DE69928523T2

DE69928523T2 - Verotoxin b untereinheit zur immunisierunug

Info

Publication number: DE69928523T2
Application number: DE69928523T
Authority: DE
Inventors: Allan M. Green
Original assignee: Institut Curie
Current assignee: Institut Curie
Priority date: 1998-05-15
Filing date: 1999-05-14
Publication date: 2006-08-10
Anticipated expiration: 2019-05-15
Also published as: WO1999059627A3; DE69928523D1; WO1999059627A2; ES2255269T3; JP4820000B2; JP2002515456A; AU3991899A; EP1078007B1; US8367071B2; US20040013681A1; EP1078007A2; CA2333921A1; ATE310750T1; CA2333921C; US20020081307A1

Description

Hintergrund der Erfindung
Dendritische Zellen sind die Wächter des Immunsystems. Sie stammen aus einem Knochenmarksvorläufer, wandern durch das Blut und werden in nicht lymphoides Gewebe, z.B. der Haut, ausgesät. Dendritische Zellen fangen exogene Antigene ab und prozessieren sie zur Präsentation als Peptid-MHC-Komplexe an der Zelloberfläche und wandern dann über das Blut und die afferente Lymphe zu den sekundären Lymphknoten. In den Lymphknoten wechselwirken sie mit den T-Lymphozyten, um die Aktivierung der Helfer- und Killer-T-Zellen zu erleichtern (Steinman, R. (1991) Annu. Rev. Immunol. 9:271; Cella et al. (1997) Curr. Opin. Immunol. 9:10).
Dendriten wurden auf Grund ihres Aussehens und ihrer Verteilung im Körper benannt. Beispielsweise sind die in der Epidermis liegenden dendritischen Zellen als Langerhans-Zellen bekannt. Die in der Dermis und im Interstitium liegenden dendritischen Zellen sind als interstitielle dendritische Zellen bekannt. Dendritische Blut-, Schleier- bzw. Lymphoid-Zellen werden im Kreislaufsystem in der afferenten Lymphe bzw. in den Lymphknoten festgestellt. Dendritischen Zellen sind außerdem durch die Abstammung, den Maturationszustand, die funktionellen und phänotypische Merkmale dieser Stadien und durch Mechanismen, die an ihrer Migration und Funktion teilhaben, charakterisiert (Cella et al., supra; Austyn, J. (1996) J. Exp. Med. 183: 1287).
Neuere Arbeiten haben gezeigt, dass das Choleratoxin als potentes transkutanes Adjuvans bei der nicht invasiven transkutanen Immunisierung in Mäusen wirken kann (Glenn, G. M. et al. Nature (1998) 391: 851). Auf die Oberfläche der Haut aufgebrachtes Choleratoxin stimuliert eine starke Immunantwort auf mitverabreichte Antigene, wie Diphterie- oder Tetanus-Toxoid. Dieses Verfahren ist angesichts der großen Hautoberfläche und der Existenz potenter Immunzellen darin besonders wichtig (siehe z.B. Bos, J. D., Clin. Exp. Immunol., 107 (Erg. 1), 3–5, 1997).
Studien mit Choleratoxin legen nahe, dass das Holotoxin die Präsentation löslicher Peptide auf Makrophagen verstärkt, es hemmte allerdings die intrazelluläre Prozessierung von löslichen oder bakteriellen Antigenen. Im Gegensatz dazu verstärkte die rekombinante B-Untereinheit die Oberflächenpräsentation der Antigene, hemmte allerdings die intrazelluläre Prozessierung nicht (Matousek, M. P., J. G. Nedrud und C. V. Harding, J. Immunol., 156, 4137–4145, 1996). Tierische Studien haben auch die potente Kapazität dendritischer Zellen zur Auslösung einer Antitumor-Immunität gezeigt (Nestle, F. O. et al. Nature Medicine, 4: 328–332, 1998).
EP-A-0 532 090 betrifft rekombinante Hybridproteine mit zwei Hauptkomponenten. Die erste Komponente ist ein modifiziertes Bakterientoxin, das eine translozierende Fähigkeit aufweist, während die zweite Komponente ein Polypeptid oder Protein ist, das für eine Antigen-präsentierende Zelle exogen ist. Das Hybrid besitzt die Fähigkeit, durch eine Antigen-präsentierende Zelle internalisiert zu werden, wo das Hybrid später prozessiert und ein Antigen-Segment des Hybrids auf der Oberfläche der Antigen-präsentierenden Zelle präsentiert wird, wo das Segment durch cytotoxische T-Lymphozyten eine Immunantwort auslöst.
Die WO 98/11229 A betrifft die Isolierung und Reinigung von biologisch und immunologisch aktiven Histidin-markierten Shigatoxinen (His-markiert), ein Toxin, das mit HC und der potentiell lebensbedrohenden Folgeerscheinung HUS zusammenhängt, die von Stämmen pathogener Bakterien übertragen wird. Sie beschreibt, wie das His-Markieren die Reinigung von Shigatoxinen stark vereinfacht und beschleunigt, und sie beschreibt ein verbessertes Verfahren für eine solche Reinigung. Sie beschreibt den Erhalt und die Verwendung von Shiga-Toxoiden, die immunreaktiv, allerdings nicht toxisch sind. Sie beschreibt auch den Erhalt und die Verwendung von Fusionsproteinen von His-markierten Shigatoxinen oder Toxoiden. Schließlich beschreibt sie den Erhalt und die Verwendung von Antikörpern gegen His-markierte Shigatoxine, -Toxoide oder Shigatoxin/Toxoid-Fusionsproteine.
Die WO 96/16178 A betrifft Immunogene zur Stimulierung der Schleimhaut-Immunität gegenüber einem Pathogen, das seinen Wirt durch Kontakt mit den Schleimhäuten des Säugers zu infizieren vermag. Insbesondere offenbart sie eine Anzahl von Polypeptiden und genetischen Konstrukten, die ein Membran-bindendes Polypeptid einschließen, das mit einem Peptid aus einem Pathogen operabel verknüpft ist. Es werden Verfahren zum Einschleusen dieser Immunogene in einen Säuger zur Stimulierung der mukosalen Immunantworten erläutert.
Zusammenfassung der Erfindung
Die Erfindung betrifft die Verwendung eines Toxin-Antigen-Konjugats, wobei das Toxin des Toxin-Antigen-Konjugats die Shigatoxin-B-Untereinheit oder die Verotoxin-B-Untereinheit ist, zur Herstellung eines Medikaments zur Stimulierung einer Immunantwort gegen das Antigen in einem Menschen, wobei das Medikament, das das Toxin-Antigen-Konjugat umfasst, so an den Menschen verabreicht wird, dass in dem Menschen gegen das Antigen eine Immunantwort stimuliert wird. Die bevorzugten Merkmale dieser Verwendung sind in den Ansprüchen 2 bis 5 definiert. Bei einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung die Verwendung eines Toxin-Antigen-Konjugats, wobei das Toxin des Toxin-Antigen-Konjugats die Shigatoxin-B-Untereinheit oder die Verotoxin-B-Untereinheit ist, zur Herstellung eines Medikaments, wobei das Medikament das Toxin-Antigen-Konjugat umfasst, zur Behandlung eines Antigen-verwandten Zustands in einem Säuger, umfassend: Verabreichen an den Säuger einer wirksamen Menge des Toxin-Antigen-Konjugats, Stimulieren einer Immunantwort in dem Säuger gegen das Antigen und dadurch Behandeln des Antigen-verwandten Zustands in dem Säuger, wobei der Antigen-verwandte Zustand ein Tumor, eine Infektion oder ein Tumor ist. Die bevorzugten Kennzeichen dieser Verwendung sind in Anspruch 7 definiert. Bei einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung, die ein Toxin-Antigen-Konjugat, wobei das Toxin des Toxin-Antigen-Konjugats die Verotoxin-B-Untereinheit ist, und einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfasst. Die bevorzugten Kennzeichen dieser Zusammensetzung sind in Anspruch 9 definiert.
Verfahren zur Stimulierung einer Immunantwort in einem Säuger durch Verabreichung an den Säuger eines Toxin-Antigen-Konjugats derart, dass eine Immunantwort in dem Säuger stimuliert wird, werden ebenfalls beschrieben. Vorzugsweise wird das Toxin-Antigen-Konjugat an den Säuger transkutan über die Haut oder über eine Schleimhaut verabreicht.
Bei einer vorteilhaften Ausführungsform umfasst das Toxin-Antigen-Konjugat beispielsweise ein Tumor-Antigen, ein Virus-Antigen oder ein Bakterien-Antigen. Das Tumor-Antigen kann aus Lungengewebe, Hautgewebe, Brustgewebe, Magengewebe, Darmgewebe, Rektalgewebe, oder Gehirngewebe stammen. Bei einer bevorzugten Ausführungsform stammt das Tumor-Antigen beispielsweise aus einem Melanomtumor. Zweckmäßigerweise kann das erfindungsgemäße Toxin-Antigen-Konjugat ein Toxin, wie ein Shigatoxin, ein Verotoxin oder ein Cholera-B-Toxin, umfassen. Vorzugsweise ist das Toxin das B-Fragment von Verotoxin.
Ein Verfahren zur Behandlung eines Antigen-verwandten Zustands in einem Säuger durch Verabreichung an den Säuger einer wirksamen Menge eines Antigen-Toxin-Konjugats und Stimulieren einer Immunantwort in dem Säuger wird ebenfalls beschrieben. Vorzugsweise wird das Toxin-Antigen-Konjugat an den Säuger transkutan über die Haut oder über eine Schleimhaut, z.B. eine Schleimhaut, die in den Respirationstrakt, im Gastrointestinaltrakt oder im Reproduktionstrakt des Säugers liegt, verabreicht. Bei einem besonders bevorzugten Verfahren ist der Säuger ein Mensch. Vorteilhafterweise kann mit dem erfindungsgemäßen Konjugat auch ein Adjuvans verabreicht werden.
Die Erfindung betrifft auch eine pharmazeutische Zusammensetzung, die ein Toxin-Antigen-Konjugat und einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfasst. Vorzugsweise ist die Zusammensetzung zur Verabreichung an den Säuger transkutan über die Haut oder eine Schleimhaut geeignet. Vorteilhafterweise ist der pharmazeutisch verträgliche Träger zur oralen, transdermalen oder intrabronchialen Verabreichung geeignet. Vorzugsweise ist die pharmazeutische Zusammensetzung zur nicht invasiven Verabreichung geeignet.
Die vorliegende Erfindung betrifft rekombinante Proteine, wie Toxin-Antigen-Konjugate, die ein Rezeptor-bindendes, nicht toxisches Fragment eines Toxins, z.B. eine Shigatoxin- oder eine Verotoxin-Untereinheit, und ein Epitop eines Tumor-Antigens, z.B. Mage-1, umfassen.
Die Toxin-Antigen-Konjugate können beispielsweise zur Stimulierung einer Immunantwort in einem Säuger oder zur Behandlung eines Antigen-verwandten Zustands in einem Säuger verwendet werden. Die Toxin-Antigen-Konjugate können auch zur Präsentation von Antigenen auf Antigen-präsentierenden Zellen und zur Formulierung von pharmazeutischen Zusammensetzungen verwendet werden.
Kurze Beschreibung der Figuren
1: Biochemische Charakterisierung von Shiga-B-Mage-1- und Anti-Mage-1-Fusionsproteinen. Das B-Fragment des Shigatoxins (= B) oder rekombinante B-Glyc-KDEL-, B-Mage-1-Glyc-KDEL- oder B-Mage-1-Glyc-KDELGL-Proteine wurden durch Elektrophorese auf Tris-Tricin-Gelen unter reduzierenden Bedingungen analysiert. Anschließend wurden die Gele mit Coomassie-Blau (A) angefärbt oder durch Western-Blot-Analyse mit dem monoklonalen Antikörper 13C4, der gegen das B-Fragment des Shigatoxins (B) gerichtet war, ausgewertet. Antennapedia-Mage-1(Antp-Mage-1, C)-Fusionsprotein wurde durch Coomassie-Blau-Anfärben (a) oder Western-Blot-Analyse mit anti-His-Tag Antikörper (b) analysiert.
2: MHC Klasse 1 Präsentation von löslichen Shiga-B-Mage-Fusionsproteinen gegenüber PBMC: Rolle der KDEL-Sequenz. PBMC (5 × 10⁴) wurden über Nacht entweder mit dem Peptid Mage I (1 μM) oder Mart I (11 μM) oder den Shiga-B-Mage-1-Fusionsproteinen (1 μM) mit aktiver (B-Mage-1-Glyc-KDEL)- oder inaktiver (B-Mage-1-Glyc-KDELGL)ER-Retrievalsequenz gepulst. Nach dem Waschen wurden 2 × 10⁴ Mage-1-spezifische cytotoxische T-Zellen (Klon B2/30) 24 h mit den gepulsten PBMC inkubiert. Die Überstände wurden anschließend geerntet und auf die IFNγ-Produktion getestet. Die Daten sind Mittelwerte von 3 Durchführungen ± Standardabweichungen (Balken) und sind für mindestens zwei ähnliche Experimente repräsentativ.
3: MHC-Klasse 1-Präsentation von löslichem Shiga-B-Mage-1-Fusionsprotein durch verschiedene Arten von Antigen präsentierenden Zellen. B-Lymphoblastoid-Zellen, dendritische Zellen und klonierte T-Zellen wurden wie in 2 beschrieben mit löslichem Shiga-B-Mage-1-Fusionsprotein gepulst. Die Peptid-Mage-1-Präsentation wurde mit dem 82/30 CTL getestet.
4: Analyse der Spezifität der MI-IC-Klasse 1-Präsentation von löslichem Shiga-B-Mage-1-Fusionsprotein durch B-Lymphoblastoid-Zelllinien. Die B-Lymphoblastoid-Zelllinien BM21 (HLA-A1) oder B-V.1 (HLA-42) wurden über Nacht mit Medium allein, synthetischem Peptid Mage-1 (1 μM), synthetischem Peptid Mart 1 (1 μM), Shiga-B-Mage-1-Fusionsprotein (1 μM), rekombinantem Antp-Mage-1-Fusionsprotein und dem Wildtyp-Shigatoxin-B-Fragment gepulst. Nach dem Waschen wurden Mage-1-spezifische CTL 82/30 (A) oder Mart-1-spezifische LB 373 CTL (B) 24 h mit dem gepulsten B-EBV inkubiert. Anschließend wurden die Überstände geerntet und auf die IFNγ-Produktion getestet. Die Daten sind Mittelwerte von drei Durchführungen ± Standardabweichung (Balken) und sind für mindestens zwei ähnliche Experimente repräsentativ.
5: MHC Klasse 1 Präsentation von löslichem Shiga-B-Mage-1-Fusionsprotein durch B-Lymphoblastoid-Zelllinien. Balkendiagramm der Internalisierung (A) und intrazellulärer Prozessierung (B-C): A: eine Paraformaldehyd fixierte B-Lymphoblastoid-Zelllinie (BM21) wurde über Nacht mit synthetischem Mage-1-Peptid (1 μM), Shiga-B-Mage-1-Fusionsprotein (1 μM) oder Medium allein gepulst. Nach dem Waschen wurde Mage-1-spezifisches CTL mit dem gepulsten B-EBV 24 h inkubiert. Anschließend wurden die Überstände geerntet und auf die IFNγ-Produktion getestet. B und C: Etwas unfixierte B-EBV (BM21) wurden 30 min mit Chloroquin (250 μM) oder Brefeldin A (2 μg/ml) vorbehandelt, bevor sie 4 h mit synthetischem Mage-1-Peptid (1 μM) oder Shiga-B-Mage-1-Fusionsprotein (1 μM) oder Medium allein gepulst wurden. Nach dem Waschen wurden Mage-1-spezifische CTL mit dem gepulsten B-EBV 24 h inkubiert. Anschließend wurden die Überstände geerntet und auf die IFNγ-Produktion getestet. Die Daten sind Mittelwerte von drei Durchführungen ± Standardabweichung (Balken) und sind für mindestens zwei ähnliche Experimente repräsentativ.
6: Analyse der Shiga-B-Mage-1-Fusionsprotein-Lokalisierung nach Internalisierung in B-EBV-Zellen. B-EBV-Zellen wurden mit DTAF-markiertem B-Mage-1-Glyc-KDEL (A) 45 min auf Eis inkubiert, gewaschen und 1 h bei 37°C stehen gelassen. Anschließend wurden die Zellen mit Paraformaldehyd fixiert, mit Saponin permeabilisiert und mit einem monoklonalen Anti-lamp-2-Antikörper (B) angefärbt. In C sind eine B-Fragment-spezifische Markierung (A) und eine Lamp-2-Markierung (B) überlagert. Die durch konfokale Mikroskopie erhaltenen repräsentativen Abbildungen sind gezeigt.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft zumindest teilweise pharmazeutische Zusammensetzungen und Verfahren zur Stimulierung einer Immunantwort. Die Erfindung betrifft ein rekombinantes Protein, z.B. ein Toxin-Antigen-Konjugat, das ein Antigen oder ein Antigen-Epitop, z.B. Mage-1, umfasst, das z.B. über kovalente Bindung mit einem Toxin, z.B. ein Shigatoxin, ein Verotoxin-B, assoziiert ist. Bei einer bevorzugten Ausführungsform sind die pharmazeutischen Zusammensetzungen zur transdermalen Verabreichung entweder über die Haut oder über eine Schleimhaut z.B. des Respirationssystems, des Gastrointestinalsystems oder Reproduktionssystems geeignet.
Der Begriff "Antigen" umfasst Mittel, die unabhängig eine Immunantwort hervorrufen, und diejenigen, die in der Lage sind, beim Einbau in ein erfindungsgemäßes Konjugat eine Immunantwort hervorzurufen. Der Begriff "Antigen-Epitop" umfasst Fragmente von Proteinen, die in der Lage sind, die Antigenität zu bestimmen. Ein Epitop kann beispielsweise ein Peptid von 6 bis 8 Resten Länge umfassen (Berzofsky, J. und I. Berkower, (1993) in Paul, W., Hrsg., Fundamental Immunology, Raven Press, N. Y., S. 246). Einige Epitope können wesentlich länger sein. Die Affinität eines Antikörpermoleküls gegenüber seinem Erkennungsepitop reicht von niedrig, z.B. 10^–6 M, bis hoch, z.B. 10^–11 M.
Beispielsweise umfassen Antigene Proteine und andere Moleküle, die spezifisch mit Oberflächen von bestimmten Typen von Krebszellen, z.B. Tumorzellen, assoziiert sind. Viele Formen von Krebs können durch die Produktion von Proteinen, die mit dieser Form der Krankheit zusammenhängen und im normalen Gewebe nicht festgestellt werden, charakterisiert werden. Oft werden diese Proteine als spezifisches Stadium der embryonalen Entwicklung eingesetzt und werden nicht während der normalen erwachsenen Lebenszeit beobachtet. Diese Antigene sind besonders als Quelle für Epitope für Antikrebsimpfstoffe geeignet. Beispiele für Tumorantigene, die als Antigene für die erfindungsgemäßen Konjugate betrachtet werden, umfassen diejenigen, die einem Krebs entsprechen, der Brust, Eierstock, Lunge, Haut und Gehirn befällt. Beispielsweise können Brusttumore durch abnorm exprimierte Rezeptoren, z.B. diejenige aus der Human-EGF-artigen Rezeptorfamilie (HER) charakterisiert werden. Zusätzlich wird auch das Nestinprotein, das von neuroepitelialen Stammzellen während der normalen fötalen Entwicklung eines Säugers exprimiert wird, auf Tumoren des zentralen Nervensystems, einschließlich der meisten Formen von Gehirnkrebs, exprimiert (McKay, D. G. Ronald, U.S. Patent Nr. 5,338,839, 8/16/94). Es wird auch auf Melanomen, die auf der Haut und auf denjenigen, die in andere Gewebe metastasiert haben, festgestellt werden, exprimiert (V. A. Florenes, R. Holm, O. Myklebost, U. Lendahl, O. Fodstad, 1994, Cancer Res. 54: 354–6). Die vorliegende Erfindung betrifft die Einarbeitung dieser Antigene oder Epitope dieser Antigene in die erfindungsgemäßen Verbindungen. Vorzugsweise sind die Antigene der erfindungsgemäßen Toxin-Antigen-Konjugate Peptide, die mit Melanomen assoziiert sind, die beispielsweise rekombinant oder aus Tumorzelllysat abgeleitet werden können.
Weitere Beispiele für Tumor-exprimierende Antigene, die die Erfindung betrifft, umfassen Wilms Tumor (A. J. Buckler, K. M. Call, T. M. Glaser, D. A. Haber, D. E. Housman, C. Y. Ito, J. Pelletier, Rose, E. A. Rose, U.S. Patent Nr. 5,350,840, Magen-Darm-Krebs (R. Fishel et al., International Application WO 95/14085, 05/26/95), Krebs, der durch die Entwicklung einer multiplen Arzneimittelresistenz während der Chemotherapie gekennzeichnet ist (J. M. Croop et al., U.S. Patent Nr. 5,198,344), und Krebs, der durch das Vorliegen von mindestens einem aus einer großen Anzahl von Onkogenen, die der Fachwelt gut bekannt sind, wie Rb, ras und c-myc, deren Sequenzen den Fachleuten zur Analyse zur Verfügung steht, gekennzeichnet ist.
Alternativ können die erfindungsgemäßen Antigene mit den Oberflächen oder den Sekretionsprodukten von Mikroorganismen oder Pathogenen assoziiert sein. Der Begriff "Pathogen" soll Organismen umfassen, die Störungen hervorrufen, wie Störungen die durch eine oder mehrere bestimmte Spezies von Bakterien, Viren, Fungi, und Protozoen, die krankheitserregende Organismen sind, hervorgerufen werden. Beispiele für Pathogene umfassen Gram-negative Bakterienspezies, wie Escherichia coli Serotyp 157:H7, Helicobacter pylori, H. mustelae, Haemophilus influenzae und H. ducreyi, Pseudomonas aeruginosa, Shigella dysenteria, Salmonella typhi und S. paratyphi; Gram-positive Bakterienspezies, wie Mycobacterium tuberculosis, M. leprae, Clostridium tetani, Staphylococcus aureus, und Streptococcus hemolyticus; obligat intrazelluläre Bakterienorganismen, wie Rickettsien- und Chlamydien-Spezies; Retroviren, die DNA-enthaltende Viren sind, die die Reverse Transcriptase zur Synthetisierung komplementärer DNA verwenden, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf HIV-1 und HIV-2; weitere pathogene Viren, wie HSV-I und HSV-II, Nicht-A-, Nicht-B-, Nicht-C-Hepatitisvirus; Pockenviren und Tollwutviren; Fungi, wie Candida- und Aspergillus-Spezies; Protozoen, wie Cryptosporidium parvum, Entamoeba histolytica und Giardia lamblia; und tierische Pathogene, wie das Newcastle-Krankheits-Virus. Der Erhalt von einzigartigen Epitopen aus diesen Organismen durch Screening von Proteine und Testung von Proteinen in vitro ist der Fachwelt allgemein bekannt; viele Beispiele wurden bereits beschrieben, und die entsprechende Aminosäurerestsequenz kann über Genbank bezogen werden.
Der Begriff "Infektion" soll Persistenz und Wachstum eines Pathogens in einem Wirtsindividuum einschließen. Obgleich die Symptome, die zur Diagnose des Vorliegens einer Infektion verwendet werden, Fieber, Entzündung, Schmerz, Gelenk- und Muskelempfindungen an oder nahe an der Infektionsstelle umfassen, schließt die Abwesenheit von einem oder mehreren dieser Symptome die Infektion in einem individuellen Wirtsorganismus nicht aus. Der Begriff "Entzündung" gibt eine Serie von Wirtsreaktionen an, die die Infektion begleiten und auch in Abwesenheit einer Infektion vorliegen können, wie beispielsweise das Symptom von Autoimmunreaktionen, degenerativen Erkrankungen, Gewebe-Wiederaufbaustörungen, Exposition gegenüber Allergenen und/oder anderen Bedingungen. Entzündliche Reaktionen umfassen zelluläre Prozesse, wie Neutrophilen-, Mastzellen- und Basophilen-Degranulation mit damit zusammenhängender Freisetzung von Proteasen, Histaminen und Superoxiderzeugung, und Produktion von und Reaktion auf Cytokine, wie Interferone und Tumornekrosefaktor.
Ein Typ von Antigen kann ein Allergen sein. Ein "Allergen" bezieht sich auf eine Substanz, die eine allergische oder asthmatische Reaktion in einem empfindlichen Individuum auslöst. Die Anzahl von Allergenen, die in einem Anteil einer Population eine empfindliche Reaktion hervorruft, ist enorm und umfasst Pollen, Insektengifte, Tierschuppen, Staubmilbenproteine, Pilzsporen und Arzneimittel (z.B. Penicillin). Beispiele für natürliche tierische und pflanzliche Allergene umfassen Proteine, die für die folgenden Gattungen spezifisch sind: Fells (Fells domesticus); Canis (Canis familiaris); Dermatophagoides (z.B. Dermatophagoides farinae); Periplaneta (z.B. Periplaneta americana); Ambrosia (Ambrosia artemiisfolia); Lolium (z.B. Lolium perenne oder Lolium multiflorum); Cryptomeria (Cryptomeria japonica); Alternaria (Alternaria alternata); Alnus (Alnus gultinosa); Betula (Betula verrucosa); Quercus (Quercus alba); Olea (Olea europa); Artemisia (Artemisia vulgaris); Plantago (z.B. Plantago lanceolata); Parietaria (z.B. Parietaria officinalis oder Parietaria judaica); Blattella (z.B. Blattella germanica); Apis (z.B. Apis multiflorum); Cupressus (z.B. Cupressus sempervirens, Cupressus arizonica und Cupressus macrocarpa); Juniperus (z.B. Juniperus sabinoides, Juniperus virginiana, Juniperus communis und Juniperus ashei); Thuya (z.B. Thuya orientalis); Chamaecyparis (z.B. Chamaecyparis obtusa); Agropyron (z.B. Agropyron repens); Secale (z.B: Secale cereale); Triticum (z.B. Triticum aestivum); Dacrylis (z.B. Dacrylis glomerata); Festuca (z.B. Festuca elatior); Poa (z.B. Poa pratensis oder Poa compressa); Avena (z.B. Avena sativa); Holcus (z.B: Holcus lanatus); Anthoxanthum (z.B: Anthoxanthum odoratum); Arrhenatherum (z.B. Arrhenatherum elatius); Agrostis (z.B: Agrostis alba); Phleum (z.B. Phleum pratense); Phalaris (z.B. Phalaris arundinacea); Paspalum (z.B. Paspalum notatum); Sorghum (z.B. Sorghum halepensis); und Bromus (z.B: Bromus inermis). Ein "Allergen-assoziierter Zustand" umfasst Zustände, die das Ergebnis einer allergischen oder asthmatischen Reaktion auf ein Allergen sind.
Der Begriff "Toxin" umfasst Verbindungen, die eine Immunantwort auf das Antigen zu erleichtern vermögen. Beispielhafte Toxine umfassen die Cholera-B-Kette, Shigatoxine und vorzugsweise Shiga-artige Toxine, z.B. Verotoxin. Das Shigatoxin ist ein Bakterienproteintoxin der AB-Untereinheitsfamilie, die von Shigella dysenteriae sezerniert wird. Die A-Untereinheit hemmt die Proteinbiosynthese in höheren eukariotischen Zellen nach dem Transfer in das Cytoplasma durch Modifizieren eines konservierten Restes von 28S rRNA. Die B-Untereinheit, ein Homopentamer (% B-Fragmente) ist für die Toxin-Bindung an und die Internalisierung in die Zielzellen durch Wechselwirken mit dem Glycolipid Gb, das in der Plasmamembran dieser Zellen vorkommt, verantwortlich. Das B-Fragment ist nicht toxisch, sondern konserviert die intrazellulären Transportmerkmale des Holotoxins, das in vielen Gb-exprimierenden Zellen retrogradiert aus der Plasmamembran über Endosomen in den biosynthetischen/sekretorischen Weg transportiert wird.
Bei einem Aspekt ist das Toxin ein Shiga-artiges Toxin, z.B. Verotoxin. Derzeit bekannte Verotoxine umfassen Verotoxin 1, Verotoxin 2, Verotoxin 2c und Verotoxin 2e der aus einigen Stämmen von E. coli aufgearbeiteten Untereinheitstoxinen. Diese Toxine sind an der Ätiologie des hämolytischen urämischen Syndroms und hämorrhagischer Kolitis beteiligt. Die Zell-Cytotoxizität wird über das Binden der B-Untereinheit des Holotoxins an das Rezeptorglycolipid Globotriaosylceramid in sensitiven Zellen vermittelt. Vorteilhafterweise ist das erfindungsgemäße Toxin nicht toxisch, z.B. Shigatoxin-B oder Verotoxin B.
Der Begriff "assoziiert" umfasst kovalente Bindungen zwischen Toxin und Antigen. Bevorzugte kovalente Bindungen umfassen beispielsweise Peptidverknüpfungen und Cyanogenbomid-Aktivierung. Der Begriff umfasst auch Protein-Protein-Wechselwirkungen, hydrophobe Wechselwirkungen, Van-der-Waals-Wechselwirkungen und ionische Wechselwirkungen. Beispiele umfassen Konjugate, die Biotin einschließen.
Vorzugsweise wird das Toxin-Antigen-Konjugat rekombinant hergestellt. Verfahren zur rekombinanten Herstellung von erfindungsgemäßen Verbindungen sind dem Fachmann gut bekannt und sind in den Beispielen ausgeführt.
Bei einer weiteren Ausführungsform kann das Toxin-Antigen-Konjugat außerdem ein aktives oder inaktives Endoplasmatisches-Retikulum-Retrieval-Signal umfassen. Der Begriff "Endoplasmatisches-Retikulum-Retrieval-Signal" umfasst Peptidsequenzen, die die Fähigkeit eines erfindungsgemäßen Konjugats zur Wechselwirkung mit an einer Immunantwort beteiligten Zellen verstärken. Ein Beispiel für ein aktives Endoplasmatisches-Retikulum-Retrieval-Signal ist KDEL, das beispielsweise vorteilhafterweise an den C-Terminus des Toxins gebunden sein kann. Ein Beispiel für ein geeignetes inaktives Endoplasmatisches-Retikulum-Retrieval-Signal ist KDELGL. KDELGL ist vorteilhafterweise an den C-Terminus des Toxins gebunden.
Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst das erfindungsgemäße Toxin-Antigen-Konjugat Verotoxin B und ein Tumorantigen, beispielsweise ein Melanom-assoziiertes Peptid. Vorteilhafterweise kann das Konjugat rekombinant hergestellt werden.
Auch ein Verfahren zur Stimulierung einer Immunantwort in einem Säuger durch Verabreichung eines Toxin-Antigen-Konjugats an einen Säuger wird beschrieben. Vorzugsweise umfasst die Stimulierung der Immunantwort die Beteiligung dendritischer Zellen, z.B. der Langerhans-Zellen. Der Begriff "Immunantwort" umfasst jede immunologische Reaktion des Säugers auf das erfindungsgemäße Konjugat. Günstigerweise kann die Immunantwort beispielsweise die Promotion von T-Zellen, die Erzeugung von Antikörpern gegen das Antigen und/oder die Präsentation des Antigens durch dendritische Zellen, z.B. vorzugsweise die Langerhans-Zellen, umfassen. Der Begriff umfasst jede Antwort des Immunsystems des Säugers auf das erfindungsgemäße Konjugat. Der Begriff "Stimulierung" umfasst beispielsweise die Auslösung oder Verstärkung einer Immunantwort.
Prozessierung und Präsentation von Antigenen gegenüber T-Lymphozyten sind bei der Entwicklung einer Immunantwort kritische Ereignisse. Als allgemeine Regel präsentieren Moleküle der Majorhistokompatibilitätskomplex (MHC)-Klasse I endogene Peptidepitope, die hauptsächlich aus cytosolischen und nukleären Proteinen stammen, gegenüber CD8+ T Lymphozyten (CTL) (Monaco, J. J. Immunol. Today (1992) 13: 173–179; Heemels, M. T. und Ploagh, H., Annu. Rev. Biochem. (1995) 64: 463491), wohingegen Peptide, die aus exogenen Proteinen stammen, endozytisch generiert werden und auf Molekülen der MHC-Klasse II gegenüber CD4 T-Lymphozyten präsentiert werden (Janeway, C. A. Jr., et al., Inf. Rev. Immunol. (1993) 10: 301–311; Pieters, J., Curr. Opin. Immunol. (1997) 9: 89–96). Allerdings haben verschiedene Berichte gezeigt, dass endogene Eigenantigene, die von gesundem Gewebe oder Tumor-Gewebe exprimiert werden, über einen exogenen auf die Klasse I beschränkten Weg zur Präsentation gegenüber CD8+ T Zellen wirksam prozessiert werden können.
In transgenen Mäusen, die eine Membran-gebundene Form von Ovalbumin (OVA) nur in den pankreatischen Inselzellen und in den Nierentubuluszellen exprimieren, werden aus OVA stammende Peptide auf eine auf die Klasse I beschränkte Weise von Zellen, die aus dem Knochenmark stammen, in den abfließenden Lymphknoten der Niere oder des Pankreas präsentiert (Kurts, C., et al., J. Exp. Med. (1996) 184: 923–930). Huang et al. zeigten, dass das Priming von T-Zellen auf MHC-Klasse I-beschränkte Tumorantigene den Transfer und die Prozessierung dieser Antigene aus den Tumorzellen auf die aus dem Knochenmark stammenden Antigen-präsentierenden Zellen erforderte (Huang, A. Y., et al. Science (1994) 264: 961–965). Trotz dieser Argumente, die die Präsentation im Zusammenhang von MHC-Klasse I-Molekülen und die Erzeugung von CTL über einen exogenen Prozessierungsweg zeigten, vermochten es die meisten Studien nicht, eine wirksame auf die Klasse I beschränkte Präsentation in vitro oder die Induktion von CTL in vivo mit exogenen löslichen Fremdantigenen zu zeigen (Moore, M. W., et al., Cell (1988) 54: 777–785; Rock, K. L., Immunol. Today (1996) 17: 131–137; Watts, C., Annu. Rev. Immunol. (1997) 15: 821–850).
Da die CTL eine wichtige Komponente der protektiven und therapeutischen Immunantworten auf Virusinfektionen und Tumore sind (Sabzovari, H. et al. Cancer Res. (1993) 53: 4933–4937; Rosenburg, S. A., et al. J. Natl. Cancer. Inst. (1994) 86: 1159–1166; Stevenson, P. G., et al. Virology (1997) 232: 158–166; Feltkamp, M. C. Eur. J. Immunol. (1995) 25: 2638–2642), wurden verschiedene Strategien entwickelt, um die auf die MHC-Klasse I beschränkte Präsentation und Stimulierung der CTL durch exogene lösliche Antigene zu ermöglichen.
Rekombinante Lebendvektoren, wie Vaccinia, Listeria oder Salmonella, die Virus- oder Tumor-Antigene exprimieren, gaben diese Antigene wirksam an das Cytosol ab und ermöglichten dadurch ihre Einschleusung in den auf die Klasse I beschränkten Präsentationsweg und die Sensibilisierung von CTL in vivo (Gao, S. M. et al., Infect. Immunity (1992) 60: 3780-3789; Pan, Z. K. et al., Cancer Res. (1995) 55: 4776–4779; Tsang, K. Y. et al., J. Natl. Cancer Inst. (1995) 87: 952–990). Allerdings stellt die Verwendung von gleichartigen Vektoren für den Empfänger Risiken dar auf Grund der potentiellen Pathogeniät der eingesetzten Vektoren, insbesondere in immunsupprimierten Patienten, wie Krebs- und HIV-infizierte Individuen (Kavanaugh, D. Y. et al. Hematol. Oncol. Clin. North Arnenca (1996) 10: 927–951; Redfield, R. R. et al. N. Eng. J. Med. (1987) 316: 673–676).
Anderen Wegen unter Verwendung teilchenförmiger Antigene, die an Latexperlen gebunden (Kovacsovics-Bankowski, M. et al., Pro. Nat. Acad. Sci. USA (1993) 90: 4942–4946; Harding, C. V. et al. J. Immunol. (1994) 153: 4925–4933), mit Liposomen fusioniert (Nair, S., et al., J. Exp. Med. (1992) 175: 609–612) oder mit Adjuvantien assoziiert waren (Ke, Y. et al. Eur. J. Immunol. (1995) 25: 549–553; Lipford, G. B. et al. Eur. J. Immunol. (1997) 27: 2340-2344), ist es gelungen, Fremdantigen in vitro und in vivo in den MHC-Klasse I-Weg einzuschleusen. In den meisten Fällen war die Phagozytose an diesem Prozess beteiligt, und es hatte den Anschein, dass dieser Klasse I-Präsentationsweg hohe Antigenkonzentrationen erforderte und dass seine Wirksamkeit gering war (Reis e Sousa, C. et al. J. Exp. Med. (1995) 1B2: 841–851).
Der Begriff "Säuger" umfasst warmblütige Tiere, wie beispielsweise Nager (z.B. Ratte, Mäuse, Hamster, Eichhörnchen), Pferde, Kühe, Schweine, Schafe, Katzen, Hunde, Bären, Ziegen und Primaten (z.B. Affen, Schimpansen, Gorillas und vorzugsweise Menschen).
Der Begriff "dendritische Zellen" umfasst Langerhans-Zellen, interstitielle dendritische Zellen, interdigitierende dendritische Zellen, follikuläre dendritische Zellen und zirkulierende dendritische Zellen. Langerhans-Zellen werden in der Epidermis und in den Schleimhäuten gefunden. Interstitielle dendritische Zellen bevölkern die meisten Organe, wie Herz, Lungen, Leber, Niere und den Gastrointestinaltrakt. Interdigitierende dendritische Zellen sind in den T-Zellen-Bereichen des sekundären lymphoiden Gewebes und in der Thymusmedulla vorhanden. Zirkulierende dendritische Zellen umfassen "Schleierzellen", die etwa 0,1% der Blut-Leukozyten ausmachen.
Im Allgemeinen sind die dendritischen Zellen mit einem Wirrwar von langen Membranfortsätzen bedeckt, die den Dendriten der Nervenzellen gleichen. Auf Grund ihrer langen dendritischen Fortsätze war es eine Herausforderung, dendritische Zellen unter Anwendung der herkömmlichen Vorgehensweisen zur Isolierung von Lymphozyten und akzessorischen Immunsystemzellen zu studieren. Dendritische Zellen neigen zur Expression von hohen Spiegeln sowohl von Klasse II-MHC-Molekülen als auch co-stimulatorischem B7-Molekül. Aus diesem Grund sind sie potentere Antigen-präsentierende Zellen als die Makrophagen und die B-Zellen, die beide aktiviert werden müssen, bevor sie als APCs funktionieren können. Nach Einfangen eines Antigens in den Geweben durch die Phagozytose oder die Endozytose wandern die dendritischen Zellen durch das Blut in die Lymphe und zirkulieren zu veschiedenen lymphoiden Organen, wo sie das Antigen gegenüber den T-Lymphozyten präsentieren.
Ein Verfahren zur Behandlung eines Antigen-verwandten Zustands in einem Säuger durch Verabreichung an den Säuger einer therapeutisch wirksamen Menge eines Antigen-Toxin-Konjugats und dadurch Stimulieren einer Immunantwort in den Säugern ist ebenfalls beschrieben. Beispielsweise umfasst dieses Verfahren die gemeinsame Verabreichung eines Antigens mit einer Verotoxin-B-Untereinheit oder die Verabreichung eines an eine Verotoxin-B-Untereinheit gekoppelten Antigens an ein Individuum, z.B. einen Säuger, um die Antigen-präsentierenden Fähigkeiten der dendritischen Zellen zu stimulieren.
Der Begriff "Antigen-verwandter Zustand" umfasst Mikroorganismen oder pathogene Infektionen, Allergen-assoziierte Zustände und vorzugsweise Tumore, wie beispielsweise Brust, Eierstock, Gehirn, Haut, Lunge, etc. Vorzugsweise ist der Antigen-verwandte Zustand ein Melanom.
Der Begriff "Behandeln" umfasst die Prävention und Heilung sowie die Verbesserung von mindestens einem Symptom des Antigen-verwandten Zustands. Er umfasst auch die Auslösung einer Immunantwort auf einen Antigen-verwandten Zustand, gegenüber dem der Säuger empfindlich sein kann, an dem er jedoch nicht notwendigerweise leidet. Beispielsweise kann in einem Säuger, bei dem das Risiko für ein Melanom besteht, ein erfindungsgemäßes Konjugat an den Säuger verabreicht und somit eine Immunantwort hervorgerufen werden, so dass die Auslösung des potentiellen Melanoms verhindert oder verzögert wird.
Der Begriff "Verabreichen" umfasst Wege der Verabreichung, wobei es möglich ist, dass das erfindungsgemäße Konjugat seine beabsichtigte Funktion, z.B. Stimulieren einer Immunantwort, ausübt. Bevorzugte Verabreichungswege umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf oral, intrabronchial und transdermal. In Abhängigkeit von dem Verabreichungsweg kann das erfindungsgemäße Konjugat mit einem gewählten Material überzogen oder darin angeordnet sein, um es vor den natürlichen Bedingungen zu schützen, die seine Fähigkeit zur Durchführung seiner beabsichtigten Funktion beeinträchtigen können.
Das erfindungsgemäße Konjugat kann allein oder mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger verabreicht werden. Außerdem kann das erfindungsgemäße Konjugat als Gemisch von erfindungsgemäßen Konjugaten verabreicht werden, die auch zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger verabreicht werden können. Das erfindungsgemäße Konjugat kann vor dem Einsetzen eines Antigen-verwandten Zustands oder nach dem Einsetzen eines Antigen-verwandten Zustands verabreicht werden.
Vorzugsweise werden die erfindungsgemäßen Konjugate an den Säuger transkutan über die Haut oder über eine Schleimhaut verabreicht. Schleimhäute umfassen lubrizierte Membranen der inneren Auskleidungen von vielen internen Systemen der Säuger. Beispiele für Systeme mit Schleimhäuten umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, das Atmungssystem, den Gastrointestinaltrakt und den Reproduktionstrakt. Bevorzugte Schleimhäute umfassen beispielsweise die Membranen der Nase von Säugern, die Nasenpassagen, Hals, Lunge, Mund, Magen, Eingeweide, Darm, Rektum, Urethra, und Vagina. Obgleich nicht an eine Theorie gebunden, wird davon ausgegangen, dass die Verabreichung einer erfindungsgemäßen Verbindung an einen Säuger durch Aufbringen oder durch andere Mittel auf eine Schleimhaut oder die Haut eines Säugers, auf Grund der Gegenwart von spezialisierten und wirksamen Immunzellen, wie beispielsweise dendritische Zellen, z.B. Langerhans-Zellen, zweckmäßig ist.
Auch Verfahren, vorzugsweise nicht invasive, zur Immunisierung eines Säugers gegenüber einem speziellen Antigen durch transkutane Verabreichung eines erfindungsgemäßen Konjugats sind beschrieben. Ein Vorteil nicht invasiver Immunisierungsformen besteht darin, dass das Erfordernis zur Injektion der pharmazeutischen Zusammensetzung in den Säuger zumindest teilweise wegfällt und somit die Notwendigkeit für Injektionen potentiell reduziert und beispielsweise das Risiko der Exposition gegenüber Fremdpathogenen, z.B. HIV, für die Säuger vermindert wird. Der Begriff "nicht invasiv" umfasst Verabreichungsverfahren, wie die transkutane Verabreichung über die Haut und die Schleimhäuten. Beispiele umfassen Inhalation der pharmazeutischen Zusammensetzung zur transkutanen Verabreichung über die Schleimhäute der Respirationstrakt, Schlucken der pharmazeutischen Zusammensetzung zur Verabreichung beispielsweise über transkutane Verabreichung beispielsweise über die Schleimhäute z.B. des Gastrointestinaltrakts, z.B. der Membranen von Mund, Hals, Magen, Eingeweide, Darm und Rektum. Die Erfindung betrifft auch pharmazeutische Zusammensetzungen zur Immunisierung von Säugern, umfassend ein erfindungsgemäßes Toxin-Antigen-Konjugat und einen pharmazeutisch verträglichen Träger, der zur transkutanen Verabreichung des Konjugats geeignet ist.
Bei einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung pharmazeutische Zusammensetzungen und Verfahren, die außerdem Adjuvantien umfassen. Ein Beispiel für ein Adjuvans ist KLH. Adjuvantien spielen bei der Verstärkung der Fähigkeit von Verbindungen zur wirksamen transkutanen Verabreichung eine kritische Rolle (Edelman Rev. Infec. Dis. (1980) 2: 370-383). Die Adjuvantien waren bereits bei der Entwicklung der transkutanen, z.B. transdermalen oder mukosalen, Wege als brauchbare und leicht verfügbare nicht invasive Methoden zur Verabreichung von Verbindungen an Säuger wichtig (Snider, Crit. Rev. Immunol. (1995) 14: 317–348). Geeignete Adjuvantien sind den Fachleuten gut bekannt.
Ein Verfahren zur Auslösung von Immunität in einem Säuger durch Verabreichung an einen Säuger einer therapeutisch wirksamen Menge eines erfindungsgemäßen Toxin- Antigen-Konjugats und eines pharmazeutischen Trägers, der zur Verabreichung an den Säuger geeignet ist, ist ebenfalls beschrieben. Vorzugsweise ist der Träger zur nasalen, oralen oder topischen Verabreichung geeignet. Zweckmäßigerweise kann das Verfahren außerdem die Verabreichung eines Adjuvans umfassen. Pharmazeutische Zusammensetzungen, die in einem Säuger Immunität auszulösen vermögen und eine wirksame Menge eines Toxin-Antigen-Konjugats und eines pharmazeutischen Trägers umfassen, sind ebenfalls beschrieben. Bevorzugte Träger umfassen diejenigen, die zur nasalen, oralen oder topischen Verabreichung des erfindungsgemäßen Konjugats an den Säuger geeignet sind.
Der Ausdruck "therapeutisch wirksame Menge" der Verbindung ist diejenige Menge, die notwendig oder ausreichend ist, um einen Antigen-verwandten Zustand zu behandeln oder zu verhindern, z.B. Verhinderung der verschiedenen morphologischen und somatischen Symptome eines Antigen-verwandten Zustands. Die wirksame Menge kann in Abhängigkeit von solchen Faktoren wie Größe und Gewicht des Individuums, Krankheitstyp oder dem bestimmten erfindungsgemäßen Konjugat variieren. Beispielsweise kann die Wahl des erfindungsgemäßen Konjugats diejenige Menge beeinflussen, die eine "wirksame Menge" ausmacht. Ein Fachmann wäre in der Lage, die zuvor erwähnten Faktoren zu studieren und die Bestimmung hinsichtlich der wirksamen Menge des erfindungsgemäßen Konjugats ohne übermäßiges Experimentieren vorzunehmen.
Ein Verfahren zur Präsentation von Antigenen auf Antigen-präsentierenden Zellen, das das Zusammenbringen der Antigen-präsentierenden Zellen mit einem Toxin-Antigen-Konjugat umfasst, derart, dass die Antigen-präsentierenden Zellen die Antigene präsentieren, ist ebenfalls beschrieben. Die Antigene sind vorzugsweise Tumor-Antigene, z.B. Melanom-Antigene. Es wird beispielsweise angenommen, dass die B-Untereinheit von Verotoxin sowohl die Oberflächenpräsentation des Antigens durch dendritische Zellen als auch das intrazelluläre Verarbeiten der Antigen stimulieren kann.
Der Begriff "Antigen-präsentierende Zellen" umfasst diejenigen Zellen, die Antigene oder Antigen-Fragmente aufweisen. Beispiele für Antigen-präsentierende Zellen umfassen einige periphere mononukleäre Blutzellen und vorzugsweise dendritische Zellen, z.B. Langerhans-Zellen.
Bei einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung, die ein Toxin-Antigen-Konjugat und einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfasst. Der Begriff "pharmazeutisch verträglicher Träger", wie hier verwendet, bedeutet ein pharmazeutisch verträgliches Material, eine pharmazeutisch verträgliche Zusammensetzung oder ein pharmazeutisch verträgliches Vehikel, wie eine Flüssigkeit oder ein fester Füllstoff, ein Verdünnungsmittel, ein Exzipiens, Lösungsmittel, oder ein Verkapselungsmaterial, das an der Beförderung und am Transport einer erfindungsgemäßen Verbindung (erfindungsgemäßen Verbindungen) in oder zu dem Individuum beteiligt ist, derart, dass sie ihre beabsichtigte Funktion durchführen kann (können). Typischerweise werden solche Verbindungen von einem Organ oder von einem Teil des Körpers zu einem anderen Organ oder zu einem anderen Teil des Körpers befördert oder transportiert. Jeder Träger muss in dem Sinn "verträglich" sein, dass er mit den anderen Bestandteilen der Formulierung kompatibel und für den Patienten nicht schädlich ist. Einige Beispiele für Materialien, die als pharmazeutisch verträgliche Träger dienen können, umfassen: Zucker, wie Lactose, Glucose und Saccharose; Stärken, wie Maisstärke und Kartoffelstärke; Cellulose und ihre Derivate, wie Natriumcarboxymethylcellulose, Ethylcellulose und Celluloseacetat; Tragacanthpulver; Malz; Gelatine; Talk; Exzipientien, wie Kakaobutter und Suppositorienwachse; Öle, wie Erdnussöl, Baumwollsamenöl, Färberdistelöl, Sesamöl, Olivenöl, Maisöl, Sojaöl; Glycole, wie Propylenglycol; Polyole, wie Glycerin, Sorbit, Mannit und Polyethylenglycol; Ester, wie Ethyloleat und Ethyllaurat; Agar; Puffermittel, wie Magnesiumhydroxid und Aluminiumhydroxid; Alginsäure; Pyrogen-freies Wasser; isotonische Salzlösung; Ringer-Lösung; Ethylalkohol; Phosphatpufferlösungen; und andere nicht toxische kompatible Substanzen, die in pharmazeutischen Formulierungen eingesetzt werden.
Wie vorstehend ausgeführt, können bestimmte Konjugate eine basische funktionelle Gruppe, wie Amino oder Alkylamino, enthalten und sind somit in der Lage, mit pharmazeutisch verträglichen Säuren pharmazeutisch verträgliche Salze zu bilden. In dieser Hinsicht bezieht sich der Begriff "pharmazeutisch verträgliche Salze" auf relativ nicht toxische anorganische und organische Säure-Additionssalze der hier beschriebenen Verbindungen. Diese Salze können in situ während der letzten Isolierung und Reinigung der Verbindungen oder durch getrenntes Umsetzen einer gereinigten Verbindung in ihrer freien Baseform mit einer geeigneten organischen oder anorganischen Säure und Isolierung des so gebildeten Salzes hergestellt werden. Repräsentative Salze umfassen die Hydrobromid-, Hydrochlorid-, Sulfat-, Bisulfat-, Phosphat-, Nitrat-, Acetat-, Valerat-, Oleat-, Palmitat-, Stearat-, Laurat-, Benzoat-, Lactat-, Phosphat-, Tosylat-, Citrat-, Maleat-, Fumarat-, Succinat-, Tartrat-, Naphthylat-, Mesylat-, Glucoheptanoat-, Lactobionat- und Laurylsulphonatsalze und dergleichen (Siehe z.B. Berge et al. (1977) "Pharmaceutical Salts", J. Pharm. Sci. 66: 1–19).
In anderen Fällen können die erfindungsgemäßen Verbindungen eine oder mehrere Säure-funktionelle Gruppen enthalten und sind somit in der Lage, mit pharmazeutisch verträglichen Basen pharmazeutisch verträgliche Salze zu bilden. Der Begriff "pharmazeutisch verträgliche Salze" bezieht sich in diesen Fällen auf relativ nicht toxische anorganische und organische Base-Additionssalze der hier beschriebenen Verbindungen. Diese Salze können gleichermaßen in situ während der letzten Isolierung und Reinigung der Verbindungen oder durch getrenntes Umsetzen der gereinigten Verbindung in ihrer freien Säureform mit einer geeigneten Base, wie das Hydroxid, Carbonat oder Bicarbonat eines pharmazeutisch verträglichen Metallkations, mit Ammoniak oder mit einem pharmazeutisch verträglichen organischen primären, sekundären oder tertiären Amin hergestellt werden. Repräsentative Alkali- oder Erdalkalisalze umfassen das Lithium-, Natrium-, Kalium-, Calcium-, Magnesium- und Aluminiumsalz und dergleichen. Repräsentative organische Amine, die zur Bildung von Base-Additionssalzen geeignet sind, umfassen Ethylamin, Diethylamin, Ethylendiamin, Ethanolamin, Diethanolamin, Piperazin und dergleichen.
Netzmittel, Emulgatoren und Gleitmittel, wie Natriumlaurylsulfat und Magnesiumstearat, sowie Farbmittel, Trennmittel, Überzugsmittel, Süßungsmittel, Aromastoffe und Duftstoffe, Konservierungsstoffe und Antioxidantien, können ebenfalls in den Zusammensetzungen vorhanden sein.
Beispiele für pharmazeutisch verträgliche Antioxidantien umfassen: wasserlösliche Antioxidantien, wie Ascorbinsäure, Cysteinhydrochlorid, Natriumbisulfat, Natriummetabisulfit, Natriumsulfat und dergleichen; öllösliche Antioxidantien, wie Ascorbylpalmitat, butyliertes Hydroxyanisol (BHA), butyliertes Hydroxytoluol (BHT), Lecithin, Propylgallat, Alphatocopherol und dergleichen und Metallchelatbildner, wie Citronensäure, Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), Sorbit, Weinsäure, Phosphorsäure und dergleichen.
Die hier beschriebenen Formulierungen umfassen diejenigen, die zur oralen, nasalen, topischen, transdermalen, buccalen, sublingualen, rektalen, vaginalen und/oder parenteralen Verabreichung geeignet sind. Die Formulierungen können zweckmäßigerweise in einer Darreichungsform dargereicht und durch aus der pharmazeutischen Technik gut bekannten Verfahren hergestellt werden. Die Menge an Wirkstoff, die mit einem Trägermaterial kombiniert werden kann, um eine Einzeldosisform herzustellen, ist im Allgemeinen diejenige Menge der Verbindung, die eine therapeutische Wirkung hervorruft. Im Allgemeinen reicht diese Menge, bezogen auf 100%, von etwa 1 bis etwa 99%, vorzugsweise von etwa 5 bis etwa 70%, am stärksten bevorzugt von etwa 10 bis etwa 30% Wirkstoff.
Verfahren zur Herstellung dieser Formulierungen oder Zusammensetzungen umfassen den Schritt des Kontaktierens einer hier beschriebenen Verbindung mit dem Träger und gegebenenfalls von einem oder mehreren Hilfsbestandteilen. Im Allgemeinen werden die Formulierungen durch gleichmäßiges und inniges Zusammenbringen einer hier beschriebenen Verbindung mit flüssigen Trägern oder fein zerteilten festen Trägern oder mit beidem und anschließend, sofern notwendig, Formen des Produkts hergestellt.
Die erfindungsgemäßen Formulierungen, die zur oralen Verabreichung geeignet sind, können in Form von Kapseln, Sachets, Pillen, Tabletten, Lutschpastillen (unter Verwendung einer aromatisierten Grundlage, im Allgemeinen Saccharose und Akaziengummi oder Tragacanth), Pulver, Granulatkörnern oder als Lösung oder Suspension in einer wässrigen oder nicht wässrigen Flüssigkeit oder als Öl-in-Wasser- der Wasser-in-Öl-Flüssigemulsion oder als Elixier oder Sirup oder als Pastillen (unter Verwendung einer inerten Base, wie Gelatine und Glycerin, oder Saccharose und Akaziengummi) und/oder als Mundspülungen und dergleichen, die jeweils eine zuvor festgelegte Menge einer hier beschriebenen Verbindung als Wirkstoff enthalten, vorliegen. Eine hier beschriebene Verbindung kann auch als Bolus, Klistier oder Paste verabreicht werden.
In den festen erfindungsgemäßen Darreichungsformen zur oralen Verabreichung (Kapseln, Tabletten, Pillen, Dragees, Pulver, Granulatkörner und dergleichen) ist der Wirkstoff mit einem oder mehreren pharmazeutisch verträglichen Trägern, wie Natriumcitrat oder Dicalciumphosphat, und/oder mit einem der Folgenden vermischt: Füllstoffe oder Streckmittel, wie Stärken, Lactose, Saccharose, Glucose, Mannit und/oder Kieselsäure; Bindemittel, wie beispielsweise Carboxymethylcellulose, Alginate, Gelatine, Polyvinylpyrrolidon, Saccharose und/oder Akaziengummi; Feuchthaltemittel, wie Glycerin; Zerfallshilfen, wie Agar-Agar, Calciumcarbonat, Kartoffel- oder Tapiocastärke, Alginsäure, bestimmte Silicate und Natriumcarbonat; Lösungsverzögerungsmittel, wie Paraffin; Absorptionsbeschleuniger, wie quaternäre Ammoniumverbindungen; Netzmittel, wie beispielsweise Cetylalkohol und Glycerinmonostearat; Absorbentien, wie Kaolin- und Bentonit-Ton; Gleitmittel, wie Talg, Calciumstearat, Magnesiumstearat, feste Polyethylenglycole, Natriumlaurylsulfat und Gemische davon; und Farbmittel. Im Falle von Kapseln, Tabletten und Pillen können die pharmazeutischen Zusammensetzungen auch Puffermittel umfassen. Feste Zusammensetzungen eines ähnlichen Typs können auch als Füllstoffe in Weich- und Hartgelatine-Füllkapseln unter Verwendung solcher Excipientien, wie Lactose oder Milchzucker, sowie hochmolekulare Polyethylenglycole und dergleichen eingesetzt werden.
Eine Tablette kann durch Pressen oder Formen, gegebenenfalls mit einem oder mehreren Hilfsbestandteilen hergestellt werden. Gepresste Tabletten können unter Verwendung eines Bindemittels (beispielsweise Gelatine oder Hydroxypropylmethylcellulose), Gleitmittels, inerten Verdünnungsmittels, Konservierungsstoffs, einer Zerfallshilfe (beispielsweise Natriumstärkeglycolat oder vernetzte Natriumcarboxymethylcellulose), oberflächenaktiven Mittels oder Dispersionsmittel hergestellt werden. Geformte Tabletten können durch Formen in einer geeigneten Maschine eines Gemisches der pulverisierten Verbindung, die mit einem inerten flüssigen Verdünnungsmittel angefeuchtet wird, hergestellt werden.
Die Tabletten und andere feste Darreichungsformen der hier beschriebenen pharmazeutischen Zusammensetzungen, wie Dragees, Kapseln, Pillen und Granulatkörner, können gegebenenfalls mit Überzügen und Schalen, wie magensaftresistente Überzüge und weitere Überzüge, die aus der pharmazeutischen Formulierungstechnik gut bekannt sind, gewonnen oder hergestellt werden. Sie können auch so formuliert werden, dass eine langsame oder kontrollierte Freisetzung des Wirkstoffs darin unter Verwendung beispielsweise von Hydroxypropylmethylcellulose in variierenden Anteilen unter Bereitstellung des gewünschten Freisetzungsprofils, anderen Polymermatrices, Liposomen und/oder Mikrokügelchen bereitgestellt wird. Sie können sterilisiert werden, beispielsweise durch Filtration über ein Bakterien-Rückhaltefilter oder durch Einarbeiten von Sterilisierungsmitteln in Form von sterilen festen Zusammensetzungen, die in sterilem Wasser gelöst werden können, oder eines anderen sterilen injizierbaren Mediums unmittelbar vor Gebrauch. Diese Zusammensetzungen können gegebenenfalls auch Trübungsmittel enthalten und können von einer Zusammensetzung sein, dass sie den (die) Wirkstoff e) nur oder vorzugsweise in einem bestimmten Teil des Gastrointestinaltrakts, gegebenenfalls verzögert, freisetzen. Beispiele für Einbettungszusammensetzungen, die angewandt werden können, umfassen polymere Substanzen und Wachse. Der Wirkstoff kann auch in mikroverkapselter Form, sofern angemessen, mit einem oder mehreren der oben beschriebenen Exzipientien vorliegen.
Flüssige Darreichungsformen zur oralen Verabreichung der erfindungsgemäßen Verbindungen umfassen pharmazeutisch verträgliche Emulsionen, Mikroemulsionen, Lösungen, Suspensionen, Sirupe und Elixiere. Zusätzlich zu dem Wirkstoff können die flüssigen Darreichungsformen inerte Verdünnungsmittel enthalten, die allgemein in der Technik angewandt werden, wie beispielsweise Wasser oder andere Lösungsmittel, Solubilisierungsmittel und Emulgatoren, wie Ethylalkohol, Isopropylalkohol, Ethylcarbonat, Ethylacetat, Benzylalkohol, Benzylbenzoat, Propylenglycol, 1,3-Butylenglycol, Öle (insbesondere Baumwollsamenöl, Erdnussöl, Maisöl, Keimöl, Olivenöl, Castoröl und Sesamöl), Glycerin, Tetrahydrofurylalkohol, Polyethylenglycole und Fettsäureester von Sorbitan und Gemische davon. Neben inerten Verdünnungsmitteln können die oralen Zusammensetzungen auch Hilfsstoffe umfassen, wie Netzmittel, Emulgatoren und Suspensionsmittel, Süssungsmittel, Aromastoffe, Farbmittel, Duftstoffe und Konservierungsstoffe.
Suspensionen können, zusätzlich zu den aktiven Verbindungen, Suspensionsmittel, wie beispielsweise ethoxylierte Isostearylalkohole, Polyoxyethylensorbit und Sorbintanester, mikrokristalline Cellulose, Aluminium, Metahydroxid, Bentonit, Agar-Agar und Tragacanth und Gemische davon, enthalten.
Die Formulierungen der hier beschriebenen pharmazeutischen Zusammensetzungen zur rektalen oder vaginalen Verabreichung können als Suppositorien dargereicht werden, die durch Mischen von einer oder mehreren erfindungsgemäßen Verbindungen mit einem oder mehreren geeigneten nicht reizenden Excipientien oder Trägern, die beispielsweise Kakaobutter, Polyethylenglycol, ein Suppositorienwachs oder ein Salicylat umfassen und die bei Raumtemperatur in fester Form vorliegen jedoch bei Körpertemperatur flüssig sind und darum im Rektum oder in der Vaginalhöhle schmelzen und die aktive Verbindung freisetzen, hergestellt werden können.
Die erfindungsgemäßen Formulierungen, die zur vaginalen Verabreichung geeignet sind, umfassen auch Pessare, Tampons, Cremes, Gele, Pasten, Schäume oder Sprayformulierungen, die solche Träger wie sie aus der Technik als geeignet bekannt sind, enthalten.
Darreichungsformen zur topischen oder transdermalen Verabreichung einer hier beschriebenen Verbindung umfassen Pulver, Sprays, Salben, Pasten, Cremes, Lotionen, Gele, Lösungen, Pflaster und Inhalantien. Die aktive Verbindung kann unter sterilen Bedingungen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger und mit beliebigen Konservierunsstoffen, Puffern oder Treibmitteln, die erforderlich sein können, gemischt werden.
Die Salben, Pasten, Cremes, und Gele können zusätzlich zu einer erfindungsgemäßen aktiven Verbindung, Exzipientien enthalten, wie tierische und pflanzliche Fette, Öle, Wachse, Paraffine, Stärke, Tragacanth, Cellulosederivate, Polyethylenglycole, Silicone, Bentonite, Kieselsäure, Talk und Zinkoxid oder Gemische davon.
Pulver und Sprays können zusätzlich zu einer erfindungsgemäßen Verbindung Exzipientien, wie Lactose, Talk, Kieselsäure, Aluminiumhydroxid, Calciumsilicate und Polyamidpulver oder Gemische von diesen Substanzen enthalten. Sprays können zusätzlich die üblichen Treibmittel enthalten, wie Chlorfluorkohlenwasserstoffe und flüchtige unsubstituierte Kohlenwasserstoffe, wie Butan und Propan.
Transdermalpflaster haben den zusätzlichen Vorteil der Bereitstellung einer kontrollierten Abgabe einer hier beschriebenen Verbindung an den Körper. Solche Darreichungsformen können durch Auflösen oder Dispergieren der Verbindung in dem entsprechenden Medium hergestellt werden. Auch Absorptionsverstärker können verwendet werden, um den Fluss der Verbindung über die Haut zu verstärken. Die Geschwindigkeit eines solchen Flusses kann entweder durch Bereitstellung einer Geschwindigkeits-kontrollierenden Membran oder durch Dispergieren der wirksamen Verbindung in einer polymeren Matrix oder einem Gel kontrolliert werden.
Ophthalmische Formulierungen, Augensalben, Pulver, Lösungen und dergleichen werden ebenfalls betrachtet.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen, die zur parenteralen Verabreichung geeignet sind, umfassen eine oder mehrere der hier beschriebenen Verbindungen in Kombination mit einer oder mehreren pharmazeutisch verträglichen sterilen isotonischen wässrigen oder nicht wässrigen Lösungen, Dispersionen, Suspensionen oder Emulsionen oder sterilen Pulvern, die unmittelbar vor Gebrauch zu sterilen injizierbaren Lösungen oder Dispersionen rekonstituiert werden können, die Antioxidantien, Puffer, Bakteriostatika, gelöste Stoffe, die die Formulierung mit dem Blut des beabsichtigten Empfängers isotonisch machen, oder Suspensions- oder Verdickungsmittel umfassen.
Beispiele für geeignete wässrige und nicht wässrige Träger, die in den hier beschriebenen pharmazeutischen Zusammensetzungen eingesetzt werden können, umfassen Wasser, Ethanol, Polyole (wie Glycerin, Propylenglycol, Polyethylenglycol und dergleichen), und geeignete Gemische davon, Pflanzenöle, wie Olivenöl, und injizierbare organische Ester, wie Ethyloleat. Eine angemessene Fluidität kann beispielsweise durch die Verwendung von Überzugsmaterialien, wie Lecithin, durch Aufrechterhalten der erforderlichen Teilchengröße im Falle von Dispersionen und durch die Verwendung von oberflächenaktiven Mitteln aufrechterhalten werden.
Diese Zusammensetzungen können auch Adjuvantien, wie Konservierungsstoffe, Netzmittel, Emulgatoren und Dispersionsmittel, enthalten. Die Verhinderung der Wirkung von Mikroorganismen kann durch Einschluss verschiedener antibakterieller und fungizider Mittel, beispielsweise Paraben, Chlorbutanol, Phenolsorbinsäure und dergleichen sichergestellt werden. Es kann auch erwünscht sein, isotonische Mittel, wie Zucker, Natriumchlorid und dergleichen, in die Zusammensetzungen einzuschließen. Zusätzlich kann eine verlängerte Absorption der injizierbaren pharmazeutischen Form durch den Einschluss von Mitteln erreicht werden, die die Absorption verzögern, wie Aluminiummonostearat und Gelatine.
In einigen Fällen ist es zur Verlängerung der Wirkung eines Arzneimittels erwünscht, die Absorption des Arzneimittels aus der subkutanen oder intramuskulären Injektion zu verlangsamen. Dies kann durch die Verwendung einer Flüssigsuspension von kristallinem oder amorphem Material mit schlechter Wasserlöslichkeit erreicht werden. Die Absorptionsgeschwindigkeit des Arzneimittels hängt dann von seiner Auflösungsgeschwindigkeit ab, die wiederum von der Kristallgröße und von der Kristallform abhängen kann. Alternativ wird eine verzögerte Absorption einer parenteral verabreichten Arzneimittelform durch Auflösen oder Suspendieren des Arzneimittels in einem öligen Vehikel erreicht.
Injizierbare Depotformen werden durch Formen von Mikroverkapselungsmatrices der betreffenden Verbindungen in biologisch abbaubaren Polymeren, wie Polylactid-Polyglycolid hergestellt. In Abhängigkeit von dem Verhältnis von Arzneimittel zu Polymer und von der Natur des bestimmten eingesetzten Polymers kann die Arzneimittelfreisetzungsgeschwindigkeit kontrolliert werden. Beispiele für andere biologisch abbaubare Polymere umfassen Poly(orthoester) und Poly(anhydride). Injizierbare Depotformulierungen werden auch durch Einschluss des Arzneimittels in Liposomen oder Mikroemulsionen, die mit Körpergewebe kompatibel sind, hergestellt.
Die hier beschriebenen Präparationen können oral, parenteral, topisch oder rektal gegeben werden. Natürlich werden sie in den Formen verabreicht, die für den jeweiligen Verabreichungsweg geeignet sind. Beispielsweise werden sie in Tabletten- oder Kapselform, durch Injektion, Inhalation, als Augenlotion, Salbe, Suppositorien, etc., Verabreichung durch Injektion, Infusion oder Inhalation; topisch durch Lotion oder Salbe; und rektal durch Suppositorien verabreicht. Die orale Verabreichung ist bevorzugt.
Die Begriffe "parenterale Verabreichung" und "parenteral verabreicht", wie hier verwendet, bezeichnen die Verabreichungsweisen, die anders sind als die enterale und topische Verabreichung, in der Regel durch Injektion, und umfassen, uneingeschränkt, eine intravenöse, intramuskuläre, intraarterielle, intrathekale, intrakapsuläre, intraorbitale, intrakardiale, intradermale, intraperitoneale, transtracheale, subkutane, subkutikuläre, intraartikuläre, subkapsuläre, subarachnoide, intraspinale und intrasternale Injektion und Infusion.
Die Begriffe "systemische Verabreichung", "systemisch verabreicht", "periphere Verabreichung" und "peripher verabreicht", wie hier verwendet, bedeuten die Verabreichung einer Verbindung, eines Arzneimittels oder eines anderen Materials, anders als direkt, in das Zentralnervensystem, derart, dass es in das System des Patienten eintritt und somit dem Metabolismus und anderen gleichartigen Prozessen unterworfen ist, beispielsweise die subkutane Verabreichung.
Diese Verbindungen können an Menschen und andere Tiere zur Therapie durch jeden geeigneten Verabreichungsweg verabreicht werden, einschließlich oral, nasal, wie beispielsweise ein Spray, rektal, intravaginal, parenteral, intrazisternal und topisch, wie durch Pulver, Salben oder Tropfen, einschließlich buccal und sublingual.
Ohne Rücksicht auf den gewählten Verabreichungsweg werden die hier beschriebenen Verbindungen, die in einer geeigneten hydratisierten Form verwendet werden können, und/oder die hier beschriebenen pharmazeutischen Zusammensetzungen durch herkömmliche, den Fachleuten bekannte Verfahren zu pharmazeutisch verträglichen Darreichungsformen formuliert.
Die tatsächlichen Dosierungskonzentrationen der Wirkstoffe in den erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen können variiert werden, so dass eine Menge des Wirkstoffs erhalten wird, die wirksam ist, um die gewünschte therapeutische Reaktion für einen bestimmten Patienten, eine bestimmte Zusammensetzung und eine bestimmte Verabreichungsweise zu erreichen, ohne für den Patienten toxisch zu sein.
Die gewählte Dosiskonzentration hängt von einer Vielzahl von Faktoren ab, einschließlich der Aktivität der bestimmten erfindungsgemäßen eingesetzten Verbindung oder des Esters, Salzes oder Amids davon, des Verabreichungsweges der Exkretionsgeschwindigkeit der bestimmten Verbindung, die eingesetzt wird, der Dauer der Behandlung, anderer Arzneimittel, Verbindungen und/oder Materialien, die in Kombination mit der bestimmten eingesetzten Verbindung verwendet werden, Alter, Geschlecht, Gewicht, Zustand, allgemeine Gesundheit und bisheriger medizinischer Historie des Patienten, der behandelt wird und gleichartiger, den medizinischen Fachleuten gut bekannter Faktoren.
Ein praktischer Arzt oder Tierarzt kann leicht die wirksame Menge der erforderlichen pharmazeutischen Zusammensetzung bestimmen und verschreiben. Beispielsweise könnte der Arzt oder Tierarzt mit Dosierungen der hier beschriebenen Verbindungen starten, die in der pharmazeutischen Zusammensetzung eingesetzt werden, deren Konzentrationen niedriger als erforderlich sind, um die gewünschte therapeutische Wirkung zu erzielen, und nach und nach die Dosis erhöhen, bis die erwünschte Wirkung erreicht ist.
Obgleich es für eine hier beschriebene Verbindung möglich ist, allein verabreicht zu werden, ist es bevorzugt, die Verbindung als pharmazeutische Zusammensetzung zu verabreichen. Bevorzugte pharmazeutische Zusammensetzungen umfassen diejenigen, die zur oralen, intradermalen oder intrabronchialen Verabreichung geeignet sind.
Antigene, z.B. Mage 1, entweder zusammen mit einem Toxin, z.B. der Verotoxin-B-Untereinheit, oder gekoppelt, z.B. durch kovalente Bindung an das Toxin, verabreicht, werden einem Individuum zur Stimulierung der Antigen-präsentierenden Fähigkeiten dendritischer Zellen, z.B. der Langerhans-Zellen, verabreicht und wirken als Impfstoff. Solche Impfstoffe können oral, transdermal oder intrabronchial verabreicht werden und sind in der Lage dendritische Zellen in dem Gewebe zu stimulieren gegenüber dem sie ausgesetzt werden.
Eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung eines Antigen-verwandten Zustands in einem Säuger ist ebenfalls beschrieben. Die pharmazeutische Zusammensetzung umfasst eine wirksame Menge eins Toxin-Antigen-Konjugats und eines pharmazeutisch verträglichen Trägers. Vorzugsweise ist der Antigen-verwandte Zustand ein Tumor, z.B. ein Melanom, und das Toxin-Antigen-Konjugat umfasst beispielsweise eine B-Untereinheit eines Verotoxins.
Ein Impfstoff zum Impfen eines Säugers, z.B. eines Menschen, gegen einen Antigen-verwandten Zustand, z.B. ein Tumor, der ein Toxin-Antigen-Konjugat und einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfasst, ist ebenfalls beschrieben.
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Verotoxin-B-Untereinheiten, und Hybrid-Zusammensetzungen, die die gesamte oder einen Teil einer Verotoxin-B-Untereinheit einschließen, um Immunzellen zu stimulieren, z.B. um die Antigen-präsentierende Funktion von Immunzellen zu stimulieren, z.B. um eine wirksame Impfstrategie bereitzustellen.
Bei bestimmten Ausführungsformen wird das B-Toxin von Verotoxin (VT) durch Verabreichung eines Holotoxins (z.B. VT1, VT2, VT2c, VT2e) an das Individuum verabreicht. Allerdings wird bei einer bevorzugten Ausführungsform die B-Untereinheit von Verotoxin ohne die toxischen Teile des VT-Holotoxins verabreicht, um dadurch die Holotoxin-Toxizität zu vermeiden. Es wird angenommen, dass die B-Untereinheit von Verotoxin sowohl die Oberflächenpräsentation des Antigens durch die dendritischen Zellen als auch die intrazelluläre Antigen-Prozessierung stimulieren kann.
Melanom-assoziierte Peptide, die mit der Verotoxin-B-Kette oder mit der Cholera-B-Kette verknüpft sind, werden dem Individuum als Antitumor-Impfstoffe verabreicht, indem dendritische Zellen stimuliert werden und eine aktive Präsentation solcher Antigene gegenüber Lymphozyten bereitgestellt wird. Bei einer bevorzugten Ausführungsform werden Tumor-Lysate mit der Verotoxin-B-Kette unter Anwendung von Techniken wie kovalente Bindungen, z.B. Cyanogenbromid-Aktivierung, verknüpft. Bei wieder einer anderen bevorzugten Ausführungsform werden Adjuvantien, z.B. KLH, mitverabreicht.
BEISPIELE
Majorhistokompatibilitätskomplex-Klasse-1-Präsentation von ezogenem löslichem Tumorantigen, das mit dem B-Fragment des Shigatoxins fusioniert ist: das Shigatoxin-B-Fragment lenkt exogenes Antigen in den MHC-Klasse-1-Präsentations-Reaktionsweg
Rekombinante Proteine, bestehend aus dem Shigatoxin-B-Fragment, das an ein CD8-Epitop fusioniert ist, das aus dem Mage-1-Tumorantigen stammt (van der Bruggen, P. et al., Science (1991) 254: 1643–1647), wurden konstruiert. Dieses Antigen, ursprünglich aus menschlichem Melanom kloniert, wird in Tumoren verschiedenen Ursprungs exprimiert. Keine Expression dieses Gens wurde bei einer großen Palette von normalem Gewebe festgestellt, mit der Ausnahme der Hoden, die keine MHC-Klasse-1-Moleküle exprimierten (van der Bruggen, P. et al., Science (1991) 254: 1643–1647). Die in vitro Fähigkeit dieses gentechnisch hergestellten Tumorantigens in einem auf die Klasse-1 beschränkten Reaktionsweg prozessiert und präsentiert zu werden, wurde erforscht.
Materialien und Methoden
Zellen
Periphere mononukleäre Blutzellen (PBMC) wurden von peripherem Blut von gesunden HLA-A1+-Spendern durch die Zentrifugation auf Ficoll-Hypaque-Gradienten abgetrennt. Die dendritischen Zellen, die in der vorliegenden Studie verwendet wurden, wurden aus PBMC, nach den bereits beschriebenen Protokollen (Sallusto, F. und Lanzavecchia, A., J. Exp. Med. (1994) 179: 1109–1118) erzeugt. Kurz gesagt, wurden adhärente Zellen nach zweistündiger Inkubation der durch Ficoll/Hypaque-Gradienten getrennten mononukleären Population in Plastikschalen erhalten. Diese Zellen wurden sodann in RPMI 1640-Medium, angereichert mit 10% Hitze-inaktiviertem fetalem Kälberserum, 2 mM L-Glutamin, 50 IU/ml Penicillin, 50 μg/ml Streptomycin, 5% Natriumpyruvat ("Komplettmedium") und 500 U/ml rekombinantem GM-CSF (Leucomax, Molgramostin, Sandoz Pharma, Basel, Schweiz) und 100 IU/ml IL4 (Diaclone, Besançon, Frankreich) kultiviert. Am dritten Tag wurden GM-CSF und IL4 erneut zugesetzt, und die am Tag 6–7 erhaltenen dendritischen Zellen wurden für die Antigen-Präsentationstests verwendet.
Die B-Lymphoblastoid-Zelllinie LB 705 (HLA-A1, A2, B8, B27) wurde bereits beschrieben (Van der Bruggen, P. et al. Eur. J. Immunol. (1994) 24: 3038–3043). Die EBV-transformierte B-Zelllinie BM 21 stammte aus einem homozygoten HLA-A1-Individuum (Yang, S. Y. et al., Immunobiology of HLA. (Springer-Verlag, New York: 1989)). Die HLA-A2-EBV-transformierte B-Zelllinie V.1 war eine Spende von Dr. U. Blank. Sämtliche B-Lymphoblastoid-Zelllinien wurden in Komplettmedium, angereichert mit 1 μM 2-Mercaptoethanol, gehalten.
MZ2 CTL82/30 bzw. LB373 CTL 246/15-Klone erkannten das 160-168-Peptid des Mage-1-Proteins einer HLA-A1 in begrenzter Weise (Traversari, C. et al., J. Exp. Med. (1992) 176: 1453–1457) und das 27–35-Peptid des Mart-1-Proteins einer HLA-A2 in begrenzter Weise (Coulle, P. G. et al., J. Exp. Med. (1994) 180: 35–42).
Die Kultivierung von CTL folgte den von Traversi et al. beschriebenen Protokollen mit leichten Änderungen (Traversari, C. et al., Immunogenetics (1992) 35: 145–152). Kurz gesagt, wurden 3 × 10⁵ CTL in 2 ml Iscove-Komplettmedium kultiviert, das L-Arginin (116 μg/ml), L-Asparagin (36 μg/ml) und L-Glutamin (216 μg/ml) enthielt, angereichert mit 10% menschlichem Pool-A-, Pool-B- und Pool-O-Serum (SAB) aus gesunden Spendern, und in Gegenwart von 10⁶ bestrahlten (100 Gy) LG-2 EBV Feederzellen, 10⁶ bestrahlten (30 Gy) allegorischen PBMC, PHA-L (5 μg/ml) und Il–2 (50 IU/ml). 3 oder 4 Tage nach der Stimulierung wurden die CTL in Kulturmedium, angereichert mit IL-2 (50 IU/ml), verdünnt. Die Stimulierung von CTL mit den Feederzellen wurde einmal wöchentlich wiederholt. Für die IFNγ-Tests wurden die CTL-Kulturen 6 Tage nach der letzten Restimulierung verwendet.
Plasmidkonstruktionen und Fusionspeptidherstellung
Die Konstruktion der auf pSU108-basierenden Plasmide, die das B-Fragment des Shigatoxins oder die Fusionsproteine exprimieren, in die eine N-Glycosilierungsstelle und ein aktives (KDEL) oder inaktives (KDELGL) Endoplasmatisches-Retikulum(ER)-Retrieval-Signal am C-Terminus des B-Fragments eingebracht wurde, wurden bereits beschrieben (Johannes, L. et al., J. Biol. Chem. (1997) 272: 19554–19561). Eine auf PCR basierende Strategie wurde zum Einbringen des Mage-1-Epitops und seiner 5'- und 3'-flankierenden Sequenzen (DVKEADPTGHSYVLG) in die Not-1-Stelle von zuvor konstruierten B-Glyc-KDEL- und B-Glyc-KDELGL-Expressionsvektoren verwendet. Die resultierenden Fusionsproteine wurden als B-Mage1-Glyc-KDEL und B-Mage1-Glyc-KDELGL bezeichnet. Die Sequenzen wurden durch die Sequenzierung der doppelsträngigen DNA überprüft. Die Proteine wurden in dem E. coli-Stamm DH5α exprimiert, und die Reinigung wurde im wesentlichen, wie beschrieben, vorgenommen. (Johannes, L. et al., J. Biol. Chem. (1997) 272: 19554–19561).
Kurz gesagt, wurden die periplasmatischen Extrakte nach der Herstellung auf eine QFF-Säule (Pharmacia) geladen und mit einem linearen NaCl-Gradienten (120 bis 400 mM) in 20 mM Tris/HCl, pH 7,5, eluiert. Die das Shiga-B-Mage-1-Fusionsprotein enthaltenden Fraktionen wurden gegen 20 mM Tris/HCl, pH 7,5, dialysiert, wieder auf eine Mono-Q-Säule (Pharmacia) geladen und wie zuvor eluiert.
Das Antennapedia-Mage-1 (Antp-Mage 1)-Fusionsgen wurde erhalten, indem synthetische Oligonucleotide, die das Mage-1-Epitop und seine 5'- und 3'-flankierenden Sequenzen (siehe vorstehend) codieren, zwischen die XhoI und BamHI Restriktionsstellen des PAH61S-Plasmids an Stelle der Rab3-codierenden Sequenz eingefügt wurden (Perez, F. et al., J. Cell. Sci. (1992) 102: 717–722). Ein NdeI-BamHI-Restriktionsfragment, das die Antp-Mage-1-Sequenz enthält, wurde sodann in das Novagen-Plasmid pET 2gb (+) (R&D System, London, UK) subkloniert, indem die Fusionsproteinexpression sich unter der Kontrolle des T7-Promotors befand und an seinem C-Terminus His-markiert war. Die Fusionspeptide wurden in dem E. coli-Stamm BL21 (DE3)Lys nach der IPTG-Induktion, wie beschrieben (Studier, F. W. et al., Methods in Enzymol. (1990) 185: 60-89) exprimiert. Das Antp-Mage-1-Protein wurde sodann auf Ni-NTA-Agarosegel (QIAGEN GmbH, Hilden, Deutschland) unter denaturierenden Bedingungen nach den Protokollen der Herstellerfirma gereinigt. Die resultierenden Fusionsproteine wurden durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese und Coomassie-Blau-Färbung auf 95%ige Reinheit geschätzt (1A, B und C).
Western Blot
Nach hochauflösender SDS-Polyacrylamigelelektrophorese wurden die Proteine auf eine Nitrocellulose-Membran (BA85, 0,45 mm, Schleicher & Schuell, Darsell, Deutschland) in Transferpuffer (192 mM Glycin, 25 mM Trisbase pH 8,3, 20 Ethanol) unter Verwendung der Transblot-Zelle (Bio-Rad) übergeführt. Anschließend wurde die Membran 1 h bei 37°C in 20 mM Tris (pH 7,4), 150 mM NaCl (Western-Puffer (WB)), 5% Rinderserumalbumin (BSA), 0,1% Tween 20 gesättigt und 18 h bei 4°C entweder mit dem monoklonalem Maus-Antikörper 13C4 (4 μg/ml) (ATCC, Rockville, USA, der gegen das B-Fragment des Shigatoxins gerichtet ist, für Shiga-B-Mage-1-Fusionsproteine oder mit dem Anti(His)₆-markierten Maus-Antikörper (1 μg/ml) (Dianova, Takara Biomedical Europe S. A., Genevilliers, Frankreich) für das Antp-Mage-1-Fusionsprotein inkubiert. Die Membranen wurden mit WB und 0,1% Tween 20 gewaschen und 1 h mit Anti-Maus-Immunglobulin, gekoppelt an Meerrettichperoxidase (Amersham, Les Ulis, Frankreich), inkubiert. Nach Waschen mit WB und 0,1% Tween 20 wurden die Filter mit dem Western-blotting-Reagens EC1 (Amersham) inkubiert, und die Chemiluminiszenz wurde durch Exposition der Membranen gegenüber Biomax-MR-Filme (Kodak) nachgewiesen.
Antigenische Peptide
Die synthetischen Peptide 27-35 Mart 1 (AAGIGILTV) und 160-168 Mage 1 (EADPTGMSY) wurden von Neosystem (Strasbourg, Frankreich) erhalten und stammten von bereits veröffentlichten Sequenzen (Traversari, C. et al. J. Exp. Med. (1992) 176: 1453–1457; Kawakami, Y. et al. J. Exp. Med. (1994) 180: 347–352).
Antigen-Präsentationstests
Die Antigen-präsentierenden Zellen (PBMC, B-EBV, T-Zellen oder dendritische Zellen) wurden in 96-Well-Flachboden-Mikroplatten mit 10⁵ Zellen/Vertiefung gegeben und bei 37°C 4 h oder 15 h mit Antigen in 100 μl Iscove-Medium ohne SAB gepulst. Am Ende der Inkubation wurde das Medium entfernt und 20.000 CTL-Klone in 100 μl CTL-Kulturmedium, das 25 Einheiten/ml IL2 enthält, jeder Vertiefung zugesetzt. Nach 24 h wurden 50 μl Überstand geerntet, und IFNγ wurde durch ELISA (Diaclone, Besançon, Frankreich) gemessen. Bei einigen Experimenten wurden die Zellen 10 min bei Raumtemperatur in 1% Paraformaldehyd fixiert und vor dem Transfer auf die Mikroplatten ausgiebig gewaschen. Wo angemessen, wurden Brefeldin A (Sigma) oder Chloroquine (Sigma) mit 2 μg/ml bzw. 250 μM 30 min vor Zugabe von Antigen zugesetzt und waren während der Antigen-prozessierenden Inkubation in der gleichen Endkonzentration vorhanden.
DTAF-Kupplung
B-Mage-1-Glyc-KDEL wurde im Wesentlichen wie bereits beschrieben an DTAF (5-(4,6-Dichlortriazin-2-yl)amino)fluorescin gekoppelt. Kurz gesagt wurden 60 μg rekombinantes B-Mage-1-Glyc-KDEL in 20 mM HEPES, pH 7,4, 150 mM NaCl zu 250 mM NaHCO₃ zugesetzt und ein 10-facher molarer Überschuss von DTAF (Sigma) und durch End-over-end-Rotation 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurden 0,2 mM NH₄Cl zugesetzt, und das gekoppelte Protein wurde über PD10-Säulen (Pharmacia) gereinigt.
Internalisierungs- und Immunfluoreszenz-Anfärbung
10⁵ 8-EBV BM 21-Zellen, gezüchtet auf runden 12 mm Polylysin-vorbehandelten Deckgläschen, wurden 45 min mit 1 μg/ml DTAF-markierten rekombinanten B-Mage-1-Glyc-KDEL auf Eis inkubiert. Nach dem Waschen wurden die Zellen 1 h bei 37°C inkubiert, 10 min mit 3% Paraformaldehyd fixiert, mit Saponin (0,01%) permeabilisiert, mit monoklonalem Anti-Lamp-2-Antikörper H4B4 (Pharmingen, San Diego) angefärbt und mit einem Texas-Rot-gekoppelten Anti-Maus-IgG-Antikörper (Jackson, West Grove, USA) nachgewiesen.
Konfokale Laser-scanning-Mikroskopie und Immunfluoreszenzanalyse wurden unter Verwendung eines konfokalen TCS4D-Mikroskops auf der Grundlage eines DM-Mikroskop mit einem Argon/Krypton-Laser (Johannes, L. et al., J. Biol. Chem. (1997) 272: 19554–19561) durchgeführt.
Ergebnisse
Biochemische Charakterisierung von Shiga-B-Mage-1- und Antp-Mage-1-Fusionsproteinen
Wie in 1A gezeigt, wandern Mage-1-enthaltende B-Fragment-Fusionsproteine, die ein aktives ER-Retrieval-Signal (das Tetrapeptid KDEL) oder eine inaktive Version dieses Signals (das Heptapeptid KDELGL) trugen, unter reduzierenden Bedingungen mit Molekulargewichten von etwa 11,3 kDa entsprechend ihren erwarteten Größen. Die Westernblot-Analyse mit einem monoclonalen Anti-B-Fragment-Antikörper (13C4) bestätigte die Identität sämtlicher gereinigter Shiga-B-Fusionsproteine (1B).
Die beiden Shiga-B-Mage-1-Fusionsproteine waren bereits nach der Reinigung teilweise gespalten und ergaben 9,5-kDa-Fragmente (1A–B). Es sollte allerdings angemerkt werden, dass die Mage-1-Sequenz innerhalb von B-Mage-1-Glyc-KDEL und B-Mage-1-Glyc-KDELGL liegt. Somit enthalten sie, auch wenn die C-terminale Spaltung für die Produktion der 9,5 kDa Fragmente verantwortlich war, wie an Hand ihrer Molekulargewichte beurteilt wurde, immer noch das Mage-1-Epitop.
Ein weiteres Fusionsprotein wurde konstruiert, indem das Mage-1-Peptid mit einem Polypeptid fusioniert war, das dem dritten Segment der Antennapedia homöo-Domäne entstammte (Perez, F. et al., J. Cell. Sci. (1992) 102: 717–722). Coomassie-Blau-Polyacrylamidgel-Anfärbung und Westernblot-Analyse identifizierten das rekombinante Antp-Mage-1-Protein als 15 kDa Polypeptid (1C).
Präsentation von ezogenen löslichen Shiga-B-Mage-1-Fusionsproteinen durch Klasse-1-Moleküle: Rolle der KDEl-Sequenz
Zur Bewertung des Potentials von exogenem Shiga-B-Mage-1-Fusionsprotein zum Antreiben der MHC-Klasse-1-Präsentation des internen Mage-1-Epitops wurden PBMC mit B-Mage-1-Glyc-KDEL gepulst. Wie in 2 gezeigt, präsentierten diese PBMCs wirksam das Mage 1-Peptid, das aus dem Shiga-B-Mage-1-Fusionsprotein stammte, gegenüber spezifischen CTLs auf eine auf HLA-A1 beschränkte Weise. Der Einfluss des KDEL-Signals auf die Effizienz der Präsentation wurde anschließend getestet. Sowohl die KDEL- als auch die KDELGL-tragenden Shiga-B-Mage-1-Fusionsproteine waren in der Lage, eine Mage-1-spezifische auf die HLA-Klasse-1-beschränkte CTL-Antwort zu aktivieren (2). Eine vergleichbare Aktivität der beiden Moleküle wurde ebenfalls festgestellt, wenn verschieden Konzentrationen von beiden Proteinen getestet wurden (Daten nicht gezeigt). Die Gegenwart des PBMC während des Experiments war notwendig, da die direkte CLT-Aktivierung durch Shiga-B-Mage-1-Fusionsproteine nicht auftrat (Daten nicht gezeigt).
Für die folgenden Experimente wurde nur Mage-1-Glyc-KDEL verwendet, da die Antigen-Präsentationsfähigkeit von KDEL- und KDELGL-tragenden Shiga-B-Mage-1-Fusionsproteinen äquivalent waren.
Analyse der MHC-Klasse-1-Präsentation von löslichem B-Mase-1-Glyc-KDEL-Protein durch verschiedene Antigen-präsentierende Zellen
Homogene Antigen-präsentierende Zellen wurden mit Shiga-B-Mage-1-Fusionsprotein sensibilisiert. Nach dem Pulsen von B-Lymphoblastoidzellen und dendritischen Zellen wurde die Aktivierung von auf die Klasse-1-beschränkten Mage-1-spezifischen CTL gezeigt (3). Diese Ergebnisse wurden mit 2 verschiedenen B-EBV-Zelllinien (EIM21 und LB 705) und dendritischen Zellen, die aus 2 HLA-A1-Spendern stammten, festgestellt. So wenig wie 0,2 μM Shiga-B-Mage-1-Protein reichte aus, um B-EBV-Zellen und dendritische Zellen für die Mage-1-Peptid-Präsentation zu sensibilisieren (3). Umgekehrt konnten T-Zell-Klone, die in vitro mit Shiga-B-Mage-1-Fusionsprotein sensibilisiert wurden, keine autologen T-Zell-Klone aktivieren 3. Die 82/30-klonierten T-Zellen, die für diese Studie als Antigen-präsentierende Zellen eingesetzt wurden, exprimierten HLA-A1-Molküle und präsentierten das synthetische Mage-1-Peptid (Daten nicht gezeigt).
Analyse der Spezifität der MHC-Klasse-1-Präsentation von Mage-1-Peptid, das aus ezogenem löslichem Shiga-B-Mage-1-Fusionsprotein stammt, durch B-Lymphoblastoid-Zelllinien
Ein exogener auf die Klasse 1 beschränkter Antigen-Präsentations-Reaktionsweg wird selten in B-EBV-Zellen beobachtet (Rock, K. L., Immunol. Today (1996) 17: 131–137; Watts, C., Annu. Rev. Immunol. (1997) 15: 821–850). Um die Rolle des Shigatoxin-B-Fragments bei diesem Prozess zu zeigen, wurde ein rekombinantes Protein produziert, indem das B-Fragment durch das dritte Segment der Antennapedia homöo-Domäne, ein Transkriptionsfaktor aus Drosophila, ersetzt war. Es hat sich gezeigt, dass diese Domäne einige Peptide in das Cytoplasma und den Nucleus von eukariotischen Zellen translociert (Perez, F. et al., J. Cell. Sci. (1992) 102: 717–722). In einigen Zelltypen war sie in dem MHC-Klasse-1-Reaktionsweges auch auf exogenes Antigen gerichtet (Shutze-Redelmeier, M. P. et al., J. Immunol. (1996) 157: 650-655). Wie in 4A gezeigt, konnte keine Präsentation des Mage-1-Peptids nachgewiesen werden, wenn das antp-Mage-1-Fusionsprotein zum Pulsen von HLA-A1-B-EBV-Zellen verwendet wurde. Wenn B-EBV-Zellen mit HLA-A2 Haplotyp mit Shiga-B-Mage-1-Protein sensibilisiert wurden, konnte keine Aktivierung von Mage-1-spezifischen CTL festgestellt werden (4A). Die Spezifität der Aktivierung wurde auch durch das Fehlen der Stimulierung von Mart-1-spezifischen CTL-Klonen, wenn HLA-A1- oder HLA-A2-B-EBV-Zellen mit Shiga-B-Mage-1-Fusionsprotein gepulst wurden, gestützt (4B). B-Glyc-KDEL ohne Mage-1-Epitop wurde von dem Mage-1-spezifischen CTL-Klon nicht erkannt (4A). Zusammen zeigen diese Daten eine spezifische HLA-A1-beschränkte Präsentation von Mage-1-Peptid, das aus dem Shiga-B-Mage-1-Fusionsprotein stammt.
Rolle der Internalisierung und intrazellulärer Prozessierung bei der MHC-Klasse-1-Präsentation von löslichem Shiga-B1-Mage-1-Fusionsprotein durch B-Lymphoblastoid-Zelllinien
Die Fähigkeit von rekombinantem Shiga-B-Mage-1-Fusionsprotein zum Lenken von internen Peptidepitopen in den Klasse-1-beschränkten Reaktionsweg und seine Abhängigkeit von der Internalisierung dieses Proteins wurden übergeprüft.
Paraformaldehyd fixierte B-Lymphoblastoidzellen gestatteten keine Präsentation von aus Shiga-B-Mage-1-stammendem Mage-1-Peptid gegenüber auf die Klasse 1 beschränkten Mage-1-spezifischen CTL-Klonen, wohingegen exogenes synthetisches Mage-1-Peptid, inkubiert mit fixierten B-ESBV-Zellen, diese CTL aktivierte (5A). Dies schloss die extrazelluläre Shiga-B-Mage-1-Verarbeitung als Erklärung für die festgestellte exogene auf HLA-Klasse-1-beschränkte Antigenpräsentation aus. Um weiterhin zu zeigen, dass der intrazelluläre Transport oder die intrazelluläre Prozessierung an diesem Modell der Antigenpräsentation beteiligt waren, wurde Brefeldin A (BFA), das den Proteintransport im biosynthetischen/sekretorischen Reaktionsweg blockiert, oder Chloroquin, das den pH-Wert der Endosomen erhöht und somit die endosomale Proteolyse hemmt, verwendet. Weder Chloroquin noch BFA interferierten mit der Präsentation von exogenem synthetischem Mage-1-Peptid (5B). Die Antigen-präsentierende Fähigkeit dieser Zellen wurde aufrechterhalten. Im Gegensatz dazu verhinderte die Gegenwart von BFA während der Inkubation von löslichem Shiga-B-Mage-1-Fusionsprotein die Präsentation des Mage-1-T-Zell-Epitops (5C). Diese Wirkung wurde mit Chloroquin nicht festgestellt. In Kontrollexperimenten war die gleiche Konzentration an Chloroquin zur Hemmung der auf die HLA-Klasse 2 begrenzten Präsentation von aus Tetanustoxin stammenden Peptiden wirksam (Daten nicht gezeigt).
Internalisierung von Shiga-B-Mage-1-Fusionsprotein in B-EBV-Zellen: Analyse seiner Colokalisation mit einem lyosomalen Marker
Zur Verfolgung des intrazellulären Transports von B-Mage-1-Glyc-KDEL in B-EBV-Zellen wurde das Protein kovalent mit dem Fluorophor DTAF verknüpft. Nach seinem Binden an Zellen auf Eis und anschließender Inkubation für 1 h bei 37°C wurde das Protein in Cytoplasmastrukturen mit einer markierten juxtanukleären Anfärbung (6A) internalisiert. Die Anfärbemuster entsprachen den Golgi- und ER-Kompartimenten, im Einklang stehend mit den früheren Studien an HeLa-Zellen (Johannes, L. et al., J. Biol. Chem. (1997) 272: 19554–19561). Unter Verwendung eines Antikörpers gegen das lyosomal assoziierte Membranprotein-2 (Lamp-2) (6B) in immunfluoreszierenden Doppelmarkierungsexperimenten war das Shiga-B-Mage-1-Fusionsprotein großenteils aus den Lamp-2-positiven lyosomalen Kompartimenten ausgeschlossen (6C).
Etwa 10 bis 20% der B-EBV-Zellen zeigten mittelmäßige bis starke B-Fragment-spezifische Anfärbung nach B-Mage-Glyc-KDEL-Internalisierung. Eine solche Heterogenität zwischen den Zellen einer gegebenen Population wurde bereits beschrieben (Sandvig, K. et al., J. Cell. Biol. (1994) 126: 53–64) und beruht auf Schwankungen in der Toxin-Rezeptor-Expression in der Funktion des Zellzyklus (Pudymaitis, A. und Lingwood, C. A., J. Cell. Physiol. (1992) 150: 632–639).
Diskussion
Es wurde bereits gezeigt, dass ein an das B-Fragment des Shigatoxins fusioniertes lösliches CD8-Tumor-Antigen in einer auf die HLA-Klasse 1 beschränkten Weise wirksam gegenüber spezifischen CTL präsentiert. Obwohl eine etwas partielle proteolytische Spaltung des gereinigten rekombinanten Proteins festgestellt wurde, ist aus den folgenden Gründen die extrazelluläre Prozessierung unwahrscheinlich: i) das CTL-Mage-1-Epitop liegt innerhalb des Shiga-B-Mage-1-Fusionsprotein und erfordert darum zwei oder mehrere getrennte und spezifische Spaltungsereignisse zur Generierung von HLA-A1-bindendem Mage-1-Peptid; ii) das Fehlen von Präsentation von Mage-1-Peptiden, die aus dem Shiga-B-Mage-1-Fusionsprotein durch T-Zellen stammen, die bei dem gleichen Experiment die Fähigkeit behielten, synthetische Mage-1-Peptide zu binden und zu präsentieren, mindert die extrazelluläre Spaltung (3); iii) Paraformaldehyd-fixierte Antigen-präsentierende Zellen waren in der Lage, synthetische exogene Mage-1-Peptide zu präsentieren, doch sie verarbeiteten keine Shiga-B-Mage-1-Fusionsproteine; iv) Brefeldin A verhinderte die Präsentation von Mage-1-Epitop, das aus löslichem Shiga-B-Mage-1-Protein stammt. Da Brefeldin A1 sowohl den Transport von Shiga-B-Mage-1 zu dem endoplasmatischen Retikulum (Johannes, L. et al., J. Biol. Chem. (1997) 272: 19554–19561) als auch die Assoziierung und den Transport von prozessierten Peptiden mit naszierenden Klasse-1-Molekülen zu der Plasmamembran hemmte (Monaco, J. J., Immunol. Today (1992) 13: 173–179) muss der genaue Mechanismus der Hemmung noch aufgeklärt werden. Allerdings zeigen die Experimente mit BFA, dass eine Internalisierung des Shiga-B-Mage-1-Fusionsproteins zur wirksamen, auf die HLA-Klasse 1 beschränkten Präsentation erforderlich ist.
Äquivalente
Die Fachleute erkennen oder sind unter Verwendung von nicht mehr als Routineexperimenten in der Lage, viele Äquivalente für die speziellen hier beschriebenen Ausführungsformen der Erfindung sicherzustellen. Solche Äquivalente sollen durch die folgenden Ansprüche mit umfasst sein.

Claims

Verwendung eines Toxin-Antigen-Konjugats, wobei das Toxin des Toxin-Antigen-Konjugats die Shiga-Toxin-B-Untereinheit oder die Verotoxin-B-Untereinheit ist, zur Herstellung eines Medikaments zur Stimulierung einer Immunantwort gegen das Antigen in einem Menschen, wobei das Medikament, das das Toxin-Antigen-Konjugat umfasst, an den Menschen so zu verabreichen ist, dass in dem Menschen. eine Immunantwort gegen das Antigen stimuliert wird.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Toxin-Antigen-Konjugat an den Menschen transkutan über die Haut oder eine Schleimhaut (Schleim-Membran) zu verabreichen ist; und gegebenenfalls entweder (a) das Toxin-Antigen-Konjugat transkutan über die Haut des Menschen verabreicht wird; oder (b) die Schleimhaut im Respirationstrakt, Gastrointestinaltrakt oder Reproduktionstrakt des Menschen lokalisiert ist; und weiterhin gegebenenfalls entweder (i) die Schleimhaut des Respirationstrakts aus der Schleimhaut von Nase, Hals oder Lungen des Menschen ausgewählt ist, oder (ii) die Schleimhaut des Gastrointestinaltrakts aus der Schleimhaut von Mund, Rachen, Magen, Dünndarm, Dickdarm, Kolon, Harnröhre oder Rektum des Menschen ausgewählt ist.
Verwendung nach Anspruch. 1, wobei das Toxin-Antigen-Konjugat ein Tumor-Antigen, ein Virus-Antigen oder ein Bakterien-Antigen umfasst; und gegebenenfalls entweder (a) das Tumor-Antigen aus einem Tumor-Lysat stammt; und weiterhin gegebenenfalls das Tumor-Antigen aus Lungengewebe, Hautgewebe, Brustgewebe, Magengewebe, Dickdarmgewebe, Rektumgewebe oder Gehirngewebe stammt; oder (b) das Tumor-Antigen ein Melanom-Antigen ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Toxin-Antigen-Konjugat über eine nicht-kovalente Wechselwirkung oder eine kovalente Bindung assoziiert ist; und gegebenenfalls entweder (a) die kovalente Bindung eine Cyanogenbromidbindung ist; oder (b) die nicht-kovalente Wechselwirkung eine Protein-Protein-Wechselwirkung, eine hydrophobe Wechselwirkung, eine Van-der-Waals-Wechselwirkung oder eine ionische Wechselwirkung ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei: (a) das Toxin-Antigen-Konjugat außerdem ein aktives oder inaktives endoplasmatisches Reticulum-Retrievalsignal umfasst; (b) das Medikament, das das Toxin-Antigen-Konjugat umfasst, an den Menschen mit einem Adjuvans verabreicht wird; (c) das Toxin-Antigen-Konjugat rekombinant hergestellt ist; (d) das Toxin-Antigen-Konjugat Verotoxin B und ein Tumor-Antigen umfasst; (e) die Immunantwort die Stimulierung von dendritischen Zellen umfasst und gegebenenfalls die dendritischen Zellen Langerhanssche Zellen einschließen; und/oder (f) das Toxin-Antigen-Konjugat an den Säuger nicht-invasiv zu verabreichen ist.
Verwendung eines Toxin-Antigen-Konjugats, wobei das Toxin des Toxin-Antigen-Konjugats die Shiga-Toxin-B-Untereinheit oder die Verotoxin-B-Untereinheit ist, zur Herstellung eines Medikaments, wobei das Medikament, das das Toxin-Antigen-Konjugat umfasst, zur Behandlung eines Antigen-bedingten Zustands in einem Säuger ausgelegt ist, umfassend Verabreichungen an den Säuger einer wirksamen Menge des Toxin-Antigen-Konjugats, Stimulierungen einer Immunantwort in dem Säuger gegen das Antigen und dadurch Behandeln des Antigen-bedingten Zustands in dem Säuger, wobei der Antigen-bedingte Zustand ein Tumor, eine Infektion ist.
Verwendung nach Anspruch 6, wobei: (a) das Toxin-Antigen-Konjugat an den Säuger transkutan über die Haut oder eine Schleimhaut des Säugers zu verabreichen ist; und gegebenenfalls entweder (i) das Toxin-Antigen-Konjugat transkutan über die Haut des Säugers zu verabreichen ist; oder (ii) die Schleimhaut im Respirationstrakt, Gastrointestinaltrakt oder Reproduktionstrakt des Säugers lokalisiert ist; (b) der Tumor ein Hauttumor, ein Gehirntumor, ein Lungentumor, ein Dickdarmtumor, ein Rektumtumor oder ein Brusttumor ist, und gegebenenfalls der Tumor ein Melanomtumor ist; (c) das Toxin-Antigen-Konjugat ein Melanomtumor-Antigen umfasst; (d) der Säuger ein Mensch ist; (e) außerdem umfassend die Verabreichung eines Adjuvans; (f) der Säuger an dem Antigen-bedingten Zustand leidet; (g) der Säuger nicht an dem Antigen-bedingten Zustand leidet; und/oder (h) das Toxin-Antigen-Konjugat nicht-invasiv zu verabreichen ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die ein Toxin-Antigen-Konjugat, wobei das Toxin des Toxin-Antigen-Konjugats die Verotoxin-B-Untereinheit ist, und einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfasst.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 8, wobei (a) die Zusammensetzung zur Verabreichung an einen Säuger transkutan über die Haut oder eine Schleimhaut des Säugers geeignet ist; und gegebenenfalls entweder (i) die Zusammensetzung zur Verabreichung transkutan über die Haut des Säugers geeignet ist; oder (ii) die Schleimhaut im Respirationstrakt, Gastrointestinaltrakt oder Reproduktionstrakt des Säugers lokalisiert ist; (b) das Toxin-Antigen-Konjugat ein Melanom-Antigen umfasst; (c) der pharmazeutisch verträgliche Träger zur oralen, transdermalen oder intrabronchialen Verabreichung geeignet ist; und/oder (d) der pharmazeutisch verträgliche Träger zur nicht-invasiven Verabreichung geeignet ist.