JP2004531230A - Ｇｂ３レセプター発現細胞を標的とする分子の一般担体 - Google Patents
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Abstract
本発明は、Ｇｂ３レセプター発現細胞に対して直接的に又は間接的に分子を標的化させるための、次の式ＳＴｘＢ-Ｚ(ｎ)-Ｃｙｓ（ここでＳＴｘＢはシガトキシンＢサブユニット又はその機能的な等価物であり、Ｚはスルフヒドリル基のないアミノ酸であり、ｎは０、１又はポリペプチドであり、Ｃｙｓはアミノ酸システインである）を有する一般的なポリペプチド担体、及び抗原のＭＨＣクラスＩ及びＭＨＣクラスＩＩ提示のためのその使用に関する。
Description
【発明の開示】
【０００１】
本発明は、シガトキシン発現細胞のＢサブユニットのＧｂ３レセプターに対する標的分子の一般ポリペプチド担体と細胞内輸送のためのその使用及び前記分子のプロセシングに関する。
【０００２】
シガトキシンは、志賀赤痢菌により分泌されるＡＢ５サブユニットファミリーの細菌毒素である。Ａサブユニットは、毒素部分であり、前記細胞の細胞質中に翻訳された後に高等真核標的細胞においてタンパク質合成を抑制する。Ｂサブユニットはホモ五量体タンパク質（５Ｂ断片）であり、標的細胞の原形質膜に見られる糖脂質Ｇｂ３と相互作用することによる標的細胞への毒素結合及び内部移行の原因である。Ｂ断片は非毒素であるが、多くのＧｂ３発現細胞で原形質膜からサイトゾルへエンドソームを介して逆行する様式で輸送されるホロトキシンの細胞内輸送特性を保持する。
また、糖脂質Ｇｂ３レセプターは、ある種の外胚葉誘導性腫瘍（血漿）及びある種のバーキットリンパ腫で優先的に発現されることが報告されている。ＣＤ７７としても知られる。本文では、用語Ｇｂ３をＣＤ７７に相当するものとみなす。
【０００３】
シガトキシンのＢサブユニットに融合されるＣＤ８ヒト腫瘍抗原がＣＴＬに特異的なＨＬＡクラスＩ拘束法で効果的に提示されうることが、既に著者によって示されている（１）。この結果は、インフルエンザウィルスから同定されたペプチドエピトープを有するシガホロトキシンがＭＨＣクラスＩ細胞内経路内に抗原を供給することができることを示すもう一つの研究によって別に確認された（３）。
また、著者は志賀赤痢菌から誘導された細菌性シガトキシンのＧｂ３レセプター結合非毒性Ｂ断片と抗原、又はモデル腫瘍抗原由来のエピトープとの間の融合タンパク質は、特異的な細胞障害性Ｔリンパ球応答（ＣＴＬ）を誘発することができるが、前記融合タンパク質の各部分はＣＴＬ誘発を独立して導かないことを示した（１、２及びＷＯ９９／０３８８１）。
この技術の難点は、各用途において、つまり各抗原又はその断片にとって、融合タンパク質の特定の構造である必要性があり、宿主細胞で発現されるこの融合タンパク質をコード化する配列を有する組換えベクターの特定の構造を必要とすることである。
【０００４】
本発明の目的は、上述した欠点を克服し、Ｇｂ３レセプター発現細胞に分子を標的化させてＧｂ３レセプターを発現する前記細胞中にこの分子を内部移行、プロセシング及び／又は発現させることを可能にするための、一般的なフックあるいは一般担体を提供することである。
本発明において、シガトキシンＢサブユニット（ＳＴｘＢ）誘導体、又はＳｔｘＢ-Ｃｙｓと称される突然変異体が作成される。このタンパク質において、システインは成熟ＳＴｘＢのＣ末端に付加される。細菌から精製した場合、タンパク質は野生型ＳＴｘＢのように内部ジスルフィド結合を有するが、Ｃ末端Ｃｙｓのスルフヒドリル基は遊離型である。それらの求核性のために、遊離スルフヒドリル基は特異的カップリングアプローチの優れたアクセプターである（４）。
【０００５】
従って、本発明は、Ｇｂ３レセプター発現細胞に対して対象の分子を直接的に又は間接的に標的化するための、次の式：ＳＴｘＢ-Ｚ(ｎ)-Ｃｙｓ、ここで
−ＳＴｘＢはシガトキシンＢサブユニット又はその機能的等価物であり、
−Ｚはスルフヒドリル基のないアミノ酸であり、ｎは０、１又はアミノ酸配列であり、
−Ｃｙｓはアミノ酸システインである
を有する一般ポリペプチド担体に関する。
一般担体のＳＴｘＢ部分は、（８）に記載される配列又はその機能的等価物を有する。機能的等価物とは、Ｇｂ３レセプターに特異的に結合し、及び／又はその提示を抗原の内部移行及びＭＨＣクラスＩ拘束経路又はＭＨＣクラスＩとクラスＩＩの両方においてその抗原提示細胞で誘引する能力を有するポリペプチド配列を意味する。
腫瘍抗原の発現の不均一性、腫瘍細胞の表面におけるＭＨＣクラスＩ発現の対立遺伝子特異的欠損、及びＭＨＣクラスＩ及びクラスＩＩの両方による抗原の同時提示をその抗原提示細胞で有することの必要性に鑑みて、樹状細胞に対して標的化させるためにＢサブユニットに完全な大きさの抗原タンパク質を結合させることが望ましい。
【０００６】
好ましい実施態様では、ｎが０であり、一般担体は次の配列（配列番号１）：
COOH-MKKTLLIAASLSFFSASALATPDCVTGKVE
YTKYNDDDTFTVKVGDKELF
TNRWNLQSLLLSAQITGMTVTIKTNACHNGGGFSEVIFRC-NH2
を有する。
実際、Ｚリンカーが長すぎると、つまりｎが２以上であると、内部ジスルフィド架橋が生じ、ＳＴｘＢのＧｂ３レセプターへの結合を抑制し、特に対象の分子への結合を抑制する。
本発明によれば、対象の分子は、タンパク質、ペプチド、オリゴペプチド、糖タンパク質、糖ペプチド、核酸、ポリヌクレオチド、又はその組合せからなる群から選択される。
【０００７】
本発明の他の実施態様によれば、対象の分子は、抗原提示細胞に標的化される抗原である。このような細胞はＴリンパ球、樹状細胞、マクロファージ、ランゲルハンス細胞などからなる群から選択される。
本発明の他の実施態様では、対象の分子は、薬剤、例えばハプテン、ソラレン、又はＳＴｘＢ-Ｃｙｓのシステイン部分の−ＳＨ基と連結可能な化学基を有するあらゆる化合物である。
薬剤は、直接又はブロモ酢酸等の化合物での活性化の後に、あるいは反応の結果が次の式：ＳＴｘＢ-Ｃｙｓ-Ｍ（Ｍは対象とする前記分子全てである）を有する化学実体である技術者に既知の他のあらゆる方法で連結されうる。
【０００８】
ＳＴｘＢ-Ｚ(ｎ)-Ｃｙｓへのペプチド又はポリペプチド部分の共有結合のためのカップリングアプローチは、技術者によって記載又は実施されるあらゆる方法又は処理法でありうる。
具体化することのできる第１の方法は、Carlsson等（５）によって記載されるＳＰＤＰヘテロ二機能性架橋結合の利用である。しかしながら、ＳＤＰＤは反応生成物の減少の原因である血清チオラーゼにより切断可能である。
ＳＴｘＢ-Ｚ(ｎ)-Ｃｙｓペプチドと対象とする他のペプチドとの共有結合のための第２の方法は、P. Schelte等（４）によって記載されるように後者にブロモアセチル又はマレイミド基を作ることである。簡略すると、対象とするペプチドを無水ブロモ酢酸で、又はマレイミド基によって化学的に活性化する。適した反応条件（ｐＨ、温度、インキュベーション時間）下で、これらの基はそれぞれ−Ｓ-Ｓ、−Ｓ-ＣＨ２-に、−Ｓ-ＣＯ-に又は−Ｓ-ＮＨ-共有結合になるシス脱離によって脱離される。
【０００９】
実施例のように、一般担体のＣ末端システインの−ＳＨ部分にカップリングされるポリペプチド又はペプチドは、そのＮ末端を無水ブロモ酢酸により、次の反応式：
に従って活性化させる。
ブロモアセチル基は、ペプチドチオール基に対して高い官能基選択性を有し、活性化ペプチドを次の：
のようにＳＴｘＢ-Ｃｙｓと反応させることができる。
生じたチオエーテル結合は加水分解に対して安定である。
【００１０】
本発明の一般担体に分子をカップリングするための他の方法は、図６に示され実施例５で説明されるようなＭＢＳ（ｍ-マレイミドベンゾイル-Ｎ-ヒドロキシスクシンイミドエステル）を使用することである。このカップリングは、ＭＨＣクラスＩ及び／又はＭＨＣクラスＩＩ経路によって抗原タンパク質又は糖タンパク質のような大分子の輸送及び加工を可能にする。
従って、本発明の他の態様は、−Ｓ-Ｓ-、−Ｓ-ＣＯ-、又は−Ｓ-ＣＨ２-又は−Ｓ-ＮＨ-結合による対象の分子とＳＴｘＢ-Ｚ(ｎ)-Ｃｙｓとの共有結合から生じる生成物である。
【００１１】
一実施態様では、抗原提示細胞に標的化される対象の分子は、抗原又はそのエピトープ、糖ペプチド又は糖タンパク質、リポペプチド又はリポタンパク質のようなポリペプチド構造によって構築され、又はそれを含む。
好ましい実施態様では、(ｎ)が０、１又は２、好ましくは０である、ＳＴｘＢ-Ｚ(ｎ)-Ｃｙｓと抗原又はその断片とのカップリングから生じる生成物は、ＭＨＣクラスＩ及びＭＨＣクラスＩＩ拘束経路で提示可能である。
他の実施態様では、対象の分子は、例えばＤＮＡ又はＲＮＡ分子のようなポリヌクレオチド構造と結合する能力のあるポリペプチドである。このような分子は、標的細胞で発現される対象配列を含むベクター又はプラスミドでありうる。本発明において、標的細胞は、その膜上にＧｂ３レセプターを有する真核細胞である。
【００１２】
従って、本発明の一般担体はまた、遺伝子治療用に又は異種タンパク質を発現する組換え細胞を得るために標的細胞にヌクレオチド配列を導入するための担体である。
他の実施態様では、本発明に係る一般担体は、共有結合によって直接的に又はリンカーによって間接的に細胞障害剤に作用可能に連結させ、Ｇｂ３レセプターを発現する腫瘍細胞に対して標的化させることができる。
「間接的な結合」という用語は、一般担体がＣ末端システインのスルフヒドリル部分を介してリンカーに共有的に連結することを意味し、該リンカーは、薬剤又はプロドラッグに作用可能に連結されてＧｂ３レセプター担持細胞に内部移行する。
この連結は、リンカーと薬剤（又はプロドラッグ）の間の親和性が１０−９モル／ｌよりも高いと、共有結合又は非共有結合であり得る。
【００１３】
本発明の他の実施態様は：
ａ）その３'末端にシステインをコード化するコドンＴＧＴ、又はコドンＴＧＣを有するシガトキシンＢサブユニット又はその機能性等価物をコード化するヌクレオチド配列ＳＴｘＢを含むポリヌクレオチド；
ｂ）その３'末端にコドンＴＧＴ又はＴＧＣを有するシガトキシンＢサブユニット又はその機能性等価物をコード化するヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；及び
ｃ）ａ）又はｂ）の配列に相補的なヌクレオチド配列
の群から選択される単離されたポリヌクレオチドである。
【００１４】
好ましい実施態様では、ポリヌクレオチドは次の配列番号２：
５'−atgaaaaaaacattattaatagctgcatcgctttcatttttttcagcaag
tgcgctggcgacgcctgattgtgtaactggaaaggtggagtatacaaaat
ataatgatgacgatacctttacagttaaagtgggtgataaagaattattt
accaacagatggaatcttcagtctcttcttctcagtgcgcaaattacggg
gatgactgtaaccattaaaactaatgcctgtcataatggagggggattca
gcgaagttatttttcgttgt−３'
を有する。
【００１５】
また、本発明は、上記のようなポリヌクレオチド配列を有し、適した宿主細胞において一般担体ＳＴｘＢ-Ｚ(ｎ)-Ｃｙｓ（ここで、(ｎ)は０、１又は２、ＳＴｘＢ及びＺは上記と同じ意義を有する）を発現する能力のある組換えベクター又はプラスミドに関する。
例えば、好適なベクターは（７）に記載されるようなプラスミドｐＳｕ１０８である。
本発明の他の目的は：
ａ）ＳＴｘＢ配列を有するプラスミドを準備する；
ｂ）プライマーＡＡ'及びＢＢ'の２つの組を用いて２回のＰＣＲ増幅工程を実施する、
−Ａ及びＢは互いに相補的で、Ｃｙｓコドンを有する
−Ａ'及びＢ'はＳＴｘＢ配列の外側にある；
ｃ）増幅断片を単離する；
ｄ）増幅断片をハイブリダイズする；
ｅ）ハイブリダイズした断片にＰＣＲ増幅を実施する；
ｆ）プラスミドに増幅断片を挿入する
ことを含むプラスミド発現ＳＴｘＢ-Ｚ(ｎ)-Ｃｙｓを得るための方法を提供することにある。
【００１６】
好ましい実施態様では、ＳＴｘＢ断片を含むプラスミドｐＳＵ１０８（７）を修飾して、Ｂ断片ｃＤＮＡの３'末端にシステインコドンＴＧＴを導入する。工程ｂ）のプライマーは、それぞれＡＡ'及びＢＢ'について：
−プライマーＡ：５'−AGCGAAGTTATTTTTCGTTGTTGACTCAGAATAGCTC−３'（配列番号３）、及び
−プライマーＢ：５'−GAGCTATTCTGAGTCAACACGAAAAATAACTTC−３'（配列番号４）、
−プライマーＡ'：プライマーShigaAtpE：５'−CACTACTACGTTTTAAC−３'（配列番号５）、及び
−プライマーＢ'：プライマーShiga-fd：５'−CGGCGCAACTATCGG−３'（配列番号６）
である。
【００１７】
工程ｅ）のＰＣＲは、ｐＳＵ１０８のＳｐｈｌ及びＳａｌｌ制限部位にクローン化された断片を生産する。ＰＣＲによって誘導される配列はジデオキシ配列決定によって確認される。
技術者は、適した宿主細胞でＳＴｘＢ-Ｚ(ｎ)-Ｃｙｓを発現するポリヌクレオチド配列を有するベクターを作成するためのプラスミド、プライマーの選択を容易に行うことができ、この一連の工程は増幅断片へのＣｙｓコドンの解釈を可能にする。
また、本発明は、上記のような一般担体をコード化するポリペプチド配列を含む組換えベクターで形質転換することによって得られる組換え細胞株を提供する。好ましい実施態様では、該組換え細胞株は原核細胞、好ましくは大腸菌である。
【００１８】
更に好ましい実施態様では、プラスミドは、ＳｐｈｌとＳａｌｌ制限部位の間に組み込まれた配列番号２を有するｐＳＵ１０８であり、相当する細胞株は２０００年１２月１９日に登録番号ｌ-２６０４でＣＮＣＭに寄託されている。
また、本発明は：
ａ）上記のような組換え細胞株を培養し、
ｂ）該細胞のペリプラズム抽出物を採取し、
ｃ）前記ポリペプチドを生成する
ことを含む、上記のような一般担体を作成する方法を提供する。
【００１９】
好ましくは、細胞株は大腸菌であり、ｃ）において精製は陰イオン交換カラムクロマトグラフィーの後にゲル濾過カラムクロマトグラフィーをすることによってなされる。
このような方法は、その際に対象の分子と共有的にカップリングすることによって作用可能に連結させることができる限りにおいて、一般担体の大規模生産に特に有利であり、広範な用途で使用される。
また、本発明は、一般担体のＣｙｓ部分と対象とする配列との共有結合によって得られる生成物を用いて、ＭＨＣクラスＩ経路に対象とする前記配列を供給する方法を提供し；本方法は、生成物がＭＨＣクラスＩ経路に関与する細胞に特異的である限りにおいて、得られた抗原又はそのエピトープに対するＣＴＬ応答を誘発するのに有利である。
【００２０】
実際に、発明者は、卵白アルブミンタンパク質から誘導され、ＳＴｘＢ-Ｃｙｓに化学的に結合される免疫優性ペプチドを、抗原提示細胞によって特異的なハイブリドーマ細胞に提示できることを示しており、ＳＴｘＢはＭＨＣクラスＩ経路で外因性免疫原性ペプチドを供給できることを示す。物質を汚染している遊離ペプチドの存在による偏向を排除するために固定した樹状細胞を用いる実験は、融合タンパク質の内部移行がこの工程に必要とされることを明確に示した。また、本発明はシガトキシンレセプター、Ｇｂ３も内因性ＭＨＣクラスＩ経路において外因性ペプチドを標的化するＳＴｘＢ-Ｃｙｓの能力に関係していたということを示した。
また、本発明は、Ｇｂ３レセプター発現細胞に対象の配列を含む発現ベクターを供給するための、前記発現ベクターを、一般担体のＣｙｓ部分に共有的に結合されるリジンリッチペプチドに結合させることを特徴とする方法に関する。
【００２１】
実施例のように、リジンリッチペプチドはあらゆるポリヌクレオチド配列、ＤＮＡ又はＲＮＡに結合する能力のある１６アミノ酸長のポリリジンである。このような１６アミノ酸長のリジンを有するペプチドは、そのＮ末端で無水ブロモ酢酸によって活性化され、ＳＴｘＢ-Ｃｙｓにカップリングする。発現プラスミドは、このカップリング生成物に結合し、標的細胞へのＤＮＡのベクトル化は、例えば、緑色蛍光タンパク質又はルシフェラーゼのような好適なレポーター系を用いてアッセイされる。
抗原提示細胞の核にＳＴｘＢによって発現プラスミドを標的化する能力は、ｉ）ＤＮＡが新しい実験又は臨床的な必要性のためにさらにより容易に利用することができ、ｉｉ）相乗効果のためにＤＮＡ由来の抗原性ペプチド又はタンパク質の発現がＳＴｘＢ依存性抗原提示の感度を更に向上させるので、このベクターの効力をさらに改善することが期待される。
【００２２】
また、本発明は、細胞、特にＧｂ３（又はＣＤ７７）レセプターを有する癌細胞に薬剤又はプロドラッグを供給するための方法を提供する。
糖脂質Ｇｂ３レセプターは、ある種の神経外肺葉由来腫瘍（神経膠腫）及びある種のバーキットリンパ腫で優先的に発現されることが報告されている。癌の化学療法の使用の制限の一つは、正常細胞におけるそれらの毒性による薬剤の二次的な副作用であるので、薬剤はＳＴｘＢ-Ｃｙｓを用いることによって腫瘍細胞で優先的に方向づけされる。薬剤は、ＳＴｘＢ-Ｃｙｓのスルフヒドリル基反応性となるように活性化される。この目的のために、マレイミド基を薬剤、例えばソラレン化合物に導入してもよい。
【００２３】
また、本発明は：
−ペプチド又はタンパク質又は糖タンパク質又はリポペプチドの免疫原性を増強するための製薬組成物であって、該ペプチド又はタンパク質又は糖タンパク質又はリポペプチドにそのＣｙｓ部分によって共有的に結合された一般担体を含むもの；
−Ｇｂ３レセプター（ＣＤ７７）を有する腫瘍細胞を処置するための製薬組成物であって、前記腫瘍細胞にとって毒性の薬剤又はプロドラッグにそのＣｙｓ部分によって共有結合した本発明に係る一般担体を含むもの
に関する。
本発明の一般担体の範囲、他の出願のその広い用途を限定するものではなく、以下の実施例と図は本発明の有利性を示す。
【実施例１】
【００２４】
一般担体の調製
ａ）ＳＴｘＢ - Ｃｙｓを発現するプラスミドの構築：
好ましい実施態様で、プラスミドｐＳＵ１０８（７）を修飾してＢ-断片ｃＤＮＡの３'末端にシステインコドンｔｇｔを導入した。ＰＣＲプライマーＡ：配列番号３（５'−AGCGAAGTTATTTTTCGTTGTTGACTCAGAATAGCTC−３'）及びプライマーＡ'：配列番号４（５'−GAGCTATTCTGAGTCAACACGAAAAATAACTTC−３'）を、プラスミド特定プライマーShigaAtpE：配列番号５（５'−CACTACTACGTTTTAAC−３'）及びShiga-fd：配列番号６（５'−CGGCGCAACTATCGG−３'）とともに使用して、プライマーShiga AtpE及びShiga-fdでの第２のＰＣＲで、ｐＳＵ１０８のＳｐｈｌ及びＳａｌ１制限部位にクローン化された断片を生成するＤＮＡ断片を作成した。ＰＣＲにより誘導される配列はジデオキシ配列決定によって確認された。
【００２５】
ｂ）タンパク質精製：
ｂ）１．ペリプラズム抽出物の調製を次のようにして実施した：
− ３０℃で増殖させた１２５μｌの一晩培養物を含有する１２５ｍｌのＬＢ／Ａｍｐを接種し、
− ３０℃で一晩増殖させ、
− ３７５ｍｌのＬＢ／Ａｍｐ、５０℃に移して；４２℃で４時間インキュベートし、
− 遠心分離して、細胞をペレットにし、
− １０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣ１、ｐＨ８．０で３回、細胞を洗浄し、
− ２００ｍｌの２５％スクロース、１ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣ１、Ｐｈ８．０に細胞を再懸濁して；室温で１０分間インキュベートし、
− 遠心分離して、細胞をペレットにし、
− プロテアーゼ阻害剤カクテルを含有する２００ｍｌの氷冷水に細胞を再懸濁して；氷上で１０分間インキュベートし、
− 遠心分離し；上清を回収し；２０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣ１、Ｐｈ８．０を加える。
ｂ）２．カラムの準備：
ペリプラズム抽出物をＱＦＦ陰イオン交換カラム（ファルマシア社）に負荷し、２３０ｍＭのＮａｃｌで溶出させた。画分を含むＳＴｘＢ-Ｃｙｓをプールし、４倍に希釈してＭｏｎｏ Ｑ陰イオン交換カラム（ファルマシア社）に負荷し、続いて２３０ｍＭのＮａｃｌに溶出させた。PallFiltron社からのマイクロ濃縮装置で濃縮した後、プールしておいた分画をセファデックス７５ゲル濾過カラムを通した。純度は約９５％であった（図１）。
ｂ）３．生成物の特徴付け
セファデックス７５ゲル濾過カラムで精製したＳＴｘＢ-ＣｙｓのＢ断片は、基本的に単量体である（図１）。これは、Ｂ断片の天然Ｃ末端から２アミノ酸を超える位置でシステインを加えられた構築物とは著しい相違がある。これらの場合、五量体で隣接するＢ断片はジスルフィド結合で結合される。
【実施例２】
【００２６】
一般担体に活性化ペプチドをカップリングするための条件
ａ）担体：
３つの異なる担体を比較した。
１）ＳＴｘＢ-Ｃｙｓ：ＣｙｓがそのＣ末端に直接加えられたＢ断片。このタンパク質は精製カラムから単量体として溶出する。
２）ＳＴｘＢ-Ｚ２-Ｃｙｓ：野生型Ｂ断片のＣ末端とＣｙｓの間に短いスペーサー（クローニングカセットから生じる２アミノ酸）を有する担体。タンパク質の大部分は、精製カラムから二量体として溶出した。これらは、還元条件下で分離することができ、五量体のＢサブユニット複合体の単量体の間にジスルフィド結合の形成を示す。
３）ＳＴｘＢ-Ｇｌｙｃ-Ｃｙｓ-ＫＤＥＬ：Ｃｙｓが９アミノ酸長のグリコシル化カセットとＣ末端ＫＤＥＬペプチドの間にある担体。タンパク質の大部分は、精製カラムから二量体として溶出した。これらは、還元条件下で分離することができ、五量体のＢサブユニット複合体の単量体の間にジスルフィド結合の形成を示す。
【００２７】
ｂ）試験ペプチド：
１）Ｐｅｐ１：ニワトリの卵白アルブミンから誘導されるＳＬ８抗原ペプチドを有する１６アミノ酸の合成ペプチド。
２）Ｐｅｐ２：Ｃ末端にＨｉｓ-ｇａｇをさらに有する上記のような２４アミノ酸の合成ペプチド。
３）ＳＬ８：抗原提示細胞の原形質膜においてＭＨＣクラスＩ複合体のペプチドと直接変換することのできる卵白アルブミン由来の抗原ペプチド。
【００２８】
ｃ）カップリング条件：
還元条件下（タイプ１）：融合タンパク質をＤＴＴで一晩処理し、次いで、活性化ペプチド（そのＮ末端にブロモ酢酸基を有する）を過剰に加えた。融合タンパク質を用いた第一カップリング実験に用いられる条件は、ほとんど単量体を二量体化する（タンパク質ＳＴｘＢ-Ｚ２-Ｃｙｓ及びＳＴｘＢ-Ｇｌｙｃ-Ｃｙｓ-ＫＤＥＬ）。
非還元条件（タイプ２）：融合タンパク質を活性化ペプチドと直接反応させた。
【００２９】
ｄ）生化学的及び形態学的コントロール：
Ｐｅｐ２はＨｉｓタグを有する。これは、抗Ｈｉｓ抗体を用いてウェスタンブロットによるＢサブユニットのＰｅｐ２の存在を示すこと、及びＨｅＬａ細胞のＰｅｐ２のＢサブユニット依存性輸送を可能にした。
図２ａは、Ｂ３Ｚ ＣＴＬハイブリドーマの用量依存性刺激（βガラクトシダーゼ活性の測定）が非固定細胞で観察されたが、固定では抗原提示が消失したことを示す。
抗原提示は非固定細胞でのみ作用し、観察された提示は汚染のないＰｅｐ２から生じないことに注目される。
図２ｂは、固定Ｄ１細胞が遊離ＳＬ８ペプチドをまだ提示することができることを示す図２ａのコントロール実験を示す。
【００３０】
図３では、高用量（２００−１０００ｎＭ）においていくらかの提示が固定細胞で観察されたので、このタイプのプロトコールにおいては、幾つかの遊離Ｐｅｐ１が融合タンパク質と同時精製されるようである。ＳＬ８による提示は右に示される。
図４では、カップリングされたタンパク質（レーン１及び２）又はＳＬ８ペプチド（レーン５及び６）を、Ｇｂ３へのＢサブユニットの結合を阻害する１３Ｃ４抗体から誘導される抗ＢサブユニットＦａｂ断片と共にインキュベートし（レーン２及び５）、あるいはしなかった（レーン１及び４）。Ｆａｂ断片は、クラスＩ経路に抗原ペプチドを導入するＢサブユニットの能力を中和したが、ＳＬ８での提示はこれらの条件下で影響されなかったことに注目される。この実験におけるバックグラウンドシグナルは０．３であった。
【００３１】
図５ａでは、Ｄ１細胞をＰＰＭＰで３日間前処理した（（２）の図３ｂ参照）。この処理は、細胞表面でのＧｂ３発現の重大な減少をもたらすが、完全にそれを排除するものではない。この条件下で、ＳＴｘＢ-Ｇｌｙｃ-Ｃｙｓ-ＫＤＥＬとＰｅｐ１とのカップリング反応からの抗原提示は有意に減少し、Ｇｂ３が提示現象に重要であることを示した。
これら全ての実験から、ＳＴｘＢ-Ｃｙｓへの非還元下でのカップリングは、驚くべき効果があると考えられる（感受性に関して；図１に示されるように、４ｎＭのＳＴｘＢ-Ｃｙｓ-Ｐｅｐ２のみ応答がある必要がある）。そのため、一般担体ＳＴｘＢ-Ｃｙｓはその提示の簡便性及びカップリングの再現能力のために望まれる。
【００３２】
従って、ＳＴｘＢ-Ｃｙｓへの活性化ペプチドのカップリングの適切な条件は、次の通りであった：
−ＳＴｘＢ-Ｃｙｓを２０ｍＭホウ酸塩バッファー、ｐＨ９．０、１５０ｍＭのＮａＣｌに対して透析する、
−１ｍｇ／ｍｌに濃縮する、
−Ｎ末端活性化ペプチド（無水ブロモ酢酸で活性化した）を１２ｍＭでＤＭＳＯに溶解する、
−ペプチドを０．２ｍＭまでタンパク質溶液に希釈する、
−室温で１２時間インキュベートする、
−ＰＢＳに対して透析する。
【実施例３】
【００３３】
ＳＴｘＢのその抗原提示能力に関する特徴付け
次の一連の実験は、抗原提示システムで機能するＳＴｘＢの能力を十分に説明するのに役立つであろう。
ａ）クラスＩ - 及びクラスＩＩ - 拘束抗原提示：
ニワトリ卵白アルブミン（Br-CH2-CO-NH-LEQLESIINFEKLTEWSLKISQAVHAAHAEINEAGR、配列２５７−２６４及び３２３−３３９由来のクラスＩ-及びクラスＩＩ-拘束抗原ペプチドを有するペプチドをＳＴｘＢ-Ｃｙｓにカップリングし、これらのペプチドのクラスＩ-及びクラスＩＩ-拘束提示を対応するＴ細胞ハイブリドーマを用いて分析した。
【００３４】
ｂ）完全な大きさのタンパク質のカップリング。
我々による先行の証拠は、ニワトリ卵白アルブミンをＳＴｘＢ-Ｃｙｓにカップリングすることができることを示唆する。これらの実験は、ＳＰＤＰヘテロ二機能性架橋剤で実施された（Carlsson等, 1978）。
抗原提示実験の第１系列は、卵白アルブミンタンパク質をマウス樹状細胞の内因性ＭＨＣクラスＩ拘束抗原提示経路に導入することができることを示した。ＳＰＤＰは血清チオラーゼにより切断可能であるという不都合がある。この架橋剤は、切断不可能であるＭＢＳによってうまく代用された。他の抗原タンパク質（Ｍａｒｔ１及びＨＰＶ１６-Ｅ７から誘導されるポリペプチド及びＭｕｃ１）を試験して該手段が一般的な使用であることを示す。
【００３５】
ｃ）複合タンパク質の混合物のカップリング。
頸部癌誘導細胞株Ｃａｓｋｉの溶菌液を用いた。この頸部癌細胞株はその膜においてＨＬＡ-Ａ２対立遺伝子を発現し、またヒトパピローマウィルス誘導ペプチドを発現する。Ｅ７は、最初のケラチノサイトの形質転換に必要なＨＰＶ由来の初期転写ＯＲＦである。抗Ｅ７ ＨＬＡ Ａ２拘束性ＣＴＬをインビトロで誘発する。ＨＬＡ-Ａ２ Ｅ７に特異的な提示アッセイによってこのタンパク質混合物のカップリングの効果を試験した。コントロールのように、Ｅ７を発現しないＨＬＡ-Ａ２-陽性細胞株（ｃｒｏｆｔ細胞又はＤａｕｄｉ）からの溶菌液をＳＴｘＢ-ｌｙｓにカップリングした。
【実施例４】
【００３６】
ＭＨＣクラスＩ拘束抗原提示のための用途
図４の実験は、ＳＴｘＢ-Ｃｙｓ依存性抗原提示はＧｂ３との相互作用が消失した時に阻害されることを示す。ここで、ＳＬ８にカップリングされた、ＳＴｘＢに対するモノクローナルＡｂのＦａｂ断片の０．１μＭのＳＴｘＢ-Ｃｙｓへの予備結合は、抗原提示を阻害することが分かり、Ｇｂ３へのＳＴｘＢ-Ｃｙｓ結合は抗原提示に必要であることを示唆する。同様の結果が、Ｇｂ３-発現を薬剤で阻害した場合にも得られた（図４）。
【実施例５】
【００３７】
ＳＴｘＢ - Ｃｙｓに卵白アルブミンをカップリングするための反応鎖
図６に反応式を示す。
第１の反応では、ＭＢＳのＮ-ヒドロキシスクシンイミドエステル部分が、抗原標的タンパク質、例えばモデルタンパク質の卵白アルブミン（Ｏｖａ）の一級アミンと反応する。反応生成物を精製し、次いで第２反応ではマレイミドベンゾイル部分を介してカップリングを引き起こすＳＴｘＢ-Ｃｙｓとインキュベートする。
【００３８】
図７は、ＳＴｘＢ-Ｃｙｓ及びＯｖａに関与する典型的なカップリング反応のＳＤＳ-ＰＡＧＥ及びウェスタン分析を示す。カップリングについて、２０ｍｇ／ｍｌのＯｖａを含有する１００ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４を４．５ｍＭのＭＢＳとともに室温で３０分間インキュベートした。反応物を、ＰＢＳ／ＥＤＴＡ１０ｍＭで平衡にしたゲル濾過カラムに通す。溶出したＯｖａを２０ｍｇ／ｍｌに濃縮する。１容積の３．５ｍｇ／ｍｌでＳＴｘＢ-Ｃｙｓを含有するＰＢＳ／ＥＤＴＡを１容積の活性化Ｏｖａと混合し、室温で一晩インキュベートする。
【００３９】
図７は、カップリング反応の中で、カップリングしていないＳＴｘＢ（上部）とカップリングしていないＯｖａ（下部；カップリングしていないタンパク質はクロスで示した）に加えて、低い電気泳動度を有するバンド（矢印で示される；カップリング生成物）が検出された。反応生成物を１３Ｃ４抗ＳＴｘＢモノクローナル抗体で作った免疫親和性カラム（レーンＩＰカラム）に通すことによって精製した。遊離Ｏｖａが消失することに注意したい。次いで、溶出ＳＴｘＢ-Ｃｙｓ（カップリングした及びカップリングしていない）をゲル濾過カラムに通して、カップリングしたＳＴｘＢ-Ｃｙｓから遊離ＳＴｘＢ（分画１５−１９）を分離する（分画９−１４；分画１１−１２は大量のカップリングしたタンパク質を含むことに注目される；下のバンドに比較して小さい上のカップリングバンドは、おそらく二量体Ｏｖａから生じている）。
【実施例６】
【００４０】
ＳＴｘＢ - Ｃｙｓ - Ｏｖａカップリング生成物の細胞内輸送の特徴付け
０．５μＭのＳＴｘＢ-Ｃｙｓ-Ｏｖａを氷上でＨｅＬａ細胞とともにインキュベートした。細胞を洗浄し、４５分間で３７度まで変化させ、固定し、指示抗体を染色した。図８に示されるように、ＳＴｘＢ-Ｃｙｓ及びＯｖａをＭＢＳによって結合した場合には、Ｏｖａ免疫反応性はＲａｂ６で染色されるゴルジ体のＳＴｘＢ免疫反応性と一緒に検出することができる。両タンパク質をＨｅＬａ細胞と別々の存在としてインキュベートすると、ＳＴｘＢ-Ｃｙｓのみがゴルジに輸送され、Ｏｖａは細胞で検出することができなかった。これらのデータは、カップリングしたＳＴｘＢ-ＣｙｓもカップリングしていないＳＴｘＢ-Ｃｙｓと同じようにして輸送され、ＯｖａはＳＴｘＢ-Ｃｙｓを介して方向付けされることを明確に示す。
【実施例７】
【００４１】
ＳＴｘＢ - Ｃｙｓは完全な大きさの外因性抗原タンパク質から誘導されたペプチドのＭＨＣクラスＩ及びＩＩ拘束性提示を可能にする
第１の実験では（図９、左）、ＳＴｘＢ-Ｃｙｓ-Ｏｖａを使用してマウス樹状細胞株Ｄ１を感作した場合、非ベクトル化ＯｖａをパルスしたＤ１細胞に比較してＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｏｖａ誘導ペプチドＯｖａ３２３−３３９の提示の明確な増加が観察されたことを示している。実際、Ｏｖａ３２３−３３９ペプチドの有意な提示は、０．０１ｎＭのＳＴｘＢ-Ｃｙｓ-Ｏｖａと同様にほとんど検出されなかったが、１０ｎＭの完全な大きさのＯｖａはそのペプチドの有効な提示に必要とされた。ＩＡｂ拘束Ｏｖａ３２３−３３９ペプチドの提示を、このペプチドの認識後にＩＬ-２を生成するＢ０９７．１０ハイブリドーマを用いて暴露した。コントロールとして、不適切なＭＨＣクラスＩＩ拘束ハイブリドーマをＢ０９７．１０の代わりに使用した場合にＩＬ-２分泌は観察されなかった（データは示さず）。
第２の実験では、Ｏｖａのみ又はＳＴｘＢ-Ｃｙｓ-Ｏｖａと共にの何れかを同じＤ１樹状Ｈ２ｂ拘束細胞株にパルスした。Ｋｂ分子の場合にＳＬ８ペプチドを認識する特異的Ｂ３Ｚハイブリドーマによって暴露されるので、Ｏｖａ誘導免疫優性ＳＬ８ペプチド（Ｏｖａ２５７−２６４）の提示は、Ｄ１細胞を遊離Ｏｖａで１００ｎＭまで感作した場合には観察されなかったが、１−１０ｎＭのＳＴｘＢ-Ｃｙｓ-ＯｖａはＳＬ８ペプチドの提示を可能にした。コントロールとして、不適切なハイブリドーマの活性化が同様の実験条件で観察されないことを示した。
結局、これらの結果は、ＳＴｘＢ-ＣｙｓがＭＨＣクラスＩとクラスＩＩ経路の両方に高い効果を有する完全な大きさのタンパク質を標的とすることを明確に示す。
【００４２】
参考文献
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【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】図１は、最終セファデックス７５カラムで生じる精製ＳＴｘＢ-Ｃｙｓのタンパク質特性を示す。分画２０−２５は主に単量体のＳＴｘＢ-Ｃｙｓを含む（単量体及び二量体ＳＴｘＢ-Ｃｙｓの位置は右側に示される）。分子量マーカーは左に示される。
【図２ａ】図２ａは、ＳＴｘＢ-Ｃｙｓへの［実施例２に定義されるような］タイプ２のＰｅｐ２の結合、それに続く（２）に説明されるようなＤ１樹状細胞でのインビトロ抗原提示アッセイを示す。ＳＬ８ペプチド、卵白アルブミンの免疫優性エピトープにカップリングされた２つの異なる調製のＳＴｘＢ-Ｃｙｓが使用された（４Ａ及び９Ａと称される）。固定では、抗原提示が消失し、細胞外プロセシングを生じないことを示す。
【図２ｂ】図２ａのコントロール実験を示し、固定したＤ１がまだ遊離ＳＬ８ペプチドを提示することができることを示す。
【図３】図３は［実施例２に定義されるような］ＳＴｘＢ-ＳＨ及びＰｅｐ１におけるタイプ１のカップリング反応を用いた固定及び非固定Ｄ１細胞でのもう１つの実験を示す。
【図４】図４は、Ｂ-Ｇｌｙｃ-Ｃｙｓ-ＫＤＥＬへのＰｅｐ２のカップリングから誘導される抗原ペプチドのＢサブユニットに依存する提示を示す。また、Ｇｂ３に結合するＳＴｘＢを中和する抗体に由来するＦａｂ断片の使用は、抗原提示を消失させる。
【図５】図５は、Ｇｂ３合成阻害剤ＰＰＭＰがＢサブユニット依存性抗原提示を阻害し（５ａ）、ＳＬ８提示がＰＰＭＰ処理細胞において減少しないことを示す。
【図６】図６は、ヘテロ二機能性架橋剤ＭＢＳを用いてＳＴｘＢ-Ｃｙｓへの完全な大きさのＯｖａカップリングの反応式を示す。上段：Ｏｖａの一級アミンにＭＢＳを結合する第一反応。中段：活性化ＯｖａとＳＴｘＢ-Ｃｙｓとの第二反応。下段：ＭＢＳの構造。
【図７】ＳＴｘＢ-ＣｙｓへのＯｖａカップリングのウェスタン分析を示す。図の上部は抗ＳＴｘＢ抗体を用いた免疫ブロット、下部は抗Ｏｖａ抗体を用いた免疫ブロットを示す。精製手順の様々な段階の中間体を示す。レーン１：カップリングしていないタンパク質（クロスで示される）。レーン２：カップリング反応物（カップリング生成物は矢印で示される）。レーン３：抗ＳＴｘＢ抗体が点在する免疫親和性カラムの溶出物。レーン４−７：ゲル濾過カラムからの分画。レーン４：分画９−１０。レーン５：分画１１−１２。レーン６：分画１３−１４。レーン７：分画１５−１９（遊離ＳＴｘＢ-Ｃｙｓ）。分画１１−１２は大量の単量体カップリング生成物を含む。また、低い電気泳動度を有する物質もいくらか検出することができたが、元の準備物に存在する二量体Ｏｖａから生ずるようである。
【図８】図８はＨｅＬａ細胞におけるＳＴｘＢ-Ｃｙｓ-Ｏｖａ輸送の免疫蛍光分析を示す。カップリング生成物ＳＴｘＢ-Ｃｙｓ-Ｏｖａ（図の上部）又はＳＴｘＢ-ＣｙｓとＯｖａの混合物（図の下部）を氷上でＨｅＬａ細胞とともにインキュベートした。洗浄した後、細胞を３７℃で４５分間撹拌し、固定し、示される抗体で染色した。ＯｖａがＳＴｘＢ-Ｃｙｓ（上）と結合したときに、タンパク質はゴルジ体に方向付けされ、ゴルジマーカーＲａｂ６を同時染色した。ＯｖａがＳｔｘＢ-Ｃｙｓと混合しただけだと（下）、タンパク質を細胞で検出することはできない。
【図９】図９は、Ｄ１細胞とＳＴｘＢ-Ｃｙｓ-Ｏｖａとをインキュベーションすることによって誘導したＭＨＣクラスＩ及びＩＩ拘束抗原提示を示す。詳細は本文を参照のこと。
【０００１】
本発明は、シガトキシン発現細胞のＢサブユニットのＧｂ３レセプターに対する標的分子の一般ポリペプチド担体と細胞内輸送のためのその使用及び前記分子のプロセシングに関する。
【０００２】
シガトキシンは、志賀赤痢菌により分泌されるＡＢ５サブユニットファミリーの細菌毒素である。Ａサブユニットは、毒素部分であり、前記細胞の細胞質中に翻訳された後に高等真核標的細胞においてタンパク質合成を抑制する。Ｂサブユニットはホモ五量体タンパク質（５Ｂ断片）であり、標的細胞の原形質膜に見られる糖脂質Ｇｂ３と相互作用することによる標的細胞への毒素結合及び内部移行の原因である。Ｂ断片は非毒素であるが、多くのＧｂ３発現細胞で原形質膜からサイトゾルへエンドソームを介して逆行する様式で輸送されるホロトキシンの細胞内輸送特性を保持する。
また、糖脂質Ｇｂ３レセプターは、ある種の外胚葉誘導性腫瘍（血漿）及びある種のバーキットリンパ腫で優先的に発現されることが報告されている。ＣＤ７７としても知られる。本文では、用語Ｇｂ３をＣＤ７７に相当するものとみなす。
【０００３】
シガトキシンのＢサブユニットに融合されるＣＤ８ヒト腫瘍抗原がＣＴＬに特異的なＨＬＡクラスＩ拘束法で効果的に提示されうることが、既に著者によって示されている（１）。この結果は、インフルエンザウィルスから同定されたペプチドエピトープを有するシガホロトキシンがＭＨＣクラスＩ細胞内経路内に抗原を供給することができることを示すもう一つの研究によって別に確認された（３）。
また、著者は志賀赤痢菌から誘導された細菌性シガトキシンのＧｂ３レセプター結合非毒性Ｂ断片と抗原、又はモデル腫瘍抗原由来のエピトープとの間の融合タンパク質は、特異的な細胞障害性Ｔリンパ球応答（ＣＴＬ）を誘発することができるが、前記融合タンパク質の各部分はＣＴＬ誘発を独立して導かないことを示した（１、２及びＷＯ９９／０３８８１）。
この技術の難点は、各用途において、つまり各抗原又はその断片にとって、融合タンパク質の特定の構造である必要性があり、宿主細胞で発現されるこの融合タンパク質をコード化する配列を有する組換えベクターの特定の構造を必要とすることである。
【０００４】
本発明の目的は、上述した欠点を克服し、Ｇｂ３レセプター発現細胞に分子を標的化させてＧｂ３レセプターを発現する前記細胞中にこの分子を内部移行、プロセシング及び／又は発現させることを可能にするための、一般的なフックあるいは一般担体を提供することである。
本発明において、シガトキシンＢサブユニット（ＳＴｘＢ）誘導体、又はＳｔｘＢ-Ｃｙｓと称される突然変異体が作成される。このタンパク質において、システインは成熟ＳＴｘＢのＣ末端に付加される。細菌から精製した場合、タンパク質は野生型ＳＴｘＢのように内部ジスルフィド結合を有するが、Ｃ末端Ｃｙｓのスルフヒドリル基は遊離型である。それらの求核性のために、遊離スルフヒドリル基は特異的カップリングアプローチの優れたアクセプターである（４）。
【０００５】
従って、本発明は、Ｇｂ３レセプター発現細胞に対して対象の分子を直接的に又は間接的に標的化するための、次の式：ＳＴｘＢ-Ｚ(ｎ)-Ｃｙｓ、ここで
−ＳＴｘＢはシガトキシンＢサブユニット又はその機能的等価物であり、
−Ｚはスルフヒドリル基のないアミノ酸であり、ｎは０、１又はアミノ酸配列であり、
−Ｃｙｓはアミノ酸システインである
を有する一般ポリペプチド担体に関する。
一般担体のＳＴｘＢ部分は、（８）に記載される配列又はその機能的等価物を有する。機能的等価物とは、Ｇｂ３レセプターに特異的に結合し、及び／又はその提示を抗原の内部移行及びＭＨＣクラスＩ拘束経路又はＭＨＣクラスＩとクラスＩＩの両方においてその抗原提示細胞で誘引する能力を有するポリペプチド配列を意味する。
腫瘍抗原の発現の不均一性、腫瘍細胞の表面におけるＭＨＣクラスＩ発現の対立遺伝子特異的欠損、及びＭＨＣクラスＩ及びクラスＩＩの両方による抗原の同時提示をその抗原提示細胞で有することの必要性に鑑みて、樹状細胞に対して標的化させるためにＢサブユニットに完全な大きさの抗原タンパク質を結合させることが望ましい。
【０００６】
好ましい実施態様では、ｎが０であり、一般担体は次の配列（配列番号１）：
COOH-MKKTLLIAASLSFFSASALATPDCVTGKVE
YTKYNDDDTFTVKVGDKELF
TNRWNLQSLLLSAQITGMTVTIKTNACHNGGGFSEVIFRC-NH2
を有する。
実際、Ｚリンカーが長すぎると、つまりｎが２以上であると、内部ジスルフィド架橋が生じ、ＳＴｘＢのＧｂ３レセプターへの結合を抑制し、特に対象の分子への結合を抑制する。
本発明によれば、対象の分子は、タンパク質、ペプチド、オリゴペプチド、糖タンパク質、糖ペプチド、核酸、ポリヌクレオチド、又はその組合せからなる群から選択される。
【０００７】
本発明の他の実施態様によれば、対象の分子は、抗原提示細胞に標的化される抗原である。このような細胞はＴリンパ球、樹状細胞、マクロファージ、ランゲルハンス細胞などからなる群から選択される。
本発明の他の実施態様では、対象の分子は、薬剤、例えばハプテン、ソラレン、又はＳＴｘＢ-Ｃｙｓのシステイン部分の−ＳＨ基と連結可能な化学基を有するあらゆる化合物である。
薬剤は、直接又はブロモ酢酸等の化合物での活性化の後に、あるいは反応の結果が次の式：ＳＴｘＢ-Ｃｙｓ-Ｍ（Ｍは対象とする前記分子全てである）を有する化学実体である技術者に既知の他のあらゆる方法で連結されうる。
【０００８】
ＳＴｘＢ-Ｚ(ｎ)-Ｃｙｓへのペプチド又はポリペプチド部分の共有結合のためのカップリングアプローチは、技術者によって記載又は実施されるあらゆる方法又は処理法でありうる。
具体化することのできる第１の方法は、Carlsson等（５）によって記載されるＳＰＤＰヘテロ二機能性架橋結合の利用である。しかしながら、ＳＤＰＤは反応生成物の減少の原因である血清チオラーゼにより切断可能である。
ＳＴｘＢ-Ｚ(ｎ)-Ｃｙｓペプチドと対象とする他のペプチドとの共有結合のための第２の方法は、P. Schelte等（４）によって記載されるように後者にブロモアセチル又はマレイミド基を作ることである。簡略すると、対象とするペプチドを無水ブロモ酢酸で、又はマレイミド基によって化学的に活性化する。適した反応条件（ｐＨ、温度、インキュベーション時間）下で、これらの基はそれぞれ−Ｓ-Ｓ、−Ｓ-ＣＨ２-に、−Ｓ-ＣＯ-に又は−Ｓ-ＮＨ-共有結合になるシス脱離によって脱離される。
【０００９】
実施例のように、一般担体のＣ末端システインの−ＳＨ部分にカップリングされるポリペプチド又はペプチドは、そのＮ末端を無水ブロモ酢酸により、次の反応式：
ブロモアセチル基は、ペプチドチオール基に対して高い官能基選択性を有し、活性化ペプチドを次の：
生じたチオエーテル結合は加水分解に対して安定である。
【００１０】
本発明の一般担体に分子をカップリングするための他の方法は、図６に示され実施例５で説明されるようなＭＢＳ（ｍ-マレイミドベンゾイル-Ｎ-ヒドロキシスクシンイミドエステル）を使用することである。このカップリングは、ＭＨＣクラスＩ及び／又はＭＨＣクラスＩＩ経路によって抗原タンパク質又は糖タンパク質のような大分子の輸送及び加工を可能にする。
従って、本発明の他の態様は、−Ｓ-Ｓ-、−Ｓ-ＣＯ-、又は−Ｓ-ＣＨ２-又は−Ｓ-ＮＨ-結合による対象の分子とＳＴｘＢ-Ｚ(ｎ)-Ｃｙｓとの共有結合から生じる生成物である。
【００１１】
一実施態様では、抗原提示細胞に標的化される対象の分子は、抗原又はそのエピトープ、糖ペプチド又は糖タンパク質、リポペプチド又はリポタンパク質のようなポリペプチド構造によって構築され、又はそれを含む。
好ましい実施態様では、(ｎ)が０、１又は２、好ましくは０である、ＳＴｘＢ-Ｚ(ｎ)-Ｃｙｓと抗原又はその断片とのカップリングから生じる生成物は、ＭＨＣクラスＩ及びＭＨＣクラスＩＩ拘束経路で提示可能である。
他の実施態様では、対象の分子は、例えばＤＮＡ又はＲＮＡ分子のようなポリヌクレオチド構造と結合する能力のあるポリペプチドである。このような分子は、標的細胞で発現される対象配列を含むベクター又はプラスミドでありうる。本発明において、標的細胞は、その膜上にＧｂ３レセプターを有する真核細胞である。
【００１２】
従って、本発明の一般担体はまた、遺伝子治療用に又は異種タンパク質を発現する組換え細胞を得るために標的細胞にヌクレオチド配列を導入するための担体である。
他の実施態様では、本発明に係る一般担体は、共有結合によって直接的に又はリンカーによって間接的に細胞障害剤に作用可能に連結させ、Ｇｂ３レセプターを発現する腫瘍細胞に対して標的化させることができる。
「間接的な結合」という用語は、一般担体がＣ末端システインのスルフヒドリル部分を介してリンカーに共有的に連結することを意味し、該リンカーは、薬剤又はプロドラッグに作用可能に連結されてＧｂ３レセプター担持細胞に内部移行する。
この連結は、リンカーと薬剤（又はプロドラッグ）の間の親和性が１０−９モル／ｌよりも高いと、共有結合又は非共有結合であり得る。
【００１３】
本発明の他の実施態様は：
ａ）その３'末端にシステインをコード化するコドンＴＧＴ、又はコドンＴＧＣを有するシガトキシンＢサブユニット又はその機能性等価物をコード化するヌクレオチド配列ＳＴｘＢを含むポリヌクレオチド；
ｂ）その３'末端にコドンＴＧＴ又はＴＧＣを有するシガトキシンＢサブユニット又はその機能性等価物をコード化するヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；及び
ｃ）ａ）又はｂ）の配列に相補的なヌクレオチド配列
の群から選択される単離されたポリヌクレオチドである。
【００１４】
好ましい実施態様では、ポリヌクレオチドは次の配列番号２：
５'−atgaaaaaaacattattaatagctgcatcgctttcatttttttcagcaag
tgcgctggcgacgcctgattgtgtaactggaaaggtggagtatacaaaat
ataatgatgacgatacctttacagttaaagtgggtgataaagaattattt
accaacagatggaatcttcagtctcttcttctcagtgcgcaaattacggg
gatgactgtaaccattaaaactaatgcctgtcataatggagggggattca
gcgaagttatttttcgttgt−３'
を有する。
【００１５】
また、本発明は、上記のようなポリヌクレオチド配列を有し、適した宿主細胞において一般担体ＳＴｘＢ-Ｚ(ｎ)-Ｃｙｓ（ここで、(ｎ)は０、１又は２、ＳＴｘＢ及びＺは上記と同じ意義を有する）を発現する能力のある組換えベクター又はプラスミドに関する。
例えば、好適なベクターは（７）に記載されるようなプラスミドｐＳｕ１０８である。
本発明の他の目的は：
ａ）ＳＴｘＢ配列を有するプラスミドを準備する；
ｂ）プライマーＡＡ'及びＢＢ'の２つの組を用いて２回のＰＣＲ増幅工程を実施する、
−Ａ及びＢは互いに相補的で、Ｃｙｓコドンを有する
−Ａ'及びＢ'はＳＴｘＢ配列の外側にある；
ｃ）増幅断片を単離する；
ｄ）増幅断片をハイブリダイズする；
ｅ）ハイブリダイズした断片にＰＣＲ増幅を実施する；
ｆ）プラスミドに増幅断片を挿入する
ことを含むプラスミド発現ＳＴｘＢ-Ｚ(ｎ)-Ｃｙｓを得るための方法を提供することにある。
【００１６】
好ましい実施態様では、ＳＴｘＢ断片を含むプラスミドｐＳＵ１０８（７）を修飾して、Ｂ断片ｃＤＮＡの３'末端にシステインコドンＴＧＴを導入する。工程ｂ）のプライマーは、それぞれＡＡ'及びＢＢ'について：
−プライマーＡ：５'−AGCGAAGTTATTTTTCGTTGTTGACTCAGAATAGCTC−３'（配列番号３）、及び
−プライマーＢ：５'−GAGCTATTCTGAGTCAACACGAAAAATAACTTC−３'（配列番号４）、
−プライマーＡ'：プライマーShigaAtpE：５'−CACTACTACGTTTTAAC−３'（配列番号５）、及び
−プライマーＢ'：プライマーShiga-fd：５'−CGGCGCAACTATCGG−３'（配列番号６）
である。
【００１７】
工程ｅ）のＰＣＲは、ｐＳＵ１０８のＳｐｈｌ及びＳａｌｌ制限部位にクローン化された断片を生産する。ＰＣＲによって誘導される配列はジデオキシ配列決定によって確認される。
技術者は、適した宿主細胞でＳＴｘＢ-Ｚ(ｎ)-Ｃｙｓを発現するポリヌクレオチド配列を有するベクターを作成するためのプラスミド、プライマーの選択を容易に行うことができ、この一連の工程は増幅断片へのＣｙｓコドンの解釈を可能にする。
また、本発明は、上記のような一般担体をコード化するポリペプチド配列を含む組換えベクターで形質転換することによって得られる組換え細胞株を提供する。好ましい実施態様では、該組換え細胞株は原核細胞、好ましくは大腸菌である。
【００１８】
更に好ましい実施態様では、プラスミドは、ＳｐｈｌとＳａｌｌ制限部位の間に組み込まれた配列番号２を有するｐＳＵ１０８であり、相当する細胞株は２０００年１２月１９日に登録番号ｌ-２６０４でＣＮＣＭに寄託されている。
また、本発明は：
ａ）上記のような組換え細胞株を培養し、
ｂ）該細胞のペリプラズム抽出物を採取し、
ｃ）前記ポリペプチドを生成する
ことを含む、上記のような一般担体を作成する方法を提供する。
【００１９】
好ましくは、細胞株は大腸菌であり、ｃ）において精製は陰イオン交換カラムクロマトグラフィーの後にゲル濾過カラムクロマトグラフィーをすることによってなされる。
このような方法は、その際に対象の分子と共有的にカップリングすることによって作用可能に連結させることができる限りにおいて、一般担体の大規模生産に特に有利であり、広範な用途で使用される。
また、本発明は、一般担体のＣｙｓ部分と対象とする配列との共有結合によって得られる生成物を用いて、ＭＨＣクラスＩ経路に対象とする前記配列を供給する方法を提供し；本方法は、生成物がＭＨＣクラスＩ経路に関与する細胞に特異的である限りにおいて、得られた抗原又はそのエピトープに対するＣＴＬ応答を誘発するのに有利である。
【００２０】
実際に、発明者は、卵白アルブミンタンパク質から誘導され、ＳＴｘＢ-Ｃｙｓに化学的に結合される免疫優性ペプチドを、抗原提示細胞によって特異的なハイブリドーマ細胞に提示できることを示しており、ＳＴｘＢはＭＨＣクラスＩ経路で外因性免疫原性ペプチドを供給できることを示す。物質を汚染している遊離ペプチドの存在による偏向を排除するために固定した樹状細胞を用いる実験は、融合タンパク質の内部移行がこの工程に必要とされることを明確に示した。また、本発明はシガトキシンレセプター、Ｇｂ３も内因性ＭＨＣクラスＩ経路において外因性ペプチドを標的化するＳＴｘＢ-Ｃｙｓの能力に関係していたということを示した。
また、本発明は、Ｇｂ３レセプター発現細胞に対象の配列を含む発現ベクターを供給するための、前記発現ベクターを、一般担体のＣｙｓ部分に共有的に結合されるリジンリッチペプチドに結合させることを特徴とする方法に関する。
【００２１】
実施例のように、リジンリッチペプチドはあらゆるポリヌクレオチド配列、ＤＮＡ又はＲＮＡに結合する能力のある１６アミノ酸長のポリリジンである。このような１６アミノ酸長のリジンを有するペプチドは、そのＮ末端で無水ブロモ酢酸によって活性化され、ＳＴｘＢ-Ｃｙｓにカップリングする。発現プラスミドは、このカップリング生成物に結合し、標的細胞へのＤＮＡのベクトル化は、例えば、緑色蛍光タンパク質又はルシフェラーゼのような好適なレポーター系を用いてアッセイされる。
抗原提示細胞の核にＳＴｘＢによって発現プラスミドを標的化する能力は、ｉ）ＤＮＡが新しい実験又は臨床的な必要性のためにさらにより容易に利用することができ、ｉｉ）相乗効果のためにＤＮＡ由来の抗原性ペプチド又はタンパク質の発現がＳＴｘＢ依存性抗原提示の感度を更に向上させるので、このベクターの効力をさらに改善することが期待される。
【００２２】
また、本発明は、細胞、特にＧｂ３（又はＣＤ７７）レセプターを有する癌細胞に薬剤又はプロドラッグを供給するための方法を提供する。
糖脂質Ｇｂ３レセプターは、ある種の神経外肺葉由来腫瘍（神経膠腫）及びある種のバーキットリンパ腫で優先的に発現されることが報告されている。癌の化学療法の使用の制限の一つは、正常細胞におけるそれらの毒性による薬剤の二次的な副作用であるので、薬剤はＳＴｘＢ-Ｃｙｓを用いることによって腫瘍細胞で優先的に方向づけされる。薬剤は、ＳＴｘＢ-Ｃｙｓのスルフヒドリル基反応性となるように活性化される。この目的のために、マレイミド基を薬剤、例えばソラレン化合物に導入してもよい。
【００２３】
また、本発明は：
−ペプチド又はタンパク質又は糖タンパク質又はリポペプチドの免疫原性を増強するための製薬組成物であって、該ペプチド又はタンパク質又は糖タンパク質又はリポペプチドにそのＣｙｓ部分によって共有的に結合された一般担体を含むもの；
−Ｇｂ３レセプター（ＣＤ７７）を有する腫瘍細胞を処置するための製薬組成物であって、前記腫瘍細胞にとって毒性の薬剤又はプロドラッグにそのＣｙｓ部分によって共有結合した本発明に係る一般担体を含むもの
に関する。
本発明の一般担体の範囲、他の出願のその広い用途を限定するものではなく、以下の実施例と図は本発明の有利性を示す。
【実施例１】
【００２４】
一般担体の調製
ａ）ＳＴｘＢ - Ｃｙｓを発現するプラスミドの構築：
好ましい実施態様で、プラスミドｐＳＵ１０８（７）を修飾してＢ-断片ｃＤＮＡの３'末端にシステインコドンｔｇｔを導入した。ＰＣＲプライマーＡ：配列番号３（５'−AGCGAAGTTATTTTTCGTTGTTGACTCAGAATAGCTC−３'）及びプライマーＡ'：配列番号４（５'−GAGCTATTCTGAGTCAACACGAAAAATAACTTC−３'）を、プラスミド特定プライマーShigaAtpE：配列番号５（５'−CACTACTACGTTTTAAC−３'）及びShiga-fd：配列番号６（５'−CGGCGCAACTATCGG−３'）とともに使用して、プライマーShiga AtpE及びShiga-fdでの第２のＰＣＲで、ｐＳＵ１０８のＳｐｈｌ及びＳａｌ１制限部位にクローン化された断片を生成するＤＮＡ断片を作成した。ＰＣＲにより誘導される配列はジデオキシ配列決定によって確認された。
【００２５】
ｂ）タンパク質精製：
ｂ）１．ペリプラズム抽出物の調製を次のようにして実施した：
− ３０℃で増殖させた１２５μｌの一晩培養物を含有する１２５ｍｌのＬＢ／Ａｍｐを接種し、
− ３０℃で一晩増殖させ、
− ３７５ｍｌのＬＢ／Ａｍｐ、５０℃に移して；４２℃で４時間インキュベートし、
− 遠心分離して、細胞をペレットにし、
− １０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣ１、ｐＨ８．０で３回、細胞を洗浄し、
− ２００ｍｌの２５％スクロース、１ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣ１、Ｐｈ８．０に細胞を再懸濁して；室温で１０分間インキュベートし、
− 遠心分離して、細胞をペレットにし、
− プロテアーゼ阻害剤カクテルを含有する２００ｍｌの氷冷水に細胞を再懸濁して；氷上で１０分間インキュベートし、
− 遠心分離し；上清を回収し；２０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣ１、Ｐｈ８．０を加える。
ｂ）２．カラムの準備：
ペリプラズム抽出物をＱＦＦ陰イオン交換カラム（ファルマシア社）に負荷し、２３０ｍＭのＮａｃｌで溶出させた。画分を含むＳＴｘＢ-Ｃｙｓをプールし、４倍に希釈してＭｏｎｏ Ｑ陰イオン交換カラム（ファルマシア社）に負荷し、続いて２３０ｍＭのＮａｃｌに溶出させた。PallFiltron社からのマイクロ濃縮装置で濃縮した後、プールしておいた分画をセファデックス７５ゲル濾過カラムを通した。純度は約９５％であった（図１）。
ｂ）３．生成物の特徴付け
セファデックス７５ゲル濾過カラムで精製したＳＴｘＢ-ＣｙｓのＢ断片は、基本的に単量体である（図１）。これは、Ｂ断片の天然Ｃ末端から２アミノ酸を超える位置でシステインを加えられた構築物とは著しい相違がある。これらの場合、五量体で隣接するＢ断片はジスルフィド結合で結合される。
【実施例２】
【００２６】
一般担体に活性化ペプチドをカップリングするための条件
ａ）担体：
３つの異なる担体を比較した。
１）ＳＴｘＢ-Ｃｙｓ：ＣｙｓがそのＣ末端に直接加えられたＢ断片。このタンパク質は精製カラムから単量体として溶出する。
２）ＳＴｘＢ-Ｚ２-Ｃｙｓ：野生型Ｂ断片のＣ末端とＣｙｓの間に短いスペーサー（クローニングカセットから生じる２アミノ酸）を有する担体。タンパク質の大部分は、精製カラムから二量体として溶出した。これらは、還元条件下で分離することができ、五量体のＢサブユニット複合体の単量体の間にジスルフィド結合の形成を示す。
３）ＳＴｘＢ-Ｇｌｙｃ-Ｃｙｓ-ＫＤＥＬ：Ｃｙｓが９アミノ酸長のグリコシル化カセットとＣ末端ＫＤＥＬペプチドの間にある担体。タンパク質の大部分は、精製カラムから二量体として溶出した。これらは、還元条件下で分離することができ、五量体のＢサブユニット複合体の単量体の間にジスルフィド結合の形成を示す。
【００２７】
ｂ）試験ペプチド：
１）Ｐｅｐ１：ニワトリの卵白アルブミンから誘導されるＳＬ８抗原ペプチドを有する１６アミノ酸の合成ペプチド。
２）Ｐｅｐ２：Ｃ末端にＨｉｓ-ｇａｇをさらに有する上記のような２４アミノ酸の合成ペプチド。
３）ＳＬ８：抗原提示細胞の原形質膜においてＭＨＣクラスＩ複合体のペプチドと直接変換することのできる卵白アルブミン由来の抗原ペプチド。
【００２８】
ｃ）カップリング条件：
還元条件下（タイプ１）：融合タンパク質をＤＴＴで一晩処理し、次いで、活性化ペプチド（そのＮ末端にブロモ酢酸基を有する）を過剰に加えた。融合タンパク質を用いた第一カップリング実験に用いられる条件は、ほとんど単量体を二量体化する（タンパク質ＳＴｘＢ-Ｚ２-Ｃｙｓ及びＳＴｘＢ-Ｇｌｙｃ-Ｃｙｓ-ＫＤＥＬ）。
非還元条件（タイプ２）：融合タンパク質を活性化ペプチドと直接反応させた。
【００２９】
ｄ）生化学的及び形態学的コントロール：
Ｐｅｐ２はＨｉｓタグを有する。これは、抗Ｈｉｓ抗体を用いてウェスタンブロットによるＢサブユニットのＰｅｐ２の存在を示すこと、及びＨｅＬａ細胞のＰｅｐ２のＢサブユニット依存性輸送を可能にした。
図２ａは、Ｂ３Ｚ ＣＴＬハイブリドーマの用量依存性刺激（βガラクトシダーゼ活性の測定）が非固定細胞で観察されたが、固定では抗原提示が消失したことを示す。
抗原提示は非固定細胞でのみ作用し、観察された提示は汚染のないＰｅｐ２から生じないことに注目される。
図２ｂは、固定Ｄ１細胞が遊離ＳＬ８ペプチドをまだ提示することができることを示す図２ａのコントロール実験を示す。
【００３０】
図３では、高用量（２００−１０００ｎＭ）においていくらかの提示が固定細胞で観察されたので、このタイプのプロトコールにおいては、幾つかの遊離Ｐｅｐ１が融合タンパク質と同時精製されるようである。ＳＬ８による提示は右に示される。
図４では、カップリングされたタンパク質（レーン１及び２）又はＳＬ８ペプチド（レーン５及び６）を、Ｇｂ３へのＢサブユニットの結合を阻害する１３Ｃ４抗体から誘導される抗ＢサブユニットＦａｂ断片と共にインキュベートし（レーン２及び５）、あるいはしなかった（レーン１及び４）。Ｆａｂ断片は、クラスＩ経路に抗原ペプチドを導入するＢサブユニットの能力を中和したが、ＳＬ８での提示はこれらの条件下で影響されなかったことに注目される。この実験におけるバックグラウンドシグナルは０．３であった。
【００３１】
図５ａでは、Ｄ１細胞をＰＰＭＰで３日間前処理した（（２）の図３ｂ参照）。この処理は、細胞表面でのＧｂ３発現の重大な減少をもたらすが、完全にそれを排除するものではない。この条件下で、ＳＴｘＢ-Ｇｌｙｃ-Ｃｙｓ-ＫＤＥＬとＰｅｐ１とのカップリング反応からの抗原提示は有意に減少し、Ｇｂ３が提示現象に重要であることを示した。
これら全ての実験から、ＳＴｘＢ-Ｃｙｓへの非還元下でのカップリングは、驚くべき効果があると考えられる（感受性に関して；図１に示されるように、４ｎＭのＳＴｘＢ-Ｃｙｓ-Ｐｅｐ２のみ応答がある必要がある）。そのため、一般担体ＳＴｘＢ-Ｃｙｓはその提示の簡便性及びカップリングの再現能力のために望まれる。
【００３２】
従って、ＳＴｘＢ-Ｃｙｓへの活性化ペプチドのカップリングの適切な条件は、次の通りであった：
−ＳＴｘＢ-Ｃｙｓを２０ｍＭホウ酸塩バッファー、ｐＨ９．０、１５０ｍＭのＮａＣｌに対して透析する、
−１ｍｇ／ｍｌに濃縮する、
−Ｎ末端活性化ペプチド（無水ブロモ酢酸で活性化した）を１２ｍＭでＤＭＳＯに溶解する、
−ペプチドを０．２ｍＭまでタンパク質溶液に希釈する、
−室温で１２時間インキュベートする、
−ＰＢＳに対して透析する。
【実施例３】
【００３３】
ＳＴｘＢのその抗原提示能力に関する特徴付け
次の一連の実験は、抗原提示システムで機能するＳＴｘＢの能力を十分に説明するのに役立つであろう。
ａ）クラスＩ - 及びクラスＩＩ - 拘束抗原提示：
ニワトリ卵白アルブミン（Br-CH2-CO-NH-LEQLESIINFEKLTEWSLKISQAVHAAHAEINEAGR、配列２５７−２６４及び３２３−３３９由来のクラスＩ-及びクラスＩＩ-拘束抗原ペプチドを有するペプチドをＳＴｘＢ-Ｃｙｓにカップリングし、これらのペプチドのクラスＩ-及びクラスＩＩ-拘束提示を対応するＴ細胞ハイブリドーマを用いて分析した。
【００３４】
ｂ）完全な大きさのタンパク質のカップリング。
我々による先行の証拠は、ニワトリ卵白アルブミンをＳＴｘＢ-Ｃｙｓにカップリングすることができることを示唆する。これらの実験は、ＳＰＤＰヘテロ二機能性架橋剤で実施された（Carlsson等, 1978）。
抗原提示実験の第１系列は、卵白アルブミンタンパク質をマウス樹状細胞の内因性ＭＨＣクラスＩ拘束抗原提示経路に導入することができることを示した。ＳＰＤＰは血清チオラーゼにより切断可能であるという不都合がある。この架橋剤は、切断不可能であるＭＢＳによってうまく代用された。他の抗原タンパク質（Ｍａｒｔ１及びＨＰＶ１６-Ｅ７から誘導されるポリペプチド及びＭｕｃ１）を試験して該手段が一般的な使用であることを示す。
【００３５】
ｃ）複合タンパク質の混合物のカップリング。
頸部癌誘導細胞株Ｃａｓｋｉの溶菌液を用いた。この頸部癌細胞株はその膜においてＨＬＡ-Ａ２対立遺伝子を発現し、またヒトパピローマウィルス誘導ペプチドを発現する。Ｅ７は、最初のケラチノサイトの形質転換に必要なＨＰＶ由来の初期転写ＯＲＦである。抗Ｅ７ ＨＬＡ Ａ２拘束性ＣＴＬをインビトロで誘発する。ＨＬＡ-Ａ２ Ｅ７に特異的な提示アッセイによってこのタンパク質混合物のカップリングの効果を試験した。コントロールのように、Ｅ７を発現しないＨＬＡ-Ａ２-陽性細胞株（ｃｒｏｆｔ細胞又はＤａｕｄｉ）からの溶菌液をＳＴｘＢ-ｌｙｓにカップリングした。
【実施例４】
【００３６】
ＭＨＣクラスＩ拘束抗原提示のための用途
図４の実験は、ＳＴｘＢ-Ｃｙｓ依存性抗原提示はＧｂ３との相互作用が消失した時に阻害されることを示す。ここで、ＳＬ８にカップリングされた、ＳＴｘＢに対するモノクローナルＡｂのＦａｂ断片の０．１μＭのＳＴｘＢ-Ｃｙｓへの予備結合は、抗原提示を阻害することが分かり、Ｇｂ３へのＳＴｘＢ-Ｃｙｓ結合は抗原提示に必要であることを示唆する。同様の結果が、Ｇｂ３-発現を薬剤で阻害した場合にも得られた（図４）。
【実施例５】
【００３７】
ＳＴｘＢ - Ｃｙｓに卵白アルブミンをカップリングするための反応鎖
図６に反応式を示す。
第１の反応では、ＭＢＳのＮ-ヒドロキシスクシンイミドエステル部分が、抗原標的タンパク質、例えばモデルタンパク質の卵白アルブミン（Ｏｖａ）の一級アミンと反応する。反応生成物を精製し、次いで第２反応ではマレイミドベンゾイル部分を介してカップリングを引き起こすＳＴｘＢ-Ｃｙｓとインキュベートする。
【００３８】
図７は、ＳＴｘＢ-Ｃｙｓ及びＯｖａに関与する典型的なカップリング反応のＳＤＳ-ＰＡＧＥ及びウェスタン分析を示す。カップリングについて、２０ｍｇ／ｍｌのＯｖａを含有する１００ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４を４．５ｍＭのＭＢＳとともに室温で３０分間インキュベートした。反応物を、ＰＢＳ／ＥＤＴＡ１０ｍＭで平衡にしたゲル濾過カラムに通す。溶出したＯｖａを２０ｍｇ／ｍｌに濃縮する。１容積の３．５ｍｇ／ｍｌでＳＴｘＢ-Ｃｙｓを含有するＰＢＳ／ＥＤＴＡを１容積の活性化Ｏｖａと混合し、室温で一晩インキュベートする。
【００３９】
図７は、カップリング反応の中で、カップリングしていないＳＴｘＢ（上部）とカップリングしていないＯｖａ（下部；カップリングしていないタンパク質はクロスで示した）に加えて、低い電気泳動度を有するバンド（矢印で示される；カップリング生成物）が検出された。反応生成物を１３Ｃ４抗ＳＴｘＢモノクローナル抗体で作った免疫親和性カラム（レーンＩＰカラム）に通すことによって精製した。遊離Ｏｖａが消失することに注意したい。次いで、溶出ＳＴｘＢ-Ｃｙｓ（カップリングした及びカップリングしていない）をゲル濾過カラムに通して、カップリングしたＳＴｘＢ-Ｃｙｓから遊離ＳＴｘＢ（分画１５−１９）を分離する（分画９−１４；分画１１−１２は大量のカップリングしたタンパク質を含むことに注目される；下のバンドに比較して小さい上のカップリングバンドは、おそらく二量体Ｏｖａから生じている）。
【実施例６】
【００４０】
ＳＴｘＢ - Ｃｙｓ - Ｏｖａカップリング生成物の細胞内輸送の特徴付け
０．５μＭのＳＴｘＢ-Ｃｙｓ-Ｏｖａを氷上でＨｅＬａ細胞とともにインキュベートした。細胞を洗浄し、４５分間で３７度まで変化させ、固定し、指示抗体を染色した。図８に示されるように、ＳＴｘＢ-Ｃｙｓ及びＯｖａをＭＢＳによって結合した場合には、Ｏｖａ免疫反応性はＲａｂ６で染色されるゴルジ体のＳＴｘＢ免疫反応性と一緒に検出することができる。両タンパク質をＨｅＬａ細胞と別々の存在としてインキュベートすると、ＳＴｘＢ-Ｃｙｓのみがゴルジに輸送され、Ｏｖａは細胞で検出することができなかった。これらのデータは、カップリングしたＳＴｘＢ-ＣｙｓもカップリングしていないＳＴｘＢ-Ｃｙｓと同じようにして輸送され、ＯｖａはＳＴｘＢ-Ｃｙｓを介して方向付けされることを明確に示す。
【実施例７】
【００４１】
ＳＴｘＢ - Ｃｙｓは完全な大きさの外因性抗原タンパク質から誘導されたペプチドのＭＨＣクラスＩ及びＩＩ拘束性提示を可能にする
第１の実験では（図９、左）、ＳＴｘＢ-Ｃｙｓ-Ｏｖａを使用してマウス樹状細胞株Ｄ１を感作した場合、非ベクトル化ＯｖａをパルスしたＤ１細胞に比較してＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｏｖａ誘導ペプチドＯｖａ３２３−３３９の提示の明確な増加が観察されたことを示している。実際、Ｏｖａ３２３−３３９ペプチドの有意な提示は、０．０１ｎＭのＳＴｘＢ-Ｃｙｓ-Ｏｖａと同様にほとんど検出されなかったが、１０ｎＭの完全な大きさのＯｖａはそのペプチドの有効な提示に必要とされた。ＩＡｂ拘束Ｏｖａ３２３−３３９ペプチドの提示を、このペプチドの認識後にＩＬ-２を生成するＢ０９７．１０ハイブリドーマを用いて暴露した。コントロールとして、不適切なＭＨＣクラスＩＩ拘束ハイブリドーマをＢ０９７．１０の代わりに使用した場合にＩＬ-２分泌は観察されなかった（データは示さず）。
第２の実験では、Ｏｖａのみ又はＳＴｘＢ-Ｃｙｓ-Ｏｖａと共にの何れかを同じＤ１樹状Ｈ２ｂ拘束細胞株にパルスした。Ｋｂ分子の場合にＳＬ８ペプチドを認識する特異的Ｂ３Ｚハイブリドーマによって暴露されるので、Ｏｖａ誘導免疫優性ＳＬ８ペプチド（Ｏｖａ２５７−２６４）の提示は、Ｄ１細胞を遊離Ｏｖａで１００ｎＭまで感作した場合には観察されなかったが、１−１０ｎＭのＳＴｘＢ-Ｃｙｓ-ＯｖａはＳＬ８ペプチドの提示を可能にした。コントロールとして、不適切なハイブリドーマの活性化が同様の実験条件で観察されないことを示した。
結局、これらの結果は、ＳＴｘＢ-ＣｙｓがＭＨＣクラスＩとクラスＩＩ経路の両方に高い効果を有する完全な大きさのタンパク質を標的とすることを明確に示す。
【００４２】
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【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】図１は、最終セファデックス７５カラムで生じる精製ＳＴｘＢ-Ｃｙｓのタンパク質特性を示す。分画２０−２５は主に単量体のＳＴｘＢ-Ｃｙｓを含む（単量体及び二量体ＳＴｘＢ-Ｃｙｓの位置は右側に示される）。分子量マーカーは左に示される。
【図２ａ】図２ａは、ＳＴｘＢ-Ｃｙｓへの［実施例２に定義されるような］タイプ２のＰｅｐ２の結合、それに続く（２）に説明されるようなＤ１樹状細胞でのインビトロ抗原提示アッセイを示す。ＳＬ８ペプチド、卵白アルブミンの免疫優性エピトープにカップリングされた２つの異なる調製のＳＴｘＢ-Ｃｙｓが使用された（４Ａ及び９Ａと称される）。固定では、抗原提示が消失し、細胞外プロセシングを生じないことを示す。
【図２ｂ】図２ａのコントロール実験を示し、固定したＤ１がまだ遊離ＳＬ８ペプチドを提示することができることを示す。
【図３】図３は［実施例２に定義されるような］ＳＴｘＢ-ＳＨ及びＰｅｐ１におけるタイプ１のカップリング反応を用いた固定及び非固定Ｄ１細胞でのもう１つの実験を示す。
【図４】図４は、Ｂ-Ｇｌｙｃ-Ｃｙｓ-ＫＤＥＬへのＰｅｐ２のカップリングから誘導される抗原ペプチドのＢサブユニットに依存する提示を示す。また、Ｇｂ３に結合するＳＴｘＢを中和する抗体に由来するＦａｂ断片の使用は、抗原提示を消失させる。
【図５】図５は、Ｇｂ３合成阻害剤ＰＰＭＰがＢサブユニット依存性抗原提示を阻害し（５ａ）、ＳＬ８提示がＰＰＭＰ処理細胞において減少しないことを示す。
【図６】図６は、ヘテロ二機能性架橋剤ＭＢＳを用いてＳＴｘＢ-Ｃｙｓへの完全な大きさのＯｖａカップリングの反応式を示す。上段：Ｏｖａの一級アミンにＭＢＳを結合する第一反応。中段：活性化ＯｖａとＳＴｘＢ-Ｃｙｓとの第二反応。下段：ＭＢＳの構造。
【図７】ＳＴｘＢ-ＣｙｓへのＯｖａカップリングのウェスタン分析を示す。図の上部は抗ＳＴｘＢ抗体を用いた免疫ブロット、下部は抗Ｏｖａ抗体を用いた免疫ブロットを示す。精製手順の様々な段階の中間体を示す。レーン１：カップリングしていないタンパク質（クロスで示される）。レーン２：カップリング反応物（カップリング生成物は矢印で示される）。レーン３：抗ＳＴｘＢ抗体が点在する免疫親和性カラムの溶出物。レーン４−７：ゲル濾過カラムからの分画。レーン４：分画９−１０。レーン５：分画１１−１２。レーン６：分画１３−１４。レーン７：分画１５−１９（遊離ＳＴｘＢ-Ｃｙｓ）。分画１１−１２は大量の単量体カップリング生成物を含む。また、低い電気泳動度を有する物質もいくらか検出することができたが、元の準備物に存在する二量体Ｏｖａから生ずるようである。
【図８】図８はＨｅＬａ細胞におけるＳＴｘＢ-Ｃｙｓ-Ｏｖａ輸送の免疫蛍光分析を示す。カップリング生成物ＳＴｘＢ-Ｃｙｓ-Ｏｖａ（図の上部）又はＳＴｘＢ-ＣｙｓとＯｖａの混合物（図の下部）を氷上でＨｅＬａ細胞とともにインキュベートした。洗浄した後、細胞を３７℃で４５分間撹拌し、固定し、示される抗体で染色した。ＯｖａがＳＴｘＢ-Ｃｙｓ（上）と結合したときに、タンパク質はゴルジ体に方向付けされ、ゴルジマーカーＲａｂ６を同時染色した。ＯｖａがＳｔｘＢ-Ｃｙｓと混合しただけだと（下）、タンパク質を細胞で検出することはできない。
【図９】図９は、Ｄ１細胞とＳＴｘＢ-Ｃｙｓ-Ｏｖａとをインキュベーションすることによって誘導したＭＨＣクラスＩ及びＩＩ拘束抗原提示を示す。詳細は本文を参照のこと。
Claims (24)
- Ｇｂ３レセプター発現細胞に対して分子を直接的に又は間接的に標的化するための一般ポリペプチド担体であって、次の式：ＳＴｘＢ-Ｚ(ｎ)-Ｃｙｓ、ここで：
−ＳＴｘＢはシガトキシンＢサブユニット又はその機能的等価物であり、
−Ｚはスルフヒドリル基のないアミノ酸であり、ｎは０、１又はポリペプチドであり、
−Ｃｙｓはアミノ酸システインである
を有する一般担体。 - ｎが０である、請求項１に記載の一般担体。
- 分子が、タンパク質、ペプチド、オリゴペプチド、糖タンパク質、糖ペプチド、核酸、ポリヌクレオチド、又はその組合せからなる群から選択される、請求項１又は２に記載の一般担体。
- 分子が、−Ｓ-Ｓ-、又は−Ｓ-ＣＯ-、又は−Ｓ-ＣＨ２-、又は−Ｓ-ＮＨ-結合によって一般担体の−Ｓ残基に共有的に結合される、請求項１又は２に記載の一般担体。
- 分子が抗原提示細胞に標的化される抗原である、請求項４に記載の一般担体。
- 一般担体が、−Ｓ-Ｓ-、又は−Ｓ-ＣＯ-、又は−Ｓ-ＣＨ２-又は−Ｓ-ＮＨ-結合によってオリゴペプチド又はポリペプチドと共有的に結合し、標的化される分子が、前記オリゴペプチド又はポリペプチドに作用可能に結合する、請求項１又は２に記載の一般担体。
- ポリリジンオリゴペプチドに共有的に結合し、標的化される分子が前記ポリリジン部位に作用可能に結合された核酸又はオリゴヌクレオチドであることを特徴とする、請求項６に記載の一般担体。
- 分子がＧｂ３レセプターを発現する腫瘍細胞に標的化される細胞障害性の薬剤またはプロドラッグである、請求項４に記載の一般担体。
- ａ）その３'末端にシステインをコード化するコドンＴＧＴ、又はコドンＴＧＣを有するシガトキシンＢサブユニット又はその機能性等価物をコード化するヌクレオチド配列ＳＴｘＢを含むポリヌクレオチド、
ｂ）その３'末端にコドンＴＧＴ又はＴＧＣを有するシガトキシンＢサブユニット又はその機能性等価物をコード化するヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、
ｃ）ａ）又はｂ）の配列に相補的なヌクレオチド配列
からなる群から選択される単離されたポリヌクレオチド。 - 配列番号２を有する請求項９に記載のポリヌクレオチド。
- 請求項９又は１０に記載のポリヌクレオチド配列を有し、適した宿主細胞において請求項１の一般ベクターを発現するための組換えベクター又はプラスミド。
- 請求項１１に記載の組換えベクターで形質転換することによって得られた組換え細胞株。
- 原核細胞株、好ましくは大腸菌である請求項１２に記載の組換え細胞株。
- ２０００年１２月１９日に登録番号ｌ-２６０４でＣＮＣＭに寄託された請求項１１、１２又は１３に記載の組換え細胞株。
- ａ）ＳＴｘＢ配列を有するプラスミドを準備する；
ｂ）プライマーＡＡ'及びＢＢ'の２つの組を用いて２回のＰＣＲ増幅工程を実施する、
−Ａ及びＢは互いに相補的で、Ｃｙｓコドンを有する
−Ａ'及びＢ'はＳＴｘＢ配列の外側にある；
ｃ）増幅断片を単離する；
ｄ）増幅断片をハイブリダイズする；
ｅ）ハイブリダイズした断片にＰＣＲ増幅を実施する；
ｆ）プラスミドに増幅断片を挿入する
ことを含む請求項１１又は１２に記載の組換えベクターを構築する方法。 - 工程ｆ）において、断片がプラスミドｐＳＵ１０８のＳｐｈｌとＳａｌｌ制限部位に組み込まれる、請求項１５に記載の方法。
- ａ）請求項１２ないし１４の何れか１項に記載の細胞株を培養し、
ｂ）前記細胞のペリプラズム抽出物を採取し、
ｃ）前記ポリペプチドを精製する
ことを含む、請求項１に記載の精製ポリペプチドを作成する方法。 - ａ）において、細胞株が大腸菌であり、ｃ）において、精製が陰イオン交換カラムクロマトグラフィーの後にゲル濾過カラムクロマトグラフィーをすることによってなされる、請求項１７に記載の方法。
- ＭＨＣクラスＩ及びＭＨＣクラスＩＩ経路に対象の配列を供給するための方法であって、一般担体のＣｙｓ部分と対象とする前記配列との共有結合によって得られる生成物を用いる方法。
- Ｇｂ３レセプター発現細胞に対象の配列を含む発現ベクターを供給するための方法であって、前記発現ベクターを、一般担体のＣｙｓ部分に共有的に結合されるリジンリッチペプチドに作用可能に結合させることを特徴とする方法。
- リジンリッチペプチドが１６アミノ酸長のポリリジンである、請求項２０に記載の方法。
- 対象の配列が：
−免疫原性ペプチドをコード化する配列、又は
−Ｇｂ３レセプター発現細胞にとって毒性となる薬剤又はプロドラッグをコード化する配列、又は
−治療活性分子をコード化する配列
の中から選択される、請求項１９ないし２１に記載の方法。 - ペプチド又はタンパク質又は糖タンパク質又はリポペプチドの免疫原性を増強するための製薬組成物であって、前記ペプチド又はタンパク質又は糖タンパク質又はリポペプチドに、そのＣｙｓ部分によって共有的に結合した請求項１又は２に記載のポリペプチド担体を含む製薬組成物。
- Ｇｂ３を有する腫瘍細胞を処置するための製薬組成物であって、前記腫瘍細胞にとって毒性の薬剤又はプロドラッグに、そのＣｙｓ部分によって共有的に結合した請求項１又は２に記載のポリペプチド担体を含む製薬組成物。
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