ES2287239T3 - Vehiculo universal para dirigir moleculas hacia celulas que expresan receptor gb3. - Google Patents

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ES2287239T3 ES02700240T ES02700240T ES2287239T3 ES 2287239 T3 ES2287239 T3 ES 2287239T3 ES 02700240 T ES02700240 T ES 02700240T ES 02700240 T ES02700240 T ES 02700240T ES 2287239 T3 ES2287239 T3 ES 2287239T3
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Universite Pierre et Marie Curie Paris 6
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
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Abstract

Vehículo polipeptídico universal para dirigir una molécula hacia células que expresan receptor Gb3 y que tiene la siguiente fórmula STxB-Z(n)-Cys, en la que: - STxB es la subunidad B de la toxina Shiga o un equivalente funcional de la misma, teniendo dicho equivalente funcional la capacidad de unirse específicamente al receptor Gb3 y/o provocar una internalización de un antígeno y su presentación en una ruta restringida por MHC de clase I, o MHC tanto de clase II como de clase II sobre la misma célula que presenta antígeno, - Z es un aminoácido carente de grupo sulfhidrilo, siendo n 0, 1 o un polipéptido, - Cys es el aminoácido cisteína.

Description

Vehículo universal para dirigir moléculas hacia células que expresan receptor Gb3.
La invención se refiere a un vehículo polipeptídico universal para dirigir moléculas hacia un receptor Gb3 para las células que expresan la subunidad B de la toxina Shiga y su uso para el transporte intracelular y el tratamiento de dichas moléculas.
La toxina Shiga es una toxina bacteriana de la familia de la subunidad AB_{5} que se segrega por Shigella dysenteriae. La subunidad A es el resto tóxico e inhibe la síntesis de la proteína en células diana eucariotas superiores después de transferirse en el citoplasma de dichas células. La subunidad B es una proteína homopentamérica (fragmentos 5B) y es responsable de la unión de la toxina a, e internalización en, células diana mediante la interacción con el glicolípido Gb3 encontrado en las membranas plasmáticas de estas células. El fragmento B no es tóxico, pero conserva las características del transporte intracelular de la holotoxina que, en muchas células que expresan Gb3, se transporta de una manera retrógrada desde las membranas plasmáticas hasta el citosol, a través de
endosomas.
También se ha notificado que el receptor glicolípido Gb3 está expresado preferentemente en algunos tumores derivados ectodérmicos (plasma) y algún linfoma de Burkitt. También se conoce como CD 77. En el presente texto, el término Gb3 debe considerarse como equivalente a CD77.
Los autores ya han mostrado que un antígeno tumoral humano CD8 fusionado a la subunidad B de la toxina Shiga podría presentarse eficazmente de una forma restringida por HLA de clase I frente a CTL específico (1). Este resultado se confirmó independientemente por otro estudio que demostró que la holotoxina Shiga, que lleva un epítopo peptídico definido del virus influenza, puede administrar el antígeno en la ruta intracelular de MHC de clase I (3).
Los autores también han mostrado que las proteínas de fusión entre el fragmento B no tóxico que se une al receptor Gb3 de la toxina Shiga bacteriana derivada de Shigella dysenteriae y un antígeno, o un epítopo de un antígeno tumoral modelo, puede provocar una respuesta de los linfocitos T citotóxicos específica (CTL), mientras que cada resto de dicha proteína de fusión no conduce de manera individual a la inducción de CTL (1, 2 y documento
WO 99/03881).
La dificultad de esta tecnología es que, para cada aplicación, es decir, para cada antígeno o fragmento del mismo, existe una necesidad para una construcción específica de una proteína de fusión, que necesita una construcción específica de un vector recombinante que lleva las secuencias que codifican para esta proteína de fusión que va a expresarse en una célula huésped.
El objetivo de la presente invención es superar los inconvenientes mencionados anteriormente y proporcionar un gancho universal, o un vehículo universal para dirigir una molécula hacia una célula que expresa receptor Gb3 para permitir que esta molécula se internalice, se trate y/o se exprese en dicha célula que expresa receptor Gb3.
En la presente invención, se ha diseñado un derivado de la subunidad B de la toxina Shiga (STxB), o mutante, denominado STxB-Cys. En esta proteína, se añade una cisteína al extremo C terminal de STxB madura. La proteína, cuando se purifica de las bacterias, lleva el puente disulfuro interno, como la STxB de tipo natural, mientras que el grupo sulfhidrilo de la Cys del extremo C terminal está libre. Debido a su carácter nucleófilo, los grupos sulfhidrilo son excelentes aceptores para enfoques de acoplamiento dirigido (4).
Por tanto, la presente invención se refiere a un vehículo polipeptídico universal para dirigir directa o indirectamente una molécula de interés hacia células que expresan receptor Gb3 que tiene la siguiente fórmula: STxB-Z(n)-Cys, en la que:
- STxB es la subunidad B de la toxina Shiga o un equivalente funcional de la misma,
- Z es un aminoácido carente de grupo sulfhidrilo, siendo n 0, 1 o una secuencia de aminoácidos,
- siendo Cys el aminoácido cisteína.
El resto STxB del vehículo universal tiene la secuencia descrita en (8) o un equivalente funcional de la misma. Un equivalente funcional significa una secuencia polipeptídica que tiene la capacidad de unirse específicamente al receptor Gb3 y/o de provocar una internalización de un antígeno y su presentación en una ruta restringida por MHC de clase I, o MHC tanto de clase I como de clase II sobre la misma célula que presenta antígeno.
A la luz de la heterogeneidad de la expresión de antígenos tumorales, la pérdida específica de alelos de la expresión de MHC de clase I en la superficie de células tumorales, la necesidad de tener una presentación concomitante de antígenos por MHC tanto de clase I como de clase II sobre la misma célula que presenta antígeno, resulta ventajoso acoplar proteínas antigénicas de tamaño completo a la subunidad B para la dirección hacia células
dendríticas.
\newpage
En una realización preferida, n es 0 y el vehículo universal tiene la siguiente secuencia (SEQ ID No 1):
COOH-MKKTLLIAASLSFFSASALATPDCVTGKVE
YTKYNDDDTFTVKVGDKELF
TNRWNLQSLLLSAQITGMTVTIKTNACHNGGGFSEVIFRC-NH2
De hecho, si el ligador Z es demasiado largo, es decir, cuando n es igual o superior a 2, pueden producirse algunos puentes disulfuro internos, y evitar la unión de STxB al receptor Gb3 y especialmente evitar la unión a la molécula de interés.
Según la invención, la molécula de interés se selecciona del grupo constituido por proteínas, péptidos, oligopéptidos, glicoproteínas, glicopéptidos, ácidos nucleicos, polinucleótidos, o una combinación de los mismos.
En otro aspecto de la invención, la molécula de interés es un antígeno que va a dirigirse hacia células que presentan antígenos. Tales células se seleccionan de un grupo que comprende linfocitos T, células dendríticas, macrófagos, células de Langerhans y similares.
En otro aspecto de la invención, la molécula de interés son fármacos tales como haptenos, psoralenos, o cualquier compuesto siempre que tengan un grupo químico que puede unirse con el grupo -SH del resto de cisteína de STxB-Cys.
El fármaco puede unirse o bien directamente o bien tras la activación con compuestos tales como bromoacetato, o bien cualquier otro método conocido por un experto, siempre que el resultado de la reacción sea una entidad química que tiene la siguiente fórmula: STxB-Cys-M, siendo M todas las moléculas de interés mencionadas anteriormente.
Los enfoques de acoplamiento para la unión covalente de un resto peptídico o polipeptídico con STxB-Z(n)-Cys puede ser cualquier método o procedimiento descrito o llevado a cabo por un experto.
Un primer método que puede realizarse es el uso del reticulante heterobifuncional SPDP descrito por Carlsson et al (5). Sin embargo, SPDP puede escindirse por tiolasas del suero, lo que es una causa de la disminución del rendimiento de la reacción.
Un segundo método para el acoplamiento covalente de péptidos STxB-Z(n)-Cys con otro péptido de interés es producir funciones bromoacetilo o maleimida sobre éste último tal como describen P. Schelte et al (4). En resumen, el péptido de interés está activado químicamente con anhídrido de bromoacetato o mediante un grupo maleimida respectivamente. En condiciones de reacción apropiadas (pH, temperatura, tiempos de incubación), se eliminan estos grupos
mediante eliminación en cis, dando lugar respectivamente a uniones covalentes -S-S, -S-CH_{2}-, a -S-CO- o a -S-NH-.
Como un ejemplo, el polipéptido o el péptido que va a acoplarse al resto -SH de la cisteína del extremo C terminal del vehículo universal, tiene su extremo N terminal activado con anhídrido bromoacético siguiendo el esquema de reacción:
Br-CH_{2}-CO-O-CO-CH_{2}-Br \hskip0,1cm + \hskip0,1cm NH_{2}-péptido \hskip0,1cm \Rightarrow \hskip0,1cm Br-CH_{2}-CO-NH-péptido \hskip0,1cm + \hskip0,1cm Br-CH_{2}-COOH
La función bromoacetilo tiene una alta quimioselectividad por los grupos tioles de péptidos y puede hacerse reaccionar el péptido activado con STxB-Cys tal como sigue:
STxB-Cys-SH \hskip0,1cm + \hskip0,1cm Br-CH_{2}-CO-NH- péptido \hskip0,1cm \Rightarrow \hskip0,1cm STxB-Cys-S-CH_{2}CO-NH-péptido \hskip0,1cm + \hskip0,1cm HBr
La unión tioéter resultante es estable frente a la hidrólisis.
Otro método para acoplar una molécula al vehículo universal de la invención es usar MBS (éster m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida) tal como se muestra en la figura 6 y se explica en el ejemplo 5. Este acoplamiento permite el transporte y el tratamiento de moléculas grandes tales como proteínas antigénicas o glicoproteínas a través de rutas de MHC de clase I y/o MHC de clase II.
Por tanto, otro aspecto de la invención es el producto resultante de la unión covalente de STxB-Z(n)-Cys con una molécula de interés mediante una unión --S-S-, -S-CO-, o S-CH_{2}- o -S-NH-.
En una realización, la molécula de interés que va a dirigirse hacia células que presentan antígeno está constituida por, o comprende, una estructura polipeptídica, tales como antígenos o epítopos de la misma, glicopéptidos o glicoproteínas, lipopéptidos o lipoproteínas.
En una realización preferida, el producto resultante del acoplamiento de STxB-Z(n)-Cys con un antígeno o un fragmento del mismo, en el que (n) es 0, 1, ó 2, y preferiblemente 0, puede representarse en una ruta restringida por MHC de clase I y MHC de clase II.
En otra realización, la molécula de interés es un polipéptido que puede unirse con estructuras de polinucleótidos tales como moléculas de ADN o ARN. Tales moléculas pueden ser vectores o plásmidos que comprenden una secuencia de interés que va a expresarse en una célula diana. En la presente invención, una célula diana es una célula eucariota que lleva en su membrana el receptor Gb3.
Por tanto, el vehículo universal de la presente invención también es un vehículo para introducir una secuencia de nucleótidos en una célula diana ya sea para terapia génica o para obtener células recombinantes que expresan proteínas heterólogas.
En otra realización, el vehículo universal según la presente invención puede estar operativamente unido directamente a través de una unión covalente o indirectamente a través de un ligador a un fármaco citotóxico que va a dirigirse hacia células tumorales que expresan receptor Gb3.
El término "unión indirecta" significa que el vehículo universal está unido covalentemente a través del resto sulfhidrilo de la cisteína del extremo C terminal a un ligador, estando dicho ligador operativamente unido a un fármaco o un profármaco que va a internalizarse en células que llevan receptor Gb3.
Esta unión puede ser una unión covalente o una unión no covalente, siempre que la afinidad entre el ligador y el fármaco (o el profármaco) sea superior a 10^{-9} moles/l.
Otro aspecto de la invención es un polinucleótido aislado seleccionado del grupo de:
(a) un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos STxB que codifica para la subunidad B de la toxina Shiga o un equivalente funcional de la misma que lleva en su extremo 3' el codon TGT, o el codon TGC que codifica para la cisteína;
b) un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 80% con respecto a una secuencia de nucleótidos que codifica para la subunidad B de la toxina Shiga o un equivalente funcional de la misma que lleva en su extremo 3' el codon TGT o TGC; y
c) una secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia en a) o b).
En una realización preferida, el polinucleótido tiene la siguiente secuencia SEQ ID Nº2:
100
La presente invención también se refiere a un vector recombinante o a un plásmido que comprende una secuencia de polinucleótidos tal como se describió anteriormente, y que puede expresar el vehículo universal STxB-Z(n)-Cys, en el que (n) es 0, 1 ó 2, STxB y Z tienen el mismo significado que anteriormente, en una célula huésped apropiada.
Como un ejemplo, se describe en (7) un vector oportuno que es el plásmido pSu108.
Otro objetivo de la presente invención es proporcionar un método para obtener un plásmido que expresa STxB-Z(n)-Cys que comprende:
a) proporcionar un plásmido que comprende una secuencia de STxB;
b) aplicar dos etapas de amplificación de PCR usando dos parejas de cebadores, AA' y BB',
\quad
- siendo A y B complementarios entre sí y comprendiendo el codon de Cys,
\quad
- estando A' y B' fuera de la secuencia de STxB;
c) aislar los fragmentos amplificados;
d) hibridar los fragmentos amplificados;
e) aplicar una amplificación de PCR sobre los fragmentos hibridados;
f) la inserción del fragmento amplificado en un plásmido.
En una realización preferida, se modificó el plásmido pSU108 (7) que contenía fragmento de STxB para introducir el codon de cisteína TGT en el extremo 3' del ADNc del fragmento B. Los cebadores para la etapa b) son para AA' y BB' respectivamente:
- cebador A: 5'-AGCGAAGTTATTTTTCGTTGTTGACTCAGAATAGCTC-3' (SEQ ID 3), y
- cebador B: 5'-GAGCTATTCTGAGTCAACACGAAAAATAACTTC-3' (SEQ ID nº 4).
- cebador A': cebador ShigaAtpE: 5'-CACTACTACGTTTTAAC-3' (SEQ ID nº 5), y
- cebador B': cebador Shiga-fd: 5'-CGGCGCAACTATCGG-3' (SEQ ID nº 6).
La PCR de la etapa e) produce un fragmento que se clona en los sitios de restricción de Sphl y Sall de pSU108. Se verifican las secuencias derivadas por PCR mediante secuenciación didesoxi.
El experto puede diseñar fácilmente la elección de cebadores, plásmidos para producir un vector que lleva la secuencia de polinucleótidos que expresa STxB-Z(n)-Cys en una célula huésped apropiada, siempre que esta sucesión de etapas permita la interpretación del codon de Cys en el fragmento amplificado.
La invención también proporciona una línea celular recombinante obtenida mediante la transformación con el vector recombinante que contiene la secuencia de polipéptidos que codifican para el vehículo universal tal como se describió anteriormente. En una realización preferida, dicha línea celular recombinante es una célula procariota, preferentemente E. coli.
En una realización todavía preferida, el plásmido es pSU108 que tiene la SEQ ID No. 2 integrada entre los sitios de restricción de Sphl y Sall, y se ha depositado la correspondiente línea celular en la CNCM el 19 de diciembre de 2000 con el número de registro 1-2604.
La presente invención también proporciona un procedimiento para producir un vehículo universal tal como se describió anteriormente que comprende:
a) cultivar una línea celular recombinante tal como se describió anteriormente,
b) obtener un extracto periplasmático de dichas células, y
c) purificar dicho polipéptido.
Preferentemente, la línea celular es E. coli y en c) se realiza la purificación mediante cromatografía en columna de intercambio aniónico seguida por una cromatografía en columna de filtración en gel.
Un procedimiento de este tipo es particularmente ventajoso para la producción a gran escala del vehículo universal, siempre que pueda entonces unirse operativamente mediante acoplamiento covalente con una molécula de interés, y usarse en un gran alcance de aplicación.
La presente invención también proporciona un método para administrar una secuencia de interés en la ruta del MHC de clase I usando un producto obtenido mediante la unión covalente del resto Cys del vehículo universal con dicha secuencia de interés; este método es ventajoso para provocar una respuesta de CTL frente a un antígeno dado o un epítopo del mismo siempre que el producto sea específico para la célula implicada en la ruta del MHC de clase I.
De hecho, los inventores han mostrado que un péptido inmunodominante, derivado de la proteína ovoalbúmina, y acoplado químicamente a STxB-Cys, podría presentarse mediante células que presentan antígeno frente a células de hibridoma específicas, demostrando que STxB podría administrar péptido inmunogénico exógeno en la ruta del MHC de clase I. Para excluir un sesgo debido a la presencia de péptidos libres que contaminan el material, los experimentos que usan células dendríticas, fijas, demostraron claramente que la internalización de la proteína de fusión era necesaria para este procedimiento. Los inventores también han mostrado que el receptor de la toxina Shiga, Gb_{3}, también estaba implicado en la capacidad de STxB-Cys para dirigir péptido exógeno en la ruta del MHC de clase I endógena.
La invención también se refiere a un método para administrar un vector de expresión que contiene una secuencia de interés en las células que expresan receptor Gb3 caracterizado porque dicho vector de expresión está unido a un péptido rico en lisina unido covalentemente al resto de Cys del vehículo universal.
Como un ejemplo, el péptido rico en lisina es una polilisina de 16 monómeros que puede unirse a cualquier secuencia polinucleotídica de naturaleza o bien de ADN o bien de ARN. Un péptido de este tipo que lleva 16 monómeros de lisina se activará en su extremo N terminal por anhídrido de bromoacetato y se acoplará a STxB-Cys. Los plásmidos de expresión se unirán a este producto de acoplamiento, y se evalúa la vectorización de ADN en células diana usando sistemas indicadores oportunos, tales como la proteína fluorescente verde o luciferasa.
Se espera que la capacidad para dirigir plásmidos de expresión con la ayuda de STxB hacia el núcleo de las células que presentan antígeno mejore adicionalmente la potencia de este vector, dado que i) ADN puede adoptarse incluso más fácilmente a nuevas necesidades clínicas o experimentales, y ii) debido a su efecto de potenciación, la expresión de péptidos antigénicos o proteínas a partir de ADN aumentaría adicionalmente la sensibilidad de la presentación de antígeno dependiente de STxB.
La invención también proporciona un método para administrar un fármaco o un profármaco en una célula, particularmente en una célula cancerosa que lleva receptor Gb3 (o CD77).
Se ha notificado que el receptor glicolípido Gb3 está preferentemente expresado en algunos tumores derivados neuroectodérmicos (glioma) y algún linfoma de Burkitt. Dado que una limitación del uso de la quimioterapia en el cáncer son los efectos secundarios de los fármacos debido a su toxicidad en células normales, preferentemente se vectorizan los fármacos en células tumorales usando STxB-Cys. Se activan los fármacos para volverlos reactivos con el grupo sulfhidrilo de STxB-Cys. Para lograr esto, puede introducirse un grupo maleimida en un fármaco, por ejemplo compuestos de psoralenos.
La presente invención también se refiere a:
- una composición farmacéutica para potenciar la inmunogenicidad de un péptido o una proteína o una glicoproteína o un lipopéptido, que contiene el vehículo universal unido covalentemente por su resto de Cys a dicho péptido o proteína o glicoproteína o lipopéptido;
- una composición farmacéutica para tratar células tumorales que llevan el receptor Gb3 (CD77), que contienen el vehículo universal según la invención unido covalentemente por su resto de Cys a un fármaco o un profármaco tóxico para dichas células tumorales.
Sin limitar el alcance del vehículo universal de la invención y su uso generalizado en diferentes aplicaciones, los ejemplos y las figuras a continuación en el presente documento ilustran las ventajas de la presente invención.
Leyendas de las figuras
La figura 1 representa el perfil de proteína de la columna SephaDex 75 final que produce STxB-Cys purificado. Las fracciones 20-25 contienen principalmente STxB-Cys monomérico (se indican las posiciones de STxB-Cys monomérico y dimérico a la derecha). Se indican los marcadores de peso molecular a la izquierda.
La figura 2a representa el acoplamiento del tipo 2 de Pep2 [tal como se define en el ejemplo 2] a STxB-Cys, seguido por un ensayo de presentación de antígeno in vitro sobre células dendríticas D1, tal como se describe en (2). Se usaron dos preparaciones diferentes de STxB-Cys acoplado al péptido SL8, un epítopo inmunodominante de ovoalbúmina (denominados 4A y 9A). Tras la fijación, se suprime la presentación de antígeno demostrando que no se producía ningún tratamiento extracelular.
La figura 2b representa un experimento control de la figura 2a, en la que se muestra que las D1 fijadas todavía puedes presentar péptido SL8 libre.
La figura 3 representa otro experimento sobre células D1 fijas y no fijas usando una reacción de acoplamiento de tipo 1 sobre STxB-SH y Pep1 [tal como se define en el ejemplo 2].
La figura 4 representa la presentación dependiente de subunidad B de péptidos antigénicos derivados de un acoplamiento de Pep2 a B-Glyc-Cys-KDEL. El uso de fragmentos Fab de un anticuerpo que neutraliza la unión de STxB a Gb3 también suprime la presentación de antígeno.
La figura 5 muestra que el inhibidor de la síntesis de Gb3, PPMP, inhibe la presentación de antígeno dependiente de subunidad B (5a) y que la presentación de SL8 no disminuye en células tratadas con PPMP.
La figura 6 representa el esquema de reacción para el acoplamiento de Ova de tamaño completo a STxB-Cys usando el reticulador heterobifuncional MBS. Arriba: primera reacción que une MBS a las aminas primarias de Ova. Medio: segunda reacción entre Ova activada y STxB-Cys. Abajo: estructura de MBS.
La figura 7 muestra el análisis de inmunotransferencia del acoplamiento de Ova a STxB-Cys. La parte superior de la figura representa una inmunotransferencia usando el anticuerpo anti-STxB, la parte inferior una inmunotransferencia usando anticuerpo anti-Ova. Se muestran los productos intermedios de las diferentes etapas del procedimiento de purificación. Carril 1: proteínas no acopladas (marcadas mediante una cruz). Carril 2: reacción de acoplamiento (producto de acoplamiento marcado mediante una flecha). Carril 3: eluato de la columna de inmunoafinidad dotada con el anticuerpo anti-STxB. Carriles 4-7: fracciones de la columna de filtración en gel. Carril 4: fracciones 9-10. Carril 5: fracciones 11-12. Carril 6: fracciones 13-14. Carril 7: fracciones 15-19 (STxB-Cys libre). Las fracciones 11-12 contienen la mayor parte del producto de acoplamiento monomérico. También puede detectarse algo de material con movilidad electroforética inferior, generado probablemente de Ova dimérica presente en la preparación
original.
La figura 8 representa un análisis de inmunofluorescencia del transporte de STxB-Cys-Ova en células HeLa. Se incubaron el producto de acoplamiento STxB-Cys-Ova (parte superior de la figura) o una mezcla de STxB-Cys y Ova (parte inferior de la figura) con células HeLa en hielo. Después del lavado, se desplazaron las células durante 45 min hasta 37ºC, se fijaron, y se tiñeron con los anticuerpos indicados. Obsérvese que cuando Ova está unida a STxB-Cys (arriba), se vectoriza la proteína en el aparato de Golgi, teñida de manera conjunta para el marcador de Golgi Rab6. Si Ova sólo se mezcla con STxB-Cys (abajo), no puede detectarse la proteína en las células.
La figura 9 muestra la presentación de antígeno restringida por MHC de clase I y II inducida por la incubación de células D1 con STxBCys-Ova. Véase el texto para detalles.
Ejemplo 1 Preparación del vehículo universal a) Construcción de un plásmido que expresa STxB-Cys
En una realización preferida, se modificó el plásmido pSU108 (7) para introducir el codon de cisteína tgt en el extremo 3' del ADNc del fragmento B. Se usaron cebador A de PCR: SEQ ID nº3 (5'-AGCGAAGTTATTTTTCGTTGTT
GACTCAGAATAGCTC-3') y cebador A': SEQ ID nº 4 (5'-GAGCTATTCTGAGTCAACACGAAAAATAACTTC-3') con cebadores específicos de plásmido ShigaAtpE: SEQ ID nº 5 (5'-CACTACTACGTTTTAAC-3') y Shiga-fd: SEQ ID nº 6 (5'-CGGCGCAACTATCGG-3') para producir fragmentos de ADN que, en una segunda PCR con cebadores Shiga AtpE y Shiga-fd produjeron un fragmento que se clonó en los sitios de restricción de Sphl y Sal1 de pSU108. Se verificaron las secuencias derivadas por PCR mediante secuenciación didesoxi.
b) Purificación de proteína
b) 1. Se realizó la preparación del extracto periplasmático tal como sigue:
\quad
- Inocular 125 ml de LB/Amp con 125 \mul de un cultivo crecido durante la noche a 30ºC,
\quad
- crecer durante la noche a 30ºC,
\quad
- transferir en 375 ml de LB/Amp a 50ºC; incubar 4 horas a 42ºC,
\quad
- centrifugar para sedimentar las células,
\quad
- lavar 3 veces las células con Tris/HCl 10 mM, pH 8,0,
\quad
- resuspender las células en 200 ml de sacarosa al 25%, EDTA 1 mM, Tris/HC1 10mM, pH 8,0; incubar a {}\hskip0,15cm temperatura ambiente durante 10 min.,
\quad
- centrifugar para sedimentar las células,
\quad
- resuspender las células en 200 ml de agua muy fría que contiene un cóctel inhibidor de proteasa; incubar en {}\hskip0,15cm hielo durante 10 min.,
\quad
- centrifugar; recoger el sobrenadante; añadir Tris/HCl 20 mM, pH 8,0.
b) 2. Purificación en columnas
Se cargó el extracto periplasmático en una columna de intercambiadora de aniones QFF (pharmacia) y se eluyó a NaCl 230 mM. Se juntaron las fracciones que contienen STxB-Cys, se diluyeron 4 veces y se cargaron en una columna intercambiadora de aniones Mono Q (pharmacia), seguido por elución a NaCl 230 mM. Tras la concentración con dispositivos de microconcentración de PallFiltron, se pasaron las fracciones juntadas a través de una columna de filtración en gel Sephadex 75. La pureza era superior al 95% (figura 1).
\newpage
b) 3. Caracterización del producto
Los fragmentos B de STxB-Cys, purificados de las columnas de filtración en gel Sephadex 75, son esencialmente monoméricos (figura 1). Esto es en clara diferencia a las construcciones en las que se añadía la cisteína a más de 2 aminoácidos del extremo C terminal natural del fragmento B. En estos casos, los fragmentos B vecinos en un pentámero están conectados en puentes disulfuro.
Ejemplo 2 Condiciones para el acoplamiento de péptidos activados al vehículo universal a) Vehículos
Se han comparado tres vehículos diferentes.
1) STxB-Cys: fragmento B al que se ha añadido una Cys justo en su extremo C terminal. Esta proteína se eluye como un monómero de las columnas de purificación.
2) STxB-Z_{2}-Cys: vehículo con un espaciador corto (2 aminoácidos que resultan de un casete de clonación) entre el extremo C terminal del fragmento B de tipo natural y la Cys. La mayoría de la proteína se eluyó como dímeros de las columnas de purificación. Éstos pueden separarse en condiciones reductoras, indicando la formación de enlaces disulfuro entre monómeros en el complejo de la subunidad B pentamérico.
3) STxB-Glyc-Cys-KDEL: vehículo en el que la Cys está localizada entre un casete de glicosilación que tiene una longitud de 9 aminoácidos y un péptido KDEL del extremo C terminal. La mayoría de la proteína se eluyó como dímeros a partir de las columnas de purificación. Éstos pueden separarse en condiciones reductoras, indicando la formación de enlaces disulfuro entre los monómeros en el complejo de subunidad B pentamérico.
b) Péptidos de prueba
1) Pep1: un péptido sintético de 16 aminoácidos que lleva el péptido antigénico SL8 derivado de ovoalbúmina de gallina.
2) Pep2: un péptido sintético de 24 aminoácidos tal como anteriormente con, además, una etiqueta His en su extremo C terminal.
3) SL8: el péptido antigénico de ovoalbúmina que puede intercambiarse directamente con los péptidos en complejos de MHC de clase I en la membrana plasmática de las células que presentan antígeno.
c) Condiciones de acoplamiento
En condiciones reductoras (Tipo 1): Se trataron proteínas de fusión con DTT durante la noche, después se añadió en exceso el péptido activado (que lleva un grupo bromoacetato en su extremo N terminal). Las condiciones usadas para los primeros experimentos de acoplamiento usando proteínas de fusión principalmente dimerizarán monómeros (proteínas STxB-Z_{2}-Cys y STxB-Glyc-Cys-KDEL).
En condiciones no reductoras (Tipo 2): Se hacen reaccionar directamente proteínas de fusión con los péptidos activados.
d) Controles bioquímicos y morfológicos
Pep2 lleva una etiqueta His: Esto ha permitido a los investigadores, usando un anticuerpo anti-His, mostrar la presencia de Pep2 en la subunidad B mediante inmunotransferencia, y el transporte dependiente de la subunidad B de Pep2 en las células HeLa.
La figura 2a muestra que se observó una estimulación dependiente de la dosis del hibridoma B3Z de CTL (medición de la actividad de \beta-galactosidasa) con células no fijadas, mientras que la fijación suprimía la presentación de antígeno.
Obsérvese que la presentación de antígeno sólo funciona en células no fijadas, lo que indica que la presentación observada no resulta de la contaminación de Pep2 libre.
La figura 2b muestra el experimento de control de la figura 2a en el que se muestra que las células D1 fijas todavía pueden presentar péptido SL8 libre.
En la figura 3, parece que en este tipo de protocolo, algunos Pep1 libres parecen purificarse de manera conjunta con la proteína de fusión, dado que a dosis altas (200-1000 nM), se observó algo de presentación en células fijadas. Se muestra la presentación mediante SL8 a la derecha.
En la figura 4, se incubaron (carriles 2 y 5) o no (carriles 1 y 4) la proteína acoplada (carriles 1 y 2) o el péptido SL8 (carriles 5 y 6) con el fragmento Fab anti-subunidad B derivado del anticuerpo 13C4 que inhibe la unión de la subunidad B a Gb3. Obsérvese que el fragmento Fab neutraliza la capacidad de la subunidad B para introducir el péptido antigénico en la ruta de clase I, mientras que la presentación con SL8 no se ve afectada en estas condiciones. La señal de fondo en este experimento fue de 0,3.
En la figura 5a, se pretrataron las células D_{1} con PPMP (véase la figura 3b de (2)) durante 3 días. Este tratamiento condujo a un importante descenso de la expresión de Gb3 en la superficie de la célula, sin embargo sin eliminarlo completamente. En esta condición, la presentación de antígeno a partir de una reacción de acoplamiento de Pep1 con STxB-Glyc-Cys-KDEL se redujo significativamente, lo que indica que Gb3 es importante para los fenómenos de presentación.
A partir de todos estos experimentos parece que el acoplamiento en condiciones no reductoras con STxB-Cys es sorprendentemente eficaz (en términos de sensibilidad; obsérvese que, tal como se muestra en la figura 1, sólo son necesarios 4 nM de STxB-Cys-Pep2 para tener una respuesta). Por tanto, se prefiere el vehículo universal STxB-Cys debido a su simplicidad en su preparación y a la reproducibilidad del acoplamiento.
Por tanto, las condiciones óptimas para el acoplamiento de péptidos activados a STxB-Cys fueron las siguientes:
- dializar STxB-Cys contra tampón borato 20 mM, pH 9,0, NaCl 150 mM,
- concentrar hasta 1 mg/ml,
- disolver el péptido activado en el extremo N terminal (activado con anhídrido de bromoacetato) a 12 mM en DMSO,
- diluir el péptido hasta 0,2 mM en disolución de proteína,
- incubar 12 horas a temperatura ambiente,
- dializar contra PBS.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 3 Caracterización de STxB con respecto a su capacidad de presentación de antígeno
Las siguientes series experimentales ayudarán a describir totalmente la capacidad de STxB para funcionar en un sistema de presentación de antígeno.
a) Presentación de antígeno restringida por clase I y clase II
Un péptido que lleva péptidos antigénicos restringidos por clase I y II de ovoalbúmina de gallina (Br-CH2-CO-NH-LEQLESIINFEKLTEWSLKISQAVHAAHAEINEAGR, secuencias 257-264 y 323-339 se acoplaron las secuencias 257-264 y 323-339 con STxB-Cys, y se evaluó la presentación restringida por clase I y clase II de estos péptidos usando los hibridomas de célula T correspondientes.
b) Acoplamiento de proteínas de tamaño completo
Las pruebas preliminares de los investigadores sugieren que la ovoalbúmina de gallina puede acoplarse a STxB-Cys. Se han realizado estos experimentos con el reticulante heterobifuncional SPDP. (Carlsson et al., 1978).
Una primera serie de experimentos de presentación de antígeno indicó que puede introducirse la proteína ovoalbúmina en la ruta de presentación de antígeno restringida por MHC de clase I endógena de células dendríticas de ratón. SPDP tiene el inconveniente de ser escindible por tiolasas del suero. Se sustituyó satisfactoriamente este reticulante por MBS que no es escindible. Se someten a prueba otras proteínas antigénicas (Mart 1 y polipéptidos derivados de VPH16-E7 y Muc1) para mostrar que el procedimiento es de uso universal.
c) Acoplamiento de mezclas de proteína complejas
Se usa un lisado de la línea celular derivada del carcinoma de cuello uterino Caski. Esta línea celular de carcinoma de cuello uterino, que expresa el alelo HLA-A2 en su membrana, también expresa péptidos derivados del virus del papiloma humano. E7 es una ORF (estructura de lectura abierta) transcrita de manera temprana a partir del VPH que es necesario para la transformación de queratinocitos primarios. Dado que se obtienen in vitro CTL restringidos por HLA A2 anti-E7, se sometió a prueba la eficacia del acoplamiento de esta mezcla de proteínas mediante un ensayo de presentación específico para péptidos derivados de HLA-A2 E7. Como control, se acopló un lisado de la línea celular positiva para HLA-A2 que no expresa E7 (células Croft o Daudi) a STxB-lys.
Ejemplo 4 Aplicación a presentación de antígeno restringida por MHC de clase I
El experimento de la figura 4 muestra que la presentación de antígeno dependiente de STxB-Cys se inhibe cuando se suprime la interacción con Gb_{3}. Aquí se encuentra que la unión previa del fragmento Fab del Ac monoclonal contra STxB con STxB-Cys 0,1 \muM, acoplado a SL8, inhibe la presentación de antígeno, lo que sugiere que la unión de STxB-Cys a Gb_{3} es necesaria para la presentación de antígeno. Se obtuvieron resultados similares cuando se inhibió la expresión de Gb_{3} con un fármaco (figura 4).
Ejemplo 5 Cadena de reacción para el acoplamiento de ovoalbúmina a STxB-Cys
Se muestra el esquema de reacción en la figura 6.
En una primera reacción, el resto de éster N-hidroxisuccinimida de MBS reacciona con las aminas primarias sobre una proteína diana antigénica, tal como la proteína modelo de ovoalbúmina (Ova). Se purifica el producto de reacción y después se incuba en una segunda reacción con STxB-Cys conduciendo al acoplamiento a través del resto maleimidobenzoilo.
La figura 7 muestra el análisis por SDS-PAGE y inmunotransferencia de una reacción de acoplamiento típica que implica STxB-Cys y Ova. Para el acoplamiento, se incubaron 20 mg/ml de Ova en HEPES 100 mM, pH 7,4, con MBS 4,5 mM durante 30 min a temperatura ambiente. Se pasó la reacción a través de una columna de filtración en gel equilibrada de PBS/EDTA 10 mM. Se concentró la Ova eluída hasta 20 mg/ml. Se mezcló 1 volumen de STxB-Cys a 3,5 mg/ml en PBS/EDTA con 1 volumen de Ova activada y se incubó durante la noche a temperatura ambiente.
La figura 7 muestra que en la reacción de acoplamiento, pueden detectarse las bandas con menor movilidad electroforética (marcadas con flechas; producto de acoplamiento) además de STxB no acoplada (parte superior) y Ova no acoplada (parte inferior; proteínas no acopladas están marcadas con una cruz). Se purificó el producto de reacción mediante el paso a través de una columna de inmunoafinidad preparada con anticuerpo monoclonal anti-STxB 13C4 (columna IP de carril). Obsérvese que se elimina la Ova libre. El STxB-Cys eluído (acoplado y no acoplado) se pasó entonces a través de una columna de filtración en gel para separar STxB libre (fracciones 15-19) de STxB-Cys acoplado (fracciones 9-14; obsérvese que las fracciones 11-12 contienen la mayor parte de la proteína acoplada; la banda de acoplamiento superior, que es menor comparada con la banda inferior, probablemente resulta de Ova dimérica).
Ejemplo 6 Características de transporte intracelular del producto de acoplamiento STxB-Cys-Ova
Se incubaron 0,5 \muM de STxB-Cys-Ova con células HeLa en hielo. Se lavaron las células y se desplazaron hasta 37ºC durante 45 min, se fijaron, y se tiñeron para los anticuerpos indicados. Tal como se muestra en la figura 8, cuando se unieron STxB-Cys y Ova por MBS, pudo detectarse la inmunorreactividad de Ova junto con la inmunorreactividad de STxB en el aparato de Golgi, teñido por Rab6. Cuando se incubaron ambas proteínas como entidades separadas con células HeLa, sólo se transportó STxB-Cys al Golgi, mientras que no pudo detectarse Ova en las células. Estos datos muestran claramente que STxB-Cys acoplado todavía se transporta de la misma manera que STxB-Cys no acoplado, y que Ova se vectoriza a través de STxB-Cys.
Ejemplo 7 El STxB-Cys permite la presentación restringida por MHC tanto de clase I como II de péptidos derivados de proteínas antigénicas exógenas de tamaño completo
En un primer experimento (figura 9, izquierda), los investigadores han encontrado que cuando se usa STxB-Cys-Ova para sensibilizar la línea celular dendrítica murina D1, se observa un claro aumento del péptido derivado de Ova restringido por MHC de clase II Ova_{323-339}, comparado con células D1 pulsadas con Ova no vectorizada. De hecho, podría detectarse un presentación significativa de péptido Ova_{323-339} con tan poco como 0,01 nM de STxB-Cys-Ova, mientras que fueron necesarios 10 nM de Ova de tamaño completo para una presentación eficaz del mismo péptido. Se reveló la presentación del péptido Ova_{323-339} restringido por IA^{b} usando el hibridoma B097.10 que produce IL-2 después del reconocimiento de este péptido. Como control, no se observó segregación de IL-2 cuando se usó un hibridoma restringido por MHC de clase II irrelevante en lugar de B097.10 (datos no mostrados).
En un segundo experimento, los investigadores pulsaron la misma línea celular restringida por H2^{b} dendrítica D1 con o bien Ova sola o bien con STxB-Cys-Ova. No se observó péptido SL8 inmunodominante derivado de Ova (Ova_{257-264}) cuando se sensibilizaron las células D1 con hasta 100 nM de Ova libre, mientras que 1-10 nM de STxB-Cys-Ova permitieron la presentación del péptido SL8, tal como se reveló mediante el hibridoma B3Z específico que reconoce el péptido SL8 en el contexto de moléculas K^{b}. Como control, se mostró que no se observó activación de un hibridoma irrelevante en las mismas condiciones experimentales.
En general, estos resultados claramente demuestran que STxB-Cys dirige proteínas de tamaño completo con alta eficacia en ambas rutas de MHC de clase I y de clase II.
Bibliografía
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<110> INSTITUTO CURIE
\hskip1cm CENTRO NACIONAL DE LA INVESTIGACIÓN CIENTÍFICA
\hskip1cm INSTITUTO NACIONAL DE LA SALUD Y DE LA INVESTIGACIÓN M
\hskip1cm UNIVERSIDAD PIERRE ET MARIE CURIE (PARIS VI)
\vskip0.400000\baselineskip
<120> VEHÍCULO UNIVERSAL PARA DIRIGIR MOLÉCULAS HACIA CÉLULAS QUE EXPRESAN RECEPTOR Gb3
\vskip0.400000\baselineskip
<130> B4719A - FL/SDU (Institut Curie et al)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> PCT/EP 02/01627
\vskip0.400000\baselineskip
<141> 01-02-2002
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> EP 01400255.4
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 2001-02-01
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 90
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial: vehículo universal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
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101 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
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<211> 270
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial: Polinucleótido
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
102 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
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<211> 37
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Cebador A
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
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\hskip-.1em\dddseqskip
agcgaagtta tttttcgttg ttgactcaga atagctc 
\hfill
37 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
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<211> 33
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: Cebador B
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
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\hskip-.1em\dddseqskip
gagctattct gagtcaacac gaaaaataac ttc 
\hfill
33 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
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<211> 17
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Cebador A'
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
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<222> (1)..(17)
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<223> Cebador ShigaAtpE
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<400> 5
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\hskip-.1em\dddseqskip
cactactacg ttttaac 
\hfill
17 
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<210> 6
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<211> 15
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Cebador B'
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<220>
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<221> misc_feature
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<222> (1)..(15)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador Shiga-fd
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cggcgcaact atcgg 
\hfill
15

Claims (24)

1. Vehículo polipeptídico universal para dirigir una molécula hacia células que expresan receptor Gb3 y que tiene la siguiente fórmula STxB-Z(n)-Cys, en la que:
- STxB es la subunidad B de la toxina Shiga o un equivalente funcional de la misma, teniendo dicho equivalente funcional la capacidad de unirse específicamente al receptor Gb3 y/o provocar una internalización de un antígeno y su presentación en una ruta restringida por MHC de clase I, o MHC tanto de clase II como de clase II sobre la misma célula que presenta antígeno,
- Z es un aminoácido carente de grupo sulfhidrilo, siendo n 0, 1 o un polipéptido,
- Cys es el aminoácido cisteína.
2. Vehículo universal según la reivindicación 1, en el que n es 0.
3. Vehículo universal según la reivindicación 1 ó 2 unido a una molécula, en el que la molécula se selecciona del grupo constituido por proteínas, péptidos, oligopéptidos, glicoproteínas, glicopéptidos, ácidos nucleicos, polinucleótidos, o una combinación de los mismos.
4. Vehículo universal según la reivindicación 1 ó 2 unido a una molécula, en el que la molécula está unida covalentemente al residuo -S del vehículo universal mediante una unión -S-S-, o -S-CO-, o -S-CH_{2}-, o -S-NH-.
5. Vehículo universal según la reivindicación 4, en el que la molécula es un antígeno que va a dirigirse hacia células que presentan antígeno.
6. Vehículo universal según la reivindicación 1 ó 2, en el que el vehículo universal está unido covalentemente a un oligopéptido o un polipéptido mediante una unión - S-S-, o -S-CO-, o -S-CH_{2}- o -S-NH-, y la molécula que va a dirigirse está unida a dicho oligopéptido o polipéptido.
7. Vehículo universal según la reivindicación 6, caracterizado porque está unido covalentemente a un oligopéptido de polilisina y la molécula que va a dirigirse es un ácido nucleico o un oligonucleótido unido a dicho resto de polilisina.
8. Vehículo universal según la reivindicación 4, en el que la molécula es un fármaco citotóxico o profármaco que va a dirigirse a células tumorales que expresan receptor Gb3.
9. Polinucleótido aislado seleccionado del grupo que consiste en:
a) un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos STxB que codifica para la subunidad B de la toxina Shiga o un equivalente funcional de la misma que lleva en su extremo 3' el codon TGT, o el codon TGC que codifica para cisteína, teniendo dicho equivalente funcional la capacidad de unirse específicamente al receptor Gb3 y/o provocar una internalización de un antígeno y su presentación en una ruta restringida por MHC de clase I, o MHC tanto de clase I como de clase II en la misma célula que presenta antígeno,
b) una secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia en a).
10. Un polinucleótido según la reivindicación 9 que tiene la SEQ ID NO 2.
11. Vector recombinante, o plásmido, que comprende una secuencia de polinucleótidos según la reivindicación 9 ó 10, para la expresión del vector universal según la reivindicación 1 en una célula huésped apropiada.
12. Línea celular recombinante obtenida mediante la transformación con el vector recombinante según la reivindicación 11.
13. Línea celular recombinante según la reivindicación 12, siendo una línea celular procariota.
14. Línea celular recombinante según la reivindicación 12 ó 13, depositada en la CNCM el 19 de diciembre de 2000, con el número de registro I-2604.
15. Método para construir un vector recombinante según la reivindicación 11, que comprende:
a) proporcionar un plásmido que comprende una secuencia de STxB;
b) aplicar dos etapas de amplificación de PCR usando dos parejas de cebadores, AA' y BB',
\quad
- siendo A y B complementarios entre sí y comprendiendo el codon de Cys,
\quad
- estando A' y B' fuera de la secuencia de STxB;
c) aislar los fragmentos amplificados;
d) hibridar los fragmentos amplificados;
e) aplicar una amplificación de PCR sobre los fragmentos hibridados;
f) la inserción del fragmento amplificado en un plásmido.
16. Método según la reivindicación 15, en el que en la etapa f) el fragmento se inserta en el sitio de restricción de Sphl y Sall del plásmido pSU108.
17. Procedimiento para producir un vehículo polipeptídico según la reivindicación 1 que comprende:
a) cultivar la línea celular según una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14,
b) obtener un extracto periplasmático de dichas células
c) purificar dicho polipéptido.
18. Procedimiento según la reivindicación 17, en el que en a), la línea celular es E. coli y en c) la purificación se realiza mediante cromatografía en columna de intercambio aniónico seguido por una cromatografía en columna de filtración en gel.
19. Producto obtenido mediante la unión covalente del resto de Cys del vehículo polipeptídico universal según la reivindicación 1, con una secuencia de interés, para su uso para la administración de dicha secuencia de interés en la ruta de MHC de clase I y MHC de clase II.
20. Vector de expresión que contiene una secuencia de interés y operativamente unido al péptido rico en lisina unido covalentemente al resto de Cys del vehículo polipeptídico universal según la reivindicación 1 para su uso en la administración de dicha secuencia de interés en células que expresan receptor Gb3.
21. Vector de expresión según la reivindicación 20, en el que el péptido rico en lisina es una polilisina de 16 monómeros.
22. Producto según la reivindicación 19 o vector de expresión según las reivindicaciones 20 y 21, en el que la secuencia de interés se selecciona entre:
-
una secuencia que codifica para un péptido inmunogénico, o
-
una secuencia que codifica para un fármaco o un profármaco volviéndose tóxico para las células que expresan receptor Gb3, o
-
una secuencia que codifica para una molécula activa terapéutica.
23. Composición farmacéutica para potenciar la inmunogenicidad de un péptido o una proteína o una glicoproteína o un lipopéptido, que contiene el vehículo polipeptídico según la reivindicación 1 ó 2, unido covalentemente por su resto de Cys a dicho péptido o proteína o glicoproteína o lipopéptido.
24. Composición farmacéutica para tratar células tumorales que llevan el receptor Gb3, que contiene el vehículo polipeptídico según la reivindicación 1 ó 2, unido covalentemente por su resto de Cys a un fármaco o un profármaco tóxico para dichas células tumorales.
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