CN110078835A - 一种类egf蛋白及其构建方法、嵌合蛋白及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物工程技术领域，尤其涉及一种类EGF蛋白及其构建方法、嵌合蛋白及其制备方法和应用。本发明提供了一种类EGF蛋白，类EGF蛋白为EGF‑CTA2‑TAT蛋白，EGF‑CTA2‑TAT蛋白的核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示。本发明EGF‑CTA2‑TAT蛋白嵌合有具有修复作用的EGF蛋白、辅助透皮吸收的穿膜肽TAT和具有穿透细胞膜能力的霍乱毒素A2亚基(CTA2)，细胞活性实验测试结果表明EGF‑CTA2‑TAT蛋白对BALB/c 3T3细胞株有明显的促增长的作用，具有生物活性。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，尤其涉及一种类EGF蛋白及其构建方法、嵌合蛋白及其制备方法和应用。
背景技术
由于血脑屏障的选择性开启机制，血脑屏障是治疗性生物大分子运输的主要障碍，治疗性生物大分子在治疗中枢神经系统疾病的用途有限。虽然大分子蛋白质可借助透过细胞膜的肽类物质、利用特异性受体介导进入大脑，但是能够入脑的蛋白的设计与开发仍十分迫切。
发明内容
有鉴于此，本发明公开了一种类EGF蛋白及其构建方法、嵌合蛋白及其制备方法和应用，拓展了入脑蛋白的设计。
本发明的具体技术方案如下：
一种类EGF蛋白，所述类EGF蛋白为EGF-CTA2-TAT蛋白，所述EGF-CTA2-TAT蛋白的核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示。
本发明还提供了上述技术方案所述类EGF蛋白的构建方法，包括以下步骤：
将片段EGF酶切替换到pET22b-EGFP-CTA2-TAT载体中构建质粒pET22b-EGF-CTA2-TAT，再将所述质粒pET22b-EGF-CTA2-TAT导入宿主菌中进行蛋白表达，得到EGF-CTA2-TAT蛋白。
优选的，所述宿主菌为大肠杆菌BL21或大肠杆菌DH5a。
优选的，所述进行蛋白表达之后，所述得到EGF-CTA2-TAT蛋白之前，还包括：
进行蛋白纯化。
优选的，所述进行蛋白纯化具体为：
在亲和层析柱上复性进行蛋白纯化。
本发明还提供了一种嵌合蛋白，所述嵌合蛋白为EGF-CTA2-TAT/(CTB)5，所述嵌合蛋白由上述技术方案所述EGF-CTA2-TAT蛋白和CTB蛋白嵌合组装而成。
本发明还提供了上述技术方案所述嵌合蛋白的制备方法，包括以下步骤：
将所述EGF-CTA2-TAT蛋白与(CTB)5蛋白进行酸碱嵌合，得到嵌合蛋白EGF-CTA2-TAT/(CTB)5。
优选的，所述将所述EGF-CTA2-TAT蛋白与(CTB)5蛋白进行酸碱嵌合具体包括：
将所述EGF-CTA2-TAT蛋白与所述(CTB)5蛋白在pH 2.0～2.5、23℃～25℃下进行15min～30min变性，再在pH 8.3～8.5、4℃下进行1h～48h复性。
优选的，所述EGF-CTA2-TAT蛋白与所述(CTB)5蛋白的摩尔比为1：1。
本发明还提供了上述技术方案所述类EGF蛋白和/或上述技术方案所述嵌合蛋白在制备大脑损伤修复药物中的应用。
综上所述，本发明提供了一种类EGF蛋白，所述类EGF蛋白为EGF-CTA2-TAT蛋白，所述EGF-CTA2-TAT蛋白的核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示。本发明EGF-CTA2-TAT蛋白嵌合有具有修复作用的EGF蛋白、辅助透皮吸收的穿膜肽TAT和具有穿透细胞膜能力的霍乱毒素A2亚基(CTA2)，细胞活性实验测试结果表明EGF-CTA2-TAT蛋白对BALB/c 3T3细胞株有明显的促增长的作用，具有生物活性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为本发明实施例中pET22b-EGF-CTA2-TAT质粒的构建图；
图2为本发明实施例1中EGF-CTA2-TAT的SDS-PAGE电泳图，其中，泳道1为未诱导菌体，泳道2为菌液诱导5h，泳道3为湿菌体冻融裂解后的离心上清溶液，泳道4为包涵体溶解后的离心上清液；
图3为本发明实施例2中采用亲和层析柱纯化得到的EGF-CTA2-TAT蛋白的SDS-PAGE电泳图，其中，泳道3和泳道4为采用亲和层析柱纯化得到的EGF-CTA2-TAT蛋白；
图4为本发明实施例3中采用透析复性后亲和层析得到的EGF-CTA2-TAT蛋白的SDS-PAGE电泳图，其中，泳道2为透析复性后亲和层析得到的EGF-CTA2-TAT蛋白；
图5为本发明实施例4中EGF-CTA2-TAT和CTB的Western Blot图(兔源一抗抗EGF、二抗羊抗兔)，左图为转膜图，右图为显影图；
图6为本发明实施例4中EGF-CTA2-TAT和CTB的Western Blot图(兔源一抗抗CTB、二抗羊抗兔)，左图为转膜图，右图为显影图；
图7为本发明实施例5中酶标仪测定10μg/ml的EGF-CTA2-TAT/(CTB)5、CTB、EGF-CTA2-TAT对GM1受体的结合活性的吸光度；
图8为本发明实施例6中酶标仪测定蛋白样品溶液对BALB/c 3T3细胞株促生长的吸光度，其中，Control是空白组，EGF-CTA2-TAT.1为通过透析复性后亲和层析获得的蛋白，EGF-CTA2-TAT.2为在亲和层析柱上复性获得的蛋白，EGF-CTA2-TAT/(CTB)5.1、EGF-CTA2-TAT/(CTB)5.2分别为EGF-CTA2-TAT.1、2与(CTB)5蛋白酸碱嵌合获得的嵌合蛋白；
图9为本发明实施例7中不同处理组小鼠的逃逸潜伏期。
具体实施方式
本发明公开了一种类EGF蛋白及其构建方法、嵌合蛋白及其制备方法和应用，拓展了入脑蛋白的设计。
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式仅仅是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。
一种类EGF蛋白，类EGF蛋白为EGF-CTA2-TAT蛋白，EGF-CTA2-TAT蛋白的核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示。
本发明EGF-CTA2-TAT蛋白嵌合有具有修复作用的EGF蛋白、辅助透皮吸收的穿膜肽TAT和具有穿透细胞膜能力的霍乱毒素A2亚基(CTA2)，细胞活性实验测试结果表明EGF-CTA2-TAT蛋白对BALB/c 3T3细胞株有明显的促增长的作用，具有生物活性。
本发明实施例中，EGF蛋白为人重组EGF蛋白。
本发明还提供了上述技术方案类EGF蛋白的构建方法，包括以下步骤：
将片段EGF酶切替换到pET22b-EGFP-CTA2-TAT载体中构建质粒pET22b-EGF-CTA2-TAT，再将质粒pET22b-EGF-CTA2-TAT导入宿主菌中进行蛋白表达，得到EGF-CTA2-TAT蛋白。
质粒pET22b-EGF-CTA2-TAT经上海生工测序，确认质粒pET22b-EGF-CTA2-TAT正确合成。
本发明实施例中，宿主菌为大肠杆菌BL21。
本发明实施例中，质粒pET22b-EGF-CTA2-TAT导入宿主菌中进行蛋白表达具体包括：质粒pET22b-EGF-CTA2-TAT导入宿主菌得到pET22b-EGF-CTA2-TAT/BL21菌液，将pET22b-EGF-CTA2-TAT/BL21菌液加入氨苄青霉素溶液进行培养，再加入IPTG储存液诱导蛋白质表达，裂解、冻融破碎获得包涵体，再通过溶解方法获得EGF-CTA2-TAT蛋白。
本发明实施例中，进行蛋白表达之后，得到EGF-CTA2-TAT蛋白和CTB蛋白之前，还包括：
进行蛋白纯化。
本发明实施例中，进行蛋白纯化具体为：
在亲和层析柱上复性进行蛋白纯化。
本发明实施例中，进行蛋白纯化之后，还包括：冻干。
本发明实施例将片段EGF酶切替换到pET22b-EGFP-CTA2-TAT载体中构建质粒pET22b-EGF-CTA2-TAT，再将质粒pET22b-EGF-CTA2-TAT导入大肠杆菌BL21中，得到pET22b-EGF-CTA2-TAT/BL21进行蛋白表达，通过裂解、冻融破碎获得包涵体，再通过溶解方法获得EGF-CTA2-TAT蛋白并在亲和层析柱上复性进行了纯化，经SDS PAGE灰度检测测定EGF-CTA2-TAT蛋白的纯度为90％，冻干后计算EGF-CTA2-TAT蛋白的得率为4.23％。通过细胞活性实验表明通过该构建方法得到的EGF-CTA2-TAT蛋白对BALB/c 3T3细胞株有明显的促增长的作用，具有生物活性。
本发明实施例中，亲和层析柱为镍柱，能够加快EGF-CTA2-TAT蛋白的纯化，并极大提高蛋白纯度，得到的蛋白纯度为90％。
本发明实施例中，类EGF蛋白的构建方法更具体包括如下步骤：
将质粒pET22b-EGF-CTA2-TAT导入宿主菌得到pET22b-EGF-CTA2-TAT/BL21菌液，将pET22b-EGF-CTA2-TAT/BL21菌液加入氨苄青霉素溶液进行培养12h，再扩大培养4h，再加入IPTG储存液诱导5h。离心收集湿菌体后，加10ml：1g的裂解液和溶菌酶(80μg/mL)，冻融，离心取包涵体。按每克包涵体湿重加入10mL包涵体洗涤液A，分别用洗涤液A悬浮包涵体0.5h，离心，弃上清，重复3次。洗涤液B按上述步骤重复3次，然后用蒸馏水洗去残留的洗涤液2次，离心收集沉淀。洗涤后的包涵体沉淀，按1g包涵体湿重：10mL 8moL/L的溶解液添加，搅拌悬浮6h后离心，取上清，留作后续在亲和层析柱上复性进行蛋白纯化。对亲和层析柱进行装柱：检漏，将镍-琼脂糖凝胶6FF装入离子交换柱中，打开核酸蛋白检测仪，用去离子水过柱，蠕动泵rpm 1.0过夜；调蠕动泵rpm 4.8，用10倍凝胶体积的8mol/L尿素-Tris-HCl缓冲液平衡，上样，然后分别用10倍凝胶体积的8、6、4、2、1、0.5、0mol/L尿素-Tris-HCl缓冲液复性蛋白。调蠕动泵rpm3.2，用20、50、100、200mmol/L咪唑溶液洗脱蛋白，获得蛋白溶液。SDS-PAGE电泳确定蛋白溶液为纯目的蛋白溶液。把蛋白溶液置于培养皿中，-80℃冰冻2h，然后使用冻干机冻干获得EGF-CTA2-TAT蛋白。
本发明还提供了一种嵌合蛋白，嵌合蛋白为EGF-CTA2-TAT/(CTB)5，嵌合蛋白由上述技术方案EGF-CTA2-TAT蛋白和(CTB)5蛋白嵌合组装而成。
本发明嵌合蛋白为EGF-CTA2-TAT/(CTB)5，由EGF-CTA2-TAT和(CTB)5嵌合组装而成，血脑屏障、鼻黏膜上有丰富的神经节苷脂GM1，霍乱毒素B亚基(CTB)能与其结合；霍乱毒素A2亚基(CTA2)能与CTB结合，且本身具有弱穿透细胞膜的能力；穿膜肽TAT能够跨膜导入细胞内，并保持细胞完好无损；表皮生长因子具有能维持体外神经元的存活，促进神经干细胞分化为神经元，并修复神经元的神经纤维延长功能，本发明EGF-CTA2-TAT嵌合有修复作用的人重组EGF蛋白、能与CTB嵌合的CTA2和辅助透皮吸收的穿膜肽TAT蛋白嵌合在一起，并将EGF-CTA2-TAT蛋白与(CTB)5蛋白通过酸碱嵌合，得到了嵌合蛋白EGF-CTA2-TAT/(CTB)5，通过神经节苷脂GM1-ELISA实验表明嵌合蛋白保留(CTB)5与GM1的结合活性，通过细胞活性实验测试表明嵌合蛋白对3T3细胞具有69.55％的促增长的作用，表明嵌合蛋白具有生物活性，具有用于通过滴鼻入脑修复大脑损伤的应用前景。
本发明还提供了上述技术方案嵌合蛋白的制备方法，包括以下步骤：
将EGF-CTA2-TAT蛋白与(CTB)5蛋白进行酸碱嵌合，得到嵌合蛋白EGF-CTA2-TAT/(CTB)5。
本发明实施例中，将EGF-CTA2-TAT蛋白与(CTB)5蛋白进行酸碱嵌合具体包括：
将EGF-CTA2-TAT蛋白与CTB蛋白在pH 2.0～2.5、23℃～25℃下进行15min～30min变性，再在pH 8.3～8.5、4℃下进行1h～48h复性。
更优选为将EGF-CTA2-TAT蛋白与(CTB)5蛋白在pH 2.3、23℃下进行20min变性，再在pH 8.5、4℃下进行1h复性。
本发明实施例中，变性的pH值采用0.5M柠檬酸调节，复性的pH值采用2M Tris调节。
本发明实施例中，EGF-CTA2-TAT蛋白与(CTB)5蛋白的摩尔比为1：1。
本发明制备方法得到的嵌合蛋白具有生物活性，并能大量、快速生产，能够用于通过滴鼻入脑修复大脑损伤。
本发明还提供了上述技术方案类EGF蛋白和/或上述技术方案嵌合蛋白在制备大脑损伤修复药物中的应用。
为了进一步理解本发明，下面结合具体实施例对本发明进行详细阐述。
实施例1
请参阅图1，为本发明实施例中pET22b-EGF-CTA2-TAT质粒的构建图。本实施例将质粒pET22b-EGF-CTA2-TAT导入大肠杆菌BL21后，得到pET22b-EGF-CTA2-TAT/BL21进行蛋白表达，通过裂解、冻融破碎获得包涵体，再通过溶解方法获得EGF-CTA2-TAT蛋白，包括以下步骤：
1)蛋白表达：在超净工作台上分别往6支试管(7mL)中加入7μL氨苄青霉素溶液(储存液50mg/mL，终浓度50μg/mL)和10μL pET22b-EGF-CTA2-TAT/BL21菌液，将试管置于37℃的恒温培养振荡箱以200rpm转速振荡摇菌培养过夜12h。12h后取出经过夜培养的6支试管，在超净工作台上按2％的接种量转接到含350μL氨苄青霉素溶液(储存液50mg/mL，终浓度50μg/mL)的350mL LB液体培养基的锥形瓶中，将6个锥形瓶置于37℃的恒温振荡培养箱以200rpm转速振荡摇菌培养4h。4h后，在超净工作台上分别往6个锥形瓶中各加入350μL IPTG储存液(储存液1mol/L，终浓度为1mmol/L)诱导蛋白质表达，置于37℃的恒温振荡培养箱以200rpm转速振荡摇菌培养5h。5h后，将培养液均匀分装至离心瓶，在4℃、转速10000rpm下进行10min离心收菌，收菌时每次均弃上清留沉淀，得到湿菌体。
2)获得包涵体：将步骤1)得到的湿菌体悬浮于裂解缓冲液中，根据湿菌体1g：裂解缓冲液10mL的比例加入裂解缓冲液，加入溶菌酶(80μg/mL)，搅拌1h完全悬浮菌体。湿菌体悬浮均匀后放入-80℃超低温保存箱冻至完全凝固，取出于37℃振荡培养箱解冻至完全变成液体时再次放入-80℃超低温保存箱冻完全凝固(30min/次)，取出于37℃下完全解冻(30min/次)。如此反复多次至菌液不再粘稠即可判断为冻融充分且完全。取出搅拌子，将裂解后的菌体离心，离心参数：温度4℃、离心转速10000rpm、时间15min，收集裂解上清和裂解沉淀，裂解沉淀为包涵体。
3)包涵体洗涤：按每克包涵体湿重加入10mL包涵体洗涤液A，在加热磁力搅拌器上使沉淀重新悬浮均匀30min后，以参数：温度4℃、转速10000r/min、离心时间15min离心，弃上清；称量剩下的沉淀重量，重复以上步骤多次至沉淀质量变化差异不大。同样加入包涵体洗涤液B并使沉淀重新悬浮均匀30min后，以与包涵体洗涤液A洗涤后离心的相同参数离心，弃上清，重复多次直至沉淀质量变化差异不大。最后，用蒸馏水洗去残留的洗涤液2次，收集上清，收集沉淀，得到洗涤后的包涵体。
4)溶解：将洗涤后的包涵体沉淀按1g包涵体湿重：10mL 8moL/L的尿素-Tris溶液添加尿素-Tris溶液，加入β巯基乙醇至终浓度为1％，搅拌至少6小时。当沉淀重新溶解和悬浮于尿素溶液时，用大容量高速冷冻离心机以温度4℃、转速10000rpm、离心时间20min的参数进行离心，得到溶解上清和溶解沉淀，收集所有溶解上清并做好保存。
5)将上述步骤诱导前菌液、诱导后菌液、裂解上清、溶解上清进行SDS-PAGE，结果如图2所示。图2表明，泳道2相比于泳道1在16kD处附近出现条带，即EGF-CTA2-TAT成功表达；在16kD附近，泳道3没有条带，泳道4有，所以EGF-CTA2-TAT以包涵体的形式表达，故该蛋白需要包涵体洗涤、纯化。
实施例2
本实施例将实施例1溶解上清经亲和层析柱(镍柱)上复性进行蛋白纯化，并冻干获得EGF-CTA2-TAT蛋白粉末，一共用时10小时。其中，蛋白纯化包括以下步骤：
1)装柱：检查亲和层析柱密闭性良好，将10mL填料(组氨酸标签凝胶)装入亲和层析柱中，同·时打开核酸蛋白检测仪预热30min，调节蠕动泵(最终rpm1.0、灵敏度1.0A、基线为0.02)，用去离子水洗12h；
2)复性：调节蠕动泵rpm 3.6，用30ml的8mol尿素-Tris-HCl缓冲液平衡洗，将20mL溶解上清加入亲和层析柱，上样完毕后，继续加30ml的8mol尿素-Tris-HCl缓冲液平衡，待峰值稳定再各用30ml的6、4、2、1、0.5、0mol/L尿素-Tris-HCl洗脱缓冲液过柱；
3)洗脱、收集出峰蛋白：分别用30ml的20、50、100、200、400mmol/L咪唑的洗脱缓冲液，用30ml Tris-HCl缓冲液再继续洗涤待数值稳定，收集出峰蛋白；
4)结束：数值稳定后换用0.5mol/L NaOH浸泡10min，冲洗(可调快流速)充分清洗之后将填料抽滤(不能抽干)置于20％乙醇中4℃保存，关闭仪器，清洗柱子。
请参阅图3，为本发明实施例2中采用亲和层析柱纯化得到的EGF-CTA2-TAT蛋白的SDS-PAGE电泳图，泳道3和泳道4为采用亲和层析柱纯化得到的EGF-CTA2-TAT蛋白。图3表明，通过亲和层析柱(镍柱)复性的方法进行蛋白纯化，得到的EGF-CTA2-TAT蛋白表达量非常纯，目的条带灰度占总条带的94％。
实施例3
本实施例将实施例1溶解上清经透析复性后亲和层析进行蛋白纯化，并冻干获得EGF-CTA2-TAT蛋白粉末，一共用时64个小时。其中，蛋白纯化包括以下步骤：
1)将透析袋剪成15-20cm的小段,在大体积(300ml)的2％(W/V)的NaHCO3和1mol/L的EDTA-2Na(pH＝8.00)中将透析袋煮沸10min。用蒸馏水彻底清洗透析袋后，装入溶解上清液并用夹子夹住两端，放入500mL烧杯中，依次在外液为6、4、2、1、0.5和0mol/L尿素溶液(溶剂为25mmol/L Tris-HCl)中透析，0mol/L时可以透析至少3次，每隔8h换一次液(前期透析时间可以调整)，透析在4℃的层析柜中进行，在外液中加搅拌子不断搅拌。
2)装柱：检查亲和层析柱密闭性良好，将10mL填料(组氨酸标签凝胶)装入亲和层析柱中，同时打开核酸蛋白检测仪预热30min，调节蠕动泵(最终rpm1.0、灵敏度1.0A、基线为0.02)，用去离子水洗12h；
3)洗脱、收集出峰蛋白：分别用30ml的20、50、100、200、400mmol/L咪唑的洗脱缓冲液，用30ml Tris-HCl缓冲液再继续洗涤待数值稳定，收集出峰蛋白；
4)结束：数值稳定后换用0.5mol/L NaOH浸泡10min，冲洗(可调快流速)充分清洗之后将填料抽滤(不能抽干)置于20％乙醇中4℃保存，关闭仪器，清洗柱子。
请参阅图4，为本发明实施例3中采用透析复性后亲和层析得到的EGF-CTA2-TAT蛋白的SDS-PAGE电泳图，泳道2为透析复性后亲和层析得到的EGF-CTA2-TAT蛋白。图4表明，通过透析复性后亲和层析获得的EGF-CTA2-TAT蛋白还有较多的杂蛋白，目的条带灰度占总条带的65％。
实施例4
本实施例将实施例2得到的EGF-CTA2-TAT蛋白粉末和CTB蛋白溶解于无菌水中进行western blot，结果请参阅图5和图6。图5显影图表明，EGF-CTA2-TAT有显示，CTB无显示，即16kD处的蛋白确定是EGF-CTA2-TAT。图6显影图表明，EGF-CTA2-TAT无显示，CTB有显示，即12kD处的蛋白确定是CTB。
实施例5
本实施例将EGF-CTA2-TAT蛋白与(CTB)5蛋白进行酸碱嵌合，得到嵌合蛋白EGF-CTA2-TAT/(CTB)5，再将嵌合蛋白EGF-CTA2-TAT/(CTB)5进行神经节苷脂GM1-ELISA实验，包括以下步骤：
1)BCA蛋白定量：将蛋白标准品按0、1、2、4、8、12、16、20μl加到96孔板的标准孔中，加标准稀释液(水)补足至20μl，即蛋白标准品浓度为0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/ml。将实施例2EGF-CTA2-TAT蛋白粉末加标准稀释液(水)进行溶解，得到样品上清液，再将样品上清液加到96孔板的样品孔中，标准孔和样品孔中加入200μL BCA工作液，37℃放置30min。在450nm下采用酶标仪进行检测，得到样品上清液中EGF-CTA2-TAT蛋白的浓度。
2)酸碱嵌合：将EGF-CTA2-TAT蛋白与(CTB)5蛋白按照摩尔比1:1加入至EP管中，缓慢加入十分之一体积的0.5M柠檬酸调pH为2.3，于23℃变性20min；20min后，加入12％体积的2M Tris调pH为8.5，在4℃复性至少1h，得到嵌合蛋白EGF-CTA2-TAT/(CTB)5。
3)GM1包被：用15μg/mL的GM1(溶解在PBS中)包被96孔板，每孔100μL，4℃过夜。GM1母液：1mg GM1+500μL PBS即为2mg/ml，稀释为15μg/ml，即稀释133.33倍。如12孔需1200μL的GM1。取11.25μL母液，加1488.75μL PBS，得到体积共1500μL的浓度为15μg/mL的GM1。
4)BSA封闭：移去包被液，用150μL枪头取PBST洗涤2次，第3次垫纸巾拍干。用含10％BSA的PBS溶液37℃封闭1h，每孔100μL。10％BSA的PBS溶液(w/v)：10g/100ml。
5)加入蛋白溶液：移去封闭液，用PBST洗涤3次拍干。加入EGF-CTA2-TAT、(CTB)5、EGF-CTA2-TAT/(CTB)5系列浓度稀释液(10、5、2.5、1.25、0.625μg/mL)(以PBS稀释)，同时设置阴性对照(只加PBS液)。每个浓度设3个平行孔，每孔100μL，37℃作用1h。PBST：含体积分数0.1％Tween20的PBS。
6)洗涤：移去蛋白溶液，用PBST洗涤3次，每次3min，每孔100μL。
7)加入一抗：每孔加入稀释的兔抗CTB IgG抗体100μL(稀释比例为1：200～1：2000，PBS稀释)，37℃放置1h。例如：按1：1000稀释，即2μL一抗可稀释为2ml。
8)洗涤：操作同步骤4)。
9)加入酶标二抗：加入稀释的辣根酶标记羊抗兔IgG抗体100μL(稀释比例为1：1000～1：10000)，37℃放置1h。例如：按1：1000稀释，即2μL一抗可稀释为2ml。
10)洗涤：操作同步骤4)。
11)加入底物溶液：将TMB工作液加入96孔板，并设置空白对照组，每孔100μL，室温避光作用15min。
12)加入终止剂测定OD值：每孔加入50μL的2mol/L H2SO4中止反应，测定OD450的值。
结果请参阅7，结果表明本实验室表达纯化的EGF-CTA2-TAT与阴性对照组并没有和GM1结合，EGF-CTA2-TAT/(CTB)5与GM1有非常好的结合活性。与阴性对照组相比，EGF-CTA2-TAT/(CTB)5组具有显著性差异，表明嵌合获得的EGF-CTA2-TAT/(CTB)5没有改变CTB和GM1的结合活性，理论上能有效结合鼻黏膜上的GM1，达到靶向治疗的作用。
实施例6
本实施例将冻干好的蛋白粉末用PBS稀释系列浓度，通过细胞活性实验测定嵌合蛋白EGF-CTA2-TAT/(CTB)5的生物活性，包括以下步骤：
将冻干好的蛋白粉末用PBS稀释，通过BCA蛋白浓度测定确定EGF-CTA2-TAT蛋白、嵌合蛋白EGF-CTA2-TAT/(CTB)5的浓度，将两种蛋白的浓度稀释为1520、152、15.0pg/mL，待用。
将BALB/c 3T3细胞株用完全培养液于37℃、5％二氧化碳条件下培养，控制细胞浓度为每1mL含1.0×105～5.0×105个细胞，传代后24～36h用于生物学活性测定。弃去培养瓶中的培养液，消化和收集细胞，用完全培养液配成每1mL含5.0×104～8.0×104个细胞的细胞悬液，接种于96孔细胞培养板中，每孔100μL，于37℃、5％二氧化碳条件下培养。24h后换成维持培养液，于37℃、5％二氧化碳条件下培养48h。制备的细胞培养板弃去维持培养液，加入1520、152、15.2pg/ml的EGF-CTA2-TAT和EGF-CTA2-TAT/(CTB)5，每孔100μL，于37℃、5％二氧化碳条件下培养30～36h。每孔加入MTT溶液20μL，于37℃、5％二氧化碳条件下培养5h。以上操作在无菌条件下进行。弃去培养板中的液体后，向每孔中加入二甲基亚砜100μL，混匀后在酶标仪上，以630nm为参比波长，在波长570nm处测定吸光度，记录测定结果。结果请参阅图8，结果表明本发明EGF-CTA2-TAT有良好的生物活性，实验室嵌合获得的EGF-CTA2-TAT/(CTB)5没有改变EGF-CTA2-TAT的生物活性，且在152pg/ml的浓度下有更好的促成纤维细胞增长的活性。
实施例7
本实施例将40只C57小鼠分为5组，每组8只，分别为正常组(Control)、模型组(LPS)、(CTB)5组、EGF-CTA2-TAT组和EGF-CTA2-TAT/(CTB)5组。将(CTB)5、EGF-CTA2-TAT和EGF-CTA2-TAT/(CTB)5分别溶于PBS并配置成浓度为225μg/ml的溶液。
在第0天～第14天，分别依次对空白组、模型组、(CTB)5组、EGF-CTA2-TAT组和EGF-CTA2-TAT/(CTB)5组小鼠滴鼻给药PBS、PBS、(CTB)5溶液、EGF-CTA2-TAT溶液和EGF-CTA2-TAT/(CTB)5溶液，各20μL。第15天～第21天在滴鼻给药的同时分别腹腔注射PBS、LPS溶液、LPS溶液、LPS溶液、LPS溶液，LPS溶液的浓度为250μg/kg。
进行莫里斯水迷宫测试以评估小鼠的学习和记忆能力。结果请参阅图9，结果表明模型组逃逸潜伏期相比于正常组明显降低，即记忆能力明显被破坏。(CTB)5、EGF-CTA2-TAT、EGF-CTA2-TAT/(CTB)5均有明显的恢复小鼠记忆能力的作用，并且EGF-CTA2-TAT/(CTB)5组的逃逸潜伏期接近正常组，治疗效果明显高于单独的(CTB)5、EGF-CTA2-TAT，说明嵌合后的蛋白EGF-CTA2-TAT/(CTB)5通过滴鼻给药的治疗效果明显高于没有嵌合的蛋白，表明EGF-CTA2-TAT/(CTB)5可更好地进入大脑。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 广东工业大学
<120> 一种类EGF蛋白及其构建方法、嵌合蛋白及其制备方法和应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 4
<211> 408
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
catatgaata gcgattcaga atgcccactg agtcacgatg gatattgctt acacgatggc 60
gtgtgtatgt atatcgaagc tctggacaag tatgcctgca actgcgtcgt aggttatatt 120
ggtgaacgtt gtcaatatcg tgatctgaaa tggtgggaac tgcgtgctag cgaattcgag 180
ctcggaggtg gtggatccat gagcaatacg tgcgatgaga agacacaaag cctgggcgtg 240
aaattcttag acgaatatca aagcaaagtg aaacgccaaa tcttcagcgg ataccaaagc 300
gatattgaca cgcacaatcg catcaaggat gagttagtcg acggtcgtaa gaaacgtcgt 360
cagcgtcgtc gtccaccaca gctcgagcac caccaccacc accactga 408
Claims (10)
1.一种类EGF蛋白，其特征在于，所述类EGF蛋白为EGF-CTA2-TAT蛋白，所述EGF-CTA2-TAT蛋白的核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示。
2.权利要求1所述类EGF蛋白的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
将片段EGF酶切替换到pET22b-EGFP-CTA2-TAT载体中构建质粒pET22b-EGF-CTA2-TAT，再将所述质粒pET22b-EGF-CTA2-TAT导入宿主菌中进行蛋白表达，得到EGF-CTA2-TAT蛋白。
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述宿主菌为大肠杆菌BL21或大肠杆菌DH5a。
4.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述进行蛋白表达之后，所述得到EGF-CTA2-TAT蛋白之前，还包括：
进行蛋白纯化。
5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述进行蛋白纯化具体为：
在亲和层析柱上复性进行蛋白纯化。
6.一种嵌合蛋白，其特征在于，所述嵌合蛋白为EGF-CTA2-TAT/(CTB)5，所述嵌合蛋白由权利要求1所述EGF-CTA2-TAT蛋白和CTB蛋白嵌合组装而成。
7.权利要求6所述嵌合蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将所述EGF-CTA2-TAT蛋白与(CTB)5蛋白进行酸碱嵌合，得到嵌合蛋白EGF-CTA2-TAT/(CTB)5。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述将所述EGF-CTA2-TAT蛋白与(CTB)5蛋白进行酸碱嵌合具体包括：
将所述EGF-CTA2-TAT蛋白与所述(CTB)5蛋白在pH2.0～2.5、23℃～25℃下进行15min～30min变性，再在pH8.3～8.5、4℃下进行1h～48h复性。
9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述EGF-CTA2-TAT蛋白与所述(CTB)5蛋白的摩尔比为1：1。
10.权利要求1所述类EGF蛋白和/或权利要求6所述嵌合蛋白在制备大脑损伤修复药物中的应用。
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