ES2225996T3 - Composiciones hibridas para seleccion intracelular. - Google Patents

Abstract

LA INVENCION SE REFIERE A COMPUESTOS HIBRIDOS QUE COMPRENDEN UN PRIMER DOMINIO Y UN SEGUNDO DOMINIO. EL PRIMER DOMINIO Y EL SEGUNDO DOMINIO ESTAN PREFERIBLEMENTE ENLAZADOS DE FORMA COVALENTE, Y EL PRIMER DOMINIO COMPRENDE UN DOMINIO QUE ES CAPAZ DE UNIRSE ESPECIFICAMENTE AL GB 3 ; Y EL SEGUNDO DOMINIO COMPRENDE UNA MOLECULA SELECCIONADA ENTRE EL GRUPO QUE CONSTA DE UNA MOLECULA MEDICAMENTOSA, UN ACIDO NUCLEICO, UNA SONDA, UN POLIPEPTIDO Y UN GANCHO, CON LA CONDICION DE QUE EL SEGUNDO DOMINIO NO SEA UNA VEROTOXINA O UN FRAGMENTO DE LA MISMA. TAMBIEN SE PRESENTAN PROCEDIMIENTOS PARA PREPARAR Y UTILIZAR LOS COMPUESTOS HIBRIDOS. TAMBIEN SE SUMINISTRAN MOLECULAS DE ACIDO NUCLEICO QUE CODIFICAN LA MOLECULA HIBRIDA DE LA INVENCION, VECTORES RECOMBINANTES QUE INCLUYEN UNA MOLECULA DE ACIDO NUCLEICO DE LA INVENCION EN UNA FORMA ADECUADA PARA LA EXPRESION DE LA PROTEINA DE FUSION EN UNA CELULA ANFITRIONA, Y CELULAS ANFITRIONAS QUE INCLUYEN UN VECTOR RECOMBINANTE DE LA INVENCION.

Description

Composiciones híbridas para selección intracelular.

Antecedentes de la invención

Los recientes avances en la comprensión de las bases moleculares de ciertos estados de enfermedad y afecciones han permitido el desarrollo racional, al menos en principio, de terapias diseñadas específicamente para dirigir una entidad o entidades moleculares particulares. Desafortunadamente, a menudo surge una dificultad práctica cuando se intenta tratar enfermedades con fármacos diseñados racionalmente, es decir, aunque el fármaco puede actuar como era de esperar in vitro, para que tenga el efecto terapéutico deseado, el fármaco debe poder alcanzar el sitio de acción in vivo sin activarse o degradarse metabólicamente. En el caso de fármacos que deben reaccionar en un sitio intracelular para ser eficaces, puede ser difícil proporcionar el fármaco en una forma capaz de alcanzar el sitio deseado. Aunque se han realizado muchas propuestas para solucionar este problema, hay pocas estrategias aplicables generalmente a una amplia diversidad de fármacos y estados de enfermedad. Una estrategia ha sido administrar el fármaco en una forma, tal como una preparación de liposomas, que permita que el fármaco atraviese la membrana celular. Sin embargo, los liposomas no dirigidos pueden liberar el fármaco a células u órganos no deseados, y el uso de liposomas dirigidos específicamente puede ser caro o inconveniente.

La ruta endocítica de muchas toxinas proteicas que comprenden subunidades A (enzimática) y B (unión al receptor) separadas, implica a la célula, internalización, translocación desde un compartimento intracelular al citosol, e inactivación enzimática de sus dianas intracelulares (1, 2). Después de la translocación al citoplasma, las subunidades A de la ricina, abrina, modecina y de las verotoxinas inactivan catalíticamente el ARN 28 S de las subunidades ribosómicas 60 S, ocasionando una inhibición de la síntesis de proteínas celulares (3, 4). Además, tanto la holotoxina como la subunidad B son capaces de inducir la muerte celular programada (apoptosis) (5-7).

La familia de verotoxinas derivadas de E coli (o toxinas de tipo Shiga) comprende VT1, VT2 y VT2c, que están implicadas en la etiología de enfermedades microvasculares en el ser humano (8), principalmente en personas muy jóvenes y de edad avanzada (9), y VT2e, que produce la enfermedad de edema en cerdos (10). El glicolípido globotriaosilceramida (galaI-4galbI-4glc cer.- Gb_{3}) en la membrana plasmática es el receptor específico de todas las verotoxinas y media la internalización de la verotoxina (VT1) en células susceptibles por protección terminal y endocitosis mediada por receptor (RME) (11). La verotoxina es el único ligando de unión a glicolípidos que se internaliza en células eucariotas por medio de RME (12-14). Además de la concentración de receptores, tanto la composición de ácidos grasos heterogéneos de Gb_{3} (15, 16), como la longitud de la cadena de fosfolípidos dentro de la bicapa fosfolipídica (17) juegan papeles importantes en la unión e internalización de VT. Ciertos estudios de modelado molecular del sitio de unión de Gb_{3} en la subunidad B (18) demuestran que pueden unirse diferentes confórmeros de Gb_{3} de membrana en diferentes sitios. Tales confórmeros pueden estar relacionados con el contenido de ácidos grasos de Gb_{3} y el microentorno de los fosfolípidos de membrana (18.-20).

El requisito del transporte retrógrado para la intoxicación de células por verotoxina se demostró por primera vez por Sandvig (21). Las células A431 son resistentes a VT. Estas células expresaban Gb_{3}, pero el complejo toxina-receptor se internalizaba en endosomas y lisosomas. Sin embargo, después del crecimiento en presencia de ácido butírico, un inductor de la diferenciación celular, las células A431 pasaron a ser sensibles a VT, coincidiendo con la detección de la toxina internalizada en las cisternas de Golgi, en el ER (retículo endoplásmico) e incluso en la envuelta nuclear (21). Se ha descubierto una dirección similar tanto de la holotoxina como de la subunidad B a la envuelta nuclear en linfomas B muy sensibles a toxinas (11).

Cuando se estudia la sensibilidad de líneas de células de astrocitoma humanas a las verotoxinas, se encuentran diferencias significativas que no se correlacionan con el nivel de expresión del receptor (6). De forma similar, ciertas variantes resistentes a múltiples fármacos (MDR) de líneas de células tumorales de ovario eran hipersensibles a VT en comparación con la línea de células parentales, sin un aumento importante en la expresión del receptor (22). Basándose en estas discrepancias, el tráfico intracelular dependiente de Gb_{3} juega un papel importante en la determinación de la sensibilidad celular a VT.

Sumario de la invención

La invención se refiere a compuestos híbridos y a métodos para preparar y usar dichos compuestos.

En un aspecto, la invención proporciona una molécula híbrida que comprende un primer dominio y un segundo dominio unidos covalentemente, donde (a) el primer dominio comprende una verotoxina o una subunidad de verotoxina que es capaz de unirse específicamente a Gb_{3}; y (b) el segundo dominio comprende un resto seleccionado entre el grupo compuesto por restos de fármaco, un ácido nucleico, una sonda, un polipéptido, y un gancho, con la condición de que el segundo dominio no sea una verotoxina o un fragmento de la misma. En realizaciones preferidas, el primer dominio es VT-B; el segundo dominio es un polipéptido; el polipéptido es un elemento de unión al ADN; el segundo dominio es un ácido nucleico; y el ácido nucleico es un ácido nucleico antisentido.

En otro aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende una molécula híbrida de la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable (que opcionalmente comprende además un compuesto que altera la composición de ácidos grasos de Gb_{3}).

En otro aspecto, la invención se refiere a un método in vitro para dirigir la liberación del compuesto híbrido de la invención en una localización intracelular particular en una célula, comprendiendo el método poner en contacto la célula con el compuesto híbrido, opcionalmente en presencia de un compuesto que altera la composición de ácidos grasos de Gb_{3}, de tal forma que el compuesto híbrido se libere en una localización intracelular particular de la célula.

En otro aspecto, la invención proporciona un compuesto híbrido de la invención para uso en tratamiento, profilaxis o diagnóstico.

En otro aspecto, la invención proporciona un compuesto híbrido de la invención para uso en la dirección de la liberación de la molécula híbrida a una localización intracelular particular en una célula, opcionalmente donde la molécula híbrida se libera en presencia de un compuesto que altera la composición de ácidos grasos de Gb_{3}.

En otro aspecto, la invención proporciona una molécula de ácido nucleico que codifica una molécula híbrida de la invención (en la que el segundo dominio es un polipéptido).

En otro aspecto, la invención proporciona un vector recombinante que comprende una molécula de ácido nucleico de la invención en forma adecuada para la expresión de la proteína de fusión en una célula hospedadora.

En otro aspecto, la invención proporciona una célula hospedadora que comprende un vector recombinante de la invención.

Estos y otros objetos, características y ventajas de la invención serán evidentes tras la siguiente descripción y reivindicaciones.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1. Citotoxicidad de VT1 en diferentes líneas de células de astrocitoma humano. La citotoxicidad de VT1 para seis líneas de células de astrocitoma se determinó como se describe en los métodos. SF-539 es la más sensible y XF-498 la menos sensible de las células a la citotoxicidad de VT1. Cada valor representa la media \pm S.D. de triplicados. Este experimento se repitió tres veces con resultados similares.

Figura 2. Unión de ^{125}I-VT1 a la superficie de células de astrocitoma. Se trataron células SF-529 (\blacksquare), CF 498 (o) y XF-498 tratadas con butirato (\Delta) con diluciones en serie de ^{125}I-VT1 en PBS a 4ºC, se incubaron durante 1 hora y la unión se determinó como se describe en la sección de Métodos. Las tres líneas celulares demuestran niveles similares de unión a VT1. Cada valor representa la media \pm S.D. de determinaciones por triplicado.

Descripción detallada de la invención

La invención se refiere a compuestos híbridos, a ácidos nucleicos que codifican las moléculas híbridas, a métodos para preparar los compuestos híbridos y los ácidos nucleicos que los codifican, y a métodos para tratar a pacientes con las composiciones híbridas.

En un aspecto, la invención proporciona un compuesto híbrido. El compuesto híbrido incluye un primer dominio y un segundo dominio; el primer y el segundo dominios, preferiblemente, están unidos covalentemente. El primer dominio comprende una verotoxina o una subunidad de verotoxina capaz de unirse específicamente a globotriaosilceramida (Gb_{3}) y de internalizarse en una célula que expresa Gb_{3} en la superficie celular. El segundo dominio es un dominio funcional que incluye un resto molecular que se va a liberar dentro de la célula, por ejemplo, en el núcleo de la célula. El segundo dominio preferiblemente no es una verotoxina, una subunidad de verotoxina o un fragmento de la misma. El segundo dominio puede ser, por ejemplo, un resto de fármaco (por ejemplo, una molécula de fármaco unida al primer dominio), un ácido nucleico (por ejemplo, un gen que codifica una proteína exógena, o un ácido nucleico que regula la expresión génica en una célula, tal como un ácido nucleico antisentido, represores o activadores trans), una sonda (tal como una sonda fluorescente), una proteína, y similares. El segundo dominio también puede ser un dominio que funciona como un asa o gancho para la formación de complejos o la unión a otro resto o restos. Por ejemplo, el segundo dominio puede ser un miembro de un par de unión específico (tal como biotina/estreptavidina, hormona/receptor, proteína de unión/ligando, y similares) que puede complejarse o unirse con el otro miembro del par de unión específico que, a su vez, puede unirse a un resto que se desea liberar en el interior de la
célula.

Una molécula híbrida de la invención puede ser una proteína de fusión del primer dominio (por ejemplo, la subunidad B de verotoxina (VT-B)) con un segundo dominio proteico (tal como una proteína de unión al ADN). La proteína de fusión, en ciertas realizaciones, puede unirse o complejarse con un resto a liberar en el interior de una célula. Por ejemplo, en el ejemplo de una fusión de VT-B/proteína de unión al ADN (véase, por ejemplo, el Ejemplo 4, Infra), la proteína de fusión puede prepararse, opcionalmente purificarse, y después unirse a un ácido nucleico para formar un complejo del compuesto híbrido con el ácido nucleico. Tras la presentación del complejo proteína de fusión/ácido nucleico a una célula, y la endocitosis de la proteína de fusión, con el ácido nucleico asociado, dentro de la célula, el ácido nucleico se libera dentro de la célula, por ejemplo en el núcleo, por ejemplo, para promover la transfección de la célula con el ácido nucleico.

Una molécula híbrida de la invención también puede incluir un aducto covalente que no es una molécula de fusión del primer dominio y el segundo dominio. Por ejemplo, son bien conocidos los métodos para la modificación covalente de proteínas y están disponibles en el mercado kits para realizar la conjugación covalente de proteínas con otras proteínas y restos no proteicos. Por ejemplo, un polipéptido o proteína tal como VT-B puede unirse por medio del uso de agentes de enlace heterobifuncionales a restos tales como otras proteínas, ácidos nucleicos, fármacos, sondas o marcadores, y similares. Como ejemplo, un primer dominio, tal como VT-B, puede unirse covalentemente a un polipéptido tal como polilisina (véase, por ejemplo, el Ejemplo 5, Infra). La polilisina puede complejarse con ácidos nucleicos tales como ADN para liberar el ácido nucleico en una célula (véanse, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos Nº 5.635.383 y 5.166.320 de Wu); de esta manera, puede usarse un conjugado de VT-B/polilisina para unirse a un ácido nucleico y transportar el ácido nucleico al interior de una célula, por ejemplo, para aplicaciones tales como terapia génica, terapia antisentido y similares.

En otra realización, la invención se refiere al uso de un compuesto híbrido de la invención para uso en terapia, profilaxis o diagnóstico, por ejemplo, de un compuesto híbrido de la invención para la preparación de un medicamento para tratamiento, profilaxis o diagnóstico. Los compuestos híbridos de la invención encuentran utilidad en métodos de tratamiento tales como el tratamiento de cánceres, por ejemplo, por métodos tales como terapia génica (es decir, por medio de la introducción de un gen que codifica una proteína exógena en una célula, o la introducción de una secuencia supresora o activadora trans en una célula), terapia de ácido nucleico antisentido (es decir, por medio de la introducción de secuencias antisentido, por ejemplo, antisentido con respecto a un oncogen de una célula cancerosa); dirección de un fármaco quimioterapéutico a una célula, y similares.

Como se describe con más detalle más adelante, la invención también proporciona métodos para alterar la diana intracelular de un compuesto híbrido de la invención. De esta manera, por ejemplo, el tratamiento de una célula con butirato sódico puede alterar el destino intracelular de VT-B y, por lo tanto, de un compuesto híbrido de la invención. Como se describe infra, en ciertas células, VT-B se transporta normalmente a los componentes del aparato de Golgi en ausencia de butirato sódico; sin embargo, en presencia de butirato, VT-B se transporta a elementos del retículo endoplásmico y/o la envuelta nuclear. Como también se describe con más detalle más adelante, se considera que este efecto de debe, al menos en parte, a alteraciones en la composición de ácidos grasos del glicolípido de la superficie celular Gb_{3}. La invención contempla en transporte selectivo de un compuesto híbrido de la invención a una localización seleccionada en la célula, por ejemplo, la membrana nuclear o el núcleo. Esta característica de la invención es especialmente útil para aplicaciones de terapia génica (o tratamientos antisentido) en los que se desea que la diana sea el genoma nuclear en lugar del ADN del citoplasma o de orgánulos citoplásmicos. Por consiguiente, en ciertas realizaciones, la invención contempla el tratamiento de una célula con un compuesto (por ejemplo, butirato) o en condiciones capaces de conseguir un cambio en la composición de ácidos grasos de Gb_{3} y, por lo tanto, de promover el transporte selectivo de un compuesto híbrido de la invención a una localización intracelular preseleccionada (por ejemplo, el núcleo).

El especialista en la técnica apreciará que el uso de los compuestos híbridos de la invención proporciona efectos beneficiosos tales como especificidad de la dirección a la célula, la capacidad de liberar casi cualquier resto terapéutico a una célula, la capacidad de dirección específica a estructuras subcelulares, y similares. Por ejemplo, es bien conocido que ciertos tipos celulares, incluyendo ciertas células cancerosas, expresan grandes cantidades de Gb_{3} en la superficie celular, mientras que otros tipos celulares expresan poco Gb_{3} en la superficie celular. Los compuestos híbridos de la invención se internalizarán fácilmente por endocitosis en los primeros tipos celulares, pero se transportarán menos fácilmente al interior del segundo tipo celular. De esta manera, usando los compuestos híbridos de la invención puede convertirse en una diana selectiva un tipo celular que expresa grandes cantidades de Gb_{3} en la superficie celular. De forma importante, ciertas células cancerosas muestran mayores niveles de Gb_{3} que las células normales; por ejemplo, se ha descubierto que las células de tumores de ovario primarios muestran mayores niveles de Gb_{3} que las células del tejido ovárico normal. De esta manera, los compuestos híbridos de la invención pueden usarse para liberar un fármaco, un gen u otro agente terapéutico específicamente a tipos de células cancerosas mientras se evitan los tejidos normales.

El primer dominio

El primer dominio de los compuestos híbridos de la invención comprende una verotoxina o una subunidad de verotoxina que es capaz de unirse específicamente a globotriaosilceramida (Gb_{3}) y es capaz de internalizarse en una célula que expresa Gb_{3} en la superficie celular; por conveniencia, tal dominio algunas veces se denominará en este documento "dominio de unión de VT" aunque, como se describe en este documento, los primeros dominios adecuados para uso en la invención no se limitan a verotoxinas o fragmentos de las mismas. Los dominios adecuados para uso como primer dominio de un compuesto híbrido de la invención incluyen verotoxinas nativas (VT), subunidades de verotoxinas (por ejemplo, la subunidad VT-B) que se une a Gb_{3}, y polipéptidos que comprenden secuencias de aminoácidos homólogas y/o derivadas de la secuencia de aminoácidos de un dominio de unión de VT nativo, que puede incluir más, menos (por ejemplo, una deleción o truncación) o un número igual (por ejemplo, mutaciones puntuales) de aminoácidos que una proteína de dominio de unión de VT de longitud completa, mientras que retiene una afinidad de unión específica sustancial por Gb_{3} (o antígeno asociado al linfoma de Burkitt (BLA) (Nudelman, et al. Science 220:509 (1983), también conocido como antígeno de diferenciación de células B CD77). De esta manera, un "dominio de unión de VT", como se usa en este documento, se refiere a la subunidad de unión al receptor Gb_{3} de verotoxinas o dominios homólogos que tienen actividad de unión a Gb_{3}. Se apreciará que se conocen ciertas proteínas o polipéptidos que tiene una homología sustancial a los dominios de unión de verotoxina (por ejemplo, CD19, una glicoproteína integral de la membrana de la superfamilia de inmunoglobulinas de 95 kDa presente en la superficie celular de linfocitos B humanos desde las primeras fases de desarrollo de las células B hasta la diferenciación terminal de las células B en células plasmáticas (Nadier, et al. J. Immunol. 131:244-250 (1988); Lingwood, C.A. (1996) Trends In Microbiol. 4(4):147-153; Maloney, M.D. y Lingwood, C.A. (1994). J. Exp. Med. 180; 191-201; Nyholm, P.G., Magnusson, H. y Lingwood, C. (1996) Chem. Biol 3:263-275)) y que pueden unirse a Gb_{3} o a restos de la superficie celular parecidos a Gb_{3}; en los compuestos híbridos de la invención se contempla el uso tales proteínas o polipéptidos homólogos. En una realización, el primer dominio de un compuesto híbrido de la invención presenta una homología de al menos aproximadamente 30%, 40%, más preferiblemente de al menos aproximadamente 50%, 60%, incluso más preferiblemente de al menos aproximadamente 70%, 80% y aún más preferiblemente de al menos aproximadamente 90%, siendo la homología más preferida de al menos aproximadamente 95% (o más) con un dominio de unión a Gb_{3} de una verotoxina nativa (o subunidad de verotoxina). Típicamente, las porciones biológicamente activas comprenden un dominio o motivo con al menos una actividad de un dominio de unión de VT. Una porción biológicamente activa de una proteína de dominio de unión de VT puede ser un polipéptido que, por ejemplo, tiene una longitud de 10, 25, 50,100 o más aminoácidos.

En una realización, una porción biológicamente activa de una proteína de dominio de unión de VT comprende al menos un dominio de unión a Gb_{3}. En otras realizaciones, una porción biológicamente activa de una proteína de dominio de unión de VT comprende dos, tres o cuatro dominios de unión a Gb_{3}.

Además, pueden prepararse otras porciones biológicamente activas, en las que se han delecionado otras regiones de la proteína, por técnicas recombinantes y evaluarse con respecto a una o más de las actividades funcionales de una proteína de dominio de unión de VT nativa. El especialista en la técnica apreciará que la holotoxina VT tiene una toxicidad significativa en ciertos tipos celulares. La toxicidad de la holotoxina VT se debe en gran medida (aunque no totalmente) a la subunidad A de la VT; la VT-B aislada tiene una toxicidad mucho menor contra la mayoría de los tipos celulares que la holotoxina. Por consiguiente, en realizaciones preferidas, un compuesto híbrido de la invención no comprende la subunidad VT, o una porción de la misma, que confiere toxicidad celular a la holotoxina VT; por ejemplo, en realizaciones preferidas, un compuesto híbrido de la invención no incluye la subunidad VT A, o cualquier porción sustancialmente citotóxica de la misma. De esta manera, en una realización preferida, el primer dominio de un compuesto híbrido de la invención consta esencialmente de VT-B, o un homólogo del mismo, o un fragmento del mismo, que carece sustancialmente de la subunidad VT A o de porciones de la subunidad VT A. Por supuesto, si se desea usar un compuesto híbrido de la invención para destruir una célula (tal como una célula cancerosa o una célula infectada por un virus), puede emplearse un resto tóxico como segundo dominio, por ejemplo, todo o parte de una proteína tóxica tal como ricina, toxina diftérica, toxina tetánica y similares.

Para determinar el porcentaje de homología de dos secuencias de aminoácidos o de dos ácidos nucleicos, las secuencias se alinean para poder realizar una comparación óptima (por ejemplo, pueden introducirse huecos en una primera secuencia de aminoácidos o de ácido nucleico para conseguir una alineación óptima con una segunda secuencia de aminoácidos o de ácido nucleico). Después se comparan los restos aminoacídicos o los nucleótidos en las correspondientes posiciones de aminoácidos o posiciones de nucleótidos. Cuando una posición en la primera secuencia está ocupada por el mismo resto aminoacídico o nucleótido que la posición correspondiente en la segunda secuencia, entonces las moléculas son homólogas en esa posición (es decir, como se usa en este documento, "homología" de aminoácidos o de ácido nucleico es equivalente a "identidad" de aminoácidos o de ácido nucleico''). El porcentaje de homología entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (es decir, % homología = nº de posiciones idénticas/nº total de posiciones x 100).

El segundo dominio

El segundo dominio de un compuesto híbrido de la invención puede ser casi cualquier resto que se desee transportar al interior de una célula (in vitro o in vivo) y que sea capaz de unirse (por ejemplo, por medio de un enlace covalente) al primer dominio del compuesto de la invención. El segundo dominio también puede ser un asa o gancho para la unión o complejación con un tercer componente (por ejemplo, un ácido nucleico, y similares).

Los ejemplos de segundos dominios contemplados para uso en los compuestos híbridos de la invención incluyen proteínas, polipéptidos y fragmentos de los mismos (incluyendo peptidomiméticos, análogos de aminoácidos y similares). Por ejemplo, un segundo dominio puede comprender una proteína, por ejemplo, eritropoyetina, hormona de crecimiento humana, insulina, somatostatina, EGF e interleuquinas I, II, III, IV y VI, una toxina proteica, y similares. Se apreciará que el uso de un segundo dominio que por sí mismo tiene una especificidad particular por un receptor de la superficie celular puede proporcionar especificidad adicional al compuesto híbrido de la invención cuando se administra a un sujeto, por ejemplo, un ser humano o un animal. Por ejemplo, un compuesto híbrido que incluye VT-B como primer dominio y sustancia P como segundo dominio puede dirigirse preferentemente a células que expresan tanto Gb_{3} como receptores de la sustancia P.

Otros ejemplos de segundos dominios incluyen ácidos nucleicos, por ejemplo, ADN, ARN, ácidos nucleicos quiméricos de ADN/ARN y similares, así como análogos de ácidos nucleicos tales como ácidos nucleicos de fosforotioato (véanse, por ejemplo, Cornish et al., Pharmacol. Com. 3: 239-247, 1993; Crooks, Ann. Rev. Pharm. Toxicol. 32: 329-376, 1992; Iversen, Anti-cáncer Drug Design 6: 531-538, 1991). Un ácido nucleico puede codificar, por ejemplo, una proteína o un fragmento de la misma, puede ser una secuencia reguladora tal como una secuencia represora o promotora, o puede ser un complemento de una secuencia de nucleótidos presente en una célula, por ejemplo, para uso en una terapia antisentido.

Otros ejemplos adicionales de segundos dominios útiles en los compuestos híbridos de la invención incluyen hormonas (polipeptídicas o no polipeptídicas) (por ejemplo, esteroides) u otros restos biológicamente activos (por ejemplo, retinoides) que pueden afectar a propiedades tales como el crecimiento o diferenciación celular, y similares. Otros ejemplos de segundos dominios incluyen restos de fármaco, por ejemplo, restos de modificación del ADN para el tratamiento del cáncer.

Otros ejemplos adicionales de segundos dominios incluyen sondas, por ejemplo, sondas para examinar la estructura celular (por ejemplo, para uso in vitro, incluyendo marcadores de radioisótopos, marcadores fluorescentes (por ejemplo isotiocianato de fluoresceína, isotiocianato de rodamina, fural y similares), marcadores de átomos pesados tales como partículas de oro, y similares), marcadores para estudios in vivo (por ejemplo, marcadores detectables por rayos X, agentes para la formación de imágenes por resonancia magnética y similares), o radioisótopos o un quelante para un radioisótopo (por ejemplo, véase Infra) y similares. De esta manera, la invención proporciona compuestos híbridos que encuentran uso como agentes de diagnóstico, por ejemplo, para uso en estudios de cultivo de células o cuando se formulan en un vehículo farmacéuticamente aceptable para administración a un sujeto. Sin embargo, en ciertas realizaciones preferidas, el segundo dominio no comprende isotiocianato de fluoresceína o isotiocianato de rodamina.

Otros ejemplos de segundos dominios incluyen un asa o gancho (polipeptídico o no polipeptídico) para unirse o formar un complejo con un tercer componente. Por ejemplo, un segundo resto puede ser un miembro de un par de unión específico (por ejemplo, receptor/ligando, hormona/receptor, ácido nucleico/complemento, enzima/ligando y similares). Después, un compuesto híbrido que incluye un gancho como segundo dominio puede usarse para transportar una molécula complementaria al interior de una célula por endocitosis, por ejemplo, un compuesto híbrido que incluye una secuencia de estreptavidina (o una porción de la misma) puede usarse para unirse a biotina, que a su vez puede unirse o acoplarse a un resto para liberarse en el interior de una célula (por ejemplo, un ácido nucleico biotinilado o similares). Un segundo resto también puede ser, por ejemplo, un resto que se une de una manera no específica a un tercer componente que se va a liberar en una célula. Por ejemplo, puede usarse un compuesto híbrido de VT-B/policatión (por ejemplo, polilisina) (véase, por ejemplo, el Ejemplo 5, infra) para liberar un compuesto cargado negativamente (por ejemplo, un ácido nucleico tal como ADN) en una célula por endocitosis.

Compuestos híbridos

De esta manera, la invención contempla una amplia diversidad de compuestos híbridos, que tienen un gran número de usos.

En ciertas realizaciones, los compuestos híbridos de la invención incluyen un primer dominio y un segundo dominio (por ejemplo, como se ha descrito anteriormente), unidos covalentemente. El enlace covalente puede proporcionarse de muchas formas que serán rutinarias para el especialista habitual en la técnica. Por ejemplo, el segundo dominio puede unirse covalentemente al primer dominio por medio de la química conocida para la modificación covalente de proteínas, por ejemplo, el uso de enlazadores heterobifuncionales, en los que un grupo funcional puede reaccionar con un grupo funcional de una proteína (por ejemplo, el primer dominio) (por ejemplo, un tiol de la cadena lateral, amina, o carboxilato del primer dominio) y un segundo grupo funcional puede reaccionar con un resto del segundo dominio (por ejemplo, un grupo de cadena lateral, siendo el segundo dominio un polipéptido, un grupo hidroxilo de un ácido nucleico, un fármaco, una hormona, y similares). En la técnica se conoce una amplia diversidad de reactivos de entrecruzamiento bifuncionales o polifuncionales, tanto homo- como heterofucionales, y están disponibles en el mercado (por ejemplo, Pierce Chemical Co., Rockford, IL). Por consiguiente, un especialista habitual en la técnica podrá preparar una amplia diversidad de compuestos híbridos de la invención usando no más que una experimentación rutinaria. Se entenderá que el primer y segundo dominios pueden unirse covalentemente a través de un resto de unión; el resto de unión puede ser de cualquier longitud o composición química deseada para asegurar que el primer y el segundo dominios sean capaces de realizar una función deseada, por ejemplo, el enlazador puede ser suficientemente largo para asegurar que el impedimento estérico no afecta significativa y perjudicialmente a la capacidad del primer o del segundo dominio de realizar una función deseada tal como la unión a una diana celular.

La invención también proporciona proteínas de fusión, por ejemplo, proteínas de fusión o quiméricas del dominio de unión de VT. La expresión "proteína de fusión" pretende describir al menos dos polipéptidos, típicamente de diferentes orígenes, que están unidos operativamente. Con respecto a los polipéptidos, la expresión "unido operativamente" pretende hacer referencia a que los dos polipéptidos están conectados de tal manera que cada polipéptido pueda realizar su función deseada. Típicamente (aunque no exclusivamente), los dos polipéptidos están unidos covalentemente a través de enlaces peptídicos. La proteína de fusión preferiblemente se produce por técnicas de ADN recombinante convencionales. Por ejemplo, una molécula de ADN que codifica el primer polipéptido se une a otra molécula de ADN que codifica el segundo polipéptido, y la molécula de ADN híbrida resultante se expresa en una célula hospedadora para producir la proteína de fusión. Las moléculas de ADN están unidas entre sí en una orientación 5' a 3' de tal forma que, después de la unión, no se altere la fase de traducción de los polipéptidos codificados (es decir, las moléculas de ADN se unen entre sí en fase).

De esta manera, una "proteína quimérica" o "proteína de fusión" de dominio de unión de VT comprende un primer dominio, por ejemplo, un polipéptido del dominio de unión de VT unido operativamente a un segundo dominio, por ejemplo, un segundo polipéptido, que preferiblemente no es un polipéptido del dominio de unión de VT, por ejemplo, un polipéptido que no es sustancialmente homólogo a una proteína del dominio de unión de VT, por ejemplo una proteína que es diferente de la proteína del dominio de unión de VT y que procede del mismo organismo o de un organismo diferente. De esta manera, el segundo dominio preferiblemente no es un polipéptido que forma parte de una proteína natural que se une selectivamente a Gb_{3}. El polipéptido del segundo dominio puede fusionarse al extremo N o C del polipéptido del primer dominio. En una realización preferida, el segundo dominio comprende al menos aproximadamente 5 restos aminoacídicos, más preferiblemente aproximadamente 10, 20, 30, 40, 50, 100 ó 200 restos aminoacídicos. Como se describe en este documento, por ejemplo, en el Ejemplo 4, Infra, una proteína de fusión puede incluir una secuencia de polipéptido enlazador entre el primer y el segundo dominios, por ejemplo, 6-12 restos hidrófilos. Tal secuencia de polipéptido enlazador puede proporcionarse por una construcción de ácido nucleico que incluye una secuencia de nucleótidos que codifica el primer dominio, una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia del polipéptido enlazador, y una secuencia de nucleótidos que codifica el segundo dominio.

Por ejemplo, en una realización, una proteína de fusión del dominio de unión de VT comprende un dominio de unión a Gb_{3} unido operativamente al dominio extracelular de una segunda proteína. Tales proteínas de fusión pueden utilizarse adicionalmente para liberar moléculas en la región intracelular de una célula, por ejemplo, para liberar composiciones farmacéuticas.

En otra realización, la proteína de fusión es una proteína de fusión GST-dominio de unión de VT en la que las secuencias del dominio de unión de VT están fusionadas al extremo C de las secuencias de GST. Tales proteínas de fusión pueden facilitar la purificación del dominio de unión de VT recombinante.

Preferiblemente, una proteína quimérica o de fusión del dominio de unión de VT de la invención se produce por técnicas de ADN recombinante convencionales. Por ejemplo, se unen fragmentos de ADN que codifican las diferentes secuencias polipeptídicas entre sí en fase de acuerdo con técnicas convencionales, por ejemplo, empleando extremos romos o extremos escalonados para la unión, digestión con enzimas de restricción para proporcionar los extremos apropiados, relleno de extremos cohesivos según sea apropiado, tratamiento con fosfatasa alcalina para evitar la unión indeseable, y unión enzimática. En otra realización, el gen de fusión puede sintetizarse por técnicas convencionales que incluyen sintetizadores de ADN automáticos. Como alternativa, puede realizarse la amplificación por PCR de fragmentos génicos usando cebadores de anclaje que proporcionan salientes complementarios entre dos fragmentos génicos consecutivos que posteriormente pueden hibridar y reamplificarse para generar una secuencia génica quimérica (véase, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al. John Wiley & Sons: 1992). Además, en el mercado están disponibles muchos vectores de expresión que ya codifican un resto de fusión (por ejemplo, un polipéptido GST). Un ácido nucleico que codifica un dominio de unión de VT puede clonarse en tal vector de expresión de tal manera que el resto de fusión esté unido en fase a la proteína del dominio de unión de VT.

A partir de lo anterior se apreciará que la invención también proporciona ácidos nucleicos (por ejemplo, ADN) que codifican las proteínas de fusión de la invención. Los ácidos nucleicos que codifican las proteínas de fusión de la invención son ácidos nucleicos de la invención. De esta manera, en otro aspecto, la invención proporciona una molécula de ácido nucleico (preferiblemente aislada) que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un primer dominio polipeptídico que es capaz de unirse específicamente a globotriaosilceramida y un segundo dominio polipeptídico. El segundo dominio polipeptídico puede ser, por ejemplo, cualquiera de los dominios polipeptídicos descritos en este documento.

En una realización, pueden identificarse variantes de la porción del dominio de unión de VT de la proteína de fusión del dominio de unión de VT que funcionan como agonistas del dominio de unión de VT (miméticos) o como antagonistas del dominio de unión de VT mediante investigación de bibliotecas combinatorias de mutantes, por ejemplo, mutantes truncados, de la proteína del dominio de unión de VT, con respecto a actividades agonistas o antagonistas de la proteína del dominio de unión de VT. En una realización, se genera una biblioteca variegada de variantes del dominio de unión de VT por mutagénesis combinatoria a nivel del ácido nucleico y se codifica por una biblioteca génica variegada. Una biblioteca variegada de variantes de dominios de unión de VT puede producirse, por ejemplo, por medio de la unión enzimática de una mezcla de oligonucleótidos sintéticos en secuencias génicas de tal manera que una serie degenerada de secuencias del dominio de unión de VT potenciales se puedan expresar como polipéptidos individuales o, como alternativa, como una serie de proteínas de fusión mayores (por ejemplo, para la presentación de fagos) que contienen la serie de secuencias de dominios de unión de VT en su interior. Hay varios métodos que pueden usarse para producir bibliotecas de variantes potenciales de dominios de unión de VT a partir de una secuencia oligonucleotídica degenerada. La síntesis química de una secuencia génica degenerada puede realizarse en un sintetizador de ADN automático, y el gen sintético después puede unirse a un vector de expresión adecuado. El uso de una serie degenerada de genes permite la provisión, en una mezcla, de todas las secuencias que codifican la serie deseada de secuencias del dominio de unión de VT potenciales. En la técnica se conocen métodos para sintetizar oligonucleótidos degenerados (véase, por ejemplo, Narang, S.A. (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura et al. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura et al. (1984) Science 198:1056; Ike et al. (1983) Nucleic Acid Res. 11:477.

Además, pueden usarse bibliotecas de fragmentos de la secuencia codificante de la proteína del dominio de unión de VT para generar una población variegada de fragmentos de dominios de unión de VT para la investigación y posterior selección de variantes de una proteína del dominio de unión de VT. En una realización, puede generarse una biblioteca de fragmentos de secuencia codificante tratando un fragmento de PCR bicatenario de una secuencia codificante del dominio de unión de VT con una nucleasa en condiciones en las que se producen muescas sólo aproximadamente una vez por molécula, desnaturalizando el ADN bicatenario, renaturalizando el ADN para formar ADN bicatenario que pueda incluir pares con sentido/antisentido de diferentes productos con muesca, retirando las porciones monocatenarias de los duplex reformados por tratamiento con la nucleasa S 1, y uniendo la biblioteca de fragmentos resultante en un vector de expresión. Por medio de este método puede obtenerse una biblioteca de expresión que codifique fragmentos N-terminales e internos de diversos tamaños de la proteína del dominio de unión de VT.

En la técnica se conocen varios métodos para investigar productos génicos de bibliotecas combinatorias obtenidos por mutaciones puntuales o truncación, y para seleccionar en bibliotecas de ADN productos génicos que tengan una propiedad seleccionada. Tales técnicas son adaptables para la investigación rápida de bibliotecas génicas generadas por mutagénesis combinatoria de proteínas del dominio de unión de VT. Las técnicas usadas más ampliamente, que son susceptibles de análisis de alto rendimiento, para la investigación de grandes bibliotecas génicas típicamente incluyen la clonación de la biblioteca génica en vectores de expresión replicables, la transformación de las células apropiadas con la biblioteca de vectores resultante, y la expresión de los genes combinatorios en condiciones en las que la detección de una actividad deseada facilita el aislamiento del vector que codifica el gen cuyo producto se detectó. Puede usarse una mutagénesis de conjunto recursiva (REM), una nueva técnica que aumenta la frecuencia de mutantes funcionales en las bibliotecas, en combinación con los ensayos de selección para identificar variantes del dominio de unión de VT (Arkin y Yourvan (1992) PNAS 89:7811-7815; Delgrave et al. (1993) Protein Engineering 6(3): 327-331).

Una proteína del dominio de unión de VT aislada, o una porción o fragmento de la misma, puede usarse como inmunógeno para generar anticuerpos que se unen al dominio de unión de VT usando técnicas convencionales para la preparación de anticuerpos policlonales y monoclonales. Puede usarse la proteína del dominio de unión de VT de longitud completa o, como alternativa, la invención proporciona fragmentos de péptidos antigénicos del dominio de unión de VT para uso como inmunógenos. El péptido antigénico del dominio de unión de VT comprende al menos 8 restos aminoacídicos de la secuencia de aminoácidos del dominio de unión de VT de tal forma que un anticuerpo inducido contra el péptido forme un complejo inmune específico con el dominio de unión de VT. Preferiblemente, el péptido antigénico comprende al menos 10 restos aminoacídicos, más preferiblemente al menos 15 restos aminoacídicos, e incluso más preferiblemente al menos 20 restos aminoacídicos, siendo lo más preferido que comprenda al menos 30 restos aminoacídicos.

Un anticuerpo de acuerdo con la invención puede usarse para liberar un resto dentro de una célula, por ejemplo, un resto puede unirse a un anticuerpo y el anticuerpo puede unirse a un dominio de unión de VT. El complejo después puede internalizarse en una célula como se describe en este documento, liberando de esta manera el resto en la célula.

Un inmunógeno de dominio de unión de VT típicamente se usa para preparar anticuerpos por inmunización de un sujeto adecuado (por ejemplo, conejo, cabra, ratón u otro mamífero) con el inmunógeno. Una preparación inmunogénica apropiada puede contener, por ejemplo, proteína de dominio de unión de VT expresada de manera recombinante o un polipéptido de dominio de unión de VT sintetizado químicamente. La preparación también puede incluir un adyuvante, tal como adyuvante completo o incompleto de Freund, o un agente inmunoestimulador similar. La inmunización de un sujeto adecuado con una preparación del dominio de unión de VT inmunogénico induce una respuesta de anticuerpos policlonales anti-dominio de unión de VT.

Por consiguiente, otro aspecto de la invención se refiere a anticuerpos anti-dominio de unión de VT. El término "anticuerpo", como se usa en este documento, se refiere a moléculas de inmunoglobulina y porciones inmunológicamente activas de moléculas de inmunoglobulina, es decir, moléculas que contienen un sitio de unión a antígenos que se une específicamente (presenta una reacción inmunológica con) un antígeno, tal como un dominio de unión de VT. Los ejemplos de porciones inmunológicamente activas de moléculas de inmunoglobulina incluyen fragmentos F(ab) y F(ab')_{2} que pueden generarse tratando el anticuerpo con una enzima tal como pepsina. La invención proporciona anticuerpos policlonales y monoclonales que se unen al dominio de unión de VT. La expresión "anticuerpo monoclonal" o "composición de anticuerpo monoclonal", como se usa en este documento, se refiere a una población de moléculas de anticuerpo que contiene sólo una especie de un sitio de unión a antígenos capaz de presentar reacción inmunológica con un epítopo particular del dominio de unión de VT. De esta manera, una composición de anticuerpo monoclonal típicamente presenta una sola afinidad de unión por una proteína del dominio de unión de VT particular con la que presenta reacción inmunológica.

Pueden prepararse anticuerpos policlonales anti-dominio de unión de VT como se ha descrito anteriormente por medio de la inmunización de un sujeto adecuado con un inmunógeno del dominio de unión de VT. La titulación de anticuerpos anti-dominio de unión de VT en el sujeto inmunizado puede controlarse a lo largo del tiempo por técnicas convencionales, tales como con un ensayo de inmunoabsorbente con enzima unida (ELISA) usando el dominio de unión de VT inmovilizado. Si se desea, las moléculas de anticuerpo dirigidas contra el dominio de unión de VT pueden aislarse a partir del mamífero (por ejemplo, de la sangre) y purificarse adicionalmente por técnicas bien conocidas, tales como cromatografía de proteína A, para obtener la fracción de IgG. En un momento apropiado después de la inmunización, por ejemplo, cuando las titulaciones del anticuerpo anti-dominio de unión de VT son las máximas, pueden obtenerse células productoras de anticuerpos a partir del sujeto y usarse para preparar anticuerpos monoclonales por técnicas convencionales, tales como la técnica de hibridoma descrita originalmente por Kohler y Milstein (1975) Nature 256:495-497) (véase también Brown et al. (1981) J. Immunol. 127:539-46; Brown et al. (1980) J. Biol. Chem. 255.4980-83; Yeh et al. (1976) PNAS 76:2927-31; y Yeh et al. (1982) Int. J. Cancer 29:269-76), la técnica de hibridoma de células B humanas más reciente (Kozbor et al. (1983) Immunol Today 4:72), la técnica de hibridoma-EBV (Cole et al. (1985), Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., p. 77-96) o técnicas de trioma. La tecnología para producir hibridomas de anticuerpos monoclonales es bien conocida (véase, en general, R. H. Kenneth, en Monoclonal Antibodies: A New Dimension in Biological Analyses, Plenum Publishing Corp., New York, New York (1980); E. A. Lerner (1981) Yale J. Biol. Med., 54:387-402; M. L. Gefter et al. (1997) Somatic Cell Genet. 3:231-36). En resumen, una línea de células inmortales (típicamente un mieloma) se fusiona con linfocitos (típicamente esplenocitos) de un mamífero inmunizado con un inmunógeno del dominio de unión de VT como se ha descrito anteriormente, y los sobrenadantes de cultivo de las células de hibridoma resultantes se investigan para identificar un hibridoma que produzca un anticuerpo monoclonal que se una al dominio de unión de VT.

Para generar un anticuerpo monoclonal anti-dominio de unión de VT puede aplicarse cualquiera de los muchos protocolos bien conocidos usados para fusionar linfocitos y líneas de células inmortalizadas (véase, por ejemplo, G. Galfre et al. (1977) Nature 266:55052; Gefter et al. Somatic Cell Genet., citados supra; Lerner, Yale J. Biol. Med., citado supra; Kenneth, Monoclonal Antibodies, citado supra). Además, el especialista habitual apreciará que hay muchas variaciones de tales métodos que también serían útiles. Típicamente, la línea de células inmortales (por ejemplo, una línea de células de mieloma) procede de la misma especie de mamífero que los linfocitos. Por ejemplo, pueden obtenerse hibridomas murinos fusionando linfocitos procedentes de un ratón inmunizado con una preparación inmunogénica de la presente invención con una línea de células de ratón inmortalizada. Las líneas celulares inmortales preferidas son líneas de células de mieloma de ratón que son sensibles a medios de cultivo que contienen hipoxantina, aminopterina y timidina ("medio HAT"). Como molécula de fusión puede usarse cualquiera de varias líneas de células de mieloma de acuerdo con técnicas convencionales, por ejemplo, las líneas de mieloma P3-NS1/1-Ag4-1, P3-x64-Ag8.653 o Sp2/O-Ag14. Estas líneas de mieloma están disponibles en ATCC. Típicamente, las células de mieloma de ratón sensibles a HAT se fusionan con esplenocitos de ratón usando polietilenglicol ("PEG"). Después, las células de hibridoma resultantes de la fusión se seleccionan usando medio HAT que destruye las células de mieloma no fusionadas y fusionadas de manera no productiva (los esplenocitos no fusionados mueren después de varios días porque no se transforman). Las células de hibridoma que producen un anticuerpo monoclonal de la invención se detectan por selección de los anticuerpos que se unen al dominio de unión de VT en los sobrenadantes de cultivo del hibridoma, por ejemplo, usando un ensayo ELISA convencional.

Como alternativa a la preparación de hibridomas de secreción de anticuerpos monoclonales, puede identificarse un anticuerpo monoclonal anti-dominio de unión de VT y aislarse por selección de una biblioteca de inmunoglobulinas combinatoria recombinante (por ejemplo, una biblioteca de presentación de anticuerpos en fagos) con el dominio de unión de VT para aislar de esta manera miembros de la biblioteca de inmunoglobulinas que se unan al dominio de unión de VT. En el mercado están disponibles kits para generar y seleccionar bibliotecas de presentación de fagos (por ejemplo, el Recombinant Phage Antibody System de Pharmacia, Nº de catálogo 27-9400-0 1; y el kit de Stratagene SurfZAP^{TM} Phage Display Kit, Nº de catálogo 240612). Además, pueden encontrarse ejemplos de métodos y reactivos particularmente susceptibles de uso en la generación y selección de bibliotecas de presentación de anticuerpos en, por ejemplo, Ladner et al. Patente de Estados Unidos Nº 5.223.409; Kang et al. Publicación Internacional PCT Nº WO 92/18619; Dower et al. Publicación Internacional PCT Nº WO 91/17271; Winter et al. Publicación Internacional PCT Nº WO 92/20791; Markland et al. Publicación Internacional PCT Nº WO92/15679; Breitling et al. Publicación Internacional PCT Nº WO93/01288; McCafferty et al. Publicación Internacional PCT Nº WO 92/01047; Garrard et al. Publicación Internacional PCT Nº WO 92/09690; Ladner et al. Publicación Internacional PCT Nº WO 90/02809; Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9: 1370-1372; Hay et al. (1992) Hum. Antibod. Hybridomas 3:81-85 ; Huse et al. (1989) Science 246; 1275-1281; Griffiths et al. (1993) EMBO J 12:725-734; Hawkins et al. (1992) J. Mol. Biol. 226: 889:896; Clarkson et al. (1991) Nature 352:624-628; Gram et al. (1992) PNAS 89:3567-3580 ; Garrad et al. (1991) Bio/Technology 9:1373-1377; Hoogenboorn et al. (1991) Nuc. Acid Res. 19: 4133-4137; Barbas et al. (1991) PNAS 88; 7978-7982; y McCafferty et al. Nature (1990) 348: 552-554.

Además, dentro del alcance de la invención se encuentran anticuerpos recombinantes anti-dominio de unión de VT, tales como anticuerpos monoclonales quiméricos y humanizados, que comprenden tanto porciones humanas como porciones no humanas, que pueden obtenerse usando técnicas de ADN recombinante convencionales. Tales anticuerpos monoclonales quiméricos y humanizados pueden producirse por técnicas de ADN recombinante conocidas en la técnica, por ejemplo, usando métodos descritos en Robinson et al. Solicitud de Patente Internacional Nº PCT/US86/02269; Akira, et al. Solicitud de Patente Europea 184.187; Taniguchi, M., Solicitud de Patente Europea 171.496; Morrison et al. Solicitud de Patente Europea 173.494; Neuberger et al. Publicación Internacional PCT Nº WO 86/01533; Cabilly et al., Patente de Estados Unidos Nº 4.816.567; Cabilly et al., Solicitud de Patente Europea 125.023; Better et al. (1988) Science 240:1041-1043; Liu et al. (1987) PNAS 84:3439-3443; Liu et al. (1987) J. Immunol. 139:3521-3526; Sun et al. (1987) PNAS 84:214-218; Nishimura et al. (1987)Canc. Res. 47:999-1005; Wood et al. (1985) Nature 314:446-449; y Shaw et al. (1988) J. Natl. Cancer Inst 80:1553-1559); Morrison, S. L. (1985) Science 229:1202-1207; Oj et al. (1986) BioTechniques 4:214; Winter, Patente de Estados Unidos Nº 5.225.539; Jones et al. (1986) Nature 321:552-525; Verhoeyan et al. (1988) Science 239:1534; y Beidler et al. (1988) J. Immunol. 141:4053-4060.

Puede usarse un anticuerpo anti-dominio de unión de VT (por ejemplo, un anticuerpo monoclonal) para aislar el dominio de unión de VT por técnicas convencionales, tales como cromatografía de afinidad o inmunoprecipitación. Un anticuerpo anti-dominio de unión de VT puede facilitar la purificación del dominio de unión de VT natural a partir de las células y del dominio de unión de VT producido de manera recombinante expresado en células hospedadoras. Además, un anticuerpo anti-dominio de unión de VT puede usarse para detectar una proteína del dominio de unión de VT (por ejemplo, en un lisado celular o sobrenadante celular) para evaluar la abundancia y modelo de expresión de la proteína del dominio de unión de VT. Pueden usarse anticuerpos anti-dominio de unión de VT como herramientas de diagnóstico para controlar los niveles de proteínas en los tejidos como parte de un procedimiento de ensayo clínico, por ejemplo, para determinar la eficacia de un régimen de tratamiento dado. La detección puede facilitarse por acoplamiento (es decir, unión física) del anticuerpo a una sustancia detectable. Los ejemplos de sustancias detectables incluyen diversas enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, materiales bioluminiscentes y materiales radiactivos. Los ejemplos de enzimas adecuadas incluyen peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, \beta-galactosidasa, o acetilcolinesterasa; los ejemplos de complejos de grupos prostéticos adecuados incluyen estreptavidina/biotina y avidina/biotina; los ejemplos de materiales fluorescentes adecuados incluyen umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina, fluoresceína, cloruro de dansilo o ficoeritrina; un ejemplo de un material luminiscente incluye luminol; los ejemplos de materiales bioluminiscentes incluyen luciferasa, luciferina y aequorin, y los ejemplos de materiales radiactivos adecuados incluyen ^{125}I, ^{131}I, ^{35}S o ^{3}H.

Vectores de expresión recombinante y células hospedadoras.

Otro aspecto de la invención se refiere a vectores, preferiblemente vectores de expresión, que contienen un ácido nucleico que codifica una proteína de fusión de la invención, por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico que codifica un dominio de unión de VT (o una porción del mismo) unido operativamente a al menos otra secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido (por ejemplo, un segundo dominio de un compuesto híbrido de la invención) en una forma adecuada para la expresión de la proteína de fusión en una célula hospedadora. La expresión "en una forma adecuada para la expresión de la proteína de fusión en una célula hospedadora" pretende hacer referencia a que el vector de expresión recombinante incluye una o más secuencias reguladoras unidas operativamente al ácido nucleico que codifica la proteína de fusión de una manera que permite la transcripción del ácido nucleico en ARNm y la traducción del ARNm en la proteína de fusión. La expresión "secuencia reguladora" se reconoce en la técnica y pretende incluir promotores, potenciadores y otros elementos de control de la expresión (por ejemplo, señales de poliadenilación). Tales secuencias reguladoras son conocidas por los especialistas en la técnica y se describen en Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). Debe entenderse que el diseño del vector de expresión puede depender de factores tales como la elección de la célula hospedadora a transfectar y/o la cantidad de proteína de fusión a expresar.

Como se usa en este documento, la expresión "vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al que se ha unido. Un tipo de vector es un "plásmido", que se refiere a un bucle de ADN bicatenario circular al que pueden unirse segmentos de ADN adicionales. Otro tipo de vector es un vector viral, pudiendo unirse segmentos de ADN adicionales al genoma viral. Por ejemplo, pueden usarse retrovirus, adenovirus y virus asociados a adeno con defectos en la replicación. Pueden encontrarse protocolos para producir retrovirus recombinantes y para infectar células in vitro o in vivo con tales virus en Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel F.M. et al. (ads.) Greene Publishing Associates, (1989), Sections 9.10-9.14 y otros manuales de laboratorio convencionales. Los ejemplos de retrovirus adecuados incluyen pLj, pZIP, pWE y pEM, que son bien conocidos para los especialistas en la técnica. Los ejemplos de líneas de virus de empaquetamiento adecuados incluyen \PsiCrip, \PsiCre, \Psi2 y \PsiAm. El genoma de los adenovirus puede manipularse de tal forma que codifique y exprese una proteína de fusión transactivadora, pero se inactiva en términos de su capacidad de replicarse en un ciclo de vida viral lítico normal. Véanse, por ejemplo, Berkner et al. (1988) BioTechniques 6:616; Rosenfeld et al. (1991) Science 252:431-434; y Rosenfeld et al. (1992) Cell 68:143-155. Los vectores adenovirales adecuados derivados de la cepa de adenovirus Ad tipo 5 d1324 u otras cepas de adenovirus (por ejemplo, Ad2, Ad3, Ad7, etc.) son bien conocidos para los especialistas en la técnica. Como alternativa, puede usarse un vector de virus asociado a adeno tal como el descrito en Tratschin et al. (1995) Mol. Cell. Biol. 5:3251-3260 para expresar una proteína de fusión de la invención.

Ciertos vectores pueden replicarse de forma autónoma en una célula hospedadora en la que se introducen (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen de replicación bacteriano y vectores episomales de mamíferos). Otros vectores (por ejemplo, vectores no episomales de mamífero) se integran en el genoma de una célula hospedadora tras la introducción en la célula hospedadora y, por lo tanto, se replican junto con el genoma del hospedador. Además, ciertos vectores pueden dirigir la expresión de genes con los que están unidos operativamente. Tales vectores se denominan en este documento "vectores de expresión". En general, los vectores de expresión de utilidad en las técnicas de ADN recombinante a menudo están en forma de plásmidos. En la presente memoria descriptiva, "plásmido" y "vector" pueden usarse indistintamente, ya que el plásmido la mayoría de las veces se usa en forma de vector. Sin embargo, la invención pretende incluir otras formas de vectores de expresión tales como vectores virales (por ejemplo, retrovirus con defectos en la replicación, adenovirus y virus asociados a adeno) que tienen funciones equivalentes.

Los vectores de expresión recombinantes de la invención comprenden un ácido nucleico de la invención en una forma adecuada para la expresión del ácido nucleico en una célula hospedadora, lo que significa que los vectores de expresión recombinantes incluyen una o más secuencias reguladoras seleccionadas basándose en las células hospedadoras a usar para la expresión, que está unida operativamente a la secuencia de ácido nucleico a expresar. Dentro de un vector de expresión recombinante, "unido operativamente" pretende hacer referencia a que la secuencia de nucleótidos de interés está unida a la secuencia o secuencias reguladoras de una manera que permita la expresión de la secuencia de nucleótidos (por ejemplo, en un sistema de transcripción/traducción in vitro o en una célula hospedadora cuando el vector se introduce en la célula hospedadora). La expresión "secuencia reguladora" pretende incluir promotores, potenciadores y otros elementos de control de la expresión (por ejemplo, señales de poliadenilación). Tales secuencias reguladoras se describen, por ejemplo, en Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). Las secuencias reguladoras incluyen las que dirigen la expresión constitutiva de una secuencia de nucleótidos en muchos tipos de células hospedadoras y las que dirigen la expresión de la secuencia de nucleótidos sólo en ciertas células hospedadoras (por ejemplo, secuencias reguladoras con especificidad de tejido). Los especialistas en la técnica apreciarán que el diseño del vector de expresión puede depender de factores tales como la elección de la célula hospedadora a transformar, el nivel de expresión de proteína deseado, etc. Los vectores de expresión de la invención pueden introducirse en células hospedadoras para producir de esta manera proteínas o péptidos, incluyendo proteínas o péptidos de fusión, codificados por ácidos nucleicos como los descritos en este documento (por ejemplo, proteínas del dominio de unión de VT, formas mutantes del dominio de unión de VT, proteínas de fusión etc.).

Los vectores de expresión recombinantes de la invención pueden diseñarse para la expresión de un dominio de unión de VT unido operativamente a otras moléculas en células procariotas o eucariotas. Por ejemplo, un dominio de unión de VT unido operativamente a otra molécula puede expresarse en células bacterianas tales como E. coli, células de insectos (usando vectores de expresión de baculovirus), células de levadura o células de mamífero. Se describen adicionalmente células hospedadoras adecuadas en Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). Como alternativa, el vector de expresión recombinante puede transcribirse y traducirse in vitro, por ejemplo, usando secuencias reguladoras del promotor de T7 y la polimerasa de T7.

La mayoría de las veces, la expresión de proteínas en procariotas se realiza en E. coli con vectores que contienen promotores constitutivos o inducibles que dirigen la expresión de proteínas de fusión o de proteínas que no son proteínas de fusión. Los vectores de fusión añaden varios aminoácidos a una proteína codificada en los mismos, normalmente en el extremo amino de la proteína recombinante. Tales vectores de fusión típicamente tienen tres fines: 1) aumentar la expresión de la proteína recombinante; 2) aumentar la solubilidad de la proteína recombinante; 3) ayudar a la purificación de la proteína recombinante actuando como un ligando en una purificación por afinidad. A menudo, en los vectores de expresión de fusión se introduce un sitio de escisión proteolítica en la unión del resto de fusión y la proteína recombinante para permitir la separación de la proteína recombinante del resto de fusión después de la purificación de la proteína de fusión. Tales enzimas y sus secuencias de reconocimiento afines incluyen el Factor Xa, la trombina y la enteroquinasa. Los vectores de expresión de fusión típicos incluyen pGEX (Pharmacia Biotech Inc; Smith, D.B. y Johnson, K.S. (1988) Gene 67:31-40), pMAL (New England Blolabs, Bevery, MA) y pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ), que fusionan la glutatión S transferasa (GST), la proteína de unión a maltosa E, o la proteína A, respectivamente, a la proteína recombinante diana. Los ejemplos de vectores de expresión de E. Coli, que no son de fusión, inducibles adecuados incluyen pTrc (Amann et al., (1988) Gene 69:301-315) y pET 11d (Studier et al., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 60-89). La expresión del gen diana en el vector pTrc se basa en la transcripción de la ARN polimerasa del hospedador a partir de un promotor de fusión trt-lac híbrido. La expresión del gen diana en el vector pET 11d se basa en la transcripción a partir de un promotor de fusión gn10 de T7-lac mediada por una ARN polimerasa viral coexpresada (gn 1 de T7). Esta polimerasa viral se suministra por cepas hospedadoras BL21(DE3) o HMS 174(DE3) de un profago \lambda residente que lleva un gen gn 1 de T7 bajo el control de la transcripción del promotor lacUV 5.

Una estrategia para maximizar la expresión de proteínas recombinantes en E. Coli es expresar la proteína en una bacteria hospedadora que ha perdido la capacidad de escindir proteolíticamente la proteína recombinante (Gottesman, S., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 119-128). Otra estrategia es alterar la secuencia del ácido nucleico a insertar en un vector de expresión de forma que los codones individuales para cada aminoácido sean los utilizados preferentemente en E. coli (Wada et al., (1992) Nucleic Acids Res. 20:2111-211B). Tal alteración de secuencias de ácido nucleico de la invención puede realizarse por técnicas de síntesis de ADN convencionales.

En otra realización, el vector de expresión de la proteína de fusión es un vector de expresión de levadura. Los ejemplos de vectores de expresión en levadura S. cerevisiae incluyen pYepSec1 (Baldari, et al., (1987) Embo J. 6:229-234), pMFa (Kurjan y Herskowitz, (1982) Cell 30:933-943), pJRY88 (Schultz et al., (1987) Gene 54:113-123), pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA), y picZ (InVitrogen Corp, San Diego, CA).

Como alternativa, puede expresarse un dominio de unión de VT unido operativamente a otras moléculas en células de insecto usando vectores de expresión de baculovirus. Los vectores de baculovirus disponibles para la expresión de proteínas en células de insectos cultivadas (por ejemplo, células Sf 9), incluyen la serie pAc (Smith et al. (1983) Mol. Cell Biol. 3:2156-2165) y la serie pVL (Lucklow y Summers (1989) Virology 170:31-39).

En otra realización, un ácido nucleico de la invención se expresa en células de mamífero usando un vector de expresión de mamífero. Los ejemplos de vectores de expresión de mamífero incluyen pCDM8 (Seed, B. (1987) Nature 329:840) y pMT2PC (Kaufman et al. (1987) EMBO J. 6:187-195). Cuando se usa en células de mamífero, las funciones de control del vector de la expresión a menudo se proporcionan por elementos reguladores virales. Por ejemplo, ciertos promotores usados comúnmente proceden de polioma, Adenovirus 2, citomegalovirus y virus de simio 40. En relación con otros sistemas de expresión adecuados tanto para células procariotas como para células eucariotas, véanse los capítulos 16 y 17 de Sambrook, J. Fritsh, E. F., y Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, HY, 1989.

En otra realización, el vector de expresión de mamífero recombinante es capaz de dirigir la expresión del ácido nucleico preferentemente en un tipo de célula particular (por ejemplo, se usan elementos reguladores específicos de tejido para expresar el ácido nucleico). Los elementos reguladores específicos de tejido son conocidos en la técnica. Los ejemplos no limitantes de promotores específicos de tejido adecuados incluyen el promotor de albúmina (específico de hígado; Pinkert et al. (1987) Genes Dev. 1:268:277), promotores específicos linfoides (Calame y Eaton (1988) Adv. Immunol 43:235-275), en particular promotores de receptores de células T (Winoto y Baltimore (1989) EMBO J. 8:729-733) e inmunoglobulinas (Banerji et al. (1983) Cell 33:729-740; Queen y Baltimore (1983) Cell 33:741-748), promotores específicos de neuronas (por ejemplo, el promotor de neurofilamento; Byme y Ruddle (1989) PNAS 86:5473-5477), promotores específicos de páncreas (Edlund et al. (1985) Science 230:912-916), y promotores específicos de glándulas mamarias (por ejemplo, promotor del suero de la leche; Patente de Estados Unidos Nº 4.873.316 y Publicación de la Solicitud de Patente Europea Nº 264.166). También se incluyen promotores regulados en el desarrollo, por ejemplo, los promotores de hox murinos (Kessel y Gruss (1990) Science 249:374-379) y el promotor de la a-fetoproteína (Campes y Tilghman (1989) Genes Dev. 3:537-546).

La invención también proporciona un vector de expresión recombinante que comprende una molécula de ADN de la invención clonada en el vector de expresión en una orientación antisentido. Es decir, la molécula de ADN está unida operativamente a una secuencia reguladora de una manera que permita la expresión (por transcripción de la molécula de ADN) de una molécula de ARN que es antisentido con respecto al ARNm del dominio de unión de VT. Pueden elegirse secuencias reguladoras unidas operativamente a un ácido nucleico clonado en la orientación antisentido que dirijan la expresión continua de la molécula de ARN antisentido en una diversidad de tipos celulares, por ejemplo, promotores virales y/o potenciadores, o secuencias reguladoras que dirijan la expresión constitutiva, específica de tejido o específica de tipo celular del ARN antisentido. El vector de expresión antisentido puede estar en forma de un plásmido recombinante, fagémido o virus atenuado en el que los ácidos nucleicos antisentido se producen bajo el control de una región reguladora de alta eficacia, cuya actividad puede determinarse por el tipo celular en el que se introduce el vector. Como discusión de la regulación de la expresión génica usando genes antisentido véase Weintraub, H. et al., Antisense RNA as a molecular tool for genetic analysis, Reviews - Trends in Genetics, Vol 1(1) 1986.

Otro aspecto de la invención se refiere a células hospedadoras en las que se ha introducido un vector de expresión recombinante de la invención. Las expresiones "célula hospedadora" y "célula hospedadora recombinante" se usan indistintamente en este documento. Se entiende que tales términos se refieren no sólo a la célula objeto particular, sino también a la progenie o progenie potencial de tal célula. Como pueden producirse ciertas modificaciones en generaciones sucesivas debidas a mutaciones o a influencias ambientales, es posible que tal progenie, efectivamente, no sea idéntica a la célula parental, pero aún así se incluye dentro del alcance del término usado como se usa en la presente invención.

Una célula hospedadora puede ser cualquier célula procariota o eucariota. Por ejemplo, una proteína de fusión de la invención puede expresarse en células bacterianas tales como E. coli, células de insecto, células de levadura o de mamífero (tales como células de ovario de hámster chino (CHO) o células COS). Los especialistas en la técnica conocen otras células hospedadoras adecuadas.

El ADN del vector puede introducirse en células procariotas o eucariotas por medio de técnicas convencionales de transformación o transfección. Como se usan en este documento, los términos "transformación" y "transfección" pretenden hacer referencia a una diversidad de métodos reconocidos en la técnica para introducir ácidos nucleicos extraños (por ejemplo, ADN) en una célula hospedadora, incluyendo coprecipitación con fosfato cálcico o cloruro cálcico, transfección mediada por DEAE-dextrano, lipofección o electroporación. Pueden encontrarse métodos adecuados para transformar o transfectar células hospedadoras en Sambrook, et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989), y otros manuales de laboratorio.

Para una transfección estable de células de mamífero, se sabe que, dependiendo del vector de expresión y de la técnica de transfección usada, sólo una pequeña fracción de las células puede integrar el ADN extraño en su genoma. Para identificar y seleccionar estos integrantes, generalmente se introduce un gen que codifica un marcador selectivo (por ejemplo, resistencia a un antibiótico) en las células hospedadoras junto con el gen de interés. Los marcadores selectivos preferidos incluyen los que confieren resistencia a fármacos, tales como G418, higromicina y metotrexato. Un ácido nucleico que codifica un marcador selectivo puede introducirse en una célula hospedadora en el mismo vector que el que codifica la proteína de fusión A de la invención o puede introducirse en un vector separado. Las células transfectadas de forma estable con el ácido nucleico introducido pueden identificarse por selección con fármacos (por ejemplo, las células que han incorporado el gen marcador selectivo sobrevivirán, mientras que las otras células morirán).

Una célula hospedadora de la invención, tal como una célula hospedadora procariota o eucariota en cultivo, puede usarse para producir (es decir, expresar) la proteína del dominio de unión de VT unida operativamente a otras moléculas. Por consiguiente, la invención también proporciona métodos para producir una proteína del dominio de unión de VT unida operativamente a otras moléculas usando las células hospedadoras de la invención. En una realización, el método comprende cultivar la célula hospedadora de la invención (en la que se ha introducido un vector de expresión recombinante que codifica el dominio de unión de VT unido operativamente a otras moléculas) en un medio adecuado de manera que se produzca la proteína del dominio de unión de VT unida operativamente a otras moléculas. En otra realización, el método también comprende aislar un dominio de unión de VT unido operativamente a otras moléculas del medio o de la célula hospedadora.

Las células hospedadoras de la invención también pueden usarse para producir animales transgénicos no humanos. Por ejemplo, en una realización, una célula hospedadora de la invención es un oocito fertilizado o una célula madre embrionaria dentro de la cual se han unido operativamente secuencias codificantes del dominio de unión de VT a otras secuencias codificantes. Como se usa en este documento, un "animal transgénico" es un animal no humano, preferiblemente un mamífero, más preferiblemente un roedor tal como una rata o un ratón, en el que una o más de las células del animal incluye un transgen. Otros ejemplos de animales transgénicos incluyen primates no humanos, ovejas, perros, vacas, cabras, pollos, anfibios, etc. Un transgen es un ADN exógeno que está integrado en el genoma de una célula a partir de la cual se desarrolla un animal transgénico y que permanece en el genoma del animal maduro, dirigiendo de esta manera la expresión de un producto génico codificado en uno o más tipos celulares o tejidos del animal transgénico.

Un animal transgénico de la invención puede crearse introduciendo un ácido nucleico que codifica un dominio de unión de VT unido operativamente a otra molécula de ácido nucleico en el pronúcleo masculino de un oocito fertilizado, por ejemplo, por microinyección, infección retroviral y dejando que el oocito se desarrolle en un animal de acogida hembra seudopreñada. Una secuencia o secuencias reguladoras específicas de tejido pueden unirse operativamente al transgen del dominio de unión de VT para dirigir la expresión de la proteína híbrida del dominio de unión de VT a células particulares. Los métodos para generar animales transgénicos mediante manipulación de embriones y microinyección, particularmente animales tales como ratones, se han convertido en convencionales en la técnica y se describen, por ejemplo, en las Patentes de Estados Unidos Nº 4.736.866 y 4.870.009, ambas de Leder et al., en la patente de Estados Unidos Nº 4.873.191 de Wagner et al, y en Hogan, B., Manipulating the Mouse Embryo (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY., (1986). Se usan métodos similares para la producción de otros animales transgénicos. Un animal fundador transgénico puede identificarse basándose en la presencia de la proteína de fusión A del transgen de la invención en su genoma y/o la expresión de la proteína de fusión A del ARNm de la invención en tejidos o células de los animales. Un animal fundador transgénico después puede usarse para criar más animales que lleven el transgen. Además, los animales transgénicos que llevan un transgen que codifica una proteína de fusión A de la invención pueden reproducirse adicionalmente para proporcionar otros animales transgénicos que lleven otros transgenes.

En otra realización, pueden producirse animales transgénicos no humanos que contienen sistemas seleccionados que permiten la expresión regulada del transgen. Un ejemplo de tal sistema es el sistema recombinasa cre/loxP del bacteriófago P1. Como descripción del sistema recombinasa cre/loxP véase, por ejemplo, Lakso et al. (1992) PNAS 89:6232-6236. Otro ejemplo de un sistema de recombinasa es el sistema recombinasa FLP de Saccharomyces cerevisiae (O'Gorman et al. (1991) Science 251:1351-1355. Si se usa un sistema recombinasa cre/loxP para regular la expresión del transgen, se requieren animales que contengan transgenes que codifiquen tanto la recombinasa Cre como una proteína seleccionada. Tales animales pueden proporcionarse por medio de la construcción de animales transgénicos "dobles", por ejemplo, por emparejamiento de dos animales transgénicos, conteniendo uno de ellos un transgen que codifica una proteína seleccionada y conteniendo el otro un transgen que codifica una recombinasa.

También pueden producirse clones de los animales transgénicos no humanos descritos en este documento de acuerdo con los métodos descritos en Wilmut, l. et al. (1997) Nature 385:810-813. En resumen, puede aislarse una célula, por ejemplo, una célula somática del animal transgénico e inducirse para que salga del ciclo de crecimiento y entre en la fase G_{o}. La célula quiescente después puede fusionarse, por ejemplo, por medio del uso de pulsos eléctricos, a un oocito enucleado de un animal de la misma especie de la que se aísla la célula quiescente. El oocito reconstruido después se cultiva de tal manera que se desarrolle hasta una mórula o blastocito y después se transfiere a un animal de acogida hembra seudopreñada. La descendencia de este animal de acogida hembra será un clon del animal a partir del cual se aísla la célula, por ejemplo, la célula somática

Composiciones farmacéuticas

Las moléculas de ácido nucleico de la invención (por ejemplo, ácidos nucleicos que codifican una proteína de fusión de la invención), los compuestos híbridos de la invención, y los anticuerpos anti-dominio de unión de VT (también denominados en este documento "compuestos activos") de la invención pueden incorporarse en composiciones farmacéuticas adecuadas para la administración. Tales composiciones típicamente comprenden la molécula de ácido nucleico, el compuesto híbrido o el anticuerpo, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Como se usa en este documento, la expresión "vehículo farmacéuticamente aceptable" pretende incluir todos y cada uno de los siguientes: disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y para retrasar la absorción, y similares, compatibles con la administración farmacéutica. El uso de tales medios y agentes para las sustancias farmacéuticamente activas es bien conocido en la técnica. Excepto cuando cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el compuesto activo, se contempla su uso en las composiciones. En las composiciones también pueden incorporarse compuestos activos complementarios.

Una composición farmacéutica de la invención se formula para que sea compatible con la vía de administración para la que está destinada. Los ejemplos de vías de administración incluyen administración parenteral, por ejemplo, intravenosa, intradérmica, subcutánea, oral (por ejemplo, inhalación), transdérmica (tópica), transmucosa y rectal. Las soluciones o suspensiones usadas para aplicación parenteral, intradérmica o subcutánea pueden incluir los siguientes componentes: un diluyente estéril tal como agua para inyección, solución salina, aceites fijos, polietilenglicoles, glicerinas, propilenglicol u otros disolventes sintéticos; agentes antibacterianos tales como alcohol bencílico o metilparabenos; antioxidantes tales como ácido ascórbico o bisulfito sódico; agentes quelantes tales como ácido etilendiaminatetraacético; tampones tales como acetatos, citratos o fosfatos, y agentes para el ajuste de la tonicidad tales como cloruro sódico o dextrosa. El pH puede ajustarse con ácidos o bases, tales como ácido clorhídrico o hidróxido sódico. La preparación parenteral puede encerrarse en ampollas, jeringas desechables o viales de múltiples dosis hechos de vidrio o de plástico.

Las composiciones farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones (cuando el ingrediente activo es soluble en agua) o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. Para la administración intravenosa, los vehículos adecuados incluyen solución fisiológica salina, agua bacteriostática, Cremophor EL^{TM} (BASF, Parsippany, NJ) o solución salina tamponada con fosfato (PBS). En todos los casos, la composición debe ser de estéril y debe ser fluida en tal medida que se pueda inyectar fácilmente con una jeringa. Debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y debe conservarse frente a la acción contaminante de microorganismos tales como bacterias y hongos. El vehículo puede ser un disolvente o medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido, y similares) y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez apropiada puede mantenerse, por ejemplo, usando un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partículas requerido en el caso de las dispersiones y mediante el uso de tensioactivos. La prevención de la acción de microorganismos puede conseguirse por diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azucares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol, o cloruro sódico en la composición. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede conseguirse incluyendo en la composición un agente que retrase la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

Pueden prepararse soluciones inyectables estériles incorporando el compuesto activo (por ejemplo, un compuesto híbrido de la invención) en la cantidad requerida en un disolvente apropiado con uno o una combinación de los ingredientes enumerados anteriormente, según se requiera, seguido de esterilización por filtración. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando el compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los demás ingredientes requeridos de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son secado al vacío y liofilización, que produce un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente deseado adicional a partir de una solución filtrada de forma estéril previamente del mismo.

Las composiciones orales generalmente incluyen un diluyente inerte o un vehículo comestible. Pueden encerrarse en cápsulas de gelatina o comprimirse en comprimidos. Para la administración terapéutica oral, el compuesto activo puede incorporarse con excipientes y usarse en forma de comprimidos, trociscos o cápsulas. También pueden prepararse composiciones orales usando un vehículo fluido para uso como un elixir bucal, donde el compuesto en el vehículo fluido se aplica por vía oral, se agita en la boca y se escupe o se traga. Como parte de la composición pueden incluirse agentes aglutinantes farmacéuticamente compatibles y/o materiales adyuvantes. Los comprimidos, píldoras, cápsulas, trociscos y similares pueden contener cualquiera de los siguientes ingredientes, o compuestos de una naturaleza similar: un aglutinante tal como celulosa microcristalina, goma de tragacanto o gelatina; un excipiente tal como almidón o lactosa, un agente disgregante tal como ácido algínico, Primogel o almidón de maíz; un lubricante tal como estearato de magnesio, o Sterotes; un deslizante tal como dióxido de silicio coloidal; un agente edulcorante tal como sacarosa o sacarina; o un agente aromatizante tal como menta, salicilato de metilo o aroma de naranja.

Para la administración por inhalación, los compuestos se suministran en forma de una pulverización de aerosol desde un recipiente presurizado o distribuidor que contiene un propelente adecuado, por ejemplo, un gas tal como dióxido de carbono, o un nebulizador.

La administración sistémica también puede realizarse por medios transmucosos o transdérmicos. Para la administración transmucosa o transdérmica, en la formulación se usan penetrantes apropiados para la barrera a atravesar. Tales penetrantes son conocidos generalmente en la técnica e incluyen, por ejemplo, para la administración transmucosa, detergentes, sales biliares y derivados de ácido fusídico. La administración transmucosa también puede realizarse por medio del uso de pulverizaciones nasales o supositorios. Para la administración transdérmica, los compuestos activos se formulan en pomadas, ungüentos, geles o cremas como es conocido generalmente en la técnica.

Los compuestos también pueden prepararse en forma de supositorios (por ejemplo, con bases de supositorios convencionales tales como manteca de cacao y otros glicéridos) o enemas de retención para administración rectal.

En una realización, los compuestos activos se preparan con vehículos que protegerán el compuesto contra la eliminación rápida del cuerpo, tales como una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes y sistemas de liberación microencapsulados. Pueden usarse polímeros biocompatibles y biodegradables, tales como etileno-acetato de vinilo, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres y ácido poliláctico. Los métodos para la preparación de tales formulaciones serán evidentes para los especialistas en la técnica. Los materiales también pueden obtenerse en el mercado en Alza Corporation and Nova Pharmaceuticals, Inc. También pueden usarse suspensiones liposomales (que incluyen liposomas dirigidos a células infectadas con anticuerpos monoclonales contra antígenos virales) como vehículos farmacéuticamente aceptables. Éstas pueden prepararse de acuerdo con métodos conocidos por los especialistas en la técnica, por ejemplo, como se describe en la Patente de Estados Unidos Nº 4.522.811.

Es especialmente ventajoso formular las composiciones orales o parenterales en formas de dosificación unitarias para facilitar la administración y la uniformidad de la dosificación. La expresión "formas de dosificación unitarias", como se usa en este documento, se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosificaciones unitarias para el sujeto a tratar; conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico requerido. La especificación para las formas de dosificación unitarias de la invención se dicta y es directamente dependiente de las características únicas del compuesto activo y el efecto terapéutico particular a conseguir, y las limitaciones intrínsecas en la técnica de la composición de tal compuesto activo para el tratamiento de individuos.

Las moléculas de ácido nucleico de la invención pueden insertarse en vectores y usarse como vectores de terapia génica, por ejemplo, como se ha descrito anteriormente en este documento. Los vectores de terapia génica pueden suministrarse a un sujeto, por ejemplo, por inyección intravenosa, administración local (véase la Patente de Estados Unidos 5.328.470) o por inyección estereotáctica (véase, por ejemplo, Chen et al. (1994) PNAS 91:3054-3057). La preparación farmacéutica del vector de terapia génica puede incluir el vector de terapia génica en un diluyente aceptable, o puede comprender una matriz de liberación lenta en la que está incluido el vehículo de liberación del gen. Como alternativa, cuando el vector de liberación del gen completo puede producirse intacto a partir de células recombinantes, por ejemplo, vectores retrovirales, la preparación farmacéutica puede incluir una o más células que producen el sistema de liberación del gen.

Las composiciones farmacéuticas pueden incluirse en un recipiente, paquete o distribuidor junto con instrucciones para su administración.

Usos y métodos de la invención

Las moléculas de ácido nucleico, los compuestos híbridos y los anticuerpos descritos en el presente documento pueden usarse para métodos de tratamiento. Como se describe en este documento, un compuesto híbrido de la invención puede tener las siguiente actividades: (i) puede interaccionar con (por ejemplo, unirse a) receptores específicos presentes en la superficie de una célula, por ejemplo, Gb_{3}; (ii) mientras está unido a su receptor, se internaliza en la célula; y (iii) se suministra a una localización específica dentro de la célula. De esta manera, un dominio de unión de VT unido (por ejemplo, a través de un enlace covalente) a otro resto puede usarse para (i) internalizar pequeñas moléculas, por ejemplo, péptidos o moléculas de ácido nucleico; (ii) internalizar composiciones farmacéuticas; y (iii) dirigir específicamente las moléculas o composiciones a localizaciones intracelulares.

De esta manera, la invención se refiere a métodos para modular una actividad asociada con una célula (por ejemplo, el crecimiento celular, replicación, expresión de un producto génico exógeno o endógeno, y similares). Un método ilustrativo incluye poner en contacto una célula con un compuesto híbrido de la invención, de tal forma que se altere una actividad asociada con la célula (por ejemplo, el crecimiento o la diferenciación) con respecto a la actividad asociada con la célula de dicha célula en ausencia del compuesto híbrido.

La invención también se refiere a métodos para dirigir un resto para su internalización en una célula que contiene Gb_{3}. El método incluye la etapa de poner en contacto la célula con un compuesto híbrido de la invención, donde el compuesto híbrido incluye el resto para la internalización, de tal forma que el compuesto híbrido se internalice en la célula. El resto puede ser cualquier resto que se vaya a liberar en el interior de la célula, por ejemplo una toxina (por ejemplo, para destruir la célula), un polinucleótido, por ejemplo, un gen (por ejemplo, para realizar una modificación genética, por ejemplo, para la expresión de un producto génico en la célula), una proteína o péptido (por ejemplo, un anticuerpo o antígeno) y similares. El resto de unión a Gb_{3} puede ser, por ejemplo, un anticuerpo anti-Gb_{3}, como se ha descrito supra. El resto dirigido puede unirse o conjugarse al resto de unión a Gb_{3} como se ha descrito anteriormente.

Por consiguiente, la invención se refiere a métodos para el tratamiento, profilaxis o diagnóstico de un sujeto, por ejemplo, un animal, incluyendo un mamífero (incluyendo tanto animales no humanos como seres humanos). En una realización, la invención proporciona el uso de un compuesto híbrido para el tratamiento, terapia o diagnóstico de un sujeto. En una realización, la invención proporciona el uso de un compuesto híbrido de la invención para la fabricación de un medicamento para el tratamiento, diagnóstico o profilaxis de un sujeto. Por ejemplo, a un sujeto se le puede administrar un medicamento que contiene un compuesto híbrido de la invención de tal forma que se trate un estado de enfermedad de dicho sujeto. Por ejemplo, el compuesto híbrido puede comprender un primer dominio que comprende VT-B y un segundo dominio, unido covalentemente al primer dominio, que comprende un ácido nucleico que codifica un gen. La administración del compuesto híbrido (opcionalmente en un vehículo farmacéuticamente aceptable) proporciona un medio para liberar el gen a células que expresan Gb_{3}. El gen después puede integrarse en el genoma celular y el producto génico puede expresarse por la célula. Por ejemplo, el gen podría codificar la enzima adenosina desaminasa (ADA), una enzima que está ausente en sujetos que padecen deficiencia de ADA, por ejemplo, como resultado de una deficiencia genética congénita. De esta manera, la invención se refiere a métodos para el tratamiento de defectos genéticos, por ejemplo, por terapia génica. En otra realización, el compuesto híbrido comprende un primer dominio que comprende VT-B y un segundo dominio, unido covalentemente al primer dominio, que comprende una enzima, por ejemplo, una enzima que está ausente (o presente en una cantidad insuficiente) en un sujeto o en un tejido de un sujeto. Por ejemplo, la enzima podría ser, por ejemplo, ADA.

En otro ejemplo, un compuesto híbrido comprende un primer dominio que comprende VT-B y un segundo dominio, unido covalentemente al primer dominio, que comprende un ácido nucleico que es antisentido con un ácido nucleico encontrado en una célula, por ejemplo, una célula cancerosa. La administración del compuesto híbrido y la internalización del compuesto híbrido en la célula permite la regulación antisentido de la expresión de genes específicos o series de genes.

En otra ilustración, un compuesto híbrido comprende un primer dominio que comprende VT-B, y un segundo dominio que comprende un resto quelante para quelar un radionúclido (de los que muchos se conocen en la técnica). Por ejemplo, puede usarse un resto quelante tal como N_{2}S_{2} o N_{3}S (véanse, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos Nº 5.091.514, 5.573.748 y 5.556.982, y las referencias citadas en estos documentos) para quelar un radionúclido para liberarlo en el interior de una célula. Tal compuesto híbrido de la invención, cuando se quela con un radionúclido, puede suministrarse selectivamente a células que expresan Gb_{3}, y la diana intracelular puede seleccionarse como se proporciona en este documento. Para el tratamiento, por ejemplo, del cáncer, el compuesto híbrido puede dirigirse al núcleo, donde la irradiación del ADN de la célula puede dar como resultado la muerte celular; ésta es una forma dirigida selectiva de quimioterapia. También puede usarse un compuesto híbrido radiomarcado para la formación de imágenes, por ejemplo, de órganos, tejidos y similares.

Puede proporcionarse un tratamiento adicional para el cáncer acoplando un fármaco modificador del ADN tal como mitomicina a un primer dominio (por ejemplo, VT-B). El suministro de la segunda porción de modificación del ADN al núcleo puede permitir que el fármaco dañe al ADN y produzca la muerte celular.

Un compuesto híbrido de la invención puede usarse para afectar al procesamiento del ARN (por ejemplo, en el nucleolo) por medio de su dirección al nucleolo; puede emplearse un segundo dominio que afecte al procesamiento del ARN para modificar el procesamiento del ARN en la célula.

Ejemplos

En los ejemplos se usaron los siguientes materiales y métodos:

Purificación de verotoxina

La VT1 recombinante de pJLB28 (23), y la subunidad B de VT1 (24) se purificaron por una técnica cromatográfica de afinidad desarrollada recientemente (25), se introdujeron alícuotas en PBS y se almacenaron a -70ºC. La subunidad B purificada se marcó con isotiocianato de fluoresceína (o rodamina) como se describe (11).

Cultivo celular

Se cultivaron líneas de células de astrocitoma malignas humanas permanentes (SF-126, SF-188, SF-539, U 87-MG, U 251-MG, y XF-498 (proporcionadas por el Dr. J Rutka) HSC (26-29). Todas las líneas celulares se cultivaron en monocapas en medio a-MEM (GIBCO) más aminoácidos no esenciales, glutamina, gentamicina, y 10% de suero bovino fetal inactivado térmicamente, con la excepción de XF-498 (que se cultivó en medio RPMI) y SKVLB (que se cultivó en presencia de 1 \mug/ml de vinblastina), que es una variante resistente a múltiples fármacos de la línea de células de carcinoma de ovarios SKOV3 parental (30).

Citotoxicidad de verotoxina

Se incubaron células semiconfluentes en placas de microtitulación por triplicado con diluciones de diez veces de VT y las células que quedaban después de 72 horas se cuantificaron por tinción con violeta de cristal al 0,1% y midiendo la densidad óptica a 570 nm usando un lector de placas de microtitulación (31).

La Figura I muestra la respuesta citotóxica de seis líneas de células de astrocitoma a concentraciones crecientes de VT1. Aunque todas las líneas celulares eran sensibles a VT1, fue evidente una diferencia >5000 veces en la sensibilidad entre la línea celular más sensible (SF-539) y la menos sensible (XF-49B).

Previamente se ha demostrado que las líneas de células variantes de carcinoma de ovario resistentes a múltiples fármacos SKVLB y SKOVC eran \sim1000 veces más sensibles a VT que la línea de células SKOV3 parental (22).

Extracto de glicolípido de células cultivadas

Después de la tripsinización, las células (\sim1 x 10^{6}) se lavaron con PBS tres veces, se resuspendieron en un volumen mínimo y se extrajeron con 20 volúmenes de cloroformo/metanol (C/M) 2:1 en volumen. El extracto se repartió frente a agua y la fase inferior se repartió de nuevo frente a la fase superior teórica. La fase inferior combinada después se evaporó, se saponificó con NaOH 1 N en metanol y los glicolípidos se reextrajeron como se ha indicado anteriormente. La fase inferior seca se disolvió en CM 98:2 y se separó por cromatografía en sílice (32). La columna se lavó ampliamente con cloroformo y glicolípido eluido en acetona/metanol (9:1 en volumen). El Gb_{3} presente se detectó por unión solapante en TLC con VT1 (16).

Ensayo del contenido de Gb_{3} por solapamiento de TLC con VT1

Se separaron alícuotas del extracto de glicolípido de muestras de tumores humanos o de líneas de células tumorales por TLC {cloroformo, metanol, agua-65:25:4 (v/v/v)}. Las placas se secaron y se bloquearon con gelatina al 1% en agua a 37ºC durante una noche. Después se lavaron tres veces con TBS 50 mM durante 5 minutos y se incubaron con 0,1 \mug/ml de toxina durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de lavar adicionalmente con TBS, las placas se incubaron con anticuerpo monoclonal de ratón anti-VT1 (33) (2 \mug/ml) para VT1 seguido de anticuerpo de cabra anti-ratón conjugado con peroxidasa. Finalmente, las placas se lavaron con TBS y la unión a la toxina se visualizó con sustrato de peroxidasa 4-cloro-1-naftol. Se preparó una placa similar y se pulverizó con orcinol para comparar el contenido de glicolípido.

Como la presencia del glicolípido receptor de la toxina Gb_{3} es esencial para conferir sensibilidad a VT, el contenido de Gb_{3} de las seis líneas de células de astrocitoma se analizó por solapamiento de TLC. Cada una de las líneas de células de astrocitoma expresó niveles significativos de Gb_{3}. SF-539, la línea celular más sensible, y SF-49B, la línea celular menos sensible, expresaron los mayores niveles de receptor. De esta manera, el contenido de Gb_{3} no es suficiente para explicar la notable diferencia en la sensibilidad a VT de estas células.

El análisis de solapamiento de TLC de VT1 previo del contenido de Gb_{3} también sugirió la existencia de mayores niveles de especies de Gb_{3} de migración más lenta en SKVLB (22). Se realizó un análisis de HPLC comparativo de los ésteres metílicos de ácidos grasos de Gb_{3} deSKOV_{3} y SKVLB. En cuanto a las células de astrocitoma, no se detectaron ácidos grasos más cortos que C12 ni hidroxiácidos grasos. Los resultados muestran una notable elevación en los ácidos grasos de cadena corta en Gb_{3} de SKVLB en comparación con SKOV_{3}, es decir, en los ácidos grasos C16:0 y particularmente C18:0, mientras que el contenido de ácidos grasos de cadena larga, C22:0, 24:0 y 24:1 se reduce en gran medida en comparación con Gb_{3} de SKOV3. De esta manera, el cambio en el contenido de ácidos grasos de Gb_{3} para la línea celular MDR SKVLB es similar a la diferencia observada para las células SF 529 frente a las células XF 498 y el cambio encontrado después del tratamiento con butirato de células XF 498, en cada caso, aumentó la sensibilidad a VT1 en correlación con una mayor proporción de especies de Gb_{3} de ácidos grasos de cadena corta.

Sensibilización celular a VT por tratamiento con butirato

Se cultivaron líneas de células de astrocitoma XF-498, líneas de células de tumores de ovario y líneas de células vero en medios que contenían butirato sódico 2 mM (o propionato o capronato para células de astrocitoma).

Se ha descubierto que el butirato sódico aumenta la sensibilidad a VT en varios sistemas celulares (12, 13, 43, 44). Por lo tanto, se determinó el efecto del butirato sobre la sensibilidad a VT de células XF-498.

Morfología y crecimiento

Los estudios iniciales demostraron que el tratamiento con butirato de células XF-498 tenía un profundo efecto sobre la morfología de estas células. Las células XF-498 son células pequeñas, redondas que se amontonas e, incluso después de la confluencia, no forman una monocapa. Por el contrario, las células SF-539 son células planas, estrelladas y forman una monocapa confluente. El tratamiento con butirato de células XF-498 hace que estas células adopten una morfología similar a la de las células SF-539. Las células XF-498 cultivadas en propionato mostraron un cambio morfológico similar pero menos significativo, pero el cultivo de XF-498 en capronato no tuvo ningún efecto. La inhibición por PPMP de la biosíntesis de glicolípidos (45) impidió los cambios morfológicos inducidos por butirato. El PPMP solo no tuvo ningún efecto sobre la morfología de XF-498.

Sensibilidad a VT1

Además de efectuar un cambio morfológico para parecerse más a las células SF596, el butirato indujo un aumento significativo (5000 veces) en la sensibilidad de las células XF-498 a VT1. La sensibilidad a VT1 aumentó en una menor medida en las células tratadas con propionato, pero el capronato no tuvo ningún efecto. El PPMP previno la sensibilidad a VT1 inducida por butirato de células XF-498 (no mostrado) como ha informado Sandvig (46).

Dirección de VT subcelular

Conjuntamente con la mayor sensibilidad a VT1 inducida por el tratamiento con butirato de células XF-498, el butirato indujo un notable cambio en la ruta intracelular de VT1 B, de tal forma que la toxina se localizó principalmente alrededor de la membrana del ER/nuclear como en SF-539. El seccionamiento en serie demuestra que la subunidad B, en parte, está localizada dentro de una región restringida del núcleo. La integración de píxeles de exploraciones "z" a través del núcleo en las imágenes confocales compuestas muestra tres máximos de marcaje que corresponden a los límites nucleares y a un pico intranuclear central en células SF 529, pero un solo pico yuxtanuclear en células XF 498 sin tinción peri o intranuclear. Después del tratamiento con butirato, el marcaje principal para las células XF-498 está dentro del núcleo.

La microscopía inmunoelectrónica confirmó adicionalmente la localización nuclear de VT1 B en las células SF-539 y en las células XF-498 tratadas con butirato. En las células XF-498 no tratadas, se detecto VT1 B en el aparato de Golgi, pero el marcaje nuclear no estuvo por encima del efecto de fondo.

Expresión de Gb_{3}

Se ha descubierto previamente que el tratamiento con butirato induce la síntesis de Gb_{3} para mediar la mayor sensibilidad a VT (43, 46). Por lo tanto, se comparó el contenido de Gb_{3} de células SF-539 con el de células XF-498 antes y después del tratamiento con butirato por solapamiento de TLC de VT1. Se descubrió que el Gb_{3} contenido dentro de las células XF-498 realiza un recorrido en la TLC como una sola banda correspondiente a la banda de Gb_{3} más rápida del patrón renal. Por el contrario, las células SF-539 contienen una banda de Gb_{3} de migración más lenta adicional. Después del tratamiento con butirato, hay un aumento espectacular y selectivo de esta banda de Gb_{3} más lenta en células XF-498, de tal forma que esta banda se convierte ahora en la especie de Gb_{3} de unión a VT1 dominante. Esta especie de Gb_{3} también aumenta selectivamente, pero en una menor medida, después del tratamiento con propionato, mientras que el capronato no tiene ningún efecto.

Expresión de isoformas de ácidos grasos de Gb_{3}

El análisis de HPLC de la composición de ácidos grasos del Gb_{3} purificado a partir de células SF-539 y XF-498 antes y después del tratamiento con butirato demostró que la especie de Gb_{3} de SF-539 estaba enriquecida en ácidos grasos de cadena corta (C16 y C18) y era deficiente en las especies de cadena más larga (C22, C24) con respecto al Gb_{3} de XF-498. La subfraccionación de la especie de Gb_{3} en XF-498 tratada con butirato en fracciones lentas, "intermedias" y rápidas confirmó el notable aumento del contenido de ácidos grasos C16 y la reducción de ácidos grasos C24 de la especie de Gb_{3} de migración lenta inducido por butirato.

Unión de VT1 a la superficie celular

Para excluir que la sensibilidad de VT1 diferencial de las células de astrocitoma se deba a las diferencias en la unión de la toxina, se cuantificó la unión a la superficie celular a 4ºC usando VT1 marcada con ^{125}I. La comparación de XF-498 (con y sin tratamiento con butirato) y SF-539 se muestra en la Figura 2. Los tres "tipos" celulares demuestran una unión a VT1 comparable. Si acaso, las células tratadas con butirato más susceptibles a VT muestran menos unión a VT.

Microscopía electrónica

La dirección de VT1 en células SF-539 y XF-498 se examinó con detalle por EM (microscopía electrónica) de transmisión. Las células se cultivaron en insertos de membrana transferibles en placas de cultivo de tejidos de 24 pocillos y se dejó que formaran una monocapa confluente. Para la unión de superficie, las células se incubaron a 4ºC en presencia de 5 \mug/ml de VT1B durante 30 minutos y se lavaron con PBS frío. Después, las células se incubaron con anticuerpo primario anti-VT1B seguido de anticuerpo secundario GAM-oro durante 30 minutos a 4ºC. Para los estudios de internalización de la toxina, las células se incubaron con VT1B (5 \mug/ml) a 37ºC durante 1 hora. Para cualquier tratamiento, las células se fijaron en glutaraldehído al 2,5%, paraformaldehído al 2% en PBS durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de lavar con PBS, las células se fijaron posteriormente en tetróxido de osmio al 1% en tampón fosfato durante 30 minutos y se lavaron con solución salina. Las células se fijaron posteriormente además con acetato de uranilo al 2% en etanol al 30% durante 15 minutos (38) y se deshidrataron en un gradiente de etanol. Las células deshidratadas se infiltraron en serie con Epon al 50-75% en etanol al 100% durante 30 minutos y finalmente con Epon al 100% durante 1 hora con dos cambios de Epon. La membrana se retiró del soporte y se insertó verticalmente en la cápsula de gelatina, se rellenó con Epon al 100% y se polimerizó a 65ºC.

Después de seccionar el bloque polimerizado en un ultramicrotomo, las secciones para los estudios de unión a la superficie se tiñeron con un tinte de contraste, mientras que las secciones para los estudios de internalización se inmunomarcaron. Estas secciones se trataron con metaperyodato sódico saturado durante 30 minutos para desenmascarar la antigenicidad (39) y se lavaron en agua destilada. Las secciones después se bloquearon por flotación en una gota de BSA al 0,1% y gelatina de piel de pescado al 0,2% en TBS 50 mM (NaCl 150 mM, Tris 50 mM, pH 7,4) durante 30 minutos y se inmunomarcaron con una dilución 1:50 de anticuerpo anti-VT1B, seguido de una dilución 1:50 de GAM-15 u oro de -10 nm durante 1 hora cada uno a temperatura ambiente, con un lavado minucioso después de cada etapa. Finalmente, las secciones se tiñeron con acetato de uranilo al 5% y después con citrato de plomo de Reynold durante 6 minutos y se analizaron con un microscopio EM Philips 300 a 60 kV.

Ejemplo 1 Preparación de un resto de VT híbrido marcado Marcaje lisosomal (marcaje doble con FITC-dextrano y con RITC-VT1B)

Se usó la internalización de FITC-dextrano como marcador lisosomal como se ha indicado previamente (34). Se incubaron células cultivadas durante 1 noche en cubreobjetos con 0,5 \mug/ml de FITC-dextrano en a-MEM durante 24 horas a 37ºC y se siguieron con medio nuevo durante 2 horas a la misma temperatura. Se añadió RITC-VT1B (2-5 \mug/ml) a las células en la última hora de seguimiento a 37ºC. Las células después de lavaron cinco veces con PBS estéril, se fijaron en formaldehído al 2%, se montaron con DABCO (35) y se visualizaron con luz fluorescente incidente usando un microscopio fluorescente Polyvar. Las imágenes fluorescentes se registraron en una película Kodak TMAX 400 ASA.

Unión a ^{125}I-verotoxina de células intactas

Se cultivaron células en placas de 96 pocillos. El medio se aspiró y las células se lavaron con PBS (pH 7,4) a temperatura ambiente. Después de equilibrar las células en hielo, a cada pocillo se le añadieron 100 \mul de PBS enfriada con hielo. Se añadió la toxina radiomarcada y se dejó incubar durante 1 hora en hielo. Después se retiró la toxina no unida por lavado con PBS enfriado con hielo tres veces. Las células se solubilizaron con 1 ml de SDS al 10% añadido a cada pocillo y se incubaron a 37ºC durante 15 minutos y los extractos se contaron en un contador gamma.

Inhibición de la síntesis de glicolípidos

El PPMP (1-fenil-2-hexadecanoilamino-3-morfolino-1-propanol, Matreya Inc., Pleasant Gap, PA) es un potente inhibidor de la síntesis de glucosilceramida (36) y, por lo tanto, impide la síntesis de la mayoría de los glicolípidos. Los experimentos establecieron que PPMP 27 \muM podía inhibir la síntesis de glicoesfingolípidos sin inducir la muerte celular. Después se incubaron células de astrocitoma XF-498 y células vero a 37ºC con PPMP 27 \muM en presencia y en ausencia de butirato 2 mM durante 6-7 días.

Microscopía de fluorescencia

Se preparó FITC-VT1 B como se ha descrito anteriormente (11, 37). En resumen, se dializaron 50 \mug de VT1 purificada frente a tampón borato (50 mM, pH 9,0) durante 1 noche. Se añadió isotiocianato de fluoresceína (FITC) (10 mg/ml) a la subunidad B de VT1 dializada, se dejó reaccionar en la oscuridad durante 2 horas a 4ºC y después se dializó frente a PBS. La VT1 B conjugada con fluoresceína se almacenó a -70ºC. De forma similar se preparó VT1B conjugada con rodamina (RITC-VT1B). Para determinar la dirección subcelular de VT1 en células de astrocitoma, se incubaron células SF-539 y XF-498 cultivadas durante una noche en cubreobjetos de vidrio durante 1 hora en presencia de 10 \mug/ml de FITC-VT1 B a 37ºC para la internalización de VT1. Después de un lavado extensivo con PBS a 50 mM, las células se montaron con DABCO y se examinaron con el microscopio de fluorescencia.

Microscopía confocal

Para determinar la topología tridimensional de la dirección subcelular de VT1, se incubaron células tumorales cultivadas en cubreobjetos en presencia de 10 \mug/ml de FITC-VT1B a 37ºC durante 1 hora. Después de un lavado extensivo con PBS 50 mM, las células se montaron con DABCO y se examinaron por microscopía confocal usando un microscopio confocal láser con un objetivo de 40 aumentos. Para el marcaje doble, se fijaron células marcadas con RITC-VT1B, se permeabilizaron con saposina o tritón al 0,1% y se trataron con anticuerpo de conejo anti-ERGIC 53 (proporcionado amablemente por el Dr H. Hauri, Biozentrum, Basilea) o anti BIP (dirigido contra aminoácidos y sin presentar reacción cruzada con otros hsp70s, Santa Cruz Ltd) seguido de Ig de conejo anti-ratón marcada con FITC, o ConA marcada con FITC, y se lavaron minuciosamente. Para el marcaje doble lisosomal, las células se pretrataron con dextrano marcado con FITC durante 1 noche antes de la incubación con RITC-VT1B durante 1 hora.

Se ajustó un láser de criptón/argón para producir haces de longitudes de onda de 488 nm y 565 nm para la excitación de fluoresceína y rodamina, respectivamente. El filtro doble bloquea K1K2 y permite el control simultáneo de la emisión de fluoresceína y rodamina. Las señales se registraron por secciones ópticas de 1 \mum de espesor. El diafragma y el nivel de detección de fluorescencia se ajustaron para evitar cualquier emisión cruzada de dos canales (FITC y RITC). Los gráficos se registraron con un filtro Kalman (promedio de seis imágenes) y se transfirieron a una película Kodak T-max 400. El análisis computacional de la imagen digital permitió una identificación precisa de las estructuras marcadas de manera doble.

Ejemplo 2 RME de un resto de un dominio de unión de VT híbrido marcado Dirección subcelular de VT1B en líneas de células de astrocitoma

Se controló la ruta intracelular de VT1, después de RME, en células SF-539 y XF-498, usando la subunidad B marcada con FITC. Se obtuvieron resultados similares usando FITC-VT1 (datos no mostrados).

El modelo de localización de FITC-VT1B fue totalmente distinto entre las líneas de células de astrocitoma SF-539 y XF-498, a pesar del contenido comparable de Gb_{3} y de la unión comparable en la superficie celular a 4ºC. En las células SF-539 más sensibles a VT, a 37ºC, FITC-VT1B intracelular se acumulaba alrededor del núcleo y aparentemente dentro del núcleo. Sin embargo, la localización intracelular de FITC-VT1-B en las células XF-498 era yuxtanuclear, coherente con la localización del aparato de Golgi. La microscopía confocal de marcaje doble verificó la dirección de VT1 B a la envuelta nuclear/ER y al núcleo en las células SF-539. En las células SF-539, RITC-B también se colocalizó con anti BIP (GRP 78), un marcador para el ER(41) como un anillo alrededor del núcleo. La tinción punteada para VT1B y BIP en su mayor parte era coincidente, sin embargo, parte de la tinción de BIP no mostró localización de toxina correspondiente y viceversa. Este último resultado probablemente se debe a la localización de VT1B, en parte, en vesículas de compartimentos intermedios (entre el aparato de Golgi y ER) (42). Además, claramente se observa tinción intranuclear para VT1 B, pero no para BIP. La tinción para ERGIC 53, un marcador de las vesículas de compartimentos intermedios, en parte, se colocalizaba con la tinción de VT1B. Por el contrario, no se observó tinción nuclear en las células XF-498. La microscopía confocal de doble marcaje demostró que la estructura yuxtanuclear marcada en células XF-498 se colocalizaba con el aparato de Golgi marcado con Con A. VT1B se restringió al aparato de Golgi y no se localizó con la tinción de Con A adicional del ER alrededor del núcleo.

Se observó un grado de colocalización de VT1B marcado con RITC con FITC-dextrano (marcador lisosomal) en células XF-498, que sugería que la toxina se internaliza a través de vesículas lisosomales/endosomales en estas células. En las células SF-539 (y en las células XF-498 tratadas con butirato, no mostradas) el FITC-dextrano no se colocalizaba con RITC-VT1B.

La microscopía confocal demuestra que FITC-VT1-B se dirigía diferencialmente en las células SKVLB y SKOV3. En las células SKVLB la toxina internalizada se encuentra dentro de la membrana nuclear/ER y el núcleo, mientras que en las células SKOV3, la mayor parte de la toxina intracelular está en una localización yuxtanuclear, coherente con la dirección al aparato de Golgi. De esta manera, la VT1 B intracelular se localiza en SKVLB de una manera similar a las células SF 529 y XF 498 tratadas con butirato, mientras que en las células SKOV3, la toxina se localiza como en las células XF 498.

Ejemplo 3 Preparación de proteína de fusión del dominio de unión de VT

El dominio de unión de VT recombinante puede producirse en una diversidad de sistemas de expresión. Por ejemplo, el péptido del dominio de unión de VT maduro puede expresarse como una proteína de fusión con glutatión-S-transferasa (GST) en E. coli y la proteína de fusión puede aislarse y caracterizarse. Específicamente, como se ha descrito anteriormente, el dominio de unión de VT (por ejemplo VT-B) puede fusionarse a GST y esta proteína de fusión puede expresarse en la cepa de E. coli PEB 199. Como se prevé que GST tenga 26 kD, se prevé que la proteína de fusión tendrá aproximadamente 26 kD de peso molecular más que VT-B. La expresión de la proteína de fusión GST-dominio de unión de VT en PEB 199 puede inducirse con IPTG. La proteína de fusión recombinante puede purificarse a partir de lisados bacterianos brutos de la cepa PEB 199 inducida por cromatografía de afinidad en perlas de glutatión. El análisis electroforético en gel de poliacrilamida de las proteínas purificadas a partir de los lisados bacterianos da como resultado el aislamiento de la proteína de fusión como una banda con aproximadamente 26 kD de peso molecular más que VT-B.

Se ha publicado la preparación y la purificación del dominio de unión de VT modificado que tiene un tetrapéptido carboxi terminal (Johannes et al. (1997) J. Biol. Chem. 272:19554-19561) usando un plásmido basado en pSU108 que expresa el dominio de unión de VT. También pueden purificarse proteínas de fusión de acuerdo con la invención y marcarse como se describe en este documento.

Ejemplo 4 Preparación de molécula de fusión de ADN con el dominio de unión de VT Construcción de proteínas de fusión de subunidad B de VT1 \lambda Cro para la transferencia de secuencias de ADN específicas al interior del núcleo celular.

\lambda Cro es una proteína de unión al ADN de hélice-vuelta-hélice de 66 aminoácidos procedente del bacteriófago \lambda. Esta proteína de une como un dímero a un secuencia operadora \lambda de 17 pares de bases y actúa como represor de la transcripción. Se ha diseñado una forma monomérica estable de \lambda Cro que presenta una estructura similar a Cro de tipo silvestre aunque con menor capacidad de unión al ADN (por ejemplo, Mossing y Sauer, Science (1990) 250 (4988): 1712-5).

Para construir la proteína de fusión VTIB-Cro, se inserta la secuencia codificante de \lambda Cro de tipo silvestre completa procedente del plásmido pUCroRX (donación de M. Mossing, University of Notre Dame, IN) cadena abajo y en fase con la secuencia de VT1B completa en el plásmido pJLB120 (por ejemplo, Ramotar, et al., Biochem. J. (1990) 272 (3); 805-11). pJLB120 es un derivado del vector de expresión de E. coli pKK223-3. El codón stop de VT1B se elimina y se reemplaza por una secuencia enlazadora corta que codifica 6-12 restos hidrófilos. Esto permite que tanto el dominio de la subunidad VT1B como el dominio de Cro presenten un plegamiento e interacciones moleculares apropiadas. VT1B-Cro se expresa en E. coli y se purifica por afinidad por unión a Gb_{3}. Para reconstituir la unión proteína de fusión-ADN, la proteína de fusión VT1B-Cro se incuba con \lambda Cro de tipo silvestre purificado (o traducido in vitro), y después este complejo se deja unir a fragmentos de ADN que contienen secuencias operadoras de \lambda procedentes del plásmido ptac\lambda1 (por ejemplo, Mossing et al., Methods Enzymol. (1991) 208:605-19).

Como alternativa, la proteína de fusión se construye como se ha descrito anteriormente, con la excepción de que la secuencia de Cro de tipo silvestre se reemplazará por la secuencia del monómero de Cro modificada por ingeniería genética procedente del plásmido pUCro.mDG (por ejemplo, Mossing y Sauer, Science (1990) 250 (4988): 1712-5). La proteína de fusión de VT1B purificada se incuba con fragmentos de ADN que contienen el operador \lambda y se ensayan con respecto a la unión del ADN por Ensayo de Cambio de Movilidad Electroforética o por Análisis con DNasa 1.

La proteína de fusión construida como se ha indicado anteriormente puede unirse a un ADN para el que es selectiva y, por lo tanto, puede usarse para transportar el ADN al interior de la célula por endocitosis mediada por receptor.

Ejemplo 5 Preparación de un compuesto híbrido VT-B/polilisina

Se activó polilisina disponible en el mercado (MWI-4000) usando EDC (1-etil-3-(3-dimetil-aminopropil)carbodiimida) en presencia de N-hidroxisuccinimida, usando el método de Grabarek y Gergely ("Zero Length Crosslinking Procedures with the use of Active Esters" Analytical Biochemistry 185: 131-134, 1990). El succinimidil éster resultante después se hizo reaccionar con la subunidad 1B de verotoxina (purificada como se ha descrito supra) en tampón MES 0,1 M, NaCl 0,5 M, pH 6,0 durante una hora a temperatura ambiente. El entrecruzamiento se controló por Tricina-SDS-PAGE (electroforesis en gel de poliacrilamida). El análisis de PAGE mostró la presencia de bandas de mayor peso molecular, correspondientes al conjugado de VT-B/polilisina.

El conjugado de VT-B/polilisina (compuesto híbrido) se purifica por métodos rutinarios y después se usa en un complejo con un ADN. El complejo molécula híbrida/ADN puede administrarse a una célula (o una sujeto vivo) para liberar el ADN en la célula.

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Claims (11)

1. Una molécula híbrida que comprende un primer dominio y un segundo dominio unidos covalentemente, donde

(a)

dicho primer dominio comprende una verotoxina o una subunidad de verotoxina que es capaz de unirse específicamente a Gb_{3};

(b)

comprendiendo dicho segundo dominio un resto seleccionado entre el grupo compuesto por un resto de fármaco, un ácido nucleico, una sonda para examinar la estructura celular (incluyendo marcadores de radioisótopos, marcadores fluorescentes, isotiocianato de fluoresceína, isotiocianato de rodamina, fural, marcadores de átomos pesados, partículas de oro, marcadores detectables por rayos X, agentes para formar imágenes de resonancia magnética o radioisótopos o un quelante para una radioisótopo), un polipéptido, y un gancho para formar complejos o para unirse a otro resto o restos (por ejemplo, un gancho puede ser un miembro de un par de unión específico (tal como biotina estreptavidina, hormona/receptor, proteína de unión/ligando)), con la condición de que el segundo dominio no sea una verotoxina o un fragmento de la misma.

2. La molécula híbrida de la reivindicación 1, donde el primer dominio es VT-B y/o el segundo dominio es un polipéptido.

3. La molécula híbrida de la reivindicación 1 o de la reivindicación 2, donde el polipéptido es un elemento de unión al ADN.

4. La molécula híbrida de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde el segundo dominio es un ácido nucleico (opcionalmente un ácido nucleico antisentido).

5. Una composición farmacéutica que comprende la molécula híbrida de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores y un vehículo farmacéuticamente aceptable (que opcionalmente comprende además un compuesto que altera la composición de ácidos grasos de Gb_{3}).

6. La molécula híbrida de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para uso en el tratamiento, profilaxis o diagnóstico (para modular una actividad asociada con una célula).

7. La molécula híbrida de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, para uso en la dirección del suministro de la molécula híbrida a una localización intracelular particular en una célula, opcionalmente donde la molécula híbrida se suministra en presencia de un compuesto que altera la composición de ácidos grasos de Gb_{3}.

8. Una molécula de ácido nucleico que codifica una molécula híbrida de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4.

9. Un vector recombinante que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 8 en una forma adecuada para la expresión de la proteína de fusión en una célula hospedadora.

10. Una célula hospedadora que comprende el vector recombinante de la reivindicación 9.

11. Un método in vitro para convertir en diana una célula que expresa Gb_{3}, que comprende las etapas de (a) poner en contacto la célula con el compuesto híbrido de la reivindicaciones 1-4; y (b) permitir que el compuesto híbrido se una a la célula, con lo que la célula se convierte en la diana.