CN111132671B - 治疗印记缺陷相关疾病的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供激活印记控制区内阻遏的等位基因从而治疗印记相关病变的方法。

Description

治疗印记缺陷相关疾病的组合物和方法
相关申请的交叉引用
本申请主张2017年7月19日提交的美国临时专利申请62/534,532的权益，该临时专利申请的整体内容通过引用并入本文。
背景技术
精子和卵母细胞是通过截然不同的过程从原始生殖细胞生成的。因此，它们的基因组封装不同，具有截然不同的表观遗传风貌。受精之后，父系核染色质释放鱼精蛋白并且与缺乏大多数组蛋白修饰的母系存储组蛋白一起重新封装，而母系核染色质携带从卵母细胞遗传的各种组蛋白修饰。亲本核染色质形成的不同过程导致了受精卵中亲本表观遗传的不对称性，在后续的发育过程中，除了包括印记控制区(ICR)在内的某些基因组位点之外，这些不对称性在很大程度上趋于平衡。基因组印记中的错误可能造成严重的病变和巨大的发育缺陷，包括，例如，伯-韦综合征(Beckwith-Wiedemann syndrome)、安格尔曼综合征(Angleman syndrome)以及普拉德-威利综合征(Prader-Willi syndrome)，这些病变导致终身健康问题。对于治疗印记相关病变的改善疗法存在显著需求。
发明内容
本发明提供激活印记控制区内阻遏的等位基因从而治疗印记相关病变的方法。
一方面，本发明提供一种激活细胞的印记控制区内组蛋白H3赖氨酸27三甲基化(H3K27me3)阻遏的等位基因的方法，所述方法包括令细胞与抑制组蛋白H3赖氨酸27三甲基化的试剂接触，从而激活所述H3K27me3阻遏的等位基因。一个实施方案中，该试剂是H3K27甲基转移酶的抑制剂。另一个实施方案中，该H3K27甲基转移酶选自由EZH1、EZH2、PRC2、PRC2-Ezh1或PRC2-Ezh2组成的组。另一个实施方案中，该试剂是小化合物、多肽或多核苷酸。另一个实施方案中，该试剂选自由tazemetostat、DZNep、GSK373、GSK126、El1、Epz005687、CPI-169组成的组。
另一方面，本发明提供一种激活细胞的印记控制区内H3K27me3阻遏的等位基因的方法，所述方法包括令细胞与选择性地去除组蛋白3的赖氨酸27处的三甲基化的试剂接触，从而激活所述H3K27me3阻遏的等位基因。一个实施方案中，该试剂是H3K27特异性甲基转移酶。另一个实施方案中，该试剂是赖氨酸特异性去甲基酶6A(KDM6A)、KDM6B或KDM6C。又一个实施方案中，该细胞是体外或体内的哺乳动物细胞。又一个实施方案中，该细胞是正在经历产前或产后发育的哺乳动物细胞。
另一方面，本发明提供一种治疗具有与H3K27me3依赖性印记相关病变的受试者的方法，所述方法包括向受试者给药抑制组蛋白H3赖氨酸27三甲基化的试剂，从而治疗所述病变。
另一方面，本发明提供一种治疗具有与H3K27me3依赖性印记相关病变的受试者的方法，所述方法包括向受试者给药选择性地去除赖氨酸27处的三甲基化的试剂，从而治疗所述病变。
多个实施方案中，该病变与表1的基因或选自由Adamts2、Bbx、BC049762,Bmp7、C430002E04Rik、E2f3、Enc1、Epas1、Etv6、Fam198b、G730013B05Rik、Gab1、Gramd1b、Mbnl2、Otx2、Otx2os1、Phf17、Rbms1、Rbp2、Runx1、Sfmbt2、Sh3gl3、Slc38a1、Slc38a2、Slc38a4、Smoc1、Sox21和Tle3所组成组的基因中的突变相关。
多个实施方案中，该病变与选自由Sfmbt2、Bbx、C430002E04Rik、Phf17、Slc38a4、Gramd1b、Tle3、E2f3、Smoc1、Sox21、Slc38a1、Runx1、Bmp7、Rnc1、Fam198b、Rbms1、Zrsr1、Impact和Fkbp6所组成组的基因中的突变有关。其它实施方案中，该病变与选自由Sfmbt2、Gab1、Slc38a4和Phf17所组成组的基因中的突变有关。其它实施方案中，该病变与选自由Etv6、17001125H03Rik、Smoc1和Bmp7所组成组的基因中的突变有关。其它实施方案中，该病变与选自由Gab1、Phf17、Sfmbt2、Slc38a4或Smoc1所组成组的基因中的突变有关。其它实施方案中，该病变是与Smoc1中突变有关的伴有肢体异常(MLA)的小眼畸形。其它实施方案中，该病变与肢体发育有关，而该肢体发育与Smoc1中突变有关。其它实施方案中，该病变与胎盘缺陷有关，而该胎盘缺陷与Gab1或Sfmbt2中突变有关。其它实施方案中，一个亲本等位基因包含突变，并且另一个亲本等位基因是野生型等位基因。
另一方面，本发明提供一种鉴定包含H3K27me3依赖性印记的基因的方法，所述方法包括分析来自生物样品的核染色质中H3K27me3修饰的存在，以及鉴定具有所述修饰的基因。
另一方面，本发明提供一种表征样品中H3K27me3依赖性印记的方法，所述方法包括分析来自样品的核染色质中子能够对于参考样品的H3K27me3修饰的存在，从而表征所述样品中的H3K27me3依赖性印记。一个实施方案中，该样品是从胚胎获得的。另一个实施方案中，相对于所述参考样品的印记增加或减少与发育性病变有关。具体的实施方案中，该印记位于选自由Adamts2、Bbx、BC049762,Bmp7、C430002E04Rik、E2f3、Enc1、Epas1、Etv6、Fam198b、G730013B05Rik、Gab1、Gramd1b、Mbnl2、Otx2、Otx2os1、Phf17、Rbms1、Rbp2、Runx1、Sfmbt2、Sh3gl3、Slc38a1、Slc38a2、Slc38a4、Smoc1、Sox21和Tle3所组成组的基因中。其它实施方案中，该印记位于选自由Sfmbt2、Bbx、C430002E04Rik、Phf17、Slc38a4、Gramd1b、Tle3、E2f3、Smoc1、Sox21、Slc38a1、Runx1、Bmp7、Rnc1、Fam198b、Rbms1、Zrsr1、Impact和Fkbp6所组成组的基因中。其它实施方案中，该印记位于选自由Sfmbt2、Gab1、Slc38a4和Phf17所组成组的基因中。其它实施方案中，该印记位于选自由Etv6、17001125H03Rik、Smoc1和Bmp7所组成组的基因中。
另一方面，本发明提供一种增加杂交细胞的印记控制区内的组蛋白H3赖氨酸27三甲基化(H3K27me3)的方法，所述方法包括令供体哺乳动物细胞、供体细胞核、接纳者哺乳动物细胞、杂交细胞与增加组蛋白H3赖氨酸27三甲基化(H3K27me3)的试剂接触，从而增加杂交细胞的印记控制区内的组蛋白H3赖氨酸27三甲基化(H3K27me3)。一个实施方案中，该试剂是编码H3K27甲基转移酶的mRNA。
定义
除非另做定义，否则本文使用的全部科技术语均具有本发明所属领域技术人员通常理解的意义。下述参考文献向技术人员提供很多本发明所用术语的一般定义：《微生物学和分子生物学词典(第二版)》(Singleton et al.,Dictionary of Microbiology andMolecular Biology(2nd ed.1994))；《剑桥科技词典》(he Cambridge Dictionary ofScience and Technology(Walker ed.,1988))；《遗传性专业词典(第五版)》(TheGlossary of Genetics,5th Ed.,R.Rieger et al.(eds.),Springer Verlag(1991))；以及《哈珀·柯林斯生物学词典》(Hale&Marham,The Harper Collins Dictionary ofBiology(1991))。如本文中所用，除非明确指定，否则下列术语具有其下方所述意义。
“EZH1多肽”(组蛋白-赖氨酸N-甲基转移酶EZH1)意为一种具有甲基转移酶活性的蛋白质或其片段，该蛋白质具有至少约85％的与NCBI参考序列NP_001982的氨基酸一致性。示例性H3K27甲基转移酶氨基酸序列提供如下：
“EZH1多核苷酸”意为一种编码EZH1多肽的核酸分子。示例性EZH1多核苷酸序列在NM_001991.4提供，并转载(reproduced)如下：
“EZH2多肽”(组蛋白-赖氨酸N-甲基转移酶EZH2)意为一种具有甲基转移酶活性的蛋白质或其片段，该蛋白质具有至少约85％的与UniProtKB/Swiss-Prot:Q15910.2提供序列的氨基酸一致性。示例性H3K27甲基转移酶氨基酸序列提供如下：
“EZH2多核苷酸”意为一种编码EZH2多肽的核酸分子。示例性EZH2多核苷酸序列在NM_001203248.1提供，并提供如下：
“KDM6A多肽”(赖氨酸特异性去甲基酶6A，也称为组蛋白去甲基酶UTX)意为一种具有去甲基酶活性的蛋白质或其片段，该蛋白质具有至少约85％的与NCBI参考序列O15550.2的氨基酸一致性。示例性KDM6A氨基酸序列提供如下：
“KDM6A多核苷酸”意为一种编码KDM6A多肽的核酸分子。示例性KDM6A多核苷酸序列在NM_001291415.1提供。
“KDM6B多肽”(赖氨酸特异性去甲基酶6，也称为含有JmjC结构域的蛋白质3)意为一种具有去甲基酶活性的蛋白质或其片段，该蛋白质具有至少约85％的与NCBI参考序列O15054.4的氨基酸一致性。示例性KDM6B氨基酸序列提供如下：
“KDM6B多核苷酸”意为一种编码KDM6B多肽的核酸分子。示例性KDM6B多核苷酸序列在NM_001080424.2提供，并转载如下：
“KDM6C多肽”(组蛋白去甲基酶UTY，也称为Y染色体上的广泛转录TPR蛋白)意为一种具有去甲基酶活性的蛋白质或其片段，该蛋白质具有至少约85％的与NCBI参考序列O14607.2的氨基酸一致性。示例性KDM6C氨基酸序列提供如下：
/>
“KDM6C多核苷酸”意为一种编码KDM6C多肽的核酸分子。示例性KDM6C多核苷酸序列在NM_001258249.1提供，该序列转载如下：
/>
/>
“Gab1多肽”(GRB2相关结合蛋白1)意为一种蛋白质或其片段，该蛋白质具有至少约85％的与NCBI参考序列NP_997006.1的氨基酸一致性。示例性Gab1氨基酸序列提供如下：
“Gab1多核苷酸”意为一种编码Gab1多肽的核酸分子。示例性Gab1多核苷酸序列在NM_002039.3提供，该序列转载如下：
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“Sfmbt2多肽”(具有四个MBT结构域的scm样蛋白2)意为一种蛋白质或其片段，该蛋白质具有至少约85％的与NCBI参考序列NP_001018049.1的氨基酸一致性。示例性Sfmbt2氨基酸序列提供如下：
“Sfmbt2多核苷酸”意为一种编码Sfmbt2多肽的核酸分子。示例性Sfmbt2多核苷酸序列在NM_001018039.1提供，该序列转载如下：
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“Smoc1多肽”(SPARC相关模块化钙结合蛋白1)意为一种蛋白质或其片段，该蛋白质具有至少约85％的与NCBI参考序列NP_001030024的氨基酸一致性。示例性Smoc1氨基酸序列提供如下：
“Smoc1多核苷酸”意为一种编码Smoc1多肽的核酸分子。示例性Smoc1多核苷酸序列在XM_005267995.1提供，该序列转载如下：
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“在赖氨酸27处三甲基化的组蛋白H3(H3K27me3)”意为在组蛋白H3蛋白质亚基上的赖氨酸27的三甲基化。H3K27me3修饰通常与基因阻遏有关。
“试剂”意为肽、核酸分子或小化合物。
“等位基因”意为在染色体相同位置处发现的两种或更多种可选形式的基因中的一种。
“改变”意为通过该领域的标准已知方法例如本文所述的那些方法检测的基因或多肽的表达水平或活性的变化(增加或减少)。如本文所用，改变包括表达水平变化10％，优选表达水平变化25％，更优选变化40％，最优选变化50％或更大。
“缓解”意为减少、压制、衰减、消除、阻止疾病的发展或进展或令疾病的发展或进展稳定化。
本公开中，“包含(comprise)”、“包含(comprising)”、“含有”和“具有”等可具有美国专利法所规定的意义，并且可意为“包括”、“包括在内”等；“主要由...组成”或“基本由...组成”等具有美国专利法所规定的意义，并且该术语是开放性的，允许超过其所引用者的存在，只要超过其所引用者的存在不改变其所引用者的基本特征或新颖特征即可，但不包括先前技术实施方案。
“检测”是指鉴定待检测分析物的存在、不存在或量。
“疾病”意为损害或干扰细胞、组织或器官正常功能的任何病症或病变。病变的实例包括与通过H3K27me3依赖性印记进行的对等位基因的不希望的阻遏有关的那些。与H3K27me3依赖性印记有关的小眼畸形示例性病变涉及印记病变。
“DNA”意为脱氧核糖核酸。多个实施方案中，术语DNA是指基因组DNA、重组DNA或cDNA。具体的实施方案中，DNA包含“靶点区”。本文构想的DNA库包括基因组DNA库，以及从RNA构建的cDNA库例如RNA表达库。多个实施方案中，DNA库包含一个或多个附加DNA序列和/或标签。
“有效量”意为相对于未治疗的患者缓解疾病症状所需的量。用来实践本发明的用于对疾病进行治疗性处理的活性化合物的有效量一句给药方式以及受试者的年龄、体重和一般健康状况而变。最终，主治医师或兽医将决定适宜的量和剂量方案。此量称为“有效”量。
“片段”意为多肽或核酸分子的一部分。这一部分优选含有该参考核酸分子或多肽整个长度的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。片段可含有10、20、30、40、50、60、70、80、90、或100、200、300、400、500、600、700、800、900、或1000个核苷酸或氨基酸。
术语“单离的”、“纯化的”或“生物学纯的”是指在不同程度上不含通常伴随它的成分(如在其原生状态下所见)的材料。“单离”表示与原始来源或周围物质分隔的程度。“纯化”表示高于单离的分隔程度。“纯化的”或“生物学纯的”蛋白质足够不含其它材料，使得任何杂质在材料层面不影响该蛋白质的生物学性质或造成其它负面后果。换句话说，当通过重组DNA技术生产时，如果本发明的核酸或肽基本上不含细胞材料、病毒材料或培养基，则它是纯化的；或者当化学合成时，如果不含化学前体或其它化学物质，则它是纯化的。典型使用分析化学技术例如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱测定纯度及同质性。术语“纯化的”可表示核酸或蛋白质在电泳凝胶中产生实质上的一个带。对于可进行修饰例如磷酸化或糖基化的蛋白质，不同的修饰可产生不同的单离蛋白质，这些蛋白质可独立纯化。
“单离的多核苷酸”意为一种核酸(例如，DNA)，其不含在本发明核酸分子所来源的有机体的天然基因组中位于该基因侧翼的基因。因此该术语包括，举例而言，重组DNA，其被并入载体内、自主复制质粒或病毒内、或并入原核生物或真核生物的基因组DNA内；或作为独立于其它序列的单独分子存在(例如，通过PCR或限制性核酸内切酶消化产生的cDNA或基因组或cDNA片段)。此外，该术语包括从DNA分子转录的RNA分子，以及作为编码附加多肽序列的杂交基因的一部分的重组DNA。
“单离的多肽”意为已经与其天然伴随组分分隔的本发明的多肽。典型地，当多肽不含至少60重量％的天然与其相关的蛋白质和天然有机分子。优选地，该制剂是至少75重量％、更优选至少90重量％、且最优选至少99重量％的本发明的多肽。本发明的单离多肽可以例如通过从天然来源萃取、通过表达编码此多肽的重组核酸、或通过化学合成该蛋白质而获得。可通过任何适宜的方法，例如柱色谱、聚丙烯酰胺凝胶电泳或HPLC分析，来测量纯度。
本文提供的范围理解为是该范围内所有值的简写。例如，1至50的范围理解为包括来自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50所组成组的任何数字、数字组合或子范围。
“降低”意为至少10％、25％、50％、75％或100％的反向改变。
“参考”意为标准或对照条件。
“参考序列”是用作序列比对基础的定义序列。参考序列可以是特定序列的子集或整体，例如，全长度cDNA或基因序列的节段，或完整的cDNA或基因序列。对于多肽，参考多肽序列的长度通常将会是至少约16个氨基酸，优选至少约20个氨基酸，更优选至少约25个氨基酸，甚至更优选约35个氨基酸、约50个氨基酸、或约100个氨基酸。对于核酸，参考核酸序列的长度通常将会是至少约50个核苷酸，优选至少约60个核苷酸，更优选至少约75个核苷酸，甚至更优选约100个核苷酸或约300个核苷酸或其附近或期间任意整数个核苷酸。
可用于本发明方法中的核酸分子包括任何编码本发明多肽或其片段的核酸分子。此类核酸分子无需与内源性核酸序列100％一致，但典型将表现出基本一致性。具有与内源性序列的“基本一致性”的多核苷酸典型能与双链核酸分子的至少一条链杂交。可用于本发明方法中的核酸分子包括任何编码本发明多肽或其片段的核酸分子。此类核酸分子无需与内源性核酸序列100％一致，但典型将表现出基本一致性。具有与内源性序列的“基本一致性”的多核苷酸典型能与双链核酸分子的至少一条链杂交。“杂交”意为在各种严格条件下在互补多核苷酸序列(例如，本文所述的基因)或其片段之间配对以形成双链分子。(见，例如，Wahl,G.M.and S.L.Berger(1987)Methods Enzymol.152:399；Kimmel,A.R.(1987)Methods Enzymol.152:507)。
例如，严格的盐浓度一般将低于约750mM NaCl和75mM柠檬酸三钠，优选低于500mMNaCl和50mM柠檬酸三钠，且更优选约250mM NaCl和25mM柠檬酸三钠。在有机溶剂例如甲酰胺的缺席下可获得低严格度杂交，而在至少约35％甲酰胺且更优选至少约50％甲酰胺的存在下可获得高严格度杂交。严格的温度条件一般将包括至少约30℃、更优选至少约37℃且最优选至少约42℃的温度。不同的其它参数例如杂交时间、表面活性剂例如十二烷基硫酸钠(SDS)的浓度、以及载剂DNA的包含或不包含是该领域技术人员所熟知的。通过按需要将这些条件组合，实现各种水平的严格度。一个优选实施方案中，杂交将在30℃下在750mMNaCl、75mM柠檬酸三钠和1％ SDS中发生。一个更优选的实施方案中，杂交将在37℃下在500mM NaCl、50mM柠檬酸三钠、1％ SDS、35％甲酰胺和100μg/ml变性鲑鱼精DNA(ssDNA)中发生。一个最优选的实施方案中，杂交将在42℃下在250mM NaCl、25mM柠檬酸三钠、1％SDS、50％甲酰胺和200μg/ml ssDNA中发生。这些条件的可用改变对于该领域技术人员是显而易见的。
对于大多数应用，杂交后的洗涤步骤也将改变严格度。洗涤严格度条件可通过盐浓度并且通过温度界定。如上，可通过减低盐浓度或升高温度来增加洗涤严格度。例如，用于洗涤步骤的严格的盐浓度优选将低于约30mM NaCl和3mM柠檬酸三钠，且最优选约15mMNaCl和1.5mM柠檬酸三钠。用于洗涤步骤的严格的温度条件一般将包括至少约25℃、更优选至少约42℃、甚至更优选至少约68℃的温度。一个优选实施方案中，洗涤步骤将在25℃下在30mM NaCl、3mM柠檬酸三钠和0.1％ SDS中发生。一个更优选的实施方案中，洗涤步骤将在42℃下在15mM NaCl、1.5mM柠檬酸三钠和0.1％ SDS中发生。一个更优选的实施方案中，洗涤步骤将在68℃下在15mM NaCl、1.5mM柠檬酸三钠和0.1％ SDS中发生。这些条件的其它改变对于该领域技术人员是显而易见的。杂交技术是该领域技术人员所熟知的，并且在例如Benton and Davis(Science 196:180,1977)；Grunstein and Hogness(Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 72:3961,1975)；《分子生物学现代方法》(Ausubel et al.(Current Protocols in Molecular Biology,Wiley Interscience,New York,2001))；《分子克隆技术指南》(Berger and Kimmel(Guide to Molecular Cloning Techniques,1987,Academic Press,New York))；和《分子克隆：实验室手册》(Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,NewYork)中有所描述。
“基本上一致”意为多肽或核酸分子表现出至少50％的与参考氨基酸序列(例如，本文所述氨基酸序列中的任何一个)或核酸分子(例如，本文所述核酸序列中的任何一个)的一致性。优选地，此序列在氨基酸水平上或核酸水平上具有与用于比对的序列的至少60％、更优选80％或85％、且更优选90％、95％或甚至99％的一致性。
典型使用序列分析软件(例如，威斯康星大学生物技术中心遗传学计算机组(Genetics Computer Group,University of Wisconsin Biotechnology Center,1710University Avenue,Madison,Wis.53705)的序列分析软件包(Sequence AnalysisSoftware Package)，BLAST、BESTFIT、GAP或PILEUP/PRETTYBOX程序)测量序列一致性。此类软件通过对不同的替换、删除和/或其它修饰指定同源性程度来匹配相同或相似的序列。保守替换典型包括系列各组的组内替换：甘氨酸、丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸；天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺；丝氨酸、苏氨酸；赖氨酸、精氨酸；以及苯丙氨酸、酪氨酸。在测定一致性程度的一个示例性方法中，可使用BLAST程序，e-3和e-100之间的概率评分指示密切相关的序列。
“体细胞核移植”或“SCNT”意为将来自体细胞的供体细胞核转移到去核的卵母细胞内。该过程可用于繁殖性克隆或治疗性克隆中。“受试者”意为哺乳动物，包括但不限于，人类或非人哺乳动物，例如具有农业意义的哺乳动物(例如，牛、马、羊)、宠物(例如，犬、猫)、或珍稀或濒危哺乳动物(例如，熊猫)。
如本文所用，术语“处理(treat)”、“处理(treating)”、“治疗(treatment)”等是指减轻或缓解病变和/或与之相关的症状。应理解，尽管没有排除，但治疗病变或病症并不需要完全消除该病变、病症或与之相关的症状。
如本文所用，除非具体指定或从上下文明显可见，否则术语“或”理解为包括性的。如本文所用，除非具体指定或从上下文明显可见，否则术语一(a)”、“一(an)”或“该”理解为单数或复数。
如本文所用，除非具体指定或从上下文明显可见，否则术语“或”理解为包括性的。如本文所用，除非具体指定或从上下文明显可见，否则术语“一(a)”、“一(an)”或“该”理解为单数或复数(即，至少一个)。举例而言，“一元件”意为一个元件或超过一个元件。
如本文所用，除非具体指定或从上下文明显可见，否则术语“约”理解为处于该领域正常公差范围内，例如处于平均值的2个标准偏差内。“约”可理解为处于所指定值的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％或0.01％内。除非上下文明确排除，否则本文提供的所有数值均以术语“约”修饰。
本文中的任何变量定义中对一系列化学基团的叙述包括该变量作为任何单一基团或所列基团的组合的定义。本文中对于变量或方面的实施方案的叙述包括该实施方案作为任何单一实施方案或与其它实施方案或其部分组合。
本文所提供的任何组合物或方法可与本文所提供的任何其它组合物和方法中的一者或多者合用。
附图说明
图1A至图1C显示受精卵中标记ZGA上等位基因表达的等位基因DNA酶I超敏位点(DHS)。
图1A提供用于鉴定受精卵中亲本等位基因特异性DHS的示意图。IVF，体外受精。PN，原核。图1B示出了显示受精卵中双等位基因DHS、父系等位基因特异性DHS(Ps-DHS)和母系等位基因特异性DHS(Ms-DHS)。每一列表示DHS±5kb的liDNase-seq(低通量DNase-seq)信号强度。
图1C提供受精卵中携带等位基因启动子DHS的代表性雄性单性生殖(AG)和雌性单性生殖(GG)特异性的差异表达的基因(DEG)。上图是父系和母系原核中DHS与生物学复本的基因组浏览器视图。每个视图的DHS信号强度和基因组长度(kb)分别在每张图的上部左侧和底部标出。下图是AG、GG和α-鹅膏蕈碱处理的(Ama)2细胞胚胎中的基因表达。误差线：生物学复本的标准偏差。注意，在减去母系池转录物之后，Akap1和Isl2的GG特异性表达是明显的。
图2A至图2H显示亲本等位基因DHS的鉴定，与图1对照。图2A提供散点图，显示三个生物学复本间父系和母系原核(PN)的DHS相关性。
图2B提供散点图，显示双等位基因DHS(上-右)、Ps-DHS(上中-左)、和Ms-DHS(左)。标出了用来定义这些DHS组别的截止值。
图2C提供在DHS附近±5kb内的Ps-DHS和Ms-DHS的平均DHS信号。
图2D提供DHS的基因组分布。启动子表示在转录起始位点(TSS)附近±1kb。“随机”指示小鼠基因组的每个基因组元件的百分比。图2E提供位于CpG岛(CGI)处的DHS的百分比。启动子表示在TSS附近±1kb。CGI的基因组定位在Kobayashi et al.,2012中有所描述。
图2F提供代表性被印记基因的印记控制区(ICR)处的Ps-DHS的基因组浏览器视图。ICR的基因组定位在Kobayashi et al.,2012中有所探讨。
图2G提供受精卵中一系列携带启动子Ps-DHS或Ms-DHS的基因。
图2H提供在基因启动子处的代表性等位基因DHS的基因组浏览器视图，先前不知道该等位基因DHS将会被印记。
图3A至图3F显示2细胞胚胎中的等位基因ZGA与受精卵中的等位基因DHS之间的相关性。实验方案、RNA-seq再现性和分析方案是关于图1的。
图3A提供用于鉴定在ZGA处的亲本等位基因特异性基因表达的示意图。通过原核移植产生雄性单性生殖(AG)胚胎和雌性单性生殖(GG)胚胎。AG 2细胞胚胎含有父系表达的新生转录物和母系存储的转录物。GG 2细胞胚胎含有母系表达的新生转录物和母系存储的转录物。α-鹅膏蕈碱处理的(Ama)2细胞胚胎仅含有母系存储的转录物。
图3B提供散点图，显示2细胞RNA-seq样品的复本之间的相关性。
图3C提供用于避免母系存储的转录物和鉴定ZGA处的新生等位基因转录物的流程图。
图3D提供AG和GG 2细胞胚胎中新生转录物的散点图。对于每个基因，分别从AG和GG胚胎中的FPKM值减去Ama胚胎中的FPKM值。分别在虚线下方或虚线上方标出AG和GG特异性差异表达的基因(DEG)(FC>10)。已知的被印记基因使用其相关名称在虚线下方标出。
图3E和图3F提供散点图，显示雄性单性生殖(图3E)和雌性单性生殖(图3F)特异性差异表达的基因(DEG)在启动子(TSS处±0.5kb)处的DHS等位基因偏位。FC>2视为“偏位”，在图3E和图3F中以深灰色表示。
图4A至图4H显示，合子Ms-DHS遗传自卵母细胞DHS，与图6对照。
图4A提供散点图，显示用于从成熟卵母细胞单离的生殖泡(GV)核的liDNase-seq的三个生物学复本之间的相关性。
图4B显示传递到合子的父系PN上的精子DHS的基因组浏览器视图。最接近的基因名称在每张图的顶部标出。
图4C提供显示Ps-DHS的热图。每一列表示DHS±5kb的liDNase-seq信号强度。注意，精子或卵母细胞中，Ps-DHS均大部分缺失。
图4D提供代表性Ps-DHS的基因组浏览器视图。
图4E提供显示Ms-DHS的热图。注意，在卵母细胞中，大多数Ms-DHS已经存在。
图4F提供代表性Ms-DHS的基因组浏览器视图。
图4G提供显示双等位基因DHS的热图。
图4H提供代表性双等位基因DHS的基因组浏览器视图。
图5A至图5J显示受Kdm6b影响的和受Kdm4d影响的Ps-DHS的截然不同的表观遗传学特征，与图6对照。
图5A提供饼形图，显示与±100kb内内的卵母细胞配子差异甲基化区(gDMR)重叠(黑色)或相关(灰色)的Ps-DHS的百分比。通过在卵母细胞内的>80％甲基化和在精子中的<20％甲基化定义卵母细胞gDMR。
图5B提供饼形图，显示以其卵母细胞DNA甲基化水平为基础组织的Ps-DHS的百分比。
图5C提供箱型图，显示配子(左图)和合子(右图)中在Ps-DHSs±1kb处的H3K27me3水平。Ps-DHS分为卵母细胞DNA去甲基化组(0-20％，n＝296)和高甲基化组(80-100％，n＝305)。箱的中线表示中位数。箱边和须分别指示25th/75th和2.5th/97.5th百分位。
图5D提供以抗Flag抗体染色的注射Kdm6b或Kdm4d的合子的代表性图像，使用未注射的合子作为阴性对照。
图5E提供以抗H3K27me3抗体染色的合子的代表性图像。M：母系原核。P：父系原核。右侧的柱状图表示母系原核的相对免疫染色信号强度。未注射的合子的平均信号设定为1.0。所坚持的胚胎总数为8(未注射)、13(Kdm6bWT)和10(Kdm6bMUT)。误差线指示SD。***，p<0.001(双尾学生t检验)。N.S：统计学不显著。
图5F提供以抗H3K9me3抗体染色的合子的代表性图像。右侧的柱状图表示母系原核中的相对免疫染色信号强度。未注射的合子的平均信号设定为1.0。所坚持的胚胎总数为5(未注射)、5(Kdm4dWT)和7(Kdm4dMUT)。误差线指示SD。***，p<0.001(双尾学生t检验)。N.S：统计学不显著。
图5G提供散点图，显示用于注射Kdm6bWT的合子和注射Kdm6bMUT的合子的母系原核(Mat)和父系原核(Pat)的liDNase-seq的生物学复本间的相关性。
图5H提供散点图，显示用于注射Kdm4dWT的合子和注射Kdm4dMUT的合子的母系原核(Mat)和父系原核(Pat)的liDNase-seq的生物学复本间的相关性。
图5I提供受到Kdm4dWT影响的代表性Ps-DHS的基因组浏览器视图。
图5J提供箱型图，显示配子(左图)和合子(右图)中在Ps-DHSs±1kb处的受Kdm6b或Kdm4d影响的H3K27me3信号。箱的中线指示中位数。箱边和须分别指示25th/75th和2.5th/97.5th百分位。
图6A至图6D显示，卵母细胞特异性H3K27me3阻止了在DNA高甲基化区的母系核染色质可及性。
图6A提供用于研究组蛋白甲基化在母系核染色质不可及性中的角色的示意图。
图6B提供热图，显示注射Kdm6b或Kdm4d的合子中在Ps-DHS处的等位基因偏位。
图6C提供受到Kdm6bWT影响的代表性Ps-DHS的基因组浏览器视图。
图6D提供饼形图，显示以其卵母细胞DNA甲基化水平为基础组织的受Kdm6b或Kdm4d影响的Ps-DHS的百分比。
图7A至图7D显示，具有H3K27me3标记的AG-DHS的基因被父系表达在桑椹胚中。
图7A提供用于鉴定桑椹胚中亲本等位基因特异性DHS的示意图。
图7B提供热图，显示桑椹胚中的AG特异性DHS(AG-DHS)和GG特异性DHS(GG-DHS)。每一列表示DHS±5kb的liDNase-seq信号强度。
图7C提供散点图，显示在囊胚内部细胞团(ICM)中H3K27me3ChIP-seq信号在AG-DHS±1kb处的等位基因富集。将具有[RPM>0.5，FC(Mat/Pat)>2]的AG-DHS视为携带母系等位基因偏位的H3K27me3(深灰色点)。
图7D提供热图，显示假定的H3K27me3依赖性印记基因的亲本等位基因特异性基因表达。显示了表达在AG桑椹胚中的基因(RPKM>0.5)。左列表示AG/GG基因表达之比。右侧两列表示杂交桑椹胚中的相对基因表达。BxC：B6/CAST。CxB：CAST/B6。4个已知的非规范印记基因以粗体标出。白色箱指示由于缺乏SNP读取((<20个读取)而“未检测(N.D.)”。
图8A至图8D显示桑椹胚中的雄性单性生殖(AG)特异性DHS和雌性单性生殖(GG)特异性DHS，与图7对照。
图8A提供散点图，显示用于AG和GG桑椹胚的liDNase-seq的生物学复本之间的相关性。
图8B提供杂交桑椹胚中父系和母系等位基因的平均SNP追踪liDNase-seq信号强度。数据从BDF1与JF1杂交种的桑椹胚获得。显示了来自生物学复本(例如，BDF1_1和BDF1_2)的曲线图。注意，是父系(JF1)而非母(BDF1)的SNP读取在AG-DHS中富集(左图)，而没有SNP读取在GG-DHS中富集(右图)。
图8C提供了已知印记控制区(ICR)处的DHS的基因组浏览器视图。
图8D提供饼形图，显示以其卵母细胞DNA甲基化水平为基础分组的AG-DHS。
图9A至图9D显示桑椹胚中的等位基因表达，与图7对照。
图9A提供散点图，显示RNA-seq样品的生物学复本之间的相关性。
图9B提供AG和GG桑椹胚中基因表达水平的散点图。分别在虚线下方或虚线上方标出AG和GG特异性差异表达的基因(DEG)(FC>10)。父系表达的已知印记基因在虚线下方，并且包括它们的相关基因名称。母系表达的已知基因Meg3在虚线上方标出。
图9C提供非规范的印记基因中等位基因H3K27me3水平的基因组浏览器视图。Sp：精子。Oo：MII阶段卵母细胞。ICM：囊胚的内部细胞团。1细胞胚胎和ICM中的父系(Pat)和母系(Mat)等位基因信号是基于SNAP分析的。
图9D提供代表性的规范印记基因中等位基因H3K27me3水平的基因组浏览器视图。已知的ICR在每个规范的印记基因的底部标出。
图10A至图10E显示用作印记标记的母系H3K27me3。
图10A提供用于研究H3K27me3在母系等位基因阻遏中的角色的示意图。使用注射Kdm6bMUT的单性生殖(PG)胚胎作为阴性对照。
图10B提供假定的H3K27me3依赖性印记基因的相对基因表达水平(对数尺度)。显示了在AG桑椹胚中表达(RPKM>0.5)并且被Kdm6bWT显著去阻遏的基因。雌性单性生殖(GG)桑椹胚的表达水平设定为1。通过Kdm6bWT样品与Kdm6bMUT样品间的统计学显著性(DEseq的p值)将基因排序。箭头指示已知的非规范印记基因。
图10C提供热图，显示假定的H3K27me3依赖性印记基因在注射Kdm6bWT和Kdm6bMUT的桑椹胚中的亲本等位基因特异性基因表达。显示了图3D所列的28个基因中那些在两个样品中均具有>10SNP读取的基因。已知的非规范印记基因以粗体标出。在底部显示了代表性规范印记印记的等位基因表达水平。
图10D提供热图，显示注射Kdm6bWT和Kdm6bMUT的桑椹胚中在Ag-DHS处的核染色质可及性的水平。将AG胚胎中的DHS信号强度设定为100％。通过Δ(Kdm6bWT-Kdm6bMUT)将AG-DHS排序。已知的印记基因在右侧标出，并且非规范的印记基因以浅灰色字体显示在该图的上右侧。
图10E提供在假定的H3K27me3依赖性印记基因的AG-DHS处的可及性增益。
图11A至图11G显示Kdm6b mRNA注射对于母系等位基因表达和可及性的效果，与图10对照。
图11A提供注射Kdm6bWT和Kdm6bMUT的单性生殖(PG)胚胎的发育比率。所检查的总胚胎数为60(WT)和58(MUT)。
图11B提供散点图，显示用于注射Kdm6bWT和Kdm6bMUT的PG胚胎的RNA-seq的生物学复本之间的相关性。
图11C提供在AG桑椹胚中表达(RPKM>0.5)的规范印记基因的相对基因表达。注意，无一被Kdm6bWT注射阻遏。
图11D提供散点图，显示用于注射Kdm6bWT和Kdm6bMUT的PG胚胎的liDNase-seq的生物学复本之间的相关性。
图11E和图11F提供非规范印记基因(E)和规范印记基因(F)的全基因组浏览器视图。箭头标出注射Kdm6bWT的PG胚胎中核染色质可及性得以增益之处的AG-DHS(图4E中所示)。已知的印记控制区(ICR)在规范印记基因(F)的各图上方标出。
图11G提供在代表性规范印记基因的AG-DHS的基因组浏览器视图。
图12A至图12E显示H3K27me3依赖性基因组印记的细胞世系特异性动力学。
图12A提供热图，显示假定的H3K27me3依赖性印记基因在杂交囊胚中的亲本等位基因特异性基因表达。BxC：B6/CAST。CxB：CAST/B6。在图12A至图12D中，已知的非规范印记基因以粗体标出。图12A至图12D中的灰度方案遵循图7D。
图12B提供热图，显示假定的H3K27me3依赖性印记基因在囊胚的ICM和TE中的雄性单性生殖/雌性单性生殖(AG/GG)相对表达。箭头标出了当与TE比较时ICM中的显示中等程度的AG偏位的基因。白色箱指示由于低基因表达水平(RPKM<0.5)而“未检测”。
图12C提供热图，显示假定的H3K27me3依赖性印记基因在E6.5胚胎的外胚层(EPI)、内脏内胚层(VE)、以及胚胎外的外胚层(EXE)中的亲本等位基因特异性基因表达。显示了在两个正反杂交种中均具有>20SNP读取的基因。BxP：B6/PWK。PxB：PWK/B6。箭头标出了显示印记表达的基因。
图12D提供热图，显示假定的H3K27me3依赖性印记基因在纯胎儿来源的E9.5胎盘细胞中的亲本等位基因特异性基因表达。显示了在两个正反杂交种中均具有>20SNP读取的基因。箭头标出了显示印记表达的基因。
图12E提供模型，示出了发育过程中H3K27me3依赖性基因组印记的命运。
图13A至图13E显示E6.5胚胎中的基因组印记，与图12对照。
图13A提供样品中TE标记基因(Cdx2)和ICM标记基因(Sox2)的表达水平。
图13B提供散点图，显示来自B6xPWK和PWKxB6两个杂交种的E6.5外胚层(EPI)、内脏内胚层(VE)、和胚胎外的外胚层(EXE)RNA-seq样品的生物学复本间的相关性。
图13C提供柱形图，显示样品中外胚层标记基因(Pou5f1和Nanog)、胚胎外的外胚层标记基因(Elf5和Gata3)、以及内脏内胚层标记基因(Gata6和Gata4)的表达水平。
图13D提供热图，显示E6.5胚胎的外胚层、内脏内胚层、以及胚胎外的外胚层中的父系表达基因(PEG)和母系表达基因(MEG)。BxP：B6/PWK。PxB：PWK/B6。显示了每个样品中显示父系等位基因特异性(在BxP和PxB两者中，FC>2)表达的全部基因。先前未知的被印记基因以粗体标出。
图13E提供在新鉴定的印记基因的RNA-seq数据的基因组浏览器视图。D7Ertd715e和Smoc1是父系表达的，而Mas1是母系表达的。EXE：胚外的外胚层。VE：内脏内胚层。
图14A至14C显示样品制备和质量验证，与图12对照。
图14A提供胎盘细胞纯化的实验方案。从B6GFP鼠采集精子或卵母细胞，并使用从PWK种的配对物进行体外受精。将胚胎移植到代孕母亲体内。在E9.5收获胎盘，通过胰蛋白酶处理解离为单个细胞，之后进行GFP阳性细胞的FACS分选。
图14B提供散点图，显示RNA-seq样品的生物学复本之间的相关性。
图14C提供纯化的胎盘细胞中父系和母系SNP读取的总数。
图15A至图15B显示E9.5胎盘中的基因组印记，与图12对照。
图15A提供热图，显示E9.5胎盘中的父系表达基因(PEG)和母系表达基因(MEG)。BxP：B6/PWK。PxB：PWK/B6。显示了表现出父系等位基因特异性(在BxP和PxB两者中，FC>2)表达的全部基因。先前未知的被印记基因以粗体标出。
图15B提供在新鉴定的印记基因的RNA-seq数据的基因组浏览器视图。D7Ertd715e和Smoc1是父系表达的，而Cbx7和Thbs2是母系表达的。
图16A和图16B显示，母系H3K27me3包覆Xist并通过着床前发育一直存在。
图16A提供配子和生长中的卵母细胞的H3K27me3富集的基因组浏览器视图，以及GV卵母细胞中Xist基因座处的DNaseI-seq信号和DNA甲基化水平。顶部中心的柱标出了母系H3K27me3结构域包覆Xist。H3K27me3 ChIP-seq数据集、DNaseI-seq数据集和DNA甲基化数据集分别来自(Zheng et al.,2016)、(Inoue et al.,2017)和(Kobayashi etal.,2012)。Oo：MII卵母细胞。Sp：精子。7d和14d分别表示从7日龄和14日龄雌性采集的生长中的卵母细胞。GV：从8周龄雌性采集的成熟的GV阶段卵母细胞。
图16B提供1细胞胚胎、2细胞胚胎和囊胚中Xist基因座处的等位基因H3K27me3的基因组浏览器视图。突出显示的方块表示计算确定的区域，在囊胚中的该区域内保留H3K27me3的母系等位基因偏位的富集。Mat：母系核染色质。Pat：父系核染色质。H3K27me3ChIP-seq数据集来自(Zheng et al.,2016)。
图17A至图17D显示，H3K27me3的异位去除诱导母系Xist表达。
图17A提供用于探索着床前发育过程中H3K27me3在母系Xist阻遏中的角色的实验方案。
图17B提供注射Kdm6b的桑椹胚中Xist RNA FISH的代表性图像(最上排，浅灰色)。使用在含有X染色体上的Rnf12基因座的绿色荧光BAC探针，通过同步DNA FISH评估每个胚胎的性别(中间排，箭头)。
图17C和图17D提供卵裂球之比，显示雄性(图17C)和雌性(图17D)桑椹胚中XistRNA云团的数目。每个柱表示一个胚胎。所坚持的胚胎数是19个(Kdm6bWT)和35个(Kdm6bMUT)雄性以及34个(Kdm6bWT)和35个(Kdm6bMUT)雌性。
图18A至图18C显示，H3K27me3的异位去除诱导母系XCI。
图18A提供箱型图，显示注射Kdm6bMUT和Kdm6bWT的囊胚间的基因在单个母系染色体上的相对表达。分析了具有足够SNP读取(RPM>0.5)的基因。箱的中线表示中位数。箱边和须分别指示25th/75th和2.5th/97.5th百分位。***，p<0.001(秩和检验)。
图18B和图18C提供注射Kdm6bMUT和Kdm6bWT的囊胚间的Xm连接基因的相对表达水平。每个点表示显示足够SNP读取(RPM>0.5)的单个基因。图18C显示已知的逃脱者，而图18B显示剩余的基因。
图19A和图19B显示，Kdm6b mRNA注射以催化活性依赖的模式导致了H3K27me3的丢失，与图17对照。
图19A提供以抗H3K27me3抗体染色的合子的代表性图像。M：母系原核。P：父系原核。
图19B提供母系原核的相对免疫染色信号强度。未注射的合子的平均信号设定为1.0。所坚持的胚胎总数为8(未注射)、13(Kdm6bWT)和10(Kdm6bMUT)。误差线指示SD。***，p<0.001(双尾学生t检验)。N.S：统计学不显著。
图20A至图20E显示，H3K9me3的异位去除不诱导母系Xist表达，与图17对照。
图20A提供以抗H3K9me3抗体染色的合子的代表性图像。M：母系原核。P：父系原核。
图20B提供母系原核中的相对免疫染色信号强度。未注射的合子的平均信号强度设定为1.0。所检查的胚胎总数为5(未注射)、5(Kdm4dWT)和7(Kdm4dMUT)。误差线指示SD。***，p<0.001(双尾学生t检验)。N.S：统计学不显著。
图20C提供注射Kdm4b的桑椹胚中Xist RNA FISH的代表性图像(品红)。使用在含有X染色体上的Rnf12基因座的绿色荧光BAC探针，通过同步DNA FISH评估每个胚胎的性别(箭头)。
图20D和图20E提供卵裂球之比，显示雄性(图20D)和雌性(图20E)桑椹胚中XistRNA云团的数目。每个柱表示一个胚胎。所坚持的胚胎数是9个(Kdm4dWT)和12个(Kdm4dMUT)雄性以及9个(Kdm4dWT)和15个(Kdm4dMUT)雌性。
图21提供散点图，显示关于图18的RNA-seq样品的生物学复本之间的相关性。
具体实施方式
本发明提供通过将印记控制区中的H3K27me3静默的等位基因与去除H3K27me3的试剂或抑制H3K27三甲基化的试剂接触而激活该静默的等位基因，从而治疗与H3K27me3依赖性印记相关的病变的方法。
本发明至少部分地基于下述发现：母系H3K27me3作为DNA甲基化依赖性印记机制而发挥作用，并且该H3K27me3是Xist的印记标记，而Xist是一种在X染色体灭活中起作用的X连锁非编码长RNA。
H3K27me3是DNA甲基化依赖性印记机制
哺乳动物精子和卵母细胞具有不同的表观遗传风貌，并且以不同的方式组织。受精之后，除了包括印记控制区(ICR)在内的某些基因座，最初截然不同的亲本表观基因组变为在很大程度上是均等的。亲本核染色质如何变为均等以及ICR如何从这一重新编程中逃脱在很大程度上是未知的。这里，在小鼠合子和桑椹胚中发现了亲本等位基因特异性DNaseI超敏位点(DHS)，并且探讨了潜在等位基因DHS的表观遗传机制。DNA甲基组和H3K27me3ChIP-seq数据集的综合分析显示，76个基因具有缺乏DNA甲基化的父系等位基因特异性DHS，但携带母系等位基因特异性H3K27me3。有趣的是，这些基因被父系表达在着床前胚胎中，而H3K27me3的异位去除诱导了母系等位基因表达。H3K27me3依赖性印记在胚胎细胞系中大部分丢失，但至少5个基因在胚胎外细胞学中保持其印记。这5个基因包括所有先前鉴定的DNA甲基化依赖性印记的常染色体基因。因此，本文中报告的结果鉴定母系H3K27me3为DNA甲基化依赖性印记机制。
据此，本发明提供用于解除细胞中不希望的H3K27me3依赖性印记的方法，该细胞包括具有H3K27me3依赖性印记相关病变的受试者体的细胞。一个实施方案中，此类方法牵涉HeK7me3选择性甲基化酶的使用。
H3K27me3对于X染色体失活是重要的
在包括啮齿动物在内的某些兽类哺乳动物的雌性体内，两条X染色体之一被灭活以实现基因剂量补偿。这一现象称为X染色体失活(XCI)，提供用于理解表观遗传静默的优秀模型。发育过程中，XCI可能以印记或随机的方式发生。对于被印记的XCI，在着床前发育过程中，父系X染色体(Xp)被选择性地灭活。尽管被印记的XCI在胚胎外细胞系中得以保持，但其在晚期囊胚的内部细胞团(ICM)中丢失。在着床前阶段，外培成细胞经历随机XCI，导致Xp或母系X染色体(Xm)的静默。以往的研究已经表明了Xist——一种X连锁非编码长RN——在印记XCI和随机XCI两者中的关键角色。Xist RNA通过在cis中包覆和灭活X染色体而参与到XCI中。
基因组印记可以实现亲本来源特异性的基因调控。为了在印记XCI期间选择性地静默Xp，Xist基因被印记用于在Xm中静默，其静默机制是长期探寻但尚未确定的。以往使用细胞核移植途径进行的研究已经提出，Xist的基因组印记在卵子发生过程中被建立，与常染色体印记基因类似。在小鼠着床前胚胎细胞和胚胎外细胞中，仅父系X染色体(Xp)失活。印记的父系X染色体失活(XCI)的核心是非编码长RNA-Xist，它从Xp表达并且在cis中发挥作用以包覆和静默整个Xp。为了实现Xp特异性失活，母系Xist基因必须静默，但静默机制尚不清楚。如本文所报告，在小鼠卵母细胞中，Xist基因座被一个宽H3K27me3结构域包覆，其通过着床前发育而一直存在。H3K27me3的异位去除诱导母系Xist表达和母系XCI。因此，母系H3K27me3用作Xist的印记标记。
一些实施方案中，本文公开的内容涉及治疗受试者的与H3K27me3依赖性印记缺陷相关病变的方法，该方法包括给药包含选择性H3K27me3去甲基酶抑制剂的药物组合物，从而治疗H3K27me3依赖性印记缺陷。
治疗性方法
去除印记控制区内存在的H3K27me3印记的试剂可用于预防或缓解与印记控制区相关的发育性病变。与印记控制区相关的发育性病变包括，例如，其中一个突变等位基因(例如，父系等位基因)被激活而野生型等位基因(例如，母系等位基因)处于不希望的静默状态的病变。与印记控制区相关的病变可通过从处于不希望的静默状态的等位基因去除H3K27me3，从而使得该等位基因被表达而治疗。
一个治疗性途径中，将抑制H3K27me3去甲基化酶的试剂全身性给药，从而减轻受试者体内该病变的症状。所给药的剂的计量取决于大量因素，包括个体患者的体格和健康状况。对于任何特定的受试者，应根据个体需要和对给药组合物或监督给药组合物的人的专业判断，随时间而调整具体给药方案。
详述以下实施例以向该领域技术人员提供对如何制备和使用本发明的检验、筛选和治疗性方法的完全公开和说明，并且以下实施例不试图限制发明人所认为的本发明的范畴。
修饰H3K27me3的试剂
本文公开了已知组蛋白H3赖氨酸27三甲基化(H3K27me3)从而激活被H3K27me3阻遏的等位基因的试剂。本文还公开选择性地去除组蛋白H3赖氨酸27处的三甲基化并激活被H3K27me3阻遏的等位基因的试剂(例如，去甲基化酶，如KDM6A、KDM6B和KDM6C)。已知H3K27me3的试剂是该领域中已知的，并且在例如以下专利和专利公布中有所描述：美国专利8,895,245(例如，化合物75、37、65等)、美国专利9,688,665、美国专利申请15/101,577、美国专利申请15/211,792、PCT/US2016/065447、PCT/US2016/055554、PCT/US2016/060814；其通过引用并入本文。在具体的实施方案中，该试剂是tazemetostat、DZNep、GSK373、GSK126、El1、Epz005687、CPI-169(见，Morera etal.,Clinical Epigenetics 2016 8:57)。
其它实施方案中，本文所公开的试剂选择性地去除组蛋白H3赖氨酸27处的三甲基化并激活被H3K27me3阻遏的等位基因(例如，KDM6A、KDM6B或KDM6C)。此类去甲基化酶可在细胞内被表达为多核苷酸(例如，mRNA)或被作为蛋白质注射到细胞内。
根据本文所公开的方法，在治疗性应用中，根据本发明使用的该试剂的剂量取决于该试剂；接纳者患者的年龄、体重和临床情况；以及给予该治疗的临床医生或从业人员的经验和判断；以及其它影响剂量选择的因素。通常，该剂量应足以导致减缓且优选阻遏该病变，并且最优选造成对该病变的完全阻遏。
细胞核移植
体细胞核移植(SCNT)是一种可用于，例如，家畜(例如，牛、马、绵羊、山羊)的生殖性克隆或治疗性克隆的技术，在该技术中，产生用于细胞替代疗法所需的组织。不幸的是，克隆的动物苦于某些由于不当印记引起的缺陷，例如，在组蛋白H3蛋白质亚基上赖氨酸27的三甲基化中的缺陷。这一缺陷可通过提供编码在SCNT过程期间进行三甲基化事件的酶来弥补。一个实施方案中，在SCNT过程之前或期间，将编码能进行三甲基化事件的酶的mRNA(例如，EZH1、EZH2、PRC2)注射到接纳者细胞内或细胞核供体细胞中。
体细胞核移植牵涉获得细胞核供体细胞，随后将这一细胞核供体细胞融合到去核的接纳者细胞内，最优选去核的卵母细胞内，以形成细胞核移植胚胎，激活这一胚胎，最终培养该胚胎或将这一胚胎移植到母系宿主体内。在细胞核移植过程中，将来自一个细胞的细胞核DNA的完全补体引入去核的细胞中。细胞核移植方法是该领域技术人员熟知的。见：美国专利4,994,384，1991年2月19日授权Prather等人，题为《繁殖牛胚胎》；美国专利5,057,420，1991年10月5日授权Massey，题为《牛细胞核移植》；美国专利5,994,619，1999年11月30日授权Stice等人，题为《使用培养的内细胞团细胞产生嵌合的牛或羊动物》；英国专利GB 2,318,578和GB 2,331,751，2000年1月19日分别授权Campbell等人和Wilmut等人，题为《用于细胞核移植的静止细胞群》；美国专利6,011,197，2000年1月4日授权Strelchenko等人，题为《使用重新编程的非胚胎牛细胞克隆牛的方法》；和美国专利申请09/753,323，题为《克隆猪动物的方法》(代理人案号030653.0026.CIP1，2000年12月28日递交)，其各自通过引用而以其包括所有附图、表和图式在内的整体并入本文。可使用没有被透明带环绕的卵母细胞执行细胞核移植。
在细胞核移植过程中，将细胞核供体细胞或其细胞核引入接纳者细胞内。接纳之细胞优选为卵母细胞，并且优选是去核的。但是，本发明部分地涉及其中卵母细胞的细胞核不是在物理上从卵母细胞提取出来的细胞核移植。建立其中来自供体细胞的细胞核DNA在细胞分裂过程中被复制的细胞核移植胚胎是可能的。见，例如，Wagoner et al.,1996,Functional enucleation of bovine oocytes:effects of centrifugation andultraviolet light,Theriogenology 46:279-284。此外，可通过将一个细胞核供体与超过一个去核的卵母细胞组合来执行细胞核移植。另外，可将一个细胞核供体、一个或多个去核的卵母细胞、以及一个或多个去核的卵母细胞的细胞质组合来执行细胞核移植。所得的细胞核供体系统与接纳者细胞的组合可称为“杂交细胞”。
如本文中所用，术语“细胞核供体”是指具有可被转移到卵母细胞内的细胞核DNA的任何细胞或其细胞核。细胞核供体可以是已经从细胞中单离的细胞核。该领域技术人员可应用多种技术从细胞单离细胞核并随后使用该细胞核作为细胞核供体。见，例如，美国专利第4,664,097、6,011,197和6,107,543号，其各自通过引用而以其包括所有附图、表格和图式的整体并入本文。任何类型的细胞均可用作细胞核供体。细胞核供体细胞的示例包括但不限于，从体外或体内的两个配子联合体产生的胚胎中单离的培养和非培养细胞；从培养胚胎细胞(例如，囊胚前细胞和内细胞团细胞)产生的胚胎干细胞(ES细胞)；从胚胎单离的内细胞团细胞产生的培养和非培养细胞；培养和非培养囊胚前细胞；培养和非培养胎儿细胞；培养和非培养成体细胞；培养和非培养原始生殖细胞；培养和非培养生殖细胞(例如，胚胎生殖细胞)；从动物单离的培养和非培养体细胞；培养和非培养卵丘细胞；培养和非培养羊膜细胞；培养和非培养胎儿成纤维细胞；培养和非培养生殖嵴细胞；培养和非培养分化细胞；同步群体中的培养和非培养细胞；不同步群体中的培养和非培养细胞；培养和非培养血清饥饿细胞；培养和非培养永久细胞；以及培养和非培养全能细胞。见，例如，Piedrahitaet al.,1998,Biol.Reprod.58:1321-1329；Shim et al.,1997,Biol.Reprod.57:1089-1095；Tsung et al.,1995,Shih Yen Sheng Wu Hsueh Pao 28:173-189；和Wheeler,1994,Reprod.Fertil.Dev.6:563-568，其各自通过引用而以其包括所有附图、表格和图式的整体并入本文。此外，细胞核供体可以是先前冷冻或低温保藏的细胞。
通过细胞核移植过程制备的杂交细胞可用于生殖性克隆或再生性克隆中。
除非另外指定，否则本发明的实践采用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的传统技术，这些技术完全在该领域技术人员的权限之内。此类技术在文献中有完整阐述，例如，《分子克隆：实验室手册(第二版)》(MolecularCloning:A Laboratory Manual,second edition(Sambrook,1989)；《寡核苷酸合成》(Oligonucleotide Synthesis(Gait,1984))；《动物细胞培养》(Animal Cell Culture(Freshney,1987))；《酶学方法：实验免疫学手册》(Methods in Enzymology Handbook ofExperimental Immunology(Weir,1996))；《用于哺乳动物细胞的转基因载体》(GeneTransfer Vectors for Mammalian Cells(Miller and Calos,1987))；《分子生物学现代方法》(Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel,1987))；《PCR：聚合酶链反应》(PCR:The Polymerase Chain Reaction,(Mullis,1994))；《免疫学现代方法》(CurrentProtocols in Immunology(Coligan,1991))。这些技术科用于生产本发明的多核苷酸和多肽，并因此可视为作出并实践本发明。尤其可用于具体实施方案的技术将在以下章节中讨论。
详述以下实施例以向该领域技术人员提供对如何制备和使用本发明的检验、筛选和治疗性方法的完全公开和说明，并且以下实施例不试图限制发明人所认为的本发明的范畴。
[实施例]
实施例1：合子中的等位基因DHS标记已准备好进行等位基因合子基因组激活的启动子
转录调节元件例如启动子和增强子，可通过DNase I超敏检验映射。通过使用低输入DNase I-测序(liDNase-seq)技术映射着床前胚胎的转录调节风貌，并且，基于SNP的分析表明，两个亲本等位基因的核染色质可及性整体上相当，但被印记的基因启动子除外。使用以高通量测序进行的转座酶可接近的核染色质检验(ATAC-seq)也得到类似的结论。但是，潜在亲本来源特异性核染色质可及性的机制尚不清楚。
为了全面勾勒合子中的亲本等位基因特异性DHS，从PN5阶段的合子单离父系和母系原核并实施liDNase-seq(图1A、图2A)。使用严格标准(图2B)并排除性染色体的数据，分别鉴定了3,462个双等位基因DHS、687个父系等位基因特异性DHS(Ps-DHS)和169个母系等位基因特异性DHS(Ms-DHS)(图1B、图2C)。当与在启动子和CpG岛中富集的双等位基因DHS相比时，等位基因DHS的基因组定位严重偏向非启动子元件(图2D、图2E)。Ps-DHS包括已知印记基因的ICR(图2F)。有趣的是，Ps-DHS和Ms-DHS两者也包括以往不知道的待印记基因的启动子(图2G、图2H)。
由于启动子DHS可在下一个发育阶段启动基因表达，因此研究了合子中的等位基因DHS能否在合子基因组激活(ZGA)时启动基因表达。使用α-鹅膏蕈碱处理作为阴性对照，2细胞阶段雄性单性生殖(AG)和雌性单性生殖(GG)胚胎的RNA-seq分析鉴别了107个AG特异性差异表达基因(DEG)和14个GG特异性差异表达基因(DEG)，包括8个已知的印记基因(图3A、图3B、图3C和图3D)。
对合子中的等位基因ZGA和等位基因启动子DHS的综合分析表明，大部分(59％和79％)的AG特异性DEG和GG特异性DEG分别于父系和母系等位基因偏位的核染色质可及性相关联(图3E、图3F)。显示这一相关性的基因不仅包括已知的印记基因，而且包括未知的待印记基因(图1C)。这些结果表明，合子中的等位基因DHS可标记被启动用于等位基因ZGA的启动子。
实施例2：DNA甲基化和等位基因DHS
为了理解合子中的等位基因DHS如何被特异化，检查了它们是否遗传自配子。勾勒了成熟卵母细胞的DHS(图4A)并分析精子DHS。尽管精子仅具有34个可复现DHS，但它们中的一些促成Ps-DHS(图4B)。但是，大多数的Ps-DHS在精子和卵母细胞中不存在，表明它们实在受精后生成的(图4C、图4D)。相反，大多数的Ms-DHS和双等位基因DHS已经存在于卵母细胞中(图4E、图4F、图4G、图4H)，表明大多数的母系DHS遗传自卵母细胞。
为了确定Ps-DHS处的母系等位基因如何保留可及性，假设母系DNA甲基化阻止DHS形成。对于公开的卵母细胞和精子全基因组亚硫酸盐测序(WGBS)数据集的分析表明，仅17％的Ps-DHS与卵母细胞生殖系差异甲基化区(gDMR)重叠(图5A)。尽管延伸到Ps-DHS侧翼的±100kb区，但发现只有另外的21％与卵母细胞gDMR相关联(图5A)。即使当仅考虑卵母细胞DNA甲基化水平时，仍有48％的Ps-DHS缺乏卵母细胞DNA甲基化(图5B)，表明了阻止母系等位基因可及性的DNA甲基化依赖性机制的存在。
实施例3：通过H3K27me3进行母系等位基因保护
多梳介导的H3K27me3可介导DNA去甲基化的启动子静默的事实导致以下假设：H3K27me3可能是母系等位基因不可及性的原因。对公开ChIP-seq数据集的分析表明，在DNA去甲基化的Ps-DHS处，卵母细胞中的H3K27me3水平比精子中高得多，而在DNA超甲基化的Ps-DHS处则相反(图5C，左图)。SNP追踪分析表明，在合子中，去甲基化的Ps-DHS保留母系等位基因特异性H3K27me3(图5C，右图)，指示H3K27me3可能是DNA去甲基化区处的母系等位基因不可及性的原因。
为了测试这一可能性，注射编码H3K27me3特异性去甲基酶Kdm6b的mRNA(Kdm6bWT)及其催化突变物(H1390A)(Kdm6bMUT)作为对照(图6A)。同样，制备了注射有H3K9me3特异性去甲基化酶Kdm4d或其催化突变物(H189A)的合子。WT和突变的Kdm6b以及Kdm4d均以类似的水平表达(图5D)，并且，Kdm6bWT和Kdm4dWT，而不是它们的突变物，分别降低了H3K27me3水平和H3K9me3水平(图5E、图5F)。单离原核的LiDNase-seq(图5G、图5H)表明，在注射Kdm6bWT和Kdm4dWT的合子中，431个最可靠Ps-DHS中分别有78个和150个变为双等位基因的，而它们的催化突变物几乎没有这一效果(图6B、图6C、图5I)。这一结果表明，母系H3K27me3和H3K9me3两者均牵涉到母系等位基因不可及性中。重要的是，Kdm6b影响的Ps-DHS在很大程度上缺乏卵母细胞DNA甲基化，这显著不同于位于DNA超甲基化区的Kdm4d影响的Ps-DHS(图6D)。自始至终，Ps-DHS特异性地收到Kdm6b而非Kdm4d的影响，与母系等位基因特异性H3K27me3重叠(图5J)。这些结果表明，母系H3K27me3和H3K9me3分别限制了具有去甲基化DNA的区域和具有超甲基化DNA的区域处的母系等位基因可及性。
实施例4：H3K27me3依赖性印记
母系H3K27me3用作DNA甲基化依赖性印记标记并且限制母系等位基因可及性，以介导H3K27me3依赖性基因组印记。为了理解在晚期胚胎阶段存在何种程度的等位基因DHS，生成AG和GG桑椹胚(图7A)并实施liDNase-seq(图8A)。使用与用于合子中等位基因DHS相同的标准并排除性染色体数据，36,569个常见DHS中分别鉴定出247个AG特异性DHS(AG-DHS)和176个GG特异性DHS(GG-DHS)(图7B)。通过对公开的杂交桑椹胚DHS图谱的SNP追踪分析，证实是AG-DHS而不是GG-DHS再现了相应亲本等位基因特异性DHS(图8B)，表明AG-DHS是生理性的。有趣的，AG-DHS包括几乎全部已知的母系甲基化的ICR(图8C)。这一发现提高了AG-DHS能用作基因组印记指示剂的可能性。
因为gDMR和母系H3K27me3均可导致母系等位基因不可及性(图6)，所以测定了它们各自对于生成247个AG-DHS的贡献。对卵母细胞DNA甲基化组的分析鉴别了DNA去甲基化区中的183个(74％)AG-DHS(图8D)。等位基因H3K27me3富集分析表明，在囊胚的内细胞团(ICM)中，183个中的112个标记有母系等位基因偏位H3K27me3(图7C)。在合子中，112个AG-DHS中的105个显示母系等位基因特异性H3K27me3富集[RPM>0.5，FC(Mat/Pat)>4]，这表明母系等位基因偏位H3K27me3遗传自合子的母系核染色质。通过将105个H3K27me3标记的AG-DHS与其最接近的基因关联，获得76个基因(下表1)作为假定的H3K27me3依赖性印记基因。
表1：
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为了确定所述76个基因中的任一个是否真的被印记在着床前胚胎中，对AG和GG桑椹胚实施RNA-seq分析(图9A)。证实已知印记基因的AG或GG特异性表达(图9B)之后，计算每个候选物的相对AG/GG表达水平。76个基因中，28个被表达在AG胚胎或GG胚胎中(FPKM>0.5)。有趣的是，在AG胚胎中，28个基因中有27个显示偏位(FC>2)，并且有23个基因显示高度偏位(FC>8)(图7D，左栏)。使用杂交IVF桑椹胚的RNA-seq数据集，进一步证实了全部13个SNP追踪基因均表现出亲本等位基因特异性表达(图7D，右栏)。重要的是，这些基因包括Sfmbt2、Gab1、Slc38a4和Phf17，其印记表达被提示为与卵母细胞DNA甲基化无关。这些“不规范”印记基因包覆有甚至在囊胚中仍保留的卵母细胞特异性H3K27me3(图9C)，这与缺乏卵母细胞H3K27me3的DNA甲基化依赖性“规范”印记基因形成对照(图9D)。总之，这些结果表明，母系H3K27me3可用作DNA甲基化依赖性印记标记。
为了确定母系H3K27me3是否为假定H3K27me3依赖性印记基因的母系等位基因阻遏的原因，将Kdm6bWT或Kdm6bMUT mRNA注射到1细胞阶段的单性生殖(PG)胚胎中(图10A)。在确认该注射不影响胚胎发育到桑椹胚阶段(图11A)之后，实施RNA-seq分析(图11B)。在AG桑椹胚中表达的28个假定印记基因(图7D)中，16个被以催化活性依赖的方式显著去阻遏，包括全部4个已知的不规范印记基因(图10B)。相比之下，规范的印记基因不受Kdm6bWT注射的影响(图11C)，证明H3K27me3特异性地为假定的H3K27me3依赖性印记基因的母系等位基因阻遏所需。
为了证明Kdm6b介导的母系等位基因去阻遏出现在生理学情境中，对已经在1细胞阶段注射Kdm6bWT或Kdm6bMUT mRNA的源自IVF的杂交桑椹胚实施RNA-seq分析。28个假定的印记基因中，17个具有足够的SNP读取，并且它们中的16个在注射Kdm6bMUT的胚胎中显示亲本等位基因偏位表达(图10C)。注意，在注射Kdm6bWT的胚胎中，所有这些基因的亲本等位基因偏位均变得较轻，而规范的印记基因不受影响(图10C)。这些数据表明，这些基因的印记表达取决于母系H3K27me3。
为了确定母系等位基因去阻遏是否与母系核染色质可及性的获得有关，对注射Kdm6bWT和Kdm6bMUT的PG桑椹胚实施liDNase-seq(图7D)。我们发现，是Kdm6bWT而非Kdm6bMUT显著增加了包括4个不规范的印记基因在内的假定的H3K27me3依赖性印记基因的AG-DHS中的核染色质可及性(图10D、图10E和图11E)。相比之下，规范的印记印记的ICR不受影响(图10D和图11F、图11G)。这些结果表明，母系H3K27me3限制母系等位基因可及性以介导H3K27me3依赖性基因组印记。
实施例5：囊胚中的印记状态
随后，通过对最近公开的数据集的SNP追踪，分析了假定的H3K27me3依赖性印记基因在囊胚中的印记状态。在28个被印记在桑椹胚中的基因(图7D)中，15个在两个互交杂交中具有足够的SNP读取(图12A)。它们中，12个(80％)在两个杂交系中显示亲本等位基因表达(图12A)，表明大部分H3K27me3依赖性印记被保留在囊胚中。
由于以往的研究已经表明Gab1、Sfmbt2和Phf17仅被印记在细胞外组织中，检查了它们在ICM中的印记状态。从AG囊胚和GG囊胚单离TE细胞和ICM细胞，并实施RNA-seq分析。标记物基因表达证实没有杂交污染(图13A)。在28个假定的印记基因(图7D)中，分别有23个和24个表达在TE和ICM中(RPKM>0.5)。其中，TE中有18个(78％)并且ICM中有16个(67％)显示AG偏位表达(FC>2)(图12B)。注意，9个基因显示在ICM中的AG偏位比在TE中弱(图12B，箭头)，提示H3K27me3依赖性印记可能在ICM中开始减少。
实施例6：植入后印记状态
将杂交E6.5胚胎解剖为外胚层(EPI)、内脏内胚层(VE)和胚胎外的外胚层(EXE)，并实施RNA-seq分析，以确定移植后胚胎的印记状态(图13B)。通过分析细胞系特异性标记物基因表达(图13C)证实了细胞强度，并且在EPI中鉴别了17个父系表达基因(PEG)和8个母系表达基因(MEG)，在VE和EXE两者中鉴别了19个PEG和12个MEGs，包括新印记的基因，例如D7Ertd715e(也称为Snhg14)、Smoc1和Mas1(图13D、图13E)。
在76个假定的H3K27me3依赖性印记基因中，在EPI、VE和EXE中分别有25个、23个和17个基因在两个互交杂交中具有足够的SNP读取(图12C)。发现，在EPI、VE和EXE中分别有1个、3个和5个基因被父系表达(图12C，箭头)。被印记在EXE中的基因包括4个不规范印记基因：Gab1、Phf17、Sfmbt2和Slc38a4；以及一个新的印记基因：Smoc1(图12C)。这些结果提示，除Slc38a4以外，H3K27me3依赖性印记在外胚层中被完全清楚，但一部分仍保留在胚胎外细胞系中。
为了分析E9.5胎盘中的印记状态，避免可能的母系细胞污染，通过FACS分选从GFP转基因胚胎纯化源自胎儿的胎盘细胞(图14A)并实施RNA-seq分析(图14B)。通过证明来自亲本等位基因的可比较的总SNP读取而证实细胞纯度(图14C)之后，鉴别了25个PEG和21个MEG，包括新的印记基因，例如D7Ertd715e、Smoc1、Cbx7和Thbs2(图15A、图15B)。在76个假定的H3K27me3依赖性印记基因中，有27个基因在两个互交杂交中具有足够的SNP读取(图12D)。它们中，Gab1、Sfmbt2、Slc38a4和Smoc1被父系表达(图12D)。Phf17的印记在一个杂交系中较弱(FC＝1.87)(图12D)，这与以往的研究一致。综上所述，该数据不仅将Smoc1鉴别为新的H3K27me3依赖性印记基因，而且提示大多数H3K27me3依赖性印记基因瞬时地印记在着床前胚胎中，同时一部分仍被印记在胚胎外细胞系中(图12E)。
由于DNA甲基化早在二十多年前就已经被鉴别为基因组印记标记，其是仅有的已知哺乳动物生殖系印记标记。但是，最近的研究已经鉴别了几种能在DNA甲基化不存在下维持亲本等位基因特异性表达的印记基因，提示了DNA甲基化依赖性印记机制的存在。如本文所述，这些不规范的印记基因携带高水平的卵母细胞特异性H3K27me3，并且H3K27me3的丢失导致了印记的丢失。尽管以往的研究已经表明了被阻遏等位基因与包括H3K27me3在内的阻遏性组蛋白修饰之间的关联，但在某些印记基因座中，这些基因座的印记状态最初取决于gDMR。一贯地，H3K27me3的异位去除特异性地影响不规范的印记印记，表明H3K27me3依赖性印记的调控机制与gDMR介导的规范印记机制有根本性的差异。
H3K27me3依赖性印记的动力学与DNA甲基化依赖性印记完全不同，后者被大部分保留在胚胎细胞系和胚胎外细胞系中。同样，H3K27me3印记标记在卵子发生过程中建立并且保留在着床前胚胎中(图12E)。尽管它在ICM中开始减少并且在E6.5胚胎的外胚层中几乎完全丢失，但至少在E9.5胎盘之前，它仍保留在一些基因中。进一步的研究有助于理解这些基因为何和如何被选择以维持印记，它们为何使用H3K27me3而不是DNA甲基化作为印记标记，以及如何实现细胞系特异性印记。此外，考虑到开花植物也采用这一机制，什么样的其它生物可保存H3K27me3依赖性基因组印记是一个有趣的问题。
实施例7：母系H3K27me3包覆Xist
如果H3K27me3用作Xist的印记标记，则它将存在于卵母细胞而非精子中。为了测试这一观点，分析了公开的H3K27me3 ChIP-seq数据集，结果显示，Xist基因座被一个宽H3K27me3结构域包覆，该结构域的跨度为约450kb且包括卵母细胞中的Xist基因体(图16A)。与显示Xist印记在卵母细胞生长过程中被建立的以往研究一致，H3K27me3结构域在此期间逐步获得(图16A)。此外，对卵母细胞DNaseI测序数据集的分析显示，这一完整H3K27me3结构域的核染色质可及性显著低于环绕区(图16A)，提示异染色质结构域的形成。对卵母细胞DNA甲基化组的分析表明，在卵母细胞中，这一结构域的大部分被去甲基化(图16A)，这与显示Xist印记独立于卵母细胞DNA甲基化的以往报导一致。
为了确定在卵母细胞中观察到的母系等位基因特异性H3K27me3在着床前发育过程中是否得以维持，分析了1细胞胚胎、2细胞胚胎和囊胚的ChIP-seq数据集。发现母系H3K27me3结构域在整个着床前发育过程中得以维持(图16B)，并且，H3K27me3结构域上游的包括Xist在内的大约200kb区维持母系等位基因偏位的H3K27me3在囊胚中的富集(图16B)。相比之下，在囊胚中，由于父系H3K27me3的获得，H3K27me3结构域的下游大约250kb区几乎丢失了等位基因差异(图16B)。这些数据支持母系H3K27me3在母系Xist静默中的可能角色。
实施例8：母系H3K27me3对于母系Xist静默负有责任
为了检查H3K27me3是否对于母系Xist静默负有责任，通过注射编码H3K27me3特异性去甲基化酶Kdm6bWT的mRNA耗竭合子中的H3K27me3(图17A)。制备了注射其携带位于催化结构域的点突变的催化突变体Kdm6bMUT的合子，作为阴性对照。这一途径使得合子中的H3K27me3以催化活性依赖性模式有效减少(图19A、图19B)。为了可视化Xist RNA表达，在桑椹胚阶段实施RNA荧光原位杂交(FISH)分析。为了区分雄性胚胎和雌性胚胎，通过携带Rnf12的X染色体基因座探针实施DNA FISH而同步标记X染色体。这样，卵裂球中的一个和两个DNA FISH信号可分别区分雄性胚胎和雌性胚胎。不出所料，RNA/DNA FISH分析表明，大多数注射Kdm6bMUT的雌性显示一个RNA云团，而雄性显示无RNA云团信号(图17B、图17C)。相比之下，大多数注射Kdm6bWT的雄性和雌性分别显示一个和两个Xist RNA云团(图17B、图17C、图17D)，表明H3K27me3对于着床前胚胎中的母系Xist阻遏负有责任。
之后，正常胚胎和双亲胚胎中的H3K9me3丢失是否和在PG胚胎中一样导致母系Xist去阻遏。为此，向合子中注射编码Kdm4d的mRNA，这一催化活性依赖性模式有效地减少了H3K9me3(图20A、图20B)。在桑椹胚阶段的RNA/DNA FISH表明，Kdm4dWT的表达不诱导雄性胚胎或雌性胚胎中的母系Xist表达(图20C、图20D、图20E)，提示在生理学条件下，H3K9me3在母系Xist阻遏中不扮演主要角色。
实施例9：H3K27me3的丢失诱导母系XCI
为了确定母系Xist表达是否在注射Kdm6bWT的胚胎中导致母系XCI，对早期囊胚实施RNA-seq分析。为了区分亲本等位基因，制备了源自用PWK受精的BDF1卵母细胞的杂交种系胚胎。RNA-seq数据集的两个生物学复本是高度可再现的(图21)。对单核苷酸多态性(SNP)信息的分析表明，X连锁基因的母系等位基因的表达水平，而不是常染色体基因的表达水平，在注射Kdm6bWT的胚胎中被显著下调(图18A)。对单个SNP追踪X连锁基因的进一步检查证实，大多数基因均被下调(图18B)。此外，已知从印记XCI中逃脱的基因(称为“逃脱者”)也从母系XCI中逃脱(图18C)。这些数据进一步支持H3K27me3对于母系Xist静默以防止母系XCI负有责任。
使用下述方法和材料获得上文所述结果。
从PN5阶段合子单离母系原核和父系原核
所有动物研究均根据哈佛医学院动物护理和使用委员会的指南实施。从通过注射7.5I.U.的PMSG(Millipore)和hCG(Millipore)促排的8周龄B6D2F1/J(BDF1)雌性采集MII阶段的卵母细胞。对于体外受精(IVF)，在补充10mg/ml牛血清白蛋白(BSA；Sigma-Aldrich)的HTF培养基中，用从成年BDF1雄性小鼠的附睾尾部获得的激活精子令MII卵母细胞受精。通过在HTF培养基中培养1小时取得精子获能。将合子在具有5％ CO2/95％空气的湿润大气中在37.8℃培养。受精后10小时(hpf)，将合子转移到含有10μg/ml细胞松弛素B(Sigma-Aldrich)的M2培养基中。通过压电冲击驱动未操作完(Prime Tech Ltd.,Ibaraki,Japan)切除透明带，并且从合子单离原核。在12hpf(PN5阶段)，单离的原核用0.2％ BSA/PBS洗涤，转移到Eppendorf LoBind 1.5ml试管中，并且在DNase I处理之前一直放置在冰上。对于每个实验，采集150至200个原核并制备用于liDNase-seq。亲本原核的不同之处在于(1)与第二极体的聚合和(2)原核的尺寸。
雄性单性生殖(AG)胚胎和雌性单性生殖(GG)胚胎的制备
从8周龄的促排BDF1雌性采集MII卵母细胞，并使用BDF1精子受精。在7hpf，将合子转移到含有5μg/ml细胞松弛素B的M2培养基中，使用压电冲击驱动微操作器交换亲本原核。如先前所述，用仙台病毒(HVJ,Cosmo-bio)将细胞核与细胞质融合。重构之后，在KSOM中培养胚胎。
当采集用于RNA-seq或/和liDNase-seq的胚胎时，我们通过短暂暴露于酸性台氏液(Acid tyrode's solution(Sigma-Aldrich))去除透明带(ZP)，然后，先后用M2培养基和0.2％ BSA/PBS洗涤胚胎。对于liDNase-seq，将10个桑椹胚转移到Eppendorf LoBind1.5ml试管中，并DNase I处理之前一直在冰上放置。对于RNA-seq，将7至10个胚胎转移到不含RNase的PCR薄壁试管(Ambion)内。分别在30hpf和78hpf采集2细胞胚胎和桑椹胚。当制备α-鹅膏蕈碱处理的2细胞胚胎时，将5hpf合子转移到含有25μg/mlα-鹅膏蕈碱(Sigma-Aldrich)的KSOM中，并且在采集(30hpf)之前，一直在α-鹅膏蕈碱的存在下培养。单离ICM和TE。简单地说，在120hpi用酸性台氏液处理AG胚胎和GG胚胎以去除ZP。在M2培养基中洗涤之后，将胚胎在含有兔抗鼠淋巴细胞血清(Cedarlane,1:8稀释)的KSOM中在37℃培养45分钟。在M2培养基中洗涤之后，将它们转移到含有豚鼠补体(MP Biomedicals,1:3.3dilution)的KSOM中。在37℃培养30分钟之后，通过用玻璃毛细管吸液去除裂解的TE细胞。将剩余的ICM丛在37℃在0.25％胰蛋白酶/EDTA(Thermo Fisher,25200)中培养10分钟，随后解离为单细胞以避免被裂解的TE细胞污染。采集100至200细胞用于RNA-seq。
从成熟卵母细胞单离GV细胞核
在注射5I.U.PMSG之后44至48小时，从3周龄的BDF1小鼠获得成熟的GV阶段卵母细胞。将卵巢转移到M2培养基中。用30号针刺穿卵泡，使用窄口径玻璃吸管从卵丘-卵母细胞复合体中轻轻地去除卵丘细胞。随后将卵母细胞转移到补充5％胎牛血清(FBS)(Sigma-Aldrich,F0926)、10ng/ml表皮生长因子(Sigma-Aldrich,E4127)和0.2mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX；Sigma–Aldrich)的α-MEM(Life technologies,12571-063)中。采集后一小时，剔除表现出可见卵周隙的具有围绕核仁(SN)型核染色质的GV卵母细胞。随后将它们在含有10μg/ml细胞松弛素B、0.1μg/ml秋水仙胺(Sigma-Aldrich)和0.2mM IBMX的M2培养基中培养15分钟。然后，使用压电驱动微操作器单离GV细胞核。用0.2％ BSA/PBS洗涤后，将GV细胞核转移到Eppendorf LoBind 1.5ml试管中。对于每个实验，采集115至150个GV细胞核用于liDNase-seq。
E6.5胚胎的解剖以及GFP阳性E9.5胎盘细胞的FACS分选
使用自然交配方案获得C57BL6(B6)/PWK杂交胚胎。使用PWK卵母细胞与B6精子的体外受精获得PWK/B6杂交胚胎，并将2细胞胚胎转移到ICR种系代孕母体内。实施E6.5胚胎到EPI、EXE和VE的解剖。从杰克逊实验室购买B6GFP小鼠[C57BL/6-Tg(CAG-EGFP)131Osb/LeySopJ,Stock number 006567]，采集E9.5胎盘细胞。从促排的8周龄B6GFP或PWK小鼠采集MII卵母细胞和精子。在体外受精后，将2细胞胚胎转移到ICR种系代孕母体内。在E9.5收获胎盘，切割为约0.5mm的片，转移到50ml试管内，用2ml的0.25％ Trypsin-EDTA(ThermoFisher Scientific,25200)在30℃在培养箱中以200rpm处理15分钟，以解离胎盘细胞。加入2ml含有10％FBS的DMEM来终止胰蛋白酶处理。吸液之后，将试管离心，用0.2％BSA/PBS将成丸的细胞洗涤三次。加入DAPI，令其在最终细胞悬浮液中的最终浓度为1μM。使用BDFACSaria机器(BD Biosciences)存储GFP阳性细胞，并且将DAPI阳性细胞作为死亡细胞排除。从每个胎盘中采集到大约10,000至20,000个GFP阳性细胞，对应于胎盘总细胞的40％至60％。
质粒构造和mRNA制备
为了生成Kdm6bWT构造体，扩增了编码含有催化结构域(氨基酸1025至末端)的羧基端部分的cDNA。在pcDNA3.1-Flag-poly(A)83质粒的Flag标签与poly(A)之间克隆PCR扩增。使用PrimeSTAR诱变(TAKARA)生成H1390A Kdm6bMUT构造体。用于诱变的引物是5'-CCAGGCgctCAAGAGAATAACAATTTCTGCTCAGTCAACATCAAC-3'和5’-CTCTTGagcGCCTGGCGTTCGGCTGCCAGGGACCTTCATG-3’。通过DNA测序来验证全部构造体。先前描述了用于野生型和H189A突变Kdm4d的质粒。
用限制性内切酶线性化之后，用苯酚-氯仿提取法纯化构造体。根据制造商的说明书，使用mMESSAGE mMACHINE T7 Ultra试剂盒(Life technologies)通过体外转录合成mRNA。合成的mRNA通过氯化锂沉淀纯化，用不含核酸酶的水稀释。使用前，将mRNA等量小样在-80℃存储。
mRNA注射
从促排的8周龄BDF1雌性采集MII卵母细胞，并使用BDF1精子受精。2.5hpf后，将受精的合子转移到M2培养基中，使用压电冲击驱动微操作器注射mRNA。在4hpf完成mRNA注射。Kdm6bWT和Kdm6bMUT的mRNA浓度为1.8μg/μl，而Kdm4dWT和Kdm4dMUT的mRNA浓度为1.5μg/μl。当制备注射Kdm6b的PG胚胎时，通过使用SrCl2在含有5μg/ml细胞松弛素B的不含Ca2+的KSOM中的3mM溶液处理而化学地激活MII卵母细胞。在激活后4小时(hpa)，用KSOM洗涤胚胎。在5hpa，向它们注射mRNA。
整体免疫染色
将合子在3.7％多聚甲醛(PFA)在含有0.2％ Triton的PBS中的溶液中固定20分钟。使用含有10mg/ml BSA的PBS(PBS/BSA)洗涤4次之后，用一级抗体在4℃将合子处理过夜。这一研究中使用的一级抗体是小鼠抗H3K27me3(1/500，Active Motif，61017)、兔抗H3K9me3(1/500，Millipore，07-442)和兔抗FLAG(1/2000，Sigma-Aldrich，F7524)。用PBS/BSA洗涤3次之后，使用荧光素异硫氰酸酯缀合的抗鼠IgG(Jackson Immuno-Research)或Alexa Flour 568驴抗兔IgG(Life technologies)的1:250稀释液培养1小时。随后，用具有4’,6-二酰亚胺基-2-苯基吲哚(DAPI)(Vector Laboratories,Burlingame,CA)的Vectashield抗漂洗溶液和将合子封固在载玻片上在具有旋转盘的荧光扫描共聚焦显微镜(CSU-10,Yokogawa)和EM-CCD相机(ImagEM,Hamamatsu)或Zeiss LSM800下检测荧光。
获得全部图像并使用Axiovision软件(Carl Zeiss)分析。使用Axiovision软件将荧光信号强度量化。简单地说，测定母系原核内的信号强度，并将细胞质信号作为背景减去。随后，将未注射的对照合子的平均信号强度设定为1.0。
低输入DNase-seq
如先前所述并略作修改，制备低输入DNase-seq库。将收集在1.5ml试管中的胚胎或细胞核重新悬浮在36μl裂解缓冲液(10mM Tris-HCl,pH 7.5、10mM NaCl、3mM MgCl2、0.1％ Triton X-100)中，在冰上培养5分钟。以80U/ml(对于GV细胞核样品)或40U/ml(对于全部其它样品)的最终浓度加入DNase I(10U/μl,Roche)，并在37℃培养整整5分钟。加入含有2μl蛋白酶K(20mg/ml，Life technologies)的80μl终止缓冲液(10mM Tris-HCl,pH 7.5、10mM NaCl、0.15％ SDS、10mM EDTA)终止反应。随后加入20ng的环状运载剂DNA[不含任何哺乳动物基因的纯质粒DNA，使用0.5x Beckman SPRIselect珠(Beckman Coulter)纯化以去除小DNA片段]。将混合物在50℃培养1小时，随后通过使用苯酚-氯仿提取并在线性丙烯酰胺(Life technologies)的存在下在-20℃用乙醇沉淀过夜来纯化DNA。将沉淀的DNA重新悬浮在50μl TE(2.5mM Tris,pH 7.6、0.05mM EDTA)中，全部体积均用于测序库构造。
根据制造商的说明书，使用Illumina的NEBNext Ultra IIDNA库制备试剂盒(NewEngland Biolabs)制备测序库，但是适配体结扎是使用0.03μM适配体在20℃进行30分钟的结扎反应而实施，并且PCR扩增是使用Kapa Hifi即用型预混物(hotstart readymix)(KapaBiosystems)实施8个循环。使用x1.3体积的SPRIselect珠(Beckman Coulter)纯化PCR产物，接着先后使用x0.65体积和x0.7体积的SPRIselect珠进行尺寸选择。样品在24μl TE中洗脱。使用1μl的1:1,000稀释样品，通过qPCR确定第二次PCR扩增所需的循环数。接着使用Kapa Hifi即用型预混物扩增剩余的23μl样品(这一研究中，对所有样品我们均采用7个循环)。使用x1.3体积的SPRIselect珠纯化PCR产物，接着先后使用x0.65体积和x0.7体积的SPRIselect珠进行尺寸选择。DNA在30μl TE中洗脱，并通过Qubit dsDNA HS检测试剂盒(Thermo Fisher Scientific,Q32854)和Agilent高灵敏度检测试剂盒(AgilentTechnologies)量化。在具有单端100bp读取的Hiseq2500(Illumina)上对这些库测序。
RNA测序
如先前所述制备RNA-seq库。简单地说，使用权胚胎裂解物和更智能的超低输入RNA cDNA制备试剂盒(Clontech,634890)实施逆转录和cDNA扩增。当处理2细胞的、AG的、GG的和α-鹅膏蕈碱处理的IVF胚胎样品时，在细胞裂解步骤将1μl的1:40,000稀释ERCC(External RNAControls Consortium)标准RNA(Life technologies)加入每个试管中。随后使用Covaris M220超声波样品震碎机(Covaris)和microTUBE-50(Covaris)将cDNA片段化为平均150-160bp的片段。根据制造商的说明书(New England Biolabs)，使用Illumina的NEBNext Ultra DNA库制备试剂盒对片段化的cDNA进行末端修复、适配体结扎和扩增。在HiSeq2500测序仪(Illumina)上实施单端100bp测序。
liDNase-seq数据分析
首先用trim_galore对liDNase-seq数据的读取进行低质量和适配体裁剪，然后使用Bowtie v0.12.9映射到小鼠基因组(mm9)。“-m 1”参数以保持唯一的映射命中。使用SAMtools去除映射质量(MAPQ)≤10的读取或被映射到具有相同取向的相同定位的冗余读取。通过具有FDR<＝0.01的Hotspot程序鉴别liDNase-seq数据中的DHS峰。使用来自bedtools的“bedtools merge”合并来自全部33个库的DHS峰。使用来自deepTools的“multiBamSummary”计算每个库中各DHS的读取数，并归一化到映射读取总数和DHS长度(每百万个映射读取中每1kb中标签位于位置上的可能性).去除性染色体的读取，因为性染色体数再亲本原核之间以及雄性单性生殖胚胎与雌性单性生殖胚胎之间是不同的。计算在全基因组DHS处的标签密度的皮尔森相关系数(r)，以测量复本间的相关性。对于合子和桑椹胚中的亲本等位基因特异性DHS的鉴别，我们使用严格的截止值(在所有复本中偏位等位基因的RPKM均值>2，RPKM>1，并且两个等位基因之间的倍变的均值大于4)。通过将额外的标准“显微注射的合子的亲本PN的全部复本中，RPKM>1”应用到Ps-DHS上，鉴别了431个最可靠的Ps-DHS。使用来自UCSC基因组浏览器数据库的RefSeq基因组装(mm9)和先前定义的CGI作为图2D和图2E中的基因组特征分布分析。
RNA-seq数据分析
我们构建了一个结合小鼠基因组(mm9)和ERCC对照的自定义参考序列。使用TopHat v2.0.6或STAR(github.com/alexdobin/STAR)将RNA-seq的读取映射到该参考基因组。除非另外指定，否则所用程序均使用默认参数运行。随后，在参考注释(UCSC基因模型)的引导下，使用来自subread-v1.5.1的featureCounts将唯一映射的读取组装为转录物。对于所有的2细胞RNA-seq库，仅使用ERCC读取计数，用来自R语言DESeq包的“estimateSizeFactors”函数估算库大小因子。将库大小归一化之后，使用归一化的FPKM(每百万个映射中，映射到外显子上的每千个碱基上的片段数)将每个基因的表达水平量化。计算基因表达水平的皮尔森相关系数(r)来指示复本间的相关性。对于2细胞阶段的新合成转录物的鉴别，我们首先过滤出AG或GG与α-鹅膏蕈碱处理的2细胞胚胎之间的统计学不显著基因。为此，使用负二项模型，用来自R语言DESeq包的“nbinomTest”函数计算调节P值，并且仅选择FDR<0.05的基因。随后，我们应用其它的截止值[均值FPKM(AG或GG)>2且倍变(FC)(AG/Ama或GG/Ama)>2]。结果，在AG和GG 2细胞胚胎中分别有4,381个和3,916个基因被鉴别为新合成的基因。对于鉴别2细胞胚胎中的AG特异性DEG和GG特异性DEG，从AG胚胎和GG胚胎中减去各基因在α-鹅膏蕈碱2细胞胚胎中的基因表达水平(FPKM)。显示FC(AG/GG或GG/AG)>10的基因被鉴别为DEG。
WGBS和H3K27me3 ChIP-seq数据分析
使用methpipe v3.4.2计算DHS处的DNA甲基化水平。当计算在各DHS处的DNA甲基化水平时，为了获得足够的WGBS读取覆盖率，我们将各DHS向上游和下游均延伸2kb以包括更多的附近CpG位点。通过在卵母细胞中的>80％甲基化和精子中的<20％甲基化，定义卵母细胞甲基化的gDMR。就图5A而言，使用“bedtools makewindows”生成一组不重叠的关于Ps-DHS的±100kb侧翼区的1kb存储箱。对于H3K27me3 ChIP-seq分析，从Zheng et al.,2016下载床文件并使用来自UCSC基因组浏览器数据库的“bedClip”和“bedGraphToBigWig”转化为bigWig格式。使用来自deepTools的“multiBigwigSummary”计算DHS和周围区域上的H3K27me3信号。
统计分析和数据可视化
使用R(www.r-project.org/)具体执行统计分析。使用默认参数的“cor”函数计算皮尔森相关系数。使用R函数“heatmap.2”生成图6B和图10D。使用R函数“pheatmap”生成图7D、图10C、图12A至图12D。使用deepTools中的“computeMatrix”和“plotHeatmap”生成图1B和图7B。使用macs2 v2.1.0归一化库中的总唯一映射读取，并可视化为IGV基因组浏览器中的自定义轨迹，确定通过测序读取得到的基因组位置覆盖率。
已知的印记基因信息
已知的印记基因信息从www.geneimprint.com/site/genes-by-species.Mus+musculus下载。
代码可用性
基于SNP信息，使用定制管线将杂交RNA-seq数据分割到它们的亲本来源。代码可在github.com/lanjiangboston/UniversalSNPsplit找到。
数据可用性声明
本研究中生成的全部liDNase-seq和RNA-seq数据集均存放到GEO数据库中的登录号GSE92605下。精子liDNase-seq数据集来自以前的出版物(GSE76642)。精子和GV卵母细胞的WGBS数据集从www.nodai-genome.org/mouse.html？lang＝en下载。精子、MII卵母细胞、和1细胞胚胎的SNP追踪母系和父系等位基因的H3K27me3 ChIP-seq数据集从以前的出版物(GSE76687)下载。
小鼠着床前胚胎的采集
所有动物研究均根据哈佛医学院动物护理和使用委员会的指南实施。从通过注射7.5I.U.的PMSG(Millipore)和hCG(Millipore)促排的8周龄B6D2F1/J(BDF1)雌性采集MII阶段的卵母细胞。对于体外受精(IVF)，在补充10mg/ml牛血清白蛋白(BSA；Sigma-Aldrich)的HTF培养基中，用从成年BDF1或PWK(Jackson Laboratory,003715)雄性的附睾尾部获得的激活精子令MII卵母细胞受精。通过在HTF培养基中培养1小时取得精子获能。将合子转移到KSOM，并在具有5％ CO2/95％空气的湿润大气中在37.8℃培养。
mRNA注射
在受精后4小时(hpf)，将合子转移到M2培养基中，使用压电冲击驱动微操作器(Prime Tech Ltd.,Ibaraki,Japan)注射mRNA。mRNA的构造和制备描述于上。所注射的Kdm6bWT和Kdm6bMUT的mRNA浓度为1.8μg/μl，而Kdm4dWT和Kdm4dMUT的mRNA浓度为1.5μg/μl。
用于荧光原位杂交的探针
根据制造商的说明书，使用Nick翻译试剂(Abbott Molecular,07J00-001)和Cy3-dCTP(GE healthcare,PA53021)制备用于Xist RNA的探针。用于探针制备的模板DNA是编码全长度小鼠Xist基因的质粒，是来自Rudolf Jaenisch的礼物(pCMV-Xist-PA,26760)(Wutzand Jaenisch,2000)。使用相同试剂盒和Green-dUTP(Abbott Molecular,02N32-050)制备用于DNA FISH的探针。模板DNA是含有Rnf12基因座的BAC克隆物(RP23-36C20)。用乙醇将荧光探针与5μg Cot-1 DNA(Life technologies)、5μg鲱鱼精子DNA(Thermo FisherScientific)和2.5μg酵母tRNA(Thermo Fisher Scientific,AM7119)一起沉淀，随后用20μl甲酰胺(Thermo Fisher Scientific,17899)溶解。探针在4℃储存，在使用前，将探针(每次0.75μl)与0.75μl的已经使用乙醇沉淀并溶解在甲酰胺中的Cot-1 DNA、以及2.25μl的4xSSC/20％葡聚糖(Millipore S4030)混合。将探针混合物在80℃加热30分钟，随后转移到37℃培养器中(“预退火探针”)。
整体RNA/DNA荧光原位杂交
在室温下，将桑椹胚在2％多聚甲醛(PFA)在含有0.5％ Triton X-100的PBS中的溶液中以78hpf固定20分钟。用含有1mg/ml BSA的PBS(PBS/BSA)洗涤3次后，在4℃用含有0.02％ Triton X-100的0.1N HCl将胚胎处理15分钟。用含有0.1％ BSA的2xSSC洗涤3次后，在玻璃皿(Electron Microscopy Science,705430-30)中将胚胎在15μl的10％甲酰胺/2xSSC中培养。通过轻柔地吸液，所有胚胎均下沉并附着在玻璃皿底部。5分钟后，加入15μl的30％甲酰胺/2xSSC。5分钟后，加入90μl的60％甲酰胺/2xSSC，使得甲酰胺的最终浓度为50％，在室温将胚胎再培养30分钟。用矿物油覆盖含有胚胎的甲酰胺溶液。将样品在80℃加热30分钟，随后转移到37℃培养器中，放置至少30分钟。用剥离吸管将胚胎吸出，转移到另一玻璃皿上的覆盖有矿物油的4.5μL“预退火探针”中，在37℃培养至少24小时。用预热(42℃)的含有0.1％ BSA的2xSSC洗涤胚胎，并在最后一滴中放置30分钟。用1％BSA/PBS洗涤3次后，用具有4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)的Vectashield抗漂洗溶液(VectorLaboratories,Burlingame,CA)将它们封固在载玻片上。在激光扫描共聚焦显微镜ZeissLSM800下检测荧光。
整体免疫染色
免疫染色和量化过程如上文所述。
母系等位基因偏位H3K27me3的计算鉴定
从GEO下载编号GSE76687下的床文件，该文件包括内部细胞团(ICM)中H3K27me3ChIP-seq的100bp存储箱内的RPKM值。将标记为母系或父系的含有两种亲本等位基因和等位基因读取的RPKM值的床文件归一化至总读取数。使用“bedtools makewindows”为mm9基因组生成1000bp存储箱，随后通过“bedtools map”计算每个存储箱的RPKM值。使用信号截止值1和倍变截止值4，将所有存储箱分为三类：无信号、双等位基因、母系偏位。使用滑动窗途径鉴别含有母系偏位H3K27me3存储箱的窗口，标准是窗口尺寸为20kb，最小存储箱数为3，以及母系偏位H3K27me3存储箱的百分比大于50％。使用“bedtools merge”合并重叠的窗口。在基因组中鉴别了总计5986个窗口。
RNA测序
RNA-seq库的制备如上所述，只需略作修改。简单地说，使用全胚胎裂解物和更智能的超低输入RNA cDNA制备试剂盒(Clontech,634890)实施逆转录和cDNA扩增。随后使用以Nextera XT DNA库制备试剂盒(Illumina)进行的Tagmentation将cDNA片段化。根据制造商的说明，使用Nextera PCR反应混合物扩增片段化的cDNA。在HiSeq2500测序仪(Illumina)上实施单端100bp测序。
RNA-seq数据分析
使用STAR(github.com/alexdobin/STAR)将RNA-seq的读取映射到该参考基因组。除非另外指定，否则所用程序均使用默认参数运行。随后，在参考注释(UCSC基因模型)的引导下，使用来自subread-v1.5.1的featureCounts将唯一映射的读取组装为转录物。将库大小归一化之后，使用归一化的FPKM(每百万个映射中，映射到外显子上的每千个碱基上的片段数)将每个基因的表达水平量化。计算基因表达水平的皮尔森相关系数(r)来指示复本间的相关性。
使用R(www.r-project.org/)具体执行统计分析。使用默认参数的“cor”函数计算皮尔森相关系数。使用R函数“boxplot”生成图18A。使用R函数“plot”生成图18B。
代码可用性
基于SNP信息，使用定制管线将杂交RNA-seq数据分割到它们的亲本来源。代码可在github.com/lanjiangboston/UniversalSNPsplit找到。
数据可用性
本研究中生成的RNA-seq数据集均存放到GEO数据库中的登录号GSEXXXXX下。GV卵母细胞的WGBS数据集从www.nodai-genome.org/mouse.html？lang＝en下载。将来自相同的100bp存储箱的WGBS看读取汇集到一起以计算平均甲基化水平，并且要求最少覆盖10次读取。精子、MII卵母细胞、和1细胞胚胎、2细胞胚胎和囊胚内细胞团的SNP追踪母系和父系等位基因的H3K27me3ChIP-seq数据集从以前的研究(GSE76687)下载。卵母细胞DNaseI-seq数据集来自上文(GSE92605)。
其它等效物
从前述说明书明显可见，可对本文所述的发明作出变更和修饰以使其适用于各种用途和条件。此类实施方案也处于权利要求书的范畴内。
本文中的任何变量定义中对一系列元件的叙述包括该变量作为任何单一元件或所列元件的组合(亚组合)的定义。本文中对于实施方案的叙述包括该实施方案作为任何单一实施方案或与其它实施方案或其部分组合。
本说明书中提及的全部专利和出版为通过引用以与各独立专利和出版为被具体且独立地指明为通过引用并入相同的程度并入本文。

Claims (12)

1.一种在体外激活细胞中H3赖氨酸27三甲基化(H3K27me3)依赖性、父系或母系表达印记基因的印记控制区内组蛋白H3K27me3阻遏的等位基因的方法，所述方法包括令所述细胞与组蛋白H3赖氨酸27三甲基化的抑制剂接触，从而激活所述H3K27me3依赖性、父系或母系表达印记基因的印记控制区内H3K27me3阻遏的等位基因，以及其中所述细胞是哺乳动物细胞，其中所述抑制剂是H3K27me3特异性的去甲基酶。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述抑制剂是赖氨酸特异性去甲基酶6A、赖氨酸特异性去甲基酶6B或赖氨酸特异性去甲基酶6C。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是产前或产后的哺乳动物细胞。
4.一种组蛋白H3赖氨酸27三甲基化(H3K27me3)的抑制剂用于制备治疗与Smoc1基因中的突变相关、或与Gab1基因或Sfmbt2基因中的突变相关的疾病或病变的药物的用途，所述Smoc1基因中的突变与伴有肢体异常的小眼畸形(MLA)相关，所述Gab1基因或Sfmbt2基因中的突变与胎盘缺陷相关，其中所述抑制剂是H3K27me3特异性的去甲基酶。
5.根据权利要求4所述的抑制剂，其中所述抑制剂是赖氨酸特异性去甲基酶6A、赖氨酸特异性去甲基酶6B或赖氨酸特异性去甲基酶6C。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述H3K27me3阻遏的等位基因与选自由Rbp2、Runx1、Sfmbt2、Slc38a2、Slc38a4、Gramd1b、Bbx、Sox21、Mbnl2、Prdm11、1700067G17Rik、1700095B10Rik、Mir692-2b、Sh3gl3、Etv6、Tle3、Hunk、Gab1、Matn1、Chst1、Clic6、1700110K17Rik、Foxl1、Mir6241、Otog、1700017J07Rik、4930404H11Rik、Gm5086、Tshz2、Bmp7、G730013B05Rik、Rftn1、G430002E04Rik、Myoz2、Six3os1、Slc38a1、Rbms1、Flt1、Sall3、Otx2os1、1700006F04Rik、2300005B03Rik、4931430N09Rik、Gas7、Phf17、Igsf21、Otx2,Klhdc7a、1700125H03Rik、Lpar3、Mir6239、Epas1、Slc6a1、Cdh26、1700025C18Rik、Prox1、1700121N20Rik、Adamts2、Gadl1、Dnase2b、Inhbb、E2f3、Ajap1、BC049762、Edn3、Enc1、4930465M20Rik、9630028H03Rik、Cd44、Epgn、Syt13、Myb、Lrig3、Fam198b、Smoc1和1700084F23Rik所组成组的基因中的突变有关。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述H3K27me3阻遏的等位基因与选自由Adamts2、Bbx、BC049762、Bmp7、C430002E04Rik、E2f3、Enc1、Epas1、Etv6、Fam198b、G730013B05Rik、Gab1、Gramd1b、Mbnl2、Otx2、Otx2os1、Phf17、Rbms1、Rbp2、Runx1、Sfmbt2、Sh3gl3、Slc38a1、Slc38a2、Slc38a4、Smoc1、Sox21和Tle3所组成组的基因中的突变相关。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述H3K27me3阻遏的等位基因与选自由Sfmbt2、Bbx、C430002E04Rik、Phf17、Slc38a4、Gramd1b、Tle3、E2f3、Smoc1、Sox21、Slc38a1、Runx1、Bmp7、Rnc1、Fam198b、Rbms1、Zrsr1、Impact和Fkbp6所组成组的基因中的突变有关。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述H3K27me3阻遏的等位基因与选自由Sfmbt2、Gab1、Slc38a4和Phf17所组成组的基因中的突变有关。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述H3K27me3阻遏的等位基因与选自由Etv6、17001125H03Rik、Smoc1和Bmp7所组成组的基因中的突变有关。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述H3K27me3阻遏的等位基因与选自由Gab1、Phf17、Sfmbt2、Slc38a4和Smoc1所组成组的基因中的突变有关。
12.根据权利要求1所述的方法，其中一个亲本等位基因包含突变，并且另一个亲本等位基因是野生型等位基因。
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