CN104387472A

CN104387472A - 一种具有脑靶向作用的多亚基蛋白质及其制备方法、用途

Info

Publication number: CN104387472A
Application number: CN201410578270.0A
Authority: CN
Inventors: 王华倩; 周小芬; 林卫萍; 张焜; 王真史; 杜志云; 郑希; 方岩雄; 赵肃清; 黄宝华
Original assignee: Guangdong University of Technology
Current assignee: Guangdong University of Technology
Priority date: 2014-10-24
Filing date: 2014-10-24
Publication date: 2015-03-04

Abstract

本发明公开了一种具有脑靶向作用的多亚基蛋白质及其制备方法、用途。利用不相容的双质粒系统在大肠杆菌中表达霍乱毒素B亚基，和增强型绿色荧光蛋白、霍乱毒素A亚基、穿膜肽三种蛋白的融合蛋白EGFP-CTA2-TAT，通过PCR扩增得到CTB基因，将该基因片段克隆到载体pET-28a中，获得重组质粒pET-28a-CTB；以野生型CTA2、EGFP、TAT氨基酸序列为模板，在EGFP与CTA2之间插入3个酶切位点和linker，优化获得适宜在大肠杆菌中表达的密码子，将基因片段克隆到载体PET-22b（+）中，获得重组质粒PET-22b-EGFP-CTA2-TAT；利用PET-28a-CTB和PET-22b-EGFP-CTA2-TAT二者不同抗性，将其共转化到大肠杆菌BL21中，在氨苄青霉素和卡那青霉素的双抗性选择压力下，筛选获得工程菌，该工程菌经IPTG诱导表达后，可获得CTB₅/EGFP-CTA2-TAT嵌合蛋白。本发明同时公开了该蛋白质的制备方法及用途。

Description

一种具有脑靶向作用的多亚基蛋白质及其制备方法、用途

技术领域

本发明涉及一种多亚基蛋白质及其制备方法、用途，具体涉及一种具有脑靶向作用的多亚基蛋白质及其制备方法、用途，利用双质粒系统直接在大肠杆菌中表达一种脑靶向蛋白质CTB₅/EGFP-CTA2-TAT，属于基因工程技术、蛋白质分离纯化技术及医药生物工程技术相关领域；在医学领域中，本发明是一种脑靶向蛋白质，能用于脑靶向蛋白质的无创给药。

背景技术

蛋白质类药物活性高、毒性低、特异性强，已经成为医药产品中的重要组成部分。近年来有不少脑部疾病治疗用蛋白质类药物问世。蛋白质类药物应用于脑部疾病的最大障碍是血脑屏障。如果无法将药物递送到大脑，治疗也只能隔靴搔痒不得其法。使用脑内注射的方法虽然可以使药物绕过血脑屏障，有效地作用于脑部，但其具有创伤性且可能造成感染、出血等并发症，在临床应用中难以广泛开展及被患者接受。因此迄今为止，还没有一个能无创且特效治疗诸如老年痴呆、帕金森病等中枢神经系统疾病的药物。但相关疾病的发病率却在不断上升。寻找一种途径来协助大分子蛋白质药物通过血脑屏障具有广阔的应用前景。

2011年，康奈尔大学的Aaron J. Carman等宣布找到新的直接开启与关闭血脑屏障的方法：利用腺苷受体随时打开血脑屏障用药。这种非选择性开启血脑屏障的方式的安全性引起了极大争议。

血脑屏障由毛细血管的多层膜性结构组成，其严格的选择性开启机制对于生物来讲极为重要，它只允许诸如氨基酸、氧、血糖与水等营养分子通过。蛋白质类药物由血液进入脑组织间液的过程中，穿越毛细血管内皮细胞是关键性的步骤。与其他组织相比，脑毛细血管内皮细胞的胞饮作用很微弱。因此，对脑毛细血管内皮细胞来说，借胞饮作用转运大分子物质的能力非常有限。要想大分子蛋白质穿越血脑屏障，进入脑内，主要靠载体转运的方式，如：

（1）将血脑屏障中特异性蛋白的单克隆抗体作为载体，利用受体介导作用进入脑内；或者利用天然受体转运入脑途径，如胰岛素、转铁蛋白等特异性受体天然存在于脑毛细血管内皮细胞膜上，使用能结合这些受体的特异性载体用于药物转运；（2）血脑屏障内皮细胞带有一定的负电荷，使用带正电荷的材料如脂质体或纳米粒作为载体，利用吸附作用可运送药物进入脑内；（3）利用直接能携带蛋白质穿过细胞膜的肽类载体如穿膜肽（TAT），将蛋白质转运入脑。

目前，利用单克隆抗体等载体实现脑靶向给药依然是突破血脑屏障的主要手段，2012年将有两个老年痴呆治疗性单克隆抗体药物进入III期临床（http://www.nature.com/news/new-year-new-science-1.9730）。为提高入脑效率，降低副作用，越来越多的研究者试图整合多个载体优势，开发更高效更安全的脑靶向递药载体。如在传统的脂质体载体上掺入脑内受体的配体，抗原决定簇的抗体、靶向肽或穿膜肽，用以提高脑靶向性和载药能力。其中穿膜肽（TAT）成为新的研究热点。

1988年，研究者首次发现人类免疫缺陷病毒（HIV）的反式激活蛋白（TAT）能够跨膜导入细胞内，并保持细胞完好无损，称之为穿膜肽（TAT）。近年来发现并合成了大量穿膜肽，皆为富含阳离子短肽。大量研究证实这些短肽与异源蛋白质结合后，可有效携带比其分子质量大100倍的外源性疏水大分子进入细胞。Schwarze等通过腹腔注射穿膜肽与β-半乳糖苷酶组成的融合蛋白，结果发现穿膜肽能携带该蛋白（分子量高达120 kDa）通过血脑屏障到达脑组织，并能保持酶活性。一系列穿膜肽的发现和应用给脑靶向系统的研发注入了新的活力。不过同时也有研究者担心，高穿膜活性的TAT必然伴随有高细胞毒性。研究发现，低剂量下使用TAT并无细胞毒性。Suhorutsenko J等的研究证实体外实验以10 μM 剂量，体内实验以5 mg/kg的剂量使用TAT是安全的。但同时研究也发现，GFP与穿膜肽融合蛋白在血脑屏障完好无损的情况下入脑效率并不高。

将药物分子搭载于各类靶向载体，可以成功穿越血脑屏障，但需克服载体/复合物产生的免疫反应和细胞毒性。理想的脑靶向递药载体应可以在低剂量下，无创伤给药并将药物高效送入脑内，而载体不进入脑部，避免免疫反应和细胞毒性。

病毒即采用这种方式将病毒基因递送入细胞。病毒由衣壳蛋白和内核基因组成，在侵染至靶细胞内后，脱去衣壳蛋白，内核基因进入宿主细胞。此外，病毒侵染也是天然的入脑通路。不过使用基因治疗必须在体内转录翻译为蛋白质发挥药效。基因持续表达的时间不长、疗效不稳定、对移植部位微环境的影响大小不明确以及可能增加癌变的可能性等问题都引起研究者们的普遍担心。同时，载体安全性也备受关注。同样使用AAV作为载体，荷载有肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）抑制剂基因的基因治疗药物就曾在2007年导致患者死亡，造成恐慌。因此，新的脑靶向载体的设计与开发仍十分迫切。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有脑靶向作用的多亚基蛋白质。

本发明的另一目的是提供生产该蛋白质的方法。

本发明的再一目的是提供了该蛋白质的给药途径及用途。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种具有脑靶向作用的多亚基蛋白质，由一个氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的EGFP-CTA2-TAT亚基和五个氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的CTB亚基构成；该蛋白质中含有一个EGFP-CTA2-TAT亚基，EGFP氨基酸序列为SEQ ID NO.3，CTA2氨基酸序列为SEQ ID NO.4，TAT氨基酸序列为SEQ ID NO.5；

一种具有脑靶向作用的多亚基蛋白质的制备方法，包括用化学合成法和PCR法合成CTB和CTA2-EGFP-TAT的编码序列DNA，将这些DNA分步插入不相容表达载体，采用分步转化法将不相容双质粒转化至大肠杆菌BL21中，采用不相容双质粒表达的方法在大肠杆菌BL21中共表达蛋白质，得到6聚体（CTB）₅/EGFP-CTA2-TAT蛋白，具体方法如下：

该蛋白质采用基因工程手段，将霍乱毒素A亚基基因A2（CTA2）与增强型绿色荧光蛋白（EGFP）以及穿膜肽（TAT）融合表达；本发明的融合蛋白亚基使用“EGFP-CTA2-TAT”表示，含有CTA2、EGFP和TAT依次串联，CTB是指来源于霍乱毒菌的霍乱毒素的B亚基，将串联蛋白亚基与CTB分别使用不相容质粒共表达于大肠杆菌，得到六聚体蛋白质CTB₅/EGFP-CTA2-TAT：

（1）基因设计与获得

霍乱毒素B亚基基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。该序列是将野生型的CTB的核苷酸序列的信号肽基因序列切去，获得高表达量的的CTB基因。此外以天然的EGFP、CTA2、TAT氨基酸序列为模板，在EGFP与CTA2之间插入3个酶切位点（Nhe I、EcoR I、Sac I）和linker（GGGGS)，通过密码子优化获得的新的基因，基因序列如SEQ ID NO:7所示，由北京普尔普乐公司全合成。

（2）基因工程菌的构建

采用primer premier5.0专业引物设计软件设计兼并引物如SEQ ID NO:8^9所示，对SEQ ID NO.6进行PCR扩增，通过Nco I和Xho I连入PET-28a载体中，转化至大肠杆菌DH5α中，进行质粒提取，质粒PCR、菌液PCR、双酶切、测序鉴定，获得构建重组质粒PET-28a-CTB。

采用primer premier5.0专业引物设计软件设计兼并引物如SEQ ID NO:10^11所示，将SEQ ID NO.7进行PCR扩增，通过Nde I和Xho I酶切位点连入PET-22b（+）载体中，转化至大肠杆菌DH5α中，进行质粒提取，质粒PCR、菌液PCR、双酶切、测序鉴定，获得构建重组质粒PET-22b-EGFP-CTA2-TAT 。

将PET-28a-CTB转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态中，在30mmol/lKan抗生素压力下选择稳定存在的单菌落。将上述工程菌做成感受态，将重组质粒PET-22b-EGFP-CTA2-TAT转化至该感受态中，在100mmol/l Amp和30mmol/l Kan双抗性选择压力下筛选能稳定传代的工程菌。

（3）多亚基蛋白质的表达纯化

在100mmol/l Amp和30mmol/l Kan双抗性选择压力下筛选能稳定传代的工程菌。在培养基中同时存在两种抗生素，缺乏任何一种质粒的细菌都会因为失去该质粒所携带的抗性而被相应的抗生素杀死，因此存活下来的细菌中同时含有这两种不相容质粒，并能够同时表达这两种质粒所携带的基因。其中EGFP与CTA2和TAT融合后为可溶性表达，CTB本身是包涵体表达，但由于形成的5聚体会与EGFP-CTA2-TAT重新组装形成6聚体（CTB5/EGFP-CTA2-TAT），组装之后变为有活性的可溶性表达，无需进行包涵体复性，可直接使用NI柱纯化得到目的蛋白质。

通过基因工程手段，使用其他蛋白替换EGFP-CTA2-TAT亚基中的EGFP蛋白，可以将其他蛋白用于靶向入脑；

一种具有脑靶向作用的多亚基蛋白质的应用：多亚基蛋白质通过滴鼻给药，将EGFP-CTA2-TAT通过血脑屏障，靶向入脑。

一种具有脑靶向作用的多亚基蛋白质的应用：该蛋白质可与药物载体或药物活性成分组合制成药物组合物。

本发明模拟病毒的天然侵染过程，构建类似于病毒衣壳蛋白的载体，携带蛋白质药物，使用鼻粘膜给药方式，侵染细胞后，蛋白质药物穿越细胞进入脑内发挥药效，载体则仍然留在细胞外。

霍乱毒素（CT）由A亚基（CTA，包括CTA₁和CTA₂）和B亚基（CTB）组成。五聚体CTB₅与A亚基以共价方式结合，其侵染粘膜细胞的方式与病毒极为类似：无毒的CTB₅与鼻粘膜细胞上神经节苷脂（GM1）受体结合，将整个分子“锚定”于粘膜表面。无毒CTA₂亚基有弱穿膜活性，经其引导，有毒的CTA₁亚基可被“注射”入细胞内，发挥毒性作用。

本发明使用霍乱毒素无毒五聚体CTB₅模拟病毒衣壳蛋白“锚定”细胞膜，以高穿膜活性短肽TAT增加CTA₂亚基的穿膜活性，将有毒的CTA₁亚基替换为增强型绿色荧光蛋白（EGFP）作为荷载蛋白主体，得到一个脑靶向蛋白质，用于EGFP的脑靶向研究。

本发明的有效益处：

1. 本发明人通过模拟天然霍乱毒素致病原理，获得一种具有脑靶向作用的多亚基蛋白质，为研究入脑蛋白药物提供了更加丰富的内容和研究手段；

2. 本发明通过密码子优化、筛选、基因合成得到一条新的EGFP-CTA2-TAT基因，通过Nde I和Xho I酶切位点连入PET-22b（+）载体中，使该基因适宜在大肠杆菌中上清表达；

3. 本发明改造了CTB基因，使该蛋白更容易与EGFP-CTA2-TAT形成6聚体；

4. 本发明融合了EGFP蛋白，便于观察；

5. 本发明采用大肠杆菌作为宿主菌，其转化效率高。

附图说明

图1：pET-28a-CTB载体构建流程图；

图2：CTB基因PCR扩增电泳图；（1 :CTB基因PCR产物；M :5kb DNA ladder Marker）；

图3：重组质粒pET28a-CTB C端部分基因测序结果；

图4：pET-22b-EGFP-CTA2-TAT载体构建流程图；

图5：EGFP-CTA2-TAT扩增电泳图；（1:EGFP基因PCR产物；M:5kb DNA ladder Marker）；

图6：重组质粒pET-22b-EGFP-CTA2-TAT C端部分基因测序结果；

图7：质粒及菌液PCR鉴定图；（1:目的基因CTB的PCR产物；2:目的基因EGFP的PCR产物；3:BL21(DE3)-PET-28a质粒PCR；4:BL21(DE3)-PET-22b质粒PCR；5:BL21(DE3)-PET-28a-CTB质粒PCR；6:BL21(DE3)-PET-22b-EGFP-CTA2-TAT质粒PCR；7:BL21(DE3)-PET-28a-CTB/PET-22b-EGFP-CTA2-TAT抽提的质粒PCR；M:5kb DNA ladder Marker；8：BL21(DE3)-PET-28a-CTB/PET-22b-EGFP-CTA2-TAT菌液PCR；9:BL21(DE3)-PET-22b-EGFP-CTA2-TAT菌液PCR；10:BL21(DE3)-PET-28a-CTB菌液PCR；11:BL21(DE3)-PET-22b菌液PCR；12:BL21(DE3)-PET-28a菌液PCR；13:目的基因EGFP的PCR产物；14:目的基因CTB的PCR产物）；

图8：酶切鉴定图；(M：5kb DNA ladder Marker；1：菌种抽提质粒；2：PET-22b-EGFP-CTA2-TAT；3：PET-22b（+）；4：PET-28a-CTB；5：PET-28a；6：菌种抽提质粒经Nco I、HindⅢ、Nde I、Xho I四酶切；7：目的基因EGFP的PCR产物；8：目的基因CTB的PCR产物)；

图9：纯化谱图；

图10：SDS-PAGE电泳结果图；(M：protein marker 1： BL21(DE3) (PET-28a-CTB/PET-22b（+）-EGFP-CTA2-TAT)未诱导 2：BL21(DE3)(PET-28a-CTB/PET-22b（+）-EGFP-CTA2-TAT) 37度过夜诱导全菌 3：诱导全菌冻融破碎上清 4：诱导全菌冻融破碎沉淀 5：纯化后CTB₅/EGFP-CTA2-TAT)；

图11：PAGE电泳结果图；(1：(CTB)₅/EGFP-CTA2-TAT M：marker）；

图12：western blot鉴定图；（1：(CTB)₅/EGFP-CTA2-TAT 2：EGFP-CTA2-TAT 3：CTB 4：EGFP)；

图13：进出细胞结果图；（A：正常光照下的细胞图 B：激发光下的细胞图）。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步地描述，但具体实施例并不对本发明做任何限制，实施例中如无特殊说明，均为本领域常规实验手段。

实施例中所用到的生物材料及来源：

（1）载体pET-28a：北京天恩泽公司；

（2）载体pET-22b（+）：北京天恩泽公司；

（3）大肠杆菌DH5α：暨南大学赠送；

（4）大肠杆菌Rosetta：暨南大学赠送；

（5）大肠杆菌BL21(DE3)：华南农业大学赠送；

（6） EGFP-CTA2-TAT基因：北京普尔普乐公司合成；

（7） CTB基因：由本实验室保存及修饰。

实施例1 编码CTB基因的工程菌构建

天然的霍乱毒素B亚基由372个核苷酸编码124个氨基酸，利用PCR技术去除霍乱毒素B亚基前端的63个核苷酸，这21个氨基酸是CTB的信号肽，去除它有利于提高CTB的表达量，去除后并不影响其生物活性，其DNA和氨基酸序列分别如SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:2所示。pET-28a-CTB载体构建流程如图1所示。具体步骤如下所示：

1.采用上游引物： 5’-CATGCCATGGGAACACCTCAAAATATTACT-3’ SEQ ID NO:8 ，

下游引物： 5’-CCGCTCGAGATTTGCCATACTAATTGC-3’ SEQ ID NO:9；

进行PCR扩增，PCR反应体系：50ul 体系中含10×PCR buffer 5ul (不含Mg2+)，dNTP 1ul ，上、下游引物各1ul，模板DNA 1ul（约0.7ug）、pfu DNA聚合酶1ul，Mg2+ 加至1.0mmol/l，加ddH2O至50ul。反应条件为：95℃预变性5min，95℃变性30s，30℃退火30s，72℃延伸30s，循环35轮，最后一轮结束后进行总延伸72℃ 10min，得到PCR产物，扩增电泳结果如图2所示。利用凝胶纯化的方法纯化回收获得CTB基因片段。为方便后续操作，在上下用引物中分别引入Nco I和Xho I酶切位点（下划线部分），经过序列比较证实，PCR扩增得到的CTB编码基因与设计的CTB基因序列完全一致。

2. 通过Nco I和Xho I酶切位点连入PET-28a载体中，转化至大肠杆菌DH5α中，进行质粒提取，质粒PCR、菌液PCR、双酶切、测序鉴定，获得构建重组质粒PET-28a-CTB，测序结果见图3所示。

实施例2 编码EGFP-CTA2-TAT基因的工程菌构建

1. pET-22b-EGFP-CTA2-TAT载体构建流程如图4所示。具体过程为：以天然的CTA2、EGFP、TAT氨基酸序列为模板，通过密码子优化获得的基因序列如SEQ ID NO:3所示，由公司全合成。将上述基因序列进行PCR扩增，扩增引物如SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11所示：

采用上游引物： 5’-GGGAATTCCATATGGTGAGCAAGG-3’ SEQ ID NO:10

下游引物： 5’-CCGCTCGAGCTGTGGTGGAC-3’ SEQ ID NO:11

2. PCR反应体系：50ul 体系中含10×PCR buffer 5ul (不含Mg2+)，dNTP 1ul ，上、下游引物各1ul，模板DNA 1ul（约0.5ug）、pfu DNA聚合酶1ul，Mg2+ 加至1.0mmol/l，加ddH2O至50ul。反应条件为：95℃预变性5min，95℃变性30s， 58℃退火30s， 72℃延伸90s，循环35轮，最后一轮结束后进行总延伸72℃ 10min，得到PCR产物，扩增电泳结果如图5所示。

3. 通过Nde I和Xho I酶切位点连入PET-22b（+）载体中，转化至大肠杆菌DH5α中，进行质粒提取，质粒PCR、菌液PCR、双酶切、测序鉴定，获得构建重组质粒pET-22b-EGFP-CTA2-TAT。测序结果见图6所示。

实施例3 分步转化获得目的蛋白表达工程菌

将PET-28a-CTB转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态中，在30mmol/lKan抗生素压力下选择稳定存在的单菌落，在37℃、IPTG终溶度为0.75mmol/l、200rpm、诱导过夜，挑选出稳定表达的工程菌。将上述工程菌做成感受态，将重组质粒PET-22b-EGFP-CTA2-TAT转化至该感受态中，在100mmol/l Amp和30mmol/lKan双抗性选择压力下筛选能稳定传代的工程菌。质粒及菌液PCR鉴定如图7所示。酶切鉴定如图8所示。

实施例4 重组蛋白在大肠杆菌中的表达

（1）诱导

将实施例3中筛选的稳定传代的工程菌接种于含100mmol/l Amp和30mmol/l Kan新的液体LB培养基中在37℃培养过夜。将过夜培养的菌液按再按2%转接至新的 100mmol/l Amp和30mmol/l Kan新的液体LB培养基中，37℃，200 r/min ，当长至OD300达到0.6-1.0 （约4h）时，加入终浓度为 0.75mmol/l 的IPTG， 30℃ 、200rpm诱导16h以上。 10000rpm、10min收集菌体，称重。

（2）破碎

按湿菌：结合缓冲液为1：40的比例加入结合缓冲液，加入溶菌酶至终浓度为0.2mg/ml，混合物于-20℃-4℃中反复过夜冻融3次后破碎菌体，加入DNAse 、RNAse 、MgCl2至终浓度分别为750u/ml、150u/mg、1mg/l于4℃摇至无粘性， 10000rpm、100min×3收集上清，用0.45um滤头过滤。

（3）纯化

装柱，加入3-5个柱体积的蒸馏水在自然重力条件下压柱。先用纯水洗柱3-5个柱体积，流速为1.5 ml/min，压力为0.1 MP。用3-5个柱体积结合缓冲液洗柱子（20 mmol/lPB缓冲液、500 mmol/l NaCl 、20 mmol/l咪唑 PH 7.4) ，流速为1.5 ml/min，压力为0.1MP。用上样泵进行上样，流速为0.4 ml/min。用3-5个柱体积结合缓冲液平衡柱子（20 mmol/l PB缓冲液、500 mmol/l NaCl 、20 mmol/l咪唑 PH 7.4) ，洗至基线。流速为1.5 ml/min，压力为0.1MP。用3-5个柱体积洗涤缓冲液洗杂蛋白（20 mmol/l PB缓冲液、500 mmol/l NaCl 、50 mmol/l咪唑 PH 7.4) ，洗至基线。流速为2.0 ml/min，压力为0.1MP。用洗脱缓冲液洗脱目的蛋白（20 mmol/l PB缓冲液、500 mmol/l NaCl 、125 mmol/l咪唑 PH 7.4)，洗至基线。流速为1.5ml/min，压力为0.1MP。先用纯水洗柱10个柱体积，流速为2.0 ml/min，压力为0.1MP。

纯化谱图如图9所示，SDS-PAGE电泳结果如图10所示，PAGE电泳结果如图11所示。

实施例5 目的蛋白鉴定

采用western blot方法鉴定

先制好 12%PAGE 凝胶，然后取蛋白样品，按每孔 10μg 上样量与 2×上样缓冲液混合后，沸水中煮 5min，室温 12000rpm 离心 5min，吸取上清，小心点样加入到 12%PAGE 凝胶的上样孔内。在一个空上样孔中加入 2μL 预染的蛋白 Marker。电泳程序为：浓缩胶 45V；分离胶 90V。

电泳结束后，在转膜夹上放用转膜液预湿的海绵垫子，盖上三层用转膜液预湿的滤纸，然后将凝胶取出，放在甲醇预湿的 PVDF 膜上，然后转移至滤纸上，再盖上滤纸和海绵垫子，除去气泡，形成一个类似三明治的结构，合上夹子，放入转膜槽中，加满转膜缓冲液，盖好盖子，四周用冰块将转膜槽盖严，室温，100V转移 1h。转膜结束后，取出 PVDF 膜，根据预染蛋白 Marker 判断不同分子量大小的蛋白所在位置，适当剪膜，分别放入装有 5%封闭液的专用盒中，并做标记，室温摇动封闭 1h。加入 15mL 5%封闭液稀释后的EGFP一抗，室温，摇动孵育 1h，回收EGFP一抗。用 TBST 溶液洗涤膜，10min×3次， TBS 溶液洗涤膜，10min×1次。加入 15mL 5%封闭液稀释后的二抗，室温，摇动孵育 1h，回收二抗。用 TBST 溶液洗涤膜，10min×3次， TBS 溶液洗涤膜，10min×1次。

将膜平放到保鲜膜上，将混合好的 DAB 底物(按1ml蒸馏水加A 液、 B 液和C液各一滴)滴加到膜表面，均匀覆盖，室温反应30s- 1min 后，用蒸馏水终止反应，取出，拍照。

如图12所示。

实施例6 目的蛋白（CTB₅/EGFP-CTA2-TAT）穿膜活性鉴定

取对数生长期的胞小鼠成纤维细胞L-929消化后，按 1500 细胞/孔接种于 6孔板中，3 mL/孔。培养 5d 后，加药作用细胞。加蛋白（CTB₅/EGFP-CTA2-TAT）至终溶度为 3 μmol/L，作用 4 h 后，PBS 洗 3 次；用40%的多聚甲醛固定液固定15min，PBS 洗 3 次；用荧光显微镜下观察细胞内的荧光强弱如图13所示。

SEQUENCE LISTING

<110> 广东工业大学

<120> 一种以不相容双质粒共表达获得的脑靶向蛋白质

<130> 2014

<160> 11

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 319

<212> PRT

<213> 氨基酸序列

<400> 1

Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu

1 5 10 15

Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly

20 25 30

Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile

35 40 45

Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr

50 55 60

Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys

65 70 75 80

Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu

85 90 95

Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu

100 105 110

Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly

115 120 125

Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr

130 135 140

Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn

145 150 155 160

Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser

165 170 175

Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly

180 185 190

Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu

195 200 205

Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe

210 215 220

Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys Ala

225 230 235 240

Ser Glu Phe Glu Leu Gly Gly Gly Gly Ser Met Ser Asn Thr Cys Asp

245 250 255

Glu Lys Thr Gln Ser Leu Gly Val Lys Phe Leu Asp Glu Tyr Gln Ser

260 265 270

Lys Val Lys Arg Gln Ile Phe Ser Gly Tyr Gln Ser Asp Ile Asp Thr

275 280 285

His Asn Arg Ile Lys Asp Glu Leu Val Asp Gly Arg Lys Lys Arg Arg

290 295 300

Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln Leu Glu His His His His His His

305 310 315

<210> 2

<211> 104

<212> PRT

<213> 氨基酸序列

<400> 2

Met Thr Pro Gln Asn Ile Thr Asp Leu Cys Ala Glu Tyr His Asn Thr

1 5 10 15

Gln Ile Tyr Thr Leu Asn Asp Lys Ile Phe Ser Tyr Thr Glu Ser Leu

20 25 30

Ala Gly Lys Arg Glu Met Ala Ile Ile Thr Phe Lys Asn Gly Ala Ile

35 40 45

Phe Gln Val Glu Val Pro Gly Ser Gln His Ile Asp Ser Gln Lys Lys

50 55 60

Ala Ile Glu Arg Met Lys Asp Thr Leu Arg Ile Ala Tyr Leu Thr Glu

65 70 75 80

Ala Lys Val Glu Lys Leu Cys Val Trp Asn Asn Lys Thr Pro His Ala

85 90 95

Ile Ala Ala Ile Ser Met Ala Asn

100

<210> 3

<211> 239

<212> PRT

<213> 氨基酸序列

<400> 3

Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu

1 5 10 15

Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly

20 25 30

Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile

35 40 45

Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr

50 55 60

Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys

65 70 75 80

Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu

85 90 95

Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu

100 105 110

Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly

115 120 125

Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr

130 135 140

Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn

145 150 155 160

Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser

165 170 175

Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly

180 185 190

Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu

195 200 205

Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe

210 215 220

Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys

225 230 235

<210> 4

<211> 46

<212> PRT

<213> 氨基酸序列

<400> 4

Met Ser Asn Thr Cys Asp Glu Lys Thr Gln Ser Leu Gly Val Lys Phe

1 5 10 15

Leu Asp Glu Tyr Gln Ser Lys Val Lys Arg Gln Ile Phe Ser Gly Tyr

20 25 30

Gln Ser Asp Ile Asp Thr His Asn Arg Ile Lys Asp Glu Leu

35 40 45

<210> 5

<211> 13

<212> PRT

<213> 氨基酸序列

<400> 5

Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln

1 5 10

<210> 6

<211> 315

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

atgacacctc aaaatattac tgatttgtgt gcagaatacc acaacacaca aatatatacg 60

ctaaatgata agatattttc gtatacagaa tctctagctg gaaaaagaga gatggctatc 120

attactttta agaatggtgc aatttttcaa gtagaagtac caggtagtca acatatagat 180

tcacaaaaaa aagcgattga aaggatgaag gataccctga ggattgcata tcttactgaa 240

gctaaagtcg aaaagttatg tgtatggaat aataaaacgc ctcatgcgat tgccgcaatt 300

agtatggcaa attaa 315

<210> 7

<211> 942

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

catatggtga gcaagggcga ggagctgttc accggggtgg tgcccatcct ggtcgagctg 60

gacggcgacg taaacggcca caagttcagc gtgtccggcg agggcgaggg cgatgccacc 120

tacggcaagc tgaccctgaa gttcatctgc accaccggca agctgcccgt gccctggccc 180

accctcgtga ccaccctgac ctacggcgtg cagtgcttca gccgctaccc cgaccacatg 240

aagcagcacg acttcttcaa gtccgccatg cccgaaggct acgtccagga gcgcaccatc 300

ttcttcaagg acgacggcaa ctacaagacc cgcgccgagg tgaagttcga gggcgacacc 360

ctggtgaacc gcatcgagct gaagggcatc gacttcaagg aggacggcaa catcctgggg 420

cacaagctgg agtacaacta caacagccac aacgtctata tcatggccga caagcagaag 480

aacggcatca aggtgaactt caagatccgc cacaacatcg aggacggcag cgtgcagctc 540

gccgaccact accagcagaa cacccccatc ggcgacggcc ccgtgctgct gcccgacaac 600

cactacctga gcacccagtc cgccctgagc aaagacccca acgagaagcg cgatcacatg 660

gtcctgctgg agttcgtgac cgccgccggg atcactctcg gcatggacga gctgtacaag 720

gctagcgaat tcgagctcgg aggtggtgga tccatgagca atacgtgcga tgagaagaca 780

caaagcctgg gcgtgaaatt cttagacgaa tatcaaagca aagtgaaacg ccaaatcttc 840

agcggatacc aaagcgatat tgacacgcac aatcgcatca aggatgagtt agtcgacggt 900

cgtaagaaac gtcgtcagcg tcgtcgtcca ccacagctcg ag 942

<210> 8

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

catgccatgg gaacacctca aaatattact 30

<210> 9

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

ccgaagctca tttgccatac taattgc 27

<210> 10

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

gggaattcca tatggtgagc aagg 24

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

ccgctcgagc tgtggtggac 20

Claims

1.一种具有脑靶向作用的多亚基蛋白质，其特征在于：由一个氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的EGFP-CTA2-TAT亚基和五个氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的CTB亚基构成。

2.根据权利要求1所述的具有脑靶向作用的多亚基蛋白质，其特征在于：该蛋白质中含有一个EGFP-CTA2-TAT亚基，EGFP氨基酸序列为SEQ ID NO.3，CTA2氨基酸序列为SEQ ID NO.4，TAT氨基酸序列为SEQ ID NO.5。

3.一种具有脑靶向作用的多亚基蛋白质的制备方法，其特征在于：包括用化学合成法和PCR法合成CTB和CTA2-EGFP-TAT的编码序列DNA，将这些DNA分步插入不相容表达载体，采用分步转化法将不相容双质粒转化至大肠杆菌BL21中，采用不相容双质粒表达的方法在大肠杆菌BL21中共表达蛋白质，得到6聚体（CTB）₅/EGFP-CTA2-TAT蛋白，具体方法如下：

（1）基因设计与获得

霍乱毒素B亚基基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；该序列是将野生型的CTB的核苷酸序列的信号肽基因序列切去，获得高表达量的的CTB基因；此外以天然的EGFP、CTA2、TAT氨基酸序列为模板，在EGFP与CTA2之间插入3个酶切位点：Nhe I、EcoR I、Sac I和linker：GGGGS，通过密码子优化获得的新的基因，基因序列如SEQ ID NO:7所示，由北京普尔普乐公司全合成；

（2）基因工程菌的构建

采用primer premier5.0专业引物设计软件设计兼并引物如SEQ ID NO:8^9所示，对SEQ ID NO.6进行PCR扩增，通过Nco I和Xho I连入PET-28a载体中，转化至大肠杆菌DH5α中，进行质粒提取，质粒PCR、菌液PCR、双酶切、测序鉴定，获得构建重组质粒PET-28a-CTB；

采用primer premier5.0专业引物设计软件设计兼并引物如SEQ ID NO:10^11所示，将SEQ ID NO.7进行PCR扩增，通过Nde I和Xho I酶切位点连入PET-22b（+）载体中，转化至大肠杆菌DH5α中，进行质粒提取，质粒PCR、菌液PCR、双酶切、测序鉴定，获得构建重组质粒PET-22b-EGFP-CTA2-TAT ；

将PET-28a-CTB转化至大肠杆菌BL21感受态中，在30mmol/lKan抗生素压力下选择稳定存在的单菌落；将上述工程菌做成感受态，将重组质粒PET-22b-EGFP-CTA2-TAT转化至该感受态中，在100mmol/l Amp和30mmol/l Kan双抗性选择压力下筛选能稳定传代的工程菌；

（3）多亚基蛋白质的表达纯化

在100mmol/l Amp和30mmol/l Kan双抗性选择压力下筛选能稳定传代的工程菌，在培养基中同时存在两种抗生素，缺乏任何一种质粒的细菌都会因为失去该质粒所携带的抗性而被相应的抗生素杀死，因此存活下来的细菌中同时含有这两种不相容质粒，并能够同时表达这两种质粒所携带的基因；其中EGFP与CTA2和TAT融合后为可溶性表达，CTB本身是包涵体表达，但由于形成的5聚体会与EGFP-CTA2-TAT重新组装形成6聚体CTB5/EGFP-CTA2-TAT，组装之后变为有活性的可溶性表达，无需进行包涵体复性，直接使用NI柱纯化得到目的蛋白质。

4.根据权利要求3所述的一种具有脑靶向作用的多亚基蛋白质的制备方法，其特征在于：通过基因工程手段，使用其他蛋白替换EGFP-CTA2-TAT亚基中的EGFP蛋白，可以将其他蛋白用于靶向入脑。

5.一种具有脑靶向作用的多亚基蛋白质的应用，其特征在于：多亚基蛋白质通过滴鼻给药，将EGFP-CTA2-TAT通过血脑屏障，靶向入脑。

6.一种具有脑靶向作用的多亚基蛋白质的应用，其特征在于：该蛋白质可与药物载体或药物活性成分组合制成药物组合物。