CN113754733B - 一种vGPCR蛋白靶向肽的筛选方法及其嵌合毒素与应用 - Google Patents

一种vGPCR蛋白靶向肽的筛选方法及其嵌合毒素与应用 Download PDF

Info

Publication number
CN113754733B
CN113754733B CN202111104478.5A CN202111104478A CN113754733B CN 113754733 B CN113754733 B CN 113754733B CN 202111104478 A CN202111104478 A CN 202111104478A CN 113754733 B CN113754733 B CN 113754733B
Authority
CN
China
Prior art keywords
vgpcr
protein
targeting peptide
peptide
vgcr
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202111104478.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113754733A (zh
Inventor
魏芳
郑响
蔡启良
丁玲
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shanghai Jiaotong University
Original Assignee
Shanghai Jiaotong University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shanghai Jiaotong University filed Critical Shanghai Jiaotong University
Priority to CN202111104478.5A priority Critical patent/CN113754733B/zh
Publication of CN113754733A publication Critical patent/CN113754733A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113754733B publication Critical patent/CN113754733B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A61P31/22—Antivirals for DNA viruses for herpes viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/15043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)

Abstract

本发明公开了一种vGPCR蛋白靶向肽的筛选方法，及其衍生而成的嵌合毒素与应用，涉及于生物医药技术领域领域，所述靶向肽筛选方法包括慢病毒包装及稳定细胞系构建；利用表达和不表达vGPCR蛋白的细胞系交替进行噬菌体筛选，His‑vGPCR及vGPCR1‑51‑Fc蛋白纯化和结合，vGPCR蛋白短肽的单克隆候选噬菌体的筛选。基于此靶向肽构建的嵌合毒素分子能够有效选择性杀伤KSHV相关肿瘤细胞，抑制肿瘤的进展，可被进一步开发为抗肿瘤药物，同时该靶向短肽也可被改造用作于以vGPCR为靶点的间接酶联免疫反应、免疫印迹和免疫组化等检测方法的试剂，用于基础研究和临床诊治的应用。

Description

一种vGPCR蛋白靶向肽的筛选方法及其嵌合毒素与应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种vGPCR蛋白靶向肽的筛选方法及其嵌合毒素与应用。
背景技术
卡波氏肉瘤病毒(Kaposi,s sarcoma associated herpesvirus,KSHV)，又称人类疱疹病毒8型(HHV-8)，在全球范围内KSHV引发的肿瘤约占病原感染相关肿瘤总病例数的2％，其诱导的肿瘤类型包括卡波氏肉瘤(Kaposi’s Sarcoma,KS)、原发渗出性淋巴瘤(Primary Effusion Lymphoma,PEL)以及多中心性Castleman病(MulticentricCastleman’s disease,MCD)等，PEL目前尚无最佳治疗方案且预后很差，平均生存时间仅为6个月左右；KS是艾滋病患者在HIV滴度得到控制的情况下发生死亡的主要病因之一。
KSHV生命周期存在潜伏期和裂解复制期的两个感染阶段，由KSHV开放读码框ORF74编码的病毒G蛋白偶联受体(vGPCR)在裂解复制期高表达，对驱动KSHV诱变宿主细胞癌变过程及维持潜伏感染至关重要。因此，清除vGPCR表达的肿瘤细胞，对KSHV相关肿瘤的治疗至关重要。
裂解肽可通过在生物膜上寡聚，形成孔道，从而破坏细胞膜，杀死肿瘤细胞。相较于肿瘤治疗常规治疗药物，裂解肽的使用不存在耐药性问题。此外，肿瘤细胞表面负电性的磷脂酰丝氨酸水平略高于正常细胞，带正电性的裂解肽对于肿瘤细胞的杀伤活性高于正常细胞。同时，由于裂解肽含有D型氨基酸，能有效防止其被细胞内蛋白水解酶水解，从而延长作用效果；靶向结合短肽，其合成工艺成熟稳定，具有良好的肿瘤穿透能力，不易在体内诱发免疫应答，具有良好的应用前景，因此，研发vGPCR靶向肽对于KSHV相关的肿瘤的诊疗具有重要的应用价值。
发明内容
本发明提供了一种vGPCR蛋白靶向肽的筛选方法及其嵌合毒素与应用，所述靶向肽能够高效地识别结合vGPCR蛋白，基于此靶向肽构建的嵌合毒素分子能够有效选择性杀伤KSHV相关肿瘤细胞，抑制肿瘤的进展，可被进一步开发为抗肿瘤药物，同时该靶向短肽也可被改造用作于以vGPCR为靶点的间接酶联免疫反应、免疫印迹和免疫组化等检测方法的试剂，用于基础研究和临床诊治的应用。
为实现上述目的，本发明提供的技术方案是：
一种vGPCR蛋白靶向肽的筛选方法，其特征在于，所述靶向肽筛选方法包括利用表达和不表达靶蛋白的细胞多轮交替筛选，具体步骤包括：
步骤1、慢病毒包装及稳定细胞系构建；
步骤2、噬菌体库的筛选；
步骤3、His-vGPCR及vGPCR1-51-Fc蛋白纯化；
步骤4、结合vGPCR蛋白短肽的单克隆候选噬菌体的筛选。
优选的，步骤3采取四轮噬菌体淘选，淘选条件如下：
第1轮至第3轮淘选采用表达目标蛋白的vGPCR-GFP/HEK293T细胞系，第4轮采用不表达目标蛋白的GFP/HEK293T细胞系，5％BSA封闭时间依次是15min、30min、45min和60min，噬菌体原始库与封闭后的细胞悬液结合时间依次是60min、45min、30min和60min。
本发明还保护vGPCR蛋白靶向肽的衍生物在以vGPCR为靶点的检测试剂中的应用。
本发明还保护vGPCR蛋白靶向肽的衍生物在KSHV相关肿瘤诊断或治疗中的应用。
本发明还提供了一种靶向vGPCR的嵌合毒素，包括所述的靶向肽、连接肽和裂解肽，该嵌合毒素氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
本发明还保护靶向vGPCR的嵌合毒素作为制备KSHV相关肿瘤靶向药物的应用。
以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。
附图说明
图1：嵌合毒素的结构图；
图2：不同抗原包被下单克隆噬菌体亲和力分析结果分析图；
图3：免疫荧光检测3条候选短肽的结合特异性结果分析图；
图4：嵌合毒素对于KSHV相关肿瘤细胞的杀伤活性结果分析图；
图5：嵌合毒素对KSHV相关肿瘤细胞凋亡的影响结果分析图；
图6：异种移植小鼠荷瘤模型中FL-Lytic有效抑制PEL肿瘤进展结果分析图。
具体实施方式
以下参考说明书附图介绍本发明的多个优选实施例，使其技术内容更加清楚和便于理解。本发明可以通过许多不同形式的实施例来得以体现，本发明的保护范围并非仅限于文中提到的实施例。在本发明的构思前提下对本发明vGPCR蛋白靶向肽筛选方法及嵌合毒素的简单改造，均属本发明要求保护的范围。
下述实施例中所使用的实验方法，如无特殊说明均为常规方法，所用的试剂、方法和设备，如无特殊说明均为本技术领域常规试剂、方法和设备。
实施例1：特异结合vGPCR蛋白的短肽的筛选
具体操作如下：
一、慢病毒包装及稳定细胞系构建
1.质粒构建：vGPCR及GFP以EcoRI/XbaI、XbaI/NotI插入到pLVX IRES Puro载体，测序成功后使用STBL3进行扩增，同时扩增VSVG、pSPAX并进行质粒大抽。
2.细胞铺板：将HEK293T接种于10cm dish，细胞密度长至60-70％。
3.慢病毒包装：
1)量取1.25μg VSVG、3.5μg pSPAX2以及5μg重组质粒加入到500μL无血无抗DMEM培养基中，加入30μL PEI，充分混匀后静置20min。
2)转染6h后，换成完全培养基，24、48、72h收集上清。
4.慢病毒纯化：4000rpm离心5min取上清，0.45μm滤器过滤后12000g离心2h，弃上清，加入100μL无血无抗DMEM静置2h后重悬，20μL/管分装，-80℃保存。
5.慢病毒感染及稳定细胞系筛选：
1)HEK293T接种于24孔板，待长至60-70％进行慢病毒感染。
2)感染前病毒提前0.5h冰上解冻，HEK293T换成无血无抗DMEM培养基。
3)加入20μL病毒液后室温2500g离心感染1h，37℃孵育1h后换成完全培养基，72h后加入终浓度1μg/mL嘌呤霉素进行筛选，直至建系成功。
二、噬菌体库的筛选
1.将扩增菌株ER2738在平板划线(四环素抗性)，待长出单克隆后接种在10mL LB的锥形瓶中，37℃剧烈振摇备用。
2.收集细胞：将5×106vGPCR-GFP/HEK293T收集至Eppendorf管中，PBST洗一次，3000rpm离心3min，轻轻吸去上清。
3.封闭：5％BSA旋转孵育封闭细胞15min，并用PBST漂洗三次。；
4.结合：用PBST稀释10μL(4×1010)噬菌体原始库(NEB的Ph.D.-12library)至1mL，加入到封闭后的细胞悬液中，4℃下旋转孵育1h。
5.漂洗：PBST漂洗六次，去掉未结合的噬菌体，200μL重悬细胞。
6.扩增：细胞悬液加入到20mL LB的锥形瓶，按照1:100加入ER2738菌株，37℃剧烈振摇4.5h。
7.离心：将培养物转入30mL离心管中，4℃12000rpm离心10min，上清转移到新的30mL离心管再次离心。
8.沉淀噬菌体：将80％的上清转移到新的30mL离心管中，加入1/6体积的PEG/NaCL4℃沉淀过夜。
9.离心：4℃离心15min，倾去上清，再次离心，倾去多余的上清，用1mL PBST重悬沉淀并转入新的Eppendorf管中，4℃12000rpm离心5min，吸去80％体积的上清，转移至新的Eppendorf管中。
10.沉淀噬菌体：加入1/6体积的PEG/NaCL冰上再次沉淀60min。
11.4℃离心10min，弃上清，再次短暂离心，用微量枪头弃去多余的上清，用200μLPBST重悬噬菌体沉淀，含0.02％叠氮钠，离心1min，将上清转移至新的Eppendorf管，即为第一轮噬菌体淘选扩增产物。
12.取1μL测定扩增后噬菌体的浓度，其余-20℃保存，用于下一次扩增。一共进行四轮淘选，淘选条件如表1。
表1噬菌体展示技术生物淘选条件
三、His-vGPCR及vGPCR1-51-Fc蛋白纯化
1.质粒构建：利用Uniprot数据库查询vGPCR(KSHV，Strain GK18)N端第一段膜外氨基酸1-51，将其对应的碱基序列进行基因合成，以EcoRI/HindIII插入到PET-28a载体，测序成功后备用，质粒命名His-vGPCR。将vGPCR膜外1-51氨基酸对应的碱基序列，进行基因合成以SfiI/ApaI插入到pSecTag载体，测序成功后备用，命名vGPCR1-51-Fc。
2.包涵体蛋白表达纯化：
1)His-vGPCR重组质粒转入Rosetta菌株，挑单克隆初步扩增后加1mM IPTG诱导过夜。
2)菌液经高压均质机破碎离心(15000rpm，4℃)取沉淀。
3)加入2mol/L尿素重悬菌体，冰上放置30min，4℃12000rpm离心20min，然后用6mol/L盐酸胍溶解菌体，冰上放置30min，4℃12000rpm离心20min。
4)取上清，加入镍珠4℃结合过夜，用梯度咪唑(20、40、60、100、250、500mmol/L)洗脱液洗脱。
5)SDS-PAGE检测蛋白表达情况，放入透析液内(透析时按照4、2、1、0.5mol/L的原则，逐渐降低透析液内尿素的摩尔浓度)，4℃透析换液7次。
6)透析结束后将蛋白样品进行SDS-PAGE电泳，检测透析后目标蛋白的纯度和含量，同时放入-80℃冻存。
3.真核蛋白纯化
1)vGPCR1-51-Fc重组质粒通过PEI转染转入到HEK293TT，表达48h后，收集细胞上清，
2)浓缩：超滤管进行离心浓缩至5mL。
3)离心换液：4℃12000rpm 10min离心两次，每次加入10ml IP buffer，离心换液后总体积约1mL。
4)加入Protein A beads 500μL，2mL IP buffer，4℃旋转孵育过夜。
5)4℃4000rpm离心1min取沉淀，1mL Elution buffer进行重悬，洗脱蛋白。
6)4℃4000rpm离心1min取上清，加入Neutralization buffer平衡。
7)超滤离心三次换液，每次加入10mL PBS。
8)蛋白样品及上述各步骤留样一起进行SDS-PAGE电泳，检测目标蛋白的纯度和含量，所有蛋白每管200μL分装，然后于-80℃冻存。
四、结合vGPCR蛋白短肽的单克隆候选噬菌体的筛选
1.包板：将纯化的His-vGPCR蛋白及vGPCR1-51-Fc蛋白稀释至1μg/mL，每孔加100μL，4℃过夜，次日，弃去孔内溶液，用1×TBST洗1次，拍干；
2.封闭：1％BSA 37℃孵育1h，弃封闭液。
3.加一抗：将经四轮淘筛获得的噬菌体感染ER2738菌株,振荡培养(需加IPTG诱导)，离心取上清即为噬菌体抗体。将噬菌体抗体加入已封闭的反应孔，同时设置好阴性对照孔(1％BSA)，置37℃孵育1h，弃液，用1×TBST洗3次，拍干。
4.加HRP标记的二抗：稀释的anti-M13-HRP(1:10000稀释，用1％BSA进行稀释)，加入酶标板孔中，置37℃孵育45min，用1×TBST洗3次，拍干。
5.加底物液显色：分别量取4.86mL柠檬酸(0.1mol/L)和5.14mL Na2HPO4(0.2mol/L)，0.5mL TMB以及32μL 0.75％双氧水，上述底物液现配现用，每孔加入100μL，置37℃反应5min。
6.终止反应：于各反应孔中加入2mol/L硫酸100μL，终止反应；
7.读板：酶标仪读板，数据使用GraphPad prism 5.0软件进行分析。
筛选结果如图2所示，(A)His-vGPCR和(B)vGPCR1-51-Fc抗原蛋白以0.1μg/mL 100μl包板过夜，12个阳性单克隆作为一抗，利用anti-M13 HRP检测亲和力，筛选出1C3、1F10、1B5三个高亲和力的阳性克隆。
五、测序
根据图2结果，选择高亲和力的阳性克隆进行测序，其核苷酸序列以及氨基酸序列，结果如表2所示。
实施例2：利用免疫荧光验证vGPCR蛋白与候选短肽的亲和力
具体操作如下：
1.短肽合成：将图中与vGPCR结合能力较强的三个阳性克隆(1C3、1F10、1B5)对应的候选多肽片段N端与生物素耦连(1C3：Biotin-LR；1F10：Biotin-FL；1B5：Biotin-SR)，该部分由上海吉尔生物有限公司完成。
2.细胞铺板：将细胞爬片放入6孔板，冰PBS洗三次，GFP/HEK293T及vGPCR-GFP/HEK293T细胞接种在6孔板中过夜，细胞密度达到60-70％；
3.固定细胞：将培养基吸出，用冰PBS洗两次，4％多聚甲醛室温固定30min。
4.封闭：PBS洗三次后，加入0.2％FSG封闭液，室温封闭0.5h。
5.一抗：用封闭液稀释生物素耦连的多肽，终浓度为100μg/mL，4℃14000rpm离心2min，去掉杂质，加入50μL抗体，室温孵育1h，随后用封闭液洗三次。
6.二抗：用封闭液稀释链霉亲和素594荧光二抗，4℃14000rpm离心2min去杂质，加入50μL荧光二抗，室温孵育1h。随后用封闭液洗三次。
7.染核：PBS稀释Hoechst至终浓度0.5μg/mL(1:2000)，室温孵育20min。
8.封片：向载玻片上滴加20μL Mounting Medium，封片，过夜避光晾干，放入玻片盒。
实验结果如图3所示，Biotin-FL吸附在vGPCR-GFP/HEK293T膜外表位，而其他两条短肽Biotin-SR以及Biotin-LR与vGPCR-GFP/HEK293T没有特异性，说明候选多肽FL(氨基酸序列FGDRTITQMSQL)，可以与vGPCR膜外部分特异性结合。
实施例3：嵌合毒素FL-Lytic对KSHV相关肿瘤细胞的特异杀伤活性
具体操作如下：
1.短肽合成：合成嵌合毒素(FL-Lytic)和作为阴性对照的裂解肽(Lytic)，该部分由上海强耀生物科技有限公司完成。
FL-Lytic:FGDRTITQMSQLGGGKLLLKLLKKLLKLLKKK
Lytic:KLLLKLLKKLLKLLKKK
2.细胞杀伤活性实验：将25000个KSHV相关肿瘤细胞(BCBL-1、BCP-1为KSHV阳性细胞，BJAB和DG75为KSHV阴性细胞)种于96孔板中(25000个/50μL含10％FBS的1640培养基)，然后加入50μL用10％FBS的1640培养基配制的不同浓度的嵌合毒素溶液(0、2.5、5、10μmol/L)，在37℃，5％的条件下处理2h，通过MTT试剂检测细胞存活率。
结果如图4所示，发现对于KSHV阳性细胞，嵌合毒素在5μmol/L浓度以上，可有效杀死半数KSHV阳性细胞，而对照的裂解肽在0-10μmol/L浓度范围内杀伤效果不明显；对于KSHV阴性细胞，嵌合毒素的半数有效量高于10μmol/L，同时裂解肽在0-10μmol/L浓度范围内杀伤效果不明显。总体而言，嵌合毒素能对KSHV阳性细胞具有选择杀伤活性，而对阴性细胞杀伤活性较弱，裂解肽在0-10μmol/L浓度范围内对于KSHV相关肿瘤细胞的杀伤活性不明显。
实施例4：嵌合毒素FL-Lytic可诱导KSHV相关肿瘤细胞的凋亡
具体操作如下：
1.使用去离子水稀释结合缓冲液(10×)至1×,同时配制Staining Buffer(PBS加2％胎牛血清)。
2.收集KSHV相关肿瘤细胞(BCBL-1、BCP-1为KSHV阳性细胞，BJAB、DG75为KSHV阴性细胞，1×105个/次)，加入嵌合毒素和裂解肽(终浓度为5μmol/L)，37℃处理1h。
3.然后离心，冷Staining Buffer洗涤一次，100μL binding Buffer重悬。
4.每管依次加入0.5μL Annexin V-APC【货号：640919，厂家：biolegend】和1μL PI【货号：556547，厂家：BD】,室温，避光15min。
5.加400μL binding Buffer，混匀。
6.在流式细胞仪上完成检测。
实验结果如图5所示从图中看出嵌合毒素显著促进了KSHV阳性细胞的凋亡，而对阴性细胞不明显，同时裂解肽对于KSHV阳性和阴性细胞凋亡均没有显著的促进作用。
实施例5：异种移植小鼠荷瘤模型中嵌合毒素抑制PEL肿瘤进展
具体操作如下：
1.8只8周龄雌性NOD/SCID小鼠，经腹腔注射带有荧光素酶标记的BCBL-1细胞(注射剂量为1×106个细胞/只)，建立异种移植小鼠PEL荷瘤模型。
2.BCBL-1细胞植入后第1周，进行实时生物发光成像以检测每只小鼠内的肿瘤信号强度(如图6)。随后，将具有相似信号强度的荷瘤小鼠随机分成两组，分别PBS组和嵌合毒素FL-Lytic组。
3.PBS组和嵌合毒素组小鼠分别腹腔注射PBS和嵌合毒素(5mg/kg)，每周三次，连续3周，第4周进行成像，检测肿瘤大小。
体内实验结果如图6所示，PBS组小鼠的肿瘤进展迅速，而嵌合毒素组肿瘤进展缓慢，由此可见嵌合毒素可以显著抑制PEL肿瘤进展。
综合上述实施例可知：本发明实施例通过噬菌体库技术筛选可选择识别结合vGPCR蛋白的短肽，构建嵌合毒素，可实现靶向杀死KSHV相关肿瘤细胞，抑制PEL肿瘤进展的潜在临床治疗效果。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
序列表
<110> 上海交通大学
<120> 一种vGPCR蛋白靶向肽的筛选方法及其嵌合毒素与应用
<130> 2121
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 1
Phe Gly Asp Arg Thr Ile Thr Gln Met Ser Gln Leu Gly Gly Gly Lys
1 5 10 15
Leu Leu Leu Lys Leu Leu Lys Lys Leu Leu Lys Leu Leu Lys Lys Lys
20 25 30

Claims (2)

1.一种靶向vGPCR的嵌合毒素，其特征在于，包括靶向肽、连接肽和裂解肽，所述嵌合毒素氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.一种KSHV相关肿瘤靶向药物，其特征在于，包含权利要求1所述的靶向vGPCR的嵌合毒素。
CN202111104478.5A 2021-09-18 2021-09-18 一种vGPCR蛋白靶向肽的筛选方法及其嵌合毒素与应用 Active CN113754733B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111104478.5A CN113754733B (zh) 2021-09-18 2021-09-18 一种vGPCR蛋白靶向肽的筛选方法及其嵌合毒素与应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111104478.5A CN113754733B (zh) 2021-09-18 2021-09-18 一种vGPCR蛋白靶向肽的筛选方法及其嵌合毒素与应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113754733A CN113754733A (zh) 2021-12-07
CN113754733B true CN113754733B (zh) 2023-10-20

Family

ID=78796606

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202111104478.5A Active CN113754733B (zh) 2021-09-18 2021-09-18 一种vGPCR蛋白靶向肽的筛选方法及其嵌合毒素与应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113754733B (zh)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1229045A1 (en) * 2001-02-01 2002-08-07 Institut Curie Universal carrier for targeting molecules to Gb3 receptor expressing cells
CN111205351A (zh) * 2020-01-19 2020-05-29 中国药科大学 一种pd-1靶向阻断肽及其应用
CN111825749A (zh) * 2020-07-31 2020-10-27 江苏莱森生物科技研究院有限公司 一种抗肿瘤多肽及其制备方法与用途
CN111875673A (zh) * 2020-07-31 2020-11-03 江苏莱森生物科技研究院有限公司 一种具有抗肿瘤活性的多肽及其用途

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1229045A1 (en) * 2001-02-01 2002-08-07 Institut Curie Universal carrier for targeting molecules to Gb3 receptor expressing cells
CN111205351A (zh) * 2020-01-19 2020-05-29 中国药科大学 一种pd-1靶向阻断肽及其应用
CN111825749A (zh) * 2020-07-31 2020-10-27 江苏莱森生物科技研究院有限公司 一种抗肿瘤多肽及其制备方法与用途
CN111875673A (zh) * 2020-07-31 2020-11-03 江苏莱森生物科技研究院有限公司 一种具有抗肿瘤活性的多肽及其用途

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Anti-HCMV and KSHV effect of a trapping ligand antagonist for Herpesvirus-encoded GPCR;Hong-Ai Liu et al.;Indian Journal of Experimental Biology;第50卷;313-319 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN113754733A (zh) 2021-12-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN114163523B (zh) 一种针对新型冠状病毒的单域抗体及其应用
CN111647076B (zh) 抗新型冠状病毒SARS-Cov-2的中和性单域抗体及其应用
CN111320694B (zh) 一种由重链抗体的可变区组成的纳米抗体gn2及其制备方法和应用
JP2001513335A (ja) 細胞内の物質移送のための抗体から誘導されたベクター
CN108892723B (zh) 用于检测猪流行性腹泻病毒的单域重链抗体、制备方法及应用
CN103709251B (zh) 全人源抗cd26抗体及其应用
WO2023009028A1 (ru) Однодоменное антитело и его модификации, специфически связывающиеся с rbd s белка вируса sars-cov-2
CN103641917B (zh) 抗cd26抗体及其应用
CN114478696A (zh) 一种新型冠状病毒刺突蛋白受体结合区rbd的亲和多肽及其应用
CN111171148A (zh) 一种抗补体c3分子的人源化单链抗体及其应用
CN113045662B (zh) 一种特异性识别pd-l1的纳米抗体及其应用
WO2022140422A1 (en) Llama-derived nanobodies binding the spike protein of novel coronavirus sars-cov-2 with neutralizing activity
CN113754733B (zh) 一种vGPCR蛋白靶向肽的筛选方法及其嵌合毒素与应用
CN112625132B (zh) 纳米抗体及其编码基因、表达载体、宿主细胞和应用
CN111499744A (zh) 一种乳铁蛋白纳米抗体及制备方法、应用
CN114213532B (zh) 高亲和力的抗鸡传染性法氏囊病毒的scFv抗体的制备及其应用
CN114478755B (zh) 抗新型冠状病毒的全人源抗体及其组合物与应用
WO2021197212A1 (zh) 噬菌体药物蛋白展示系统及其应用
CN114539395A (zh) SARS-CoV-2野生型毒株和α突变株骆驼源高亲和力纳米抗体
CN115975015A (zh) 一种小反刍兽疫病毒（pprv）f蛋白纳米抗体和纳米抗体的制备、纯化及中和试验方法
CN103694352B (zh) 一种抗 cd26 抗体及其制备方法
CN103724431B (zh) 一种人源抗cd26抗体及其应用
CN117720659A (zh) 一种抗cd28纳米抗体、编码基因及应用
CN106188285B (zh) 一种中和新疆出血热病毒的单域抗体
Li et al. N-terminal residues of an HIV-1 gp41 membrane-proximal external region antigen influence broadly neutralizing 2F5-like antibodies

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant