KR101671540B1 - 점막성 및 전신성 백신용 어주번트로서의 콜레라 독소 ａ 서브유닛의 ａ1 모이어티 - Google Patents

Abstract

본 발명은 콜레라 독소 CTA1 단백질 절편, 어주번트 조성물 및 백신을 위한 어주번트에 관한 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 면역조절제로서 단백질 형질도입 도메인 또는 세포-관통 펩티드를 함유하는 폴리펩티드에 접합된 재조합 CTA1 절편의 용도에 관한 것이다.

Description

점막성 및 전신성 백신용 어주번트로서의 콜레라 독소 Ａ 서브유닛의 Ａ1 모이어티{A1 MOIETY OF CHOLERA TOXIN A SUBUNIT AS AN ADJUVANT FOR MUCOSAL AND SYSTEMIC VACCINES}

본 발명은 그 전체가 인용에 의해 본 발명에 포함되어 있는 2008년 10월 21일자로 출원된 미국 가특허 출원 제61/107,179호에 대해 35 U.S.C. §119에 의한 우선권을 주장한다.

본 발명은 콜레라 독소 서브유닛 A1(CTA1) 단백질 절편, 어주번트(adjuvant) 조성물 및 백신을 위한 점막성 어주번트에 관한 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 면역조절제로서 단백질 형질도입 도메인(transduction domain)을 함유하는 폴리펩티드에 접합된 재조합 CTA1 절편의 용도에 관한 것이다.

점막 표면에서의 면역 반응의 중요한 측면은 분비성 IgA(S-IgA)가 생성된다는 것과 이것이 상피를 가로질러 운반된다는 것이다. 상기 S-IgA 반응은 바이러스 또는 박테리아 병원체에 의한 침입에 대한 첫 번째 방어 라인을 나타낸다. 점막성 면역 시스템은 이들 병원체로부터 숙주를 보호하는 기능을 하는 조직, 세포 및 반응(effector) 분자의 통합적인 네트워크이다. 특유의 상호연결된 점막의 유도 및 반응 부위가 존재하기 때문에, 상기 점막성 면역 시스템은 말초 면역 시스템과 분리된다. 따라서, 비경구 면역에 의해 말초 면역 반응을 유도하더라도 현저한 점막성 면역이 나타나지는 않는다; 그러나, 점막성 면역은 외부 분비 및 말초 면역 구획(compartment) 모두에서 보호성 면역을 유도할 수 있다[2,3].

점막성 경로의 백신화를 이용하는 첫 번째 이유는 대부분의 감염이 점막 표면에 영향을 미치거나 이로부터 시작되고, 이러한 감염에서 보호성 면역 반응을 유도하기 위하여 백신을 국소 적용하는 것이 종종 요구되고 있기 때문이다[1].

인간 치료용으로 동물 혈청을 생산하는 것에 대한 1920년대의 연구에서, 항원에 첨가된 어떤 물질, 특히 알루미늄염이 항체의 생산을 매우 향상시킨다는 것이 발견되었다. 즉, 이것이 어주번트로 작용한다. 선천성(innate) 면역 반응의 활성화는 어주번트 작용의 전제조건이며, 어떤 백신에서도 매우 요구되는 요소이다. 현재, 매우 제한된 스펙트럼의 백신 어주번트가 상업적으로 이용되며, 지금까지는 알루미늄염이 여전히 가장 큰 군이다. 면역 기억의 촉발과 발생을 유도하는 공정에 대한 최근의 이해로부터, 더 나은 어주번트를 제조하기 위한 상당한 노력이 있어왔다(Immunology 7'th edition, 18-19, 2006, Ivan Roitt et al.).

최근, 점막 조직에서 효과적인 면역 반응을 유도하기 위해 많은 노력이 집중되고 있다; 그러나, 대부분의 단백질 항원(Ag)은 점막성 경로를 통해 제공될 때에는 다소 약한 면역원이다. 이러한 관점에서, 콜레라 독소(CT)와 같은 점막성 어주번트의 동시투여는 Ag-특이적 점막성 면역 반응을 효과적으로 지원하는 것으로 나타났다. 따라서, 효과적이고 신뢰할 수 있는 점막성 어주번트의 개발이 새로운 세대의 백신을 위해 집중되고 있다[3].

CT는 5개의 GM1 결합(B) 도메인, 활성(A1) 서브유닛 및 A1을 5B 서브유닛에 결합시키는 가교 조각(bridging piece)(A2)을 함유한다. 세포 내로 들어간 후, 상기 A1 서브유닛은 NAD 유래의 ADP 리보오스를 포유동물 세포의 세포막의 안쪽에 위치하는 아데닐레이트 사이클라제 시스템(adenylate cyclase system)을 조절하는 Gs 단백질로 효소적으로 전달한다. 상기 A1 절편은 ADP-리보오스(ADPR)가 상기 조절 단백질에 부착하는 것을 촉매하여 Gs-ADPR을 형성하며, 이로 인해 GTP가 가수분해될 수 없다. GTP의 가수분해는 아데닐레이트 사이클라제를 불활성화시키는 사건이기 때문에, 상기 효소는 계속적으로 활성인 채로 남아 있게 되고, 아데닐레이트 사이클라제를 자극하며, 그 결과 많은 양의 세포내 사이클릭 AMP(cAMP)를 형성하게 된다[4].

cAMP의 증가는 종종 다양한 항원 제공 세포(APC, antigen presenting cell)에 의해 증가된 항원을 제공하는 것[5], B 세포에서 이소타입의 분화를 촉진하여 증가된 IgA의 형성을 유도하는 것[6], 및 APC 상의 CD80 및 CD86의 표면 발현을 상향조절(up-regulation)하는 것[7,8]과 같은 많은 면역 반응을 면역조절하는 작용을 한다.

CT는 IgG 및 IgA 면역 반응을 크게 향상시키는 강한 전신성 및 점막성 어주번트이다. 1980년대 이후, CT가 점막성 어주번트로 작용하는 능력이 다양한 Ag를 이용한 다수의 연구자에 의해 확증되어 왔다[9]. CT의 어주번트 특성은 생체내 및 시험관내 실험 시스템 모두를 이용한 마우스 모델에서 연구되어 왔다[10-13].

그러나, CT는 강력한 장독소이다. 예를 들면, 5 ng만큼 작은 경구 투여된 정제된 CT는 인간에서 현저한 설사를 유도하기에 충분하며, 이는 장독성이 CT를 실제로 사용함에 있어서 심각한 제한요인이 될 수 있음을 제시한다.

어주번트성으로부터 장독성을 분리하기 위한 몇 가지 연구가 수행되었다. CT 분자의 장독소 효과를 그 어주번트 활성으로부터 분리하려는 시도로서 CT의 돌연변이체를 구축하였다. 상기 두 분자의 활성 부위 및 프로테아제 부위 모두의 돌연변이가 조사되었고, 다수의 상이한 CT 돌연변이체의 특성이 분석되었다[15-17].

돌연변이체 CT(mCT; S61F 및 E112K)는 아데노신 디포스페이트-리보실화(ribosylation), 환형 아데노신 모노포스페이트의 형성 또는 접합된 회장 루프(ligated ileal loop)에서의 유체의 축적을 유도하는데 실패했으며, 따라서 비독성이었다[18]. 상기 mCT S61F는 또한 CD41을 유도함으로써 점막성 어주번트로 작용한다. Th2 세포는 Ag-특이적 점막성 S-IgA 뿐만 아니라 IgG1, IgE 및 IgA Ab 반응을 위한 효과적인 도움을 제공하는 IL-4, IL-5, IL-6 및 IL-10을 분비한다. mCT S61F 및 E112K의 점막성 어주번트 활성은 오브알부민(ovalbumin), 파상풍 독소 및 인플루엔자 바이러스를 포함하는 몇 가지 Ag을 이용하여 설명되어 왔다[18].

효소적으로 활성인 CTA1과 스타필로코커스 단백질 A의 Ig 결합 D 영역(DD)을 결합시킨 융합 단백질(CTA1-DD)은 가용성 단백질 Ag에 대한 특정 혈청뿐만 아니라 점막성 Ab 반응을 증가시키는 것으로 나타났다. CTA1-DD는, CTB를 갖고 있지 않아 GM1-강글리오사이드 수용체에 결합할 수 없는 B 세포 표적화된 융합 단백질 내에서, CTA1-서브유닛의 완전한 효소 활성을 유지한다[7,19].

CTA1-DD는 완전히 비독성인 것으로 나타났으며, 보다 선별적인 결합 특성에도 불구하고 온전한(intact) CT의 경우에 필적하는 점막성 및 전신성 어주번트 효과를 갖는다(미국 특허 제5,917,026호). 그러나, 후자의 구축물(construct)은 선별적인 세포 결합 모이어티(moiety)로서, 상기 CTA1 모이어티를 DD에 대한 수용체를 발현하는 세포, 구체적으로는 B 림프구 및 수지상세포의 부분모집단(subpopulation)으로 유도하기 위한 DD(스타필로코커스 아우레우스 단백질 A 결합 부위)를 나타낸다. 또한, CTA-DD는 CTA1 모이어티에 대한 높은 면역원성을 나타내었으며, 이러한 CTA1-특이적 혈청 Ab의 증가는 면역증강용 어주번트로 작용하는데 필수적이었다(20).

따라서, 점막성 및 전신성 면역 효과를 생성하기 위하여 백신에서 사용하기 위한 보다 효과적이고 신뢰할 수 있는 점막성 어주번트에 대한 계속적인 필요성이 있다.

한 구현예에서, 본 발명은 아미노 말단, 카르복시 말단 또는 아미노 및 카르복시 말단 모두에서 단백질 형질도입 도메인 또는 세포-관통(penetrating) 펩티드의 클래스(class)에 속하는 폴리펩티드에 접합되며, 콜레라 독소 A1 및 대장균 열-민감성(labile) 장독소로 이루어진 군으로부터 선택되는 박테리아 장독소의 A1 서브유닛을 포함하는 융합 단백질에 관한 것이다.

어떤 구현예에서, 상기 융합 단백질은 동시투여된 항원에 대한 면역 반응을 증가시킬 수 있다.

추가 구현예에서, 상기 장독소는 ADP 리보실 트랜스퍼라제 활성을 갖는 서브유닛을 포함한다. 어떤 구현예에서, 상기 서브유닛은 콜레라 독소의 ADP-리보실화 A1 서브유닛이다.

추가 구현예에서, 상기 장독소는 대장균 열-민감성 장독소의 ADP-리보실화 A1 서브유닛을 포함한다.

다른 추가 구현예에서, 상기 단백질 형질도입 도메인 또는 세포-관통 펩티드는 HIV-1 Tat 단백질 형질도입 도메인이다.

다른 추가 구현예에서, 본 발명은 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 단리된 폴리펩티드에 관한 것이다.

다른 추가 구현예에서, 본 발명은 본 발명에 개시된 임의의 융합 또는 재조합 단백질을 포함하는 백신 조성물에 관한 것이다.

추가 구현예에서, 본 발명은 (a) 본 발명에 개시된 융합 단백질 또는 폴리펩티드, (b) 항원 및 (c) 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 포함하는 백신 조성물에 관한 것으로서, 상기 (a) 및 (b)의 양은 조합하여 면역 반응을 일으키기에 효과적이다. 어떤 구현예에서, 상기 백신은 점막성 또는 전신성 경로에 의해 투여된다. 또 다른 구현예에서, 상기 백신은 점막성 면역 반응을 유도할 수 있다.

어떤 구현예에서, 상기 점막성 면역 반응은 분비성 항체 반응이다. 또 다른 구현예에서, 상기 점막성 면역 반응은 세포독성 T 림프구 반응이다.

다른 추가 구현예에서, 상기 백신은 전신성 면역 반응을 유도할 수 있다. 어떤 구현예에서, 상기 전신성 면역 반응은 혈청 항체 반응이다. 다른 추가 구현예에서, 상기 전신성 면역 반응은 세포독성 T 림프구 반응이다.

추가 구현예에서, 본 발명은 본 발명에 개시된 임의의 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 핵산 절편에 관한 것이다.

다른 추가 구현예에서, 본 발명은 본 발명에 개시된 임의의 핵산으로 형질전환된 숙주세포에 관한 것이다.

다른 추가 구현예에서, 본 발명은 본 발명에 개시된 임의의 핵산을 포함하는 발현 벡터에 관한 것이다.

다른 추가 구현예에서, 본 발명은 단백질 발현을 위한 적합한 조건 하에 본 발명에 개시된 임의의 숙주세포를 배양하는 단계를 포함하는 융합 폴리펩티드의 제조 방법에 관한 것이다.

다른 추가 구현예에서, 본 발명은 (a) 임의의 융합 단백질 또는 (b) 항원 및 선택적으로는 (c) 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 포함하는 면역성 조성물에 관한 것으로서, 상기 (a) 및 (b)의 양은 조합하여 면역 반응을 일으키기에 효과적이다.

다른 추가 구현예에서, 본 발명은 본 발명에 게시된 백신 또는 면역성 조성물을 포함하는 키트에 관한 것이다.

다른 추가 구현예에서, 본 발명은 본 발명에 개시된 융합 단백질 또는 폴리펩티드를 포함하는 키트에 관한 것이다.

다른 추가 구현예에서, 본 발명은 본 발명에 개시된 임의의 백신 또는 면역성 조성물을 효과량으로 투여하는 단계를 포함하는 병원성 장내 감염을 앓거나 병원성 장내 감염에 민감한 포유동물을 치료하는 방법에 관한 것이다.

다른 추가 구현예에서, 본 발명은 본 발명에 개시된 임의의 백신 또는 면역성 조성물을 효과량으로 투여하는 단계를 포함하는 포유동물의 면역 반응을 조절하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에 개시된 융합 단백질 또는 폴리펩티드 어주번트의 양은 용량 당 약 1 ㎍ 내지 1 ㎎ 범위의 양으로 백신 또는 면역성 조성물 내에 존재할 수 있다. 어떤 구현예에서, 상기 어주번트를 포함하는 백신은 0일에 시작한 후 14일 내지 28일에 재투여되고, 필요시 두 번째 투여 후 1 내지 6개월 후에 다시 투여되는 2 내지 3번의 투여와 같이 여러번 투여된다.

본 발명의 상기 및 다른 측면은 본 발명의 상세한 설명, 청구항 및 도면의 견지에서 본 기술분야의 당업자에게 있어서 자명할 것이다.

본 발명은 콜레라 독소 CTA1 단백질 절편, 어주번트 조성물 및 백신을 위한 점막성 어주번트에 관한 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 면역조절제로서의 재조합 CTA1 절편의 용도에 관한 것이다.

콜레라 독소(CT)는 강력한 점막성 어주번트이고, 동물 모델에서 가장 널리 사용되는 점막성 어주번트 중 하나이지만, 불행하게도 인간에서 점막용 백신을 위해 어주번트로 사용하기에는 독성이 매우 강하다. CT는 A1, A2 및 B 서브유닛으로 이루어진다. 상기 A1 서브유닛(CTA1)은 어주번트 활성을 갖고, B 서브유닛(CTB)은 모든 핵을 갖는 세포상의 GM1 강글리오사이드 수용체를 통해 세포막에 결합한다. CT의 서열은 메칼라노스, J.J. 등에 의해 개시되어 있다(Mekalanos, J.J., et al., Nature, 306, 551-557).

결합 후, CTA1은 세포 내로 이동된 후, 최종적으로 염소 및 물을 분비시켜 순차적으로 설사가 일어나도록 하는 cAMP 레벨을 증가시키는 일련의 사건을 유도한다. 본 발명에 개시된 바와 같이, 독성은 낮추지만 강력한 어주번트 활성은 갖고 있는 단백질 형질도입 도메인(PTD)으로 상기 CTB 서브유닛을 치환시킴으로써 콜레라 독소로부터 안전하고 효과적인 점막성 어주번트를 개발하기 위한 새로운 접근법이 개발되고 있다. 세포 흡수를 향상시키기 위하여, PTD는 CTA1의 N- 및 C-말단 모두에 부착(즉, 융합)되었다. CT와 달리, 상기 융합 단백질은 세포막 수용체에 결합하지 않고 세포 내로 들어갈 수 있으며, CTA1은 CTB에 의해 운반되는 CTA1과는 상이한 부위에 위치할 수 있다. 이후 그 구현예를 TCTA1T 또는 PTD-CTA1-PTD 또는 서열번호 5로 나타내게 되는 PTD CTA1 융합 단백질의 독성 및 어주번트 활성을 알부민과의 동시투여에 의해 CT와 비교하였다. 여기서, TCTA1T는 sIgA 및 IgG 항체 반응을 향상시키며, 이는 CT의 경우에 필적한다는 것이 발견되었다. TCTA1T는 대략 CT의 경우보다 폐에서 5배(IgG 클래스) 또는 10배(IgA 클래스)만큼 많은 항체 분비 세포(ASC, antibody-secreting cell)를 생성하였다. TCTA1T에 의해 발생한 생체내 CTL 활성은 CT의 경우보다는 약간 낮았지만, ADP 리보실트랜스퍼라제 활성에 대해 불활성인 돌연변이체 TmCTA1T의 경우 및 OVA를 단독으로 투여한 경우보다는 여전히 훨씬 높았다. 아울러, 인플루엔자 M2 단백질과 TCTA1T를 동시투여하면 살아있는 H1N1 바이러스를 이용한 치사적인(lethal) 챌린지에 대해서도 완전히 보호하였다. 아울러, CT와 대조적으로, TCTA1T는 발 부종(footpad edema)을 초래하지 않았고, 소장의 루프 분석(loop assay)에서 유체의 손실을 유도하는데 실패하였다. PTD 연장(extension)이 없는 CTA1은 또한 마우스에서 독성을 나타내지 않으면서 폐 및 비장 내의 혈청 IgG, 분비형 IgA 반응 및 항체 분비 세포의 확장을 향상시킴으로써 어주번트 활성을 보여주었다. 상기 결과는 TCTA1T 및 CTA1은 상당한 어주번트 활성을 갖지만, CT와 대조적으로 독성이 없는 것으로 보이고, 따라서 안전하고 효과적인 점막성 어주번트로 사용될 수 있음을 나타낸다.

생물학적 막을 가로지르는 효능을 갖는 단백질의 작은 영역 내의 세포-관통 펩티드 또는 단백질 형질도입 도메인(PTD)으로 불리는 펩티드 클래스의 동정은, 낮은 세포 관통을 갖는 거대분자를 상기 PTD와 접합시킴으로써, 상기 거대분자의 세포내 생체이용가능성(bioavailability)을 증가시키도록 하였다[21,22]. 세포막을 가로지르는 능력으로 인하여, 상기 PTD는 단백질의 세포내 기능을 연구하고 단백질의 잠재적인 임상적 이용성을 증가시키기 위한 강력한 수단을 제공한다. 아울러, 담체로서의 PTD는 핵산, 나노입자 및 리포좀을 포함하는 다른 거대분자로 확대된다[23-26]. 또한, 상기 PTD는, 항상은 아니지만 가장 빈번하게는 상기 거대분자를 세포질 및/또는 핵으로 운반하지 않는 엔도솜 경로를 통해, 접합된 거대분자가 세포 내로 들어가도록 한다는 것이 발견되었다.

HIV Tat를 효과적으로 운반하는 역할을 하는 PTD는 매우 염기성인 내부 도메인인 Tat(49-57)(RKKRRQRRR)이다. HIV-1 Tat PTD는 단독으로 또는 전장(full length) 단백질 또는 펩티드와 융합함으로써 세포의 세포막을 가로지를 수 있다. HIV-1 Tat PTD에 의한 형질도입은 고전적인 수용체, 운반체(transporter) 또는 엔도솜-매개성 방식으로 일어나지 않는다는 것이 제시되어 왔다.

C-말단에 PTD를 갖는 GFP 융합 단백질은 N-말단에 PTD에 의해 융합된 GFP 융합 단백질만큼 효과적으로 흡수되었지만, 양 말단에 PTD가 존재하면 흡수가 향상되는 것으로 나타났다[27].

CTA1은 3개의 독특한 서브도메인을 갖는 22 kDa의 ADP 리보실트랜스퍼라제이다: CTA11(1 내지 132번 잔기)은 독소의 촉매 코어(core)를 포함한다; CTA12(133번 내지 161번 잔기)는 짧고 유연한 서브도메인이다; 및 CTA13(162 내지 192번 잔기)은 CTA11과 접하고 있으며, 많은 소수성 잔기와 CTA2와의 이황화결합을 제공하는 하나의 시스테인 잔기를 갖는 구형의 영역이다. 상기 CTA1의 아미노산 서열은 공개되어 있으며, EU487781 및 GenBank ID(GI: 169247721)의 19 내지 212의 아미노산으로 나열되어 있다. 상기 5.5 kDa의 CTA2 폴리펩티드는 상기 B 모이어티와 많은 비공유 상호작용을 유지하며, 이로 인해 CT의 촉매성 및 세포-결합 성분 사이의 링커(linker)로 작용한다. CT의 호모펜타머성(homopentameric) B 모이어티는 11.6 kDa의 모노머로부터 조립되고, 진핵생물 세포막 상의 GM1 강글리오사이드에 결합하며, CTA1을 소포체(ER, endoplasmic reticulum)로 운반하기 위한 비히클(vehicle)로 작용한다.

콜레라 독소(CT)는 역행성 소낭 운행(retrograde vesicular traffic)에 의해 세포막으로부터 소포체(ER)로 이동한다. ER에서, 촉매성 CTA1 폴리펩티드는 나머지 독소로부터 분리되며, ER-연관성 분해(ERAD, ER-associated degradation)의 품질 관리 메카니즘(quality control mechanism)을 포함하는 과정에 의해 세포질로 들어간다. 이후, 세포질의 CTA1은 Gs를 ADP 리보실화하여, 아데닐레이트 사이클라제 활성과 표적 세포의 중독을 일으키게 된다. CTA1의 C-말단 A13 서브도메인이 상기 중독 과정에서 2가지 중요한 역할을 한다는 가설이 세웠졌다: (ⅰ) 이것은 ERAD 메카니즘을 촉발하는 소수성 도메인을 함유하고, (ⅱ) 이것은 CTA1의 분자병용(allosteric) 활성제로 기능하는 세포내 ADP-리보실화 인자(ARF, ADP-ribosylation factor)와의 상호작용을 촉진한다.

상기 결과에 기초하여, 본 발명자들은 상기 융합된 TCTA1T는 자연형의(native) CT와는 상이한 경로를 이용하여 세포에 들어가기 때문에 상피세포 내로 들어간 후에도 ADP 리보실 트랜스퍼라제 활성을 갖는 안전한 어주번트를 개발하였다. 어떤 구현예에서, 본 발명은 PTD CTA1 융합 단백질(TCTA1T)을 어주번트로 사용하는 용도에 관한 것이다. 추가 구현예에서, 본 발명은 자유로운 또는 비접합된 단백질로서 운반된, 또는 살아있는 약독화된 재조합 바이러스, 살아있는 약독화된 박테리아 또는 바이러스-유사 입자에 의해 발현되는 재조합 단백질의 형태로 CTA1을 어주번트로 사용하는 용도에 관한 것이다.

다른 구현예에서, 본 발명은 대장균의 열-민감성 내독소의 A1 서브유닛과 같은 ADP 리보실 트랜스퍼라제 활성을 갖는 폴리펩티드의 용도에 관한 것이다.

상기 TCTA1T 재조합 단백질은 CTA1 및 CTA1의 N- 및 C-말단 모두에서의 HIV Tat PTD로 이루어진다. 상기 분자는 세포막 수용체 또는 운반체에 결합하거나 엔도솜-매개성 운반에 의하지 않고 비특이적으로 살아있는 세포 내로 들어간다. 따라서, TCTA1T의 CTA1 모이어티는 수용체 매개성 엔도사이토시스(endocytosis)를 하기 위해 강글리오사이드 GM1 수용체를 이용하는 CT의 CTA1과는 상이한 세포내 부위에 위치할 것으로 기대된다.

상기 결과는 TCTA1T가 마우스에서 임의의 독성이 없이 강한 어주번트 활성을 갖는다는 것을 나타낸다.

어떤 구현예에서, 본 발명은 백신에 이용하기 위한 점막성 어주번트의 생성에 관한 것이다. 본 발명의 데이터는 TCTA1T가 sIgA 및 IgG 항체 반응, ASC 및 CTA 활성을 향상시킨다는 것을 보여준다. TCTA1T는 또한 이후의 치사적인 바이러스 챌린지에 대한 보호를 제공한다.

본 발명에 개시된 결과는 또한 강글리오사이드 GM1 수용체에 결합하기 위한 CTB가 없는 CTA1이 마우스에서 임의의 독성이 없이 강한 어주번트 활성을 갖는다는 것을 나타낸다. CTA1은 sIgA 및 IgG 항체 반응, ASC 및 CTL 활성을 향상시킨다.

본 발명은 또한 재조합 단백질, 바이러스 및/또는 박테리아의 형태로 CTA1을 면역조절제로 사용하는 용도에 관한 것이다.

본 발명에 따르면, 본 기술분야의 기술 내에는 분자 면역학, 세포 면역학, 약리학 및 미생물학에서 보통 사용되는 것들과 같은 다양한 수단과 기술이 있을 수 있다. 이러한 수단과 기술은 예컨대 다음의 문헌들에 상세히 개시되어 있다: Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3rd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, New York; Ausubel et al. eds. (2005) Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley and Sons, Inc.: Hoboken, NJ; Bonifacino et al. eds. (2005) Current Protocols in Cell Biology. John Wiley and Sons, Inc.: Hoboken, NJ; Coligan et al. eds. (2005) Current Protocols in Immunology, John Wiley and Sons, Inc.: Hoboken, NJ; Coico et al. eds. (2005) Current Protocols in Microbiology, John Wiley and Sons, Inc.: Hoboken, NJ; Coligan et al. eds. (2005) Current Protocols in Protein Science, John Wiley and Sons, Inc.: Hoboken, NJ; and Enna et al. eds. (2005) Current Protocols in Pharmacology, John Wiley and Sons, Inc.: Hoboken, NJ.

본 명세서에 개시된 약자는 측정 단위, 기술, 특성 또는 화합물에 해당하며, 다음과 같다: "min"은 분을 의미하고, "h"는 시간(들)을 의미하며, "㎕"는 마이크로리터(들)를 의미하고, "㎖"은 밀리리터(들)를 의미하며, "mM"은 밀리몰을 의미하고, "M"은 몰을 의미하며, "mmole"은 밀리몰(들)을 의미하고, "kb"는 킬로베이스를 의미하며, "bp"는 염기쌍(들)을 의미하고, "IU"는 국제 단위(International Unit)를 의미한다.

"중합효소 연쇄 반응"은 PCR로 줄여 쓴다; "역전사효소 중합효소 연쇄 반응"은 RT-PCR로 줄여 쓴다; "비번역 구역"은 UTR로 줄여 쓴다; "나트륨 도데실 설페이트"는 SDS로 줄여 쓴다; 및 "고압 액체 크로마토그래피"는 HPLC로 줄여 쓴다.

본 발명에서 사용된 것과 같은 DNA의 "증폭"은 DNA 서열의 혼합물 내에서 특정 DNA 서열의 농도를 증가시키기 위하여 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 사용하는 것을 나타낸다. PCR의 설명에 대해서는 Saiki et al., Science 1988, 239:487을 참조.

"폴리뉴클레오티드" 또는 "뉴클레오티드 서열"은 DNA 및 RNA와 같은 핵산 내의 일련의 뉴클레오티드 염기("뉴클레오티드"라고도 불림)로서, 둘 이상 뉴클레오티드의 임의의 사슬을 의미한다. 뉴클레오티드 서열은 전형적으로 단백질 및 효소를 만들기 위하여 세포 기계(cellular machinery)에 의해 사용되는 정보를 포함하는 유전 정보를 운반한다. 상기 용어들은 이중 또는 단일 가닥의 게놈 및 cDNA, RNA, 임의의 합성 및 유전적으로 조작된 폴리뉴클레오티드, 및 센스 및 안티센스 폴리뉴클레오티드 모두(비록, 센스 가닥만이 본 발명에서 나타나 있지만)를 포함한다. 이것은 단일 및 이중 가닥 분자들, 즉 DNA-DNA, DNA-RNA 및 RNA-RNA 하이브리드뿐만 아니라 염기를 아미노산 백본(backbone)에 접합시킴으로써 형성되는 "단백질 핵산"(PNA)을 포함한다. 이것은 또한 예를 들면 티오-우라실, 티오-구아닌 및 플루오로-우라실과 같은 변형된 염기를 함유하는 핵산을 포함한다.

본 발명에 있어서, 상기 핵산은 자연적 조절(발현 조절) 서열 옆에 있을 수 있으며, 또는 프로모터, 내부 리보솜 진입 부위(IRES) 및 다른 리보솜 결합 부위 서열, 인핸서, 반응 인자, 서프레서(suppressor), 신호 서열, 폴리아데닌화 서열, 인트론, 5' 및 3' 비코딩 영역 등을 포함하는 이형 서열과 연관될 수 있다. 상기 핵산은 또한 본 기술분야에 알려진 많은 수단에 의해 변형될 수 있다. 이러한 변형의 비제한적인 예는 메틸화, "캡(cap)", 하나 이상의 자연적으로 발생하는 뉴클레오티드를 유사체로 치환하는 것, 및 예를 들면 비전하성(uncharged) 결합을 갖는 변형(예컨대, 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 및 전하성 결합을 갖는 변형(예컨대, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)과 같은 뉴클레오티드 사이의 변형을 포함한다. 폴리뉴클레오티드는 예를 들면 단백질(예컨대, 뉴클레아제, 독소, 항체, 신호 펩티드, 폴리-L-라이신 등), 인터컬레이터(intercalator)(예컨대, 아크리딘, 소랄렌(psoralen) 등), 킬레이터(예컨대, 금속, 방사성 금속, 철, 산화성 금속 등) 및 알킬화제(alkylator)와 같은 하나 이상의 추가적인 공유결합된 모이어티를 함유할 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 메틸 또는 에틸 포스포트리에스테르 또는 알킬 포스포라미데이트 결합의 형성에 의해 유도될 수 있다. 아울러, 본 발명에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 또한 검출가능한 신호를 직접적으로 또는 간접적으로 제공할 수 있는 표지로 변형될 수 있다. 예시적인 표지는 방사성동위원소, 형광 분자, 바이오틴 등을 포함한다.

"핵산의 교잡(hybridization)"이란 용어는 A는 T(또는, RNA 핵산인 경우에는 U)와 쌍을 이루고 C는 G와 쌍을 이루는 두 개의 단일 가닥 핵산 사이의 역평행(anti-parallel) 수소결합을 나타낸다. 핵산 분자는 정해진 엄격성(stringency) 조건 하에 한 핵산 분자의 적어도 한 가닥이 다른 핵산 분자의 상보성 염기와 수소결합을 형성할 수 있을 때 서로 "교잡할 수 있다". 교잡의 엄격성은 예컨대 (ⅰ) 교잡 및/또는 세척이 수행되는 온도, (ⅱ) 이온의 세기 및 (ⅲ) 상기 교잡 및 세척 용액의 포름아미드와 같은 변성제의 농도뿐만 아니라 다른 파라미터(parameter)에 의해 결정된다. 교잡은 상기 두 개의 가닥이 실질적으로 상보적인 서열을 함유하는 것을 필요로 한다. 그러나, 교잡의 엄격성에 따라, 어느 정도의 불일치(mismatch)가 용인될 수도 있다. "낮은 엄격성" 조건 하에서는 더 큰 백분율의 불일치가 용인될 수 있다(즉, 역팽행 하이브리드의 형성을 방지하지 않을 것이다). Molecular Biology of the Cell, Alberts et al., 3rd ed., New York and London: Garland Publ., 1994, Ch. 7 참조.

전형적으로, 높은 엄격성으로 두 개의 가닥이 교잡하는 것은 그 서열이 그 길이의 연장된 부분에 걸쳐 높은 정도의 상보성을 나타내는 것을 필요로 한다. 높은 엄격성 조건의 예는 다음을 포함한다: 65℃에서 0.5 M NaHPO₄, 7% SDS, 1 mM EDTA에서 필터-결합 DNA에 대해 교잡한 후, 68℃에서 0.1×SSC/0.1% SDS(1×SSC는 0.15 M NaCl, 0.15 M 나트륨 시트레이트) 또는 올리고뉴클레오티드 분자인 경우에는 약 37℃(약 14 뉴클레오티드 길이의 올리고인 경우), 약 48℃(약 17 뉴클레오티드 길이의 올리고인 경우), 약 55℃(20 뉴클레오티드 길이의 올리고인 경우) 및 약 60℃(23 뉴클레오티드 길이의 올리고인 경우)에서 6×SSC/0.5% 나트륨 피로포스페이트로 세척함. 따라서, "높은 엄격성의 교잡"이란 용어는 두 개의 가닥이 그 뉴클레오티드 서열이 거의 완전히 상보적일 때에만 "교잡" 나선을 형성하도록 쌍을 이루는 용매와 온도의 조합을 나타낸다(Molecular Biology of the Cell, Alberts et al., 3rd ed., New York and London: Garland Publ., 1994, Ch. 7 참조).

중간 또는 보통의 엄격성 조건(예를 들면, 65℃에서 2×SSC의 수용액; 다른 한편으로, 예를 들면, 65℃에서 0.5 M NaHPO₄, 7% SDS, 1 mM EDTA에서 필터-결합 DNA에 대해 교잡한 후 42℃에서 0.2×SSC/0.1% SDS로 세척하는 것) 및 낮은 엄격성 조건(예를 들면, 55℃에서 2×SSC의 수용액)은 두 개의 서열 사이에 교잡이 일어나기 위한 해당 전체 상보성이 낮은 것을 필요로 한다. 임의의 주어진 엄격성 교잡 반응을 위한 특정 온도 및 염 조건은 표적 DNA의 농도 및 탐침의 길이 및 염기 조성에 의존하며, 보통 일상적인 예비 실험에서 경험적으로 결정된다(Southern, J. Mol . Biol . 1975; 98: 503; Sambrook et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 2nd ed., vol. 2, ch. 9.50, CSH Laboratory Press, 1989; Ausubel et al. (eds.), 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, Green Publishing Associates, Inc., and John Wiley & Sons, Inc., New York, at p. 2.10.3 참조).

본 발명에서 사용된 것과 같이, "표준 교잡 조건"이란 용어는 적어도 75%의 서열 동질성을 갖는 서열이 교잡되도록 하는 교잡 조건을 나타낸다. 특정 구현예에 따르면, 높은 엄격성의 교잡 조건은 적어도 80%의 서열 상동성, 적어도 90%의 서열 상동성, 적어도 95%의 서열 상동성 또는 적어도 99%의 서열 상동성을 갖는 서열만을 교잡하도록 하기 위해 사용될 수 있다.

본 발명의 임의의 원하는 핵산에 "교잡하는" 핵산 분자는 임의의 길이일 수 있다. 한 구현예에서, 이러한 핵산 분자는 적어도 10개, 적어도 15개, 적어도 20개, 적어도 30개, 적어도 40개, 적어도 50개 및 적어도 70개의 뉴클레오티드 길이이다. 다른 구현예에서, 교잡하는 핵산 분자는 특정한 원하는 핵산과 거의 동일한 길이이다.

"단리된(isolated)"이란 용어는 대상 물질이 보통 발견되는 환경으로부터 상기 대상 물질이 제거되는 것을 의미한다. 따라서, 단리된 생물학적 물질은 세포 성분, 즉 상기 물질이 발견되거나 제조되는 세포의 성분이 없을 수 있다. 단리된 핵산 분자는 예를 들면 PCR 생성물, 단리된 mRNA, cDNA 또는 제한효소 절편을 포함한다. 또한, 단리된 핵산 분자는 예를 들면 플라스미드, 코스미드, 인공 염색체 등에 삽입된 서열을 포함한다. 단리된 핵산 분자는 상기 핵산 분자가 발견될 수 있는 게놈으로부터 절단되는 것이 바람직하며, 비조절성 서열, 비코딩 서열 또는 상기 게놈 내에서 발견될 때 상기 핵산 분자의 상류 또는 하류에 위치하는 다른 유전자에 더 이상 결합되어 있지 않는 것이 더욱 바람직하다. 단리된 단백질은 세포 내에서 상기 단백질이 연관되어 있는 다른 단백질 또는 핵산 또는 이들 모두, 또는 만일 막-연관 단백질이라면 세포막과 연관될 수 있다.

상태, 질병 또는 증상의 "처리" 또는 "치료"는 다음을 포함한다:

(1) 상기 상태, 질병 또는 증상의 임상 또는 준임상 증후가, 상기 상태, 질병 또는 증상을 앓거나 이에 취약할 수 있지만 상기 상태, 질병 또는 증상의 임상 또는 준임상 징후를 아직 경험하거나 나타내지 않은 포유동물에서 나타나는 것을 방지하거나 늦추는 것; 또는

(2) 상기 상태, 질병 또는 증상을 억제하는 것, 즉 상기 질환 또는 그의 재발(유지 치료의 경우) 또는 적어도 그의 임상 또는 준임상 징후 중 하나의 발생을 저지, 감소 또는 지연시키는 것; 또는

(3) 상기 질환을 경감시키는 것, 즉 상기 상태, 질병 또는 증상 또는 적어도 그의 임상 또는 준임상 징후 중 하나의 퇴행(regression)을 초래하는 것.

치료되는 대상에 대한 이점은 통계학적으로 유의미하거나, 적어도 환자 또는 의사에게 인지가능한 것이다.

"면역 반응"은 숙주에서 관심있는 조성물 또는 백신에 대해 세포성 및/또는 항체-매개성 면역 반응이 발생하는 것을 나타낸다. 이러한 반응은 보통 상기 관심있는 조성물 또는 백신 내에 포함되는 항원 또는 항원들을 특이적으로 겨냥하는 항체, B 세포, 헬퍼(hepler) T 세포 및/또는 세포독성 T 세포를 생성하는 대상으로 이루어진다. 또한, 상기 면역 반응은 그 활성이 관심있는 생물체를 넘어서는 것으로서, 다른 면역 또는 알레르기 반응을 억제할 수 있는 조절성 T-세포를 포함할 수 있다.

"치료학적 유효량"은 상태, 질병 또는 증상을 치료하기 위해 포유동물에 투여될 때 화합물, 어주번트 또는 백신 조성물이 이러한 치료에 효과를 나타내기에 충분한 양을 의미한다. 상기 "치료학적 유효량"은 투여되는 화합물, 박테리아 또는 유사체뿐만 아니라 상기 질환 및 그 중증도(severity), 치료되는 포유동물의 연령, 중량, 물리적 증상 및 반응성에 따라 달라질 것이다.

"예방학적 유효량"은 용량 및 필요한 기간 동안 원하는 예방 결과를 달성하기 위한 유효량을 나타낸다. 전형적으로, 예방학적 용량은 질환의 이전 또는 초기 단계에 사용되기 때문에, 예방학적 유효량은 상기 치료학적 유효량보다 적을 것이다.

본 발명에 의해 제공된 조성물을 치료용으로 사용하는 것이 가능하지만, 이를 약학적 제형, 예컨대 원하는 투여 경로 및 표준 약학적 실무와 관련하여 선택된 적합한 약학적 부형제(excipient), 희석제, 담체와의 혼합물로 투여하는 것이 바람직할 수 있다. 따라서, 한 측면에서, 본 발명은 적어도 하나의 활성형 조성물 또는 약학적으로 허용가능한 그의 유도체를 포함하며, 약학적으로 허용가능한 부형제, 희석제 및/또는 담체와 연관된 약학적 조성물 또는 제형을 제공한다. 상기 부형제, 희석제 및/또는 담체는 상기 제형의 다른 성분과 양립가능하고 그 수용자에게 해롭지 않는다는 측면에서 "허용가능"해야 한다.

본 발명의 조성물은 인간 또는 척추동물 약물에서 사용하기 위하여 임의의 편리한 방식으로 투여하기 위해 제형화될 수 있다. 따라서, 본 발명은 그 범위 내에 인간 또는 척추동물 약물에서 사용하도록 적응된 본 발명의 생성물을 포함하는 약학적 조성물을 포함한다.

바람직한 구현예에서, 상기 약학적 조성물은 액체 경구용 제형으로 편리하게 투여된다. 상기 제형의 운반에는 물리적이 제약이 없지만, 경구 운반이 간편하고 편리하며, 경구용 제형은 우유, 야쿠르트 및 유아용 유동식과 같은 추가적인 혼합물을 즉시 수용하기 때문에 바람직하다. 다른 경구용 제형은 본 기술분야에 잘 알려져 있으며, 정제, 당의정, 젤캡(gelcap), 캡슐 및 의료용 식품을 포함한다. 예를 들면, 정제는 젖은, 건조된 또는 유동화된 베드(bed) 과립화 방법을 이용하는 잘 알려진 압착 기술에 의해 만들어질 수 있다.

이러한 경구용 제형은 하나 이상의 적합한 부형제, 희석제 및 담체의 도움으로 종래의 방식대로 사용하기 위해 제공될 수 있다. 약학적으로 허용가능한 부형제는 생물활성 물질을 위한 제형의 형성을 돕거나 형성하도록 하며, 희석제, 결합제, 윤활제, 활택제(glidant), 붕괴제(disintegrant), 발색제 및 다른 성분들을 포함한다. 보존제, 안정화제, 염료 및 심지어 향미제도 약학적 조성물 내에 제공될 수 있다. 보존제의 예는 나트륨 벤조에이트, 아스코르브산 및 p-히드록시벤조산의 에스테르를 포함한다. 항산화제 및 서스펜션제(suspending agent)도 사용될 수 있다. 부형제는 그 원하는 기능을 수행하는 것에 추가하여, 비독성이고, 섭취시 잘 견딜 수 있으며, 생물활성 물질의 섭취를 방해하지 않는다면 약학적으로 허용가능한 것이다.

치료학적 용도를 위해 허용가능한 부형제, 희석제 및 담체는 약학 분야에 잘 알려져 있으며, 예를 들면 Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott Williams & Wilkins (A.R. Gennaro edit. 2005)에 개시되어 있다. 약학적 부형제, 희석제 및 담체의 선택은 원하는 투여 경로 및 표준 약학적 실무와 관련하여 선택될 수 있다.

본 발명에서 사용된 것과 같이, "약학적으로 허용가능한"이란 표현은 일반적으로 생리학적으로 용인되는 것으로 간주되는 분자 엔티티(entity) 및 조성물을 나타낸다.

"환자" 또는 "대상"은 포유동물을 나타내며, 인간 및 척추동물 대상을 포함한다.

어주번트 제형 또는 상기 CTA1 어주번트를 함유하는 백신 조성물의 용량은 질환의 본성, 환자의 병력, 투여 빈도, 투여 방식, 숙주로부터의 상기 제제의 제거 등에 따라 매우 달라질 것이다. 초기 용량은 많고, 이후의 유지 용량은 작을 수 있다. 상기 용량은 효과적인 용량 레벨을 유지하기 위하여 매주 또는 격주로, 또는 더 작은 용량으로 분획화하여 매일, 주 2회 등과 같이 드물게 투여될 수 있다.

"담체"라는 용어는 상기 화합물과 함께 투여되는 희석제, 부형제 또는 비히클을 나타낸다. 이러한 약학적 담체는 물 및 땅콩유, 대두유, 미네랄 오일, 참깨유 등과 같은 석유, 동물, 식물 또는 합성 기원의 오일을 포함하는 오일과 같은 멸균된 액체일 수 있다. 물 또는 수용액, 생리식염수(saline) 용액 및 수성 덱스트로오스 및 글리세롤 용액이 특히 주사용 용액을 위한 담체로 바람직하게 도입된다. 다른 한편으로, 상기 담체는 하나 이상의 결합제(압착된 알약의 경우), 활택제, 캡슐화제, 향미제 및 발색제를 포함하는 고형 제형의 담체일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 적합한 약학적 담체는 E.W. Martin에 의한 "Remington's Pharmaceutical Sciences"에 개시되어 있다.

또한, 본 발명은 약학적 조성물 및 백신을 포괄한다. 본 발명의 약학적 조성물 및 백신 조성물은 적어도 하나의 상기 신규한 시겔라 항원 및 하나 이상의 어주번트와 함께 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함한다. 약학적 조성물 및 백신의 제형화 방법은 전술한 Remington의 문헌에 개시된 것과 같이 본 기술분야의 숙련된 당업자에게 잘 알려져 있다.

제형. 본 발명의 조성물은 약학적으로 허용가능한 희석제, 보존제, 가용화제, 에멀전화제, 어주번트 및/또는 담체를 포함할 수 있다. 이러한 조성물은 다양한 버퍼 내용물(예컨대, Tris-HCl, 아세테이트, 포스페이트), pH 및 이온 세기; 계면활성제 및 가용화제와 같은 첨가제(예컨대, 트윈 80, 폴리소르베이트 80), 항산화제(예컨대, 아스코르브산, 나트륨 메타비설파이트), 보존제(예컨대, 티메르솔, 벤질 알코올) 및 벌킹(bulking) 물질(예컨대, 락토오스, 만니톨); 상기 물질을 폴리아세트산, 폴리글리콜산 등과 같은 폴리머성 화합물의 특정 준비물 또는 리포좀 내로 포함시키는 것을 포함한다. 또한, 히알우론산도 사용될 수 있다. 예컨대, 인용에 의해 본 발명에 포함되어 있는 Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042) pages 1435-1712 참조.

본 발명에서 사용하기 위해 고려되는 것은 경구용 고형 제형이며, 인용에 의해 본 발명에 포함되어 있는 Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. 1990 (Mack Publishing Co. Easton PA 18042)의 Chapter 89에 일반적으로 개시되어 있다. 고형 제형은 정제, 캡슐, 알약, 트로키(troch), 로젠지(lozenge), 까세(cachet), 펠렛, 분말 또는 과립을 포함한다. 또한, 리포좀성 또는 단백질성 캡슐화가 본 발명의 조성물을 제형화하기 위해 사용될 수 있다(예를 들면, 미국 특허 제4,925,673호에 보고된 단백질성 마이크로스피어). 리포좀성 캡슐화가 사용될 수 있으며, 상기 리포좀은 다양한 폴리머로 유도될 수 있다(예컨대, 미국 특허 제5,013,556호). 치료제용으로 가능한 고형 제형은 인용에 의해 본 발명에 포함되어 있는 Marshall, K. In: Modern Pharmaceutics, Edited by G.S. Banker and C.T. Rhodes, Chapter 10, 1979에 개시되어 있다. 일반적으로, 상기 제형은 상기 치료제 및 위의 환경에 대해 보호하고 장내에서 생물학적 활성 물질을 방출하도록 하는 불활성 성분을 포함할 것이다.

또한, 본 발명에서 사용하기 위해 고려되는 것은 약학적으로 허용가능한 에멀전, 용액, 서스펜션 및 시럽을 포함하는 경구 투여용 액체 제형이며, 불활성 희석제; 어주번트, 습윤제, 에멀전화제 및 서스펜션제; 및 감미제, 향미제, 발색제 및 향수제를 포함하는 다른 성분을 함유할 수 있다.

경구용 제형의 경우, 방출 위치는 위, 소장(십이지장, 공장(jejunum), 회장(ileum)), 대장 또는 구강의 점막일 수 있다. 본 기술분야의 숙련된 당업자는 예컨대 장용 코팅(enteric coating)을 사용함으로써 위에서는 용해되지 않지만 그 물질을 장내의 십이지장 또는 다른 곳에 방출하는 제형을 이용할 수 있다. 장용 코팅으로 사용되는 보다 일반적인 불활성 성분의 예는 셀룰로오스 아세테이트 트리멜리테이트(CAT), 히드록시프로필메틸셀룰로오스 프탈레이트(HPMCP), HPMCP 50, HPMCP 55, 폴리비닐 아세테이트 프탈레이트(PVAP), 유드라짓(Eudragit) L30D, 아쿠아테릭(Aquateric), 셀룰로오스 아세테이트 프탈레이트(CAP), 유드라짓 L, 유드라짓 S 및 쉘락(Shellac)이다. 이들 코팅은 혼합된 필름으로 사용될 수 있다.

또한, 코팅 또는 코팅의 혼합물은 위에 대한 보호를 목적으로 하지 않는 정제 위에 사용될 수 있다. 이것은 당 코팅 또는 상기 정제를 삼키기 쉽게 만드는 코팅을 포함할 수 있다. 캡슐은 건조된 치료제(즉, 분말)의 운반용으로 경질의 쉘(hard shell)(예컨대, 젤라틴)로 이루어질 수 있거나, 액체 형태의 경우 연질 젤라틴 쉘이 사용될 수 있다. 까세의 쉘 물질은 두꺼운 전분 또는 다른 식용 종이일 수 있다. 알약, 로젠지, 성형된 정제 또는 정제 연마물의 경우, 습기 매싱 기술(moist massing technique)이 사용될 수 있다. 캡슐 투여용 물질의 제형은 또한 분말, 가볍게 압착된 플러그 또는 심지어 정제의 형태일 수 있다. 상기 치료제는 압착에 의해 제조될 수 있다.

당업자는 불활성 물질을 이용하여 치료제의 부피를 희석 또는 증가시킬 수 있다. 상기 희석제는 탄수화물, 특히 만니톨, β-락토오스, 무수 락토오스, 셀룰로오스, 수크로오스, 변형된 덱스트란 및 전분을 포함할 수 있다. 또한, 칼슘 트리포스페이트, 마그네슘 카보네이트 및 염화나트륨을 포함하는 특정 무기염도 충전제로 사용될 수 있다. 어떤 상업적으로 이용가능한 희석제는 Fast-Flo, Emdex, STA-Rx 1500, 엠콤프레스(Emcompress) 및 아비셀(Avicell)이다.

붕괴제는 치료제의 제형에서 고형 제형 내로 포함될 수 있다. 붕괴제로 사용되는 물질은 전분, 전분에 기반하는 시판되는 붕괴제, Explotab, 나트륨 전분 글리콜레이트, 앰버라이트(Amberlite), 나트륨 카르복시메틸셀룰로오스, 울트라밀로펙틴, 나트륨 알기네이트, 젤라틴, 오렌지 필, 산 카르복시메틸 셀룰로오스, 자연형 스폰지 및 벤토나이트를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니며, 이들 모두 사용될 수 있다. 상기 붕괴제는 또한 불용성 양이온성 교환 수지일 수 있다. 분말화된 검이 붕괴제 및 결합제로 사용될 수 있으며, 아가, 카라야(Karaya) 또는 트라가칸트(tragacanth)와 같은 분말화된 검을 포함할 수 있다. 알긴산 및 그 나트륨염 또한 붕괴제로 유용하다. 결합제는 치료제와 함께 잡아서 경질 정제를 형성하는데 사용될 수 있으며, 아카시아, 트라가칸트, 전분 및 젤라틴과 같은 천연 생성물 유래의 물질을 포함한다. 다른 것들로는 메틸 셀룰로오스(MC), 에틸 셀룰로오스(EC) 및 카르복시메틸 셀룰로오스(CMC)를 포함한다. 폴리비닐 피롤리돈(PVP) 및 히드록시프로필메틸 셀룰로오스(HPMC) 모두 알코올성 용액 내에서 상기 펩티드(또는 유도체)를 과립화하는데 사용될 수 있다.

제형 공정 동안에 들러붙는 것을 방지하기 위하여 감마제(antifrictional agent)가 상기 제형 내에 포함될 수 있다. 윤활제가 상기 펩티드(또는 유도체)와 다이 벽(die wall) 사이에 층으로서 사용될 수 있으며, 윤활제는 그 마그네슘 및 칼슘염을 포함하는 스테아르산, 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE), 액체 파라핀, 식물성 오일 및 왁스를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 나트륨 라우릴 설페이트, 마그네슘 라우릴 설페이트, 다양한 분자량의 폴리에틸렌 글리콜, 카르보왁스(Carbowax) 4000 및 6000과 같은 가용성 윤활제가 사용될 수 있다.

제형화하는 동안에 약물의 유동 특성을 개선하고 압착하는 동안에 재배열을 도와줄 수 있는 활택제가 첨가될 수 있다. 상기 활택제는 전분, 탈크, 발열성 실리카 및 수화된 실리코알루미네이트를 포함할 수 있다.

수성 환경 내로 치료제가 용해되는 것을 돕기 위하여, 계면활성제가 습윤제로 첨가될 수 있다. 계면활성제는 나트륨 라우릴 설페이트, 디옥틸 나트륨 설포숙시네이트 및 디옥틸 나트륨 설포네이트와 같은 음이온성 세제(detergent)를 포함할 수 있다. 양이온성 계면활성제가 사용될 수 있으며, 벤즈알코니움 클로라이드(benzalkonium chloride) 또는 벤즈에토미움 클로라이드(benzethomium chloride)를 포함할 수 있다. 계면활성제로 제형 내에 포함될 수 있는 잠재적인 비이온성 세제의 리스트는 라우로매크로골(lauromacrogol) 400, 폴리옥실 40 스테아레이트, 폴리옥시에틸렌 수화된(hydrogenated) 피마자유 10, 50 및 60, 글리세롤 모노스테아레이트, 폴리솔베이트 40, 60, 65 및 80, 수크로오스 지방산 에스테르, 메틸 셀룰로오스 및 카르복시메틸 셀룰로오스이다. 이들 계면활성제는 단독으로 또는 상이한 비의 혼합물로 상기 단백질 또는 유도체의 제형 내에 존재할 수 있다.

방출이 조절되는 경구용 제형이 본 발명을 실행함에 있어 사용될 수 있다. 상기 치료제는 확산 또는 예컨대 검과 같은 리칭(leaching) 메카니즘에 의해 방출을 허용하는 불활성 매트릭스 내로 포함될 수 있다. 천천히 줄어드는 매트릭스 또한 상기 제형 내에 포함될 수 있다. 어떤 장용 코팅은 또한 지연성 방출 효과를 갖는다. 다른 형태의 조절된 방출은 오로스(Oros) 치료 시스템(Alza Corp.)에 기반하는, 즉 상기 치료제가 삼투 효과로 인하여 단일한 작은 개구를 통해 물은 들어가고 제제는 밖으로 내보내도록 하는 반투과성 막 내에 들어 있는 방법에 의한 것이다.

다른 코팅이 상기 제형에 사용될 수 있다. 이들은 코팅 팬에 적용될 수 있는 다양한 당을 포함한다. 상기 치료제는 또한 필름 코팅된 정제 내에 제공될 수 있으며, 이 경우에 사용되는 물질은 2가지 군으로 나누어진다. 첫 번째는 비장용(nonenteric) 물질이며, 메틸 셀룰로오스, 에틸 셀룰로오스, 히드록시에틸 셀룰로오스, 메틸히드록시에틸 셀룰로오스, 히드록시프로필 셀룰로오스, 히드록시프로필메틸 셀룰로오스, 나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스, 프로비돈 및 폴리에틸렌 글리콜을 포함한다. 두 번째 군은 보통 프탈산의 에스테르인 장용 물질로 이루어진다. 물질의 혼합물이 최적의 필름 코팅을 제공하기 위해 사용될 수 있다. 필름 코팅은 팬 코터 또는 유동층 내에서, 또는 압착 코팅에 의해 수행될 수 있다.

비경구 투여를 위한 본 발명에 따른 제조물은 멸균된 수성 또는 비수성 용액, 서스펜션 또는 에멀전을 포함한다. 비수성 용매 또는 비히클의 예는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일 및 옥수수 오일과 같은 식물성 오일, 젤라틴 및 에틸 올레에이트와 같은 주사가능한 유기 에스테르이다. 이러한 제형은 또한 어주번트, 보존제, 습윤제, 에멀전화제 및 분산제를 함유할 수 있다. 상기 약학적 조성물은 예를 들면 박테리아 유지 필터를 통해 여과하거나, 멸균제를 조성물 내에 포함시키거나, 조성물에 방사능 처리를 하거나, 또는 조성물을 가열함으로써 멸균될 수 있다. 이들은 또한 사용 직전에 멸균수 또는 어떤 다른 멸균된 주사가능한 매체를 이용하여 제조될 수 있다.

백신. 백신의 경우에 있어서, 어주번트 없이 항원을 단독으로 이용하는 1차 챌린지(primary challenge)는 전신성 또는 세포성 면역 반응을 일으키는데 실패한다는 것이 종종 관찰된다. 따라서, 본 발명의 백신은

완전 프로이드(Freund) 어주번트, 불완전 프로이드 어주번트, 사포닌, 알루미늄 히드록시드와 같은 미네랄 겔, 리소레시틴과 같은 표면 활성 물질, 플루로닉 폴리올, 폴리음이온, 펩티드, 오일 또는 탄화수소 에멀전, 키홀 림펫 헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanin), 및 N-아세틸-무라밀-L-트레오닐-D-이소글루타민(thr-MDP), N-아세틸-노르무라밀-L-알라닐-D-이소글루타민, N-아세틸무라밀-L-알라닐-D-이소글루타미닐-L-알라닌-2-(1'-2'-디팔미토일-sn-글리세로-3-히드록시포스포릴옥시)-에틸아민, BCG(bacille Calmette - Guerin) 및 코리네박테리움 파르붐(Corynebacterium parvum)과 같은 잠재적으로 유용한 인간 어주번트를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아닌 다른 어주번트를 함유할 수 있다. 어주번트는 항원을 천천히 방출하는 조직의 저장소(depot), 또는 면역 반응을 비특이적으로 향상시키는 림프 시스템 활성제로서 기능할 수 있다(Hood et al., Immunology, Second Ed., 1984, Benjamin/cummings: Menlo Park, California, p.384). 백신이 인간 대상에서 사용하기 위한 의도라면, 상기 어주번트는 약학적으로 허용가능해야 한다.

투여. 이러한 약학적 조성물 및 백신은 경구(고형 또는 액체), 비경구(근육내, 복강내, 정맥내(IV) 또는 피하 주사), 경피내(수동적으로 또는 이온이동(ionophoresis) 또는 전기천공을 이용하여), 점막내(transmucosal)(코, 질, 직장 또는 설하), 또는 흡입 투여 경로, 또는 생분해성(bioerodible) 삽입체를 이용하여 투여될 수 있으며, 각각의 투여 경로에 적합한 제형으로 제형화될 수 있다.

어떤 구현예에서, 상기 조성물 또는 백신은 폐 운반(pulmonary delivery)에 의해 투여된다. 상기 조성물 또는 백신은 흡입하는 동안에 포유동물의 폐로 운반되며, 폐의 상피 라이닝(lining)을 가로질러 혈류로 들어간다[예컨대, Adjei, et al. Pharmaceutical Research 1990; 7:565-569; Adjei, et al. Int. J. Pharmaceutics 1990;63:135-144 (leuprolide acetate); Braquet, et al. J. Cardiovascular Pharmacology 1989;13(sup5):143-146 (endothelin-1); Hubbard, et al. (1989) Annals of Internal Medicine, Vol.Ⅲ, pp. 206-212 (α1-antitrypsin); Smith, et al. J. Clin. Invest. 1989;84:1145-1146 (α-1-proteinase); Oswein, et al. "Aerosolization of Proteins", 1990; Proceedings of Symposium on Respiratory Drug Delivery Ⅱ Keystone, Colorado (recombinant human growth hormone); Debs, et al. J. Immunol. 1988;140:3482-3488 (interferon-γ and tumor necrosis factor α); 및 Platz 등의 미국 특허 제5,284,656호(granulocyte colony stimulating factor) 참조]. 전신성 효과를 위한 약물의 폐 운반용 방법 및 조성물은 Wong 등의 미국 특허 제5,451,569호에 개시되어 있다. 또한, Licalsi 등의 미국 특허 제6,651,655호 참조.

본 발명의 어떤 구현예의 실행에 사용하기 위하여, 치료용 생성물의 폐 운반을 위해 디자인된 네불라이저(nebulizer), 계량된 용량 흡입기 및 분말 흡입기를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아닌 다양한 범위의 기계 장치가 고려되며, 이들 모두는 본 기술분야의 숙련된 당업자에게 있어서 익숙하다. 본 발명의 실행을 위해 적합한 상업적으로 이용가능한 장치의 어떤 특정한 예는 울트라벤트(Ultravent) 네불라이저(Mallinckrodt Inc., St. Louis, MO); 아콘(Acorn) Ⅱ 네불라이저(Marquest Medical Products, Englewood, CO); 벤톨린(Ventolin) 계량된 용량 흡입기(Glaxo Inc., Research Triangle Park, NC); 및 스핀홀러(Spinhaler) 분말 흡입기(Fisons Corp., Bedford, MA)이다. 이러한 모든 장치는 상기 치료제를 조제하는데 적합한 제형을 사용하는 것을 필요로 한다. 전형적으로, 각각의 제형은 도입되는 장치의 유형에 특이적이며, 치료에 유용한 통상의 희석제, 어주번트, 계면활성제 및/또는 담체 이외에 적절한 분사제(propellant) 물질을 사용하는 것을 포함할 수 있다. 또한, 리포좀, 마이크로캡슐 또는 마이크로스피어, 인클루전 복합체(inclusion complex) 또는 다른 유형의 담체를 사용하는 것이 고려된다.

계량된 용량 흡입 장치와 함께 사용하기 위한 제형은 일반적으로 계면활성제의 도움으로 분사제 내에 서스펜드된 치료제를 함유하는 미세하게 나누어진 분말을 포함할 것이다. 상기 분사제는 클로로플루오로카본, 히드로클로로플루오로카본, 히드로플루오로카본, 또는 트리클로로플루오로메탄, 디클로로디플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄올 및 1,1,1,2-테트라플루오로에탄을 포함하는 탄화수소, 또는 이들의 조합과 같이 이러한 목적을 위해 도입되는 임의의 종래 물질일 수 있다. 적합한 계면활성제는 솔비탄 트리올레에이트 및 콩 레시틴을 포함한다. 또한, 올레산도 계면활성제로 유용할 수 있다.

분말 흡입 장치로부터 조제하기 위한 제형은 상기 치료제를 함유하는 미세하게 나누어진 건조된 분말을 포함할 것이며, 또한 락토오스, 솔비톨, 수크로오스 또는 만니톨과 같은 벌킹 제제를 예컨대 상기 제형의 50 내지 90 중량%와 같이 상기 장치로부터 분말이 분산되는 것을 촉진하는 양으로 포함할 것이다. 상기 치료제는 가장 유익하게는 가장 효과적으로 말단 폐까지 운반하기 위하여 10 ㎜(또는 ㎛) 이하, 가장 바람직하게는 0.5 내지 5 ㎜의 평균 입자 크기의 입자 형태로 준비되어야 한다.

또한, 상기 치료제의 코 또는 다른 점막성 운반이 고려된다. 코 운반은 상기 조성물을 코로 투여한 후 상기 생성물이 폐 내에 증착(deposition)할 필요없이 직접적으로 혈류로 통과하도록 한다. 코 운반용 제형은 어주번트로 덱스트란 또는 시클로덱스트란 및 사포닌을 갖는 것들을 포함한다.

본 발명의 조성물 또는 백신은 하나 이상의 추가적인 활성 성분, 약학적 조성물 또는 백신과 함께 결합되어 투여될 수 있다. 본 발명의 치료제는 동물, 바람직하게는 포유동물, 가장 바람직하게는 인간에게 투여될 수 있다.

용량.

본 기술분야에 잘 확립된 방법론을 따라, 시험관내 테스트에서 잘 수행되는 본 발명의 화합물 및 조성물의 효과적인 용량 및 독성은, 상기 시겔라 항원, 폴리펩티드, 약학적 또는 백신 조성물이 치료학적으로 유효한 것으로 나타났고, 이들 약물이 인간의 임상 시험에 대해 제안된 동일한 경로에 의해 투여될 수 있는 작은 동물 모델(예컨대, 마우스 또는 래트)을 이용하는 전임상 연구에서 결정된다.

본 발명의 방법에서 사용되는 임의의 약학적 조성물에 있어서, 상기 치료학적으로 효과적인 용량은 먼저 동물 모델로부터 추정될 수 있다. 이후, 동물 시스템으로부터 얻은 용량-반응 커브는 인간에서 초기 임상 연구를 위한 테스팅 용량을 결정하는데 사용된다. 각각의 조성물에 대해 안전성을 결정함에 있어서, 투여 용량 및 빈도는 임상 시험에서 사용하도록 예측되는 것들을 충족하거나, 이를 상회하여야 한다.

본 발명에서 개시된 바와 같이, 본 발명의 조성물 내의 성분들의 용량은 지속적으로 또는 간헐적으로 투여되는 용량이 동물 테스트 및 환자의 개별적인 증상의 결과를 고려한 후 결정되는 양을 초과하지 않는 것을 보증하도록 결정된다. 물론 특정 용량은 복용 절차, 연령, 체중, 성별, 민감성, 음식, 복용 기간, 조합으로 사용되는 약물 및 질환의 중증도와 같은 환자 또는 대상 동물의 증상에 따라 달라진다. 어떤 조건 하의 적합한 용량 및 복용 시간은 전술한 지표에 기반하는 테스트에 의해 결정될 수 있지만, 표준 임상 기술에 따라 실무자의 판단 및 각각의 환자의 상황(연령, 일반적인 증상, 징후의 중증도, 성별, 등)에 따라 조정되고 최종적으로 결정될 수 있다.

본 발명의 조성물의 독성 및 치료학적 효능은 실험 동물에서의 표준 약학적 절차에 의해, 예컨대 LD₅₀(모집단의 50%에 치사적인(lethal) 용량) 및 ED₅₀(모집단의 50%에 치료학적으로 효과적인 용량)을 측정함으로써 결정될 수 있다. 치료 및 독성 효과 사이의 용량 비는 치료학적 지수이며, 이것은 ED₅₀/LD₅₀의 비로 표현될 수 있다. 큰 치료 지수를 나타내는 조성물이 바람직하다.

동물 연구로부터 얻어진 데이터는 인간에서 사용하기 위한 용량 범위를 제형화하는데 사용될 수 있다. 인간에서의 치료학적으로 효과적인 용량은 바람직하게는 독성이 거의 없거나 없는 ED₅₀을 포함하는 순환하는 농도 범위 내에 놓여 있다. 상기 용량은 도입되는 제형 및 이용되는 투여 경로에 따라 이러한 범위 내에서 변할 수 있다. 이상적으로는, 각각의 약물의 단일한 용량이 매일 사용되어야 한다.

도 1은 PTD CTA1 융합 단백질(TCTA1T) 발현 벡터(도 1의 A) 및 대장균으로부터의 TCTA1T 단백질의 정제(도 1의 B)를 개략적으로 나타낸 것을 보여준다.
도 2는 어주번트로서 TCTA1T, TmCTA1T 또는 CT를 이용하여 비강내에 면역된 마우스의 OVA-특이적 혈청 IgG 반응을 보여준다. 5마리 마우스의 군이 0, 14, 28일에 20 ㎍의 OVA 단독, 10 ㎍의 TCTA1T, TmCTA1T 또는 2 ㎍의 CT를 이용하여 비강내에 면역되었다. 혈청 샘플을 13, 27 및 41일에 수집하였다.
도 3은 어주번트로서 TCTA1T, TmCTA1T 또는 CT를 이용하여 비강내에 면역된 마우스의 OVA-특이적 점막 항체 반응을 보여준다. 침을 13, 27 및 41일에 수집하였다. 폐 조직, 폐 세척 및 코 세척 샘플을 세 번째 면역 후 14일에 수집하였다.
도 4는 TCTA1T, TmCTA1T 또는 CT를 이용하여 비강내에 면역된 마우스의 비장(도 4의 A) 및 폐(도 4의 B)에서 OVA-특이적 Ab를 생산하는 세포를 보여준다. Ab를 생산하는 세포는 세 번째 면역 후 7일에 측정하였다.
도 5는 어주번트로서 다양한 용량의 TCTA1T를 이용하여 비강내에 면역된 마우스의 OVA-특이적 점막성 및 전신성 항체 반응을 보여준다. 침 및 혈청을 13, 27 및 41일에 수집하였다.
도 6은 TCTA1T, TmCTA1T 또는 CT를 이용하여 비강내에 면역된 마우스의 비장 및 폐에서의 OVA-특이적 CD8+ 세포독성 T 세포 반응을 보여준다.
도 7은 두 번째 면역 2주 후 10 LD₅₀의 A/PR/8로 비강내 접종함으로써 챌린지(challenge)된 마우스에서의 체중 감소(도 7의 A) 및 생존율(도 7의 B)을 보여준다.
도 8은 cAMP 테스트, 발 부종(footpad edema) 및 장의 루프 테스트를 통한 TCTA1, TmCTA1 또는 CT의 시험관내 및 생체내 독성을 보여준다.
도 9는 CTA1 발현 벡터(도 9의 A) 및 대장균으로부터의 CTA1 단백질의 정제(도 9의 B)를 개략적으로 나타낸 것을 보여준다.
도 10은 어주번트로서 CTA1을 이용하여 비강내에 면역된 마우스의 OVA-특이적 항체 반응을 보여준다. 혈청(도 10의 A) 및 침(도 10의 B)은 13, 27 및 41일에 수집하였다. 폐 조직(도 10의 C)은 세 번째 면역 후 14일에 수집하였다.
도 11은 CTA1 + OVA를 이용하여 비강내에 면역된 마우스의 비장(도 11의 A) 및 폐(도 11의 B)에서 OVA-특이적 Ab를 생산하는 세포를 보여준다. Ab를 생산하는 세포는 세 번째 면역 후 7일에 측정하였다.
도 12는 CTA1 + OVA를 이용하여 비강내에 면역된 마우스의 비장 및 폐에서의 OVA-특이적 CD8+ 세포독성 T 세포 반응을 보여준다.
도 13은 cAMP 테스트(도 13의 A), 발 부종(도 13의 B) 및 장의 루프 테스트(도 13의 C)를 통한 CTA1의 시험관내 및 생체내 독성을 보여준다.
도 14는 콜레라 독소 A 서열(도 14의 A), pET15b-CTA1(도 14의 B), pET15b-TCTA1T(도 14의 C) 및 pET15b-TmCTXA1T(도 14의 D)의 뉴클레오티드 서열을 보여준다.
도 15는 TCTA1T(PTD-CTA1-PTD, 서열번호 5로도 나타냄)(도 15의 A), CTA1(도 15의 B) 및 HIV Tat(PTD 모티프는 굵게 나타냄)(도 15의 C)의 아미노산 서열을 보여준다.
도 16은 TCTA1T가 그 자체를 향한 항체를 일으키지 않는다는 것을 보여준다.

이하, 실시예 1 내지 실시예 10에서 도입되는 물질 및 방법을 개시한다.

물질 및 방법

TCTA1T 및 TmCTA1T 단백질을 발현하는 플라스미드의 구축

N- 및 C-말단 모두에 HIV-1 Tat PTD(TAT 서열의 49-57 아미노산, RKKRRQRRR; 뉴클레오티드 서열: AGGAAGAAGCGGAGACAGCGACGAAGA)를 갖는 GFP 단백질을 발현하는 플라스미드(pET15b-Tat-GFP-Tat)는 대한민국 한림대학교의 최수영 박사로부터 제공받았다. 콜레라 독소 A1 서브유닛(1-194 아미노산)을 코딩하는 DNA는 전방 프라이머(5'-GGGCCCCTCGAGAATGATGATAAGTTATATCGG-3') 및 후방 프라이머(5' -CCCGGGGGATCCCGATGATCTTGGAGCATTCCC-3')를 이용한 PCR에 의해 증폭하였다. 비브리오 콜레라 N16961 균주(AE003852)를 CTA1에 대한 주형으로 사용하였다. PCR 증폭된 CTA1 생성물을 XhoI(카탈로그 번호 R0146S, New England Biolabs, Beverly, MA) 및 BamHI(카탈로그 번호 R0136S, NEB)으로 소화시켰고, 동일한 효소를 이용하여 선형화한 pET15b-Tat-GFP-Tat 플라스미드에 접합시켜 재조합 플라스미드 pET15b-TCTA1T를 생성하였다. ADP 리보실트랜스퍼라제 효소 활성 부위에서의 돌연변이체 CTA1(Ser-63 → Lys)을 발현하는 플라스미드 pET15b-TmCTA1T은 Pyrobest DNA 중합효소(카탈로그 번호 R005, Takara, Japan)에 의해 5'-TATGTTTCCACCAAGATTAGTTTGAGA-3' 및 5'-TCTCAAACTAATCTTGGTGGAAACATA-3' 프라이머를 이용하여 위치-지정 돌연변이(site-directed mutagenesis)를 통해 생성하였다. pET15b-TCTA1T 플라스미드를 TmCTA1T를 위한 주형으로 사용하였다. DpnI(카탈로그 번호 R0176S, NEB)을 PCR 생성물에 직접 첨가한 후, DH5α 수용성(competent) 세포(카탈로그 번호 YE608, Yeastern Biotech Co., Taiwan) 내로 형질전환시켰다. 다음날 각각의 단일 콜로니를 1.5 ㎖의 LB 배지 내에서 배양하였다. 각각의 플라스미드를 QIAprep 스핀 미니프렙 키트(카탈로그 번호 27106, QIAgen, Valencia, CA)를 이용하여 정제하였다. pET15b-TmCTA1T의 서열을 마크로젠사(Macrogen, Seoul, Korea)에 의해 확증하였다. CTA1의 경우, 전방 프라이머(5'-CCCGGGCATATGAATGATGATAAGTTATATCGG-3') 및 후방 프라이머(5'-CCCGGGGGATCCCTACGATGATCTTGGAGCATT-3')를 이용한 PCR에 의해 유전자를 증폭하였다. 상기 pET15b-TCTA1T 플라스미드를 CTA1을 위한 주형으로 사용하였다. 상기 PCR 생성물 및 pET15b 벡터를 NdeI(카탈로그 번호 R0111S, New England Biolabs, Beverly, MA) 및 BamHI(카탈로그 번호 R0136S, NEB)을 이용하여 소화시켰다. 상기 PCR 생성물을 T4 DNA 리가제(ligase)(카탈로그 번호 M0202S, NEB)에 의해 pET15b 벡터 내로 접합시켰다. 상기 pET15b-CTA1 플라스미드를 마크로젠사(Seoul, Korea)에 의해 시퀀싱하였다. 상기 구축물 및 해당 아미노산 절편의 서열은 도 14의 A 내지 D 및 도 15의 A 내지 C에 나타나 있다.

대장균에서의 TCTA1T 및 TmCTA1T 단백질의 발현 및 정제

pET15b-TCAT1T, pET15b-CAT1 또는 pET15b-TmCTA1T로 형질전환된 대장균 BL21(DE3) 균주(카탈로그 번호 69387, Novagen, Germany) 내에서 재조합 단백질을 발현시켰다. OD₆₀₀이 0.6에 도달할 때까지 100 ㎍/㎖의 암피실린을 함유하는 1 리터의 LB 배지 내에서 37℃에서 세포를 성장시켰다. 이후, 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드(IPTG)를 0.5 mM의 최종 농도로 첨가하였다. 세포를 37℃에서 4시간 동안 추가로 인큐베이션하였고, 최종적으로 6,000 rpm에서 10분 동안 원심분리하여 수확하였다. 세포 펠렛을 결합 버퍼(20 mM Tris-Cl, 0.5 M NaCl, 10% 글리세롤, pH 8.0) 내에 현탁시켰고, 음파처리(sonication)에 의해 세포를 용해시켰다. 18,000 rpm에서 30분 동안 원심분리하여 가용성 및 불용성 분획을 분리하였다. 불용성 분획을 6 M 우레아(urea)를 함유하는 결합 버퍼 내에 용해시켰다. 18,000 rpm에서 30분 동안 원심분리한 후, 상등액을 Talon 금속 친화성 칼럼(Clontech, Palo Alto, CA)에 적용하였다. 세척 버퍼(20 mM Tris-Cl, 0.5 M NaCl, 30 mM 이미다졸, 10% 글리세롤, pH 8.0)를 이용하여 상기 칼럼을 세척하였고, 용출 버퍼(20 mM Tris-Cl, 0.5 M NaCl, 0.3 M 이미다졸, 10% 글리세롤, pH 7.9)를 이용하여 단백질을 용출하였다. 정제된 단백질을 -80℃에 보관하였다.

마우스의 면역

6주령의 암컷 BALB/c 마우스(Orient, Korea)를 20 ㎕의 PBS 내에서 OVA(20 or 200 ㎍, 지시된 바와 같이 함; 카탈로그 번호 A5503, Sigma, St. Louis, MO)를 단독으로 또는 10 ㎍의 CTA1, TCTA1T, TmCTA1T 또는 2 ㎍의 CT(카탈로그 번호 101A; List Biological Laboratories Inc., Campbell, CA)와 혼합하여 0, 14 및 28일에 비강내(i.n.)에 면역시켰다(군 당 n=5). 어주번트의 최적 용량을 결정하기 위하여, 다른 세트의 마우스를 20 ㎍의 OVA를 단독으로 또는 0.1, 1.0, 10 또는 20 ㎍의 TCTA1T와 혼합하여 2주 간격으로 3회 비강내(즉, "i.n.")에 면역시켰다. 별도 세트의 실험에서, BALB/c 마우스를 10 ㎍의 재조합 인플루엔자 M2 단백질 및 10 ㎍의 TCTA1T를 어주번트로 이용하여 14일 간격으로 2회 비강내에 면역시켰다. 면역 2주 후, 상기 마우스를 10 LD₅₀의 A/PR/8 바이러스로 비강내에 챌린지하였고, 체중 및 생존율에 대해 모니터링하였다.

샘플의 수집

마우스를 케타민(Yuhan Co., Korea)의 복강내(즉, "i.p.") 주사에 의해 마취시켰다. 각각의 면역 12일 후에 안와후방총(retro-orbital plexus)으로부터 혈액을 수집하였고, 13,000 rpm에서 10분 동안 원심분리함으로써 혈액으로부터 혈청을 얻었다. 각각의 면역 2주 후에 필로카르핀(pilocarpine, 1 ㎎/㎖의 100 ㎕; 카탈로그 번호 P6503, Sigma, St. Louis, MO)을 복강내 주사함으로써 침샘 분비를 유도한 후 침 샘플을 얻었다. 코 및 폐 세척물을 42일에 수집하였다. 마취된 마우스를 해부하여 기관을 노출하였고, IV 카테터(카탈로그 번호 591836, BD Biosciences, San Jose, CA)를 기관의 작은 칼자국 내로 삽입시켰다. 500 ㎕의 PBS를 폐 내로 반복적으로 씻고 흡입함으로써 폐 세척을 수행하였다. 비강을 통해 50 ㎕의 PBS로 2회 씻어줌으로써 코 세척물을 수집하였다. 폐 조직을 작은 절편으로 자르고, 냉동-해동 사이클을 2회 수행하였다. 조직을 4℃에서 13,000 rpm으로 10분 동안 원심분리하였고, Ag-특이적 Ab 반응을 검사하기 위해 상등액을 수집하였다.

항원-특이적 항체의 측정

효소결합 면역흡착 분석(ELISA)에 의해 OVA-특이적 항체 반응을 측정하였다. 항체 반응을 측정하기 위하여, OVA 단백질을 50 mM 나트륨 비카보네이트 버퍼(pH 9.6)를 이용하여 1 ㎎/㎖로 희석하였다. ELISA 플레이트(카탈로그 번호 439454, Nunc, Denmark)를 웰 당 100 ㎕의 희석된 단백질로 코팅하였고, 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBS로 세척하였고, 실온에서 1시간 동안 PBS 내의 5% 탈지유로 블로킹하였다. 혈청 또는 점막 샘플을 2배씩의 순차적인 희석으로 블로킹 버퍼 내에서 희석하였다. 희석된 샘플을 웰 내에 첨가하였고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. PBS로 세척한 후, 각각의 웰을 상기 블로킹 버퍼로 희석된 100 ㎕의 염소-항-마우스 IgG-양고추냉이 퍼옥시다제(HRP; 카탈로그 번호 sc-2005, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) 접합체 또는 염소-항-마우스 IgA-HRP(카탈로그 번호 sc-3791, Santa Cruz, CA)로 처리하였고, 실온에서 1시간 동안 플레이트를 인큐베이션하였다. 암실에서 20분 동안 100 ㎕의 기질 TMB(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine) 용액(ES001, Millipore, Billerica, MA)을 이용하여 색을 발생시켰다. 50 ㎕의 0.5 N HCl을 첨가함으로써 반응을 중지시켰다. 마이크로플레이트 판독기(Molecular Devices Corp., Menlo Park, CA)에 의해 450 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 각각의 면역 군에 있어서, 결과는 기하평균 역가(GMT)+S.D.로 표현하였다.

ELISPOT 분석

최종 면역 7일 후에 비장 및 폐의 단일 세포 서스펜션을 준비하였고, 전술한 바와 같이 ELISPOT 분석에 의해 특이적인 항체 분비 세포(ASC)의 빈도를 평가하였다[29]. 니트로셀룰로오스 마이크로플레이트(카탈로그 번호 MAHAN4510, Millipore)를 OVA(1 ㎎/㎖)로 코팅하였고, 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척하였고, 웰을 10% FBS(카탈로그 번호 14-501F, Biowhittaker, Walkersville, MD)를 함유하는 RPMI 배지를 이용하여 실온에서 30분 동안 블로킹하였다. 블로킹 버퍼 내에서 순차적으로 희석된 세포를 상기 플레이트에 첨가하였고, 37℃에서 3시간 동안 인큐베이션하였다. PBS로 4회 세척한 후, HRP-접합된 염소 항-마우스 IgG(카탈로그 번호 1030-05, Southern Biotechnology Associates, Birmingham, AL) 또는 IgA Ab(카탈로그 번호 1040-05, Southern Biotechnology Associates)를 주위 온도에서 1시간 동안 상기 플레이트에 첨가하였다. PBS로 다시 세척한 후, 플레이트를 AEC-H2O2 발색성 기질(카탈로그 번호 A5754, Sigma-Aldrich)과 함께 인큐베이션하였고, 특정 ASC의 이전 위치를 나타내는 점들을 입체현미경 하에서 계수하였다. 결과는 평균 점-형성 세포(SFC, spot-forming cell)/10⁶ 세포로 표현하였다.

생체내 CTL 분석

전술한 방법(30)을 약간 변형하여 생체내 CTL 분석을 수행하였다. C57BL/6 마우스의 비장 세포를 2개의 분획으로 나누었다. 한 분획은 5 μM의 카르복시플루오레센 숙신이미딜 에스테르(CFSE)(카탈로그 번호 V12883, Invitrogen, Carlsbad, CA)를 이용하여 실온에서 5분 동안 표지하였고, 오브알부민(OVA)의 257-264 아미노산 서열을 함유하는 합성 펩티드인 1 μM의 OVA SIINFEKL 펩티드를 이용하여 37℃에서 1시간 동안 펄스하였다. 다른 분획은 펩티드 펄스 없이 0.5 μM의 CFSE를 이용하여 표지하였다. 양쪽 분획을 혼합하였고, OVA 및 표시된 어주번트를 이용하여 미리 면역되어 있는 수용자(recipient) C57BL/6 마우스 내로 정맥내 주사하였다. 이후, 세포 전달 24시간 후에 수용자 마우스의 폐 및 비장으로부터 단일 세포 서스펜션을 준비하였다. 특정 죽임 활성(specific killing activity)을 유세포분석에 의해 측정하였다.

독성 검사

발 부종(31)을 평가하기 위하여, 케타민으로 마취된 마우스를 10 ㎕의 PBS 내의 20 ㎍의 TCTA1T, CTA1, TmCTA1T 또는 1 ㎍의 CT로 뒷발에 주사하였다. 24시간 후에 발의 두께를 측정하였다.

장의 루프 테스트[32]를 수행하기 위하여, 케타민으로 마우스를 마취시켰고, 배를 개복하여 소장의 가운데 부분에 3 내지 5 ㎝의 루프를 만들었다. 100 ㎕의 PBS 내의 2 ㎍의 CT, 20 ㎍의 TCTA1T, 20 ㎍의 CTA1 또는 20 ㎍의 TmCTA1T를 상기 루프 내에 주사하였다. 배를 닫고, 6시간 후에 상기 루프를 그 유체 내용물과 함께 칭량하고, 그 길이를 측정하였다.

BHK21 세포(ATCC 번호 CCL-10)를 6 웰 플레이트 내에 1×10⁶ 세포/웰로 접종하였다. 1일 후, 세포를 혈청-부재 배지로 세척하였고, 1 ㎍의 CT, 10 ㎍의 TCTA1T, CTA1 또는 TmCTA1T을 이용하여 3시간 동안 인큐베이션하였다. 1,000×g에서 10분 동안 원심분리하여 상등액을 얻었다. 상등액 내의 cAMP의 농도를 제조사의 지침에 따라 cAMP EIA 키트(카탈로그 번호 581001, Cayman)에 의해 측정하였다.

본 발명을 보다 잘 이해하기 위하여 하기 실시예를 개시한다. 하기 실시예는 예시만을 위한 목적이며, 본 발명의 범위를 한정하는 것으로 이해되어서는 안된다.

실시예 1

재조합 PTD - CTA1 의 구축 및 특성분석

HIV Tat 유래의 PTD를 프레임(frame) 내에서 CTA1의 N- 및 C-말단 모두에 부착시킴으로써 TCTA1T를 구축하였다. PTD를 양쪽에 부착시키면 하나의 PTD를 부착시키는 것보다 더 세포 흡수를 더 향상시킨다. 음성 대조군으로 사용하기 위하여, TCTA1T에 대해 사용된 것과 동일한 과정을 이용하여 ADP 리보실트랜스퍼라제의 효소적 활성 부위를 함유하는 돌연변이체 CTA1(TmCTA1T)를 생성 및 정제하였다. 모든 구축물은 DNA 시퀀싱 분석에 의해 확증하였다. 금속 친화성 크로마트그래피에 의해 정제된 단백질을 SDS-PAGE에 의해 분석하였으며, TCTA1T 및 TmCTA1T의 예상 되는 크기에 잘 부합되는 27 kDa의 단일한 구별되는 밴드를 보여주었다(도 1). CTA1-특이적 모노클로날 항체를 이용한 웨스턴 블롯 분석으로부터 CTA1의 발현을 확증하였다.

실시예 2

TCTA1T 는 전신성 및 점막성 항체 반응을 향상시킨다.

TCTA1T의 어주번트 활성을 테스트하기 위하여, 마우스 군을 TCTA1T(10 ㎍), TmCTA1T(10 ㎍) 또는 CT(2 ㎍)과 함께 혼합된 20 ㎍의 OVA를 이용하여 비강내에 3회 면역시켰고, 0, 14, 28 및 42일에 혈청을 수집하여 ELISA에 의해 OVA-특이적 IgG 반응을 분석하였다.

도 2에 나타낸 바와 같이, TCTA1T로 면역시키면 CT 어주번트의 경우에 필적하도록 총 혈청 Ig 항-OVA를 향상시켰다. ADP-리보실화 불활성 돌연변이체인 TmCTA1T는 총 IgG 반응을 OVA로만 면역된 대조군의 경우보다 상당히 높게 향상시켰지만, 상기 항체의 레벨은 TCTA1T 및 CT의 경우보다는 훨씬 낮았는데, 이는 최적의 어주번트 활성에 있어서의 활성형 ADP 리보실트랜스퍼라제의 중요성을 나타낸다.

상기 IgG 반응은 IgG1 이소타입에서 우세하였으며, IgG2a 항-OVA 항체 반응은 TCTA1T 또는 CT를 이용하여 함께 면역된 마우스 군에서 세 번째 면역후에 현저하게 증가하였다(도 2).

세 번째 면역 후 침, 코 세척물 및 폐 조직에서의 항-OVA IgA 항체의 역가를 분석하여 점막성 면역 반응에 대한 어주번트 활성을 평가하였다(도 3).

OVA + TCTA1T를 이용하여 비강내에 면역시키면 상기 점막 샘플 모두에서 높은 항-OVA IgA 항체 반응을 생성하였으며, 상기 반응은 OVA + CT를 이용한 면역에 의해 유도된 것과 동일한 크기였다(도 3). 그러나, 점막성 OVA-특이적 항체 반응은 OVA 단독으로 면역시킨 후에는 검출되지 않았고, OVA + TmCTA1T를 이용하여 면역된 마우스에서는 매우 낮았다(도 3).

OVA + TCTA1T를 이용한 세 번째 면역 후에 많은 수의 OVA-특이적 항체 분비 세포(ASC)가 비장(도 4의 A) 및 폐 세포 서스펜션(도 4의 B)에서 검출되었다. OVA + TCTA1T를 이용하여 면역된 마우스의 비장 유래의 IgA 클래스 OVA 특이적 ASC의 수는 OVA + CT를 이용하여 면역된 마우스의 경우보다 더 높았다(도 4의 A). 더욱 흥미롭게도, TCTA1T는 폐에서 CT의 경우보다 대략 5배(IgG 클래스) 또는 10배(IgA 클래스) 더 높은 ASC를 생성하였다(도 4의 B). TCTA1T와 마찬가지로 발현 및 정제된 TmTCA1T는 ASC의 수를 현저하게 증가시키는데 실패하였다.

2 ㎍의 CT와 비교하여 TCTA1T를 이용한 용량 반응 분석을 수행하여, 전신성 및 점막성 어주번트로서의 최적의 면역 용량을 확인하였다(도 5의 A 및 B). TCTA1T는 0.1 ㎍의 용량에서는 OVA-특이적 혈청 IgG 반응을, 1 ㎍ 용량에서는 IgA 반응을 증가시켰다(도 5의 A 및 B). 상기 OVA 특이적 항체 반응은, 2 ㎍의 CT의 경우에 필적하는 OVA-특이적 IgG 및 IgA 항체 반응의 향상을 제공하는, 10 ㎍의 TCTA1T까지 선형의 용량 반응 활성을 보여주었다.

함께 고려할 때, 상기 데이터는 TCTA1T는 CT에 의해 자극되는 경우에 필적하게 전신성 IgG 및 점막성 IgA 면역 반응을 향상시키기 위하여 강한 점막성 어주번트 활성을 나타낸다는 것을 보여주었다.

실시예 3

TCTA1T 는 생체내 CTA 반응을 향상시킨다.

항원-특이적 세포독성 T 세포 반응을 향상시키기 위하여 CT와 용해성 단백질 항원을 함께 운반하는 것은 잘 알려져 있다[33]. TCTA1T의 CTL 활성을 평가하기 위하여, 비장 및 폐에서 H-2Kb MHC 클래스 I 분자에 의해 인식되는 OVA257-264 에피토프(SIINFEKL 펩티드)에 대한 생체내 세포독성 분석을 수행하였다(도 6). 마우스 군을 200 ㎍의 OVA 및 TCTA1T, TmCTA1T 또는 CT를 이용하여 14일 간격으로 3회 면역시켰다.

TCTA1T에 의해 일어난 생체내 CTL 활성은 CT에 의한 것보다는 약간 낮았지만, 폐 및 비장 모두에서 TmCTA1T 및 OVA 단독에 의한 것보다는 여전히 훨씬 더 높았다(도 6). 상기 데이터는 TCTA1T가 전신성 및 점막성 CD8+ 세포독성 T 세포 반응을 유도하기 위한 강력한 어주번트임을 나타낸다.

실시예 4

TCTA1T 는 마우스에서 보호성 면역을 향상시킨다.

인플루엔자 A 바이러스의 M2 단백질은 모든 인간 인플루엔자 A 균주에서 잘 보존되어 있으며, 보편적인 독감 백신의 개발에 사용되고 있다. 최근, CT와 함께 M2를 점막 백신화하는 것이 비경구 백신화보다 치사적인 바이러스 챌린지에 대한 보호에 더 뛰어나다는 것이 보고되었다. 이러한 점막성 백신화의 이점의 관점에서, 본 발명자들은 TCTA1T를 M2-기반의 백신을 위한 강력한 점막성 어주번트로 사용하는 가능성을 조사하였다.

TCTA1T와 함께 재조합 인플루엔자 M2 단백질을 동시투여하면 치사적인 인플루엔자 바이러스 챌린지에 대해 완전히 보호하였다(도 7의 B). M2 단독 또는 PBS를 이용하여 비강내에 면역된 어떠한 마우스도 10 LD₅₀의 H1N1 인플루엔자 바이러스를 이용한 챌린지 후에 생존하지 않았으며, TCTA1T를 어주번트로 이용한 군과 비교할 때 더욱 현저한 체중 감소를 보여주었다(도 7의 A 및 B).

실시예 5

TCTA1T 는 점막성 어주번트로서 안전하다.

CT는 매우 강한 점막성 어주번트이지만, 높은 독성은 이를 인간에 대한 어주번트로 사용하는 것을 막고 있다. TCTA1T는 PTD를 통한 비특이적 결합 후에 매우 효과적으로 세포에 들어가며, 이는 수용체 매개성 엔도사이토시스를 위해 강글리오사이드 G _M1 수용체를 이용하는 CT와는 상이한 것이다. 따라서, TCTA1T의 CTA1 부분은 CT의 CTA1와는 상이한 세포내 부위에 위치할 수 있다. TCTA1T의 독성을 평가하기 위하여, 3가지 고전적인 CT 독성 검사를 약간 변형하여 수행하였다: BHK21 세포에서의 cAMP 분비 테스트, 마우스에서의 발 부종 테스트 및 루프 접합 테스트(도 8). TCTA1T는 cAMP의 분비를 유도하였지만, cAMP의 레벨은 CT의 경우보다 훨씬 낮았다. CT는 발 부종 및 루프 접합 테스트에서 강한 독성을 보여주었지만, TCTA1T는 어떠한 독성 징후도 나타내지 않았다(도 8).

실시예 6

CTA1 의 구축 및 발현

CTA1 발현 벡터인 pET15b-TCAT1T(도 9의 A)를 서열 분석에 의해 확증한 후, SDS-PAGE 분석에서 24 kDa의 단일한 구별되는 밴드를 보여주는 금속 친화성 크로마토그래피에 의해 단백질을 정제하였다(도 9의 B).

실시예 7

CTA1 은 전신성 및 점막성 항체 반응을 향상시킨다.

도 10의 A에 나타낸 바와 같이, CTA1을 이용한 면역은 총 혈청 IgG 항-OVA를 CT 어주번트의 경우에 필적하도록 향상시켰다. 세 번째 면역 후 침 및 폐 조직에서의 항-OVA IgA 항체의 역가를 분석하여 점막성 면역 반응에 대한 어주번트 활성을 평가하였다(도 10의 B 및 C).

OVA + CTA1을 이용한 비강내 면역은 침 및 폐 샘플에서 OVA + CT를 이용한 면역에 의해 유도된 것과 유사한 정도로 높은 항-OVA IgA 항체 반응을 생성하였다(도 10의 B 및 C).

OVA + CTA1을 이용한 세 번째 면역 후에 많은 수의 OVA-특이적 항체 분비 세포(ASC)가 비장(도 11의 A) 및 폐 세포 서스펜션(도 11의 B)에서 검출되었다.

실시예 8

CTA1 은 생체내 CTL 반응을 향상시킨다.

CTA1 + OVA를 이용하여 비강내에 면역된 마우스의 비장 및 폐에서 OVA-특이적 CD8+ 세포독성 T 세포 반응을 측정하였다. CTA1과 OVA의 동시투여는 폐 및 비장 모두에서 높은 레벨의 OVA-특이적 생체내 CTL 활성을 생성하였다(도 12). 상기 데이터는 CTA1은 전신성 및 점막성 CD8+ 세포독성 T 세포 반응을 유도하기 위한 강한 어주번트일 수도 있음을 나타낸다.

실시예 9

CTA1 은 비독성 어주번트이다 .

CTA1 절편은 CTB 모이어티가 없기 때문에, 강글리오사이드 G _M1 수용체 매개성 엔도사이토시스를 통해 세포에 들어갈 수 없다. 그러나, 이것은 여전히 ADP 리보실트랜스퍼라제 활성을 갖고 있으며, 결과적으로 독성 효과를 나타낼 잠재성을 갖는다.

CTA1의 ADP 리보실트랜스퍼라제 활성과 연관된 임의의 독성 효과를 테스트하기 위하여, 마우스에서 발 부종 및 루프 접합 테스트를 수행하였다. 도 13의 A에 나타낸 바와 같이, CTA1은 cAMP의 분비를 유도하였지만, cAMP의 레벨은 CT의 경우보다 훨씬 낮았다. CTA1은 마우스에서의 발 부종(도 13의 B) 또는 루프 접합 테스트(도 13의 C)에서 어떠한 독성 징후도 나타내지 않았다.

본 발명의 구축물은, 다양한 종래 연구와는 반대로, CTA의 ADP 리보실 트랜스퍼라제 활성을 나타내는 CTA1이 비독성이고 강한 어주번트 특성을 보여준다는 것을 나타낸다. 추가로, ADP 리보실화 활성이 없는 돌연변이 형태의 CTA1은 어주번트 특성도 없다. 이러한 발견은 예상치 못한 것이며, CTA1(또한 CTA 및 자연형 CT)의 ADP 리보실화 활성은 어주번트성을 위해 필요하지만 독성을 위해서는 불필요하다는 것을 나타낸다.

본 발명은 부분적으로 CTA1이 세포 표면 수용체 결합 모이어티에 결합할 필요없이 어주번트 특성을 나타낼 수 있다는 예상치 못한 발견에 기반하고 있다. 아울러, 본 발명은 PTD 또는 세포-관통 펩티드로도 불리고 세포 유형에 무관하게 포유동물 세포막을 가로질러 관통하는 것으로 알려져 있는 단백질 형질도입 도메인을 함유하는 폴리펩티드 클래스에 속하는 폴리펩티드와 CTA1의 결합이, 아마도 세포 표면 수용체와 무관한 방식으로 세포막을 가로질러 CTA1이 통과하는 것을 촉진함으로써, CTA1의 어주번트 특성을 향상시키기 위해 이용될 수 있다는 것을 보여준다.

실시예 10

CTA1 은 그 자체에 대한 항체를 유도하지는 않는다.

6 내지 8주령의 암컷 BALB/c 마우스(Orient, Korea)를 케타민(Yuhan Corporation, Seoul, Korea)의 복강내 주사에 의해 마취시켰다. TCTA1T 및 콜레라 독소(CT)(List Biological Laboratories)를 PBS로 희석하였다. 상기 마우스를 10 ㎍의 TCTA1T 또는 2 ㎍의 CT를 이용하여 14일 간격으로 3회 연속하여 비강내(i.n.) 또는 혀밑(s.l.)에 투여하였다. 혀밑 경로의 경우, 혀의 배쪽에 적용되고 입의 바닥을 향하는 얇은 피펫를 이용하여 15 ㎕의 단백질을 마우스에 투여하였다. 동물을 머리를 앞쪽으로 구부려 30분 동안 유지하였다. 비강내 경로의 경우, 각각의 콧구멍 내로 나누어 총 15 ㎕의 부피로 단백질을 투여하였다. 각각의 투여 12-14일 후에 안와후방총으로부터 혈액을 수집하였고, 13,000 rpm에서 10분 동안 원심분리함으로써 혈액으로부터 혈청을 얻었다. 혈청 내의 (A) TCTA1T 특이적 및 (B) CT 특이적 IgG Ab 반응을 ELISA에 의해 측정하였다. 항체 반응을 측정하기 위하여, TCTA1T 및 CT 단백질을 50 mM 나트륨 비카보네이트 버퍼, pH 9.6 내에서 각각 3 ㎍/㎖ 및 1 ㎍/㎖로 희석하였다. 마이크로타이터 플레이트(Nunc, Denmark)를 웰 당 상기 희석된 단백질 100 ㎕로 코팅하였고, 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBS로 세척하였고, PBS 내의 5% 탈지유(블로킹 버퍼)로 실온에서 1시간 동안 블로킹하였다. 혈청 샘플을 블로킹 버퍼 내에서 연속적으로 5배씩 희석하여 준비하였고, 100 ㎕ 이하의 부피로 웰 내에 첨가하였으며, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. PBS로 세척한 후, 각각의 웰을 블로킹 버퍼로 1/1,000으로 희석된 100 ㎕의 염소-항-마우스 IgG-양고추냉이 퍼옥시다제(HRP) 접합체(Southern Biotechnology Associats, Birmingham, AL, USA)로 인큐베이션하였고, 상기 플레이트를 실온에서 1시간 동안 추가로 인큐베이션하였다. PBS로 세척한 후, TMB(3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘)(Sigma) 및 0.05% H₂O₂ 용액으로 이루어지는 100 ㎕/웰의 발색성 기질을 첨가한 후 암실에서 20분 동안 효소 결합 활성을 모니터링하였다. 50 ㎕의 0.5 N HCl(Sigma)을 첨가함으로써 상기 반응을 중지시켰다. 개별 웰의 흡광도를 마이크로플레이트 판독기(Molecular Devices Corp., Menlo Park, CA)를 이용하여 450 ㎚에서 측정하였다. 그 결과는 각각의 동물 실험 군에 대해 기하평균 항체 역가(GMT)±S.E.M.으로 표현하였다. 해당 혈청 샘플의 역가는 3회에 걸쳐 대조군 혈청의 풀(pool) 그 이상의 흡광도 값을 나타내는 가장 많이 희석된 샘플의 역수로 정의하였다. 그 결과는 도 16의 A 및 B에 나타내었으며, TCTA1T가 그 자체에 대한 항체를 유도하지 않는다는 것을 보여준다.

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29. Teter, K., et al., The cholera toxin Al[S) subdomain is essential for interaction with ADP-ribosylation factor 6 and full toxic activity but is not required for translocation from the endoplasmic reticulum to the cytosol. Infect Immun, 2006. 74(4): p. 2259-67.

30. Johansson, E.L., et al., Antibodies and antibody - secreting cells in the female genital tract after vaginal or intranasal immunization with cholera toxin B subunit or conjugates. Infect Immun, 1998. 66(2): p. 514-20.

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32. Lexomboon, U., et al., Clinical evaluation of co - trimoxazole and furazolidone in treatment of shigellosis in children. Br Med J, 1972. 3(5817): p. 23-6.

33. Lange, S. and J. Holmgren, Protective antitoxic cholera immunity in mice : influence of route and number of immunizations and mode of action of protective antibodies. Acta Pathol Microbiol Scand[C], 1978. 86C(4): p. 145-52.

34. Bowen, J.C., et al., Cholera toxin acts as a potent adjuvant for the induction of cytotoxic T- lymphocyte responses with non - replicating antigens. Immunology, 1994. 81(3): p. 338-42.

35. 미국 특허 제5,917,026호

본 발명은 본 명세서에 개시된 특정 구현예에 의해 그 범위가 한정되는 것은 아니다. 실제로, 본 명세서에 개시된 것들에 더하여 본 발명의 다양한 구현예가 전술한 내용 및 첨부된 도면으로부터 본 기술분야의 당업자에게 있어서 자명해질 것이다. 이러한 변형은 첨부된 청구항의 범위 내에 속하기 위한 의도이다. 아울러, 모든 값들은 근사값이며, 설명을 위해 제공된다는 점이 이해되어야 한다.

특허, 특허 출원, 공개문헌, 제품의 설명 및 프로토콜(protocol)이 본 출원의 전반에 걸쳐 인용되어 있으며, 그 개시된 내용은 모든 목적을 위하여 그 전체가 인용에 의해 본 발명에 포함된다.

<110> THE INTERNATIONAL VACCINE INSTITUTE <120> A1 MOIETY OF CHOLERA TOXIN A SUBUNIT AS AN ADJUVANT FOR MUCOSAL AND SYSTEMIC VACCINES <130> 2011-opa-4804kr <150> 61/107,179 <151> 2008-10-21 <160> 16 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 777 <212> DNA <213> Vibrio cholera <400> 1 atggtaaaga taatatttgt gttttttatt ttcttatcat cattttcata tgcaaatgat 60 gataagttat atcgggcaga ttctagacct cctgatgaaa taaagcagtc aggtggtctt 120 atgccaagag gacagagtga gtactttgac cgaggtactc aaatgaatat caacctttat 180 gatcatgcaa gaggaactca gacgggattt gttaggcacg atgatggata tgtttccacc 240 tcaattagtt tgagaagtgc ccacttagtg ggtcaaacta tattgtctgg tcattctact 300 tattatatat atgttatagc cactgcaccc aacatgttta acgttaatga tgtattaggg 360 gcatacagtc ctcatccaga tgaacaagaa gtttctgctt taggtgggat tccatactcc 420 caaatatatg gatggtatcg agttcatttt ggggtgcttg atgaacaatt acatcgtaat 480 aggggctaca gagatagata ttacagtaac ttagatattg ctccagcagc agatggttat 540 ggattggcag gtttccctcc ggagcataga gcttggaggg aagagccgtg gattcatcat 600 gcaccgccgg 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virus type 1 <400> 8 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 <210> 9 <211> 27 <212> DNA <213> Human immunodeficiency virus type 1 <400> 9 aggaagaagc ggagacagcg acgaaga 27 <210> 10 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 10 gggcccctcg agaatgatga taagttatat cgg 33 <210> 11 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 11 cccgggggat cccgatgatc ttggagcatt ccc 33 <210> 12 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 12 tatgtttcca ccaagattag tttgaga 27 <210> 13 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 13 tctcaaacta atcttggtgg aaacata 27 <210> 14 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 14 cccgggcata tgaatgatga taagttatat cgg 33 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Claims (26)

1. 아미노 말단, 카르복시 말단 또는 아미노 및 카르복시 말단 모두에서 HIV-1 Tat 단백질 형질도입 도메인에 접합되며, 콜레라 독소 A1 및 대장균 열-민감성 장독소 A1로 이루어진 군으로부터 선택되는 박테리아 장독소의 A1 서브유닛을 포함하는 융합 단백질.
2. 청구항 1에 있어서,
   상기 융합 단백질은 동시투여된 항원에 대한 면역 반응을 증가시킬 수 있는 융합 단백질.
3. 청구항 1에 있어서,
   상기 융합 단백질은 상기 A1 서브유닛에 대한 항체를 유도하지 않는 융합 단백질.
4. 청구항 1에 있어서,
   상기 장독소는 ADP 리보실 트랜스퍼라제 활성을 갖는 서브유닛을 포함하는 융합 단백질.
5. 청구항 4에 있어서,
   상기 서브유닛은 콜레라 독소의 ADP-리보실화 A1 서브유닛인 융합 단백질.
6. 청구항 1에 있어서,
   상기 장독소는 대장균 열-민감성 장독소의 ADP-리보실화 A1 서브유닛을 포함하는 융합 단백질.
7. 청구항 1에 있어서,
   상기 HIV-1 Tat 단백질 형질도입 도메인은 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 것인 융합 단백질.
8. 청구항 1에 있어서,
   서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 단리된 폴리펩티드인 융합 단백질.
9. (a) 청구항 1 내지 청구항 8 중 어느 한 항의 융합 단백질, (b) 항원 및 (c) 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 포함하는 백신 조성물로서, 상기 (a) 및 (b)의 양은 조합하여 상기 항원에 대한 면역 반응을 일으키기에 효과적인 백신 조성물.
10. 청구항 9에 있어서,
    상기 백신은 점막성 또는 전신성 경로에 의해 투여되는 백신 조성물.
11. 청구항 10에 있어서,
    점막성 면역 반응을 유도할 수 있는 백신 조성물.
12. 청구항 11에 있어서,
    상기 점막성 면역 반응은 분비성 항체 반응인 백신 조성물.
13. 청구항 11에 있어서,
    상기 점막성 면역 반응은 점막성 세포독성 T 림프구 반응인 백신 조성물.
14. 청구항 9에 있어서,
    전신성 면역 반응을 유도할 수 있는 백신 조성물.
15. 청구항 14에 있어서,
    상기 전신성 면역 반응은 혈청 항체 반응인 백신 조성물.
16. 청구항 14에 있어서,
    상기 전신성 면역 반응은 전신성 세포독성 T 림프구 반응인 백신 조성물.
17. 청구항 1 내지 청구항 8 중 어느 한 항의 융합 단백질을 코딩하는 단리된 핵산.
18. 청구항 17의 핵산으로 형질전환된 숙주세포.
19. 청구항 17의 핵산을 포함하는 발현 벡터.
20. 단백질 발현을 위한 적합한 조건 하에 청구항 18의 숙주세포를 배양하는 단계를 포함하는 융합 단백질의 제조 방법.
21. (a) 청구항 1 내지 청구항 8 중 어느 한 항의 융합 단백질, (b) 항원 및 선택적으로는 (c) 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 포함하는 면역성 조성물로서, 상기 (a) 및 (b)의 양은 조합하여 면역 반응을 일으키기에 효과적인 면역성 조성물.
22. 청구항 9에 따른 백신 조성물을 포함하는 키트.
23. 청구항 1 내지 청구항 8 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질을 포함하는 키트.
24. 청구항 9의 백신 조성물을 효과량으로 투여하는 단계를 포함하는 병원성 감염을 앓거나 병원성 감염에 민감한 인간을 제외한 포유동물을 치료하는 방법.
25. 청구항 9의 백신 조성물을 효과량으로 투여하는 단계를 포함하는 인간을 제외한 포유동물의 면역 반응을 조절하는 방법.
26. 청구항 9에 있어서,
    1 ㎍ 내지 1 ㎎의 융합 단백질을 포함하는 백신 조성물.

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