PT1355928E - Transportador universal para dirigir moléculas para células que expressam o receptor gb3 - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "Transportador universal para dirigir moléculas para células que expressam o receptor Gb3" 0 invento refere-se a um transportador polipeptídico universal para dirigir moléculas para um receptor Gb3 em células que expressam a subunidade B de toxina Shiga e sua utilização para transporte intracelular e processamento das referidas moléculas. A toxina Shiga é uma toxina bacteriana da família de subunidades AB5 que é excretada por Shigella dysenteriae. A subunidade A é a porção tóxica e inibe síntese de proteínas em células alvo eucarióticas superiores após transferência para o citoplasma das referidas células. A subunidade B é uma proteína homopentamérica (5B - fragmentos) e é responsável por ligação de toxina a células alvo e sua internalização por interacção com o glicolípido Gb3 presente nas membranas plasmáticas dessas células. 0 fragmento B não é tóxico mas conserva as características de transporte intracelular da holotoxina que, em muitas células que expressam Gb3 é transportada de modo retrógrado das membranas plasmáticas para o citosol através de endossomas.

Também se relatou que o receptor glicolipídico Gb3 se expressava de preferência em alguns tumores derivados de ectoderme (plasma) e em alguns linfomas de Burkitt. É também conhecido como CD 77. No presente texto a expressão Gb3 deve ser considerada como uma equivalente a CD77.

Os autores já demonstraram que um antigénio de tumor humano CD8 fundido a uma subunidade B de toxina Shiga pode ser eficazmente apresentado de um modo restrito a HLA classe I, a CTL específicos (1). Este resultado foi confirmado independentemente por outro estudo que demonstrou que a holotoxina Shiga, transportando um epítopo de péptido definido de vírus influenza, pôde entregar o antigénio à via intracelular de MHC de classe I (3).

Os autores também demonstraram que proteínas de fusão entre o fragmento de B não tóxico de toxina Shiga bacteriana 2 ΕΡ 1 355 928/ΡΤ derivado de Shigella dysenteriae que se liga a receptor Gb3 e um antigénio, ou um epitopo de um antigénio de tumor modelo, pode desencadear resposta de linfócitos T citotóxicos (CTL) especifica, ao passo que cada parte da referida proteína de fusão não leva individualmente a indução de CTL (1, 2 e WO 99/03881). A dificuldade desta tecnologia é que, para cada aplicação, ou seja, para cada antigénio ou seu fragmento, há necessidade de uma construção específica de uma proteína de fusão que necessita de uma construção específica de um vector recombinante apresentando as sequências que codificam esta proteína de fusão a ser expressa numa célula hospedeira. O objectivo do presente invento é o de ultrapassar as desvantagens mencionadas supra e proporcionar uma âncora universal ou um transportador universal para dirigir uma molécula para uma célula que expressa um receptor Gb3, para permitir que essa molécula seja internalizada, processada e/ou expressa na referida célula que expressa um receptor Gb3.

No presente invento, desenhou-se um derivado ou mutante de subunidade B de toxina Shiga (STxB) denominado STxB-Cys. Nesta proteína adicionou-se uma cisteína ao terminal C da STxB madura. A proteína, quando purificada a partir de bactérias, apresenta a ligação dissulfureto interna, tal como STxB de tipo selvagem, enquanto que o grupo sulfidrilo na Cys do terminal C se encontra livre. Devido à sua nucleofilicidade os grupos sulfidrilo livres são excelentes aceitadores para abordagens de acoplamento dirigido (4).

Assim, o presente invento refere-se a um transportador polipeptídico universal para dirigir directa ou indirectamente uma molécula de interesse a células que expressam receptor Gb3 apresentando a fórmula seguinte: STxB-Z(n)-Cys, em que: • STxB é a subunidade B de toxina Shiga ou um seu equivalente funcional, • Z é um aminoácido isento de grupo sulfidrilo, sendo η, 0, 1 ou uma sequência de aminoácidos, • sendo Cys o aminoácido cisteína. 3 ΕΡ 1 355 928/ΡΤ A porção STxB do transportador universal tem a sequência descrita em (8) ou um seu equivalente funcional. Um equivalente funcional significa uma sequência polipeptidica apresentando a capacidade de se ligar especificamente a um receptor Gb3 e/ou desencadear uma internalização de um antigénio e a sua apresentação numa via restrita de MHC de classe I, ou tanto MHC de classe I como de classe II na mesma célula apresentadora de antigénios.

Tendo em conta a heterogeneidade de expressão de antigénios tumorais, a perda especifica do alelo de expressão de MHC de classe I à superfície de células tumorais e a necessidade de apresentação concomitante de antigénios do MHC de ambas as classes I e II na mesma célula apresentadora de antigénios, é vantajoso acoplar proteínas antigénicas completas à subunidade B para direccionamento a células dendríticas.

Numa concretização preferida, n é 0 e o transportador universal tem a sequência seguinte (SEQ ID No 1): COOH-MKKTLLIAASLSFFSASALATPDCVTGKVEYTKYNDDDTFTVKVGDKELFTNRWNLQ SLLLSAQITGMTVTIKTNACHNGGGFSEVIFRC-NH2

De facto, se o ligante z for demasiado longo, ou seja, quando n é igual ou superior a 2 podem ocorrer algumas pontes dissulfureto internas, que evitam a ligação de STxB ao receptor Gb3 e que evitam especialmente a ligação à molécula de interesse.

De acordo com o invento, a molécula de interesse é seleccionada do grupo constituído por proteínas, péptidos, oligopéptidos, glicoproteínas, glicopéptidos, ácidos nucleicos, polinucleótidos ou uma sua combinação.

Noutro aspecto do invento, a molécula de interesse é um antigénio a ser dirigido a células apresentadoras de antigénios. Tais células são seleccionadas num grupo que inclui linfócitos T, células dendríticas, células de macrófagos de Langerhans e semelhantes.

Noutro aspecto do invento, a molécula de interesse são fármacos tais como haptenos, psoralenos ou quaisquer compostos 4 ΕΡ 1 355 928/ΡΤ desde que apresentem um grupo químico que se possa ligar ao grupo -SH da porção de cisteína de STxB-Cys. 0 fármaco pode ser ligado directamente ou após activação com compostos tais como bromoacetato ou qualquer outro método conhecido por um perito na arte, desde que o resultado da reacção seja uma entidade química apresentando a formula seguinte: STxB-Cys-Μ, sendo M todas as moléculas de interesse supramencionadas.

As abordagens de acoplamento para ligação covalente de uma porção peptídica ou polipeptídica a STxB-Z(n)-Cys podem ser qualquer método ou processos descritos ou efectuados por um perito na arte.

Um primeiro método que pode ser concretizado é a utilização do agente de reticulação heterobifuncional SPDP descrito por Carlsson et al (5). Contudo, o SPDP é susceptível de ser clivado por tiolases do soro o que é uma causa para diminuição do rendimento da reacção.

Um segundo método para acoplamento covalente de péptidos STxB-Z(n)-Cys com outro péptido de interesse é produzir funções bromoacetilo ou maleimida neste último tal como descrito por P. Schelte et al (4) . Sucintamente, o péptido de interesse é activado quimicamente com anidrido de bromoacetato ou por um grupo maleimida, respectivamente. Em condições reaccionais apropriadas (pH, temperatura, tempos de incubação), estes grupos são eliminados por eliminação cis dando origem respectivamente a ligações covalentes -S-S, -S-CH2-, -S-CO- ou -S-NH-.

Como exemplo, o polipéptido ou péptido a acoplar à porção -SH da cisteína C-terminal do transportador universal, apresenta o seu terminal N activado com anidrido bromoacético segundo o esquema reaccional:

Br-CH2-C0-0-C0-CH2-Br+NH2-péptido^Br-CH2-C0-NH-péptido+Br-CH2-C00H A função bromoacetilo tem elevada selectividade quimica para grupos tiol peptídicos e o péptido activado pode ser feito reagir com STxB-Cys como se segue: 5 ΕΡ 1 355 928/ΡΤ STxB-Cys-SH+Br-CH2-CO-NH-péptido=>STxB-Cys-S-CH2CO-NH-péptido+HBr A ligação tioéter resultante é estável à hidrólise.

Outro método para acoplar uma molécula ao transportador universal do invento é utilizar MBS (éster m-maleimidobenzoil-N-hidroxissuccinimida) tal como apresentando na figura 6 e explicado no exemplo 5. Este acoplamento permite o transporte e processamento de moléculas grandes tais como proteínas ou glicoproteinas antigénicas através de vias de MHC de classe I e/ou MHC de classe II.

Assim, outro aspecto do invento é o produto que resulta de uma ligação covalente de STxB-z(n)-Cys a uma molécula de interesse através de uma ligação -S-S-, -S-CO- ou -S-CH2- ou -S-NH-.

Noutra concretização, a molécula de interesse a dirigir para as células apresentadoras de antigénio é constituída por, ou inclui, uma estrutura polipeptidica, tal como antigénios ou seus epitopos, glicopéptidos ou glicoproteinas, lipopéptidos ou lipoproteinas.

Numa concretização preferida, o produto resultante do acoplamento de STxB-Z(n)-Cys com um antigénio ou um seu fragmento, em que (n) é 0,1 ou 2 e de preferência 0, é capaz de ser apresentado numa via restrita a MHC de classe I e MHC de classe II.

Noutra concretização, a molécula de interesse é um polipéptido capaz de se ligar a estruturas polinucleotídicas tais como moléculas de ADN ou ARN. Tais moléculas podem ser vectores ou plasmídeos incluindo uma sequência de interesse para expressar numa célula alvo. No presente invento, uma célula alvo é uma célula eucariótica apresentando na sua membrana o receptor Gb3.

Assim, o transportador universal do presente invento é também um transportador para introdução de uma sequência nucleotidica numa célula alvo quer para terapia génica quer para obter células recombinantes que expressam proteínas heterólogas. 6 ΕΡ 1 355 928/ΡΤ

Noutra concretização, ο transportador universal de acordo com o presente invento pode ser ligado operativamente, directamente através de uma ligação covalente ou indirectamente através de um ligante, a um fármaco citotóxico que vai ser direccionado para células tumorais que expressam o receptor Gb3. A expressão "ligação indirecta" significa que o transportador universal está ligado covalentemente através da porção sulfidrilo da cisteina do terminal C a um ligante, estando o referido ligante ligado operativamente a um fármaco ou a um profármaco que vai ser internalizado nas células que apresentam o receptor Gb3.

Esta ligação pode ser uma ligação covalente ou uma ligação não covalente, desde que a afinidade entre o ligante e o fármaco (ou o profármaco) seja superior a 10”9mol/l.

Outro aspecto do invento é um polinucleótido isolado seleccionado do grupo de: (a) um polinucleótido incluindo a sequência nucleotidica STxB que codifica a subunidade B de toxina Shiga ou um seu equivalente funcional apresentando na sua extremidade 3' o codão TGT ou o codão TGC codificando cisteina; b) um polinucleótido incluindo uma sequência nucleotidica apresentando pelo menos 80% de identidade de sequência com uma sequência nucleotidica que codifica a subunidade B de toxina Shiga ou um seu equivalente funcional apresentando na sua extremidade 3' o codão TGT ou TGC; e c) uma sequência nucleotidica complementar à sequência de a) ou b) .

Numa concretização preferida, o polinucleótido tem a seguinte SEQ ID N°2: 7 ΕΡ 1 355 928/ΡΤ 5’ - atgaaaaaaacattattaatagctgcatcgctttcatttttttcagçaag tgcgctggcgacgcctgattgtgtaactggaaaggtggagtatacaaaat ataatgatgacgatacctttacagttaaagtgggtgataaagaattattt accaacagatggaatcttcagtctcttcttctcagtgcgcaaattacggg gatgactgtaaccattaaaactaatgcctgtcataatggagggggattca gcgaagttatttttcgttgt - 3’ 0 presente invento refere-se também a um vector recombinante ou a um plasmídeo incluindo uma sequência polinucleotídica tal como descrito acima e capaz de expressar o transportador universal STxB-Z(n)-Cys, em que (n) é 0, 1 ou 2, STxB e Z têm o mesmo significado que acima, numa célula hospedeira apropriada.

Como exemplo, um vector conveniente é o plasmideo pSul08 descrito em (7).

Outro objecto do presente invento consiste em proporcionar um método para obter o plasmideo que expressa STxB-Z(n)-Cys incluindo: a) proporcionar um plasmideo incluindo uma sequência STxB; b) aplicar duas etapas de amplificação de PCR utilizando dois pares de iniciadores, AA' e BB', - sendo A e B complementares entre si e incluindo o codão Cys, - estando A' e B' no exterior da sequência STxB; c) isolar os fragmentos amplificados; d) hibridar os fragmentos amplificados; e) aplicar uma amplificação de PCR aos fragmentos hibridados; f) inserir o fragmento amplificado num plasmideo.

Numa concretização preferível, o plasmídeo pSU108 (7) contendo o fragmento STxB foi modificado para introduzir o codão de cisteína TGT na extremidade 3' do ADNc do fragmento B. Os iniciadores para a etapa b) são respectivamente para AA' e BB': 8 ΕΡ 1 355 928/ΡΤ iniciador A: 5'-AGCGAAGTTATTTTTCGTTGTTGACTCAGAATAGCTC-3' (SEQ ID n. 0 3) , e iniciador B: 5'-GAGCTATTCTGAGTCAACACGAAAAATAACTTC-3' (SEQ ID n.0 4). iniciador A': iniciador ShigaAtpE: 5'-CACTACTACGTTTTAAC-3' (SEQ ID n.0 5), e iniciador B': iniciador Shiga-fd: 5'-CGGCGCAACTATCGG-3' (SEQ ID n.0 6). A PCR da etapa e) proporciona um fragmento que é clonado nos locais de restrição Sphl e Sall de pSUl08. As sequências derivadas por PCR são verificadas por sequenciação didesoxi. 0 perito na especialidade pode facilmente conceber a escolha de iniciadores, plasmídeos para produzir um vector que apresenta a sequência polinucleotídica que expressa STxB-Z(n)-Cys numa célula hospedeira adequada, desde que esta sucessão de etapas permita a interpretação do codão Cys no fragmento amplificado. 0 invento também proporciona uma linha celular recombinante obtida por transformação com o vector recombinante contendo a sequência polipeptidica que codifica o transportador universal tal como descrito acima. Numa concretização preferida, a referida linha celular recombinante é uma célula procariota, de preferência E. coli.

Ainda numa concretização preferida, o plasmideo é pSUl08 apresentando SEQ ID No. 2 integrada entre os locais de restrição Sphl e Sall e a linha celular correspondente foi depositada no CNCM a 19 de Dezembro de 2000 com o número de registo 1-2604. O presente invento também proporciona um processo para produzir um transportador universal tal como descrito acima incluindo: a) cultivar uma linha celular recombinante tal como descrito acima, b) obter um extracto periplasmático das referidas células, e c) purificar o referido polipéptido. 9 ΕΡ 1 355 928/ΡΤ

De preferência, a linha celular é E. coli e em c) a purificação é efectuada por cromatografia em coluna de permuta aniónica seguida por cromatografia em coluna de filtração em gel.

Tal processo é particularmente vantajoso para produção em larga escala do transportador universal, dado que pode seguidamente ser ligado operativamente por acoplamento covalente a uma molécula de interesse e utilizado numa aplicação de âmbito alargado. 0 presente invento também proporciona um método para entregar uma sequência de interesse na via do MHC de classe I utilizando um produto obtido por ligação covalente da porção Cys do transportador universal à referida sequência de interesse; este método é vantajoso para desencadear uma resposta de CTL a um dado antigénio ou seu epítopo desde que o produto seja especifico da célula envolvida na via do MHC de classe i.

De facto, os inventores mostraram que um péptido imunodominante derivado da proteína ovalbumina e acoplado quimicamente a STxB-Cys, poderia ser apresentado por células apresentadoras de antigénios a células de hibridoma específicas, demonstrando que STxB poderia entregar péptido imunogénico exógeno à via do MHC de classe I. Para excluir a influência devida à presença de péptidos livres contaminantes do material, as experiências utilizando células dendríticas fixadas demonstraram claramente que a internalização da proteína de fusão era necessária para este processo. Os inventores também demonstraram que o receptor de toxina Shiga, Gb3, estava também envolvido na capacidade de STxB-Cys direccionar péptido exógeno na via de MHC de classe I endógena. 0 invento também se refere a um método para entregar um vector de expressão contendo uma sequência de interesse a células que expressam receptor Gb3 caracterizado por o referido vector de expressão estar ligado a um péptido rico em lisina ligado covalentemente à porção Cys do transportador universal. 10 ΕΡ 1 355 928/ΡΤ

Como exemplo, ο péptido rico em lisina é uma polilisina 16-mero que é capaz de se ligar a qualquer sequência polinucleotidica, quer de ADN quer de ARN. Tal péptido apresentando um 16-mero de lisinas será activado no seu terminal N por anidrido de bromoacetato e acoplado a STxB-Cys. Os plasmídeos de expressão serão ligados a este produto de acoplamento e ensaia-se a vectorização de ADN para células alvo utilizando sistemas repórter convenientes, tais como a proteína verde fluorescente ou a luciferase.

Espera-se que a capacidade de dirigir plasmídeos de expressão com auxílio de STxB ao núcleo de células apresentadoras de antigénios aumente adicionalmente a potência deste vector, dado que i) o ADN pode ser ainda mais facilmente adoptado para novas necessidades experimentais ou clínicas, e ii) devido ao seu efeito de potenciação, a expressão de péptidos ou proteínas antigénicos a partir de ADN aumentaria adicionalmente a sensibilidade da apresentação de antigénios dependente de STxB. 0 invento também proporciona um método para entregar um fármaco ou um profármaco a uma célula, nomeadamente a uma célula de cancro apresentando o receptor Gb3 (ou CD77).

Relatou-se que o receptor Gb3 glicolipídico era preferencialmente expresso em alguns tumores derivados de neuroectoderme (glioma) e alguns linfomas de Burkitt. Dado que uma limitação da utilização de quimioterapia em cancro são os efeitos secundários dos fármacos devido à sua toxicidade para células normais, os fármacos são vectorizados de preferência para células de tumor por utilização de STxB-Cys. Os fármacos são activados para se tornarem reactivos com o grupo sulfidrilo de STxB-Cys. Para atingir este objectivo pode introduzir-se um grupo maleimida num fármaco, por exemplo compostos de psoraleno. 0 presente invento também se refere a: • uma composição farmacêutica para aumentar a imunogenicidade de um péptido ou uma proteína ou uma glicoproteína ou um lipopéptido, contendo o transportador universal ligado covalentemente pela sua porção Cys ao referido péptido ou proteína ou glicoproteína ou lipopéptido; 11 ΕΡ 1 355 928/ΡΤ • uma composição farmacêutica para tratar células tumorais apresentando o receptor Gb3 (CD77), contendo o transportador universal de acordo com o invento ligado covalentemente pela sua porção Cys a um fármaco ou um profármaco tóxico para as referidas células de tumor.

Sem limitar o âmbito do transportador universal do invento e a sua utilização vasta em aplicações diferentes, os exemplos e figuras seguintes ilustram as vantagens do presente invento.

Legendas das figuras: A figura 1 representa o perfil de proteínas da coluna SephaDex 75 final que proporciona STxB-Cys purificada. As fracções 20-25 contêm maioritariamente STxB-Cys monomérica (as posições de STxB-Cys monomérica e dimérica são indicadas à direita). Indicam-se os marcadores de peso molecular à esquerda. A figura 2a representa o acoplamento do tipo 2 de Pep2 [tal como definido no exemplo 2] a STxB-Cys, seguido de um ensaio de apresentação de antigénios in vitro em células dendriticas Dl, tal como descrito em (2) . Utilizaram-se duas preparações diferentes de STxB-Cys acoplada ao péptido SL8, um epitopo imunodominante de ovalbumina (denominadas 4A e 9A) . Após fixação, a apresentação de antigénios é abolida demonstrando que não ocorreu qualquer processamento extracelular. A figura 2b representa uma experiência de controlo da figura 2a, na qual se mostra que Dl fixadas podem mesmo assim apresentar péptido SL8 livre. A figura 3 representa outra experiência em células Dl fixadas e não fixadas utilizando uma reacção de acoplamento do tipo 1 em STxB-SH e Pepl [tal como definido no exemplo 2]. A figura 4 representa a apresentação de péptidos antigénicos dependente de subunidade B derivada de um acoplamento de Pep2 a B-Glyc-Cys-KDEL. A utilização de 12 ΕΡ 1 355 928/ΡΤ fragmentos Fab de um anticorpo que neutraliza a ligação de STxB a Gb3 também elimina a apresentação de antigénios. A figura 5 mostra que o inibidor de síntese Gb3 ppmp inibe a apresentação de antigénios dependente de subunidade B (5a) e que a apresentação de SL8 não é diminuída em células tratadas com PPMP. A figura 6 representa o esquema reaccional para acoplamento Ova completa a STxB-Cys utilizando o ligante de reticulação heterobifuncional MBS. Topo: primeira reacção que liga MBS a aminas primárias de Ova. Meio: segunda reacção entre Ova activada e STxB-Cys. Baixo: estrutura de MBS. A figura 7 apresenta a análise de Western do acoplamento de Ova a STxB-Cys. A parte superior da figura representa uma imunotransferência utilizando anticorpo anti-STxB, a parte inferior representa uma imunotransferência utilizando anticorpo anti-Ova. Apresentam-se os intermediários das diferentes etapas do procedimento de purificação. Pista 1: proteínas não acopladas (marcadas com uma cruz). Pista 2: reacção de acoplamento (produto de acoplamento marcado com uma seta). Pista 3: eluído da coluna de imunoafinidade incubado e transferido com anticorpo anti-STxB. Pistas 4-7: fracções da coluna de filtração em gel. Pista 4: fracções 9-10. Pista 5: fracções 11-12. Pista 6: fracções 13-14. Pista 7: fracções 15-19 (STxB-Cys livre). As fracções 11-12 contêm a maior parte do produto de acoplamento monomérico. Pode também detectar-se algum material com menor mobilidade electroforética, provavelmente originário de Ova dimérica presente na preparação original. A figura 8 representa a análise de imunofluorescência do transporte de STxB-Cys-Ova em células HeLa. O produto de acoplamento STxB-Cys-Ova (parte superior da figura) ou uma mistura de STxB-Cys e Ova (parte inferior da figura) foram incubados com células HeLa em gelo. Após lavagem, mudaram-se as células durante 45 min para 37°C, fixaram-se e coraram-se com os anticorpos indicados. Note-se que quando se liga Ova a STxB-Cys (topo), a proteína é vectorizada para o aparelho de Golgi, co-corando para o marcador de Golgi Rab6. Se Ova for 13 ΕΡ 1 355 928/ΡΤ apenas misturada com STxB-Cys (em baixo), a proteína não pode ser detectada nas células. A figura 9 apresenta a apresentação de antigénios restrita a MHC de classe I e II induzida por incubação de células Dl com STxB-Cys-Ova. Consultar texto para mais pormenores.

Exemplo 1: Preparação do transportador universal a) Construção de um plasmídeo que expressa STxB-Cys:

Numa concretização preferida, modificou-se o plasmídeo PSU108 (7) para introduzir o codão de cisteína tgt na extremidade 3' do ADNc do fragmento B. Utilizaram-se o iniciador de PCR A: SEQ ID n.° 3 (5'-AGCGAAGTTATTTTTCGTTGTTGAC TCAGAATAGCTC-3') e o iniciador A': SEQ ID n.° 4 (5’-GAGCTATTCT GAGTCAACACGAAAAATAACTTC-3') com iniciadores específicos do plasmídeo ShigaAtpE: SEQ ID n.° 5 (5'-CACTACTACGTTTTAAC-3') e

Shiga-fd: SEQ ID n.° 6 (5'-CGGCGCAACTATCGG-3') para produzir fragmentos de ADN que, numa segunda PCR com os iniciadores Shiga AtpE e Shiga-fd proporcionassem um fragmento que foi clonado nos locais de restrição Sphl e Sall de pSUl08. Verificaram-se as sequências derivadas por PCR por sequenciação didesoxi. b) Purificação da proteína: b) 1. A preparação do extracto periplasmático foi efectuada do seguinte modo: • Inocular 125 ml de LB/Amp com 125 μΐ de uma cultura cultivada durante a noite a 30°C, • Crescer durante a noite a 30°C, • Transferir para 375 ml de LB/Amp a 50°C; incubar 4 horas a 42°C, • Centrifugar para sedimentar as células, • Lavar as células 3 vezes com Tris/HCl 10 mM, pH 8,0, • Ressuspender as células em 200 ml de sacarose a 25%, EDTA 1 mM, Tris/HCl 10 mM, pH 8,0; incubar à temperatura ambiente durante 10 min., 14 ΕΡ 1 355 928/ΡΤ • Centrifugar para sedimentar as células, • Ressuspender as células em 200 ml de água gelada contendo uma mistura de inibidores de proteases; incubar em gelo durante 10 min., • Centrifugar; recolher o sobrenadante; adicionar Tris/HCl 20 mM, pH 8,0. b) 2. Purificação em colunas:

Carregou-se o extracto periplasmático numa coluna permutadora aniónica QFF (Pharmacia) e eluiu-se com NaCl 230 mM. Juntaram-se as fracções contendo STxB-Cys, diluiram-se 4 vezes e carregaram-se numa coluna permutadora aniónica Mono Q (Pharmacia), seguindo-se a eluição com NaCl 230 mM. Após concentração com dispositivos de microconcentração de PallFiltron, passaram-se as fracções juntas através de uma coluna de filtração em gel Sephadex 75. A pureza foi superior a 95% (figura 1). b) 3. Caracterização do produto:

Os fragmentos B de STxB-Cys, purificados a partir de colunas de filtração em gel Sephadex 75 são essencialmente monoméricos (figura 1) . Tal é nitidamente diferente de construções nas quais a cisteina foi adicionada em mais que 2 aminoácidos do C terminal natural do fragmento B. Nestes casos, os fragmentos B vizinhos num pentâmeros estão envolvidos em ligações dissulfureto.

Exemplo 2: Condições para acoplamento de péptidos activados ao transportador universal: a) Transportadores:

Compararam-se três transportadores diferentes. 1) STxB-Cys: fragmento B ao qual se adicionou uma Cys directamente no seu terminal C. Esta proteína elui como monómero de colunas de purificação. 2) STxB-Z2-Cys: transportador com um espaçador curto (2 aminoácidos resultantes de uma cassete de clonagem) entre o 15 ΕΡ 1 355 928/ΡΤ terminal C do fragmento B de tipo selvagem e a Cys. A maior parte da proteína é eluída como dímero das colunas de purificação. Estes podem ser separados sob condições redutoras, indicando a formação de ligações dissulfureto entre monómeros no complexo pentamérico de subunidade B. 3) STxB-Glyc-Cys-KDEL: transportador no qual a Cys se localiza entre uma cassete de glicosilação com 9 aminoácidos de comprimento e um péptido KDEL no terminal C. A maior parte da proteína é eluída como dímero das colunas de purificação. Estes podem ser separados sob condições redutoras, indicando a formação de ligações dissulfureto entre monómeros no complexo pentamérico de subunidade B. b) péptidos de ensaio: 1) Pepl: péptido sintético de 16 aminoácidos apresentando o péptido antigénico SL8 derivado de ovalbumina de galinha. 2) Pep2: péptido sintético de 24 aminoácidos como acima contendo, adicionalmente, uma cauda de His no seu terminal C. 3) SL8: o péptido antigénico de ovalbumina que pode permutar directamente com péptidos de complexos de MHC de classe I na membrana plasmática de células apresentadoras de antigénio. c) Condições de acoplamento:

Em condições redutoras (tipo 1): Trataram-se proteínas de fusão com DTT durante a noite e seguidamente adicionou-se péptido activado em excesso (apresentando um grupo bromoacetato no seu terminal N). As condições utilizadas para as primeiras experiências de acoplamento utilizando proteínas de fusão provocarão principalmente a dimerização de monómeros (proteínas STxB-Z2-Cys e STxB-Glyc-Cys-KDEL).

Em condições não redutoras (tipo 2) : Fazem-se reagir directamente proteínas de fusão com os péptidos activados. d) Controlos bioquímicos e morfológicos: 0 Pep2 apresenta uma cauda de His. Tal permitiu-nos, utilizando um anticorpo anti-His, demonstrar a presença de 16 ΕΡ 1 355 928/ΡΤ

Pep2 na subunidade B por transferência de Western e o transporte de Pep2 dependente da subunidade B em células HeLa. A figura 2a mostra que foi observado um estimulo dependente da dose de hibridoma B3Z CTL (medida de actividade de β-galactosidase) com células não fixadas, enquanto que a fixação aboliu a apresentação de antigénios.

Note-se que a apresentação de antigénios apenas funciona em células não fixadas, indicando que a apresentação observada não resulta de contaminação com Pep2 livre. A figura 2b apresenta a experiência de controlo da figura 2a na qual se mostra que células Dl fixadas podem ainda apresentar péptido SL8 livre.

Na figura 3, parece que neste tipo de protocolo algum Pepl livre parece co-purificar com a proteína de fusão, dado que a doses elevadas (200-1000 nM) se observou alguma apresentação em células fixadas. A apresentação por SL8 mostra-se à direita.

Na figura 4, a proteína acoplada (pistas 1 e 2) ou o péptido SL8 (pistas 5 e 6) foram incubados (pistas 2 e 5) ou não (pistas 1 e 4) com fragmento Fab anti-subunidade B derivado do anticorpo 13C4 que inibe a ligação da subunidade B a Gb3. Note-se que o fragmento Fab neutraliza a capacidade da subunidade B para introduzir o péptido antigénico na via de classe I, enquanto que a apresentação com SL8 não é afectada nestas condições. O sinal de fundo nesta experiência foi de 0,3.

Na figura 5a, pré-trataram-se células Di com PPMP (consultar figura 3b de (2)) durante 3 dias. Este tratamento levou a uma importante diminuição da expressão de Gb3 na superfície celular sem contudo a eliminar completamente. Nestas condições a apresentação de antigénios de uma reacção de acoplamento de Pepl com STxB-Glyc-Cys-KDEL foi significativamente reduzida, indicando que Gb3 é importante para fenómenos de apresentação. 17 ΕΡ 1 355 928/ΡΤ É aparente de todas estas experiências de que o acoplamento a STxB-Cys sob condições não redutoras é surpreendentemente eficaz (em termos de sensibilidade; note-se que, tal como apresentado na figura 1, é necessário STxB-Cys-Pep2 a apenas 4 nM para que haja uma resposta) . Assim, o transportador universal STxB-Cys é preferido devido à sua simplicidade na sua preparação e à reprodutibilidade do acoplamento.

Assim, as condições óptimas para acoplamento de péptidos activados a STxB-Cys foram as seguintes: • Dialisar STxB-Cys contra tampão borato 20 mM, pH 9,0, NaCl 150 mM, • Concentrar a 1 mg/ml, • Dissolver péptido com activação no terminal N (activado com anidrido de bromoacetato) a 12 mM em DMSO, • Diluir péptido a 0,2 mM em solução de proteína, • Incubar 12 horas à temperatura ambiente, • Dialisar contra PBS.

Exemplo 3: Caracterização de STxB relativamente à sua capacidade de apresentação de antigénios

As séries experimentais seguintes auxiliarão na descrição completa da capacidade de STxB funcionar no sistema de apresentação de antigénios. a) Apresentação de antigénios restrita a classe I e classe II:

Um péptido apresentando péptidos antigénicos restritos a classe I e II de ovalbumina de galinha (Br-CH2-CO-NH-LEQLESIINFEKLTEWSLKISQAVHAAHAEINEAGR, sequências 257-264 e 323-339 foram acoplados a STxB-Cys e ensaiaram-se as apresentações restritas a classe I e classe II desses péptidos utilizando os hibridomas de células T correspondentes. b) Acoplamento de proteínas completas.

As nossas evidências preliminares sugerem que a ovalbumina de galinha pode ser acoplada a STxB-Cys. Estas 18 ΕΡ 1 355 928/ΡΤ experiências foram efectuadas com o ligante de reticulação heterobifuncional SPDP. (Carlsson et al., 1978).

Uma primeira série de experiências de apresentação de antigénios indicou que a proteína ovalbumina pode ser introduzida na via de apresentação de antigénios restrita a MHC de classe I endógena de células dendríticas de ratinho. SPDP apresenta o inconveniente de ser clivável por tiolases do soro. Este ligante de reticulação foi substituído com sucesso por MBS que não é clivável. Outras proteínas antigénicas (Marti e polipéptidos derivados de HPV16-E7 e Mucl) foram ensaiadas para demonstrar que o procedimento é de utilização universal. c) Acoplamento de misturas de proteínas complexas.

Utilizou-se um lisado da linha celular Caski derivada de carcinoma de cerviz. Esta linha celular de carcinoma de cerviz, que expressa o alelo HLA-A2 na sua membrana, também expressa péptidos derivados do vírus do papiloma humano. E7 é uma ORF de transcrição precoce de HPV que é necessária para transformação de queratinócitos primários. Dado que os CTL restritos a A2 de HLA anti-E7 são induzidos in vitro. Ensaiou-se a eficácia do acoplamento desta mistura de proteínas num ensaio de apresentação específico para péptidos derivados de HLA-A2 E7. Como controlo, acoplou-se um lisado de uma linha celular positiva para HLA-A2 que não expressa E7 (células croft ou Daudi) a STxB-lys.

Exemplo 4: Aplicação à apresentação de antigénios restrita a MHC de classe I A experiência da figura 4 mostra que apresentação de antigénios dependente de STxB-Cys é inibida quando a interacção com Gb3 é abolida. Aqui revela-se que a pré-ligação do fragmento Fab de Ab monoclonal contra STxB a STxB-Cys 0,1 μΜ, acoplado a SL8, inibiu a apresentação de antigénios, sugerindo que a ligação de STxB-Cys a Gb3 é necessária para a apresentação de antigénios. Obtiveram-se resultados semelhantes quando a expressão de Gb3 foi inibida com um fármaco (figura 4). 19 ΕΡ 1 355 928/ΡΤ

Exemplo 5: Cadeia reaccional para acoplamento de ovalbumina a STxB-Cys O esquema reaccional é apresentado na figura 6.

Numa primeira reacção, a porção éster N-hidroxissuccinimida de MBS reage com aminas primárias numa proteína antigénica alvo tal como a proteína modelo ovalbumina (Ova). 0 produto da reacção é purificado e seguidamente incubado numa segunda reacção com STxB-Cys levando a acoplamento através da porção maleimidobenzoílo. A figura 7 mostra as análises de SDS-PAGE e de Western de uma reacção de acoplamento típica envolvendo STxB-Cys e Ova. Para o acoplamento, incubou-se Ova a 20 mg/ml em HEPES 100 mM, pH 7,4 com MBS 4,5 mM durante 30 min à temperatura ambiente. Passa-se a mistura reaccional através de uma coluna de filtração em gel equilibrada com PBS/EDTA 10 mM. A Ova eluída é concentrada até 20 mg/ml. Mistura-se 1 volume de STxB-Cys a 3,5 mg/ml em PBS/EDTA com 1 volume de Ova activada e incuba-se durante a noite à temperatura ambiente. A figura 7 mostra que da reacção de acoplamento podem detectar-se bandas com menor mobilidade electroforética (marcadas com setas; produto de acoplamento) para além de STxB não acoplado (parte superior) e Ova não acoplada (parte inferior; as proteínas não acopladas estão marcadas com uma cruz). O produto da reacção é purificado por passagem através de uma coluna de imunoafinidade de anticorpo monoclonal anti-STxB 13C4 (pista de coluna IP) . Note-se que a Ova livre é eliminada. Passa-se então a STxB-Cys eluída (acoplada e não acoplada) através de uma coluna de filtração em gel para separar STxB livre (fracções 15-19) de STxB-Cys acoplada (fracções 9-14; note-se que as fracções 11-12 contêm a maior parte da proteína acoplada; a banda de acoplamento superior, que é minoritária em comparação com a banda inferior, resulta provavelmente de Ova dimérica).

Exemplo 6: Características de transporte intracelular de produto de acoplamento STxB-Cys-Ova

Incubou-se STxB-Cys-Ova 0,5 μΜ com células HeLa em gelo. Lavaram-se as células e mudaram-se para 37°C durante 45 min, 20 ΕΡ 1 355 928/ΡΤ fixaram-se e coraram-se para os anticorpos indicados. Tal como apresentado na figura 8, quando STxB-Cys e Ova foram ligadas por MBS, a imunorreactividade Ova pôde ser detectada conjuntamente com a imunorreactividade STxB no aparelho de Golgi corado por Rab6. Quando ambas as proteínas são incubadas como entidades separadas com células HeLa, apenas STxB-Cys é transportada para o Golgi enquanto que a Ova não pode ser detectada nas células. Estes dados mostram claramente que STxB-Cys acoplada é ainda transportada da mesma forma que STxB-Cys não acoplada e que a Ova é vectorizada através de STxB-Cys.

Exemplo 7: STxB-Cys permite apresentação de péptidos restrita a MHC tanto de classe I como de classe li derivada de proteínas antigénicas exógenas completas

Numa primeira experiência (figura 9, esquerda) demonstramos que quando se utiliza STxB-Cys-Ova para sensibilizar a linha celular dendríticas murina Dl, observa-se um claro aumento da apresentação do péptido derivado de Ova restrito a MHC de classe II Ova323-339 comparativamente com células Dl com impulso de Ova não vectorizada. De facto, pode detectar-se uma apresentação significativa de péptido Ova323-339 com uma quantidade tão pequena como STxB-Cys-Ova 0,01 nM, enquanto que foi necessário Ova completa 10 nM para uma apresentação eficaz do mesmo péptido. A apresentação do péptido Ova323-339 restrito a iAb foi revelada utilizando o hibridoma B097.10 que produz IL-2 após reconhecimento deste péptido. Como controlo não observamos excreção de IL-2 quando se utilizou um hibridoma restrito a MHC de classe II irrelevante em vez de B097.10 (dados não apresentados).

Numa segunda experiência, submetemos a mesma linha celular dendritica Dl restrita a H2b a um impulso de Ova sozinha ou de STxB-Cys-Ova. Não se observou apresentação do péptido imunodominante SL8 derivado de Ova (Ova257-264 ) quando as células Dl foram sensibilizadas com Ova livre até 100 nM, enquanto que STxB-Cys-Ova 1-10 nM permitiu a apresentação do péptido SL8, tal como revelado pelo hibridoma especifico B3Z que reconhece o péptido SL8 no contexto de moléculas Kb. Como controlo, mostrou-se que não se observava qualquer activação 21 ΕΡ 1 355 928/ΡΤ de um hibridoma irrelevante sob as mesmas condições experimentais.

Conjuntamente, estes resultados demonstram claramente que STxB-Cys se dirige a proteínas completas com elevada especificidade para ambas as vias do MHC, de classe I e classe li.

BIBLIOGRAFIA (1) Ren-Shiang Lee, Eric Tartour, Pierre van der Bruggen, Valérie Vantomme, Isabelle Joyeux, Bruno Goud, Wolf Herman Fridman e Ludger Johannes, "Major histocompatibility complex class I Presentation of exogenous soluble tumor antigen fused to the B-fragment of Shiga toxin". Eur. j. Immunol. (1998) 28: 2726-2737. (2) Nacilla Haicheur, Emmanuelle Bismuth, Sophie Bosset, Olivier Adotevi,, Guy Warnier, Valérie Lacabanne, Armelle Regnault, Catherine Desaymard, Sebastian Amigorena, Paola Ricciardi-Castagnoli, Bruno Goud, Wolf H. Fridman, Ludger Johannes e Eric Tartour, "The B Subunit of Shiga Toxin Fused to a Tumor Antigen Elicits CTL and Targets Dendritic Cells to Allow MHC Class I-Restricted Presentation of Peptides Derived from Exogenous Antigens". The Journal of Immunology (2000) 165: 3301-3308. (3) Noakes, K.L., H.T. Teisseranc, J.M. Lord, P.R. Dunbar, V. Cerundolo e L.M. Roberts "Exploiting retrograde transport of Shiga-like toxin 1 for the delivery of exogenous antigens into the MHC class I presentation pathway". Febs. Lett. (1999) 453:95. (4) Philippe Schelté, Christophe Boeckler, Benoit Frisch e Francis Schuber "Differential Reactivity of Maleimide and Bromoacetyl functions with Thiols: Application to the Preparation of Liposomal Diepitope Constructs". Eur. J. Immunol. (1999) 29:2297-2308. (5) Carlsson, J., H. Drevin, e R. Axen. 1978. Protein thiolation and reversible protein-protein conjugation. N-Succinimidyl 3-(2-pyridyldithio)propionate, a new heterobifunctional reagent. Biochem. J. 173:723-737. 22 ΕΡ 1 355 928/ΡΤ (6) Su, G.F., Η.Ν. Brahmbhatt, J. Wehland, M. Rohde e K.N. Timmis "Construction of stable LamB-Shiga toxin B subunit hybrids: analysis of expression in Salmonella typhimurium aroA strains and stimulation of B subunit-specific mucosal and serum antibody responses". (1992) Infect. Immun. 60:3345-3359. (7) Johannes, L., Tenza, D., Antony, C. e Goud, B., "Retrograde transport of KDEL-bearing B-fragment of Shiga toxin". (1997) J. Biol. Chem. 272: 19554-19561. (8) N.A. Stockbine, Μ. P. Jackson, L.M. Sung, R.K. Holmes, A.D. 0'Brien, J Bacteriol 170, 1116-22 (1988).

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

<110> INSTITUT CURIE CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE INSTITUT NATIONAL DE LA SANTE ET DE LA RECHERCHE M UNIVERSITE PIERRE ET MARIE CURIE (PARIS VI) <120> TRANSPORTADOR UNIVERSAL PARA DIRIGIR MOLÉCULAS PARA CÉLULAS QUE EXPRESSAM O RECEPTOR Gb3 <130> B4719A - FL/SDU (Institut Curie et al) <140> PCT/EP 02/01627 <141> 2002-02-01 <150> EP 01400255.4 <151> 2001-02-01 <160> 6 <170> Patentln Ver. 2.1

<210> 1 <211> 90 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Universal <400> 1 23 ΕΡ 1 355 928/ΡΤ

Met Lys Lys Thr Leu Leu Ile Ala 1 5

Ser Ala Leu Ala Thr Pro Asp Cys 20

Lys Tyr Asn Asp Asp Asp Thr Phe 35 40

Leu Phe Thr Asn Arg Trp Asn Leu 50 55

Ile Thr Gly Met Thr Vai Thr Ile 65 70

Gly Gly Phe Ser Glu Vai Ile Phe 85

Ala Ser Leu Ser Phe Phe Ser Ala 10 15

Vai Thr Gly Lys Vai Glu Tyr Thr 25 " "" ' " ~ ' 30

Thr Vai Lys Vai Gly Asp Lys Glu 45

Gin Ser Leu Leu Leu Ser Ala Gin 60

Lys Thr Asn Ala Cys His Asn Gly 75 80

Arg Cys 90

<210> 2 <211> 270 <212> ADN <213> Sequência Artificial < 2 2 0 > <223> Descrição de Sequência Artificial: Polinucleótido < 4 0 0 > 2 atgaaaaaaa cattattaat agctgcatcg ctttcatttt tttcagcaag tgcgctggcg 60 acgcctgatt gtgtaactgg aaaggtggag tatacaaaat ataatgatga cgataccttt 120 acagttaaag tgggtgataa agaattattt accaacagat ggaatcttca gtctcttctt 180 cteagtgcçc aaattacggg gatgactgta accattaaaa ctaatgcctg tcataatgga 240 gggggattca gcgaagttat ttttcgttgt 270

<210> 3 <211> 37 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220>

<223> Descrição de Sequência Artificial: Iniciador A < 4 0 0 > 3 agcgaagtta tttttcgttg ttgactcaga atagctc 37 <210> 4 <211> 33

< 212 > ADN <213> Sequência Artificial < 2 2 0 > <223> Descrição de Sequência Artificial: Iniciador B < 4 0 0 > 4 gagctattct gagtcaacac gaaaaataac ttc 33

<210> 5 <211> 17 <212> ADN <213> Sequência Artificial 24 ΕΡ 1 355 928/ΡΤ <22 0> <223> Descrição de Sequência Artificial: Iniciador A' <220> <221> misc_feature <222> (1). (17)

<223> Iniciador ShigaAtpE < 4 0 0 > 5 cactactacg ttttaac 17

<210> 6 <211> 15 <212> ADN <213> Sequência Artificial < 2 2 0 > <223> Descrição de Sequência Artificial: Iniciador B' < 2 2 0 > <221> misc_feature <222> (1). (15) <223> Iniciador Shiga-fd < 4 0 0 > 6 cggcgcaact atcgg 15

Lisboa

Claims (24)

1. ΕΡ 1 355 928/ΡΤ 1/4 REIVINDICAÇÕES 1. Transportador polipeptídico universal para dirigir uma molécula para células que expressam o receptor Gb3 e apresentado a seguinte fórmula STxB-Z(n)-Cys, em que: - STxB é a subunidade B da toxina Shiga ou um seu equivalente funcional, tendo o referido equivalente funcional a capacidade de se ligar especif icamente ao receptor Gb3 e/ou de desencadear uma internalização de um antigénio e a sua apresentação numa via restrita de MHC de classe I, ou tanto de MHC de classe I como de classe II na mesma célula apresentadora de antigénio, - Z é um aminoácido isento de grupo sulfidrilo, sendo η, 0, 1 ou um polipéptido, - Cys é o aminoácido cisteína.
2. 2. Transportador universal de acordo com a reivindicação 1 em que n é 0.
3. 3. Transportador universal de acordo com a reivindicação 1 ou 2 ligado a uma molécula, em que a molécula é seleccionada do grupo constituído por proteínas, péptidos, oligopéptidos, glicoproteínas, glicopéptidos, ácidos nucleicos, polinucleótidos ou uma sua combinação.
4. 4. Transportador universal de acordo com a reivindicação 1 ou 2 ligado a uma molécula, em que a molécula é ligada covalentemente ao resíduo -S do transportador universal através de uma ligação -S-S- ou -S-CO- ou -S-CH2- ou -S-NH-.
5. 5. Transportador universal de acordo com a reivindicação 4 em que a molécula é um antigénio para ser dirigido a células apresentadoras de antigénio.
6. 6. Transportador universal de acordo com a reivindicação 1 ou 2 em que o transportador universal é ligado covalentemente a um oligopéptido ou a um polipéptido através de uma ligação -S-S- ou -S-CO- ou -S-CH2- ou -S-NH- e a molécula para ser dirigida está ligada ao referido oligopéptido ou polipéptido. ΕΡ 1 355 928/ΡΤ 2/4
7. 7. Transportador universal de acordo com a reivindicação 6 caracterizado por estar ligado covalentemente a um oligopéptido polilisina e a molécula para ser dirigida é um ácido nucleico ou um oligonucleótido ligado à referida porção polilisina.
8. 8. Transportador universal de acordo com a reivindicação 4 em que a molécula é um fármaco ou profármaco citotóxico para ser dirigido para células tumorais que expressam receptor Gb3.
9. 9. Polinucleótido isolado seleccionado do grupo que consiste em: a) polinucleótido incluindo a sequência nucleotídica STxB que codifica a subunidade B de toxina Shiga ou um seu equivalente funcional apresentando na sua extremidade 3' o codão TGT, ou o codão TGC que codifica cisteína, apresentando o referido equivalente funcional a capacidade de se ligar especificamente ao receptor Gb3 e/ou de desencadear uma internalização de um antigénio e sua apresentação numa via restrita de MHC de classe I ou tanto de MHC de classe I como de classe II na mesma célula apresentadora de antigénios, b) sequência nucleotídica complementar à sequência de a).
10. 10. Polinucleótido de acordo com a reivindicação 9 apresentando a SEQ ID NO 2.
11. 11. Vector recombinante ou plasmídeo, incluindo uma sequência polinucleotídica de acordo com a reivindicação 9 ou 10, para a expressão de um vector universal de acordo com a reivindicação 1 numa célula hospedeira apropriada.
12. 12. Linha celular recombinante obtida por transformação com o vector recombinante de acordo com a reivindicação 11.
13. 13. Linha celular recombinante de acordo com a reivindicação 12 sendo uma linha celular procariótica.
14. 14. Linha celular recombinante de acordo com a reivindicação 12 ou 13, depositada em CNCM a 19 de Dezembro de 2000 com o número de registo 1-2604.
15. 15. Método para construir um vector recombinante de acordo com a reivindicação 11 incluindo: ΕΡ 1 355 928/ΡΤ 3/4 a) proporcionar um plasmídeo incluindo a sequência STxB; b) aplicar duas etapas de amplificação por PCR utilizando dois pares de iniciadores AA' e BB', - sendo A e B complementares entre si e incluindo o codão Cys, - estando A' e B' fora da sequência STxB; c) isolar os fragmentos amplificados; d) hibridar os fragmentos amplificados; e) aplicar uma amplificação por PCR aos fragmentos hibridados; f) inserir o fragmento amplificado num plasmídeo.
16. 16. Método de acordo com a reivindicação 15 em que na etapa f) o fragmento é inserido no local de restrição Sphl e Sall do plasmídeo pSU108.
17. 17. Processo para produzir um transportador polipeptídico de acordo com a reivindicação 1 incluindo: a) cultivar a linha celular de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 14, b) obter um extracto periplasmático das referidas células c) purificar o referido polipéptido.
18. 18. Processo de acordo com a reivindicação 17 em que em a) a linha celular é E.coli e em c) a purificação é efectuada por cromatografia em coluna de permuta aniónica seguida de cromatografia numa coluna de filtração em gel.
19. 19. Produto obtido por ligação covalente da porção Cys do transportador polipeptídico universal de acordo com a reivindicação 1, com uma sequência de interesse, para utilização para a entrega da referida sequência de interesse na via do MHC de classe I e do MHC de classe II.
20. 20. Vector de expressão contendo uma sequência de interesse e ligado operativamente a um péptido rico em lisina ligado covalentemente à porção Cys do transportador polipeptídico universal de acordo com a reivindicação 1, para utilização para a entrega da referida sequência de interesse a células que expressam receptor Gb3. ΕΡ 1 355 928/ΡΤ 4/4
21. 21. Vector de expressão de acordo com a reivindicação 20 em que o péptido rico em lisina é uma polilisina 16-mero.
22. 22. Produto de acordo com a reivindicação 19 ou vector de expressão de acordo com as reivindicações 20 e 21 em que a sequência de interesse é seleccionada de entre: - uma sequência que codifica um péptido imunogénico, ou - uma sequência que codifica um fármaco ou um profármaco que se torna tóxico para as células que expressam receptor Gb3, ou - uma sequência que codifica uma molécula terapeuticamente activa.
23. 23. Composição farmacêutica para aumentar a imunogenicidade de um péptido ou de uma proteína ou de uma glicoproteína ou de um lipopéptido, contendo o transportador polipeptídico de acordo com a reivindicação 1 ou 2 ligado covalentemente pela sua porção Cys aos referidos péptido ou proteína ou glicoproteína ou lipopéptido.
24. 24. Composição farmacêutica para tratar células tumorais apresentando o receptor Gb3, contendo o transportador polipeptídico de acordo com a reivindicação 1 ou 2 ligado covalentemente pela sua porção Cys a um fármaco ou um profármaco tóxico para as referidas células tumorais. Lisboa,