노겐 브로마이드; 또는 암모늄 바이카보네이트/아이오도아세트산에서 선택된다. 일부 실시형태에서, 상기 제1 친화성 분자는 상기 폴리머의 카복시, 히드록시, 아미노, 페녹시, 헤미아세탈, 및 머캅토 작용기에 가교된다. 일부 실시형태에서, 상기 제1 친화성 분자는 상기 폴리머에 공유적으로 결합된다.
일부 실시형태에서, 상기 제1 친화성 분자는 비오틴 또는 그 유도체이고, 또는 비오틴과 유사한 구조 또는 물성을 갖는 분자로서, 예를 들면, 아민-PEG3-비오틴((+)-비오틴화-3,6,9-트리옥사운데칸디아민) 또는 그 유도체이다.
일부 실시형태에서, 상기 면역성 조성물의 단백질 또는 펩티드 항원은 상기 상보적 친화성 결합 분자에 융합된 항원성 단백질 또는 펩티드를 포함하는 융합 단백질이다. 상기 융합은 유전적 구성체, 즉, 재조합 융합 펩티드 또는 단백질일 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원은 상기 상보적 친화성 분자에 융합 단백질로서 공유적으로 부착될 수 있다. 대안적 실시형태에서, 항원은 상기 상보적 친화성 분자에 비공유적으로 부착될 수 있다.
일부 실시형태에서, 상기 상보적 친화성 분자는 비오틴-결합 단백질 또는 그 유도체 또는 기능성 부분(functional portion)이다. 일부 실시형태에서, 상보적 친화성 분자는 아비딘-유사 단백질 또는 그 유도체 또는 기능성 부분이며, 예로서 리즈아비딘 또는 그 유도체를 들 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 일부 실시형태에서, 상보적 친화성 분자는 아비딘(avidin) 또는 스트렙트아비딘(streptavidin) 또는 그 유도체 또는 기능성 부분이다.
일부 실시형태에서, 분비 시그널 펩티드는 아비딘-유사 단백질의 N-말단에 위치한다. 당업자에게 알려진 임의의 시그널 서열이 사용될 수 있으며; 일부 실시형태에서, 상기 시그널 서열은 MKKIWLALAGLVLAFSASA(서열번호 1) 또는 그 유도체 또는 기능성 부분이다. 일부 실시형태에서, 상기 항원은 플렉서블 링커 펩티드를 통해 상보적 친화성 분자에 융합될 수 있으며, 상기 플렉서블 링커 펩티드는 상기 상보적 친화성 분자에 상기 항원을 부착한다.
일부 실시형태에서, 면역성 조성물의 폴리머 성분은 살아있는 유기체에서 유래한 폴리머(예: 폴리사커라이드)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리머는 천연 공급원으로부터 정제 및 단리되거나, 또는 천연 조성/구조를 갖도록 합성되거나, 또는 합성(예: 인공적 조성/구조로) 폴리머일 수 있다. 일부 실시형태에서, 폴리머는 세균(bacteria), 고세균(archaea), 또는 진균 같은 진핵 세포, 곤충, 식물, 또는 그 키메라로 이루어지는 군에서 선택된 유기체에 유래하며: 일부 실시형태에서, 상기 폴리머는 병원성 세균에서 유래한 폴리사커라이드이다. 특정 실시형태에서 상기 폴리사커라이드는 폐렴구균 피막 폴리사커라이드(pneumococcal capsular polysaccharide), 폐렴구균 세포-벽 폴리사커라이드(pneumococcal cell-wall polysaccharide), 또는 장티푸스균 Vi 폴리사커라이드(Salmonella typhi Vi polysaccharide)이다.
일부 실시형태에서, 본원에 개시된 면역성 조성물의 폴리머는 분지쇄 폴리머(예: 분지된 폴리사커라이드), 또는 대안적으로 직쇄 폴리머(예: 단쇄 폴리머(예: 폴리사커라이드))일 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 폴리머는 폴리사커라이드, 예를 들면, 덱스트란(dextran) 또는 그 유도체이다. 일부 실시형태에서, 폴리머(예: 덱스트란 폴리사커라이드)는 평균 분자량 425kD∼500kDa(일체를 포함)일 수 있고, 또는 일부 실시형태에서, 500kDa를 초과할 수 있다. 일부 실시형태에서, 폴리머(예: 덱스트란 폴리사커라이드)는 평균 분자량 60kD∼90kDa(일체를 포함)일 수 있고, 또는 일부 실시형태에서, 70 kDa 미만일 수 있다. 덱스트란 폴리머는 세균, 예컨대 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides)로부터 유래한 것일 수 있다.
일부 실시형태에서, 본원에 개시된 면역성 조성물은 적어도 2개의 항원, 또는 적어도 3개의 항원, 또는 적어도 5개의 항원, 또는 2∼10개의 항원, 또는 10∼15개의 항원, 또는 15∼20개의 항원, 또는 20∼50개의 항원, 또는 50∼100개의 항원, 또는 100개 초과의 항원(일체를 포함)을 포함할 수 있다. 본원에 개시된 면역성 조성물이 적어도 2개의 항원을 포함하는 일부 실시형태에서, 항원은 동일한 항원일 수도 있고 또는 적어도 2개의 상이한 항원일 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원은 동일 또는 상이한 병원체로부터 유래할 수 있으며, 또는 동일한 항원성 단백질의 다른 에피토프 또는 일부일 수 있으며, 또는 동일한 병원체의 상이한 혈청형 또는 계절성 변이형(예: 인플루엔자 바이러스 A, B, 및 C)에 특이적인 동일 항원일 수도 있다
일부 실시형태에서, 본원에 개시된 면역성 조성물은 병원성 유기체 또는 이상 조직으로부터의 항원을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 항원은 종양 항원이다. 일부 실시형태에서, 상기 항원은 병원체 또는 기생생물의 항원, 예컨대 폐렴연쇄구균(Streptococcus pneumoniae), 결핵균(Mycobacterium tuberculosis) 또는 M. 테타누스(M. tetanus), 탄저균(Bacillus anthracis), HIV의 항원, 계절성 또는 유행성 인플루엔자 항원(예컨대 H1N1 또는 H5N1), 백일해균(Bordetella pertussis), 황색포도구균(Staphylococcus aureus), 수막염균(Neisseria meningitides) 또는 임균(N. gonorrhoeae), HPV, 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis), HSV 또는 다른 헤르페스 바이러스, 또는 말라리아원충 종(Plasmodia sp.)의 항원에서 선택되는 적어도 하나의 항원일 수 있다. 이들 항원에는 펩티드, 단백질, 글리코단백질, 또는 폴리사커라이드가 포함될 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 항원은 톡소이드(toxoid) 또는 독소의 일부이다.
일부 실시형태에서, 본원에 개시된 면역성 조성물은 항원성 폴리사커라이드, 예를 들면, 예컨대 Vi 항원(장티푸스균 피막 폴리사커라이드(Salmonella typhi capsular polysaccharide)), 폐렴구균 피막 폴리사커라이드(pneumococcal capsular polysaccharide), 폐렴구균 세포벽 폴리사커라이드(pneumococcal cell wall polysaccharide), Hib(헤모필루스 인플루엔자 B형(Haemophilus influenzae type B) 피막 폴리사커라이드, 수막구균 피막 폴리사커라이드(meningococcal capsular polysaccharides), 탄저균(Bacillus anthracis)(탄저병의 원인 병원체)의 폴리사커라이드 및 다른 세균 피막 또는 세포벽 폴리사커라이드, 또는 그들의 임의의 조합을 포함한다. 상기 폴리사커라이드는 단백질 성분, 예컨대 바이러스로부터의 글리코단백질을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본원에 개시된 면역성 조성물은 폴리머 또는 폴리사커라이드와 결합된 적어도 하나의 공자극인자를 더 포함하며, 상기 공자극인자는 직접적으로 또는 간접적으로 결합될 수 있다. 예를 들면, 일부 실시형태에서, 공자극인자는 상기 폴리머에 공유적으로 부착될 수 있다. 예를 들면, 일부 실시형태에서, 공자극인자는 상기 제1 친화성 분자에 공유적으로 부착되고, 그 제1 친화성 분자가 그리고나서 상기 폴리머에 가교될 수 있다. 예를 들면, 일부 실시형태에서, 공자극인자는 상보적 친화성 분자에 부착되고, 그 상보적 친화성 분자가 제1 친화성 분자와 결합하여 상기 폴리머에 상기 공자극인자를 연결할 수 있다. 일부 실시형태에서, 공자극인자는 보강제이다. 대안적 실시형태에서, 공자극인자는 당업자에게 알려진 임의의 것일 수 있으며, 임의의 조합, 예를 들면, 제한 없이, 톨 유사 수용체 작용제들(TLR2, 3, 4, 5 7, 8, 9, 등에 대한 작용제들), NOD 작용제들, 또는 염증조절복합체의 작용제들이 포함될 수 있다.
본 발명의 다른 태양은 본원에 개시된 면역성 조성물의, 대상체에 투여되어 그 대상체에서 면역 반응을 끌어내는 용도에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 상기 면역 반응은 항체/B 세포 반응, CD4+ T-세포 반응(Th1, Th2 및 Th17 세포를 포함) 및/또는 CD8+ T-세포 반응이다. 일부 실시형태에서, 상기 면역성 조성물과 함께 적어도 하나의 보강제가 투여된다.
본 발명의 다른 태양은 본원에 개시된 면역성 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 적어도 하나의 항원에 대하여 대상체에서 면역 반응을 유도하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 다른 태양은 본원에 개시된 면역성 조성물을 포함하는 백신 조성물을 투여하는 단계를 포함하는. 적어도 하나의 항원에 대해, 동물, 예를 들어, 조류, 포유류 또는 인간을 백신접종하는 방법에 관한 것이다.
본원에 개시된 모든 태양에서, 동물 또는 대상체는 인간일 수 있다. 일부 실시형태에서, 대상체는 농가 동물 또는 비가축, 또는 가축일 수 있다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 면역성 조성물을 포함하는 백신 조성물은 피하, 비강내, 경구, 설하, 질, 직장, 진피내, 복강내, 또는 근육내 주사를 통해 또는 경피 면역 부여를 위한 피부 패치를 통해 투여될 수 있다.
본원에 개시된 모든 태양에서, 면역 반응은 단백질/펩티드 항원(들)에 대한 항체/B-세포 반응, CD4+ T-세포 반응(Th1, Th2 및 Th17 반응을 포함) 또는 CD8+ T-세포 반응이다. 일부 실시형태에서, 면역 반응은 폴리머, 예를 들어, 폐렴구균 폴리사커라이드에 대한 항체/B-세포 반응이다. 일부 실시형태에서, 상기 면역성 조성물과 함께 적어도 하나의 보강제가 투여된다 .
본 발명의 다른 태양은 본원에 개시된 면역성 조성물의 병원체 또는 면역원에의 노출에 대한 진단에 사용하기 위한 용도에 관한 것이다.
본 발명의 다른 태양은 본원에 개시된 면역성 조성물을 제조하기 위한 키트에 관한 것이다. 예를 들면, 그러한 키트는 다음의 재료들의 1 이상을 포함할 수 있다: 복수의 제1 친화성 분자와 가교된 폴리머(예, 폴리사커라이드)를 포함하는 용기; 및 상기 제1 친화성 분자와 결합하는 상보적 친화성 분자를 포함하는 용기로서, 상기 상보적 친화성 분자는 항원과 결합한다.
다른 실시형태에서, 상기 키트는 폴리머(예: 폴리사커라이드)를 포함하는 용기, 복수의 제1 친화성 분자를 포함하는 용기, 및 상기 폴리머에 상기 제1 친화성 분자를 가교하기 위한 가교 분자를 포함하는 용기를 포함할 수 있다 .
일부 실시형태에서, 상기 키트는 폴리머에 첨가될 수 있는 적어도 하나의 공자극인자를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 키트는 상기 폴리머 또는 폴리사커라이드에 상기 공인자를 연결하기 위한 가교제, 예를 들면, CDAP(1-시아노-4-디메틸아미노피리디늄 테트라플루오로보레이트), EDC(1-에틸-3-[3-디메틸아미노프로필]카보디이미드 하이드로클로라이드), 소듐 시아노보로하이드라이드; 시아노겐 브로마이드; 암모늄 바이카보네이트/아이오도아세트산을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다. 일부 실시형태에서, 상기 키트는 단백질 또는 펩티드 항원에 상기 상보적 친화성 분자를 부착하는 수단을 더 포함하며, 상기 수단은 가교제에 의한 것일 수도 있고 또는 어떤 중개 융합 단백질에 의한 것일 수도 있다.
일부 실시형태에서, 상기 키트는 단백질 또는 펩티드 항원-부착성 분자 융합 단백질을 발현하기 위한 발현 벡터, 예를 들면, 상보적 부착성 분자와의 융합 단백질로서 상기 단백질 또는 펩티드 항원을 발현하기 위한 발현 벡터를 포함하는 용기를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 벡터는 임의로 링커 펩티드에 대한 서열을 포함할 수 있으며, 상기 발현 벡터는 상기 항원과 상기 친화성 분자 사이에 위치한 링커 펩티드를 포함하는 항원-상보적 친화성 분자 융합 단백질을 발현할 수 있다.
일부 실시형태에서, 상기 키트는 임의로 제1 친화성 분자와 결합하는 상보적 친화성 분자를 포함하는 용기를 포함할 수 있으며, 상기 상보적 친화성 분자는 펩티드/단백질 항원과 결합한다. 일부 실시형태에서, 상기 키트는 부가적으로 상기 항원에 상기 상보적 친화성 분자를 부착하는 수단(예, 본원에 개시된 가교제 또는 다른 중개 단백질, 예컨대 2가 항체 또는 항체 단편을 사용하는)을 더 포함할 수 있다.
본 명세서에는 또한 대상체, 예, 포유류, 예, 인간을, 본원에 개시된 면역성 조성물로 백신 접종하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 상기 대상체에 본원에 개시된 백신 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
도 1은 다항원 제시 시스템(MAPS)의 개요도. MAPS는 복잡한 면역성 조성물의 신규한 플랫폼이며, 친화성 쌍, 예컨대 아비딘-비오틴 쌍의 안정한 상호작용을 통해 폴리사커라이드 또는 폴리사커라이드 항원에 다수의 단백질 항원을 부착함으로써 만들어진다. MAPS 복합체의 일 실시형태에서, 하나의 또는 상이한 병원체들로부터의 단백질 항원들은 아비딘-유사 단백질에 재조합적으로 융합되어 대장균에서 발현된다. 다양한 병원체들로부터 선택될 수 있는 폴리사커라이드 골격이, 활성화제로서 1-시아노-4-디메틸아미노피리디늄 테트라플루오로보레이트(CDAP) 또는 1-에틸-3-[3-디메틸아미노프로필] 카보디이미드 하이드로클로라이드(EDC)를 사용하여 공자극인자들과 함께 또는 공자극인자들 없이 비오틴화 및/또는 가교화된다. MAPS 복합체는 비오틴화 폴리사커라이드와 함께 원하는 비율로 하나 또는 다수의 정제된 융합 항원들을 단지 혼합하고 인큐베이팅함으로써 용이하게 조립될 수 있다. 조립된 MAPS 복합체는 젤 여과 크로마토그래피에 의해 크기에 따라 정제/분리될 수 있다.
도 2는 폴리사커라이드의 비오틴화의 전형적 예를 나타내며; 비오틴 유도체인 아민-PEG3-비오틴((+)비오틴화-3,6,9-트리옥사운데칸디아민으로도 알려져 있음)의 구조; CDAP의 구조; 및 EDC의 구조이다. 도 2는 또한 활성화제로서 CDAP를 사용하거나(과정(1)) 또는 활성화제로서 EDC를 사용하는(과정(2)) 폴리사커라이드의 비오틴화 방법의 개요도이다. 비오틴화의 다른 과정들은 본 발명의 방법에 포함된다.
도 3의 A-C는 재조합 리즈아비딘 및 리즈아비딘-항원 융합 단백질의 실시형태를 나타낸다. 도 3의 A는 변형(modified) 리즈아비딘(위) 및 리즈아비딘-항원 융합 단백질(아래)의 구성의 개요도. 모든 구성체는 PET21b 벡터로 클로닝되고 발현을 위해 대장균 BL21(DE3) 주로 형질전환되었다. 도 3의 B는 정제된 재조합 리즈아비딘(rRhavi)의 SDS-PAGE, 도 3의 C는 정제된 rhavi-항원 융합 단백질의 SDS-PAGE. 레인 1, rhavi-Pdt; 레인 2, rhavi-PsaA; 레인 3, rhavi-sp1733; 레인 4, rhavi-sp1534; 레인 5, rhavi-sp0435; 레인 6, rhavi-sp1458; 레인 7, rhavi-ESAT-6/Cfp10; 레인 8, rhavi-TB9.8/TB10.4; 레인 9, rhavi-MPT64; 레인 10, rhavi-MPT83.
도 4a-4c는 MAPS 조립 예의 용출 프로파일. 도 4a: MAPS는 4℃에서 하룻밤동안 1 mg의 비오틴화 덱스트란 90(BD90, 평균 MW 60-90 KD)과 함께 0.5 mg의 정제된 rRhavi를 인큐베이팅함으로써 조립되고 그리고나서 superdex-200 칼럼에 가해졌다. 피크 A와 피크 B는 MAPS 복합체를 함유하는 용출 분획을 가리키고 피크 C는 유리 rRhavi를 함유하는 용출 분획을 가리켰다. 도 4b는 피크 분획들의 SDS-PAGE. 모든 샘플들은 10 mM DTT와 함께 SDS 샘플 완충액에서 끓였다. 도 4c는 MAPS 복합체의 안정성을 나타낸다. 동량의 샘플들이 처리 후에 SDS-PAGE에 가해졌다. MAPS 복합체는 환원제를 함유하는 SDS 샘플 완충액 처리 후에도 온전한 채로 있으며(레인 1) 결합의 안정성에 대한 시험에서, 끓인 후에만 파괴될 수 있다. 레인 1, 10 mM DTT를 함유하는 SDS 샘플 완충액으로 처리된 MAPS, 실온 10분간; 레인 2, DTT 없는 SDS 샘플 완충액으로 처리된 MAPS, 10분간 끓임; 레인 3, 10 mM DTT를 함유하는 SDS 샘플 완충액으로 처리된 MAPS, 10분간 끓임.
도 5는 다른 온도 및 다른 농도의 PS 및 단백질 항원에서의 MAPS 복합체 조립(assembly)을 나타낸다. MAPS 복합체는 광범위의 농도의 폴리사커라이드(PS) 또는 단백질 항원(0.1 mg/ml의 저농도)에서 효과적으로 조립될 수 있다. 그 조립은 항원의 안정성에 따라 4℃(도 5의 A) 또는 25℃(도 5의 B)에서의 하룻밤동안의 인큐베이션에 의해 행하여질 수 있다. MAPS 복합체의 조립 효율은 미리 샘플을 끓이거나 또는 끓이지 않고 SDS-PAGE를 통해 조립 혼합물을 흐르게 함으로써 측정될 수 있다. 끓임 처리 없이는, MAPS 복합체에 도입된 단백질 항원들은 PS에 머무르며 따라서 젤(MAPS/PS) 상에 매우 고분자량의 밴드들로서 나타난다; 결합되지 않은 단백질들만 젤의 하부로 흘러 그 항원의 예상 분자량에서(단량체 또는 2량체 위치) 검출될 것이다. 끓이기 전후의 단백질 항원 밴드의 비교에 의해, MAPS 복합체로 조립된 항원들의 백분율이 어림될 수 있다. 일반적으로 4℃에서의 조립 효율은 85%보다 크며, 25℃에서는 95% 내지 99%에 근접한다.
도 6은 단백질 대 폴리사커라이드의 비율을 달리하여 조립된 MAPS의 용출 프로파일. 0.5 mg의 정제된 rRhavi를 각각 1 mg, 0.5 mg 또는 0.1 mg의 BD90 중 어느 하나와 함께 하룻밤동안 인큐베이션하고, 그리고나서 superdex 200 칼럼을 사용하는 젤 여과 크로마토그래피를 행하였다. 더 높은 비율의 단백질 대 폴리사커라이드로 조립된 MAPS 복합체가 더 낮은 비율로 조립된 것에 비해 더 높은 분자량을 갖는 것으로 나타났다. 각 샘플에 대한 MAPS 복합체를 함유하는 피크 분획들(화살표로 나타냄)을 수집하였다. 정제된 MAPS 복합체에서의 단백질 대 폴리사커라이드의 비율을 측정하였으며 입력 비율에 대한 양호한 상관 관계를 나타내었다.
도 7은 다양한 크기의 폴리사커라이드와 조립된 MAPS의 용출 프로파일. 0.5 mg의 융합 항원이 평균 분자량 425-500 KD(BD500), 150 KD(BD150) 또는 60-90 KD(BD90)의 비오틴화 덱스트란 0.25 mg과 함께 인큐베이션되었다. 그 MAPS 복합체를 Superpose 6 칼럼를 사용하여 분리하였으며; 그 크로마토그래피 프로파일은 더 큰 폴리사커라이드와 조립된 복합체의 크기가 더 큼을 나타내었다.
도 8의 A-D는 다수의 항원들과의 MAPS 조립을 나타낸다. 도 8의 A는 상이한 비율에 의한 2개의 항원들과의 MAPS 조립을 나타낸다. 2가 MAPS 복합체는 1:4, 1:2, 1:1, 2:1, 또는 4:1의 몰 비율로 혼합된 두개의 상이한 폐렴구균 융합 항원 rhavi-1652 및 rhavi-0757와 함께 비오틴화 폐렴연쇄구균(SP) 혈청형14 피막 폴리사커라이드를 인큐베이션함으로써 제조되었다. SDS-PAGE는 MAPS 복합체에 도입된 각 항원의 양들이 입력 비율에 양호하게 상관됨을 나타내었다. 도 8의 B-D는 2개(2V, 도 8의 B), 3개(3V, 도 8의 C) 또는 5개(5V, 도 8의 D)의 상이한 폐렴구균 및/또는 결핵 항원들을 접속하는(connecting) 비오틴화 폴리사커라이드(덱스트란, 또는 혈청형 3 폐렴구균 피막 폴리사커라이드)에 의해 제조된 다가 MAPS 복합체를 나타낸다. SDS-PAGE는 항원들이 MAPS 복합체에 도입되었음을 나타내었다. 모든 샘플은 10 mM DTT를 갖는 SDS 샘플 완충액에서 끓였다.
도 9는 MAPS 복합체에 의한 면역 부여가 폴리사커라이드 항원들에 대한 강한 항체 반응을 유도한 것을 나타낸다. 비오틴화 덱스트란(9의 A), Vi 폴리사커라이드(9의 B), 또는 폐렴구균 세포벽 폴리사커라이드(CWPS)(9의 C)으로부터 제조된 MAPS 복합체에 의해 면역 부여된 마우스들은 보강제 단독(Ag 없음("No Ag")) 또는 커플링되지 않은 폴리사커라이드와 단백질의 혼합물("혼합물")을 받은 동물 그룹에 비해 유의하게 더 많은 양의 항-폴리사커라이드 항체를 만들었다. 도 9의 D-F는 MAPS 복합체가 항-PS Ab의 생성에 있어서 통상의 콘쥬게이트 백신에 비해 손색이 없음을 나타낸다. MAPS 복합체들은 5개의 단백질 항원들이 로딩된, SP 혈청형 1, 5, 14 피막 폴리사커라이드(CPS)로부터 제조되었다. 마우스들은, 2주 간격을 두고 2회, MAPS 또는 Prevnar® 13(폐렴구균 13-가 콘쥬게이트 백신[디프테리아 CRM197 단백질]; Wyeth/Pfizer)(PCV13)에 의해 피하로 면역 부여되었으며, 백신 접종된 혈청형 CPS에 대한 혈청 IgG 항체는 ELISA에 의해 두번째 면역 부여로부터 2주 후에 분석되었다. PCV13 면역 부여된 마우스들에서의 항-CPS IgG의 역가는 비교를 위해 1200 단위(unit)로 임의로 세팅되었다. 모든 시험된 혈청형에 대해, MAPS 복합체에 의한 면역 부여는 PCV13에 의한 백신 접종에 의해 생성된 것과 유사한 수준(혈청형 5) 또는 더 큰 수준의 항-CPS IgG 항체(혈청형 1 및 혈청형 14)를 생성하였다. 혈청형 1(도 9의 D); 혈청형 5(도 9의 E); 혈청형 14(도 9의 F).
도 10은 면역 부여 용량을 달리하여 MAPS에 의해 유도된 항-PS 항체를 비교한다. MAPS 복합체는 5개의 단백질 항원이 로딩된 혈청형 5 SP CPS로부터 제조되었다. 마우스들에는, 2주 간격으로 2회, 투여량(dose)당 1㎍∼16㎍의 PS 양으로 MAPS 복합체가 주어졌다. 두번째 면역 부여로부터 2주 후 혈청형 5 CPS에 대한 혈청 항체가 측정되고 다른 면역부여 그룹들과 비교되었다. 모든 투여량에서, MAPS에 의한 면역 부여는 혈청형 5 CPS에 대한 강력한 IgG 항체를 유도하였다. 투여량 당 2 ㎍의 PS의 부여는 가장 높은 항체 역가를 생성하였고, PS 투여량의 16 ㎍까지의 증가는 항체 역가를 약 4배 감소시켰다.
도 11은 MAPS 복합체에 의한 면역 부여에 의해 생성된 항-PS 항체가 생체외에서 표적 병원체들의 살해를 촉진함을 나타낸다. 도 11a는 Vi-발현 세균의 항체-매개 살해를 증명한다. MAPS 복합체(골격으로서 Vi를 사용)에 의해 면역 부여된 동물로부터의 혈청은 1시간의 인큐베이션 내에 Vi-발현 주의 강력한 살해를 나타냈지만(90% 초과의 살해), 2개의 다른 그룹들은 그렇지 않았다. Alum(점선); 혼합물(흑색선); 또는 MAPS(회색선)에 의해 면역 부여된 마우스들로부터의 혈청. 도 11b-11d는 MAPS-면역 부여된 마우스들로부터의 혈청의 옵소닌작용 살해 활성이 허가된 백신 PCV13에 의해 면역 부여된 마우스들로부터의 혈청의 그 살해 활성에 비해 손색이 없음을 증명한다. 호중구에 의한 폐렴구균의 생체외 옵소닌작용 살해를 매개함에 있어서의 PCV13- 또는 MAPS-면역 부여된 마우스들로부터의 혈청의 능력이 분석 및 비교되었다. 인간 호중구는 HL-60 세포 주의 세포들로부터 분화되었다. 옵소닌작용 살해는 37℃에서 1시간 동안 혈청형 1(도 11b), 혈청형 5(도 11c) 또는 혈청형 13(도 11d), 폐렴구균 및 분화된 HL-60 세포들과 함께, 희석비를 달리하여, 혈청을 인큐베이션함으로써 행해졌다(아기 토끼 보체의 존재 하에). 혼합물의 부분 표본(aliquot)이 생존 세균의 계수를 위해 인큐베이션 후에 플레이팅되었다. 옵소닌작용 살해 단위(unit)는 세균의 50% 살해가 관찰되는 혈청의 배수 희석(fold dilution)으로서 정의되었다. 모든 시험된 혈청형들에 대해, MAPS 면역 부여된 마우스들로부터의 혈청은 PCV13 면역 부여된 마우스들로부터의 혈청보다 적어도 4배 더 높은 살해 활성(OPA 역가)를 나타냈다. 도 11b-11d: Alum(점선); PCV13(흑색선); 또는 MAPS(회색선)에 의해 면역 부여된 마우스들로부터의 혈청.
도 12a-12d는 MAPS 복합체에 의한 면역 부여가 단백질 항원에 대해 강력한 항체 및 세포 반응을 유도함을 증명한다. 2가 MAPS 복합체가 비오틴화 덱스트란(BD500) 및 두 폐렴구균 항원, rhavi-Pdt 및 rhavi-PsaA로부터 제조되었다. 피하 백신 접종이 격주로 3회 주어졌다. 도 12a는 최종 면역 부여로부터 2주 후 PsaA 또는 Pdt 2에 대해 측정된 혈청 IgG 항체의 결과를 나타낸다. MAPS 복합체에 의해 면역 부여된 마우스들은 상기 혼합물을 받은 마우스들보다 유의하게 더 높은 역가의 항-Pdt 및 항-PsaA 항체를 만들었다. 항원 특이적 T-세포 반응은 면역 부여된 동물의 전혈의 생체 외 자극에 의해 평가되었다. IL-17A(도 12b) 및 IFN-γ (도 12c)의 체외 생산이 정제된 PsaA, Pdt, 또는 폐렴구균 전체-세포 항원(WCA) 중 어느 하나와 함께 6일간 인큐베이션된 혈액 샘플들에서 측정되었다. 혼합물에 의해 면역 부여된 마우스들에 비해, MAPS 복합체를 받은 동물은 유의하게 더 강한 IL-17A 및 IFN-γ 반응을 나타내었다. 도 12d는 WCA의 자극에 의한 IL-17A 및 IFN-γ 생산의 상관관계를 나타낸다. 모든 패널에 대하여, 막대(bars)는 표준 편차와 함께 평균을 나타내고 통계 분석은 Mann-Whitney 테스트, 또는 상관관계에 대해 Spearman R을 사용하여 수행되었다.
도 13은 상이한 크기들의 MAPS 복합체의 면역성의 평가를 나타낸다. MAPS 복합체들은 두 폐렴구균 융합 항원, rhavi-PsaA 및 rhavi-Pdt로부터, 골격으로서 상이한 길이의 덱스트란을 사용하여(BD500, Mw 425-500 kDa; BD90, Mw 60-90 kDa), 제조되었다. 덱스트란에 대한, 및 두 단백질 항원 PdT 및 PsaA에 대한, 항체 반응들뿐만 아니라 항원 특이적 T-세포 반응들이, 3회의 면역 부여 후에 측정 및 비교되었다. 도시된 바와 같이, 더 큰 복합체(MAPS BD500)에 의해 면역 부여된 마우스들은 더 작은 복합체(MAPS BD90)를 받은 동물들과 유사한 수준의 항-PsaA 및 항-Pdt 항체를 생성하였으나(도 13의 B), 보다 유의하게 더 높은 역가의 항-덱스트란 항체(도 13의 A)와 IL-17A 관련 T-세포 반응(도 13의 C)을 생성하였다.
도 14는 MAPS 복합체들에 대한 공자극인자들(TLR 리간드들)의 부가는 IL-17A 및 IFN-γ 관련 T-세포 반응들을 촉진함을 나타낸다. MAPS 복합체들은, 추가의 TLR 리간드/작용제: rhavi-Pdt, TLR4 리간드; Pam3CSK4, TLR2 작용제와 함께 또는 이들 없이, 비오틴화 덱스트란 및 하나의 폐렴구균 단백질 항원, rhavi-0435로부터 제조되었다. rhavi-Pdt의 도입은 rhavi 및 비오틴 사이의 친화성 상호작용을 통하는 반면, Pam3CSK4 는 덱스트란 골격에 공유적으로 연결된다. 면역 부여는 3회 피하로 주어졌으며, 0435 단백질에 대한 T-세포 반응들이 측정되고 비교되었다. TLR2 작용제 또는 TLR4와 TLR2 리간드들의 조합의 첨가는 단백질 항원에 대한 IL-17A 및 IFN-γ 관련 T-세포 반응들을 유의하게 증진하였음을 나타낸다.
도 15는 다가 폐렴구균/결핵균(Mycobacterium tuberculosis)(TB) 조합 백신의 예를 나타낸다. 다가 SP/TB 조합 MAPS 백신이 SP 혈청형 3의 사용과 하나의 SP 단백질(페렴구균 용혈소 톡소이드, Pdt) 및 6개의 TB 단백질의 로딩에 의해 제조되었다(4개의 융합 구성체(construct) 내에)(도 15a). SP/TB MAPS에 의한 마우스들의 면역 부여는 3형 CPS(도 15b, 좌측 패널) 뿐만 아니라 Pdt(도 15b, 우측 패널)에 대하여 더 큰 역가의 IgG 항체를 유도하였으며, 혈청형 3 폐렴구균의 치사적 폐감염으로부터 마우스들을 100% 방어하였다(도 15c). 도 15d-15j는 SP/TB MAPS에 의한 백신 접종에 의해 유도된 B-세포 및 T-세포 면역 B 항원들을 나타낸다. 도 15d는 상이한 TB 단백질 항원들에 대한 항체 반응들을 나타낸다. 도 15e-15f는 정제된 TB 단백질 항원들에 의한 생체외 자극 후 MAPS 면역 부여된 마우스들로부터의 전혈 샘플에서의 강한 IL-17A(도 15e) 및 IFN-γ(도 15f) 관련 T-세포 반응들을 나타낸다. 도 15gh는 정제된 TB 단백질 항원들의 혼합물에 대하여 또는 TB 전 세포 추출물에 대하여 MAPS 면역 부여된 동물들로부터의 비장 세포의 IL-17A(도 15gh의 G) 및 IFN-γ(도 15gh의 H) 관련 T세포 반응들을 나타낸다. 도 15i 및 15j는 MAPS에 의한 면역 부여에 의해 유도된 TB-특이적 기억/효과자 T-세포에 관한 데이터를 더 제공한다. 결과는 CD4+ T세포의 고갈이 TB 항원 특이적 시토킨 생산에 유의한 영향을 미치나 CD8+ T-세포는 그렇지 않음을 보여주었으며, 이는 MAPS 백신에 의한 면역 부여가 주로 CD4+ T세포(T 헬퍼 세포) 면역 반응을 준비한 것임을 가리킨다.
도 16은 원형(prototype) MAPS-기반 다가 면역성 조성물이 폐렴구균의 침습성 감염 및 비강인두 콜로니화를 예방함을 증명한다. 다가 SP MAPS는 골격으로서 SP 세포벽 폴리사커라이드(CWPS)를 사용하여 제조되었으며 5개의 폐렴구균 단백질 항원들이 로딩되었다(도 16a). 마우스들은, 2주 간격으로 3회, 이 SP MAPS에 의해 면역 부여되었으며, 폐렴구균에 대한 혈청 항체들 및 특이적 T세포 반응들이 최종 면역 부여로부터 2주 후에 분석되었다. 도 16b는 CWPS(좌측 패널) 또는 폐렴구균 전 세포 항원(WCA)(우측 패널)에 대한 혈청 IgG 항체를 나타낸다. SP MAPS에 의해 면역 부여된 마우스들은 보강제 단독(Ag 없음("No Ag")) 또는 커플링되지 않은 PS/단백질 혼합물("혼합물")을 받은 대조 그룹들에서의 마우스들보다 CWPS 또는 WCA 어느 쪽에 대해 유의하게 더 높은 역가의 항체를 만들었다. 도 16c 및 16d는 SP MAPS에 의한 백신 접종에 의해 유도된 SP-특이적 T세포 반응들을 나타낸다. 상이한 면역 부여 그룹들로부터의 마우스들의 말초 혈액이 정제된 폐렴구균 단백질들(항원 혼합) 또는 WCA에 의해 자극되었다. MAPS 백신 접종된 마우스들로부터의 세포는 SP 항원에 크게 반응하여 IL-17A(도 16c) 및 IFN-γ(도 16d)를 강하게 생산하였으나 대조 그룹들로부터의 세포는 그렇지 않았다. 도 16e 및 16f는 MAPS 복합체에 의한 백신 접종이 마우스들을 폐렴구균의 침습성 감염 뿐만 아니라 비강인두 콜로니화로부터 방어함을 나타낸다. 다른 면역 부여 그룹들의 마우스들이 폐흡인 모델에서의 SP 혈청형 3 주 WU2 (도 16e), 또는 비강 콜로니화 모델에서 혈청형 6 폐렴구균 주 603(도 16f)에 의해 시험되었다. 패혈증 또는 콜로니화에 대한 방어는 MAPS-면역 부여된 마우스들에서만 관찰되었다.
도 2는 폴리사커라이드의 비오틴화의 전형적 예를 나타내며; 비오틴 유도체인 아민-PEG3-비오틴((+)비오틴화-3,6,9-트리옥사운데칸디아민으로도 알려져 있음)의 구조; CDAP의 구조; 및 EDC의 구조이다. 도 2는 또한 활성화제로서 CDAP를 사용하거나(과정(1)) 또는 활성화제로서 EDC를 사용하는(과정(2)) 폴리사커라이드의 비오틴화 방법의 개요도이다. 비오틴화의 다른 과정들은 본 발명의 방법에 포함된다.
도 3의 A-C는 재조합 리즈아비딘 및 리즈아비딘-항원 융합 단백질의 실시형태를 나타낸다. 도 3의 A는 변형(modified) 리즈아비딘(위) 및 리즈아비딘-항원 융합 단백질(아래)의 구성의 개요도. 모든 구성체는 PET21b 벡터로 클로닝되고 발현을 위해 대장균 BL21(DE3) 주로 형질전환되었다. 도 3의 B는 정제된 재조합 리즈아비딘(rRhavi)의 SDS-PAGE, 도 3의 C는 정제된 rhavi-항원 융합 단백질의 SDS-PAGE. 레인 1, rhavi-Pdt; 레인 2, rhavi-PsaA; 레인 3, rhavi-sp1733; 레인 4, rhavi-sp1534; 레인 5, rhavi-sp0435; 레인 6, rhavi-sp1458; 레인 7, rhavi-ESAT-6/Cfp10; 레인 8, rhavi-TB9.8/TB10.4; 레인 9, rhavi-MPT64; 레인 10, rhavi-MPT83.
도 4a-4c는 MAPS 조립 예의 용출 프로파일. 도 4a: MAPS는 4℃에서 하룻밤동안 1 mg의 비오틴화 덱스트란 90(BD90, 평균 MW 60-90 KD)과 함께 0.5 mg의 정제된 rRhavi를 인큐베이팅함으로써 조립되고 그리고나서 superdex-200 칼럼에 가해졌다. 피크 A와 피크 B는 MAPS 복합체를 함유하는 용출 분획을 가리키고 피크 C는 유리 rRhavi를 함유하는 용출 분획을 가리켰다. 도 4b는 피크 분획들의 SDS-PAGE. 모든 샘플들은 10 mM DTT와 함께 SDS 샘플 완충액에서 끓였다. 도 4c는 MAPS 복합체의 안정성을 나타낸다. 동량의 샘플들이 처리 후에 SDS-PAGE에 가해졌다. MAPS 복합체는 환원제를 함유하는 SDS 샘플 완충액 처리 후에도 온전한 채로 있으며(레인 1) 결합의 안정성에 대한 시험에서, 끓인 후에만 파괴될 수 있다. 레인 1, 10 mM DTT를 함유하는 SDS 샘플 완충액으로 처리된 MAPS, 실온 10분간; 레인 2, DTT 없는 SDS 샘플 완충액으로 처리된 MAPS, 10분간 끓임; 레인 3, 10 mM DTT를 함유하는 SDS 샘플 완충액으로 처리된 MAPS, 10분간 끓임.
도 5는 다른 온도 및 다른 농도의 PS 및 단백질 항원에서의 MAPS 복합체 조립(assembly)을 나타낸다. MAPS 복합체는 광범위의 농도의 폴리사커라이드(PS) 또는 단백질 항원(0.1 mg/ml의 저농도)에서 효과적으로 조립될 수 있다. 그 조립은 항원의 안정성에 따라 4℃(도 5의 A) 또는 25℃(도 5의 B)에서의 하룻밤동안의 인큐베이션에 의해 행하여질 수 있다. MAPS 복합체의 조립 효율은 미리 샘플을 끓이거나 또는 끓이지 않고 SDS-PAGE를 통해 조립 혼합물을 흐르게 함으로써 측정될 수 있다. 끓임 처리 없이는, MAPS 복합체에 도입된 단백질 항원들은 PS에 머무르며 따라서 젤(MAPS/PS) 상에 매우 고분자량의 밴드들로서 나타난다; 결합되지 않은 단백질들만 젤의 하부로 흘러 그 항원의 예상 분자량에서(단량체 또는 2량체 위치) 검출될 것이다. 끓이기 전후의 단백질 항원 밴드의 비교에 의해, MAPS 복합체로 조립된 항원들의 백분율이 어림될 수 있다. 일반적으로 4℃에서의 조립 효율은 85%보다 크며, 25℃에서는 95% 내지 99%에 근접한다.
도 6은 단백질 대 폴리사커라이드의 비율을 달리하여 조립된 MAPS의 용출 프로파일. 0.5 mg의 정제된 rRhavi를 각각 1 mg, 0.5 mg 또는 0.1 mg의 BD90 중 어느 하나와 함께 하룻밤동안 인큐베이션하고, 그리고나서 superdex 200 칼럼을 사용하는 젤 여과 크로마토그래피를 행하였다. 더 높은 비율의 단백질 대 폴리사커라이드로 조립된 MAPS 복합체가 더 낮은 비율로 조립된 것에 비해 더 높은 분자량을 갖는 것으로 나타났다. 각 샘플에 대한 MAPS 복합체를 함유하는 피크 분획들(화살표로 나타냄)을 수집하였다. 정제된 MAPS 복합체에서의 단백질 대 폴리사커라이드의 비율을 측정하였으며 입력 비율에 대한 양호한 상관 관계를 나타내었다.
도 7은 다양한 크기의 폴리사커라이드와 조립된 MAPS의 용출 프로파일. 0.5 mg의 융합 항원이 평균 분자량 425-500 KD(BD500), 150 KD(BD150) 또는 60-90 KD(BD90)의 비오틴화 덱스트란 0.25 mg과 함께 인큐베이션되었다. 그 MAPS 복합체를 Superpose 6 칼럼를 사용하여 분리하였으며; 그 크로마토그래피 프로파일은 더 큰 폴리사커라이드와 조립된 복합체의 크기가 더 큼을 나타내었다.
도 8의 A-D는 다수의 항원들과의 MAPS 조립을 나타낸다. 도 8의 A는 상이한 비율에 의한 2개의 항원들과의 MAPS 조립을 나타낸다. 2가 MAPS 복합체는 1:4, 1:2, 1:1, 2:1, 또는 4:1의 몰 비율로 혼합된 두개의 상이한 폐렴구균 융합 항원 rhavi-1652 및 rhavi-0757와 함께 비오틴화 폐렴연쇄구균(SP) 혈청형14 피막 폴리사커라이드를 인큐베이션함으로써 제조되었다. SDS-PAGE는 MAPS 복합체에 도입된 각 항원의 양들이 입력 비율에 양호하게 상관됨을 나타내었다. 도 8의 B-D는 2개(2V, 도 8의 B), 3개(3V, 도 8의 C) 또는 5개(5V, 도 8의 D)의 상이한 폐렴구균 및/또는 결핵 항원들을 접속하는(connecting) 비오틴화 폴리사커라이드(덱스트란, 또는 혈청형 3 폐렴구균 피막 폴리사커라이드)에 의해 제조된 다가 MAPS 복합체를 나타낸다. SDS-PAGE는 항원들이 MAPS 복합체에 도입되었음을 나타내었다. 모든 샘플은 10 mM DTT를 갖는 SDS 샘플 완충액에서 끓였다.
도 9는 MAPS 복합체에 의한 면역 부여가 폴리사커라이드 항원들에 대한 강한 항체 반응을 유도한 것을 나타낸다. 비오틴화 덱스트란(9의 A), Vi 폴리사커라이드(9의 B), 또는 폐렴구균 세포벽 폴리사커라이드(CWPS)(9의 C)으로부터 제조된 MAPS 복합체에 의해 면역 부여된 마우스들은 보강제 단독(Ag 없음("No Ag")) 또는 커플링되지 않은 폴리사커라이드와 단백질의 혼합물("혼합물")을 받은 동물 그룹에 비해 유의하게 더 많은 양의 항-폴리사커라이드 항체를 만들었다. 도 9의 D-F는 MAPS 복합체가 항-PS Ab의 생성에 있어서 통상의 콘쥬게이트 백신에 비해 손색이 없음을 나타낸다. MAPS 복합체들은 5개의 단백질 항원들이 로딩된, SP 혈청형 1, 5, 14 피막 폴리사커라이드(CPS)로부터 제조되었다. 마우스들은, 2주 간격을 두고 2회, MAPS 또는 Prevnar® 13(폐렴구균 13-가 콘쥬게이트 백신[디프테리아 CRM197 단백질]; Wyeth/Pfizer)(PCV13)에 의해 피하로 면역 부여되었으며, 백신 접종된 혈청형 CPS에 대한 혈청 IgG 항체는 ELISA에 의해 두번째 면역 부여로부터 2주 후에 분석되었다. PCV13 면역 부여된 마우스들에서의 항-CPS IgG의 역가는 비교를 위해 1200 단위(unit)로 임의로 세팅되었다. 모든 시험된 혈청형에 대해, MAPS 복합체에 의한 면역 부여는 PCV13에 의한 백신 접종에 의해 생성된 것과 유사한 수준(혈청형 5) 또는 더 큰 수준의 항-CPS IgG 항체(혈청형 1 및 혈청형 14)를 생성하였다. 혈청형 1(도 9의 D); 혈청형 5(도 9의 E); 혈청형 14(도 9의 F).
도 10은 면역 부여 용량을 달리하여 MAPS에 의해 유도된 항-PS 항체를 비교한다. MAPS 복합체는 5개의 단백질 항원이 로딩된 혈청형 5 SP CPS로부터 제조되었다. 마우스들에는, 2주 간격으로 2회, 투여량(dose)당 1㎍∼16㎍의 PS 양으로 MAPS 복합체가 주어졌다. 두번째 면역 부여로부터 2주 후 혈청형 5 CPS에 대한 혈청 항체가 측정되고 다른 면역부여 그룹들과 비교되었다. 모든 투여량에서, MAPS에 의한 면역 부여는 혈청형 5 CPS에 대한 강력한 IgG 항체를 유도하였다. 투여량 당 2 ㎍의 PS의 부여는 가장 높은 항체 역가를 생성하였고, PS 투여량의 16 ㎍까지의 증가는 항체 역가를 약 4배 감소시켰다.
도 11은 MAPS 복합체에 의한 면역 부여에 의해 생성된 항-PS 항체가 생체외에서 표적 병원체들의 살해를 촉진함을 나타낸다. 도 11a는 Vi-발현 세균의 항체-매개 살해를 증명한다. MAPS 복합체(골격으로서 Vi를 사용)에 의해 면역 부여된 동물로부터의 혈청은 1시간의 인큐베이션 내에 Vi-발현 주의 강력한 살해를 나타냈지만(90% 초과의 살해), 2개의 다른 그룹들은 그렇지 않았다. Alum(점선); 혼합물(흑색선); 또는 MAPS(회색선)에 의해 면역 부여된 마우스들로부터의 혈청. 도 11b-11d는 MAPS-면역 부여된 마우스들로부터의 혈청의 옵소닌작용 살해 활성이 허가된 백신 PCV13에 의해 면역 부여된 마우스들로부터의 혈청의 그 살해 활성에 비해 손색이 없음을 증명한다. 호중구에 의한 폐렴구균의 생체외 옵소닌작용 살해를 매개함에 있어서의 PCV13- 또는 MAPS-면역 부여된 마우스들로부터의 혈청의 능력이 분석 및 비교되었다. 인간 호중구는 HL-60 세포 주의 세포들로부터 분화되었다. 옵소닌작용 살해는 37℃에서 1시간 동안 혈청형 1(도 11b), 혈청형 5(도 11c) 또는 혈청형 13(도 11d), 폐렴구균 및 분화된 HL-60 세포들과 함께, 희석비를 달리하여, 혈청을 인큐베이션함으로써 행해졌다(아기 토끼 보체의 존재 하에). 혼합물의 부분 표본(aliquot)이 생존 세균의 계수를 위해 인큐베이션 후에 플레이팅되었다. 옵소닌작용 살해 단위(unit)는 세균의 50% 살해가 관찰되는 혈청의 배수 희석(fold dilution)으로서 정의되었다. 모든 시험된 혈청형들에 대해, MAPS 면역 부여된 마우스들로부터의 혈청은 PCV13 면역 부여된 마우스들로부터의 혈청보다 적어도 4배 더 높은 살해 활성(OPA 역가)를 나타냈다. 도 11b-11d: Alum(점선); PCV13(흑색선); 또는 MAPS(회색선)에 의해 면역 부여된 마우스들로부터의 혈청.
도 12a-12d는 MAPS 복합체에 의한 면역 부여가 단백질 항원에 대해 강력한 항체 및 세포 반응을 유도함을 증명한다. 2가 MAPS 복합체가 비오틴화 덱스트란(BD500) 및 두 폐렴구균 항원, rhavi-Pdt 및 rhavi-PsaA로부터 제조되었다. 피하 백신 접종이 격주로 3회 주어졌다. 도 12a는 최종 면역 부여로부터 2주 후 PsaA 또는 Pdt 2에 대해 측정된 혈청 IgG 항체의 결과를 나타낸다. MAPS 복합체에 의해 면역 부여된 마우스들은 상기 혼합물을 받은 마우스들보다 유의하게 더 높은 역가의 항-Pdt 및 항-PsaA 항체를 만들었다. 항원 특이적 T-세포 반응은 면역 부여된 동물의 전혈의 생체 외 자극에 의해 평가되었다. IL-17A(도 12b) 및 IFN-γ (도 12c)의 체외 생산이 정제된 PsaA, Pdt, 또는 폐렴구균 전체-세포 항원(WCA) 중 어느 하나와 함께 6일간 인큐베이션된 혈액 샘플들에서 측정되었다. 혼합물에 의해 면역 부여된 마우스들에 비해, MAPS 복합체를 받은 동물은 유의하게 더 강한 IL-17A 및 IFN-γ 반응을 나타내었다. 도 12d는 WCA의 자극에 의한 IL-17A 및 IFN-γ 생산의 상관관계를 나타낸다. 모든 패널에 대하여, 막대(bars)는 표준 편차와 함께 평균을 나타내고 통계 분석은 Mann-Whitney 테스트, 또는 상관관계에 대해 Spearman R을 사용하여 수행되었다.
도 13은 상이한 크기들의 MAPS 복합체의 면역성의 평가를 나타낸다. MAPS 복합체들은 두 폐렴구균 융합 항원, rhavi-PsaA 및 rhavi-Pdt로부터, 골격으로서 상이한 길이의 덱스트란을 사용하여(BD500, Mw 425-500 kDa; BD90, Mw 60-90 kDa), 제조되었다. 덱스트란에 대한, 및 두 단백질 항원 PdT 및 PsaA에 대한, 항체 반응들뿐만 아니라 항원 특이적 T-세포 반응들이, 3회의 면역 부여 후에 측정 및 비교되었다. 도시된 바와 같이, 더 큰 복합체(MAPS BD500)에 의해 면역 부여된 마우스들은 더 작은 복합체(MAPS BD90)를 받은 동물들과 유사한 수준의 항-PsaA 및 항-Pdt 항체를 생성하였으나(도 13의 B), 보다 유의하게 더 높은 역가의 항-덱스트란 항체(도 13의 A)와 IL-17A 관련 T-세포 반응(도 13의 C)을 생성하였다.
도 14는 MAPS 복합체들에 대한 공자극인자들(TLR 리간드들)의 부가는 IL-17A 및 IFN-γ 관련 T-세포 반응들을 촉진함을 나타낸다. MAPS 복합체들은, 추가의 TLR 리간드/작용제: rhavi-Pdt, TLR4 리간드; Pam3CSK4, TLR2 작용제와 함께 또는 이들 없이, 비오틴화 덱스트란 및 하나의 폐렴구균 단백질 항원, rhavi-0435로부터 제조되었다. rhavi-Pdt의 도입은 rhavi 및 비오틴 사이의 친화성 상호작용을 통하는 반면, Pam3CSK4 는 덱스트란 골격에 공유적으로 연결된다. 면역 부여는 3회 피하로 주어졌으며, 0435 단백질에 대한 T-세포 반응들이 측정되고 비교되었다. TLR2 작용제 또는 TLR4와 TLR2 리간드들의 조합의 첨가는 단백질 항원에 대한 IL-17A 및 IFN-γ 관련 T-세포 반응들을 유의하게 증진하였음을 나타낸다.
도 15는 다가 폐렴구균/결핵균(Mycobacterium tuberculosis)(TB) 조합 백신의 예를 나타낸다. 다가 SP/TB 조합 MAPS 백신이 SP 혈청형 3의 사용과 하나의 SP 단백질(페렴구균 용혈소 톡소이드, Pdt) 및 6개의 TB 단백질의 로딩에 의해 제조되었다(4개의 융합 구성체(construct) 내에)(도 15a). SP/TB MAPS에 의한 마우스들의 면역 부여는 3형 CPS(도 15b, 좌측 패널) 뿐만 아니라 Pdt(도 15b, 우측 패널)에 대하여 더 큰 역가의 IgG 항체를 유도하였으며, 혈청형 3 폐렴구균의 치사적 폐감염으로부터 마우스들을 100% 방어하였다(도 15c). 도 15d-15j는 SP/TB MAPS에 의한 백신 접종에 의해 유도된 B-세포 및 T-세포 면역 B 항원들을 나타낸다. 도 15d는 상이한 TB 단백질 항원들에 대한 항체 반응들을 나타낸다. 도 15e-15f는 정제된 TB 단백질 항원들에 의한 생체외 자극 후 MAPS 면역 부여된 마우스들로부터의 전혈 샘플에서의 강한 IL-17A(도 15e) 및 IFN-γ(도 15f) 관련 T-세포 반응들을 나타낸다. 도 15gh는 정제된 TB 단백질 항원들의 혼합물에 대하여 또는 TB 전 세포 추출물에 대하여 MAPS 면역 부여된 동물들로부터의 비장 세포의 IL-17A(도 15gh의 G) 및 IFN-γ(도 15gh의 H) 관련 T세포 반응들을 나타낸다. 도 15i 및 15j는 MAPS에 의한 면역 부여에 의해 유도된 TB-특이적 기억/효과자 T-세포에 관한 데이터를 더 제공한다. 결과는 CD4+ T세포의 고갈이 TB 항원 특이적 시토킨 생산에 유의한 영향을 미치나 CD8+ T-세포는 그렇지 않음을 보여주었으며, 이는 MAPS 백신에 의한 면역 부여가 주로 CD4+ T세포(T 헬퍼 세포) 면역 반응을 준비한 것임을 가리킨다.
도 16은 원형(prototype) MAPS-기반 다가 면역성 조성물이 폐렴구균의 침습성 감염 및 비강인두 콜로니화를 예방함을 증명한다. 다가 SP MAPS는 골격으로서 SP 세포벽 폴리사커라이드(CWPS)를 사용하여 제조되었으며 5개의 폐렴구균 단백질 항원들이 로딩되었다(도 16a). 마우스들은, 2주 간격으로 3회, 이 SP MAPS에 의해 면역 부여되었으며, 폐렴구균에 대한 혈청 항체들 및 특이적 T세포 반응들이 최종 면역 부여로부터 2주 후에 분석되었다. 도 16b는 CWPS(좌측 패널) 또는 폐렴구균 전 세포 항원(WCA)(우측 패널)에 대한 혈청 IgG 항체를 나타낸다. SP MAPS에 의해 면역 부여된 마우스들은 보강제 단독(Ag 없음("No Ag")) 또는 커플링되지 않은 PS/단백질 혼합물("혼합물")을 받은 대조 그룹들에서의 마우스들보다 CWPS 또는 WCA 어느 쪽에 대해 유의하게 더 높은 역가의 항체를 만들었다. 도 16c 및 16d는 SP MAPS에 의한 백신 접종에 의해 유도된 SP-특이적 T세포 반응들을 나타낸다. 상이한 면역 부여 그룹들로부터의 마우스들의 말초 혈액이 정제된 폐렴구균 단백질들(항원 혼합) 또는 WCA에 의해 자극되었다. MAPS 백신 접종된 마우스들로부터의 세포는 SP 항원에 크게 반응하여 IL-17A(도 16c) 및 IFN-γ(도 16d)를 강하게 생산하였으나 대조 그룹들로부터의 세포는 그렇지 않았다. 도 16e 및 16f는 MAPS 복합체에 의한 백신 접종이 마우스들을 폐렴구균의 침습성 감염 뿐만 아니라 비강인두 콜로니화로부터 방어함을 나타낸다. 다른 면역 부여 그룹들의 마우스들이 폐흡인 모델에서의 SP 혈청형 3 주 WU2 (도 16e), 또는 비강 콜로니화 모델에서 혈청형 6 폐렴구균 주 603(도 16f)에 의해 시험되었다. 패혈증 또는 콜로니화에 대한 방어는 MAPS-면역 부여된 마우스들에서만 관찰되었다.
본 발명은 본원에 기술된 특정 방법, 프로토콜(protocol), 및 시약(reagent)들 등에 한정되지 않고 변화할 수 있음이 이해되어야 한다. 본원에서 사용되는 용어들은 단지 특정 실시형태를 기재하는 목적을 위한 것이며, 오로지 청구범위에 의해서만 한정되는 본 발명의 범주를 제한하고자 하는 것은 아니다.
본원 및 청구범위에서, 단수형은 문맥이 명백하게 달리 지시하지 않는 한, 복수의 지시 대상을 포함하고 그 역도 성립한다. 용어 "또는(or)"은, 예를 들어 "어느 하나(either)"에 의해 수식되지 않는 한, 포괄적이다. 실시예 외에서는, 또는 달리 지시되지 않는 한, 본원에서 성분의 양이나 반응 조건을 표현하는 모든 숫자는 모든 경우에 있어서 용어 "약(about)"에 의해 수식되는 것으로 이해되어야 한다. 나아가 핵산 또는 폴리펩티드에 대하여 주어진 모든 염기 크기 또는 아미노산 크기, 및 모든 분자량 또는 분자 질량 값들은 근사치이며, 기재를 위해 제공된 것이라는 점이 이해되어야 한다.
확인된 모든 특허 및 다른 간행물은, 예를 들어 본 발명과 함께 사용될 수 있는 그러한 간행물에서 기술된 방법론을 설명하고 개시하려는 목적으로 본 명세서에 참고로 명시적으로 포함된다. 이들 간행물은 오로지 본 출원의 출원일 전의 그들의 개시 때문에 제공된다. 이에 관하여 어떤 것도, 본 발명자들이 종래 발명에 의해 또는 임의의 다른 이유로 그러한 개시보다 선행되지 않음을 인정하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 이들 문헌의 내용에 관한 표현 및 날짜에 관한 모든 진술은 출원인이 이용가능한 정보에 기초하며, 이들 문헌의 내용 또는 날짜의 정확함에 대해 어떠한 것도 인정하는 것으로 여겨지지 않는다.
달리 한정되지 않는 한, 본원에 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자에게 보통으로 이해되는 것과 같은 의미를 갖는다. 임의의 알려진 방법, 장치, 및 재료들이 본 발명의 실행 또는 시험에 사용될 수 있지만, 방법, 장치, 및 재료들이 본원에 기재된다.
본 발명은, 폴리머 스캐폴드에 부착된, 적어도 하나의 항원, 또는 다수의 항원을 포함하는, 대상체에게 투여될 때 상기 폴리머에 부착한 상기 항원들의 각각에 대한, 및 임의로 상기 폴리머 그 자체에 대한, 면역 반응을 끌어내는 용도의, 면역성 조성물 및 면역 복합체를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 이 다항원 제시 시스템(MAPS)은 체액성 및 세포 면역 반응을 자극한다: 그것은 단일의 MAPS 면역성 구성체를 사용하여 다수의 단백질 항원에 대한 항-폴리사커라이드 항체 및 B-세포/ Th1/Th17 반응을 생성할 수 있다. 유기체에 대한 B- 및 T-세포 면역의 조합은 침습적 감염 및 비인두 보균과 관련된 폐렴구균 질환을 포함하는 많은 질환에 대한 최적의 백신 전략일 것이다. 일부 실시형태에서, 상기 면역성 조성물은 백신이거나 또는 백신에 포함된다.
따라서, 본 발명의 일 태양은, 적어도 하나의 폴리머(예: 하나의 폴리사커라이드); 적어도 하나의 단백질 또는 펩티드 항원; 및 (i) 상기 폴리머와 결합한 제1 친화성 분자, 및 (ii) 상기 항원과 결합한 상보적 친화성 분자를 포함하여, 상기 폴리머에 상기 항원을 간접적으로 부착하는데 기능하는(예: 상기 제1 친화성 분자가 상기 상보적 친화성 분자와 결합하여 상기 폴리머에 상기 항원을 연결함), 적어도 하나의 상보적 친화성-분자 쌍;을 포함하는 면역성 조성물(다항원 제시 시스템, 또는 MAPS)에 관한 것이다. 따라서, 상기 폴리머는 스캐폴드로서 사용되어 적어도 1개, 또는 적어도 2개, 또는 그 이상의(예: 복수의) 동일 또는 상이한 항원들을 부착하는데 사용될 수 있다. 본원에 개시된 면역성 조성물은 동시에 다수의 항원에 대한 체액성 및 세포 면역 둘다를 끌어내는데 사용될 수 있다.
따라서, 본원의 실시형태는 대상체에서 면역 반응을 일으키는데 유용한 면역성 조성물 및 방법을 제공하며, 이는 그 자체로 또는 임의의 존재하는 백신 접근방식과 본질적으로 결합 또는 혼합되어 사용될 수 있다.
정의
편의를 위해, 본원 전체(명세서, 실시예, 및 첨부의 청구범위를 포함)에 사용된 일부 용어들을 여기에 모아놓는다. 별도의 언급이 없는 한, 본원에 사용된 모든 기술용어와 과학용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자에게 보통으로 이해되는 것과 같은 의미를 갖는다.
본원에 있어서 용어 "면역성 조성물(immunogenic composition)"은 대상체에게 투여되었을 때 면역 반응, 예컨대 항체 또는 세포 면역 반응을 끌어낼 수 있는 조성물로 정의된다. 본 발명의 면역성 조성물은 면역방어성(immunoprotective) 또는 치료적일수도 아닐 수도 있다. 본 발명의 면역성 조성물이 대상체로부터 질환을 예방(prevent), 개선(ameliorate), 완화(palliate) 또는 제거(eliminate)할 때, 그 면역성 조성물은 임의로 백신으로 칭할 수도 있다. 그러나, 본원에 있어서 용어 면역성 조성물은 백신에 한정되는 것은 아니다.
본원에 있어서 용어 "항원(antigen)"은 물질(substance)에 대해 면역 반응을 촉발하는 임의의 물질을 말한다. 일부 실시형태에서, 항원은 펩티드 또는 폴리펩티드이고, 다른 실시형태에서, 항원은 임의의 화학물질 또는 부분(moiety), 예를 들어, 그 물질에 대하여 면역 반응을 끌어내는, 탄수화물일 수 있다.
본원에 있어서 용어 "결합하다(associate)"는 비공유 또는 공유 결합에 의한 2 이상의 분자들의 연결(linkage)을 말한다. 2 이상의 분자들의 연결이 공유 결합에 의해 일어나는 일부 실시형태에서, 상기 2 이상의 분자들은 함께 융합되거나 또는 가교될 수 있다. 2 이상의 분자들의 연결이 비공유 결합에 의해 일어나는 일부 실시형태에서, 상기 2 이상의 분자들은 복합체를 형성할 수 있다.
본원에 있어서 용어 "복합체(complex)"는 공유적 상호 작용 외의 수단에 의해 공간적으로 연결된(spatially connected) 2 이상의 분자들의 무리(collection)를 말하며, 예를 들면 그것들은 정전기적 상호 작용, 수소 결합, 또는 소수성 상호 작용(즉, 반데르바알스힘)에 의해 연결될 수 있다.
본원에 있어서 용어 "가교된(cross-linked)"은 폴리머 쇄와 제2의 분자 간에 형성된 공유 결합을 말한다. 용어 "가교제(cross-linking reagent)"는 폴리머와 어떤 독립체(entity), 예를 들면, 제1 친화성 분자 또는 공자극인자와의 공유 연결을 촉매하는 중간의 분자인 어떤 독립체 또는 제(agent)를 말한다.
본원에 있어서 용어 "융합(fused)"은 적어도 하나의 단백질 또는 펩티드가 제2의 단백질 또는 펩티드와 물리적으로 결합되어(associated) 있는 것을 의미한다. 일부 실시형태에서, 융합은 전형적으로 공유 연결(covalent linkage)이지만, 다른 유형의 연결, 예를 들면, 정전기적 상호 작용, 또는 소수성 상호 작용 등을 통한 연결 등도 용어 "융합"에 포함된다. 공유 연결은, 융합 단백질로서의 연결, 또는 예를 들면 2개의 시스테인 잔기들 사이에 형성된 디설파이드 결합에 의하는 등의 화학적으로 커플링된 연결(chemically coupled linkage)을 포함할 수 있다.
본원에 있어서 용어 "융합 폴리펩티드(fusion polypeptide)" 또는 "융합 단백질(fusion protein)"은 2 이상의 폴리펩티드 서열을 합쳐(join together) 생성되는 단백질을 의미한다. 본 발명에 포함되는 융합 폴리펩티드에는 1개 이상의 항원, 또는 그 단편 또는 돌연변이를 코딩하는 DNA 서열을 제2의 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열과 합쳐 단일의 개방형 해독틀(single open-reading frame)을 형성하는 키메라 유전자 구성체(chimeric gene construct)의 번역 산물이 포함된다. 바꿔 말하면, "융합 폴리펩티드" 또는 "융합 단백질" 은 하나의 펩티드 결합에 의해 또는 몇개의 펩티드 결합들을 통해 합쳐진 2 이상의 단백질들의 재조합 단백질이다. 일부 실시형태에서, 항원이 융합되는 상기 제2의 단백질은 상보적 친화성 쌍의 제1 친화성 분자와 상호 작용할 수 있는 상보적 친화성 분자이다.
용어 "폴리펩티드" 및 "단백질"은 호환적으로 사용될 수 있으며 펩티드 결합들에 의해 연결된 아미노산 잔기들의 폴리머를 말하며, 청구된 발명의 목적을 위해, 적어도 25개의 아미노산들의 전형적인 최소 길이를 갖는다. 용어 "폴리펩티드" 및 "단백질"은 다량체(multimer)적인 단백질, 예를 들어, 1 이상의 도메인(domain) 또는 서브유닛(subunit)을 포함하는 단백질일 수 있다. 본원에 있어서 용어 "펩티드"는 25개 미만의 아미노산들을 함유하는 펩티드 결합-연결된 아미노산들의 서열, 예를 들어, 길이 약 4개 아미노산들에서 25개 아미노산들 사이를 말한다. 단백질 및 펩티드는 펩티드 결합들에 의해 연결된 선형적으로 배열된 아미노산들로 구성될 수 있으며, 생물학적으로, 재조합적으로, 또는 합성적으로 생성된 것도, 천연 발생 또는 비천연 발생 아미노들로 구성된 것도 본 정의에 포함된다. 전장(full length) 단백질과 그것의 25개의 아미노산보다 큰 단편이 상기 단백질의 정의 내에 포함된다. 상기 용어에는 또한 상기 폴리펩티드의 번역 과 함께의 변형(co-translational modification)(예: 시그널 펩티드 절단)과 번역 후의 변형(post-translational modification), 예컨대, 디설피드-결합 형성, 글리코실화, 아세틸화, 인산화, 지질화, 단백질 분해 절단(proteolytic cleavage)(예: 메탈로프로테아제에 의한 절단) 등을 갖는 폴리펩티드가 포함된다. 나아가, 본원에 있어서, "폴리펩티드"는, 그 단백질이 소망의 활성을 유지하는 한도 내에서의, 천연 서열에 대한 변형(modification), 예컨대 결실, 부가, 및 치환(당업자에게 알려진 바와 같이 천연에서는 일반적으로 보존적인)을 포함하는 단백질을 말한다. 이들 변형은 부위특이적 돌연변이유발을 통해 계획된 것이거나 또는 우발적인 것, 예컨대 그 단백질을 생산하는 숙주의 돌연변이, 또는 PCR 증폭 또는 다른 재조합 DNA법에 기인한 에러를 통한 것일 수 있다.
"시그널 서열"은 핵산 분자에 작동적으로 연결될 때, 그 핵산 분자에 의해 코딩되는 산물(예: 단백질 또는 펩티드)의 분비를 촉진하는 핵산 서열을 의미한다. 일부 실시형태에서, 시그널 서열은 바람직하게는 그 핵산 분자의 5'에 위치한다.
본원에 있어서 용어 "N-글리코실화된(N-glycosylated)" 또는 "N-글리코실화(N-glycosylation)"는, 폴리펩티드 내의 아스파라긴 잔기들에 당 부분(sugar moiety)이 공유 부착하는 것을 말한다. 당 부분들에는 글루코스, 만노스, 및 N-아세틸글루코사민이 포함될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 시알화 등의 글리칸의 변형도 포함된다.
"항원 제시 세포(antigen presenting cell)" 또는 "APC" 는, 주요조직적합성 복합체(MHC) 분자를 발현하며 그 표면에 MHC와 복합화된 외래 항원(foreign antigen)을 나타낼 수 있는 세포를 말한다. 항원 제시 세포의 예는 수지상 세포, 마크로파아지, B-세포, 섬유아세포(피부), 흉선 상피 세포, 갑상선 상피 세포, 교질 세포(뇌), 췌장베타 세포, 및 혈관 내피 세포이다.
"항원의 기능성 부분"의 맥락에서 사용되는 용어 "기능성 부분(functional portion)" 또는 "기능성 단편(functional fragment)" 은, 전체 항원 부분과 동일한 효과를 매개하는, 예를 들어, 대상체에서 면역 반응을 끌어내는, 또는 다른 분자와의 결합(association)(예: 적어도 에피토프에의 결합을 포함)을 매개하는, 항원 또는 항원 폴리펩티드의 부분을 말한다.
본원에 있어서 표적 항원의 "부분(portion)"은 길이가 적어도 3개의 아미노산을 말하며, 예를 들면, 적어도 6개, 적어도 8개, 적어도 10개, 적어도 14개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개 또는 적어도 25개의 아미노산 또는 그 이상(일체를 포함)일 수 있다.
용어 "세포독성 T 림프구(Cytotoxic T Lymphocyte)" 또는 "CTL"은 표적 세포에서 아폽토시스(apoptosis) 또는 다른 메커니즘을 통한 사멸을 유도하는 림프구를 말한다. CTL은 TCR과 표적 세포 표면 상의 프로세싱된 항원(Ag)의 상호 작용을 통해 표적 세포와 항원 특이적 접합체를 형성하며, 이는 그 표적 세포의 아폽토시스를 초래한다. 사멸체는 마크로파아지에 의해 제거된다. 용어 "CTL 반응" 은 CTL 세포에 의해 매개되는 원발 면역 반응을 말한다.
본원에 있어서 용어 "세포 매개 면역(cell mediated immunity)" 또는 "CMI" 는 항체 또는 보체를 개입시키지 않고, 예를 들면, 마크로파아지, 천연 킬러 세포(NK), 항원-특이적 세포독성 T-림프구(T-세포), T-헬퍼 세포, 호중구의 활성화, 및 표적 항원에 대응한 다양한 시토킨들의 방출을 개입시키는 면역 반응을 말한다. 다른 식으로 말하면, CMI는, 표적 항원을 나타내는 다른 세포(항원 제시 세포(APC) 같은)의 표면에 결합하여 반응을 촉발하는 면역 세포(예컨대 T-세포 및 다른 림프구)를 말한다. 상기 반응은 다른 림프구 및/또는 임의의 다른 백혈구와 시토킨의 방출을 수반할 수도 있다. 세포 면역은 신체를 :(1) 바이러스 감염 세포나 세포내 세균을 갖는 세포 같은, 표면에 외래 항원의 에피토프를 나타내는 체세포를 파괴할 수 있는 항원 특이적 세포독성 T-림프구(CTL)를 활성화함; (2) 마크로파아지와 NK 세포를 활성화하여, 그것들이 세포내 병원체를 파괴할 수 있게 함; 및 (3) 세포를 자극하여 획득 면역 반응과 선천 면역 반응에 관련된 다른 세포, 예컨대 T 세포, 마크로파아지 또는 호중구의 기능에 영향을 미치는 다양한 시토킨들 또는 케모킨들을 분비하게 함에 의해 방어할 수 있다.
본원에 있어서 용어 "면역 세포(immune cell)" 는 직접적 또는 간접적 항원 자극에 반응하여 시토킨 또는 케모킨 또는 항체를 방출할 수 있는 임의의 세포를 말한다. 용어 "면역 세포"에는 자연 살세포(NK 세포), T-세포(CD4+ 및/또는 CD8+ 세포), B-세포, 마크로파아지; 백혈구; 수지상 세포; 비만 세포; 단핵구 및 직접적 또는 간접적 항원 자극에 반응하여 시토킨 또는 케모킨 분자를 생산할 수 있는 임의의 다른 세포가 포함된다. 전형적으로, 면역 세포는 림프구, 예를 들면 T-세포 림프구이다.
본원에 있어서 용어 "시토킨(cytokine)"은 항원에 의한 자극에 반응하여 면역 세포로부터 방출되는 분자를 말한다. 그러한 시토킨의 예에는 GMCSF; IL-1a; IL-1b; IL-2; IL-3; IL-4; IL-5; IL-6; IL-7; IL-8; IL-10; IL-12; IL17A, IL-17F 또는 IL-17 패밀리의 다른 구성원들, IL-22, IL-23, IFN-α; IFN-β; IFN-γ; MIP-1α; MIP-1β; TGF-β; TNFα, 또는 TNFβ가 포함되나 이에 한정되는 것은 아니다. 용어 "시토킨"에는 항체가 포함되지 않는다.
본원에 있어서 용어 "대상체(subject)"는 면역 반응을 끌어내는데 유용한 임의의 동물을 말한다. 대상체는 야생 동물, 가축, 상업적 동물 또는 반려 동물, 예컨대 조류 또는 포유류일 수 있다. 대상체는 인간일 수 있다. 본 발명의 일 실시형태에서는 본원에 개시된 면역성 조성물이 인간의 치료 또는 예방적 처치에 적절할 수 있음이 고려되지만, 그것은 온혈 척추동물, 예를 들어, 포유류, 예컨대 비인간 영장류(특히 고등 영장류), 양, 개, 설치류(예: 마우스 또는 래트), 기니아 피그, 염소, 돼지, 고양이, 토끼, 소, 및 비포유류, 예컨대 닭, 오리, 또는 칠면조에도 적용 가능하다. 다른 실시형태에서, 대상체는 야생 동물, 예를 들면, 예컨대 조류 독감의 진단을 위한 조류이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 실험 동물 또는 질환 모델로서의 동물 치환체이다. 대상체는 수의과 처치를 요하는 대상체일 수 있으며, 여기서 항원에 대한 면역 반응을 끌어내는 것은 예를 들면 SIV, STL1, SFV, 또는 가축의 경우에 있어서, 발굽 및 구강 질환, 또는 조류 마레크병(Marek's disease) 또는 조류 인플루엔자의 경우에 있어서, 및 기타 다른 질환 등의 질환의 방어 및/또는 확산의 제어에 유용하다.
본원에 있어서 용어 "병원체(pathogen)"는 대상체에 질환 또는 장애를 일으키는 유기체 또는 분자를 말한다. 예를 들면, 병원체에는 바이러스, 진균, 세균, 기생생물, 및 다른 전염성 유기체들 또는 그것들로부터의 분자, 뿐만 아니라 조류(algae), 진균, 효모, 원생돌물 등의 범주 내의 분류학상으로 관련된 거시적인 유기체들이 포함되나 이에 한정되는 것은 아니다.
"암 세포"는 생체 내(in vivo), 생체 밖(ex vivo), 또는 조직 배양 중 어느 하나에서의 암성의(cancerous), 암 발병 전의(pre-cancerous), 또는 형질전환 세포를 말하며, 이는 새로운 유전물질의 흡수(uptake)를 필연적으로 수반하지 않는 자발적인 또는 유도된 형질 변화를 갖는다. 형질전환(transformation)은, 형질전환 바이러스에 의한 감염과 신규 게놈 핵산의 도입, 또는 외인성 핵산의 흡수로부터 일어날 수 있지만, 자발적으로 또는 내생 유전자를 돌연변이 시키는 발암물질에의 노출에 뒤이어 일어날 수도 있다. 형질전환/암은, 예를 들어, 세포의 형태적 변화, 불멸화, 비정상적 성장 조절, 병소 형성(foci formation), 부착 비의존성(anchorage independence), 악성종양(malignancy), 접촉 저지의 상실 및 성장의 밀도 제한, 성장 인자 또는 혈청 비의존성, 종양 특이적 마커, 침습성 또는 전이, 및 예컨대 누드 마우스들 등의 적절한 동물 숙주에서의 종양 성장과 관련될 수 있다. 참조, 예를 들어, Freshney, CULTURE ANIMAL CELLS: MANUAL BASIC TECH. (3rd ed., 1994).
용어 "야생형(wild type)" 은, 생체내에 통상 존재하는 것과 같은, 천연 발생의, 통상의 단백질 코딩 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 그 부분, 또는 단백질 서열, 또는 그 부분을 각각 말한다.
용어 "돌연변이(mutant)"는 유전 물질 내의 임의의 변화, 특히 야생형 폴리뉴클레오티드 서열에 대한 변화(즉, 결실, 치환, 부가, 또는 변경) 또는 야생형 단백질 서열에 대한 임의의 변화를 갖는 유기체 또는 세포를 말한다. 용어 "변이형(variant)"은 "돌연변이(mutant)"와 호환적으로 사용될 수 있다. 유전 물질의 변화는 그 단백질의 기능의 변화를 초래한다고 종종 가정되지만, 용어 "돌연변이"와 "변이형"은 그 변화가 그 단백질의 기능을 변경(예: 증가, 감소, 새로운 기능 부여)하는지 또는 그 변화가 단백질의 기능에 영향을 끼치지 않는지(예: 그 돌연변이 또는 변이형이 잠재성(silent)임)에 무관하게 야생형 단백질의 서열의 변화를 말한다.
용어 "약학적으로 허용가능한"은 과도한 독성 없이 포유류에 투여될 수 있는 화합물 및 조성물을 말한다. 용어 "약학적으로 허용가능한 담체는 조직 배지를 제외한다. 예시적인 약학적으로 허용가능한 염들에는, 무기산염들, 예컨대 하이드로클로라이드, 하이드로브로마이드, 인산염, 설페이트, 등, 및 유기산염들, 예컨대 아세테이트, 프로피오네이트, 말로네이트, 벤조에이트 등이 포함되나 이에 한정되는 것은 아니다. 약학적으로 허용가능한 담체들은 당 기술분야에서 잘 알려져 있다.
단백질 또는 폴리펩티드는 종종 통상 20개의 천연 발생 아미노산이라 불리우는 20개의 아미노산 외의 다른 아미노산들을 함유할 수 있고, 많은 아미노산들이, 말단 아미노산들을 포함하여, 주어진 폴리펩티드에서 예컨대 글리코실화 및 다른 번역후 변형과 같은 자연적 프로세스에 의해, 또는 당 기술분야에 기술이 잘 알려져 있는 화학적 변형에 의해 변형(modification) 될 수 있음이 이해될 것이다. 본 발명의 폴리펩티드에 존재할 수 있는 알려진 변형에는, 아세틸화, 아실화, ADP-리보실화, 아미드화, 플라빈의 공유 부착, 헴부분의 공유 부착, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 유도체의 공유 부착, 지질 또는 지질 유도체의 공유 부착, 포스포티딜이노시톨의 공유 부착, 가교, 고리화, 디설피드 결합 형성, 탈메틸 반응, 공유 가교의 형성, 시스틴 형성, 피로글루탐산 형성, 제제화, 감마-카복시화, 당화, 글리코실화, GPI 앵커 형성, 수산화, 요오드화, 메틸화, 미리스토일화, 산화, 단백질 분해 프로세싱, 인산화, 프레닐화, 라세미화, 셀레노일화, 황산화, 단백질에 대한 아미노산의 전달-RNA 매개 부가 예컨대 아르기닐화, 및 유비퀴틴화가 포함되나 이에 한정되는 것은 아니다, .
본원에 있어서 용어들 "상동의(homologous)" 또는 "상동체(homologues)"는 호환적으로 사용되며, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 기술하는데 사용될 때, 두 폴리뉴클레오티드들 또는 폴리펩티드들, 또는 그들의 지정된 서열들이, 예를 들면, 정렬에 대해 디폴트 파라미터로 하여 BLAST, version 2.2.14를 사용하여 적절히 정렬되어 비교될 때, 적절한 뉴클레오티드 삽입 또는 결실 또는 아미노산 삽입 또는 결실과 함께, 높은 상동성을 위해서는 전형적으로 적어도 70%의 뉴클레오티드가 동일한 것을 말한다. 폴리펩티드에 대해서는, 폴리펩티드에 적어도 30%의 아미노산 동일성, 또는 보다 더 높은 상동성을 위해서는 적어도 50%의 아미노산 동일성이 있어야 한다. 본원에 있어서 용어 "상동체" 또는 "상동의" 는 또한 구조에 대한 상동성을 말한다. 유전자 또는 폴리펩티드의 상동체의 결정은 당업자가 용이하게 알아낼 수 있다. 정의된 퍼센트의 문맥 중에 있을 때, 정의된 퍼센트 상동성은 적어도 그 퍼센트의 아미노산 유사성을 의미한다. 예를 들면, 85% 상동성은 적어도 85%의 아미노산 유사성을 말한다.
본원에서 핵산 서열, 단백질 또는 폴리펩티드에 대하여 사용되는 용어 " 이종(heterologous)"은, 이들 분자가 그 세포에서 천연 발생하는 것이 아님을 의미한다. 예를 들면, 예컨대 단백질 발현 벡터의 맥락에서, 세포에 삽입되는 본원에 기술된 융합 항원 폴리펩티드에 대한 코딩 핵산 서열은 이종 핵산 서열이다.
서열 비교를 위해, 전형적으로 하나의 서열이 비교될 테스트 서열에 대해 참조 서열로 작용한다. 서열 비교 알고리듬을 사용시, 테스트 서열 및 참조 서열을 컴퓨터에 입력하고, 부분열 좌표(subsequence coordinates)를 지정하며, 필요시, 서열 알고리듬 프로그램 파라미터들을 지정한다. 그리고나서 서열 비교 알고리듬은 지정된 프로그램 파라미터들에 기초하여 참조 서열에 대한 테스트 서열의 퍼센트 서열 동일성을 계산한다. 필요하거나 요망되면, 당 기술분야에 잘 알려져 있는 임의의 다양한 접근 방법에 의해 비교를 위한 적절한 서열의 정렬이 행하여 질 수 있다.
본원에 있어서 용어 "변이형(variant)"은 천연 발생 폴리펩티드 또는 핵산과 1 이상의 아미노산 또는 핵산의 결실, 부가, 치환 또는 측쇄 수식에 의해 다르지만 그 천연 발생 분자의 1 이상의 특이적 기능이나 생물학적 활성을 여전히 유지하는 폴리펩티드 또는 핵산을 말한다. 아미노산 치환에는 상이한 천연 발생(naturally-occuring) 또는 비통상적 아미노산 잔기에 의해 아미노산이 대체되는 변경이 포함된다. 그러한 치환은 폴리펩티드에 함유된 아미노산 잔기가 극성, 측쇄 기능성(side chain functionality) 또는 크기와 관련하여 유사한 특성의 다른 천연 발생 아미노산으로 대체되는 경우에 "보존적(conservative)"으로 분류될 수 있다. 본원에 기술된 바와 같은 변이형에 의해 포함되는 치환은 펩티드 내에 존재하는 아미노산 잔기가 다른 특성을 갖는 아미노산에 의해 치환되는 경우(예: 하전된 또는 소수성 아미노산을 알라닌에 의해 치환), 또는 대안적으로, 천연 발생의 아미노산이 비통상적 아미노산에 의해 치환되는 경우에는 "비보존적"일 수 있다. 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드에 대하여 사용될 때 용어 "변이형" 내에는 또한 기준 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 각각에 비교한(예: 야생형 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드에 비교한) 1차, 2차, 또는 3차 구조의 변이가 포함된다.
용어 "실질적으로 유사한(substantially similar)"은, 오리지날 항원에 비교하여 항원의 변이형 또는 항원의 기능성 유도체에 대하여 사용될 때, 특정 대상체 서열이 항원 폴리펩티드 서열과, 1 이상의 치환, 결실, 또는 부가에 의해 다르지만, 대상체에게서 면역 반응을 끌어내는 그 항원 기능을 적어도 50%, 또는 더 높게, 예를 들어, 적어도 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 이상(일체를 포함) 보유하는 것을 의미한다. 폴리뉴클레오티드 서열을 결정함에 있어서, 실질적으로 유사한 아미노산 서열을 코딩할 수 있는 모든 대상체 폴리뉴클레오티드 서열은, 코돈 서열의 차이에 상관없이, 기준 폴리뉴클레오티드에 실질적으로 유사한 것으로 간주된다. 뉴클레오티드 서열은 다음의 경우에 주어진 항원 핵산 서열에 "실질적으로 유사하다": (a) 뉴클레오티드 서열이 천연 항원 서열의 코딩 영역에 혼성화(hybridize)한다, 또는 (b) 뉴클레오티드 서열이 중등 정도의 엄격한 조건 하에서(under moderately stringent conditions) 천연 항원의 뉴클레오티드 서열에 혼성화할 수 있고 천연 항원 단백질에 유사한 생물학적 활성을 갖는다; 또는 (c) 뉴클레오티드 서열이 (a) 또는 (b)에 정의된 뉴클레오티드 서열에 관한 유전 암호의 결과 축퇴성(degenerate)이다. 실질적으로 유사한 단백질들은 전형적으로 천연 단백질의 상응하는 서열과 약 80% 넘게 유사할 것이다.
변이형에는 아래 기술하는 바와 같은 보존적 또는 비보존적 아미노산 변화가 포함될 수 있다. 폴리뉴클레오티드 변화는 기준 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드 내의 아미노산 치환, 부가, 결실, 융합 및 절단(truncation)을 초래할 수 있다. 변이형에는, 그 변이형의 기초인 펩티드 서열 내에 통상적으로는 일어나지 않는 아미노산들과 다른 분자들의 삽입 및 치환을 포함하여, 아미노산들의 삽입, 결실 또는 치환도 포함되며, 예로서 인간 단백질에서는 통상적으로 일어나지 않는 오르니틴(ornithine)의 삽입을 들 수 있지만 이에 한정되는 것은 아니다. "보존적 아미노산 치환"은 하나의 아미노산을 유사한 구조적 및/또는 화학적 성질을 갖는 다른 아미노산에 의해 대체함에 비롯된다. 기능성으로 유사한 아미노산들을 제공하는 보존적 치환표가 당 기술분야에 잘 알려져 있다. 예를 들면, 다음 여섯개의 그룹은 각각 상호 보존적인 치환인 아미노산들을 포함하고 있다: (1) 알라닌(A), 세린(S), 트레오닌(T); (2) 아스파르트산(D), 글루탐산(E); (3) 아스파라긴(N), 글루타민(Q); (4) 아르기닌(R), 리신(K); (5) 이소류신(I), 류신(L), 메티오닌(M), 발린(V); 및 (6) 페닐알라닌(F), 티로신(Y), 트립토판(W). 참조, 예를 들어, Creighton, Proteins (W. H. Freeman & Co.,1984).
보존적 아미노산의 선택은 예를 들면 아미노산이 펩티드의 외부에 있고 용매에 노출되는가, 또는 내부에 있고 용매에 노출되지 않는가와 같이, 펩티드 내 치환될 아미노산의 위치에 기초하여 선택될 수 있다. 그러한 보존적 아미노산 치환의 선택은 당업자의 기술의 범주 내이다. 따라서, 당업자는 단백질 또는 펩티드의 외부의 아미노산(즉, 용매에 노출되는 아미노산)에 적절한 보존적 아미노산 치환을 선택할 수 있다. Y의 F로의, T의 S 또는 K로의, P의 A로의, E의 D 또는 Q로의, N의 D 또는 G로의, R의 K로의, G의 N 또는 A로의, T의 S 또는 K로의, D의 N 또는 E로의, I의 L 또는 V로의, F의 Y로의, S의 T 또는 A로의, R의 K로의, G의 N 또는 A로의, K의 R로의, A의 S, K 또는 P로의 치환이 포함되나 이에 한정되는 것은 아니다.
대안적으로, 당업자는 단백질 또는 펩티드의 내부의 아미노산(즉, 용매에 노출되지 않는 아미노산)에 적절한 보존적 아미노산 치환을 선택할 수도 있다. 예를 들면, Y의 F로의, T의 A 또는 S로의, I의 L 또는 V로의, W의 Y로의, M의 L로의, N의 D로의, G의 A로의, T의 A 또는 S로의, D의 N으로의, I의 L 또는 V로의, F의 Y 또는 L로의, S의 A 또는 T로의 및 A의 S, G, T 또는 V로의 치환인 보존적 치환을 이용할 수 있다. 일부 실시형태에서, 비보존적 아미노산 치환을 포함하는 LF 폴리펩티드도 용어 "변이형"에 포함될 수 있다. 본원에 있어서 용어 "비보존적" 치환은 어떤 아미노산 잔기를 상이한 화학적 성질을 갖는 상이한 아미노산 잔기로 치환하는 것을 말한다. 비보존적 치환의 비한정적 예에는 아스파르트산(D)의 글리신(G)으로의 치환; 아스파라긴(N)의 리신(K)으로의 치환; 및 알라닌(A)의 아르기닌(R)으로의 치환이 포함된다.
본원에 있어서 용어 "유도체(derivative)"는 예를 들면 유비퀴틴화(ubiquitination), 표지화, 페길레이션(pegylation)(폴리에틸렌글리콜에 의한 유도체화) 또는 다른 분자의 부가에 의해 화학적으로 변형된 단백질 또는 펩티드를 말한다. 한 분자는 통상적으로는 그 분자의 일부가 아닌 부가적인 화학적 부분들(chemical moieties)를 함유할 때 다른 분자의 "유도체"일 수 있다. 그러한 부분들은 분자의 용해도, 흡수도, 생물학적 반감기 등을 개선할 수 있다. 그 부분들은 대안적으로 그 분자의 독성을 감소시키거나, 또는 그 분자의 바람직하지 않은 부작용을 제거 또는 약화시킬 수 있다. 그러한 효과를 매개 가능한 부분들은 REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES(21st ed., Tory, ed., Lippincott Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 2006)에 개시되어 있다.
용어 "기능성"은 "유도체" 또는 "변이형"과 함께 사용될 때, 어떤 독립체(entity) 또는 분자의 유도체 또는 변이형으로서, 그 독립체 또는 분자의 생물학적 활성에 실질적으로 유사한 생물학적 활성을 보유하는 단백질 분자를 말한다. 본 문맥에서 "실질적으로 유사한"은 생물학적 활성, 예를 들어, 폴리펩티드의 항원성이, 기준, 예를 들어 상응하는 야생형 폴리펩티드의 적어도 50% 활성인 것, 예를 들어, 적어도 60% 활성, 70% 활성, 80% 활성, 90% 활성, 95% 활성, 100% 활성 또는 그보다 더 높은(즉, 변이형 또는 유도체가 야생형보다 더 큰 활성을 갖는), 예를 들어, 110% 활성, 120% 활성, 또는 그 이상(일체를 포함)인 것을 의미한다.
용어 "재조합(recombinant)"은 핵산 분자를 기술하는데 사용될 때, 게놈, cDNA, 바이러스의, 반합성, 및/또는 합성 기원의 폴리뉴클레오티드를 의미하며, 그것은, 그것의 기원 또는 조작에 기인하여, 천연에서라면 결합할 폴리뉴클레오티드 서열들의 전부 또는 일부에 결합하지 않는다. 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 또는 재조합 융합 단백질에 대하여 사용되는 용어 재조합은 재조합 폴리뉴클레오티드로부터의 발현에 의해 생산되는 폴리펩티드를 의미한다. 숙주 세포에 대하여 사용되는 용어 재조합은, 재조합 폴리뉴클레오티드가 도입된 숙주 세포를 의미한다. 재조합은 또한 본원에서 물질(예: 세포, 핵산, 단백질, 또는 벡터)에 대하여 사용되어, 그 물질이 이종(heterologous) 물질(예: 세포, 핵산, 단백질, 또는 벡터)의 도입에 의해 변형되었다는 것을 가리킨다.
용어 "벡터(vector)"는 그것에 연결된 이종 핵산을 숙주 세포에 수송 또는 발현 매개할 수 있는 핵산 분자를 말한다; 플라스미드는 용어 "벡터"에 포함되는 속(genus)의 종(species)이다. 용어 "벡터"는 전형적으로 복제 원점과 숙주 세포 내에서의 복제 및/또는 유지에 필수적인 다른 요소들(entities)을 함유하는 핵산 서열을 말한다. 그것들이 작동적으로 연결된 유전자 및/또는 핵산 서열의 발현을 지시(direct)할 수 있는 벡터들을 본원에서는 "발현 벡터"라 한다. 일반적으로 유용한 발현 벡터는 종종 "플라스미드(plasmid)"의 형태로 존재하며, 플라스미드란, 그것의 벡터 형태에 있어서 염색체에 결합되어 있지 않고, 전형적으로 안정적 또는 일시적 발현을 위한 요소들 또는 코딩된 DNA를 포함하는 원형의 이중 나선 DNA 분자를 말한다. 본원에 개시된 방법에 사용 가능한 다른 발현 벡터에는 플라스미드, 에피좀(episome), 세균 인공 염색체, 효모 인공 염색체, 박테리오파아지 또는 바이러스 벡터가 포함되나 이에 한정되는 것은 아니며, 그러한 벡터는 특정 세포내에서 숙주 게놈에 통합되거나 자체적으로 복제할 수 있다. 벡터는 DNA 또는 RNA 벡터일 수 있다. 동등한 기능을 제공할 수 있는 당 기술분야의 숙련자에게 알려진 다른 형태의 발현 벡터를 사용할 수도 있으며, 자기 복제 염색체외 벡터(self replicating extrachromosomal vector) 또는 숙주 게놈에 통합되는 벡터를 예로 들 수 있다. 바람직한 벡터는 자체적 복제 및/또는 그것이 연결되는 핵산의 발현이 가능한 것이다.
본원에 있어서 용어 "감소된(reduced)" 또는 "감소시키다(reduce)" 또는 "감소하다(decrease)"는 일반적으로 기준에 대하여 통계적으로 유의한 양만큼의 감소를 말한다. 의심을 피하기 위해, "감소된"은, 본원의 정의에 의하면, 기준 수준에 비해 적어도 10%의 통계적으로 유의한 감소, 예를 들면 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 또는 적어도 60%, 또는 적어도 70%, 또는 적어도 80%, 적어도 90% 또는 그 이상의, 100%의 감소(즉, 기준 샘플에 비해 부재 수준), 또는 기준 수준에 비해 10∼100% 사이의 임의의 감소를 의미한다.
본원에 있어서 용어 "낮은(low)"은 일반적으로 통계적 유의량만큼 더 낮은 것을 의미한다; 의심의 여지를 피하기 위해, "낮은"은 본원의 정의에 의하면, 기준 수준보다 적어도 10% 더 낮은, 예를 들면 기준 수준보다 적어도 20% 더 낮은, 기준 수준보다 적어도 30% 더 낮은, 기준 수준보다 적어도 40% 더 낮은, 기준 수준보다 적어도 50% 더 낮은, 기준 수준보다 적어도 60% 더 낮은, 기준 수준보다 적어도 70% 더 낮은, 기준 수준보다 적어도 80% 더 낮은, 기준 수준보다 적어도 90% 더 낮은, 기준 수준보다 100% 더 낮은(즉, 기준 샘플에 비해 부재 수준), 통계적 유의치를 말한다.
본원에 있어서 용어 "증가한(increased)" 또는 "증가하다(increase)"는 본원의 정의에 의하면, 일반적으로 통계적 유의량의 증가; 예컨대 기준 수준에 비해 적어도 10%의 통계적으로 유의한 증가를, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 100% 또는 그 이상의 증가(일체를 포함)를 포함하여, 예를 들면 기준 수준에 비해 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 10배 증가 또는 그 이상의 증가를 포함하여, 의미한다.
본원에 있어서 용어 "높은(high)"은 일반적으로 기준에 대하여 통계적 유의량만큼 더 높은 것을 의미한다; 예컨대 기준 수준에 비해 적어도 10% 더 높은 통계적 유의치, 예를 들면 기준 수준에 비해 적어도 20% 더 높은, 적어도 30% 더 높은, 적어도 40% 더 높은, 적어도 50% 더 높은, 적어도 60% 더 높은, 적어도 70% 더 높은, 적어도 80% 더 높은, 적어도 90% 더 높은, 적어도 100% 더 높은(일체를 포함), 예컨대 적어도 2배 더 높은, 적어도 3배 더 높은, 적어도 4배 더 높은, 적어도 5배 더 높은, 적어도 10배 더 높은 또는 그 이상 더 높은 통계적 유의치를 의미한다.
본원에 있어서 용어 "포함하는(comprising)"은 제시된 한정 요소들에 부가하여 다른 요소들도 존재할 수 있음을 나타낸다. "포함하는"의 사용은 한정보다는 내포를 가리킨다.
용어 "로 구성된(consisting of)"은 본원에 기술된 조성물, 방법, 및 이들의 각각의 구성요소가 실시형태의 설명에서 언급되지 않은 임의의 요소를 배제하는 것을 말한다.
본원에 있어서 용어 "로 본질적으로 이루어진(consisting essentially of)"은 주어진 실시형태에 필요한 요소들을 말한다. 이 용어는 본 발명의 그러한 실시형태의 기본적이고 신규하거나 기능성인 특성(들)에 실질적으로 영향을 주지 않는 추가 요소의 존재를 허용한다.
본 발명은 특정의, 넓은 스펙트럼, 또는 다양한 항원성 표적을 유발하도록 설계 및 제조될 수 있는 플렉서블하고 다용도의(flexible and versatile) 조성물을 제공한다. 표 1은 MAPS 실시형태의 플렉서블리티를 가시화하기 위한 간단한 예시 가이드를 제공한다.
[표 1]
MAPS 플랫폼의 다용도성
폴리머
MAPS의 일 성분은 전형적으로 폴리머인 "골격(backbone)"으로 이루어진다. 상기 폴리머는 항원성 또는 비항원성일 수 있다. 그것은 폴리머가 면역적 방식으로 면역 시스템에 관련 항원(들)을 제시하는 수단으로서 작용한다는 것에 유의하여 본원에 기술된 광범위한 물질로부터 제조될 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 폴리머는 합성 폴리머이다. 일부 실시형태에서, 상기 폴리머는 천연 발생 폴리머, 예를 들면 세균 세포로부터 유래한 또는 정제된 폴리사커라이드이다. 일부 실시형태에서, 상기 폴리사커라이드는 진핵 세포, 예를 들어, 진균, 곤충 또는 식물 세포로부터 유래 또는 정제된다. 또다른 실시형태에서, 상기 폴리머는 포유류 세포, 예컨대 바이러스-감염 세포 또는 암 세포로부터 유래한다. 일반적으로, 그러한 폴리머는 당 기술분야에 잘 알려져 있으며 본원에 개시된 방법 및 조성물에의 사용에 포함된다.
일부 실시형태에서, 폴리머는 덱스트란, 장티푸스균의 Vi 폴리사커라이드, 폐렴구균 피막 폴리사커라이드, 폐렴구균 세포벽 폴리사커라이드(CWPS), 수막구균 폴리사커라이드, 헤모필루스 인플루엔자 b형 폴리사커라이드, 또는 세균, 원핵생물 또는 진핵생물 기원의 임의의 다른 폴리사커라이드들로부터 선택된 폴리사커라이드이다.
일부 실시형태에서, 상기 폴리사커라이드는 항원성 당 부분으로 구성되거나 또는 항원성 당 부분을 포함한다. 예를 들면, 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 방법과 면역성 조성물에 사용되는 폴리사커라이드는 장티푸스균의 Vi 폴리사커라이드이다. Vi 피막 폴리사커라이드는 세균성 장 감염, 예컨대 장티푸스에 대해 개발되었다. Robbins et al., 150 J. Infect. Dis. 436(1984); Levine et al., 7 Baillieres Clin. Gastroenterol. 501(1993). Vi는 C-2 위치에 N 아세틸 및 C-3 위치에 가변의 O-아세틸화된, α1→4-갈락투론산의 폴리머이다. 장티푸스균의 독성(virulence)은 이 분자의 발현과 관련되어 있다. Sharma et al., 101 PNAS 17492(2004). 장티푸스균의 Vi 폴리사커라이드 백신은 몇가지 이점을 갖는다: 부작용이 드물고 마일드하며, 1회량으로 일관된 면역성 및 효능을 낳는다. Vi 폴리사커라이드는 다른 폴리사커라이드 백신에 대해 실증된 물리화학적 방법에 의해 신뢰성 있게 표준화될 수 있으며, Vi는 실온에서 안정하고, 면역성 및 인용성(tolerability)에 영향을 끼치지 않고 다른 백신들과 동시에 투여될 수 있다. Azze et al., 21 Vaccine 2758(2003).
따라서, 장티푸스균의 Vi 폴리사커라이드는, 그 폴리사커라이드에 적어도 하나의 항원을 부착하기 위해, 본원에 개시된 제1 친화성 분자에 가교될 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원은 얻어지는 면역성 조성물이 하나의 병원체, 또는 두개의 상이한 병원체들에 대해 적어도 일정 수준의 면역을 부여하도록 동일한 또는 상이한 유기체에서 유래하며; 항원이 폐렴구균에 대한 방어를 부여하면, 폴리머 스캐폴드가 Vi 폴리사커라이드인 면역성 조성물은 장티푸스균과 폐렴구균 둘다에 대한 면역 반응을 상승시킬 수 있다. 다른 예에는 2개의 다른 병원체들에 대한 면역 반응을 일으키는 면역성 조성물을 제공하기 위해, 피막화 세균(예컨대 수막구균, 황색포도구균, 폐렴구균, Hib, 등)으로부터의 당과 결핵 항원들을 조합하는 것이 포함된다.
덱스트란, 세균 세포벽 폴리사커라이드(CWPS) 등의 대안으로서 본 발명에 사용될 수 있는 다른 폴리사커라이드(PS) 부분들에는, 암의 탄수화물 항원들이 포함된다.
폐렴구균 폴리사커라이드에 관해 부연하면, 상기 폴리사커라이드는 현재까지 동정된 폐렴구균의 93개 이상의 혈청형 중 임의의 것, 예를 들면, 혈청형 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 6C, 6D, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F, 및 33F이나 이에 한정되지 않는 것에 유래할 수 있다. 추가의 혈청형들이 동정되어 본원에 기술된 본 면역성 조성물에 포함될 수 있다. 1 이상의 폐렴구균 폴리사커라이드가 본 면역성 조성물 또는 본 MAPS 조성물을 포함하는 백신의 폴리머 골격에 포함될 수 있다.
상기 폴리사커라이드는 상기 발명으로부터 유래할 수 있으며, 상기 면역성 조성물은 혈청그룹 A, C, W, W135, 또는 Y 중 적어도 1개, 2개, 3개 또는 4개로부터의 수막염균 피막 폴리사커라이드(N. meningitidis capsular polysaccharides)를 포함한다.
추가의 실시형태는 황색포도구균의 폴리사커라이드 또는 올리고사커라이드의 5형, 8형, 또는 임의의 것을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 폴리머는 1종 이상의 폴리머를 포함하는 키메라 폴리머이다. 예를 들면 본원에 개시된 면역성 조성물의 폴리머는 일부분의 폴리머 A와 나머지 부분의 폴리머 B를 포함할 수 있다. 단일 MAPS 골격 독립체(entity)에 사용될 수 있는 상이한 종류들의 폴리머들의 양에는 제한이 없다. 폴리머가 분지된 폴리머인 일부 실시형태에서, 체인 폴리머는 폴리머 A일 수 있고, 분지는 적어도 1개 또는 적어도 2개 또는 적어도 3개 또는 그 이상의 다른 폴리머일 수 있다.
일부 실시형태에서, 상기 폴리머는 분지된 폴리머이다. 일부 실시형태에서, 상기 폴리머는 단쇄 폴리머이다.
일부 실시형태에서, 상기 폴리머는 적어도 10개의 탄수화물 반복 단위, 또는 적어도 20개, 또는 적어도 50개, 또는 적어도 75개, 또는 적어도 100개, 또는 적어도 150개, 또는 적어도 200개, 또는 적어도 250개, 또는 적어도 300개, 또는 적어도 350개, 또는 적어도 400개, 또는 적어도 450개, 또는 적어도 500개, 또는 500개 초과의(일체를 포함) 반복 단위를 포함하는 폴리사커라이드이다.
본 발명의 하나의 태양에서, 상기 폴리사커라이드(PS)는 <500 kDa 또는 >500 kDa의 분자 질량을 가질 수 있다. 본 발명의 다른 태양에서, 상기 PS는 <70 kDa의 분자 질량을 가질 수 있다.
일부 실시형태에서, 폴리머는 고분자량 폴리머이며, 예를 들어, 폴리머 는 평균 분자량이 약 425∼500kDa(일체를 포함)일 수 있고, 예를 들면, 적어도 300kDa, 또는 적어도 350kDa, 또는 적어도 400kDa, 또는 적어도 425kDa, 또는 적어도 450kDa, 또는 적어도 500kDa 또는 500kDa 초과(일체를 포함)일 수 있으나 전형적으로는 500kDa 미만이다.
일부 실시형태에서, 폴리머는 소분자량 폴리머일 수 있으며, 예를 들어, 폴리머는 평균 분자량이 약 60kDA∼약 90kDa, 예를 들면, 적어도 50kDa, 또는 적어도 60kDa, 또는 적어도 70kDa, 또는 적어도 80kDa, 또는 적어도 90kDa, 또는 적어도 100kDa, 또는 100kDa 초과(일체를 포함)일 수 있으나, 일반적으로는 약 120kDa 미만이다.
일부 실시형태에서, 상기 폴리머는 천연 공급원으로부터 취출되어 정제되고, 다른 실시형태에서, 상기 폴리머는 합성이다. 합성 폴리사커라이드를 포함, 합성 폴리머를 생산하는 방법은, 당업자에게 알려져 있으며 본원에 개시된 조성물과 방법에 포함된다.
1개 이상의 항원 또는 항원 유형들에 대한 골격으로서 기능할 수 있는 폴리사커라이드 폴리머들 중 일부만을 표 2에 예시한다:
폴리사커라이드 |
단백질 항원 | ||
항원의 수 | 항원 기원 | ||
덱스트란 |
D90(60-90KD) | 2 | 폐렴구균 |
D150(150 KD) | 3 | 폐렴구균 | |
D270(270 KD) | 3 | 폐렴구균 | |
D500(425-575 KD) | 2; 3; 6 | 폐렴구균 | |
폐렴구균 피막 폴리사커라이드 |
혈청형 1 | 1, 2, 3, 5 | 폐렴구균, 결핵, 포도구균 |
혈청형 3 | 5 | 폐렴구균, 결핵 | |
혈청형 5 | 1; 2; 3; 5 | 폐렴구균, 결핵 | |
혈청형 6B | 2 | 폐렴구균 | |
혈청형 7 | 3 | 폐렴구균 | |
혈청형 14 | 1; 2; 3; 5 | 폐렴구균, 결핵 | |
혈청형 19 | 3 | 폐렴구균 | |
폐렴구균 세포벽 폴리사커라이드 | 5 | 폐렴구균 | |
장티푸스균 Vi 폴리사커라이드 | 5 | 폐렴구균 |
본원에 개시된 면역성 MAPS 조성물에 사용될 수 있는 추가의 폴리머에는 폴리에틸렌 글리콜계 폴리머, 폴리(오르쏘 에스테르) 폴리머, 폴리아크릴 담체, PLGA, 폴리에틸렌이민(PEI), 폴리아미도아민(PAMAM) 덴드리머, β-아미노 에스테르 폴리머, 폴리포스포에스테르(PPE), 리포좀, 폴리머로좀(polymerosome), 핵산, 포스포로티오에이트화 올리고뉴클레오티드, 키토산, 실크, 폴리머 미셀, 단백질 폴리머, 바이러스 입자, 바이러스-유사-입자(VLP) 또는 다른 마이크로-입자가 포함된다. 참조, 예를 들어, El-Sayed et al., Smart Polymer Carriers for Enhanced Intracellular Delivery of Therapeutic Molecules, 5 Exp. Op. Biol. Therapy, 23 (2005). 핵산 전달을 위해 개발된 생체적합성 폴리머는 본원에 기술된 골격으로서의 사용에 알맞을 수 있다. 참조, 예를 들어, BIOCOMPATIBLE POL. NUCL. ACID. DELIV. (Domb et al., eds., John Wiley & Sons, Inc. Hoboken, NJ, 2011).
예를 들면, VLP들은 바이러스에 닮았지만, 비전염성인데 왜냐하면 그것들은 바이러스성 유전물질을 전혀 함유하지 않기 때문이다. 바이러스 구조 단백질, 예컨대 외피 또는 캡시드 성분들의 재조합 발현을 포함하는 발현은 VLP들의 자기 집합(self-assembly)을 야기할 수 있다. VLP들은 파르보바이러스과(예: 아데노-관련 바이러스), 레트로바이러스과(예: HIV), 및 플라비바이러스과(예: B형 간염 또는 C 바이러스)를 포함하는 광범위한 바이러스 패밀리의 성분들로부터 생산되었다. VLP는 포유류 세포주, 곤충 세포주, 효모, 및 식물 세포를 포함하는 다양한 세포 배양 시스템에서 생산될 수 있다. 재조합 VLP들은 특히 유용한데 왜냐하면 바이러스 성분이 본원에 기술된 재조합 항원들에 융합될 수 있기 때문이다.
항원
본원에 개시된 면역성 조성물은 대상체에서 면역 반응을 끌어내는 임의의 항원을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 적어도 1개 또는 그 이상의 항원은 조성물의 폴리머와 결합되어 있다. 일부 실시형태에서, 적어도 2개, 또는 적어도 3개, 또는 적어도 5개, 또는 적어도 10개, 또는 적어도 15개, 또는 적어도 20개, 또는 적어도 50개, 또는 적어도 100개, 또는 100개 초과의 항원들이 본원에 개시된 폴리머에 결합될 수 있다. 면역성 조성물이 1개 이상의 항원을 포함하는 일부 실시형태에서, 항원들은 동일한 항원일 수 있고 또는 항원은 상기 폴리머와 결합된 다양한 상이한 항원들일 수 있다. 면역성 조성물이 1개 이상의 항원을 포함하는 일부 실시형태에서, 항원들은 동일한 병원체 또는 상이한 병원체들로부터의 항원일 수 있으며, 또는 대안적으로, 동일한 병원체로부터의 상이한 항원들, 또는 상이한 혈청형의 병원체들로부터의 유사한 항원들일 수 있다.
본원에 기술된 면역성 조성물과 방법에 사용되는 항원은 병원성 펩티드, 독소, 톡소이드, 그 서브유닛, 또는 이들의 조합(예: 콜레라 독소, 파상풍 톡소이드)을 포함하나 이에 한정되지 않는 임의의 항원일 수 있다 .
일부 실시형태에서, 상기 상보적 친화성 분자에 융합될 수 있는 항원은 전염성 질환, 또는 암 또는 면역질환과 관련된 임의의 항원일 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원은 바이러스, 세균, 진균 또는 기생생물을 포함하는 임의의 다양한 감염원에 의해 발현되는 항원일 수 있다.
일부 실시형태에서, 항원은 병원성 유기체로부터 유래한다(예: 얻어진다). 일부 실시형태에서, 상기 항원은 암 또는 종양 항원, 예를 들면, 종양 또는 암 세포에서 유래한 항원이다.
일부 실시형태에서, 병원성 유기체에 유래하는 항원은 전염성 질환과 관련되며; 그것은 바이러스, 세균, 진균 또는 기생생물을 포함하는 다양한 감염원들 중의 어느 것으로부터 유래할 수 있다.
일부 실시형태에서, 표적 항원은 병리학, 예를 들면 전염성 질환 또는 병원체, 또는 암 또는 면역질환, 예컨대 자가면역질환과 관련된 임의의 항원이다. 일부 실시형태에서, 항원은 바이러스, 세균, 진균 또는 기생생물을 포함하는 다양한 감염원들 중 어느 것에 의해 발현될 수 있다. 본원에 개시된 방법 및 조성물에 사용되는 표적 항원에는 예를 들면, 병원성 펩티드, 독소, 톡소이드, 그 서브유닛, 또는 이들의 조합(예: 콜레라 독소, 파상풍 톡소이드)이 포함될 수 있다.
전염 바이러스의 비제한적 예에는 다음이 포함된다: 레트로바이러스과(Retroviridae); 피코르나바이러스과(Picornaviridae)(예를 들면, 폴리오 바이러스(polio viruses), A형 간염 바이러스(hepatitis A virus); 장바이러스(enteroviruses), 인간 콕사키 바이러스(human coxsackie viruses), 리노바이러스(rhinoviruses), 에코바이러스(echoviruses)); 칼시바이러스과(Calciviridae)(위창자염(gastroenteritis)을 일으키는 종 등); 토가바이러스과(Togaviridae)(예를 들면, 말 뇌염 바이러스(equine encephalitis viruses), 풍진 바이러스(rubella viruses)); 플라바이러스과(Flaviridae)(예를 들면, 뎅기 바이러스(dengue viruses), 뇌염 바이러스(encephalitis viruses), 황열병 바이러스(yellow fever viruses)); 코로나바이러스과(Coronaviridae)(예를 들면, 코로나바이러스(coronaviruses)); 라브도바이러스과(Rhabdoviridae)(예를 들면, 소수포구내염 바이러스(vesicular stomatitis viruses), 광견병 바이러스(rabies viruses)); 필로바이러스과(Filoviridae)(예를 들면, 에볼라 바이러스(ebola viruses)); 파라믹소바이러스과(Paramyxoviridae)(예를 들면, 파라인플루엔자 바이러스(parainfluenza viruses), 볼거리 바이러스(mumps virus), 홍역 바이러스(measles virus), 호흡기 세포융합 바이러스(respiratory syncytial virus)); 오르쏘믹소바이러스과(Orthomyxoviridae)(예를 들면, 인플루엔자 바이러스(influenza viruses)); 분가바이러스과(Bungaviridae)(예를 들면, 한탄 바이러스(Hantaan viruses), 분가 바이러스(bunga viruses), 플레보바이러스(phleboviruses) 및 나이로바이러스(Nairo viruses)); 아레나바이러스과(Arena viridae)(출혈열 바이러스(hemorrhagic fever viruses)); 레오바이러스과(Reoviridae)(예: 레오바이러스(reoviruses), 오르비바이러스(orbiviurses) 및 로타바이러스(rotaviruses)); 비르나바이러스과(Birnaviridae); B형 간염 바이러스과(Hepadnaviridae)(B형 간염 바이러스(Hepatitis B virus)); 파르보바이러스과(Parvoviridae)(파르보바이러스(parvoviruses)); 파포바바이러스과(Papovaviridae)(파필로마바이러스(papilloma viruses), 폴리오마 바이러스(polyoma viruses)); 아데노바이러스과(Adenoviridae)(대부분의 아데노바이러스들(adenoviruses)); 헤르페스바이러스과(Herpesviridae)(단순 헤르페스 바이러스(herpes simplex virus)(HSV) 1 및 HSV-2, 수두 대상포진 바이러스(varicella zoster virus), 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus(CMV)), 마레크병(Marek's disease) 바이러스, 헤르페스 바이러스(herpes viruses)); 마마바이러스과(Poxviridae)(두창 바이러스(variola viruses), 우두 바이러스(vaccinia viruses), 마마 바이러스(pox viruses)); 및 이리도바이러스과(Iridoviridae)(예컨대 아프리칸 돼지콜레라바이러스(African swine fever virus)); 및 미분류 바이러스들(예를 들면, 해면형 뇌증(Spongiform encephalopathies)의 병원 인자들, 델타 간염 인자들(B형 간염 바이러스의 결함있는 새털라이트(satellite)라고 생각됨), 비-A형, 비-B형 간염 인자들(클래스 1=내부로 전염된; 클래스 2=비경구적으로 전염된(즉, C형 간염)); 노르왁(Norwalk) 및 관련 바이러스, 및 아스트로바이러스(astroviruses)). 본원에 기술된 조성물과 방법은 이들 바이러스 인자들에 의한 감염의 치료에 사용하는 것이 고려된다.
본 실시형태에서 항원의 포함에 의해 언급되는 진균 감염의 예에는 아스페르길루스증(aspergillosis); 아구창(thrush)(칸디다 알비칸스(Candida albicans)에 의해 유발); 크립토콕쿠스증(cryptococcosis)(크립토콕쿠스(Cryptococcus)에 의해 유발); 및 히스토플라스마증(histoplasmosis)이 포함되나 이에 한정되는 것은 아니다 . 따라서, 전염성 진균의 예에는, 크립토콕쿠스 네오포르만스(Cryptococcus neoformans), 히스토플라스마 캅슐라툼(Histoplasma capsulatum), 콕시디오이데스 이미티스(Coccidioides immitis), 블라스토마이세스 데르마티티디스(Blastomyces dermatitidis), 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis), 칸디다 알비칸스(Candida albicans)가 포함되나 이에 한정되는 것은 아니다. 이들 유기체 성분들은 본원에 기술된 MAPS 내에 항원들로서 포함될 수 있다.
본 발명의 하나의 태양에서, 항원은 전염성 미생물 예컨대 백일해균(Bordatella pertussis), 브루셀라(Brucella), 장구균 종(Enterococci sp.), 수막염균(Neisseria meningitidis), 임균(Neisseria gonorrheae), 모락셀라(Moraxella), 분류가능한 또는 분류불가능한 헤모필루스(Haemophilus), 슈도모나스(Pseudomonas), 살모넬라(Salmonella), 시겔라(Shigella), 엔테로박터(Enterobacter), 시트로박터(Citrobacter), 클레브시엘라(Klebsiella), 대장균(E. coli), 헬리코박터 필로리(Helicobacter pylori), 클로스트리디아(Clostridia), 박테로이데스(Bacteroides), 클라미디아 과(Chlamydiaceae), 콜레라균(Vibrio cholera), 마이코플라즈마(Mycoplasma), 트레포네마(Treponemes), 보렐리아 부르그도르페리(Borelia burgdorferi), 레지오넬라 뉴모필리아(Legionella pneumophilia), 항산균 종(Mycobacteria sps)(예컨대 결핵균(M. tuberculosis), 마이코박테리움 아비움(M. avium), 마이코박테리움 인트라셀룰라(M. intracellulare), 마이코박테리움 간사이이(M. kansaii), 마이코박테리움 고르도내(M. gordonae), 나균(M. leprae)), 황색포도구균(Staphylococcus aureus), 단구성 리스테리아균(Listeria monocytogenes), 화농연쇄구균(Streptococcus pyogenes)(그룹 A 연쇄구균), 스트렙토콕쿠스 아갈락티애(Streptococcus agalactiae)(그룹 B 연쇄구균), 연쇄구균(Streptococcus)(비리던스 그룹(viridans group)), 대변연쇄구균(Streptococcus faecalis), 스트렙토콕쿠스 보비스(Streptococcus bovis), 연쇄구균(혐기성 종), 폐렴연쇄구균(Streptococcus pneumoniae), 병원성 캄필로박터 종(pathogenic Campylobacter sp.), 장구균 종(Enterococcus sp.), 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae), 탄저균(Bacillus anthracis), 디프테리아균(Corynebacterium diphtheriae), 코리네박테리움 종(Corynebacterium sp.), 단독균(Erysipelothrix rhusiopathiae), 클로스트리듐 퍼프린젠스(Clostridium perfringens), 파상풍균(Clostridium tetani), 엔테로박터 에어로게네스(Enterobacter aerogenes), 폐렴막대균(Klebsiella pneumoniae), 렙토스피라 종(Leptospira sps.), 파스튤렐라 뮬토시다(Pasturella multocida), 박테로이데스 종(Bacteroides sp.), 푸소박테리움 누클레아툼(Fusobacterium nucleatum), 모닐리포르미스사슬막대균(Streptobacillus moniliformis), 트레포네마 팔리디움(Treponema pallidium), 트레포네마 페르테뉴(Treponema pertenue), 및 방선균(Actinomyces israelli)으로부터 유래된다. 본원에 기술된 조성물과 방법은 이들 세균성 병원체에 대한 감염의 치료 또는 예방에의 사용이 고려된다.
항원이 유래할 수 있는 추가의 기생생물 병원체에는 예를 들면, 이질아메바(Entamoeba histolytica), 열대열원충(Plasmodium falciparum), 리슈만편모충 종(Leishmania sp.), 톡소포자충(Toxoplasma gondii), 리케챠(Rickettsia), 및 연충류(Helminths)가 포함된다.
본 발명의 다른 태양에서, 항원은 절단된 폐렴구균 PsaA 단백질(truncated pneumococcal PsaA protein), 폐렴구균 용혈소 톡소이드 폐렴구균 세린/트레오닌 단백질 키나제(pneumolysin toxoid pneumococcal serine/threonine protein kinase)(StkP), 폐렴구균 세린/트레오닌 단백질 키나제 반복 단위(pneumococcal serine/threonine protein kinase repeating unit)(StkPR), 폐렴구균 PcsB 단백질(pneumococcal PcsB protein), 포도구균 알파 용혈소(staphylococcal alpha hemolysin), 결핵균 mtb 단백질(Mycobacterium tuberculosis mtb protein) ESAT-6, 결핵균 세포벽 중심 항원(M. tuberculosis cell wall core antigen), 클라미디아(Chlamydia) CT144, CT242또는 CT812 폴리펩티드 또는 이들의 단편들, 클라미디아 DNA 자이라제(gyrase) 서브유닛B, 클라미디아 설파이트 합성/중인산염 포스파타제(Chlamydia sulfite synthesis/biphosphate phosphatase), 클라미디아 세포 분할 단백질(Chlamydia cell division protein) FtsY, 클라미디아 메티오닐-tRNA 합성효소, 클라미디아 DNA 헬리카제(helicase)(uvrD), 클라미디아 ATP 합성효소 서브유닛I(atpI), 또는 클라미디아 금속 의존성 가수분해효소(Chlamydia metal dependent hydrolase)이다.
본 발명의 실시형태는 병원체 결핵균(TB), 세포내의 세균성 기생생물을 표적으로 하는 면역성 조성물을 제공한다. TB 항원의 일 예는 TbH9(Mtb 39A로도 알려져 있음)이다. 다른 TB 항원에는 DPV(Mtb8.4로도 알려져 있음), 381, Mtb4l, Mtb40, Mtb32A, Mtb64, Mtb83, Mtb9.9A, Mtb9.8, Mtb16, Mtb72f, Mtb59f, Mtb88f, Mtb7lf, Mtb46f 및 Mtb31f(여기서 "f"는 융합 또는 2 이상의 단백질임을 나타냄)가 포함되나 이에 한정되는 것은 아니다.
상술한 바와 같이, 본 발명의 면역성 조성물에 사용되는 항원은 클라미디아 종으로부터 유래될 수 있다. 클라미디아 과(Chlamydiaceae)(클라미디아(Chlamydiae)와 클라미도필라(Chlamydophila)로 구성됨)는 절대 세포내 그램 음성 세균(obligate intracellular gram-negative bacteria)이다. 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis) 감염은 가장 만연한 세균성 성적 전염 감염에 속하며, 아마도 매년 8천 9백만의 신규 생식기 클라미디아 감염이 일어난다. 본 발명의 클라미디아에는 예를 들면, 클라미디아 트라코마티스(C. trachomatis), 클라미도필라 뉴모니애(Chlamydophila pneumoniae), 클라미디아 미리다룸(C. muridarum), 클라미디아 수이스(C. suis), 클라미도필라 아보르투스(Chlamydophila abortus), 클라미도필라 프시타시(Chlamydophila psittaci), 클라미도필라 카비애(Chlamydophila caviae), 클라미도필라 펠리스(Chlamydophila felis), 클라미도필라 페코룸(Chlamydophila pecorum), 및 클라미디아 뉴모니애(C. pneumoniae)가 포함된다. 클라미디아 감염의 동물 모델은 T-세포가 초기 감염의 박멸과 민감성 숙주의 재감염으로부터의 방어 양쪽에 있어서 결정적인 역할을 함을 확고히 하였다. 따라서, 본원에 개시된 면역성 조성물이 사용되어 클라미디아 감염에 대한 세포 면역 반응을 끌어냄에 의해 특별한 가치를 제공할 수 있다.
더 구체적으로, 본 발명에 유용한 클라미디아 항원에는 DNA 자이레이즈 서브유닛 B, 설파이트 합성/중인산염 포스파타제, 세포 분할 단백질 FtsY, 메티오닐-tRNA 합성효소, DNA 헬리카제(uvrD); ATP 합성효소 서브유닛 I(atpI) 또는 금속-의존성 가수분해효소(미국 특허출원 공개 제20090028891)가 포함된다. 추가의 클라미디아 트라코마티스 항원에는 CT144 폴리펩티드, CT144의 아미노산 잔기 67-86을 갖는 펩티드, CT144의 아미노산 잔기 77-96을 갖는 펩티드, CT242 단백질, CT242의 아미노산 109-117을 갖는 펩티드, CT242 폴리펩티드의 아미노산 112-120을 갖는 펩티드, CT812 단백질(pmpD 유전자로부터의), CT812 단백질의 아미노산 잔기 103-111를 갖는 펩티드; 및 클라미디아 트라코마티스로부터의 수개의 상이한 항원성 펩티드들: NVTQDLTSSTAKLECTQDLI(서열번호 2), AKLECTQDLIAQGKLIVTNP(서열번호 3), SNLKRMQKI(서열번호 4), AALYSTEDL(서열번호 5), FQEKDADTL(서열번호 6), QSVNELVYV(서열번호 7), LEFASCSSL(서열번호 8), SQAEGQYRL(서열번호 9), GQSVNELVY(서열번호 10), 및 QAVLLLDQI(서열번호 11)가 포함된다. 참조 WO 2009/020553. 또한, 전술한 폴리펩티드의 동족체를 포함하는 클라미디아 뉴모니애 항원(참조 미국 특허 제6,919,187호)도 본원에 개시된 면역성 조성물 및 방법에 사용될 수 있다.
진균 항원은 칸디다 종 및 다른 효모; 또는 다른 진균(아스페르길루스(aspergillus), 다른 환경 진균)로부터 유래될 수 있다. 다른 기생생물에 관해서는, 말라리아 뿐만 아니라 충(worm) 및 아메바도 본원에 개시된 면역성 조성물과 방법에 사용하기 위한 항원성 항원을 제공할 수 있다.
항원이 항-인플루엔자 면역원을 생성하는 일부 실시형태에서, 표면 글리코단백질 헤마글루티닌(hemagglutinin)(HA) 및 노이라미다제(neuraminidase)(NA)는 일반적으로 선택되는 항원이다. 핵단백질(NP) 폴리펩티드 및 기질(M)은 내재적 바이러스 단백질이며 따라서 항체-기반 면역을 위한 백신 설계에 통상 고려되지 않는다. 인플루엔자 백신은 통상 인간에게 사용되며, 불활성화된 전 인플루엔자 바이러스, 약독생 인플루엔자 바이러스, 또는 바이러스 주로부터의 정제되고 불활성화된 물질로부터 유래된 백신을 포함한다. 예를 들면, 전통적 인플루엔자 백신은 3주(strain)의 강력하게 위협적인 플루 바이러스를 사용하여 제조될 수 있다. 이들 주(strain)는 통상 수정 계란에서 생육되며, 난(egg) 접종 및 인큐베이션, 난을 거두어들이고(harvest), 바이러스 정제 및 불활성화, 최종 백신 제제로 바이러스 또는 바이러스 성분을 프로세싱 및 저류(pooling), 및 적절한 용기 내에 무균 충전(aseptic filling)을 포함하는 광범위한 프로세싱이 요구된다. 전형적으로, 이 난-기반 생산 사이클은 70주 넘게 걸린다. 주요 유행성 인플루엔자 유행 이벤트에 있어서, 강력하고 안전한 백신의 이용가능성은 주요 관심사이다. 또한, 난 내의 불순물, 예컨대 백신 멸균성에 부정적인 영향을 미치는 항생제 및 오염물에 관련된 위험이 있다. 게다가, 난-유도 플루 백신들은 난 단백질에 대해 심각한 알러지를 가진 자들과 길리언 바르 증후군(Guillain-Barre syndrome)의 이력을 갖는 사람들에게 금기이다. 본 발명은 난-기반 인플루엔자 백신에 대한 대안을 제공하며, 난-관련 후유증들을 회피할 뿐 아니라 고도로 제어된 플랫폼에서 다수의 인플루엔자 항원들을 사용하기 위한 플랫폼을 제공한다.
일부 실시형태에서, 본원에 개시된 면역성 조성물에 사용되는 항원에는 세균전에서 사용되는 것들, 예컨대 CMI 반응을 일으킬 수 있는 리신(ricin)이 포함될 수 있다.
또한, 본 발명은 암에 대한 면역 반응을 일으키는 항원들을 포함하는 면역성 조성물도 제공한다. 이들 접합체에 있어서, 항원은 암 또는 종양에 의해 발현되되거나 또는 종양으로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 그러한 항원들은 본원에서 "암 항원"이라 하며 그 접합체가 이 단백질에 강력한 체액성 및 강력한 세포 면역 둘다를 끌어내도록 하는 전형적으로 주로 암 세포에 발현되는 단백질이다. 많은 암-관련 항원들이 동정되었으며, 그들 중 수개는 현재 실험적 암 치료 백신의 제조에 사용되고 있으며 따라서 본 실시형태에 사용하기에 적절하다. 1종 이상의 암과 연관된 항원들에는 암배아 항원(Carcinoembryonic antigen)(CEA); 암/고환 항원들, 예컨대 NY-ESO-1; 뮤신-1(MUC1) 예컨대 시알릴(Sialyl) Tn(STn); 강글리오시드(Gangliosides), 예컨대 GM3 및 GD2; p53 단백질; 및 HER2/neu 단백질(ERBB2로도 알려져 있음)이 포함된다. 특정 유형의 암에 고유한 항원에는, EGFRvIII로 불리는, 상피 성장 인자 수용체의 돌연변이형 ; 멜라닌세포(Melanocyte)/흑색종(melanoma) 분화 항원들, 예컨대 티로시나제(tyrosinase), MART1, gp100, 계통 관련 암-고환 그룹( lineage related cancer-testis group)(MAGE) 및 티로시나제-관련 항원; 전립선-특이적 항원; 백혈병-관련 항원(LAAs), 예컨대 융합 단백질 BCR-ABL, 윌름즈 종양 단백질(Wilms' tumour protein) 및 단백질분해효소 3; 및 이디오타입(Idiotype)(Id) 항체들이 포함된다. 참조, 예를 들어, Mitchell, 3 Curr. Opin. Investig. Drugs 150(2002); Dao & Scheinberg, 21 Best Pract. Res. Clin. Haematol. 391(2008).
암에 대한 면역 반응을 생성하는 다른 접근 방식은 암의 발병을 일으키거나 또는 기여하는 미생물로부터의 항원들을 채용한다. 이들 백신은 간세포 암종(B형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스, 타이간흡충(Opisthorchis viverrin)), 림프종 및 비인두암종(엡스타인 바 바이러스(Epstei-Barr virus)), 결장직장암, 위암(헬리코박터 필로리), 방광암(방광주혈흡충(Schisosoma hematobium)), T-세포 백혈병(인간 T-세포 림프친화 바이러스(human T-cell lymphtropic virus)), 자궁경부암(인간 파필로마바이러스), 및 기타를 포함하는 암에 대해 사용되어 왔다. 지금까지, 방광암, 뇌종양, 유방암, 자궁경부암, 신장암, 흑색종, 다발골수종, 백혈병, 폐암, 췌장암, 전립선암, 및 고형 종양을 표적으로 하는 백신에 대한 임상 시험이 있었다. 참조 Pardoll et al., ABELOFF'S CLIN. ONCOL.(4th ed., Churchill Livingstone, Philadelphia 2008); Sioud, 360 Methods Mol. Bio. 277(2007); Pazdur et al., 30 J. Infusion Nursing 30(3):173(2007); Parmiani et al., 178 J. Immunol. 1975(2007); Lollini et al., 24 Trends Immunol. 62(2003); Schlom et al., 13 Clin. Cancer Res. 3776(2007); Banchereau et al., 392 Nature 245(1998); Finn, 358 New Engl. J. Med. 2704(2008); Curigliano et al., 7 Exp. Rev. Anticancer Ther. 1225(2007). 가금류에서 종양을 일으키는 마레크병(Marek's disease) 바이러스, 헤르페스 바이러스는, 백신에 의해 오랫동안 관리되어 왔다. 따라서, 본 실시형태는 예방적(preventive) 또는 예방적(prophylactic) 항암 면역성 조성물 및 처치/치료적 암 백신 둘다를 포함한다.
고려되는 증식성의 질환 및 암에는 AIDS 관련 암, 청신경종(acoustic neuroma), 급성 림프구성 백혈병(acute lymphocytic leukemia), 급성 골수성 백혈병(acute myeloid leukemia), 샘낭 암종(adenocystic carcinoma), 부신피질암(adrenocortical cancer), 원인불명골수화생(agnogenic myeloid metaplasia), 탈모증(alopecia), 포상연부육종(alveolar soft-part sarcoma), 항문암, 혈관육종(angiosarcoma), 별아교세포종(astrocytoma), 실조-모세혈관확장증(ataxia-telangiectasia), 기저 세포 암종(basal cell carcinoma)(피부), 방광암, 골암, 장암, 뇌 및 CNS 종양, 유방암, 유암종 종양(carcinoid tumors), 자궁경부암, 소아기 뇌종양, 소아기암, 소아기 백혈병, 소아기 연조직 육종(childhood soft tissue sarcoma), 연골육종(chondrosarcoma), 융모막암종(choriocarcinoma), 만성 림프구성 백혈병(chronic lymphocytic leukemia), 만성 골수성 백혈병(chronic myeloid leukemia), 결장직장암(colorectal cancers), 피부 T-세포 림프종(cutaneous t-cell lymphoma), 피부섬유육종(dermatofibrosarcoma-protuberans), 결합조직형성-소원형-세포-종양(desmoplastic-small-round-cell-tumour), 도관 암종(ductal carcinoma), 내분비 암(endocrine cancers), 자궁내막암(endometrial cancer), 뇌실막종(ependymoma), 식도암(esophageal cancer), 유잉 육종(Ewing's sarcoma), 간외 담관암(extra-hepatic bile duct cancer), 눈암(예를 들어, 눈 흑색종(eye melanoma) 및 망막모세포종(retinoblastoma)을 포함), 난관암(fallopian tube cancer), 판코니 빈혈(fanconi anemia), 섬유육종(fibrosarcoma), 담낭암(gall bladder cancer), 위암(gastric cancer), 위장암(gastrointestinal cancers), 위장-유암종종양(gastrointestinal-carcinoid-tumour), 비뇨생식암(genitourinary cancers), 생식세포 종양(germ cell tumors), 임신융모막 질환(gestational-trophoblastic disease), 신경아교종(glioma), 부인과 암(gynecological cancers), 혈액암(hematological malignancies), 털세포 백혈병(hairy cell leukemia), 두경부암, 간세포암(hepatocellular cancer), 유전 유방암(hereditary breast cancer), 호지킨병(Hodgkin's disease), 인간 파필로마바이러스-관련 자궁경부암, 포상기태(hydatidiform mole), 하인두암(hypopharynx cancer), 소도세포암(islet cell cancer), 카포시 육종(Kaposi's sarcoma), 신장암, 후두암, 평활근육종(leiomyosarcoma), 백혈병, 리-프라우메니 증후군(Li-Fraumeni syndrome), 입술암, 지방육종(liposarcoma), 폐암, 림프부종(lymphedema), 림프종(lymphoma), 비호지킨 림프종(non-Hodgkin's lymphoma), 남성 유방암, 신장의 악성 간상 종양(malignant-rhabdoid-tumour-of-kidney), 수모세포종(medulloblastoma), 흑색종(melanoma), 메르켈세포암(Merkel cell cancer), 중피종(mesothelioma), 전이성 암(metastatic cancer), 구강암, 다발 내분비 신생물(multiple endocrine neoplasia), 균상식육종(mycosis fungoides), 골수 형성이상 증후군(myelodysplastic syndromes), 골수종(myeloma), 골수증식성 질환(myeloproliferative disorders), 비암, 비강인두암, 신장모세포종(nephroblastoma), 신경모세포종(neuroblastoma), 신경섬유종증(neurofibromatosis), 니스메겐 파손 증후군(Nijmegen breakage syndrome), 비흑색종 피부암(non-melanoma skin cancer), 비소세포폐암(NSCLC), 구강암, 구인두암(oropharynx cancer), 골육종(osteosarcoma), 오스토미 난소암(ostomy ovarian cancer), 췌장암(pancreas cancer), 파라비암(paranasal cancer), 부갑상선암, 이하선암, 음경암, 말초-신경외배엽-종양(peripheral-neuroectodermal-tumours), 뇌하수체암, 진성적혈구증가증(polycythemia vera), 전립선암(rhabdomyosarcoma), 콩팥 세포 암종, 망막모세포종(retinoblastoma), 횡문근육종(rhabdomyosarcoma), 로트문드 톰슨 증후군(Rothmund-Thomson syndrome), 침샘 암(salivary gland cancer), 육종(sarcoma), 슈반세포종(Schwannoma), 세자리증후군(Sezary syndrome), 피부암, 소세포 폐암(SCLC), 소장암, 연조직 육종(soft tissue sarcoma), 척수 종양, 편평-세포-암종(squamous-cell-carcinoma)(피부), 위암, 윤활막 육종(synovial sarcoma), 고환암(testicular cancer), 가슴샘암(thymus cancer), 갑상선암, 이행세포암(transitional-cell-cancer)(방광), 이행세포암(콩팥-골반/요관), 융모암(trophoblastic cancer), 요도암(urethral cancer), 비뇨기계통암(urinary system cancer), 자궁육종(uterine sarcoma), 자궁암, 질암, 외음부암, 발덴스트롬마크로글로불린혈증(Waldenstrom's-macroglobulinemia), 및 윌름즈 종양(Wilms' tumor)이 포함된다.
일부 실시형태에서, 본원에 개시된 면역성 조성물에 사용되는 항원에는 자가면역질환(autoimmune diseases)의 항원이 포함될 수 있으며, 예를 들어, 그것은 "자가 항원(self-antigen)"일 수 있다. 본원에 기술된 검정에 따른 진단에 고려되는 자가면역질환에는 원형탈모증(alopecia areata), 강직척추염(ankylosing spondylitis), 항인지질 증후군(antiphospholipid syndrome), 애디슨병(Addison's disease), 재생불량빈혈(aplastic anemia), 다발경화증(multiple sclerosis), 부신의 자가면역질환, 자가면역 용혈빈혈, 자가면역 간염, 자가면역 난소염 및 고환염, 베체트병(Behcet's Disease), 물집유사천포창(bullous pemphigoid), 심근병증(cardiomyopathy), 비열대성 스프루우-피부염(celiac sprue-dermatitis), 만성 피로 증후군, 만성 염증성 말이집탈락 증후군(chronic inflammatory demyelinating syndrome)(CFIDS), 만성 염증성 다발신경증, 처르그 스트라우스 증후군(Churg-Strauss syndrome), 반흔성유천포창(cicatricial pemphigoid), 크레스트 증후군(CREST Syndrome), 한냉 응집소 질환(cold agglutinin disease), 크론씨병(Crohn's disease), 포진피부염(dermatitis herpetiformis), 원반모양 루푸스(discoid lupus), 원발성 혼합 한냉-글로불린증(essential mixed cryoglobulinemia), 섬유근통(fibromyalgia), 사구체신염, 그레이브병(Grave's disease), 길랑-바레(Guillain-Barre), 하시모토 갑상선염(Hashimoto's thyroiditis), 특발성폐섬유증(idiopathic pulmonary fibrosis), 특발성 혈소판 감소증 자색반증(idiopathic thrombocytopenia purpura(ITP)), IgA 신장병(IgA nephropathy), 인슐린 의존성 당뇨병(I형), 편평태선(Lichen Planus), 루푸스, 메니에르병(Meniere's Disease), 혼합결합조직병(mixed connective tissue disease), 중증근육무력증(myasthenia gravis), 심근염(myocarditis), 보통천포창(pemphigus vulgaris), 악성 빈혈, 결절다발 동맥염(polyarteritis nodosa), 다발연골염(polychondritis), 다분비선 증후군(polyglandular syndromes), 류마티스 다발성 근육통(polymyalgia rheumatica), 다발성 근염-피부 근염(polymyositis and dermatomyositis), 원발 무감마글로불린혈증(primary agammaglobulinemia), 원발담관간경화(primary biliary cirrhosis), 건선(psoriasis), 레이노현상(Raynaud's phenomenon), 라이터 증후군(Reiter's syndrome), 류마티스 열(rheumatic fever), 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis), 사르코이드증(sarcoidosis), 공피증(scleroderma), 쇠그렌 증후군(Sjogren's syndrome), 강직증후군(stiff-man syndrome), 타카야수 동맥염(Takayasu arteritis), 관자동맥염/거세포 동맥염(temporal arteritis/giant cell arteritis), 궤양대장염(ulcerative colitis), 포도막염(uveitis), 베게너 증후군(Wegener's syndrome), 혈관염, 및 백반증(vitiligo)이 포함되나 이에 한정되는 것은 아니다. 자가면역질환을 갖거나 또는 갖는 것으로 의심되거나 또는 민감성인 대상체에서 잠재적인 또는 실제의 CMI 반응성을 평가하는 것이 일반적으로 중요하다.
일부 실시형태에서, 본원에 개시된 면역성 조성물에 사용되는 항원은 염증성 질환 또는 조건에 관련된 항원일 수 있다. 항원이 유용할 수 있는 염증성 질환과 조건의 예에는 그 중에서도 여드름(acne), 협심증(angina), 관절염(arthritis), 흡인 폐렴(aspiration pneumonia), 고름집(empyema), 위창자염(gastroenteritis), 괴사소장대장염(necrotizing enterocolitis), 골반염 질환(pelvic inflammatory disease), 인두염(pharyngitis), 늑막염(pleurisy), 만성 염증성 탈수초 다발신경증(chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy), 만성 염증성 탈수초 다발신경근병증(chronic inflammatory demyelinating polyradiculoneuropathy), 및 만성 염증성 탈수초 다발신경증(chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy)이 포함되나 이에 한정되는 것은 아니다.
일부 실시형태에서, 항원은 온전한(즉, 전체) 항원, 또는 1 이상의 에피토프를 포함하는 항원의 기능성 부분일 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원은 항원의 펩티드 기능성 부분이다. 본 맥락 내에서 "온전한(intact)"은 그 항원 폴리펩티드가 자연에서 발생하는 것 같이 그 항원이 전장 항원임을 의미한다. 이는 항원의 작은 부분이나 펩티드 만의 수송과 정 반대에 있다. 세포에 온전한 항원들을 수송하는 것은, 단지 하나의 또는 선택된 몇개의 펩티드 에피토프들이 아니라 온전한 항원들의 에피토프들의 전체 범위에 대한 면역 반응의 끌어냄을 가능하게 하거나 또는 촉진한다. 따라서, 본원에 기술된 방법 및 면역성 조성물은 단일 에피토프 펩티드-기반 항원의 사용에 비해 더 민감하고 더 높은 특이성의 면역 반응을 위해 폴리머와 결합된 온전한 항원을 포함한다.
대안적으로, 일부 실시형태에서, 온전한 항원은 초기 항원의 크기에 따라 많은 부분들로 분할될 수 있다. 전형적으로, 전 항원이 다량체 폴리펩티드인 경우, 전 단백질은 항원의 각각의 개별적 서브유닛 또는 도메인이 본원에 개시된 방법에 따라 폴리머와 결합될 수 있는 서브유닛들 및/또는 도메인들로 분할될 수 있다. 대안적으로, 일부 실시형태에서, 온전한 항원은 전 항원의 기능성 단편들, 또는 부분들, 예를 들면, 적어도 2, 또는 적어도 3, 또는 적어도 4, 또는 적어도 5, 또는 적어도 6, 또는 적어도 7, 또는 적어도 8, 또는 적어도 9, 또는 적어도 10, 또는 적어도 11, 또는 적어도 12, 또는 적어도 13, 또는 적어도 15, 또는 적어도 20, 또는 적어도 25, 또는 25 부분들(예: 조각들 또는 단편들) 이상(일체를 포함)으로 분할될 수 있고, 그 경우 그 항원의 각각의 개별적 기능성 단편은 본원에 개시된 방법에 따라 상기 폴리머와 결합될 수 있다.
전장 항원 폴리펩티드의 단편화 또는 분할은 전장 항원 폴리펩티드의 균등 분할일 수 있고, 또는 대안적으로, 일부 실시형태에서, 그 단편화는 비대칭적 또는 비균등적이다. 항원이 2개의 중첩하는(overlapping) 단편으로 분할되는 비제한적 예로서, 항원은 거의 동일한(대등한) 크기의 단편들로 분할될 수 있으며, 또는 대안적으로 하나의 단편은 전 항원의 약 45%이고 다른 단편은 약 65%일 수 있다. 추가의 비제한적 예로서, 전 항원은 다른 크기의 단편들의 조합으로 분할될 수 있고, 예를 들면, 항원이 2개의 단편으로 분할되는 경우, 단편들은 전 항원의 약 40% 및 약 70%, 또는 약 45% 및 약 65%; 또는 약 35% 및 약 75%; 또는 약 25% 및 약 85%(일체를 포함)로 분할될 수 있다. 전장 전 항원의 중첩하는 단편들의 임의의 조합이 항원의 중첩하는 폴리펩티드의 패널(panel)의 생성에의 사용에 포함된다. 단지 예시를 위한 예로서, 항원이 5 부분으로 분할되는 경우, 그 부분들은 균등하게(즉, 각 중첩하는 단편은 전체 전장의 약 21% 내지 25%이다) 또는 비균등하게(즉, 각 단편이 적어도 하나의 다른 단편과 중첩한다는 전제 하에, 항원은 다음의 5개의 중첩하는 단편으로 분할될 수 있다; 단편 1은 전장 항원의 크기의 약 25%, 단편 2는 약 5%, 단편 3은 약 35%, 단편 4는 약 10% 및 단편 5는 약 25%).
전형적으로, 항원 부분(antigen portion)들의 패널(panel)은 전(또는 온전한) 항원 폴리펩티드의 전체 길이를 실질적으로 커버(cover)한다. 따라서, 일부 실시형태에서, 면역성 조성물은, 동일한 온전한 항원의, 많은 상이한, 및/또는 중첩하는 단편들을 갖는 폴리머를 포함한다. 펩티드 항원의 단독 사용에 비해 항원의 중첩하는 단백질 단편들은 더 빠르고 저렴하게 그리고 증가된 안정성으로 제조될 수 있다. 추가의 일부 실시형태에서, 간단한 폴리펩티드들보다 큰 폴리펩티드들인 항원들이, 배치(conformation)가 에피토프 인식에 중요하기 때문에 바람직하며, 더 큰 항원 폴리펩티드들 또는 단편들은 펩티드 단편들보다 유리할 것이다.
당업자는 전 항원을 항원의 중첩하는 단백질들로 분할하여 그 항원의 폴리펩티드들의 패널을 생성할 수 있다. 단지 설명을 위한 예에 지나지 않는, TB 특이적 항원 TB1(배양 여액-10 또는 CFP-10으로도 알려져 있는)은, 예를 들면 적어도 17개의 부분들로 분할되어, 각각 상이하지만 중첩하는 TB-특이적 항원 TB1(CFP) 단편을 포함하는 17개의 상이한 폴리펩티드들의 패널을 생성할 수 있다. 배양 여액 단백질(CFP-10)(Genbank AAC83445)은 결핵균(M. tuberculosis)로부터의 10 kDa, 100 아미노산 잔기 단백질 단편이다. 그것은 또한 L45 항원 상동 단백질(LHP)로도 알려져 있다.
본원에 기술된 방법 및 조성물에 사용되는 표적 항원은 재조합 수단에 의해 발현될 수 있으며, 임의로, 그 방법이 당 기술분야에 잘 알려져 있는, 정제를 촉진하기 위한 친화성 또는 에피토프 표지를 포함할 수 있다. 유리(free) 또는 담체 단백질에 접합된 올리고펩티드의 화학적 합성이 본 발명의 항원을 얻는데 이용될 수 있다. 올리고펩티드들은 일종의 폴리펩티드로 간주된다. 항원은 리즈아비딘 또는 그 유도체 또는 기능성 단편을 예로 들 수 있으나 이에 한정되지 않는 상보적 친화성 분자와의 융합으로서 발현될 수 있다. 대안적으로, 표적 항원을 마련하고 그리고나서 그것을 리즈아비딘 또는 그 유도체 또는 기능성 단편을 예로 들 수 있으나 그에 한정되는 것은 아닌 상보적 친화성 분자에 접합하는 것도 가능하다.
폴리펩티드들은 예컨대 미국 특허 제5,229,490호 및 제5,390,111호에 개시된 분지된 구조들로 합성될 수도 있다. 항원 폴리펩티드들에는 예를 들면, 합성 또는 재조합 B-세포 및 T-세포 에피토프들, 유니버설 T-세포 에피토프들, 및 하나의 유기체 또는 질환으로부터의 T-세포 에피토프들 및 다른 것으로부터의 B-세포 에피토프들의 혼합이 포함된다.
재조합 수단을 통해 얻거나 또는 화학적 폴리펩티드 합성을 통해 얻어질 수 있는 항원, 뿐만 아니라 천연 소스 또는 추출물로부터 얻어진 항원은, 그 항원의 물리화학적 특성에 의해 예컨대 분별 또는 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다. 이들 기술은 당 기술분야에 잘 알려져 있다.
일부 실시형태에서, 항원은 물, 용매 예컨대 메탄올, 또는 완충액에 가용화될 수 있다. 적절한 완충액들에는 포스페이트 완충된 식염수 Ca2+/Mg2+ 프리(PBS), 생리식염수(150 mM NaCl/물), 및 트리스 완충액이 포함되나 이에 한정되는 것은 아니다. 중성 완충액에 가용성이 아닌 항원은 10 mM 아세트산에 가용화하고나서 중성 완충액 예컨대 PBS에 의해 원하는 부피로 희석될 수 있다. 산성 pH에서만 가용성인 항원의 경우, 산성 pH의 아세테이트-PBS를 묽은 아세트산에 가용화 후에 희석제로서 사용할 수 있다. 글리세롤은 본원에 기술된 조성물, 방법 및 키트에 사용하기에 적절한 비수용매일 수 있다.
전형적으로, 병원체에 대해 단백질 백신을 설계할 때, 세포외 단백질 또는 바이러스에 대한 환경에 노출된 것은 종종 백신의 항원 성분으로서 이상적인 후보이다. 그 세포외 단백질에 대해 생성된 항체들은 감염 동안 병원체에 대한 방어의 선봉이 된다. 항체는 병원체 상의 단백질에 결합하여 항체 옵소닌화를 촉진하여 식세포 예컨대 마크로파아지에 의한 소화와 파괴에 대해 병원체를 표지한다. 항체 옵소닌화는 또한 항체-의존성 세포 세포독성에 의해 병원체를 죽일 수 있다. 항체는 세포로부터의 용해 산물 예컨대 단핵구, 호중구, 호산구, 및 천연 킬러 세포의 방출을 촉발한다.
본원에 기술된 발명의 일 실시형태에서, 본원에 개시된 조성물에 사용되는 항원은 아미노산 잔기들이 천연 발생 바이러스에서 발견되는 서열을 갖고 선택적 생장 조건 또는 분자생물학적 방법에 의해 변경되지 않은 모든 야생형 단백질들이다.
일 실시형태에서, 본원에 기술된 면역성 조성물은 글리코실화된 단백질인 항원을 포함할 수 있다. 환언하면, 관심 대상의 항원은 각각 글리코실화된 단백질일 수 있다. 본원에 기술된 면역성 조성물의 일 실시형태에서, 항원들, 또는 항원-융합 폴리펩티드들은 O-결합형 글리코실화된다. 본원에 기술된 면역성 조성물의 다른 실시형태에서 항원들, 또는 항원-융합 폴리펩티드들은 N-결합형 글리코실화된다. 본원에 기술된 면역성 조성물의 또다른 실시형태에서, 항원들, 또는 항원-융합 폴리펩티드들은 O-결합형 및 N-결합형 둘다로 글리코실화된다. 다른 실시형태에서, 다른 유형의 글리코실화도 가능하며, 예로서, C-만노실화가 있다. 단백질의 글리코실화는 주로 진핵 세포에서 일어난다. N-글리코실화는 일부 진핵생물 단백질의 접힘에 중요하며, 막과 분비된 단백질들의 구조 및 기능을 조절하는, 번역과 동시의(co-translational) 및 번역후의(post-translational) 변형(modification) 메커니즘을 제공한다. 글리코실화는 사커라이드들을 연결하여 글리칸을 생산하고 그들을 단백질들과 지질들에 부착하는 효소적 과정이다. N-글리코실화에서, 글리칸들은 단백질 번역 동안 아스파라긴 측쇄의 아미드 질소에 부착된다. 글리칸들을 형성하는 3개의 주요한 사커라이드는 글루코스, 만노스, 및 N-아세틸글루코사민 분자이다. N-글리코실화 공통서열(consensus)는 Asn-Xaa-Ser/Thr이고, 여기서 Xaa는 임의의 알려진 아미노산일 수 있다. O-결합형 글리코실화는 아마도 골지체에서, 단백질 프로세싱 동안의 후기에서 발생한다. O-결합형 글리코실화에서, N-아세틸-갈락토사민, O-퓨코스, O-글루코스, 및/또는 N-아세틸글루코사민이 세린 또는 트레오닌 잔기에 부가된다. 당업자는 생물정보학 소프트웨어 예컨대 NetNGlyc 1.0 및 NetOGlyc 예측 소프트웨어(Technical University of Denmark)를 사용하여 본 발명의 폴리펩티드 내에서 N- 및 O-글리코실화 자리를 찾아낼 수 있다. NetNglyc 서버는 Asn-Xaa-Ser/Thr 서열의 서열 전후관계를 검사하는 인공 신경망을 사용하여 단백질들에서 N-글리코실화 자리(site)들을 예측한다. NetNGlyc 1.0 및 NetOGlyc 3.1 예측 소프트웨어는 EXPASY 웹사이트에서 접근할 수 있다. 일 실시형태에서, N-글리코실화는 본원에 기술된 융합 폴리펩티드의 표적 항원 폴리펩티드에서 일어난다.
친화성 분자쌍
본원에 개시된, 일부 실시형태에서, 항원은 상보적 친화성 쌍을 통해 폴리머에 접속된다(connected). 이러한 폴리머에의 항원의 접속은 제1 친화성 분자에 접속되는 폴리머에 의해 매개되며, 제 친화성 분자는 제2(예: 상보적) 친화성 분자와 결합하며(associate), 제2 친화성 분자는 항원에 부착된다. 상보적 친화성 쌍의 예는 비오틴/비오틴-결합 단백질이다.
친화성 상보적 친화성 쌍의 전형적 예에는, 비오틴에 결합하는, 비오틴-결합 단백질 또는 아비딘-유사 단백질이 포함된다. 예를 들면, 제1 친화성 결합 분자가 비오틴(폴리머와 결합함)인 경우, 상보적 친화성 분자는 비오틴-결합 단백질 또는 아비딘-유사 단백질 또는 그 유도체, 비한정적 예로, 리즈아비딘, 또는 스트렙트아비딘 또는 변이형, 그 유도체 또는 기능성 부분일 수 있다.
일부 실시형태에서, 제1 친화성 결합 분자는 비오틴, 비오틴 유도체, 또는 비오틴 모방제(mimic)이며, 예를 들면, 아민-PEG3-비오틴(((+)비오틴화-3,6,9-트리옥사운데칸디아민) 또는 그 유도체 또는 기능성 단편이나 이에 한정되는 것은 아니다. 특이적 비오틴 모방제는 DXaAXbPXc(서열번호 12), 또는 CDXaAXbPXcCG(서열번호 13)(여기서 Xa는 R 또는 L, Xb는 S 또는 T, 그리고 Xc는 Y 또는 W)의 서열을 함유하는 특이적 펩티드 모티프를 갖는다. 이들 모티프는 아비딘 및 뉴트라비딘을 결합할 수 있으나, 스트렙트아비딘은 그렇지 않다. 참조, 예를 들어, Gaj et al., 56 Prot. Express. Purif. 54(2006).
폴리머에의 제1 친화성 분자의 연결, 및 항원에의 상보적 친화성 분자의 연결은 비공유적 연결, 또는 화학적 메커니즘, 예를 들면 공유 결합, 친화성 결합, 개재(intercalation), 배위 결합 및 복합체화(complexation)일 수 있다. 공유 결합은 매우 안정한 결합을 제공하며 본 실시형태에 특히 적합하다. 공유 결합은 존재하는 측쇄(side chain)들의 직접 축합 또는 외부 가교 분자들의 도입 중 어느 쪽에 의해 달성될 수 있다.
예를 들면, 일부 실시형태에서, 항원은 상보적 고정 쌍 내의 쌍 중 하나에 비공유적으로 결합될 수 있다. 대안적 실시형태에서, 항원은 상보적 고정 쌍 내의 쌍 중 하나에 공유적으로 결합 또는 융합될 수 있다. 융합 단백질의 생성 방법은 당 기술분야에 잘 알려져 있으며, 본원에서 논의된다.
다른 실시형태에서, 제1 친화성 결합 분자는 비공유 결합에 의해, 또는 공유 결합에 의해 폴리머에 연결되어 있다. 일부 실시형태에서, 가교제가 사용되어 본원에 개시된 고분자에 제1 친화성 결합 분자를 공유적으로 결합한다.
일부 실시형태에서, 제1 친화성 결합 분자는 정전기적 상호 작용, 수소 결합, 소수성 상호 작용(즉, 반데르바알스힘), 친수성 상호 작용, 및 다른 비공유 상호 작용이나 이에 한정되지 않는 당 기술분야에 알려져 있는 비공유 결합 결합(non-covalent bond association)에 의해 상보적 친화성 분자와 결합한다. 중간체 부분들과의 다른 더 고차의 상호 작용도 고려된다.
일부 실시형태에서, 상보적 친화성 분자는 아비딘-관련 폴리펩티드이다. 특이적 실시형태에서, 상보적 친화성 분자는 리즈아비딘이고, 예컨대 재조합 리즈아비딘이다. 특히, 재조합 리즈아비딘은 고수율로 대장균에서 발현될 수 있는 변형 리즈아비딘이다. 전형적인 수율은 대장균 배양 1 L 당 >30 mg이다. 리즈아비딘은 다른 아비딘-유사 단백질들에 비해 난 아비딘에 대해 더 낮은 서열 상동성을 갖는다(22.4% 서열 동일성 및 35.0% 유사성). 변형 리즈아비딘의 사용은 대상체에서 난-관련 알러지 반응을 유도할 MAPS의 위험을 감소시킨다. 게다가, 재조합 변형에 대한 항체는 난 아비딘에 대한 명백한 교차 반응성을 갖지 않는다(그 역도 성립).
더 구체적으로, 일부 실시형태는 대장균에서의 재조합 발현을 위해 설계된 변형 리즈아비딘을 포함한다. 리즈아비딘 유전자에 대한 코딩 서열은 오리지날 유전자에 존재하는 희귀 코돈들에 기인한 대장균에서의 발현 동안의 임의의 어려움을 회피하기 위해 대장균 발현 코돈들을 사용하여 최적화되었다. 구성체를 단순화하기 위해, 생물정보학 및 구조-기반 분석 후, 전장 리즈아비딘의 첫 44개의 잔기들을 제거했는데, 그 이유는 이것들이 중심 구조 및 기능에 불필요함을 알아냈기 때문이다. 재조합 단백질의 정확한 접힘은, 리즈아비딘에서 기능성으로 중요한 디설파이드 결합이 정확하게 형성될 수 있는 대장균의 주변세포질 공간으로의 재조합 단백질의 이행을 촉진하기 위해, 상기 짧게 한 리즈아비딘(45-179)의 N-말단에 대장균 분비 시그널 서열이 부가됨으로써 향상되었다. 4량체를 형성하는 알려진 아비딘-유사 단백질들에 비해, 상기 변형 재조합 리즈아비딘은 2량체를 형성하여, 대장균에서 가용성 단백질로서의 재조합 리즈아비딘-항원 융합의 발현을 더 향상시킨다.
게다가, 본 명세서의 다른 곳에서 더 상세히 기술하는 바와 같이, 대장균에서의 융합 항원들의 발현 및 용해도를 향상시키기 위해, 리즈아비딘과 항원 단백질 사이에 플렉서블 링커 영역이 부가되었다. 또한, 생물정보학 및 구조적 분석에 기초하여, 상이한 항원 구성체들이 클로닝 및 발현되었다: 전장 항원, 또는 중요한 기능성 도메인, 또는 키메라 단백질 중 어느 것이 2개의 상이한 항원들에 포함되었다. 본원에 기술된 방법 및 조성물에 유용할 수 있는 추가의 친화성 쌍에는 항원-항체, 금속/이온-금속/이온-결합 단백질, 지질/지질 결합 단백질, 사커라이드/사커라이드 결합 단백질, 아미노산/펩티드/아미노산 또는 펩티드 결합 단백질, 효소-기질 또는 효소-저해제, 리간드-작용제/수용체, 또는 비오틴 모방제가 포함된다. 대안적 친화성 쌍을 사용할 때, 각각의 폴리머와 항원을 부착하는 대안적 수단, 예컨대 유전적 융합이 아니라 생체외 효소 반응들도 채용될 수 있다. 더 구체적으로, 항원-항체 친화성 쌍은 매우 강하고 특이적인 상호 작용을 가능하게 한다. 항원은 단백질, 펩티드, 핵산, 지질, 폴리/올리고사커라이드, 이온, 등을 포함하는 임의의 에피토프일 수 있다. 항체는 임의의 유형의 면역글로불린, 또는 면역글로불린의 Ag-결합 부분, 예컨대 Fab 단편일 수 있다. 금속/이온-금속/이온 결합 단백질에 관한 예에는 Ni NTA 대(vs.) 히스티딘-표지된 단백질, 또는 Zn 대 Zn 결합 단백질이 포함된다. 지질/지질 결합 단백질의 예에는 콜레스테롤 대 콜레스테롤 결합 단백질이 포함된다. 사커라이드/사커라이드 결합 단백질의 예에는 말토스 대 말토스 결합 단백질, 만노스/글루코스/올리고사커라이드 대 렉틴이 포함된다. 효소-기질/저해제에는 단백질, 펩티드, 아미노산, 지질, 당, 또는 이온을 포함하는 광범위의 물질들로부터의 기질이 포함된다. 저해제는, 일반적으로 효소들에 더 단단히(tightly) 심지어 비가역적으로 결합할 수 있는, 실제 기질의 유사체(analog)일 수 있다. 예를 들면, 트립신 대 대두 트립신 저해제이다. 저해제는 천연 또는 합성 분자일 수 있다. 다른 리간드/작용제-수용체에 관하여, 리간드는 단백질, 펩티드, 아미노산, 지질, 당, 이온을 포함하는 광범위의 물질로부터의 것일 수 있고, 작용제는 진짜 리간드의 유사체일 수 있다. 그 예에는 LPS 대 TLR4 상호 작용이 포함된다.
가교제
많은 2가 또는 다가 연결제들이 다른 분자에 대한 단백질 분자의 커플링에 유용하다. 예를 들면, 대표적인 커플링제에는 유기 화합물 예컨대 티오에스테르, 카보디이미드, 석신이미드 에스테르, 디이소시아네이트, 글루타르알데히드, 디아조벤젠 및 헥사메틸렌 디아민이 포함될 수 있다. 상기 목록은 당 기술분야에 알려진 다양한 클래스의 커플링제를 남김없이 기술하려는 것이 아니며 그보다는 보다 통상적인 커플링제의 예시이다. 참조, Killen & Lindstrom, 133J. Immunol. 1335(1984); Jansen et al., 62 Imm. Rev. 185(1982); Vitetta et al.
일부 실시형태에서, 문헌에 기술된 가교제가 본원에 개시된 방법, 면역성 조성물 및 키트에서의 사용을 위해 포함된다. 참조, 예를 들어, Ramakrishnan, et al., 44 Cancer Res. 201(1984)(MBS(M-말레이미도벤조일-N-히드록시석신이미드 에스테르)의 사용을 기술하고 있음); Umemoto et al., 미국 특허 제5,030,719호(올리고펩티드 링커를 거쳐 항체에 커플링된 할로겐화 아세틸 하이드라지드 유도체의 사용을 기술하고 있음). 특정 링커들이 포함된다: (a) EDC(1-에틸-3-(3-디메틸아미노-프로필) 카보디이미드 하이드로클로라이드; (b) SMPT(4-석신이미딜옥시카보닐-알파-메틸-알파-(2-피리딜-디티오)-톨루엔(Pierce Chem. Co., Cat.(21558G); (c) SPDP(석신이미딜-6 [3-(2-피리딜디티오) 프로피온아미도] 헥사노에이트(Pierce Chem. Co., Cat #21651G); (d) 설포-LC-SPDP(설포석신이미딜 6 [3-(2-피리딜디티오)-프로피안아미드] 헥사노에이트(Pierce Chem. Co. Cat. #2165-G); 및 (f) EDC에 접합된 설포-NHS(N-히드록시설포-석신이미드: Pierce Chem. Co., Cat. #24510).
상술한 연결 또는 가교제는 다른 속성들을 갖는 성분들을 함유하므로, 따라서 접합체(conjugate)가 상이한 생리 화학적 특성들을 갖게 한다. 예를 들면, 알킬 카복실레이트의 설포-NHS 에스테르는 방향족 카복실레이트의 설포-NHS 에스테르보다 더 안정하다. 나아가, 상기 링커 SMPT는 입체 장애된 디설피드 결합을 함유하며, 증가된 안정성으로 접합체를 형성할 수 있다. 디설피드 결합들은 일반적으로 다른 연결보다 덜 안정한데 왜냐하면 디설피드 결합은 체외에서 절단되어 이용가능한 접합체가 적어지기 때문이다. 설포-NHS는 특히 카보디이미드 커플링의 안정성을 증진시킬 수 있다. 카보디이미드 커플링(예컨대 EDC)은 설포-NHS와 함께 이용될 때 카보디이미드 커플링 반응 단독에 비해 가수분해에 대하여 더 내성인 에스테르를 형성한다.
본원에 개시된 방법과 면역성 조성물에 사용되는 전형적 가교 분자들에는 표 3과 표 4에 열거된 것들이 포함되나 이에 한정되는 것은 아니다.
가교 표적 | 가교자 반응기, 특징 | 생성물 예 |
아민-to-아민 | NHS 에스테르 | DSG; DSS; BS3; TSAT(삼작용성); 생접합체 툴키트 시약 쌍(Bioconjugate Toolkit Reagent Pairs) |
NHS 에스테르, PEG 스페이서 | BS(PEG)5; BS(PEG)9 | |
NHS 에스테르, 티올-절단 가능 |
DSP; DTSSP | |
NHS 에스테르, misc-절단 가능 |
DST; BSOCOES; EGS; 설포-EGS | |
이미도에스테르 | DMA; DMP; DMS | |
이미도에스테르, 티올-절단 가능 |
DTBP | |
기타 | DFDNB; THPP (삼작용성); 알데히드-활성화 덱스트란 키트 | |
설프하이드릴-to-설프하이드릴 | 말레이미드 | BMOE; BMB; BMH; TMEA(삼작용성) |
말레이미드, PEG 스페이서 | BM(PEG)2; BM(PEG)3 | |
말레이미드, 절단 가능(cleavable) |
BMDB; DTME | |
피리딜디티올 (절단 가능) | DPDPB | |
기타 | HBVS (비닐설폰) | |
비선택적 | 아릴 아자이드 | BASED (티올-절단 가능) |
* 양 말단에 동일 유형의 반응기를 갖는 가교제. 시약들은 그것들이 어느 화학기를 가교하느냐(좌열) 및 그 화학적 조성(우열)에 의해 분류된다. 생성물은 각 칸 내에서 길이를 증가시키는 순서로 열거되어 있다. |
가교 표적 | 가교자 반응기, 특징 | 생성물 예 |
아민-to-설프하이드릴 |
NHS 에스테르/말레이미드 | AMAS; BMPS; GMBS 및 설포-GMBS; MBS 및 설포-MBS; SMCC 및 설포-SMCC; EMCS 및 설포-EMCS; SMPB 및 설포-SMPB; SMPH; LCSMCC; 설포-KMUS |
NHS 에스테르/말레이미드, PEG 스페이서 |
SM(PEG)2; SM(PEG)4; SM(PEG)6; SM(PEG)8; SM(PEG)12; SM(PEG)24 | |
NHS 에스테르/피리딜디티올, 절단 가능 |
SPDP; LC-SPDP 및 설포-LC-SPDP; SMPT; 설포-LC-SMPT | |
NHS 에스테르/할로아세틸 | SIA; SBAP; SIAB; 설포-SIAB | |
아민-to-비선택적 | NHS 에스테르/아릴 아자이드 | NHS-ASA ANB-NOS 설포-HSAB 설포-NHS-LC-ASA SANPAH 및 설포-SANPAH |
NHS 에스테르/아릴 아자이드, 절단 가능 |
설포-SFAD; 설포-SAND; 설포-SAED | |
NHS 에스테르/디아지린 | SDA 및 설포-SDA; LC-SDA 및 설포-LC-SDA | |
NHS 에스테르/디아지린, 절단 가능 |
SDAD 및 설포-SDAD | |
아민-to-카복시 | 카보디이미드 | DCC; EDC |
설프하이드릴-to-비선택적 | 피리딜디티올/아릴 아자이드 | APDP |
설프하이드릴-to-탄수화물 | 말레이미드/하이드라지드 | BMPH; EMCH; MPBH; KMUH |
피리딜디티올/하이드라지드 | BMPH; EMCH; MPBH; KMUH | |
탄수화물-to-비선택적 | 하이드라지드/아릴 아자이드 | ABH |
히드록시l-to-설프하이드릴 | 이소시아네이트/말레이미드 | PMPI |
아민-to-DNA | NHS 에스테르/소라렌(Psoralen) | SPB |
*양 말단에 다른 반응기를 갖는 가교제. 시약들은 그것들이 어느 화학기를 가교하느냐(좌열) 및 그 화학적 조성(우열)에 의해 분류된다. 생성물은 각 칸 내에서 길이를 증가시키는 순서로 열거되어 있다. |
공자극인자
일부 실시형태에서, 본원에 개시된 면역성 조성물은 적어도 하나의 공자극분자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 공자극인자는 상기 폴리머에 가교된다. 일부 실시형태에서, 항원이 폴리머와 결합되는 것과 유사하게 상보적 친화성 쌍에 의해 폴리머에 공자극인자가 결합된다. 일부 실시형태에서는, 폴리머에 공자극인자를 연결하는 상보적 친화성 쌍은, 폴리머에 항원을 연결하는 것과 동일한, 또는 상이한 상보적 친화성 쌍이다.
일부 실시형태에서, 적어도 1개, 또는 적어도 2개, 또는 적어도 3개, 또는 적어도 5개, 또는 적어도 10개, 또는 적어도 15개, 또는 적어도 20개, 또는 적어도 50개, 또는 적어도 100개, 또는 약 100개 초과(일체를 포함)의 공자극인자들이 본원에 개시된 폴리머에 결합될 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 공자극인자들은 동일한 공자극인자일 수 있고, 또는 그것들은 폴리머와 결합된 다양한 상이한 공자극인자들일 수 있다.
일부 실시형태에서, 상기 공자극인자는 톨 유사 수용체의 리간드/작용제이며, 예로서 TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, TLR11 등을 들 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 일부 실시형태에서, 공자극인자는 염증조절복합체의 NOD 리간드/작용제, 또는 활성제/작용제이다. 이론에 구속되고자 하는 것은 아니지만, 상기 염증조절복합체는 카스파제 1, PYCARD, NALP 및 때때로 카스파제 5 또는 카스파제 11로 구성된 멀티단백질 올리고머이고 염증성 시토킨들인 인터루킨 1-β 및 인터루킨 18의 성숙을 촉진한다.
일부 실시형태에서, 공자극인자는 시토킨이다. 일부 실시형태에서, 시토킨은 GM-CSF; IL-1a; IL-1b; IL-2; IL-3; IL4; IL5; IL-6; IL-7; IL-8; IL-10; IL-12; IL-23; IFN-α; IFN-β; IFN-β; IFN-γ; MIP1α; MIP-1β; TGF-β; TNFα, 및 TNFβ로 이루어지는 군에서 선택된다. 일부 실시형태에서, 상기 공자극인자는 상기한 바와 같은, 폴리머에 결합될 수 있는 보강제일 수 있고, 또는 대상체에 대한 투여의 전에 또는 투여와 동시에 MAPS 조성물에 첨가될 수 있다. 보강제들에 대해서는 후에 더 상세히 기술한다.
항원, 및 상보적 친화성 분자에 융합된 항원의 생산
재조합 단백질은 당업자에 의해, 또는 상업적으로 입수가능한 키트, 예를 들면 PROBOND™ 정제 시스템(Invitrogen Corp., Carlsbad, CA)를 사용하여, 발현 및 정제될 수 있다. 일부 실시형태에서, 재조합 항원은 합성되고 당업자에게 알려진 세균 발현 시스템, 효모 발현 시스템, 바큘로바이러스/곤충 세포 발현 시스템, 포유류 세포 발현 시스템, 또는 형질전환 식물 또는 동물 시스템을 사용하는 단백질 정제 방법에 의해 정제될 수 있다.
본원에 기술된 상기 융합 폴리펩티드는 모두 당업자에게 잘 알려져 있는 단백질 및 분자적 방법들에 의해 합성되고 정제될 수 있다. 분자생물학적 방법 및 재조합 이종(heterologous) 단백질 발현 시스템들이 사용된다. 예를 들면, 재조합 단백질은 세균, 포유류, 곤충, 효모, 또는 식물 세포에서 또는 형질전환 식물 또는 동물 숙주에서 발현될 수 있다.
일 실시형태에서, 본원에는 본원에 기술된 융합 폴리펩티드 또는 비융합 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드가 제공된다. 통상의 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 클로닝 기술을 사용하여 본원에 기술된 융합 폴리펩티드를 코딩하는 키메라 또는 융합 코딩 서열을 구성할 수 있다. 코딩 서열은 일반적 목적의 클로닝 벡터 예컨대 pUC19, pBR322, pBLUESCRIPT® (Stratagene, Inc.) 또는 pCR TOPO®(Invitrogen) 내에 클로닝할 수 있다. 얻어지는 본원에 기술된 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 지닌 재조합 벡터는 그 후 추가의 분자생물학적 조작 예컨대 부위특이적 돌연변이유발(site-directed mutagenesis)에 사용되어 본원에 기술된 변이형 융합 폴리펩티드를 생성할 수 있고, 또는 포유류 세포주, 곤충 세포주, 효모, 세균 및 식물 세포로 구성되는 군에서 선택되는 숙주 세포를 사용하는 다양한 단백질 발현 시스템 내에서의 단백질 합성을 위한 단백질 발현 벡터나 바이러스 벡터 내로 서브클로닝 될 수 있다.
각 PCR 프라이머는 증폭될 영역에서 그것의 상응하는 주형과 적어도 15 뉴클레오티드 중첩해야 한다. PCR 증폭에 사용되는 폴리머라제는 PCR 증폭 과정 동안의 서열 실수를 감소시키기 위한 예컨대 PfuULTRA® 폴리머라제(Stratagene)와 같이 높은 정확도를 가져야 한다. 수개의 개별적 PCR 단편들을 한데 연결하는 것을 용이하게 하기 위해, 예를 들면 융합 폴리펩티드의 구성 및 이어서 클로닝 벡터에의 삽입에 있어서, PCR 프라이머는 PCR 증폭동안 DNA 주형에 어닐링하지 않는 인접 말단들(flanking ends) 상에 뚜렷하고 독특한 제한 소화 부위들을 가져야 한다. 각 쌍의 특이적 프라이머에 대한 제한 소화 부위는, 융합 폴리펩티드 코딩 DNA 서열이 인 프레임(in-frame)이고 종결 코돈 없이 개시부터 종결까지 융합 폴리펩티드를 코딩하도록 선택해야 한다. 그와 동시에 그 선택된 제한 소화 부위들은 융합 폴리펩티드에 대한 코딩 DNA 서열 내에서는 발견되어서는 안 된다. 의도한 폴리펩티드에 대한 코딩 DNA 서열은, 증폭, 그 정확성(fidelity) 및 키메라 코딩 서열의 진성(authenticity)의 검증(verification), 폴리펩티드 내의 특정 아미노산 돌연변이 및 치환을 위한 치환/또는 부위특이적 돌연변이유발을 위해 클로닝 벡터 pBR322 또는 그 일 유도체 내로 라이게이션될 수 있다.
대안적으로 폴리펩티드에 대한 코딩 DNA 서열은 예를 들면, 토포아이소머라제-지원 TA 벡터, 예컨대 pCR® TOPO, pCR® BluntII-TOPO, pENTR/D-TOPO® 및 pENTR/SD/D-TOPO®(Invitrogen,Inc., Carlsbad, CA)를 포함하는 TOPO® 클로닝법을 사용하여 벡터 내로 PCR 클로닝될 수 있다. pENTR/D-TOPO®와 pENTR/SD/D-TOPO® 는 둘다, GATEWAY® 발현 벡터 내에 5'→3' 오리엔테이션으로 DNA 서열의 클로닝을 가능하게 하는, 방향성(directional) TOPO 엔트리 벡터이다. 5'→3' 오리엔테이션으로의 방향성 클로닝은, 프로모터 유도 단백질 발현을 가능하게 하는, 프로모터가 융합 폴리펩티드 코딩 DNA 서열의 5'ATG 개시 코돈의 업스트림인 단백질 발현 벡터내로의 DNA 서열의 일방향성 삽입을 용이하게 한다. 융합 폴리펩티드에 대한 코딩 DNA 서열을 지닌 재조합 벡터는 예컨대 XL1Blue, SURE®(STRATAGENE®) 및 TOP-10 세포(Invitrogen)와 같은 일반적 클로닝 대장균 내로 트랜스펙션되어 증식될 수 있다.
당업자는, 당 기술분야에 잘 알려져 있는 특이적으로 설계된 올리고뉴클레오티드 프로브들과 중합효소 연쇄 반응(PCR) 방법들을 사용하여, 항원 또는 그 단편과 그 유도체의 상보적 친화성 분자를 포함하는 융합 폴리펩티드를 위한 키메라 코딩 서열을 구성하기 위해, 관심 대상의 항원의 코딩 영역을 상보적 친화성 분자의 코딩 영역과 함께 클로닝 및 라이게이션할 수 있을 것이다. 당업자는 또한 예를 들면 세균 발현 벡터, 곤충 발현 벡터 또는 바큘로바이러스(baculovirus) 발현 벡터 등의 선택된 벡터 내로 융합 단백질의 키메라 코딩 서열을 클로닝 및 라이게이션할 수 있을 것이다. 항원의 코딩 서열과 표적 항원 폴리펩티드 또는 그 단편은 인-프레임(in-frame)으로 라이게이션되어야 하고 키메라 코딩 서열은 프로모터의 다운스트림이면서 프로모터와 전사 터미네이터의 사이에 라이게이션되어야 한다. 그 다음에, 상기 재조합 벡터는 통상의 클로닝 대장균, 예컨대 XL1Blue 내로 트랜스펙션된다. 전달 벡터 DNA를 지닌 재조합 대장균은 그 후 비 재조합 플라스미드 DNA를 지닌 대장균을 제거하기 위해 항생제 저항성에 의해 선택된다. 선택된 형질전환체 대장균은 길러지고 재조합 벡터 DNA는 이어서 스포도프테라 프루기페르다(S. frugiperda) 세포 내로의 트랜스펙션을 위해 정제된다.
일부 실시형태에서, 본원에 개시된 항원은 세균의 주변세포질 공간으로의 이행을 위해 시그널 펩티드를 포함할 수 있다. 시그널 펩티드는 또한 N-말단에서 리더 펩티드로도 불리며, 막을 통한 이행 후에 절단될 수도 절단되지 않을 수도 있다. 시그널 펩티드의 일 예는 본원에 개시된 MKKIWLALAGLVLAFSASA(서열번호 1)이다. 다른 시그널 서열은 MAPFEPLASGILLLLWLIAPSRA(서열번호 14)이다. 시그널 펩티드의 다른 예는 시그널 펩티드 데이터베이스인 SPdb(월드 와이드 웹 사이트 "proline.bic.nus.edu.sg/spdb/")에서 찾을 수 있다.
항원이 상보적 친화성 단백질에 융합되는 일부 실시형태에서, 상기 시그널 서열은 상보적 친화성 단백질의 N-말단에 위치할 수 있다. 예를 들면, 항원이 아비딘-유사 단백질에 융합되면, 시그널 서열은 상보적 친화성 단백질의 N-말단에 위치할 수 있다. 일부 실시형태에서, 시그널 서열은 상보적 친화성 단백질이 제1 친화성 분자와 결합하기 전에 상보적 친화성 단백질로부터 절단된다.
일부 실시형태에서, 본원에 기술된 항원 및/또는 상보적 친화성 단백질은 시그널 서열이 결여되어 있다.
본원에 기술된 폴리펩티드는 다양한 발현 숙주 세포 예를 들어, 세균, 효모, 포유류 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 조류(algal) 세포 예컨대 클라마도모나스(Chlamadomonas), 또는 무세포 발현 시스템에서 발현될 수 있다. 일부 실시형태에서 핵산은 클로닝 벡터로부터 세균, 포유류, 곤충, 효모, 또는 식물 세포 또는 무세포 발현 시스템 예컨대 토끼 망상적혈구 발현 시스템에서의 융합 폴리펩티드의 발현을 위해 적절한 재조합 발현 벡터 내로 서브클로닝될 수 있다. 어떤 벡터들은 1회의 재조합 반응으로 포유류 세포, 곤충 세포 및 year에서의 발현을 위한 코딩 핵산 서열을 전달하도록 설계된다. 일부 GATEWAY® (Invitrogen) 데스티네이션 벡터(destination vector)는 바큘로바이러스, 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스(AAV), 레트로바이러스, 및 렌티바이러스의 구성을 위해 설계되며, 그들 각각의 숙주 세포를 감염시켜 적절한 숙주 세포에서의 융합 폴리펩티드의 이종 발현(heterologous expression)을 가능하게 한다. 데스티네이션 벡터 내로의 유전자 전달은 제조자 지시사항에 따라 단지 2단계로 실현될 수 있다. 곤충 세포, 포유류 세포, 및 효모에서의 단백질 발현을 위한 GATEWAY® 발현 벡터들이 있다. 대장균내 형질전환 및 선택 후에, 발현 벡터는 적절한 숙주 내에서의 발현을 위해 사용될 준비가 되어 있다.
다른 발현 벡터 및 숙주 세포의 예는, 포유류 세포주, 예컨대 CHO, COS, HEK-293, Jurkat, 및 MCF-7에서의 발현을 위한, 강한 CMV 프로모터-기반 pcDNA3.1(Invitrogen) 및 pCINEO 벡터(Promega); 포유류 세포내의 아데노바이러스-매개 유전자 전달 및 발현을 위한, 복제능력이 없는 아데노바이러스 벡터 pADENOX™, pAd5F35, pLP-ADENO™-X-CMV(CLONETECH®, pAd/CMV/V5-DEST, pAd-DEST 벡터(Invitrogen); 포유류 세포내 레트로바이러스-매개 유전자 전달(transfer) 및 발현을 위한 RETRO-X™ 시스템(Clontech)과 함께 사용하기 위한 pLNCX2, pLXSN, 및 pLAPSN 레트로바이러스 벡터; 포유류 세포내 렌티바이러스-매개 유전자 전달 및 발현을 위한, pLenti4/V5-DEST™, pLenti6/V5-DEST™, 및 pLenti6.2/V5-GW/lacZ(Invitrogen); 포유류 세포에서의 아데노 관련 바이러스-매개 유전자 전달 및 발현을 위한, 아데노바이러스-관련 바이러스 발현 벡터 예컨대 pAAV-MCS, pAAV-IRES-hrGFP, 및 pAAV-RC 벡터(Stratagene); 스포도프테라 프루기페르다9(Sf9), Sf11, Tn-368 및 BTI-TN-5B4-1 곤충 세포주에서의 발현을 위한, BACpak6 바큘로바이러스(Clontech) 및 pFASTBAC™ HT(Invitrogen); 드로소필라 슈나이더(Drosophila schneider) S2세포에서의 발현을 위한, pMT/BiP/V5-His(Invitrogen); 피키아 파스토리스(P. pastoris)에서의 발현을 위한 피키아(Pichia) 발현 벡터 pPICZα, pPICZ, pFLDα 및 pFLD(Invitrogen), 및 피키아 메타놀리카(P. methanolica)에서의 발현을 위한 벡터 pMETα 및 pMET; 효모 사카로마이세스 세레비지애(S. cerevisiae)에서의 발현을 위한 pYES2/GS 및 pYD1(Invitrogen) 벡터이다.
녹조 클라미도모나스(Chlamydomonas reinhardtii)에서의 이종 단백질 대규모 발현에 있어서의 최근의 진전이 기술되어 있다. Griesbeck., 34 Mol. Biotechnol. 213(2006); Fuhrmann, 94 Methods Mol Med. 191(2006). 외래 이종(Foreign heterologous) 코딩 서열들은 상동 재조합에 의해 핵, 엽록체 및 미토콘드리아 게놈 내로 삽입된다. 가장 다용도의 엽록체 선택적 마커인, 스펙티노마이신 또는 스트렙토마이신에 내성을 부여하는, 아미노글리코시드 아데닐 전달라제(aadA)를 지니는 엽록체 발현 벡터 p64는, 엽록체에서 외래 단백질을 발현하는데 사용될 수 있다. 유전자 총 방법(biolistic gene gun method)은 조류(algae)에 벡터를 도입하는데 사용될 수 있다. 그것이 엽록체 내로 들어가면, 외래 DNA가 유전자 총 입자들로부터 방출되고 상동 재조합을 통해 엽록체 게놈 내로 통합된다.
또한 본 발명에는 항원에 융합된 상보적 친화성 분자가 포함된다. 일부 실시형태에서, 융합 구성체는 또한 임의로 정제 표지, 및/또는 분비 시그널 펩티드를 포함할 수 있다. 이들 융합 단백질은 임의의 표준적 방법에 의해 생산될 수 있다. 예를 들면, 항원-상보적 친화성 분자 융합 단백질을 발현하는 안정한 세포 주의 제조를 위해, PCR-증폭된 항원 핵산이 포유류 발현 벡터의 유도체의 제한효소 부위에 클로닝될 수 있다. 예를 들면, pcDNA3(Invitrogen)의 유도체인 KA는 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 표지(HA)를 코딩하는 DNA 단편을 함유한다. 대안적으로, 다른 표지, 예컨대 c-myc 또는 폴리히스티딘 표지를 코딩하는 벡터 유도체를 사용할 수도 있다. 항원-상보적 친화성 분자 융합 발현 구성체는 예를 들면, 제조자 지시사항에 따라 LIPOFECTAMINE™(Gibco-BRL, Gaithersburg, MD)을 사용하여, 또는 당 기술분야에 알려져 있는 임의의 다른 적절한 트랜스펙션 기술을 사용하여, 적절한 포유류 세포 주(예: COS, HEK293T, 또는 NIH 3T3 세포)내로 마커 플라스미드와 함께 트랜스펙션될 수 있다. 적절한 트랜스펙션 마커에는, 예를 들면, β-갈락토시다제 또는 녹색 형광 단백질(GFP) 발현 플라스미드 또는 항원-상보적 친화성 분자 융합 단백질과 동일한 검출가능 마커를 함유하지 않는 임의의 플라스미드가 포함된다. 융합 단백질 발현 세포는 선별하여 더 배양되거나, 또는 표지된 항원-상보적 친화성 분자 융합 단백질은 정제될 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원-상보적 친화성 분자 융합 단백질은 시그널 펩티드에 의해 증폭된다. 대안적 실시형태에서, 항원-상보적 친화성 분자 융합 단백질을 코딩하는 cDNA는 시그널 펩티드 없이 증폭되고 강력한 분비 시그널 펩티드를 갖는 벡터(pSecTagHis)에 서브클로닝될 수 있다. 다른 예에서, 항원-상보적 친화성 분자 융합 단백질은 정제를 위한 알칼린 포스파타제(AP) 표지, 또는 히스타딘(His) 표지를 가질 수 있다. 항원 및/또는 항원-상보적 친화성 분자 융합 단백질의 단백질 정제에 대한 당업자에게 알려진 어떤 방법도 본 발명의 방법에의 사용에 포함된다.
일부 실시형태에서, 본원에 개시된 임의의 폴리펩티드는 재조합 바큘로바이러스 벡터로부터의 발현에 의해 제조된다. 다른 실시형태에서, 본원에 개시된 임의의 폴리펩티드는 곤충 세포에 의해 발현된다. 또다른 실시형태에서, 본원에 개시된 임의의 폴리펩티드는 곤충 세포로부터 단리된다. 곤충 세포에서 바큘로바이러스에 의한 단백질 발현에는, 높은 발현 수준, 스케일 업(scale-up)의 용이성, 번역 후 변형에 의한 단백질 생산, 및 단순화된 세포 성장을 포함하여 몇 가지 이점이 있다. 곤충 세포는 생장을 위해 CO2를 요하지 않으며 대규모 발현을 위해 고밀도 현탁 배양에 용이하게 적응될 수 있다. 포유류 시스템 내에 존재하는 번역후 변형 경로(post-translational modification pathway) 중의 많은 것이 곤충 세포에 활용될 수 있으며, 이는 천연의 포유류 단백질에 항원적으로, 면역적으로, 및 기능성으로 유사한 재조합 단백질의 생산을 가능하게 한다.
바큘로바이러스는 바큘로바이러스과의 DNA 바이러스이다. 이들 바이러스는 주로 인시류 종(Lepidopteran species)의 곤충(나비 및 나방)에 한정되는 좁은 숙주 범위를 갖는 것으로 알려져 있다. 바큘로바이러스 아우토그라파 칼리포니카 핵 폴리헤드로시스 바이러스(Autographa californica Nuclear Polyhedrosis Virus)(AcNPV)는 원형(prototype) 바큘로바이러스로 되었으며, 민감성 배양 곤충 세포에서 효율적으로 복제된다. AcNPV는 약 130,000 염기쌍의 2중쇄 폐환 DNA 게놈을 가지며 숙주 범위, 분자생물학, 및 유전학에 대하여 잘 특성 규명되어 있다. 바큘로바이러스 발현 벡터 시스템(BEVS)은 곤충 세포 및 곤충에서의 재조합 단백질의 풍부한 생산을 위한 안전하고도 신속한 방법이다. 바큘로바이러스 발현 시스템은 곤충 세포에서의 고수준의 재조합 단백질 발현을 위한 강력하고 다용도인 시스템이다. 바큘로바이러스 발현 시스템을 사용한 500 mg/l까지의 발현 수준이 보고되었으며, 고수준 발현을 위한 이상적인 시스템임을 말한다. 외래 유전자를 발현하는 재조합 바큘로바이러스는 바큘로바이러스 DNA와 관심 대상의 유전자 서열을 함유하는 키메라 플라스미드 간의 상동 재조합을 거쳐 구성된다. 재조합 바이러스는 그 뚜렷한 플라크 형태(plaque morphology) 덕택으로 검출될 수 있으며 동종까지 플라크 분리된다(plaque-purified to homogeneity).
본원에 기술된 재조합 융합 단백질은 인시류 종(Lepidopteran species) 스포도프테라 프루기페르다(S. frugiperda)로부터 유래된 세포가 포함되나 이에 한정되지 않는 곤충 세포에서 생산될 수 있다. 바큘로바이러스에 의해 감염될 수 있는 다른 곤충 세포, 예컨대 누에나방(Bombyx mori), 갈레리아 멜라노마(Galleria mellanoma), 트리크플루시아 니(Trichplusia ni), 또는 매미나방(Lamanthria dispar) 종으로부터의 곤충 세포도 본원에 기술된 재조합 단백질을 생산하기 위한 적절한 기질로서 사용될 수 있다. 재조합 단백질의 바큘로바이러스 발현은 당 기술분야에 잘 알려져 있다. 참조 미국 특허 제4,745,051호; 제4,879,236호; 제5,179,007호; 제5,516,657호; 제5,571,709호; 제5,759,809호. 발현 시스템이 바큘로바이러스 발현 시스템에 한정되지 않는다는 것은 당업자가 잘 이해할 것이다. 중요한 것은 발현 시스템이 발현된 재조합 단백질의 N-글리코실화를 지시하는 것이다. 본원에 기술된 재조합 단백질은 다른 발현 시스템 예컨대 엔토모폭스(Entomopox) 바이러스(곤충의 마마바이러스), 세포질 폴리헤드로시스 바이러스(CPV)에서도 발현될 수 있으며, 재조합 유전자 또는 유전자들에 의한 곤충 세포의 형질전환은 발현을 구성한다. 상당히 많은 수의 바큘로바이러스 전달 벡터 및 그에 상응하는 적절히 변형된 숙주 세포들이 상업적으로 이용가능하며, 예를 들면, pAcGP67, pAcSECG2TA, pVL1392, pVL1393, pAcGHLT, 및 pAcAB4(BD Biosciences); pBAC-3, pBAC6, pBACgus-6, 및 pBACsurf-1(NOVAGEN®), 및 pPolh-FLAG 및 pPolh-MAT(SIGMA ALDRICH®)이다.
프로모터와 전사 터미네이터 사이의 영역은 외래 코딩 서열(본 예에서는 항원 폴리펩티드, 및 상보적 친화성 분자에 대한 코딩 DNA 서열)의 클로닝을 촉진하기 위해 다수의 제한효소 소화부위를 가질 수 있다. 재조합 바이러스의 분비, 확인, 적절한 삽입, 양성 선택 및/또는 재조합 단백질의 정제를 용이하게 하기 위해, 추가의 서열, 예를 들어, 시그널 펩티드들 및/또는 표지 코딩 서열들(예컨대 His-표지, MAT-표지, FLAG 표지), 엔테로키나제 인식 서열, 꿀벌 멜리틴 분비 시그널, 베타-갈락토시다제, MCS의 글루타치온 S-전달라제(GST) 표지 업스트림이 포함될 수 있다.
일부 실시형태에서, 융합 단백질은 본원에 개시된 N-말단 시그널 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 시그널 서열은 본원에 개시된 상보적 친화성 분자의 N-말단에 부착된다.
일부 실시형태에서, 본원에 기술된 융합 폴리펩티드는 스페이서 펩티드, 예를 들어, 상보적 친화성 분자로부터 항원을 분리하는 14-잔기 스페이서(GSPGISGGGGGILE)(서열번호 15)를 갖는다. 그러한 짧은 스페이서의 코딩 서열은 프라이머들의 상보적 쌍을 어닐링함으로써 구성될 수 있다. 당업자는 선택된 스페이서를 코딩할 올리고뉴클레오티드를 설계 및 합성할 수 있다. 스페이서 펩티드는 일반적으로 비극성 아미노산 잔기, 예컨대 글리신 및 프롤린을 가져야 한다.
예를 들면, 부위특이적 돌연변이유발 및 PCR-매개 돌연변이유발 같은 당업자에 알려진 표준 기술을 사용하여, 본원에 기술된 융합 폴리펩티드의 항원 폴리펩티드 서열에, 예를 들면, 본원에 기술된 융합 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 내의 항원에, 아미노산 치환을 생성하기 위해 돌연변이를 도입할 수 있다. 바람직하게는, 변이형 융합 폴리펩티드는 본원에 기술된 융합 폴리펩티드에 대하여 50개 미만의 아미노산 치환, 40개 미만의 아미노산 치환, 30개 미만의 아미노산 치환, 25개 미만의 아미노산 치환, 20개 미만의 아미노산 치환, 15개 미만의 아미노산 치환, 10개 미만의 아미노산 치환, 5개 미만의 아미노산 치환, 4개 미만의 아미노산 치환, 3개 미만의 아미노산 치환, 또는 2개 미만의 아미노산 치환(일체를 포함)을 갖는다.
또한 어떤 잠재성(silent) 또는 중성(neutral) 미스센스 돌연변이가 코딩된 아미노산 서열 또는 막관통 전달을 촉진하는 능력을 변화시키지 않는 DNA 코딩 서열 내에 만들어질 수도 있다. 이러한 유형의 돌연변이들은 코돈 사용법을 최적화하거나 재조합 단백질의 발현 및 생산에 유용하다.
벡터 내의 융합 폴리펩티드에 대한 코딩 서열의 특정 부위특이적 돌연변이유발은 특정 아미노산 돌연변이와 치환의 생성에 사용될 수 있다. 부위특이적 돌연변이유 발은 예를 들면 제조자의 지시에 따라 QUICKCHANGE® 부위특이적 돌연변이유발 키트(Stratagene)를 사용하여 행할 수 있다.
일 실시형태에서, 세균, 포유류, 곤충, 효모, 또는 식물 세포에서 선택되는 숙주 세포를 사용한 단백질 발현 시스템으로부터 제조된 재조합 폴리펩티드의 발현과 정제를 위한, 본원에 기술된 폴리펩티드에 대한 코딩 DNA 서열을 포함하는 발현 벡터가 본원에 기술된다. 상기 발현 벡터는 그것의 각 숙주 세포에서의 효율적인 유전자 전사 및 번역을 위해 예컨대 프로모터 서열들, 리보소옴 인식 및 TATA 박스, 및 3'UTR AAUAAA 전사 종결 서열 같은 필요한 5'업스트림 및 3'다운스트림 조절 요소들(regulatory elements)을 가져야 한다. 상기 발현 벡터는, 바람직하게는, CMV(사이토메갈로바이러스) 프로모터, RSV(루 사코마 바이러스) 프로모터, β-액틴 프로모터, SV40(시미안 바이러스 40) 프로모터 및 근육 크레아틴 키나제 프로모터로 이루어지는 군에서 선택되는 전사 프로모터와, SV40 폴리(A) 및 BGH 터미네이터로 이루어지는 군에서 선택되는 전사 터미네이터를 갖는 벡터; 더 바람직하게는, 사이토메갈로바이러스의 초기 프로모터/인핸서 서열과 아데노바이러스 삼부 리더(tripartite leader)/인트론 서열을 갖고 SV40의 복제원점 및 폴리(A) 서열을 함유하는 발현 벡터이다. 상기 발현 벡터는 발현된 융합 폴리펩티드에 도입될 수 있는 추가의 코딩 영역들, 예를 들면, 6X-히스티딘, V5, 티오레독신, 글루타치온-S-전달라제, c-Myc, VSVG, HSV, FLAG, 말토스 결합 펩티드, 금속-결합 펩티드, HA 및 "분비" 시그널(꿀벌 멜리틴, α-인자, PHO, Bip)을 코딩하는 영역을 가질 수 있다. 이에 더해, 그것들이 필요치 않다면 그것들의 효소적 제거를 촉진하기 위해 이들 코딩 영역 뒤에 도입된 효소 소화 부위들이 있을 수 있다. 이들 추가의 핵산들은 융합 폴리펩티드 발현의 검출, 친화성 크로마토그래피에 의한 단백질 정제, 숙주 세포질에서 재조합 단백질의 증가된 가용성, 및/또는 발현된 융합 폴리펩티드를 배지 또는 효모 세포의 스페로플라스트(spheroplast)로 분비해 내보내는 것에 유용하다. 융합 폴리펩티드의 발현은 숙주 세포에서 본질적이거나(constitutive) 또는 예를 들면 구리 설페이트, 당(예컨대 갈락토스), 메탄올, 메틸아민, 티아민, 테트라사이클린, 바큘로바이러스 감염, 및 (이소프로필-베타-D-티오갈락토피라노시드) IPTG, 락토스의 안정한 합성 유사체에 의해 유도될 수도 있다.
다른 실시형태에서, 본원에 기술된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터는 그 중에서도 바이러스 벡터, 예컨대 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스(AAV), 레트로바이러스, 및 렌티바이러스 벡터이다. 재조합 바이러스는 유전자 발현 연구 및 치료적 응용을 위한 다용도의 시스템을 제공한다.
일부 실시형태에서, 본원에는 포유류 세포의 바이러스 감염으로부터 발현되는 융합 폴리펩티드가 개시된다. 그 바이러스 벡터는, 예를 들면, 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스(AAV), 레트로바이러스, 및 렌티바이러스일 수 있다. 재조합 아데노바이러스를 생성하기 위한 단순화된 시스템은 He et al., 95 PNAS 2509(1998)에 제시되어 있다. 관심 대상의 유전자는 우선 셔틀 벡터(예: pAdTrack-CMV) 내로 클로닝된다. 얻어지는 플라스미드는 제한 효소 PmeI에 의해 소화함으로써 선형화되며, 이어서 아데노바이러스 골격 플라스미드(예: Stratagene의 ADEASY™ 아데노바이러스 벡터 시스템의 pADEASY-1)와 함께 대장균 BJ5183 세포내로 함께 형질전환된다. 재조합 아데노바이러스 벡터는 카나마이신 저항성에 대해 선택되고, 제한 효소 분석에 의해 재조합이 확인된다. 최종적으로, 선형화된 재조합 플라스미드는 아데노바이러스 패키징 세포주, 예를 들면 HEK 293 세포(E1-형질전환 인간 배아 신장세포) 또는 911(E1-형질전환 인간 배아 망막 세포) 내로 트랜스펙션된다. Fallaux, et al. 7 Human Gene Ther. 215 (1996). 재조합 아데노바이러스는 HEK 293 세포 내에서 생성된다.
재조합 렌티바이러스는 분열 및 비분열 포유류 세포에서의 융합 폴리펩티드의 전달 및 발현의 이점을 갖는다. HIV-1계 렌티바이러스는 몰로니(Moloney) 백혈병 바이러스(MoMLV)-기반 레트로바이러스 시스템보다 더 넓은 숙주 범위를 효과적으로 형질도입한다. 재조합 렌티바이러스의 제조는 예를 들면, VIRAPOWER™ 렌티바이러스 발현 시스템(Invitrogen, Inc.)과 함께 pLenti4/V5-DEST™, pLenti6/V5-DEST™ 또는 pLenti 벡터를 사용하여 달성될 수 있다.
재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV) 벡터는 많은 상이한 인간 및 비인간 세포주 또는 조직들을 포함하는 광범위한 숙주 세포에 적용 가능하다. rAAV는 광범위한 세포 유형들을 형질 도입할 수 있으며 형질 도입은 활성 숙주 세포 분열에 비의존적이다. >108 바이러스입자/ml의 고역가가 상청액에서 용이하게 얻어지며 추가 농축에 의해 1011-1012바이러스입자/ml가 얻어진다. 전이유전자가 숙주 게놈으로 통합되며 따라서 발현이 장기간이고 안정하다.
AAV 벡터의 대규모 제조는, 패키징 세포주에 3 플라스미드를(하위융합성의(subconfluent) 293 세포의 50 x 150 mm 플레이트에 코딩 핵산을 지니는 AAV 벡터, AAV rep 및 cap 유전자를 함유하는 AAV RC 벡터, 및 아데노바이러스 헬퍼 플라스미드 pDF6를) 공 트랜스펙션(co-transfection)하여 행하여질 수 있다. 트랜스펙션 3일후 세포를 거두어들이고 3사이클의 동결 해동 또는 음파처리(sonication)에 의해 바이러스들이 방출된다.
AAV 벡터는 그 벡터의 혈청형에 따라 두가지 다른 방법으로 정제될 수 있다. AAV2 벡터는 그 헤파린 친화성에 기초하여 1단계 중력류 칼럼 정제 방법에 의해 정제된다. Auricchio et. al., 12 Human Gene Ther. 71 (2001); Summerford & Samulski, 72 J. Virol. 1438 (1998); Summerford & Samulski, 5 Nat. Med. 587 (1999). AAV2/1 및 AAV2/5 벡터는 현재 3회의 순차적 CsCl 구배에 의해 정제된다.
이론에 구속되고자 하는 것은 아니지만, 단백질이 세균 세포를 포함하는 세포에 의해 발현될 때, 상기 단백질은 그 세포의 특정 부분을 표적으로 하거나 그 세포로부터 분비된다. 따라서, 단백질 조준(protein targeting) 또는 단백질 선별은 세포가 단백질들을 세포의 적합한 위치 또는 세포 외부로 수송하는 기구(mechanism)이다. 선별 표적은 세포소기관(organelle)의 내부 공간, 몇개의 내부 막들 중 어느 것, 셀의 외부 막, 또는 분비를 통한 그 외부일 수 있다. 이 전달 과정은 단백질 그 자체에 함유된 정보에 기해 행하여진다. 정확한 선별은 세포에 극히 중요하며 실수는 질환으로 이어질 수 있다.
일부 예외는 있지만, 세균은 진핵생물에서 발견되는 막결합 세포소기관들이 없으나, 단백질들을 다양한 유형의 봉입체 예컨대 기체 소낭(gas vesicle) 및 저장 과립(storage granule)으로 조립할 수 있다. 또한, 세균의 종에 따라, 세균은 단일의 원형질막(그램 양성 세균), 또는 내부(플라스마) 막 및 외부 세포벽 막의 양쪽을, 주변세포질이라고 불리우는 둘 사이의 수분함유공간과 함께 가질 수 있다(그램 음성 세균). 단백질은 외막이 있느냐에 따라 환경으로 분비될 수 있다. 원형질막에서의 기본 메커니즘은 진핵생물 단백질에 유사하다. 이에 더해, 세균은 단백질을 외막으로 또는 외막을 가로질러 조준할 수 있다. 세균 외막을 가로질러 단백질을 분비하는 시스템은 상당히 복잡할 수 있으며 발병에 핵심적인 역할을 한다. 이들 시스템은 I형 분비, II형 분비 등으로 기술될 수 있다.
대부분의 그램 양성 세균에서, 어떤 단백질들은 원형질막을 가로지르는 외수송 및 이어지는 세균 세포벽에의 공유 부착을 표적으로 한다. 특수화한 효소인 소타아제(sortase)는 상기 단백질 C-말단 근처의 특징적 인식 부위, 예컨대 LPXTG 모티프(서열번호 16)(여기서 X는 임의의 아미노산일 수 있음)에서 표적 단백질을 절단하고, 상기 단백질을 세포벽으로 전달한다. 소타아제/LPXTG에 유사한, 모티프 PEP-CTERM(서열번호 17)를 갖는, 엑소소타아제/PEP-CTERM라고 명명된 시스템이 광범위한 그램 음성 세균 내에 존재한다고 제안되었다.
적절한 N-말단 표적 시그널을 갖는 단백질들은 세포질에서 합성된 후 특이적 단백질 수송 경로를 향한다. 세포질막을 가로지른 이행의 동안, 또는 그 이행의 직후, 상기 단백질은 프로세싱되고 그 활성형으로 접힌다. 그리고나서 이행된 단백질은 그 세포의 주변세포질측에 보유되거나 또는 환경으로 방출된다. 단백질을 막으로 조준하는 시그널 펩티드는 수송 경로 특이성의 핵심 결정요소이므로, 이들 시그널 펩티드는 그것들이 단백질을 향하게 하는 수송 경로에 따라 분류된다. 시그널 펩티드 분류는 그 시그널 펩티드의 제거를 책임지는 시그널 펩티다제(SPase)의 유형에 기초한다. 외수송된 단백질의 대다수는 일반적 분비(Sec) 경로를 통해 세포질로부터 외수송된다. 그램 양성 병원체에 의해 분비되는 대부분의 잘 알려진 독성(virulence) 인자들(예: 황색포도구균의 외독소, 탄저균의 방어 항원, 단구성 리스테리아균의 리스테리오리신(lysteriolysin) O)은 그들을 상기 Sec-경로로 이끌 전형적인 N-말단 시그널 펩티드를 갖는다. 이 경로를 통해 분비되는 단백질들은 접히지 않은 상태로 세포질막을 가로질러 이행된다. 이들 단백질의 이어지는 후속의 프로세싱 및 접힘은 그 막의 트랜스 측의 세포벽 환경에서 일어난다. Sec 시스템에 더하여, 일부 그램 양성 세균은 막을 가로질러 접힌 단백질을 이행시킬 수 있는 Tat-시스템도 함유한다. 병원성 세균은 소수의 단백질들의 수송에만 특이적으로 관련되는 어떤 특이적 목적의 외수송 시스템들을 함유할 수 있다. 예를 들면 수개의 유전자 클러스터가 항산균에서 동정되었으며, 이들은 특이적 경로들(ESAT6)을 통해 환경으로 분비되며 항산균성 발병에 중요한 단백질들을 코딩한다. 특이적 ATP-결합 카세트(ATP-binding cassette)(ABC) 수송자는 박테리오신(bacteriocin)이라고 불리우는 작은 항세균 펩티드의 외수송 및 프로세싱을 지시한다. 세균 용해의 개시에 책임이 있는 엔돌리신에 대한 유전자는 종종 홀린-유사 단백질을 코딩하는 유전자의 근처에 위치하며 이들 홀린(holin)은 세포벽으로의 엔돌리신 외수송(endolysin export)에 책임이 있음을 시사한다. Wooldridge, BACT. SECRETED PROTS: SECRETORY MECHS. & ROLE IN PATHOGEN.(Caister Academic Press, 2009)
일부 실시형태에서, 본 발명에 유용한 시그널 서열은 OmpA 시그널 서열이지만, 박테리오파아지로 감염된 세포의 외부로의 항미생물제의 수송 및 분비를 가능하게 하는 당업자에게 일반적으로 알려진 임의의 시그널 서열도 본 발명에의 사용에 포함된다.
세균 세포로부터 단백질의 분비를 지시하는 시그널 서열은 예를 들면 국제 공개 제2005/071088호에 개시된 바와 같이 당 기술분야에 잘 알려져 있다. 예를 들면, 표 5에 나타낸 시그널 펩티드의 비제한적 예 중의 일부를 사용할 수 있으며, 상기 시그널 펩티드는 항미생물제 조작된 박테리오파아지(예: AMP-조작된 박테리오파아지)에 의해 발현되는 항미생물 펩티드(Amp) 또는 항미생물 폴리펩티드의 아미노 말단 또는 카복시 말단에 부착될 수 있다. 부착은, 항미생물제 조작된 박테리오파아지(예: AMP-조작된 박테리오파아지)에 의해 감염된 세균으로부터의 분비를 초래하는, 선택된 항원 또는 항원-상보적 친화성 분자 융합 단백질의 융합 또는 키메라 조성물을 통한 것일 수 있다.
[표 5]
세균 세포의 단백질 또는 펩티드 항원 또는 항원-상보적 친화성 분자 융합 단백질의 분비를 지시하는 시그널 펩티드의 예
본원에 기술된 폴리펩티드, 예를 들어, 항원 또는 항원-상보적 친화성 분자 융합 단백질은 당업자에게 알려진 다양한 방법에 의해 발현 및 정제될 수 있으며, 예를 들면, 본원에 기술된 융합 폴리펩티드는 임의의 적절한 발현 시스템으로부터 정제될 수 있다. 융합 폴리펩티드는, 당 기술분야에 잘 알려져 있는, 암모늄 설페이트 같은 물질에 의한 선택적 침전; 칼럼 크로마토그래피, 면역 정제법 및 기타를 포함하는 표준 기술에 의해 실질적으로 순수하게 정제될 수 있다. 참조, 예를 들어, Scopes, PROTEIN PURIFICATION: PRINCIPLES & PRACTICE(1982); 미국 특허 제4,673,641호.
재조합 단백질의 정제시에는 많은 과정들이 채용될 수 있다. 예를 들면 확립된 분자 부착 특성을 갖는 단백질이 선택된 단백질에 가역적으로 융합될 수 있다. 적절한 리간드에 의해, 상기 단백질은 정제 칼럼에 선택적으로 흡착되고 그리고나서 상대적으로 순수한 형태로 상기 칼럼으로부터 유리될 수 있다. 그리고나서 상기 융합된 단백질은 효소 작용에 의해 제거된다. 최종적으로, 상기 선택된 단백질은 친화성 또는 면역친화 칼럼을 사용하여 정제될 수 있다.
상기 단백질이 숙주 세포에서 발현된 후, 그 숙주 세포는 정제를 위해 발현된 단백질을 유리시키기 위해 용해될 수 있다. 다양한 숙주 세포의 용해 방법은 "Sample Preparation-Tools for Protein Research" EMD Bioscience와 Current Protocols in Protein Sciences(CPPS)에 소개되어 있다. 정제 방법의 예는 친화성 크로마토그래피 예컨대 히스티딘-표지된 융합 폴리펩티드에 대한 니켈, 코발트, 또는 아연 친화성 수지를 사용한 금속-이온 친화성 크로마토그래피이다. 히스티딘-표지된 재조합 단백질을 정제하는 방법은 Clontech에 의해 그들의 TALON® 코발트 수지를 사용하여 그리고 NOVAGEN®에 의해 그들의 pET 시스템 매뉴얼, 제10판에 기술되어 있다. 다른 바람직한 정제 전략은 면역-친화성 크로마토그래피이며, 예를 들면, 항-myc 항체 접합 수지가 myc-표지된 융합 폴리펩티드를 친화성 정제하는데 사용될 수 있다. 적절한 프로테아제 인식 서열들이 존재할 때, 융합 폴리펩티드는 상기 히스티딘 또는 myc 표지로부터 절단되어, 히스티딘-표지들과 myc-표지들이 친화성 부지에 부착해 있는 채로 그 친화성 수지로부터 그 융합 폴리펩티드를 방출할 수 있다.
재조합 및 천연 발생 단백질을 정제하는 표준 단백질 분리 기술은 당 기술분야에 잘 알려져 있으며, 예를 들면, 용해도 분별, 크기 배제 젤 여과, 및 다양한 칼럼 크로마토그래피이다.
용해도 분별(Solubility fractionation): 종종 초기 단계로서, 특히 상기 단백질 혼합물이 복합체인 경우, 초기 염 분별에 의해 관심 대상의 단백질로부터 많은 원하지 않은 숙주 세포 단백질들을(또는 세포 배지로부터 유래하는 단백질들을) 분리할 수 있다. 바람직한 염은 암모늄 설페이트이다. 암모늄 설페이트는 상기 단백질 혼합물 중의 물의 양을 효과적으로 감소시킴으로써 단백질들을 침전시킨다. 그리고나서 상기 단백질들은 그 용해도에 기해 침전한다. 단백질이 더 소수성일수록 더 낮은 암모늄 설페이트 농도에서 침전한다. 전형적인 프로토콜(protocol)에는 얻어지는 암모늄 설페이트 농도가 20∼30% 사이에 있도록 단백질 용액에 포화 암모늄 설페이트를 첨가하는 것이 포함된다. 이 농도는 대부분의 소수성 단백질을 침전시킬 것이다. 그리고 나서 그 침전물을 버리고(관심 대상의 단백질이 소수성이 아니라면) 그 상청액에 암모늄 설페이트를 관심 대상의 단백질을 침전시키는 것으로 알려진 농도까지 첨가한다. 그리고나서 그 침전물을 완충액에 용해하고 필요하다면 과잉의 염을 투석 또는 정용여과(diafiltration)에 의해 제거한다. 단백질의 용해도에 의존하는 다른 방법, 예컨대 냉 에탄올 침전(cold ethanol precipitation)은 당업자에게 잘 알려져 잇으며 복잡한 단백질 혼합물을 분별하는데 사용될 수 있다.
크기 배제 여과(Size exclusion filtration): 선택된 단백질의 분자량을 이용하여, 그 단백질을 상이한 세공 크기의 막들(예를 들면, AMICON® 또는 MILLIPORE® 막들)을 통한 한외여과에 의해 크기가 더 크거나 더 작은 단백질로부터 분리할 수 있다. 제1 단계로서, 단백질 혼합물은 관심 대상의 단백질의 분자량보다 더 낮은 분자량 컷-오프(cut-off)를 갖는 세공 크기의 막을 통해 한외여과된다. 그리고나서 그 한외여과 농축물을 관심 대상의 단백질의 분자량보다 더 큰 분자량 커-오프를 갖는 막에 대해 한외여과한다. 재조합 단백질은 그 막을 통과해 여과액으로 갈 것이다. 그리고나서 상기 여과액에 대해서는 후술하는 바와 같이 크로마토그래피를 행할 수 있다.
칼럼 크로마토그래피(Column chromatography): 선택된 단백질은 그 크기, 순 표면 전하, 소수성, 및 리간드에 대한 친화성에 기해 다른 단백질들로부터 분리될 수 있다. 이에 더하여, 재조합 또는 천연 발생 단백질들에 대하여 항체를 칼럼 매트리스에 접합하여 상기 단백질을 면역 정제할 수 있다. 이들 방법 모두는 당 기술분야에 잘 알려져 있다. 크로마토그래피 기술이 많은 다른 제조자들(예: Pharmacia Biotech)로부터의 설비를 사용하여 임의의 규모로 수행될 수 있음은 당업자에게 명백하다. 예를 들면, 항원 폴리펩티드는 PA63 7량체 친화성 칼럼을 사용하여 정제될 수 있다. Singh et al., 269, J. Biol. Chem. 29039(1994).
일부 실시형태에서, 정제 단계들의 조합, 예를 들면 (a) 이온 교환 크로마토그래피, (b) 히드록시아파타이트 크로마토그래피,(c) 소수성 상호 작용 크로마토그래피, 및 (d) 크기 배제 크로마토그래피가 본원에 기술된 융합 폴리펩티드에 사용될 수 있다.
무세포 발현 시스템도 고려할 수 있다. 무세포 발현 시스템은 전통적 세포-기반 발현 방법보다, 단백질 접힘을 돕기 위한 반응 조건의 용이한 변경, 생산물 독성에 대한 감소된 민감성, 및 감소된 반응 용적과 처리 시간에 기인한 빠른 발현 스크리닝 또는 대량의 단백질 생산과 같은 고처리용량 전략에 대한 적합성을 포함하는 몇가지 면에서 유리하다. 무세포 발현 시스템은 플라스미드 또는 선형 DNA를 사용할 수 있다. 게다가, 번역 효율의 향상은 반응 혼합물의 1밀리리터당 1밀리그램의 단백질을 초과하는 수율로 귀결된다. 시판의 무세포 발현 시스템에는 토끼 망상적혈구-기반 생체외 시스템을 사용하는 TNT 결합 망상적혈구 용해물 시스템( TNT coupled reticulocyte lysate Systems) (Promega)이 포함된다.
면역조성물의 제제와 사용 방법
본 발명의 특정 실시형태는 동물에서 면역 반응을 끌어내는 본원에 개시된 면역성 조성물의 사용을 제공한다. 더 구체적으로, 상기 조성물은 체액성 및 세포 면역 둘다를, 그리고 많은 경우에 있어서 점막 면역을 끌어낸다. 본 발명의 실시형태는 특히 폐렴구균에 의한 감염에 대한 적어도 부분적 방어 또는 그 감염 후의 부분적 개선을 제공한다. 폐렴구균은 다수의 질환들, 예컨대 수막염, 폐렴, 균혈증, 및 중이염을 유발한다. 매년 세계적으로 거의 백만의 아동이 폐렴구균 질환으로 사망한다. 폐렴연쇄구균(Streptococcus pneumoniae)은 대대적으로 연구되었으며 그 게놈 서열의 적어도 일부는 서열 결정되었다. 참조, 예를 들어, 미국 특허 제7,141,418호. 피막 폴리사커라이드들에 대한 항체들은 알려진 혈청형들을 정의하고 혈청형 특이적 방어를 부여하지만, 면역의 다른 방어 메커니즘이 기술되었다. 참조 Malleyetal., 88 J. Mol. Med. 135(2010). 이들 다른 방어 메커니즘에는 비피막 항원에 대한 항체와 폐렴 구균 구성 성분들에 대한 T-세포 반응이 포함되나 이에 한정되는 것은 아니다. 단백질-폴리사커라이드 콘쥬게이트 백신의 응용인 PCV7는 질환을 상당히 감소시켰다. Black et al., 24(S2) Vaccine 79(2006); Hansen et al., 25 Pediatr. Infect. Dis. J. 779(2006)). 그러나, 최근의 연구는 PCV7에 다른 혈청형들이 결여되어 있는 결과, 대체의 폐렴구균 혈청형이 부상하였음을 밝혀냈다. Pichichero & Casey, 26(S10) Pediatr. Infect. Dis. J. S12(2007).
종의 모든 혈청형들에 공통인 어떤 폐렴구균 항원들, 예를 들어, 표면 단백질 PspA, PspC, PsaA 및 세포독소 폐렴구균 용혈소 또는 뉴몰리소이드(pneumolysoid) 돌연변이들은 피막화에도 불구하고 면역방어 능력을 갖는 것으로 밝혀졌으며(Basset et al., 75 Infect. Immun. 5460(2007); Briles et al., 18 Vaccine 1707(2000)); 게놈 및 돌연변이 라이브러리의 사용에 의해 수십개의 추가의 종 공통 단백질이 동정되었다(Hava & Camilli, 45 Mol. Microbiol. 1389(2002); Wizemann et al., 60 Infect. Immun. 1593(2001)). 동물 모델들에서 개별 항원들에 의해 면역력이 유도되었으나(Alexander et al., 62 Infect. Immun. 5683(1994); Balachandran et al., 70 Infect. Immun. 2526(2002); Chung et al., 170 J. Immunol. 1958(2003); Glover et al., 76 Infect. Immun. 2767(2008); Wu et al., 175 J. Infect. Dis. 839(1997)), 그러나 지금까지 인간에 대한 사용에 대해 승인된 공통 항원에 기초한 백신은 없었다.
일 실시형태에서, 대상체에게 투여될 때 폴리머에 부착한 1개 이상의 항원들에 대한 면역 반응을 끌어내기 위한 용도의 적어도 1종의 폴리머 스캐폴드(예: 폴리사커라이드 또는 탄수화물 폴리머)에 부착된 적어도 하나의 또는 다항원들을 포함하는 면역성 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 포유류의 백신접종 방법이 제공된다. 일부 실시형태에서, 상기 면역 반응은 체액성 및/또는 세포 면역 반응이다.
따라서, 본 발명의 일 태양은, 적어도 1종의 폴리머(예: 폴리사커라이드); 적어도 하나의 항원; 및 (i) 상기 폴리머(예: 폴리사커라이드)와 결합하는 제1 친화성 분자, 및 (ii) 상기 폴리머(예: 폴리사커라이드)에 상기 항원을 부착시키는, 상기 항원과 결합하는 상보적 친화성 분자(예: 상기 제1 친화성 분자는 상기 상보적 친화성 분자와 결합하여 상기 폴리머(예: 폴리사커라이드)에 상기 항원을 연결함), 를 포함하는 적어도 하나의 상보적 친화성-분자 쌍; 을 포함하는 면역성 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 면역 반응을 끌어내는 방법에 관한 것이다.
따라서, 본 발명의 일 태양은 동시에 다수의 항원들에 대한 체액성 및/또는 세포 면역을 끌어내는, 예로서 상기 대상체에게 투여되는 면역성 조성물은 적어도 1개, 또는 적어도 2개, 또는 그 이상의, 예를 들어, 다수의 동일 또는 상이한 항원들을 포함하는 중합체를 포함하는, 방법에 관한 것이다.
본 발명의 일 태양은 1 이상의 병원체들에서 유래되는 적어도 하나의 항원을 포함하는 본원에 개시된 면역 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 병원체에 대해 대상체, 예를 들어 조류 또는 포유류, 예를 들어 인간을 면역 부여 또는 백신접종하는 방법에 관한 것이다. 해당하는 상이한 항원들이 상기 면역성 조성물의 폴리머에 부착되는 일부 실시형태에서, 대상체는 동시에 적어도 1, 또는 적어도 2, 또는 적어도 2, 또는 적어도 3, 또는 적어도 5, 또는 적어도 10, 또는 적어도 15, 또는 적어도 약 20, 또는 적어도 50, 또는 적어도 약 100, 또는 100 초과의 상이한 병원체들에 대하여 면역 부여될 수 있다.
일부 실시형태에서, 대상체에는 수개의 상이한 본원에 개시된 면역성 조성물들이 투여될 수 있으며, 예를 들면, 대상체에게는 하나의 항원, 또는 복수의 항원들(예: 항원 A, B, C, 및 D 등)과 함께 폴리머를 포함하는 조성물이 투여될 수 있으며 또한 상이한 항원, 또는 다른 세트의 항원들(예: 항원 W, X, Y, 및 Z 등)과 함께 폴리머를 포함하는 조성물도 투여될 수 있다. 대안적으로, 대상체에게는 하나의 항원, 또는 복수의 항원들(예: 항원 A, B, C, 및 D, 등)과 함께 폴리머 A를 포함하는 조성물이 투여될 수 있으며 또한 동일한(예: 항원 A, B, C, 및 D 등) 또는 상이한 세트의 항원들을 포함하는 폴리머 B를 포함하는 조성물이 투여될 수 있다. 본 발명은 요망되는 만큼의 많은 항원들에 의한, 예를 들어 100 개 이상의 많은 항원들에 의한 면역부여를 가능하게 하는, 본원에 개시된 다양한 상이한 면역성 복합체들에 의해, 대상체를 면역 부여하는 방법을 제공할 것으로 생각된다.
일 실시형태에서, 본원에 기술된 면역성 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 포함한다. 다른 실시형태에서, 본원에 기술된 면역성 조성물은 조류, 포유류, 또는 인간에의 투여를 위해, 또는 백신으로 제제된다. 적절한 제제는 예를 들면, Remington'S Pharmaceutical Sciences(2006), 또는 Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms(4th ed., Lea & Febiger, Philadelphia, 1985)에서 찾을 수 있다.
일 실시형태에서, 본원에 기술된 면역성 조성물은 본질적으로 비독성이고 비치료적인 약학적으로 허용가능한 담체를 포함한다. 그러한 담체의 예에는 이온교환체, 알루미나, 스테아르산 알루미늄, 레시틴, 혈청 단백질, 예컨대 인간 혈청 알부민, 완충액 물질 예컨대 인산염, 글리신, 소르브산, 소르브산 포타슘, 포화 채소 지방산의 부분적 글리세라이드 혼합물, 물, 염, 또는 전해질 예컨대 프로타민 설페이트, 인산수소 이나트륨, 인산수소 포타슘, 소듐 클로라이드, 아연염, 콜로이달 실리카, 마그네슘 트리실리케이트, 폴리비닐 피롤리돈, 셀룰로스계 물질, 및 폴리에틸렌 글리콜이 포함된다. 모든 투여를 위해, 통상의 디포 제제(depot forms)가 적절히 사용된다. 그러한 제제에는 예를 들면, 마이크로캡슐, 나노-캡슐, 리포좀, 플래스터, 흡입제제, 코 스프레이, 설하정, 및 서방성 제제가 포함된다. 서방성 조성물의 예에 대해 미국 특허 제3,773,919호, 제3,887,699호, EP58,481A, EP158,277A, 캐나다 특허 제1176565호; Sidmanetal., 22 Biopolymers 547(1983); Langer et al., 12 Chem. Tech. 98(1982)를 참조할 수 있다. 상기 단백질은 통상환자마다 적용마다 약 0.1 mg/ml 내지 100 mg/ml의 농도로 제제될 것이다.
일 실시형태에서, 항산화제(예: 아스코르브산); 저분자량(10개 미만의 잔기들) 폴리펩티드(예: 폴리아르기닌 또는 트리펩티드); 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린; 친수성 폴리머 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루탐산, 아스파르트산, 또는 아르기닌; 모노사커라이드, 디사커라이드, 및 셀룰로스 또는 그 유도체, 글루코스, 만노스, 또는 덱스트린을 포함하는 다른 탄수화물; 킬레이트제 예컨대 EDTA; 및 당 알코올 예컨대 만니톨 또는 소르비톨를 포함하는 다른 성분이 백신 제제에 첨가될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 MAPS 면역성 조성물은 적어도 하나의 보강제와 함께 투여된다. 보강제들은 동시에 투여되는 항원에 대한 면역 반응을 증진시키는 물질들의 불균질한 그룹(heterogeneous group)이다. 일부 경우에서, 보강제들은 면역 반응을 향상시켜 더 적은 백신이 필요하도록 한다. 보강제들은 항원 -특이적 방어 면역 반응을 자극하는 물질- 을 면역시스템과 접촉시키고 생산되는 면역의 유형, 뿐만 아니라 면역 반응의 질(크기 또는 지속시간)에 영향을 미친다. 보강제들은 어떤 항원들의 독성을 감소시키고 일부 백신 성분들에게 용해도를 제공한다. 오늘날 항원에 대한 면역 반응의 증진을 위해 사용되는 거의 모든 보강제들은 입자상이거나 또는 항원과 함께 입자를 형성한다. VACCINE DESIGN - SUBUNIT & ADJUVANT APPROACH (Powell & Newman, Eds., Plenum Press, 1995)라는 책에는 많은 알려진 보강제들이 그것들의 면역학적 활성 및 화학적 특성에 관하여 기술되어 있다. 입자를 형성하지 않는 유형의 보강제는 면역 시그널 물질로 작용하며 정상 조건 하에서 입자상 보강제 시스템의 투여 후에 면역 활성화의 결과로 면역 시스템에 의해 형성되는 물질로 구성되는 물질들의 그룹이다.
면역성 조성물 및 백신을 위한 보강제는 당 기술분야에 잘 알려져 있다. 예에는 모노글리세라이드 및 지방산(예: 모노-올레인, 올레산, 및 대두유의 혼합물); 미네랄 염들, 예를 들어, 수산화알루미늄 및 인산 알루미늄 또는 인산 칼슘 젤; 오일 에멀젼 및 계면활성제계 제제, 예를 들어, MF59(마이크로유동 디터전트 안정화 수중유 에멀젼), QS21(정제 사포닌), AS02 [SBAS2](수중유 에멀젼 + MPL + QS21), MPL-SE, Montanide ISA-51 및 ISA-720(안정화 유중수 에멀젼); 입자상 보강제들, 예를 들어, 비로좀(virosome)(인플루엔자 혈구응집소(haemagglutinin)를 도입하는 단층 리포좀 운반체), AS04([SBAS4] MPL과의 Al염), ISCOMS(사포닌 및 지질의 구조화 복합체), 폴리락티드 co-글리코라이드(PLG); 미생물 유도체(천연 및 합성), 예를 들어, 모노포스포릴 지질 A(MPL), Detox(MPL + 마이코박테리움 플레이(M. Phlei) 세포벽 골격), AGP [RC-529](합성 아실화 모노사커라이드), DetoxPC, DC_Chol(리포좀으로 자기조직화할 수 있는 지질 면역부활제(lipoidal immunostimulator), OM-174(지질 A 유도체), CpG 모티프(면역자극 CpG 모티프를 함유하는 합성 올리고뉴클레오티드), 또는 다른 DNA 구조, 변형 LT 및 CT(비독성 보강제 효과를 제공하기 위해 유전적으로 변형된 세균 독소); 내생의 인간 면역조절자, 예를 들어, hGM-CSF 또는 hIL-12(단백질 또는 코딩된 플라스미드 중 어느 것으로서 투여될 수 있는 시토킨들), 이뮤댑틴(Immudaptin)(C3d 종렬 정렬(tandem array)), MoGMCSF, TiterMax-G, CRL-1005, GERBU, 테라미드(TERamide), PSC97B, Adjumer, PG026, GSKI, GcMAF, B-알레틴(B-alethine), MPC-026, Adjuvax, CpG ODN, 베타펙틴, Alum, 및 MF59 및 불활성 운반체, 예컨대 금 입자가 포함되나 이에 한정되는 것은 아니다. 추가의 보강제들이 당 기술분야에 알려져 있다. 참조, 예를 들어, 미국 특허 제6,890,540호; 미국 특허공개 제2005; 0244420; PCT/SE97/01003.
일부 실시형태에서 보강제는 입자성 물질이며 느리게 생분해하는 특징을 갖는다. 보강제가 독성 대사산물을 형성하지 않도록 주의하여야 한다. 바람직하게는 일부 실시형태에서 그러한 보강제들은 기질(matrice)일 수 있으며 주로 신체로부터 기원하는 물질들이 사용된다. 이들에는 젖산 폴리머, 폴리-아미노산(단백질), 탄수화물, 지질 및 저독성의 생체적합성 폴리머가 포함된다. 신체로부터 유래하는 이들 물질의 그룹의 조합 또는 신체로부터 유래하는 물질들과 생체적합성 폴리머들의 조합도 사용될 수 있다. 지질들은 그들을 생분해성으로 만드는 구조를 나타낼 뿐만 아니라 그들이 모든 생물 막에서 결정적인 요소라는 사실 때문에 선호되는 물질이다.
일 실시형태에서, 투여를 위한 본원에 기술된 면역성 조성물은 대상체에 투여하기 위해 멸균되어야 한다. 멸균은 멸균 여과막(예: 0.2 마이크론 막)을 통한 여과, 또는 감마선 조사에 의해 용이하게 달성된다.
일부 실시형태에서, 본원에 기술된 면역성 조성물은 생체적합성 오일, 생리식염수용액, 보존제, 탄수화물, 단백질, 아미노산, 삼투압 조절제, 담체 가스, pH-조절제, 유기 용매, 소수성 물질, 효소 저해제, 수분 흡수 폴리머, 계면활성제, 흡수촉진제 및 항-산화제를 들 수 있으나 이에 한정되지 않는 의약품 부형제를 더 포함한다. 탄수화물의 대표예에는 가용성 당, 예컨대 하이드로프로필 셀룰로스, 카복시메틸셀룰로스, 소듐 카복실 셀룰로스, 히알루론산, 키토산, 알기네이트, 글루코스, 자일로스, 갈락토스, 프룩토스, 말토스, 사커로스, 덱스트란, 콘드로이틴 설페이트, 등이 포함된다. 단백질의 대표예에는 알부민, 젤라틴, 등이 포함된다. 아미노산의 대표예에는 글리신, 알라닌, 글루탐산, 아르기닌, 리신, 및 그들의 염이 포함된다. 그러한 의약품 부형제는 당 기술분야에 잘 알려져 있다.
일부 실시형태에서, 면역성 MAPS 조성물은 예로서, 감마-인터페론, 시토킨, 화학요법제, 또는 항-염증제, 또는 항바이러스제를 포함하는 다른 치료 성분과 조합하여 투여된다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 면역성 조성물은 본원에 개시된 1 이상의 공 자극 분자들 및/또는 보강제들과 함께 투여될 수 있다.
일부 실시형태에서, 면역성 조성물은 순수한 또는 실질적으로 순수한 형태로 투여되지만, 의약 조성물, 제제(formulation) 또는 프리페어레이션(preparation)으로 투여될 수도 있다. 그러한 제제는 1 이상의 약학적으로 허용가능한 담체 및 임의로 다른 치료 성분과 함께 본원에 기술된 MAPS를 포함한다. 다른 치료 성분에는 항원 제시를 증진하는 화합물, 예를 들어, 감마 인터페론, 시토킨, 화학요법제, 또는 항염증제가 포함된다. 제제는 단위 투여 제형으로 편리하게 제공될 수 있으며 약학 분야에 잘 알려져 있는 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들면, Plotkin and Mortimer, VACCINES(2nd ed., W. B. Saunders Co., 1994)는 특정 병원체에 특이적인 면역 반응을 유도하기 위한 동물 또는 인간의 백신접종, 뿐만 아니라 항원의 제조 방법, 항원의 적절한 투여량을 결정하는 방법, 및 면역 반응의 유도를 검정하는 방법을 기술한다.
정맥내, 근육내, 비강내, 경구, 설하, 질, 직장, 피하, 또는 복강내 투여용으로 적절한 제제는 바람직하게는 수용자의 혈액과 등장인 용액과 함께 활성 성분의 멸균 수용액을 적합하게 포함한다. 그러한 제제는 생리적으로 적합한 물질들 예컨대 소듐 클로라이드(예: 0.1 M∼2.0 M), 글리신, 등을 함유하는 물에 고형 활성 성분을 용해하고, 완충 pH를 생리적 조건에 적합화시켜 수용액을 제조하고, 그 용액을 멸균하여 편리하게 제조될 수 있다. 이것들은 1회분 또는 다회분의 용기에 예를 들면 봉입 앰플이나 바이얼로 존재할 수 있다.
약학적으로 허용가능한 담체로서 리포좀 현탁액도 사용될 수 있다. 이들은 예를 들면 미국 특허 제4,522,811호에 기술된 바와 같은 당업자에게 알려진 방법에 따라 제조될 수 있다.
비강내 전달용의 제제는 미국 특허 제5,427,782호; 제5,843,451호; 제6,398,774호에 기술되어 있다.
면역성 조성물의 제제에는 안정제가 도입될 수 있다. 예시적 안정제는 폴리에틸렌 글리콜, 단백질, 사커라이드, 아미노산, 무기산, 및 유기산이며 그들 단독으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 2 이상의 안정제는 적절한 농도 및/또는 pH에서 수용액으로 사용될 수 있다. 그러한 수용액 내의 특이적 삼투압은 일반적으로 0.1∼3.0 osmoses의 범위에 있고, 바람직하게는 0.80∼1.2 osmoses의 범위에 있다. 수용액의 pH는 pH 5.0∼9.0의 범위 내, 바람직하게는 pH6∼8의 범위내가 되도록 조정된다.
경구 제제가 요망될 때, 면역성 조성물은 전형적인 담체, 그중에서도 예컨대 락토스, 수크로스, 녹말, 탈크 마그네슘 스테아레이트, 결정질 셀룰로스, 메틸셀룰로스, 카복시메틸셀룰로스, 글리세린, 소듐 알기네이트 또는 아라비아 고무 와 조합될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본원에 기술된 면역원 조성물은 정맥내로, 비강내로, 근육내로, 피하로, 복강내로, 설하로, 질, 직장 또는 경구로 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, 투여 경로는 경구, 비강내, 피하, 또는 근육내이다. 일부 실시형태에서, 투여 경로는 비강내 투여이다.
백신접종은 통상의 방법에 의해 행하여질 수 있다. 예를 들면, 면역성 조성물은 적절한 희석제 예컨대 식염수 또는 물, 또는 완전한 또는 불완전 보강제들 내에 사용할 수 있다. 면역성 조성물은 면역 반응을 끌어내는 임의의 적절한 경로에 의해 투여될 수 있다. 면역성 조성물은 면역 반응이 끌어내어지기까지 1회 또는 주기적 간격으로 투여될 수 있다. 면역 반응은 항체 생산, 세포독성 검정, 증식 검정 및 시토킨 방출 검정을 포함하나 이에 한정되지 않는 당업자에게 알려진 다양한 방법에 의해 검출될 수 있다. 예를 들면, 혈액 샘플은 면역 부여된 포유류로부터 뽑을 수 있고 ELISA(참조 de Boer et. al., 115 Arch Virol. 147(1990))에 의해 면역성 조성물의 항원들에 대한 항체들의 존재에 대하여 분석될 수 있으며 이들 항체의 역가는 당 기술분야의 알려진 방법에 의해 결정될 수 있다.
제제에 채용될 정확한 투여량은 투여 경로에 의존하며 개업의의 판단과 각 환자의 상황에 따라 결정되어야 한다. 예를 들면 25 ㎍∼900 ㎍의 총단백질 범위를 세달간 매달 투여할 수 있다.
최종적으로는, 담당의가 특정 개체에 투여할 면역성 조성물 또는 백신 조성물의 양을 결정할 것이다. 모든 면역성 조성물 또는 백신에 대해, 면역원의 면역학적 유효량은 실험적으로 결정되어야 한다. 고려할 인자들에는 면역성, 면역원이 보강제 또는 담체 단백질 또는 다른 담체와 복합화되거나 또는 보강제 또는 담체 단백질 또는 다른 담체에 공유적으로 부착하는지 여부, 투여 경로 및 투여될 면역 투여량의 수치가 포함된다. 그러한 인자들은 백신 분야에 알려져 있고 과도한 실험 없이 그러한 결정을 하는 것은 면역학자의 기술의 범주 내에 있다.
키트
본 발명은 또한 연구자가 바람직한 항원들을 갖는 면역성 조성물을 맞춤하는데 유용한, 예를 들어, 항원 또는 항원들의 조합의 면역 반응에 대한 효과를 평가하기 위한 연구 목적에 유용한, 본원에 개시된 면역성 조성물을 생산하기 위한 키트를 제공한다. 그러한 키트는 곧 이용할 수 있는 재료 및 시약으로 제조될 수 있다. 예를 들면, 그러한 키트는 다음의 재료들의 1 이상을 포함할 수 있다: 복수의 제1 친화성 분자와 가교된 폴리머(예: 폴리사커라이드)를 포함하는 용기; 및 상기 제1 친화성 분자와 결합하는 상보적 친화성 분자를 포함하는 용기로서, 상기 상보적 친화성 분자는 항원과 결합한다.
다른 실시형태에서, 상기 키트는 폴리머(예: 폴리사커라이드)를 포함하는 용기, 복수의 제1 친화성 분자를 포함하는 용기, 및 상기 폴리머에 상기 제1 친화성 분자를 가교하기 위한 가교제를 포함하는 용기를 포함할 수 있다 .
일부 실시형태에서, 상기 키트는 상기 항원에 상기 상보적 친화성 분자를 부착하기 위한 수단을 더 포함하며, 상기 수단은 가교제에 의하는 것 또는 어떤 중개자 융합 단백질에 의하는 것이다. 일부 실시형태에서, 상기 키트는 폴리머에 첨가될 수 있는 적어도 하나의 공자극인자를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 키트는 상기 폴리머에 상기 공인자를 연결하기 위한 가교제, 예를 들면, CDAP(1-시아노-4-디메틸아미노피리디늄 테트라플루오로보레이트), EDC(1-에틸-3-[3-디메틸아미노프로필]카보디이미드 하이드로클로라이드), 소듐 시아노보로하이드라이드; 시아노겐 브로마이드; 암모늄 바이카보네이트/아이오도아세트산을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다.
다양한 키트 및 성분들이 그 키트의 의도된 용도, 특별한 표적 항원 및 사용자의 필요에 따라 본원에 기술된 방법에 사용하기 위해 제조될 수 있다.
일 실시형태에서, 본원에 기술된 면역성 조성물 또는 백신 조성물은 마우스들에게 투여할 때, 질환 증상을 방어할 항원들을 포함하는 면역성 조성물 5 LD50에 의해 시험된 동물의 적어도 20%에서 질환 증상을 방어하는 면역 반응을 끌어낼 수 있다. 면역 부여된 동물을 백신접종 및 시험하는 방법은 당업자에게 알려져 있다. 예를 들면, 본원에 기술된 면역성 조성물 또는 백신 조성물의 10 ㎍ 부분 표본(aliquot)을 100 ㎕ PBS 내에 마련하고 및/또는 프로인트 불완전 보강제(incomplete Freund's adjuvant)의 첨가와 함께 백신접종마다 마우스마다 근육내 주사한다. 대안적으로, 비경구적, 복강내 및 풋패드(footpad) 주사가 사용될 수 있다. 풋패드 주사의 부피는 50 ㎕로 감소된다. 마우스들은 본원에 기술된 면역성 조성물 또는 백신 조성물에 의해 수일(예: 14일) 간격을 갖는 3번의 분리된 때 면역 부여될 수 있다.
백신접종의 효능은 병원체에 의한 시험에 의해 시험될 수 있다. 면역성 조성물의 최종 투여량의 7일 후, 면역 부여된 마우스들은 항원이 유래한 병원성 유기체에 의해 비강내로 시험되었다. 에테르 마취된 마우스들(10 g ∼ 12 g)는 5 LD50의 병원성 유기체를 함유하는 50㎕의 PBS-희석 요막공간액(allantoic fluid)에 의해 비강내로 감염될 수 있다. 방어는 21일의 관찰 기간을 통해 평가되는 동물의 생존 및 체중량을 모니터링함으로써 측정될 수 있다. 심각하게 영향받은 마우스들은 안락사시킨다. A/Mallard/Pennsylvania/10218/84의 1 LD50은 100-1000 조직배양감염량50(TCID50) 검정과 같다.
다른 실시형태에서, 면역 부여된 마우스들은 다양한 상이한 병원성 유기체들, 예를 들어, 폴리머에 부착한 항원들의 각각이 유래한 상이한 병원성 유기체들에 의해 시험될 수 있다. 면역성 조성물이 폴리머(예: 폴리사커라이드)에 부착된 5개의 상이한 항원들을 포함하는, 각 항원이 5개의 상이한 병원성 유기체들로부터 유래된 예에서, 상기 면역 부여된 마우스들은 5개의 상이한 병원성 유기체의 각각에 의해 순차로(임의의 순서로), 또는 동시에 시험될 수 있다. 당업자는 면역 부여된 마우스들을 시험하는데 사용되는 각 병원성 유기체에 대하여 당 기술분야의 알려진 방법에 의해 LD50를 측정할 수 있다. 참조, 예를 들어, LaBarre & Lowy, 96 J. Virol. Meths. 107(2001); Golub, 59J. Immunol. 7(1948).
전술한 발명들은 명확한 이해를 목적으로 예시와 실시예를 이용하여 다소 상세하게 기술하였지만 당 기술분야의 통상의 기술자에게는 본 발명의 교시에 비추어 첨부된 특허청구범위의 사상 또는 범주를 벗어남 없이 소정의 변화와 변형이 행하여질 수 있음이 명백할 것이다. 하기는 본 발명의 설명에 도움을 주기 위한 것이지만 본 발명의 실행은 하기의 실시예에 의해 어떠한 식으로든 한정되거나 제한되지 않는다.
실시예
본원에 제시된 실시예들은 본원에 기술된 면역성 복합체를 생성하는 방법과 그 방법 및 조성물에 관한 것이다. 특히, 실시예들은 본원에 개시된 다항원 제시(MAP) 복합체를 제조하는 방법, 및 대상체에 면역 반응을 생성하는 사용 방법에 관한 것이다.
실시예 1 재조합 리즈아비딘 및 리즈아비딘-항원 융합 단백질의 구성
본 연구에 사용된 재조합 리즈아비딘(rRhavi)은 그 야생형 단백질의 45-179 잔기들만을 함유하는 N-말단 변형된 형태이다. 대장균에서 rRhavi의 발현 수준을 최적화하기 위해, 리즈아비딘 폴리펩티드(45-179)을 코딩하는 유전자 서열을 대장균에 바람직한 발현 코돈들을 사용하여 재설계하고나서 합성하여 PET21b 벡터에 클로닝하였다. 정확한 접힘을 촉진하고 고수율의 가용성 재조합 단백질을 얻기 위해, 대장균 주변세포질 국지화 시그널 서열(periplasmic localization signal sequence)을 코딩하는 DNA 서열(19개의 아미노산, MKKIWLALAGLVLAFSASA, 서열번호 1)을 rRhavi의 합성 유전자의 5'말단에 도입하였다. 이 시그널 서열은 발현 과정 동안 대장균의 주변세포질로의 표적화 후에 재조합 단백질로부터 자동적으로 결실될 것으로 예측된다.
리즈아비딘-항원 융합 단백질을 구성하기 위해, 7개의 아미노산으로 구성되는 플렉서블 링커 영역을 코딩하는 DNA 서열(GGGGSSS, 서열번호 27)을 합성 rRhavi 유전자의 3' 말단에 직접 삽입하여 그 융합 단백질을 안정화시키는 것을 도왔다. 후보 항원들을 코딩하는 유전자들(전장 또는 바람직한 단편)을 통상의 PCR 과정에 의해 관심 대상의 병원체의 게놈 DNA로부터 증폭하여 rRhavi 발현 벡터 내 링커 영역 바로 너머에 삽입하였다.
단백질 발현을 위해, 표적 구성체를 함유하는 플라스미드들을 표준 열충격 과정을 이용하여 대장균 주 BL21(DE3)에 형질전환하였다. 플레이트로부터 단일 콜로니를 갓 찍어(또는 나중에는 글리세롤 스톡이 사용되었다) 37℃에서의 하룻밤 동안(overnight) 배양을 위해 암피실린 함유(Amp+) Luria-Bertani(LB) 배지 30 ml에 접종하였다. 제 2일에, 5 ml의 초기 배양을 1 L의 LB 배지/Amp+에 접종하여 OD600=1이 될 때까지 37℃에서 생육하였다. 배지를 16℃로 냉각 후, 하룻밤 동안의 유도를 위해 배양에 0.2 mM 최종 농도의 IPTG를 첨가하였다.
변형 삼투 충격 프로토콜을 사용하여 주변세포질 분획으로부터 단백질을 정제하였다. 즉, 6리터 배양으로부터 세균 세포를 수집하고 30 mM Tris(pH 8.0), 20% 수크로스 및 1mM EDTA를 함유하는 120 ml 완충액에 재현탁하였다. 실온에서 20분간 교반후, 세포를 10,000 rpm으로 10분간 원심분리하여 재 펠렛화 하였다. 그 상청액을 분획 1로서 수집하고, 세포를 5 mM MgCl2, 단백질분해효소 저해제 및 데옥시리보뉴클레아제를 함유하는 80 ml 빙냉 용액에 재현탁하였다. 4℃에서 20분간 교반 후, 혼합물을 13,000 rpm으로 20분간 원심분리하여 그 상청액을 분획 2로서 수집하였다. 최종 농도 150 mM NaCl, 10 mM MgCl2 및 10mM 이미다졸의 첨가 후, 분획 1과 분획 2를 합친 상청액을 Ni-NTA 칼럼에 가하였다. Ni-NTA 칼럼으로부터 용출된 단백질을 AKTA 정제기에서의 superdex 200 칼럼 전개를 이용한 젤 여과에 의해 더 정제하였다. 표적 단백질을 함유하는 피크 분획들을 모아 농축하였다. 그 단백질 농도를 BCA 단백질 검정 키트(Bio-Rad)를 사용하여 측정하였다. 정제된 단백질을 부분 표본하고(aliquoted), 장래의 사용을 위해 액체 질소에서 급속 냉동하여 -80℃에 보존하였다.
실시예 2 폴리사커라이드의 비오틴화
활성화제로서 1-시아노-4-디메틸아미노피리디늄 테트라플루오로보레이트(CDAP)을 사용하여 폴리사커라이드의 비오틴화를 행하였다. 즉, 폴리사커라이드를 LPS 없는 물에 10 mg/ml로(또는 지시된 다른 농도들로) 용해하였다. t=0에서, 보르텍싱(vortexing)과 함께, 1 부피의 CDAP(아세토니트릴에 100 mg/ml로 갓 제조한)를 1∼2 mg CDAP/mg 폴리사커라이드의 비율로 폴리사커라이드 용액에 서서히 첨가하였다. 30초 후, pH를 올리기 위해 1 부피의 0.2 M 트리에틸아민(TEA)을 가하였다(상이한 유형의 폴리사커라이드에 따라 CDAP의 부피와 같게 또는 두배로). 2.5분에, 4℃에서 하룻밤동안의 커플링(또는 25℃에서 1∼3시간의 커플링)을 위해, 1 부피의 비오틴 유도체(EZ-링크 아민-PEG3-비오틴(Pierce사), LPS 없는 물에 20 mg/ml으로 용해된)를 최종 비율 1∼1.5 mg 비오틴/mg 폴리사커라이드로 첨가하였다. 2일차에, 50 mM 최종 농도의 글리신 또는 세린을 반응을 종결시키기 위해 첨가하고 혼합물을 유리 비오틴 유도체들을 제거하기 위해 대량의 PBS에 대하여 칼럼 통과 또는 투석하여 탈염하였다. 비오틴화 폴리사커라이드 내의 비오틴 함량을 비오틴 정량 키트(Pierce사)를 사용하여 측정하고 폴리사커라이드 농도를 안트론 검정(anthrone assay)에 의해 결정하였다.
실시예 3 MAPS의 조립 및 정제
MAPS 복합체를 조립하기 위해, 1 부피의 비오틴화 폴리사커라이드를 원하는 비율로 후보 rRhavi-항원 융합 단백질들과 혼합하고 그리고나서 하룻밤동안 4℃ 또는 25℃에서 인큐베이션 하였다. 인큐베이션 후, 불용성 응집물들을 제거하기 위해 혼합물을 13,200 rpm에서 3분간 원심분리하였다. 그 상청액을 전개액(running solution)으로서 PBS, Tris 완충액, 또는 식염수를 사용하고, superpose-6 또는 sperdex-200 칼럼을 사용하여, 젤-여과 크로마토그래피를 행하였다. 고분자량 복합체를 함유하는 피크 분획들을 수집 및 농축하였다. MAPS 복합체 내의 단백질 함량과 상이한 항원들의 비율을 쿠마시 블루 염색과 함께 하는 SDS-PAGE에 의해 시험하고, MAPS의 단백질/폴리사커라이드 비율을 BCA 단백질 검정 키트 및 안트론 검정을 사용하여 결정하였다.
실시예 4 면역 부여; 항체 및 시토킨 분석; 마우스들에서의 시험
모든 면역성 조성물들 및 백신들은 면역 부여의 하루 전에 제조되었다. 폐렴구균 전(whole) 세포 백신; MAPS; 또는 특이적 항원들, 리즈아비딘, 폴리사커라이드 및 비오틴 모두를 함유하는 등몰 혼합물;을 지시된 농도까지 식염수를 사용하여 희석하고, 그리고나서 4℃에서 하룻밤동안의 흡착을 위해 15 ml 코니카 튜브 내에서 Al(OH)3와 혼합하였다.
C57BL/6J 마우스들(Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine)을 모든 면역 부여 실험에 사용하였다. 초회의 면역 부여 시의 나이는 4-6주였다. 약하게 구속한 비 마취 마우스들에게, 2주 간격으로 등 하부에 지시된 양의 항원과 함께 또는 항원 없이 200 ㎕의 보강제의 피하 주사 3회를 놓았다. 제2회 및/또는 제3회의 면역 부여로부터 2주 후 혈액을 채취하여, 폐렴구균 전 세포 항원(WCA), TB 추출물, 또는 특정 단백질 항원에 의해 자극 후 생체 외에서 항체와 시토킨 생산에 대하여 검정하였다.
최종 면역 부여 또는 채혈로부터 2주 후에 시험을 행하였다. NP 콜로니화 모델에서, 마우스들을 20 ㎕의 PBS 내의 혈청형 6B 주 0603의 2x107 콜로니 형성 유닛 (CFU) 에 의해 비강내로 시험하였다. NP 콜로니화의 존재와 정도를 결정하기 위해, 상부 호흡 배양을, 절단된 기관을 통해 멸균 식염수를 역행으로 주입하고, 콧구멍으로부터 첫 6방울(약 0.1 ml)을 수집하고, 2.5 ㎍ 젠타미신(gentamicin)/ml을 함유하는 혈액 아가 플레이트 상에 희석되지 않은 또는 희석된 샘플을 플레이팅함으로써, 10일 후에 행하였다.
흡인-패혈증 시험 모델에서, 마우스들을 이소플로란으로 살짝 마취하고, 반듯이 눕히고, 106 CFU의 폐렴구균 혈청형 3 주 WU-2를 함유하는 비강내 접종 100㎕를 가하였다. 마우스들을 매일 2회씩 모니터링하고 병의 징후를 나타낼 때 CO2 흡입 및 종말 큰 출혈(terminal exsanguination)에 의해 도살한 다음 혈액 배양을 얻었다.
WCA 또는 상이한 단백질 항원들에 대한 마우스들 항체의 검정을 WCA(100 ㎍ 단백질/ml PBS) 또는 단백질 항원들(1 ㎍의 단백질/ml PBS)으로 코팅된 Immulon 2 HB 96-마이크로웰 플레이트(Thermo Scientific, Waltham, MA)에서 행하였다. 플레이트들을 1% BSA/PBS에 의해 블로킹하였다. PBS-T에 희석된 항체를 가하고 2시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 플레이트들을 PBS-T로 세정하고 마우스 면역글로불린 G(Sigma사)에의 2차 HRP-콘쥬게이티드 항체를 가하고 실온에서 한시간동안 인큐베이션하였다. 그 플레이트들을 세정하고 SureBlue TMB 마이크로웰 페록시다제 기질(KPL, Gaithersburg, MD)과 함께 발달시켰다.
시토킨 자극을 위해, 자극제를, 10% 저-내독소 규정된 FBS (Hyclone, Logan, UT), 50 μM 2-머캅토에탄올 (Sigma) 및 시프로플록사신(ciprofloxacin)(10 ㎍/ml, Cellgro, Manassas, VA))를 함유하는 자극 배지(DMEM (BioWhittaker, Walkersville, MD)에, 모든 단백질 항원들에 대해, 또는 폐렴구균 WCA에 대해 1 ㎍/ml∼10 ㎍/ml의 농도로 희석하였다. 25 ㎕의 헤파린화 혈액을 225 ㎕의 DMEM 배지(자극제와 함께/자극제 없이)에 가하고 37℃에서 6일간 배양하였다. 그 상청액을 수집한 다음 원심분리하고 IL-17A 또는 IFN-γ 농도에 대해 ELISA에 의해 분석할 때까지 -80℃에 보관하였다(R&D Systems, Minneapolis, MN).
비장 세포의 자극을 위해, 마우스 비장 세포를 단리하고, 자극 배지에 재현탁하고, 그리고나서 48-웰 플레이트(3×106 세포/well, 300 ㎕의 부피로)에 접종하였다. 37℃에서 2시간 동안의 인큐베이션 후, 37℃에서 3일간의 자극을 위해, 지시된 농도로 자극이 가해졌다. 그 상청액을 수집한 다음 원심분리하고 IL-17A 또는 IFN-γ 농도에 대해 ELISA에 의해 분석할 때까지 -80℃에 보관하였다.
항체 및 IL-17A 농도 및 NP 콜로니화 밀도를 PRISM(맥킨토시용 버젼 4.0a, GraphPad Software, Inc)을 사용하는 Mann-Whitney U 테스트에 의해 비교하였다. 생존의 차이를 역시 PRISM을 사용하여 Kaplan-Meier 테스트에 의해 분석하였다.
SEQUENCE LISTING
<110> MALLEY, RICHARD
LU, YINGJIE
ZHANG, FAN
<120> MULTIPLE ANTIGEN PRESENTING IMMUNOGENIC COMPOSITION, AND METHODS
AND USES THEREOF
<130> 701039-069664-US
<140> 14/116,402
<141> 2013-11-08
<150> PCT/US2012/037412
<151> 2012-05-11
<150> 61/609,974
<151> 2012-03-13
<150> 61/608,168
<151> 2012-03-08
<150> 61/484,934
<151> 2011-05-11
<160> 31
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 1
Met Lys Lys Ile Trp Leu Ala Leu Ala Gly Leu Val Leu Ala Phe Ser
1 5 10 15
Ala Ser Ala
<210> 2
<211> 20
<212> PRT
<213> Chlamyidia trachomatis
<400> 2
Asn Val Thr Gln Asp Leu Thr Ser Ser Thr Ala Lys Leu Glu Cys Thr
1 5 10 15
Gln Asp Leu Ile
20
<210> 3
<211> 20
<212> PRT
<213> Chlamyidia trachomatis
<400> 3
Ala Lys Leu Glu Cys Thr Gln Asp Leu Ile Ala Gln Gly Lys Leu Ile
1 5 10 15
Val Thr Asn Pro
20
<210> 4
<211> 9
<212> PRT
<213> Chlamyidia trachomatis
<400> 4
Ser Asn Leu Lys Arg Met Gln Lys Ile
1 5
<210> 5
<211> 9
<212> PRT
<213> Chlamyidia trachomatis
<400> 5
Ala Ala Leu Tyr Ser Thr Glu Asp Leu
1 5
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> Chlamyidia trachomatis
<400> 6
Phe Gln Glu Lys Asp Ala Asp Thr Leu
1 5
<210> 7
<211> 9
<212> PRT
<213> Chlamyidia trachomatis
<400> 7
Gln Ser Val Asn Glu Leu Val Tyr Val
1 5
<210> 8
<211> 9
<212> PRT
<213> Chlamyidia trachomatis
<400> 8
Leu Glu Phe Ala Ser Cys Ser Ser Leu
1 5
<210> 9
<211> 9
<212> PRT
<213> Chlamyidia trachomatis
<400> 9
Ser Gln Ala Glu Gly Gln Tyr Arg Leu
1 5
<210> 10
<211> 9
<212> PRT
<213> Chlamyidia trachomatis
<400> 10
Gly Gln Ser Val Asn Glu Leu Val Tyr
1 5
<210> 11
<211> 9
<212> PRT
<213> Chlamyidia trachomatis
<400> 11
Gln Ala Val Leu Leu Leu Asp Gln Ile
1 5
<210> 12
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Arg or Leu
<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)..(4)
<223> Ser or Thr
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> Tyr or Trp
<400> 12
Asp Xaa Ala Xaa Pro Xaa
1 5
<210> 13
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> Arg or Leu
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> Ser or Thr
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> Tyr or Trp
<400> 13
Cys Asp Xaa Ala Xaa Pro Xaa Cys Gly
1 5
<210> 14
<211> 23
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 14
Met Ala Pro Phe Glu Pro Leu Ala Ser Gly Ile Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Ile Ala Pro Ser Arg Ala
20
<210> 15
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 15
Gly Ser Pro Gly Ile Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ile Leu Glu
1 5 10
<210> 16
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> Any amino acid
<400> 16
Leu Pro Xaa Thr Gly
1 5
<210> 17
<211> 3
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 17
Pro Glu Pro
1
<210> 18
<211> 24
<212> PRT
<213> Listeria monocytogenes
<400> 18
Met Lys Lys Ile Met Leu Val Ile Thr Leu Ile Leu Val Ser Pro Ile
1 5 10 15
Ala Gln Gln Thr Glu Ala Lys Asp
20
<210> 19
<211> 29
<212> PRT
<213> Lactococcus lactis
<400> 19
Met Lys Lys Lys Ile Ile Ser Ala Ile Leu Met Ser Thr Val Ile Leu
1 5 10 15
Ser Ala Ala Ala Pro Leu Ser Gly Val Tyr Ala Asp Thr
20 25
<210> 20
<211> 31
<212> PRT
<213> Bacillus anthracis
<400> 20
Met Lys Lys Arg Lys Val Leu Ile Pro Leu Met Ala Leu Ser Thr Ile
1 5 10 15
Leu Val Ser Ser Thr Gly Asn Leu Glu Val Ile Gln Ala Glu Val
20 25 30
<210> 21
<211> 29
<212> PRT
<213> Listeria monocytogenes
<400> 21
Met Asn Met Lys Lys Ala Thr Ile Ala Ala Thr Ala Gly Ile Ala Val
1 5 10 15
Thr Ala Phe Ala Ala Pro Thr Ile Ala Ser Ala Ser Thr
20 25
<210> 22
<211> 54
<212> PRT
<213> Listeria monocytogenes
<400> 22
Met Gln Lys Thr Arg Lys Glu Arg Ile Leu Glu Ala Leu Gln Glu Glu
1 5 10 15
Lys Lys Asn Lys Lys Ser Lys Lys Phe Lys Thr Gly Ala Thr Ile Ala
20 25 30
Gly Val Thr Ala Ile Ala Thr Ser Ile Thr Val Pro Gly Ile Glu Val
35 40 45
Ile Val Ser Ala Asp Glu
50
<210> 23
<211> 28
<212> PRT
<213> Bacillus anthracis
<400> 23
Met Lys Lys Leu Lys Met Ala Ser Cys Ala Leu Val Ala Gly Leu Met
1 5 10 15
Phe Ser Gly Leu Thr Pro Asn Ala Phe Ala Glu Asp
20 25
<210> 24
<211> 31
<212> PRT
<213> Staphylococcus aureus
<400> 24
Met Ala Lys Lys Phe Asn Tyr Lys Leu Pro Ser Met Val Ala Leu Thr
1 5 10 15
Leu Val Gly Ser Ala Val Thr Ala His Gln Val Gln Ala Ala Glu
20 25 30
<210> 25
<211> 59
<212> PRT
<213> Listeria monocytogenes
<400> 25
Met Thr Asp Lys Lys Ser Glu Asn Gln Thr Glu Lys Thr Glu Thr Lys
1 5 10 15
Glu Asn Lys Gly Met Thr Arg Arg Glu Met Leu Lys Leu Ser Ala Val
20 25 30
Ala Gly Thr Gly Ile Ala Val Gly Ala Thr Gly Leu Gly Thr Ile Leu
35 40 45
Asn Val Val Asp Gln Val Asp Lys Ala Leu Thr
50 55
<210> 26
<211> 53
<212> PRT
<213> Bacillus subtillis
<400> 26
Met Ala Tyr Asp Ser Arg Phe Asp Glu Trp Val Gln Lys Leu Lys Glu
1 5 10 15
Glu Ser Phe Gln Asn Asn Thr Phe Asp Arg Arg Lys Phe Ile Gln Gly
20 25 30
Ala Gly Lys Ile Ala Gly Leu Gly Leu Gly Leu Thr Ile Ala Gln Ser
35 40 45
Val Gly Ala Phe Gly
50
<210> 27
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 27
Gly Gly Gly Gly Ser Ser Ser
1 5
<210> 28
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
6xHis tag
<400> 28
His His His His His His
1 5
<210> 29
<211> 23
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 29
Met Lys Lys Ile Trp Leu Ala Leu Ala Gly Leu Val Leu Ala Phe Ser
1 5 10 15
Ala Ser Ala Ala Gln Asp Pro
20
<210> 30
<211> 22
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 30
Gly Gly Gly Gly Ser Ser Ser Val Asp Lys Leu Ala Ala Ala Leu Glu
1 5 10 15
His His His His His His
20
<210> 31
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 31
Leu Glu His His His His His His
1 5
Claims (35)
- 면역학적 유효량의 적어도 하나의 항원성 폴리사커라이드와, 면역학적 유효량의 1개 내지 10개의 상이한 펩티드 또는 폴리펩티드 항원과, 제1 친화성 분자 및 제1 친화성 분자에 상보적인 제2 친화성 분자를 포함하는 친화성-분자 쌍을 포함하는 면역원성 조성물로, 상기 제1 친화성 분자는 비오틴 부분을 포함하고, 상기 제2 친화성 분자는 비오틴-결합 리즈아비딘 폴리펩티드를 포함하고; 여기에서:
상기 적어도 하나의 항원성 폴리사커라이드는 상기 제1 친화성 분자와 결합되고, 상기 1개 내지 10개의 상이한 펩티드 또는 폴리펩티드 항원은 적어도 하나의 상기 제2 친화성 분자와 결합되고, 상기 제1 친화성 분자가 상기 제2 친화성 분자와 비공유적으로 결합하여 상기 펩티드 또는 폴리펩티드 항원과 상기 항원성 폴리사커라이드를 연결하며;
상기 적어도 하나의 항원성 폴리사커라이드는 덱스트란을 포함하지 않고;
상기 면역원성 조성물은 대상체에 투여시, 대상체에서 (i) 적어도 하나의 항원성 폴리사커라이드에 대한 면역 반응, 및 (ii) 1개 내지 10개의 상이한 펩티드 또는 폴리펩티드 항원에 대한 면역 반응을 유발하는, 면역원성 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 제1 친화성 분자는 상기 항원성 폴리사커라이드에 가교 또는 공유결합된, 면역원성 조성물. - 제2항에 있어서,
상기 제1 친화성 분자는 CDAP(1-시아노-4-디메틸아미노피리디늄 테트라플루오로보레이트); EDC(1-에틸-3-[3-디메틸아미노프로필]카보디이미드 하이드로클로라이드); 소듐 시아노보로하이드라이드; 시아노겐 브로마이드; 및 암모늄 바이카보네이트/아이오도아세트산으로 이루어진 군에서 선택되는 가교제를 사용하여 상기 항원성 폴리사커라이드에 가교된, 면역원성 조성물. - 삭제
- 삭제
- 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 제2 친화성 분자는 상기 펩티드 또는 폴리펩티드 항원에 비공유적으로 또는 공유적으로 부착되어 있는, 면역원성 조성물. - 제7항에 있어서,
상기 펩티드 또는 폴리펩티드 항원은 상기 제2 친화성 분자에 공유적으로 부착하여 상기 제2 친화성 분자에 융합된 상기 펩티드 또는 폴리펩티드 항원을 포함하는 융합 단백질을 형성하고 있는, 면역원성 조성물. - 삭제
- 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 항원성 폴리사커라이드는 분지쇄형 폴리사커라이드 또는 직쇄형 폴리사커라이드인, 면역원성 조성물. - 제1항에 있어서,
2개 내지 10개의 펩티드 또는 폴리펩티드 항원을 포함하며,
상기 펩티드 또는 폴리펩티드 항원은, 상이한 펩티드 또는 폴리펩티드, 동일한 펩티드 또는 폴리펩티드의 상이한 변이형, 동일한 펩티드 또는 폴리펩티드의 상이한 도메인, 및, 동일한 펩티드 또는 폴리펩티드의 상이한 부분으로 이루어지는 군에서 선택되는, 면역원성 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 펩티드 또는 폴리펩티드 항원에 부착된 플렉서블 링커 펩티드(flexible linker peptide)를 더 포함하며, 상기 플렉서블 링커 펩티드는 상기 펩티드 또는 폴리펩티드 항원을 상기 제2 친화성 분자에 부착하는, 면역원성 조성물. - 제1항에 있어서,
적어도 하나의 상기 펩티드 또는 폴리펩티드 항원은 병원체(pathogenic organism) 또는 종양(tumor)으로부터의 것인, 면역원성 조성물. - 제14항에 있어서,
적어도 하나의 상기 펩티드 또는 폴리펩티드 항원은
폐렴구균 항원(pneumococcal antigens), 결핵 항원(tuberculosis antigens), 탄저병 항원(anthrax antigens), HIV 항원, 클로스트리디아 항원(Clostridia antigens), 대장균 항원(E. coli antigens), 살모넬라 항원(Salmonella antigens), 엔테로박터 항원(Enterobacter antigens), 클레브시엘라 항원(Klebsiella antigens), 시트로박터 항원(Citrobacter antigens), 백일해 항원(Pertussis antigens), 수막구균 항원(Meningococcal antigens), 헤모필루스 항원(Haemophilus antigens), 슈도모나스 항원(Pseudomonas antigens), 황색포도구균 항원(Staphylococcus aureus antigens), 계절성 또는 유행성 인플루엔자 항원(seasonal or epidemic influenza antigens), HPV 항원(HPV antigens), 톡소이드(toxoids), 독소 또는 독소 부분, 진균 항원, 바이러스 항원, 암 항원 및 이들의 조합으로 이루어지는 군에서 선택되는 것인, 면역원성 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 항원성 폴리사커라이드는 병원체 또는 종양에 유래하는, 면역원성 조성물. - 제16항에 있어서,
상기 항원성 폴리사커라이드는 장티푸스균 Vi 피막 폴리사커라이드(Salmonella typhi Vi capsular polysaccharides), 폐렴구균 피막 폴리사커라이드(pneumococcal capsular polysaccharides), 폐렴구균 세포벽 폴리사커라이드(pneumococcal cell wall polysaccharides), 헤모필루스 인플루엔자 b형(Hib) 폴리사커라이드(Haemophilus influenzae Type b (Hib) polysaccharides), 헤모필리 폴리사커라이드(Haemophili polysaccharides), 수막구균 폴리사커라이드(Meningococcal polysaccharides), 황색포도구균 피막 폴리사커라이드(Staphylococcus aureus capsular polysaccharides), 탄저균 폴리사커라이드(Bacillus anthracis polysaccharides), 스트렙토콕쿠스 폴리사커라이드(Streptococcus polysaccharides), 슈도모나스 폴리사커라이드(Pseudomonas polysaccharides), 진균 폴리사커라이드(fungal polysaccharides), 바이러스 폴리사커라이드(viral polysaccharides), 및 암 세포 유래 폴리사커라이드로 이루어진 군에서 선택되는, 면역원성 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 항원성 폴리사커라이드, 또는 적어도 하나의 상기 펩티드, 또는 폴리펩티드 항원에 결합된 적어도 하나의 공자극인자(co-stimulation factor)를 더 포함하는, 면역원성 조성물. - 제18항에 있어서,
상기 공자극인자는 톨 유사 수용체 리간드 또는 작용제(Toll-like receptor ligands or agonists), NOD 리간드 또는 작용제(NOD ligands or agonists), 및 염증조절복합체의 활성제 또는 작용제(activators or agonists of the inflammasome)로 이루어지는 군에서 선택되는, 면역원성 조성물. - 제1항에 있어서,
적어도 하나의 보강제(adjuvant)를 더 포함하는, 면역원성 조성물. - 적어도 하나의 항원에 대한 대상체 내의 면역 반응을 유도하기 위한 약제의 제조에 제1항 내지 제3항, 제7항, 제8항 및 제11항 내지 제20항 중 어느 한 항에 기재된 조성물을 사용하는 방법으로, 상기 약제는 제1항 내지 제3항, 제7항, 제8항 및 제11항 내지 제20항 중 어느 한 항에 기재된 조성물을 포함하는, 방법.
- 제21항에 있어서,
상기 면역 반응은 항체 또는 B 세포 반응인, 방법. - 제21항에 있어서,
상기 면역 반응은 CD4+ T 세포 반응, 또는 CD8+ T 세포 반응, 또는 CD4+ 및 CD8+ T 세포 반응 양쪽인, 방법. - 제21항에 있어서,
상기 면역 반응은 항체 또는 B 세포 반응 및 T 세포 반응인, 방법. - 제21항에 있어서,
상기 면역 반응은 적어도 하나의 항원성 폴리사커라이드 및 1개 내지 10개의 상이한 펩티드 또는 폴리펩티드 항원에 대한 것인, 방법. - 제21항에 있어서,
상기 면역 반응은, 상기 적어도 하나의 항원성 폴리사커라이드에 대한, 항체 또는 B 세포 반응과,
적어도 하나의 상기 펩티드 또는 폴리펩티드 항원에 대한, CD4+ T 세포 반응, 또는 CD8+ T 세포 반응, 또는 CD4+ 및 CD8+ T 세포 반응 양쪽인, 방법. - 제21항에 있어서,
상기 면역 반응은, 적어도 하나의 항원성 폴리사커라이드에 대한, 항체 또는 B 세포 반응과,
적어도 하나의 상기 펩티드 또는 폴리펩티드 항원에 대한, 항체 또는 B 세포 반응 및 CD4+ T 세포 반응, 또는 CD8+ T 세포 반응, 또는 CD4+ 및 CD8+ T 세포 반응 양쪽인, 방법. - (i) 복수의 제1 친화성 분자와 가교되거나 공유 결합된 항원성 폴리사커라이드를 포함하는 용기로, 상기 항원성 폴리사커라이드는 덱스트란을 포함하지 않고; 상기 제1 친화성 분자 각각은 비오틴 부분을 포함하는 용기; 및
(ii) 적어도 하나의 제2 친화성 분자에 융합된 1개 내지 10개의 펩티드 또는 폴리펩티드 항원을 포함하는 1개 내지 10개의 용기로, 상기 제2 친화성 분자는 비오틴-결합 리즈아비딘 폴리펩티드를 포함하는 용기;
를 포함하는, 제1항 내지 제3항, 제7항, 제8항 및 제11항 내지 제20항 중 어느 한 항에 기재된 면역원성 조성물의 제조에 사용하기 위한, 키트. - 제28항에 있어서,
적어도 하나의 공자극인자; 및
임의로, 상기 항원성 폴리사커라이드에 상기 공자극인자를 연결시키기 위해 CDAP(1-시아노-4-디메틸아미노피리디늄 테트라플루오로보레이트), EDC(1-에틸-3-[3-디메틸아미노프로필] 카보디이미드 하이드로클로라이드), 소듐 시아노보로하이드라이드, 시아노겐 브로마이드, 또는 암모늄 바이카보네이트/아이오도아세트산으로 이루어지는 군에서 선택될 수 있는 적어도 하나의 가교제를 더 포함하는, 키트. - 삭제
- 삭제
- 제17항에 있어서,
상기 스트렙토콕쿠스 폴리사커라이드는 그룹 A 및/또는 그룹 B 스트렙토콕쿠스 폴리사커라이드이거나 이를 포함하는, 면역원성 조성물. - 제17항에 있어서,
상기 진균 폴리사커라이드는 크립토콕쿠스로부터의 것인, 면역원성 조성물. - 제17항에 있어서,
상기 바이러스 폴리사커라이드는 당단백질이거나 이를 포함하는, 면역원성 조성물. - 제23항에 있어서,
상기 CD4+ T 세포 반응은 Th1, Th2 및/또는 Th17 반응이거나, 이를 포함하는, 방법.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
KR1020217009127A KR102494245B1 (ko) | 2011-05-11 | 2012-05-11 | 다항원 제시 면역원성 조성물, 및 그 방법 및 용도 |
Applications Claiming Priority (7)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201161484934P | 2011-05-11 | 2011-05-11 | |
US61/484,934 | 2011-05-11 | ||
US201261608168P | 2012-03-08 | 2012-03-08 | |
US61/608,168 | 2012-03-08 | ||
US201261609974P | 2012-03-13 | 2012-03-13 | |
US61/609,974 | 2012-03-13 | ||
PCT/US2012/037412 WO2012155007A1 (en) | 2011-05-11 | 2012-05-11 | Multiple antigen presenting immunogenic composition, and methods and uses thereof |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
KR1020137032789A Division KR20140146993A (ko) | 2011-05-11 | 2012-05-11 | 다항원 제시 면역성 조성물, 및 그 방법 및 용도 |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
KR1020217009127A Division KR102494245B1 (ko) | 2011-05-11 | 2012-05-11 | 다항원 제시 면역원성 조성물, 및 그 방법 및 용도 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
KR20190104631A KR20190104631A (ko) | 2019-09-10 |
KR102234933B1 true KR102234933B1 (ko) | 2021-04-05 |
Family
ID=47139675
Family Applications (4)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
KR1020197025288A KR102234933B1 (ko) | 2011-05-11 | 2012-05-11 | 다항원 제시 면역원성 조성물, 및 그 방법 및 용도 |
KR1020137032751A KR102084509B1 (ko) | 2011-05-11 | 2012-05-11 | 변형 비오틴-결합 단백질, 그 융합 단백질 및 응용 |
KR1020137032789A KR20140146993A (ko) | 2011-05-11 | 2012-05-11 | 다항원 제시 면역성 조성물, 및 그 방법 및 용도 |
KR1020217009127A KR102494245B1 (ko) | 2011-05-11 | 2012-05-11 | 다항원 제시 면역원성 조성물, 및 그 방법 및 용도 |
Family Applications After (3)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
KR1020137032751A KR102084509B1 (ko) | 2011-05-11 | 2012-05-11 | 변형 비오틴-결합 단백질, 그 융합 단백질 및 응용 |
KR1020137032789A KR20140146993A (ko) | 2011-05-11 | 2012-05-11 | 다항원 제시 면역성 조성물, 및 그 방법 및 용도 |
KR1020217009127A KR102494245B1 (ko) | 2011-05-11 | 2012-05-11 | 다항원 제시 면역원성 조성물, 및 그 방법 및 용도 |
Country Status (13)
Country | Link |
---|---|
US (7) | US9499593B2 (ko) |
EP (4) | EP2706991B1 (ko) |
JP (7) | JP6366501B2 (ko) |
KR (4) | KR102234933B1 (ko) |
CN (4) | CN103648489A (ko) |
AU (2) | AU2012253359B2 (ko) |
BR (2) | BR112013028892B1 (ko) |
CA (2) | CA2835630A1 (ko) |
ES (2) | ES2864764T3 (ko) |
MX (2) | MX2013013111A (ko) |
RU (2) | RU2632651C2 (ko) |
WO (2) | WO2012155053A1 (ko) |
ZA (2) | ZA201308465B (ko) |
Families Citing this family (53)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP4763210B2 (ja) * | 2000-02-28 | 2011-08-31 | ノバルティス ヴァクシンズ アンド ダイアグノスティクス エスアールエル | ナイセリアのタンパク質の異種発現 |
EP2293815A4 (en) * | 2008-05-22 | 2013-04-03 | Childrens Medical Center | SYNERGISTIC IMMUNOGENIC CONJUGATE FUSION-POLYSACCHARIDE PROTEIN |
EP2706991B1 (en) | 2011-05-11 | 2021-03-24 | Children's Medical Center Corporation | Multiple antigen presenting immunogenic composition, and methods and uses thereof |
US10500283B2 (en) * | 2011-05-30 | 2019-12-10 | National Institute Of Immunology | Vaccine composition capable of inducing memory antibody response from single point immunization |
US9265819B2 (en) * | 2011-09-21 | 2016-02-23 | St. Jude Children's Research Hospital | Live, attenuated Streptococcus pneumoniae strain and vaccine for protection against pneumococcal disease |
US9274430B2 (en) | 2012-10-10 | 2016-03-01 | Arizona Board Of Regents On Behalf Of Arizona State University | Systems and devices for molecule sensing and method of manufacturing thereof |
AU2014214844B2 (en) * | 2013-02-07 | 2017-12-14 | Children's Medical Center Corporation | Protein antigens that provide protection against pneumococcal colonization and/or disease |
US9981997B2 (en) | 2013-10-31 | 2018-05-29 | Arizona Board Of Regents On Behalf Of Arizona State University | Chemical reagents for attaching affinity molecules on surfaces |
US10080790B2 (en) | 2014-09-19 | 2018-09-25 | The Regents Of The University Of Michigan | Staphylococcus aureus materials and methods |
CN104548101B (zh) * | 2015-01-31 | 2017-02-22 | 广东海大畜牧兽医研究院有限公司 | 一种诱导哺乳动物乳腺黏膜产生IgA的免疫增强剂及其制备方法和应用 |
CN105646681B (zh) * | 2016-01-21 | 2021-07-16 | 浙江海隆生物科技有限公司 | 一种奶牛金黄色葡萄球菌α-溶血素亚单位疫苗的制备方法及应用 |
EP3443001A4 (en) | 2016-04-11 | 2020-04-29 | Obsidian Therapeutics, Inc. | REGULATED BIOCIRCUIT SYSTEMS |
WO2017192801A1 (en) * | 2016-05-04 | 2017-11-09 | The Children's Medical Center Corporation | Methods to purify avidin-like proteins and fusion proteins thereof |
US10751398B2 (en) * | 2016-10-07 | 2020-08-25 | Loyola University Chicago | Inflammasome activators and methods of use to treat tumors |
US11180535B1 (en) | 2016-12-07 | 2021-11-23 | David Gordon Bermudes | Saccharide binding, tumor penetration, and cytotoxic antitumor chimeric peptides from therapeutic bacteria |
US11951165B2 (en) | 2016-12-30 | 2024-04-09 | Vaxcyte, Inc. | Conjugated vaccine carrier proteins |
US11998599B2 (en) | 2016-12-30 | 2024-06-04 | Vaxcyte, Inc. | Polypeptide-antigen conjugates with non-natural amino acids |
US20180161433A1 (en) * | 2017-03-22 | 2018-06-14 | Timothy Andrew Erickson | Size tunable microbial mimetics for immunotherapy of thyroid carcinomas and solid tumors |
EP3600400A4 (en) * | 2017-03-28 | 2021-01-13 | The Children's Medical Center Corporation | MULTIPLE ANTIGEN PRESENTATION SYSTEM (MAPS) BASED STAPHYLOCOCCUS AUREUS VACCINE, IMMUNOGEN COMPOSITION AND THEIR USES |
KR20200018787A (ko) * | 2017-05-22 | 2020-02-20 | 더 칠드런스 메디칼 센터 코포레이션 | 마이코박테리움 투버큘로시스에 대한 혼합 백신 |
KR102634811B1 (ko) | 2017-06-10 | 2024-02-06 | 인벤트프라이즈 인크. | 면역원성과 항원항체 결합성이 개선된 2가 또는 다가 접합체 다당류를 가진 다가 접합체 백신 |
US10729763B2 (en) | 2017-06-10 | 2020-08-04 | Inventprise, Llc | Mixtures of polysaccharide-protein pegylated compounds |
CN111065417B (zh) | 2017-06-23 | 2024-04-19 | 美商艾芬尼维克斯公司 | 免疫原性组合物 |
MA49651A (fr) * | 2017-07-19 | 2021-04-28 | Childrens Medical Center | Compositions et procédés pour traiter des maladies associées à un défaut d'empreinte |
JP2020536968A (ja) * | 2017-10-13 | 2020-12-17 | ザ リサーチ ファウンデイション フォー ザ ステイト ユニバーシティー オブ ニューヨーク | 共生疾患進行に対する包括的ワクチン設計 |
CN108339115B (zh) * | 2018-05-11 | 2020-07-10 | 武汉博沃生物科技有限公司 | 使用重组载体蛋白的肺炎球菌联合疫苗及其制备方法 |
EP3806888B1 (en) | 2018-06-12 | 2024-01-31 | Obsidian Therapeutics, Inc. | Pde5 derived regulatory constructs and methods of use in immunotherapy |
AU2019338448A1 (en) * | 2018-09-12 | 2021-05-06 | The Children's Medical Center Corporation | Pneumococcal fusion protein vaccines |
SG11202102007UA (en) * | 2018-09-12 | 2021-03-30 | Affinivax Inc | Multivalent pneumococcal vaccines |
WO2020086742A1 (en) | 2018-10-24 | 2020-04-30 | Obsidian Therapeutics, Inc. | Er tunable protein regulation |
CN109400704B (zh) * | 2018-11-14 | 2020-07-21 | 珠海泰诺麦博生物技术有限公司 | 一种抗金黄色葡萄球菌α-溶血素的抗体及其应用 |
BR112021017744A2 (pt) | 2019-03-08 | 2021-11-16 | Obsidian Therapeutics Inc | Composições e métodos de cd40l para regulação ajustável |
US20220228168A1 (en) * | 2019-04-29 | 2022-07-21 | The Broad Institute, Inc. | Affinity-based multiplexing for live-cell monitoring of complex cell populations |
WO2020252404A1 (en) | 2019-06-12 | 2020-12-17 | Obsidian Therapeutics, Inc. | Ca2 compositions and methods for tunable regulation |
EP3983538A1 (en) | 2019-06-12 | 2022-04-20 | Obsidian Therapeutics, Inc. | Ca2 compositions and methods for tunable regulation |
CN111518822B (zh) * | 2019-07-02 | 2022-08-09 | 江南大学 | 一种硫酸软骨素abc裂解酶突变体及其分泌表达的方法 |
JP2021029171A (ja) * | 2019-08-23 | 2021-03-01 | 国立大学法人東京農工大学 | ブレビバチルス菌を用いた表層提示法 |
WO2021046451A1 (en) | 2019-09-06 | 2021-03-11 | Obsidian Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for dhfr tunable protein regulation |
US20220401542A1 (en) * | 2019-11-05 | 2022-12-22 | Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. | Mycobacterial compositions and biomarkers for use in treatment and monitoring of therapeutic responsiveness |
EP4083178A4 (en) * | 2019-12-27 | 2024-04-24 | Amolifescience Co., Ltd. | CELL CULTURE SUBSTRATE AND METHOD FOR ITS PRODUCTION |
US20230340402A1 (en) * | 2019-12-27 | 2023-10-26 | Amolifescience Co., Ltd. | Cell culture substrate and manufacturing method thereof |
WO2022053016A1 (zh) * | 2020-09-14 | 2022-03-17 | 神州细胞工程有限公司 | 通过糖-冠状病毒rbd抗原缀合物提高免疫原性的方法 |
US20240197853A1 (en) * | 2021-04-06 | 2024-06-20 | The Board Of Trustees Of The University Of Illinois | Multivalent cholera multiepitope fusion antigen (mefa) and methods of use |
WO2023039108A1 (en) | 2021-09-08 | 2023-03-16 | Affinivax, Inc. | Coronavirus vaccine |
WO2023039223A1 (en) | 2021-09-09 | 2023-03-16 | Affinivax, Inc. | Multivalent pneumococcal vaccines |
US20230122876A1 (en) * | 2021-10-20 | 2023-04-20 | Fina Biosolutions, Llc | Chemical Reagents for the Activation of Polysaccharides in the Preparation of Conjugate Vaccines |
AU2022382972A1 (en) | 2021-11-02 | 2024-05-09 | Arvada Therapeutics, Inc. | Dsg2 compositions and methods |
CA3239402A1 (en) * | 2021-12-02 | 2023-06-08 | Richard Malley | A maps vaccine targeting salmonella enterica serovars |
WO2023192997A2 (en) * | 2022-03-31 | 2023-10-05 | The Children's Medical Center Corporation | Immunogenic compositions for b-cell recall response to a polysaccharide antigen |
WO2024081871A1 (en) * | 2022-10-14 | 2024-04-18 | The Children's Medical Center Corporation | Shigella multiple antigen presenting immunogenic composition and fusion proteins thereof |
WO2024081906A1 (en) * | 2022-10-14 | 2024-04-18 | The Children's Medical Center Corporation | A maps vaccine targeting group b streptococcus (gbs) |
WO2024110839A2 (en) | 2022-11-22 | 2024-05-30 | Pfizer Inc. | Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof |
CN115819624B (zh) * | 2022-12-16 | 2023-12-15 | 深圳华腾生物医药科技有限公司 | 一种重组融合蛋白及其制备方法和应用 |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2005037190A2 (en) * | 2003-09-03 | 2005-04-28 | Dendritherapeutics, Inc. | Multiplex vaccines |
WO2007150020A1 (en) * | 2006-06-23 | 2007-12-27 | Simon Paul M | Targeted immune conjugates |
US20110065660A1 (en) | 2009-04-20 | 2011-03-17 | Elcelyx Therapeutics, Inc. | Chemosensory Receptor Ligand-Based Therapies |
WO2011137354A2 (en) | 2010-04-30 | 2011-11-03 | Augmenta Biologicals, Llc | Delivery proteins |
Family Cites Families (71)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US244420A (en) | 1881-07-19 | Stove pipe threadeb and beader | ||
US3887699A (en) | 1969-03-24 | 1975-06-03 | Seymour Yolles | Biodegradable polymeric article for dispensing drugs |
US3773919A (en) | 1969-10-23 | 1973-11-20 | Du Pont | Polylactide-drug mixtures |
PH19942A (en) | 1980-11-18 | 1986-08-14 | Sintex Inc | Microencapsulation of water soluble polypeptides |
IE52535B1 (en) | 1981-02-16 | 1987-12-09 | Ici Plc | Continuous release pharmaceutical compositions |
US4522811A (en) | 1982-07-08 | 1985-06-11 | Syntex (U.S.A.) Inc. | Serial injection of muramyldipeptides and liposomes enhances the anti-infective activity of muramyldipeptides |
US4673641A (en) | 1982-12-16 | 1987-06-16 | Molecular Genetics Research And Development Limited Partnership | Co-aggregate purification of proteins |
US4745051A (en) | 1983-05-27 | 1988-05-17 | The Texas A&M University System | Method for producing a recombinant baculovirus expression vector |
DE3413608A1 (de) | 1984-04-11 | 1985-10-24 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Implantierbare zubereitungen von regulatorischen peptiden mit gesteuerter freisetzung und verfahren zu ihrer herstellung |
US4879236A (en) | 1984-05-16 | 1989-11-07 | The Texas A&M University System | Method for producing a recombinant baculovirus expression vector |
US5030719A (en) | 1986-08-28 | 1991-07-09 | Teijin Limited | Cytotoxic antibody conjugates and a process for preparation thereof |
NZ224422A (en) | 1987-05-05 | 1990-11-27 | Molecular Eng Ass | Composition adapted for intranasal immunisation against viral infection comprising a glycoprotein complexed with a lipid |
US5229490A (en) | 1987-05-06 | 1993-07-20 | The Rockefeller University | Multiple antigen peptide system |
US5179007A (en) | 1989-07-07 | 1993-01-12 | The Texas A & M University System | Method and vector for the purification of foreign proteins |
FR2664905B1 (fr) | 1990-07-18 | 1994-08-12 | Agronomique Inst Nat Rech | Baculovirus modifie, son procede d'obtention, et vecteurs d'expression obtenus a partir dudit baculovirus. |
US5516657A (en) | 1992-05-11 | 1996-05-14 | Cambridge Biotech Corporation | Baculovirus vectors for expression of secretory and membrane-bound proteins |
US5390111A (en) | 1993-11-12 | 1995-02-14 | General Electric Company | Method and system for processing cone beam data for reconstructing free of boundary-induced artifacts a three dimensional computerized tomography image |
AU1377395A (en) | 1993-12-23 | 1995-07-10 | University Technologies International Inc. | Methods of expressing proteins in insect cells and methods of killing insects |
IL112372A (en) | 1994-02-07 | 2001-08-26 | Res Dev Foundation | Non-viral vector for the delivery of genetic information to cells |
CA2215933C (en) | 1995-03-22 | 2009-10-13 | Andrew Lees | Producing immunogenic constructs using soluble carbohydrates activated via organic cyanylating reagents |
SE506793C2 (sv) | 1996-09-19 | 1998-02-09 | Atlas Copco Rocktech Ab | Kopplingsstycke för användning vid samtidig jord- och/eller bergborrning med en övre rotationsslaganordning och en undre slaganordning |
EP0942983B2 (en) | 1996-10-31 | 2014-09-10 | Human Genome Sciences, Inc. | Streptococcus pneumoniae antigens and vaccines |
ES2230687T3 (es) | 1997-04-24 | 2005-05-01 | Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine | Copulacion de proteinas nomodificadas con polisacaridos derivados de haloacilo o de dihaloacilo para la preparacion de vacunas que incluyen proteinas-polisacaridos. |
US7060458B1 (en) * | 1997-08-14 | 2006-06-13 | Wyeth | Nucleic acid and amino acid sequences relating to Staphylococcus epidermidis for diagnostics and therapeutics |
WO1999012416A1 (en) | 1997-09-09 | 1999-03-18 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | T-independent conjugate-vaccines |
SE9900496D0 (sv) | 1999-02-12 | 1999-02-12 | Pharmatrix Ab | Vaccine formulation |
US6398774B1 (en) | 1999-09-29 | 2002-06-04 | Heska Corporation | Intranasal delivery system |
US8246945B2 (en) | 2000-04-06 | 2012-08-21 | University Of Arkansas | Methods and reagents for decreasing clinical reaction to allergy |
US6919187B2 (en) | 2000-04-21 | 2005-07-19 | Corixa Corporation | Compounds and methods for treatment and diagnosis of chlamydial infection |
DK2116257T3 (da) | 2000-08-09 | 2013-02-04 | Alk Abello As | Parenterale vaccineformuleringer og anvendelser deraf |
GB0107658D0 (en) | 2001-03-27 | 2001-05-16 | Chiron Spa | Streptococcus pneumoniae |
MXPA04011248A (es) | 2002-05-14 | 2005-02-17 | Chiron Srl | Vacunas mucosales en combinacion para la meningitis bacteriana. |
US20060251675A1 (en) * | 2003-03-17 | 2006-11-09 | Michael Hagen | Mutant cholera holotoxin as an adjuvant and an antigen carrier protein |
EP2311991A1 (en) | 2003-04-15 | 2011-04-20 | Intercell AG | S. pneumoniae antigens |
JP2007516219A (ja) | 2003-05-07 | 2007-06-21 | アヴェンティス パストゥール インコーポレイテッド | 髄膜炎菌ワクチン接種に対する免疫原性の増強の方法 |
US7786288B2 (en) | 2003-10-23 | 2010-08-31 | Karp Nelson M | Immunizing compositions encoding an epitope obtained from the HIV-1 capsid protein cyclophilin A binding site |
AU2004314347B2 (en) | 2003-12-24 | 2011-05-19 | Aduro Biotech, Inc. | Recombinant nucleic acid molecules encoding fusion proteins comprising antigens and bacterial secretory signal polypeptides, expression cassettes, and bacteria, and methods of use thereof |
JP2008508855A (ja) * | 2004-04-27 | 2008-03-27 | インターツェル・アクチェンゲゼルシャフト | Td抗原 |
GB0410220D0 (en) * | 2004-05-07 | 2004-06-09 | Kirkham Lea Ann | Mutant pneumolysin proteins |
ATE512230T1 (de) | 2004-08-18 | 2011-06-15 | Univ Alberta | Proteinherstellungsverfahren unter nutzung von yebf |
FI20041396A0 (fi) * | 2004-10-29 | 2004-10-29 | Vesa Pekka Hytoenen | Uudet mikrobiavidiinit |
US20090028891A1 (en) | 2004-11-11 | 2009-01-29 | Queensland University Of Technology | Chlamydia Antigens and Uses Thereof |
GB0428394D0 (en) | 2004-12-24 | 2005-02-02 | Chiron Srl | Saccharide conjugate vaccines |
KR20070122458A (ko) | 2005-02-11 | 2007-12-31 | 에이스 바이오사이언시즈 에이/에스 | 표재성 스트렙토코커스 뉴모니아 폴리펩티드 |
US20090148894A1 (en) | 2005-08-15 | 2009-06-11 | Broedel Sheldon E | Methods for optimizing the secretion of protein in prokaryotes |
RU2457858C2 (ru) | 2005-09-01 | 2012-08-10 | Новартис Вэксинес Энд Дайэгностикс Гмбх Унд Ко Кг | Множественная вакцинация, включающая менингококки серогруппы с |
MX2008007292A (es) | 2005-12-08 | 2008-10-17 | Univ Louisville Res Found | Composiciones inmunoestimuladoras y metodos. |
WO2007081583A2 (en) * | 2006-01-04 | 2007-07-19 | Children's Medical Center Corporation | Anti-pneumococcal preparations and methods of use |
US7943133B2 (en) | 2006-02-02 | 2011-05-17 | Boston Biocom Llc | Mesothelin antibody protein fusions and methods of use |
US20080032340A1 (en) | 2006-06-09 | 2008-02-07 | University Of Arizona | Peptide motifs for binding avidin or neutravidin |
US8148084B2 (en) | 2006-06-22 | 2012-04-03 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Diagnosis of autoimmune disease |
US7452985B2 (en) | 2006-08-17 | 2008-11-18 | Visgeneer, Inc. | Human Ron-related gene variant associated with cancers |
EP2104512A2 (en) | 2006-12-21 | 2009-09-30 | Emergent Product Development UK Limited | Streptococcus proteins, and their use in vaccination |
CN100579152C (zh) | 2007-01-29 | 2010-01-06 | 华为技术有限公司 | 一种播放集团彩铃的方法、系统及装置 |
CA2677179C (en) * | 2007-01-31 | 2016-02-16 | Dow Global Technologies Inc. | Bacterial leader sequences for increased expression |
US8128939B2 (en) | 2007-04-13 | 2012-03-06 | The Board Of Regents Of The University Of Oklahoma | Mutants of cholesterol-dependent cytolysins and uses thereof |
KR101579947B1 (ko) | 2007-06-26 | 2015-12-28 | 글락소스미스클라인 바이오로지칼즈 에스.에이. | 스트렙토코쿠스 뉴모니애 캡슐 다당류 컨쥬게이트를 포함하는 백신 |
GB0714963D0 (en) | 2007-08-01 | 2007-09-12 | Novartis Ag | Compositions comprising antigens |
CN102027003A (zh) | 2007-08-03 | 2011-04-20 | 哈佛大学校长及研究员协会 | 衣原体抗原 |
EP2176291A1 (en) | 2007-08-10 | 2010-04-21 | Wacker Chemie AG | Expression of full length igg and secretion into the culture medium of prokaryotic cells |
JP5658564B2 (ja) | 2007-08-31 | 2015-01-28 | ザ・ユニバーシティ・オブ・シカゴThe University Of Chicago | ブドウ球菌肺疾患および状態に対する免疫に関連した方法および組成物 |
MX2011006922A (es) * | 2008-12-24 | 2012-06-12 | Netherlands Vaccine Inst | Polipeptidos de neumolisina (ply) modificada a partir de streptococcus pneumonia. |
EP2208787A1 (en) * | 2009-01-19 | 2010-07-21 | Université de Liège | A recombinant alpha-hemolysin polypeptide of Staphylococcus aureus, having a deletion in the stem domain and heterologous sequences inserted |
NZ612315A (en) | 2009-04-14 | 2014-10-31 | Novartis Ag | Compositions for immunising against staphylococcus aureus |
NZ597858A (en) * | 2009-06-29 | 2014-01-31 | Genocea Biosciences Inc | Vaccines and compositions against streptococcus pneumoniae |
CN101797381B (zh) | 2010-01-29 | 2012-05-23 | 中国人民解放军第三军医大学 | 乙肝病毒抗原与路易斯寡糖的复合物及其制备方法和应用 |
EP2706991B1 (en) | 2011-05-11 | 2021-03-24 | Children's Medical Center Corporation | Multiple antigen presenting immunogenic composition, and methods and uses thereof |
WO2014018904A1 (en) | 2012-07-26 | 2014-01-30 | Genocea Biosciences, Inc. | Fused antigen vaccines and compositions against streptococcus pneumoniae |
AU2014214844B2 (en) | 2013-02-07 | 2017-12-14 | Children's Medical Center Corporation | Protein antigens that provide protection against pneumococcal colonization and/or disease |
EP3600400A4 (en) | 2017-03-28 | 2021-01-13 | The Children's Medical Center Corporation | MULTIPLE ANTIGEN PRESENTATION SYSTEM (MAPS) BASED STAPHYLOCOCCUS AUREUS VACCINE, IMMUNOGEN COMPOSITION AND THEIR USES |
SG11202102007UA (en) | 2018-09-12 | 2021-03-30 | Affinivax Inc | Multivalent pneumococcal vaccines |
-
2012
- 2012-05-11 EP EP12781636.1A patent/EP2706991B1/en active Active
- 2012-05-11 AU AU2012253359A patent/AU2012253359B2/en active Active
- 2012-05-11 CN CN201280034406.0A patent/CN103648489A/zh active Pending
- 2012-05-11 EP EP21156712.8A patent/EP3912619A1/en active Pending
- 2012-05-11 CN CN201810398905.7A patent/CN108714212A/zh active Pending
- 2012-05-11 WO PCT/US2012/037541 patent/WO2012155053A1/en active Application Filing
- 2012-05-11 CN CN201280034719.6A patent/CN103732222B/zh active Active
- 2012-05-11 JP JP2014510498A patent/JP6366501B2/ja active Active
- 2012-05-11 KR KR1020197025288A patent/KR102234933B1/ko active IP Right Grant
- 2012-05-11 US US14/116,492 patent/US9499593B2/en active Active
- 2012-05-11 WO PCT/US2012/037412 patent/WO2012155007A1/en active Application Filing
- 2012-05-11 CA CA2835630A patent/CA2835630A1/en active Pending
- 2012-05-11 CN CN201810413217.3A patent/CN108840912B/zh active Active
- 2012-05-11 ES ES12781636T patent/ES2864764T3/es active Active
- 2012-05-11 RU RU2013154706A patent/RU2632651C2/ru active
- 2012-05-11 KR KR1020137032751A patent/KR102084509B1/ko active IP Right Grant
- 2012-05-11 KR KR1020137032789A patent/KR20140146993A/ko active Search and Examination
- 2012-05-11 ES ES12782582T patent/ES2864765T3/es active Active
- 2012-05-11 MX MX2013013111A patent/MX2013013111A/es unknown
- 2012-05-11 EP EP21156431.5A patent/EP3881836A1/en active Pending
- 2012-05-11 KR KR1020217009127A patent/KR102494245B1/ko active IP Right Grant
- 2012-05-11 MX MX2013013112A patent/MX2013013112A/es unknown
- 2012-05-11 BR BR112013028892-2A patent/BR112013028892B1/pt active IP Right Grant
- 2012-05-11 AU AU2012253327A patent/AU2012253327B2/en active Active
- 2012-05-11 JP JP2014510481A patent/JP6152378B2/ja active Active
- 2012-05-11 RU RU2013154489A patent/RU2619176C2/ru active
- 2012-05-11 BR BR112013028887-6A patent/BR112013028887B1/pt active IP Right Grant
- 2012-05-11 EP EP12782582.6A patent/EP2709603B1/en active Active
- 2012-05-11 US US14/116,402 patent/US10766932B2/en active Active
- 2012-05-11 CA CA2835628A patent/CA2835628C/en active Active
-
2013
- 2013-11-11 ZA ZA2013/08465A patent/ZA201308465B/en unknown
- 2013-11-11 ZA ZA2013/08461A patent/ZA201308461B/en unknown
-
2015
- 2015-11-19 US US14/946,372 patent/US10017548B2/en active Active
-
2017
- 2017-05-29 JP JP2017105191A patent/JP6502420B2/ja active Active
-
2018
- 2018-05-30 US US15/992,343 patent/US10611805B2/en active Active
- 2018-07-03 JP JP2018126516A patent/JP6666389B2/ja active Active
-
2019
- 2019-03-20 JP JP2019052175A patent/JP2019104758A/ja active Pending
-
2020
- 2020-02-10 US US16/785,937 patent/US11560410B2/en active Active
- 2020-02-20 JP JP2020026905A patent/JP7336402B2/ja active Active
- 2020-07-31 US US16/945,714 patent/US11981708B2/en active Active
-
2022
- 2022-10-13 US US18/046,485 patent/US11976097B2/en active Active
-
2023
- 2023-08-21 JP JP2023133790A patent/JP2023162283A/ja active Pending
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2005037190A2 (en) * | 2003-09-03 | 2005-04-28 | Dendritherapeutics, Inc. | Multiplex vaccines |
WO2007150020A1 (en) * | 2006-06-23 | 2007-12-27 | Simon Paul M | Targeted immune conjugates |
US20110065660A1 (en) | 2009-04-20 | 2011-03-17 | Elcelyx Therapeutics, Inc. | Chemosensory Receptor Ligand-Based Therapies |
WO2011137354A2 (en) | 2010-04-30 | 2011-11-03 | Augmenta Biologicals, Llc | Delivery proteins |
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US11981708B2 (en) | Multiple antigen presenting immunogenic composition, and methods and uses thereof |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A107 | Divisional application of patent | ||
A201 | Request for examination | ||
E902 | Notification of reason for refusal | ||
E90F | Notification of reason for final refusal | ||
E701 | Decision to grant or registration of patent right |