KR20110060865A - 리슈마니아증 및 결핵에 대한 백신 개발을 위한 dna 키메라의 작제 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 결핵균의 esat-6 영역 및 리슈마니아 도노바니의 키네신 영역이 DNA 백신 벡터 pVAX-1 내의 자가분열 펩티드의 양측에 함께 클로닝되어 있는 DNA 작제물의 신규한 재조합 키메라로서, 키메라 작제물이 전사 프로모터에 작동가능하게 연결됨으로써 포유동물의 세포 내에서 자가복제 및 발현할 수 있는 DNA 작제물의 신규한 재조합 키메라에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 DNA 작제물의 신규한 재조합 키메라의 제조방법으로서, 무작위 MHC Class-1 결합 펩티드 예측 서버를 이용하여 키네신 모터 도메인 및 esat-6 도메인의 예측되는 단백질 서열을 분석하고, 상기 키네신 모터 도메인 및 esat-6 도메인의 유전자 암호화 증폭 단계를 행하며, 키네신 esat-6 유전자 영역을 서열분석용 pGEM-T® 벡터에 클로닝하고, pVAX-1 벡터에서 방향성 클로닝을 하여 키메라 작제물을 발생시키고, 무세포 번역 시스템을 이용한 상기 클론 유래의 키네신 모터 도메인 및 esat-6 도메인의 시험관내 발현 분석 및 상기 작제물을 이용한 면역원성 연구, 비장세포 증식 및 사이토카인 연구를 행하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 포유동물의 숙주 세포 내에서 복제할 수 있는 자가절단 펩티드 (self-cleaving peptide)의 양측에 결핵균 (Mycobacterium tuberculosis)의 esat-6 영역 및 리슈마니아 도노바니 (Leishmania donovani)의 키네신 모터 도메인 영역 (kinesin motor domain region)이 함께 클로닝되어 있는 신규한 키메라 DNA 백신 작제물 (chimeric DNA vaccine construct)을 제공한다. 상기 작제물은 리슈마니아증 (leishmaniasis) 및 결핵 (tuberculosis)에 대한 보호를 위해 사용된다.
과거 100년에 걸쳐서, 감염원 (infectious agent)에 대한 백신의 개발 및 광범위한 사용은 의료과학의 업적들중 하나가 되어왔다. 이러한 백신의 성공에 대한 한 가지 이유는 상기 백신이 대부분의 바이러스 및 박테리아에 대한 면역 보호의 주요 성분인 항체의 생성 (체액성 면역)을 유도하는 효과가 탁월하기 때문이다. 그러나, 예를 들면 결핵균, 말라리아 기생충, 리슈마니아 기생충 및 인간면역결핍 바이러스(HIV)와 같이 의학적으로 중요한 세포내 유기체와 같은 예외들이 존재하는데, 이러한 유기체로부터의 보호는 항체의 유도 (체액성 면역)보다는 세포 매개 면역 (cell-mediated immunity)에 더욱 의존한다.
통상적인 능동 백신 (active vaccine)은 사균 또는 약독화 형태 (attenuated form)의 감염원으로 이루어진다. 또한, 감염원의 변형 생성물 (톡소이드 (toxoid)) 또는 감염원의 성분 (캡슐과 같은 것)이 사용된다. 이러한 백신은 이들이 유도하는 항체 반응에 일부 한계와 문제점을 가진다. 또한, 생존 불가능한(사균, 약독화 유기체, 톡소이드 또는 캡슐) 백신이 사용되고 얻어지는 보호 면역이 오래 지속되지 않는 경우, 다량의 백신을 반복적으로 투여할 필요가 있다. 더 나아가, 약독화 생백신 및 사백신을 제조하는 방법은 천연 단백질의 구조를 변화시킬 수 있기 때문에 백신의 항원성을 저하시킬 수 있고. 대부분의 경우 세포 매개 면역 반응이 아닌 체액성 면역 반응이 발생한다. 이러한 경우에 필요한 것은, 가능한 것은 아니지만, 사용하기 안전하고 내인성 (endogenous) 경로로 진행될 수 있어 궁극적으로 세포독성 T-임파구 (CTL)를 활성화시키는 항원이다. 이는 리슈마니아 기생충과 같은 세포내 병원체에 대해 매우 바람직하게 된다. 이러한 방식으로 발생된 활성화 CTL은 기생충 감염 세포를 파괴할 것이다.
따라서, 새로운 백신접종 방법이 광범위하게 연구되고 있는데, 이는 관련 항원에 대한 유전자를 함유하는 DNA 조각을 주사하는 것을 포함한다. 플라스모듐 (Plasmodium) 및 리슈마니아를 포함한 여러 기생충 및 인간의 마이코박테리움 (Mycobacterium spp)과 같은 여러 박테리아 종에 대한 DNA 백신으로 세포 면역 반응을 유도한다는 최근의 여러 보고들은, 이러한 면역화 방법의 임상적 적용가능성에 대한 기대를 불러일으키고 있다.
DNA 백신의 경우, 원하는 관련 항원(병원체 기원)에 대한 유전자는 포유동물의 세포에서 삽입 유전자의 발현을 증가시키도록 조작되는 박테리아 플라스미드로 클로닝된다. 동물에 주입된 후, 상기 플라스미드는 숙주 세포에 들어가고, 여기에서 숙주세포의 DNA와 통합되지 않고 핵 내에서 에피솜 (episome)으로 존재한다. 숙주세포의 대사 기구 (metabolic machinery)를 이용하여, 에피솜 내의 삽입 클론 DNA는 이것이 인코딩하는 항원의 합성을 지시한다.
세포 내에서 항원의 합성을 포함하는 방법은 외인성 (exogenous) 재조합 단백질 또는 사멸 유기체를 이용하여 면역화하는 것과 비교하여 몇 가지의 장점이 있다. 플라스미드-형질감염된 세포에 의해 생성된 단백질은 중화 항체의 생성에 유리한 천연 형상에서 접혀지기 쉽다. 더 나아가, 플라스미드 DNA의 지시하에 합성된 펩티드는 세포의 표면으로 이동할 수 있고, 세포 매개 면역을 더 유도하는 CD8+ 세포독성 T 세포의 자극에서 필수적 단계인 MHC class I 분자에 의해 발현될 수 있다. 반대로, 표준 백신 항원은 포식작용 (phagocytosis) 또는 세포내이동 (endocytosis)을 통해 세포 내로 흡수되고, 주로 항체 반응을 촉진하는 MHC class II 시스템을 통해 처리된다. 마지막으로, DNA 백신은 잔존하여 지속적인 면역반응을 촉진하는 것으로 나타났다.
적절한 면역 반응을 유도할 수 있는 것 이외에도, DNA 백신은 폴리펩티드의 적절한 접힘 (folding)을 확보하고, 장기간에 걸쳐 항원을 생성 및 방출할 수 있고 면역증강제 (adjuvant)를 필요로 하지 않는다는 장점 또한 있다. 다른 장점으로는 DNA 분자의 안정성, 긴 저장 수명, 및 엄격한 저온 유통을 필요로 하지 않는다는 점이 있다. 또한, DNA 백신은 HIV 감염 환자와 같은 면역저하 환자 (immuno compromised patient)에 사용하는데 있어서 바이러스 생백신보다 더욱 안전하다. 또한, DNA 백신은 전달 벡터에 대한 면역 반응 및 바이러스 벡터의 사용과 관련된 안전성 문제와 같은 통상의 백신과 관련된 많은 문제들을 회피한다. 이들 DNA 백신은 상이한 병원체 유래의 유전자가 동일한 플라스미드에 포함됨으로써 어린이에게 필요한 백신접종의 수가 잠재적으로 감소되는 방식으로 작제될 수 있다. 또한, 사람들이 한 종 이상의 감염으로 고생하고 있는 열대 국가에서는, 키메라 백신에 대한 중대한 필요성이 있다.
리슈마니아 및 마이코박테리움은 모두 중요한 인체 병원체인 것으로 여져진다. 세계보건기구(WHO)는 리슈마니아증을 중요한 기생충 질환들중 하나로 간주하고 있는데, 약 3억 5천만 명의 사람들이 이러한 질환에 감염될 위험에 있다. 상기 질환은 전세계적으로 분포하고 있고, 최소한 88개 국가에서 풍토병 (endemic)이다. 또한, 상기 질환은 적당한 벡터가 존재하지 않는 남극대륙을 제외한 모든 대륙에서 발생하고 있다. 다른 한편으로, 마이코박테리아 감염은 전세계적으로 치사율 및 질병율의 주요 원인이다. 해마다 결핵으로 인해 전세계적으로 2백만 명 내지 3백만 명이 사망하고 있으며, 1천 5백만 명의 새로운 환자가 발생하고 있고, 인도에서는 매일 1000명 이상이 사망하고 있다.
치료를 고려하면, 약물 내성 결핵 및 약물 내성 리슈마니아증이 주요 건강 문제가 되어왔다. 특히 중요한 것은 다중약물 내성 결핵인데, 이 경우 환자는 상이한 약물들에 반응하지 않게 된다. 또한, 오늘날 리슈마니아증의 치료는 HIV 동시 감염 및 오가 안티몬성 물질 (pentavalent antimonials; 리슈마니아증에 대한 가장 일반적인 입수가능한 약물)에 대한 내성으로 인해 어려운 도전과제가 되고 있다. 이러한 문제는 빈곤 및 영양부족, 비면역 피난민들의 이동, 불충분한 진단 도구 및 불가피하거나 입수불가능한 약물로 인해 더욱 심각하게 된다.
HIV/TB와 HIV/리슈마니아증 사이의 상관관계가 보고되어 왔지만, 중요한 임상적 관련성을 갖는 증상인 TB/리슈마니아 동시 감염은 거의 알려지지 않았다. 비록 병인 및 전염 기작이 명백하지만, VL 및 TB는 몇 가지 특징을 공유한다. 가장 중요한 것은 VL 및 TB는 자연상태에서 모두 세포 내에서 일어나고, 세포 매개 면역이 감염에 대한 보호에 중요한 역할을 한다는 것이다. 또한, 양쪽 모두에서, 감염이 일부 감염자에서는 무증상 (asymptomatic)으로 유지된다. 증상은 보통 수개월 또는 수년 후에 발생하고, 이는 임상적 질환으로 진행한다. 매우 긴 잠복기 (잠복감염 (latent infection))는 나중에 발생하는 면역 억제와 관련이 있을 수 있는데, 이러한 면역 억제는 명백히 잠복감염을 활동성 질환으로 전환시킨다.
결핵 (TB)은 IFN-γ 반응성 유전자의 전사를 억제하여 IFN-γ에 대한 대식세포의 반응을 차단함으로써 면역억제를 유발하여, 잠복 리슈마니아 감염의 임상 증상으로 진행되는 것을 초래할 수 있다. 또한, 마이코박테리움은 CDl+ APCs의 세포 표면 유래의 Ag-제시 분자 CD1의 하향 조절에 관여한다. 세포 표면으로부터 CD1의 상실은 병원체 유래 당지질의 CDl-매개 제시를 통해 항균 반응을 개시할 수 있는 CD1-제한 수지상 세포에 Ag를 제시하기 위한 감염 세포의 완전한 억제 능력과 관련이 있다.
마찬가지로, VL은 잠복 마이코박테리아 감염을 다시 활성화할 수 있다. 리슈마니아는 유도가능한 산화질소 합성효소 (iNOS) 활성의 감소와 관련이 있는 산화질소 생성을 하향조절한다. 마이코박테리아와 같은 리슈마니아는 CDl의 발현을 억제하고 수지상 세포에 의한 CDl-제한 T 세포의 활성화를 억제한다. CDl에 의한 제시의 회피는 많은 기생충 당지질의 인식을 회피하기 위한 리슈마니아 생존 전략을 나타낼 수 있다. 또한, 리슈마니아 감염 대식세포는 T-세포의 활성화 및 IFN-γ 생성에 필요한 지속적인 TCR 신호전달을 촉진하는데 덜 효과적인 것으로 관찰되어 왔다.
현재의 상황에서, 동시감염 사례를 제어하는 것이 필수적이게 되었는데, 리슈마니아증과 결핵이 동시에 발생하는 지역에서는 특히 그러하다. 키메라 백신의 개발은 리슈마니아증 및 마이코박테리아 감염을 제어하고 필요한 백신접종의 수를 더욱 감소시키는데 있어서 효과적인 방법을 제공할 것이다. 또한, 백신접종은 약물 내성과 관련이 있는 문제를 회피하는 추가적인 이점을 가진다.
여러가지 특정 백신들의 개발이 리슈마니아증에 대해 고려되는 한, 시험관내 (in vitro) 및 마우스 모델을 이용하여 다수의 항원이 가변적인 성공률로 시험되어 왔다. 현재까지 개발된 여러 백신들 중에서, 열사균 백신 (heat killed vaccine)이 가장 보편적인 것이다. 첫 번째 연구는 메르티올레이트-사균된 다섯 균주들의 리슈마니아 메이저 (L. major)의 풀 (pool)이 백신으로 사용된 이중맹검 무작위 시험 (double blind randomized trial)이었다. 그 결과, 피부 리슈마니아증에 대한 보호는 플라시보 (placebo) 및 백신에서 각각 23%와 60%인 것으로 나타났다. 유사한 방법이 인도의 CDRI Lueknow에서도 사용되었는데, 열사균 (자동분열) 리슈마니아 도노바니와 함께 마이코박테리움 하바나 (Mycobacterium habana) 및 리슈마니아 메이저와 함께 BCG가 내장 및 피부 리슈마니아증에 대한 백신으로 사용되었다. 상기 백신은 양호한 보호 효능을 나타내지만, 항원이 미미한 정도의 보호만을 제공하고, 면역증강제로서 BCG를 필요로 하며, 접종 부위에서 국소적인 알레르기 반응을 일으킨다는 주요한 문제점이 있다. 비록 백신의 단회 투여 (single dose)가 원숭이에서 보호를 제공했지만, 모든 동물들은 접종 후 90일째에도 간헐적인 기생충을 가졌다.
이란에서는, 혼합 BCG-L. 메이저 사균 백신이 안전성 및 효능에 대한 임상 시험 또한 받았다. 비록 이는 안전한 것으로 증명되었지만, 효능은 겨우 35 %이었다.
사균 백신에 비해 약독화 생백신의 상대적인 이점은 많은 항균 및 바이러스 백신에 관한 논쟁의 지속적인 주제가 되어왔다. 가장 주목할만한 논쟁은 면역원성 (immunogenicity), 효능, 안전성, 제조 및 유통의 용이성, 및 안정성에 관한 것들이었다. 무독성으로 표지될 수 있는 임의의 리슈마니아 균주의 명확한 유전적 프로파일이 없어서, 약독화 생백신의 사용 가능성은 중지되어왔다. 그러나, 유전자를 도입 또는 제거함으로써 리슈마니아 게놈을 조작하는 최근의 진전은 약독화 생백신을 발생시키기 위한 방안 및 가능성을 열었다. 예를 들어, 효소인 디히드로폴레이트-리덕타아제-티미딜레이트 합성효소 (DHFR-TS)를 인코딩하는 유전자를 결실시킴으로써, 포유동물의 숙주에서 장기 생존에 필요한 유전자가 결실된 기생충을 발생시키는 것이 가능하게 되었다. 마우스 모델에서, DHFR-TS가 결실된 리슈마니아 메이저 기생충은, 리슈마니아 메이저 및 리슈마니아 아마조네시스 (L.amazonensis)의 감염에 대해 보호를 유도한다. 그러나, 이러한 백신은 실지로 대규모 제조 및 유통에서 단점이 있다. 또한, 리슈마니아 도노바니에 대한 백신의 보호 효능을 평가하기 위한 연구는 수행되지 않았다.
고려중인 더욱 새로운 백신은 재조합 DNA-유래 항원 및 펩티드를 포함한다. 표적 항원들 중 일부는 종 특이적이고 수명 주기 단계에 특이적인 반면, 다른 것들은 전편모형 (promastigote)과 무편모형 (amastigote)으로 나뉜다. 일부는 리슈마니아 종들 가운데 보존되는 반면에, 다른 것들은 그렇지 않다. 또한, 이러한 백신이 가지는 가장 큰 또 다른 장점은 정제된 면역원으로 전달될 수 있다는 것인데, 이는 네이키드 DNA (naked DNA)가 이들을 인코딩하기 때문이다. 또한, 유전자 조작으로 이들 항원을 특정 위치. 또는 1차 T 세포 반응의 개시에 필수적인 것으로 여겨지는 수지상 세포 또는 랑게르한스 (Langerhans) 세포와 같은 특정 항원-제시 세포를 표적할 수 있다.
리슈마니아증에 대한 백신으로 사용된 최초의 재조합 항원은 리슈마니오리신 (leishmaniolysin) 또는 gp63 이었다. 이것은 모든 종들의 전편모형에 존재하는 막 엑토-메탈로프로테아제 (membrane ecto-metalloprotease)이다. gp63은 또한 숙주 대식세포에 대한 기생충 수용체들 중 하나이고, 이 단백질이 결실된 기생충 돌연변이체들은 독성이 없는 것으로 보고되었다. Gp63은 전편모형이 보체-매개 세포용해 (cytolysis)에 대한 내성을 갖도록 함으로써 전편모형을 조력하는 것으로 알려져 있다. 또한, 이는 (아마도 LPC와 함께 작용하여), 수용체-매개 세포내이입 (endocytosis)을 통한 전편모형에 의해 대식세포를 감염시키는 것으로 보인다. 그러나, 그 효능은 겨우 50 %에 불과하고 더 높은 농도에서도 마찬가지인 것으로 확인되었다. 이는 몇 가지 인자들 때문일 수 있다. 상기 항원은 처리를 위해 천연 형태에 있어야 할 필요가 있고, 대장균 (Escherichia coli)-유래 재조합 단백질들은 이러한 요건을 충족시킬 수 없을 것이다. 상기 낮은 성공률의 또 다른 이유는 일부 펩티드가 중요치않은 면역원에 불과하기 때문일 수 있었다.
gp63 이외에도, LACK 및 A2와 같은 다른 항원들 또한 시험되었지만, 그 결과는 만족스럽지 못하다. 이러한 단일 항원 백신의 실패로 인해, 복합 폴리펩티드 백신이 개발되기에 이르렀다. 한 가지 후보물질은 리슈마니아 항원의 티올-특이적 항산화제, 리슈마니아 메이저 스트레스-유발성 단백질 1 (LmST1l), 및 인체용으로 적당한 모노포스포릴 지질 A-스쿠알렌 (MPL-SE)을 이용하여 전달되는 리슈마니아 연장 개시 인자 (LeIF)의 직렬 융합체 (tandem fusion)를 포함하는 재조합 폴리단백질이다. 이러한 백신 후보물질은 인체 임상 시험에서 피부 리슈마니아에 대한 최초의 백신으로서, 정상의 건강한 사람을 대상으로 1 단계 및 2 단계 안전성 및 면역원성 시험을 완료하였다. 또한, 상기 백신 후보물질은 햄스터 모델에서 내장 리슈마니아증에 대한 양호한 보호 효능을 나타낸다.
네이키드 DNA 백신은 최근에 보편화되었고, 감염성 질환, 특히 바이러스 및 박테리아에 대한 예방 및 치료방법에 혁신을 일으켰다. 그러나, DNA 백신은 말라리아를 제외하고는, 기생충학 분야를 많이 침식하지 못하였다. 인도에서는 리슈마니아 도노바니에 대한 DNA 백신에 대한 연구가 진행중이다. ORPF 유전자를 백신접종하자, ORPF에 대한 체액성 및 세포면역반응이 유도되어, 마우스 모델에서 리슈마니아 도노바니를 이용한 공격접종에 대해 유의적 수준의 보호를 제공하였다. 그러나, 영장류 모델이나 페이즈 트레일 (phase trail)에서의 효능 연구를 포함하여, 인간에게 적용하기 위한 더 이상의 연구는 수행되지 않았다.
마이코박테리움에 대한 백신을 개발하기 위하여, 면역화 연구는 결핵 및 나병에 대한 부분적이지만 가변적 보호를 제공하는 마이코박테리움 보비스 (M. bovis)의 백신 균주 [Bacilli Calmette-Guerin (BCG)]에 대하여 주로 수행되고 있다. BCG는 마이코박테리움 보비스의 분리된 균주의 약독화에 기인한다. 이는 1921년에 인간용 결핵 백신으로 소개되었고 낮은 부작용 발생률로, 비교적 안전하게 이용되어 왔다. 일부 연구에서 BCC 백신접종은 1차 감염에 대한 면역 반응을 효과적으로 강화시키지만 차후의 비활동 및 재활성화 단계에서 제한된 효과를 가지는 것으로 나타났다. 10 내지 15년 후에는 보호 효과가 거의 나타나지 않기 때문에, 어린 시절의 백신접종이 성인이 되어서도 재감염을 예방하지 않음을 알 수 있다.
BCG 백신의 안전성은 HIV 전염병 다음으로 중요해지고 있는 고려사항이다. 면역약화된 개체에서 BCG의 가능한 부작용을 회피하기 위하여, 전술한 방법을 이용하여 BCG 영양요구균 (auxotroph)이 개발되어 왔다. 영양요구균은 야생형이 필요로하지 않는 특정 영양물 또는 대사산물을 필요로하는 돌연변이체이다. 따라서, 이러한 돌연변이체들는 숙주가 특정의 영양물을 상실하는 경우 숙주내에서 단기간 동안만 생존할 수 있다. 이러한 다섯 균주들은 중증 복합 면역결핍증(SCID)을 갖는 마우스에 대해서는 안전성이, 그리고 마우스의 민감성 균주에 대해서는 보호 효과가 시험되었다. 그 결과, 이들 균주들은 SCID 마우스에서 안전하였고, 민감성 마우스에서는 정상 BCG와 동일한 양의 보호 면역을 나타냄으로써 더욱 안전한 백신접종 방법이라는 것이 확인되었다.
BCG 대체물에 대한 연구에서 오늘날 이용되는 혁신적인 백신은 단백질 또는 DNA 백신이다. 이는 결핵균에 의한 실험적 감염에 대하여 부분적인 보호를 유도할 수 있는 단일 마이코박테리아 항원을 발현하는 다수의 단백질 및 DNA 분자를 포함한다. 이러한 항원들 중 일부는 대식세포에 체류하는 동안 마이코박테리움에 의해 분비되는 것들인데, 이의 예로는 i) 단백질의 항원 85 복합체 (85A, 85B, 85C), ii) 조기 분비된 항원 표적 (ESAT-6)으로 명명되는 6 kDa 단백질, iii) PhoS와 상동성을 갖는 38 kDa 지질단백질, iv) 65 kDa 열충격 단백질 (Hsp 65), v) 프롤린 및 트레오닌이 풍부한 55 kDa 단백질, 및 vi) 19 kDa 지질단백질이 있다.
또한, 본 출원인은 광범위한 연구를 수행한 결과, 내장 리슈마니아증 및 결핵에 대한 여러 백신 후보물질들이 개발되었지만, 이들 중 어느 것도 SEQ. ID No.1 및 SEQ ID No.2를 갖는 리슈마니아증 및 결핵균의 키메라로서 개발되지 않았음을 확인하였다.
이하, 본 발명의 주제와 관련이 있는 키메라 작제물 (construction), DNA 및 재조합 폴리펩티드 백신 작제물에 관한 몇 개의 미국 특허 및 본 출원 작제물의 독창성을 설명하기로 한다.
2007년 3월 13일에 공표된 Bedate 등의 미국 특허 제7,189,399호는 개과동물 리슈마니아증의 혈청학적 진단에 유용한 것으로, 리슈마니아 인판툼 (L. infantum)의 네 개 단백질의 항원 결정기를 인코딩하는 DNA 서열로 형성되어 있는 키메라 유전자 및 그로부터 얻은 단백질에 관하여 기재하고 있다. 기재된 화합물은 키메라 폴리펩티드 및 담체를 포함하는 약학적 조성물로서, 상기 키메라 폴리펩티드는 내장 리슈마니아증을 갖는 개의 혈청에 의해 인식되고 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩되는 리슈마니아 인판툼 유래의 LiP2a, LiP2b, LiH2a, 및 LiPO 단백질 각각으로부터 유래하는 적어도 하나의 항원 결정기를 함유한다. 상기 화합물은 개과동물 리슈마니아증의 혈청학적 진단에 유용하다.
리슈마니아 인펀텀 유래의 폴리펩티드의 키메라가 개시되어 있다. 그러나, 본 발명은 폴리뉴클레오티드의 키메라이다.
2005년 11월 14일에 발행된 Zhongming의 국제특허 제WO/2006/053485호는 키메라 결핵균 유전자 백신 및 이의 제조방법에 관하여 기재하고 있다. 키메라 결핵균 유전자 백신이 제공된다. 상기 백신은 결핵균의 구조적 단백질을 인코딩하는 Ag85a 유전자 및 결핵균의 ESAT6 유전자를 포함하는데, 상기 ESAT6 유전자는 Ag85a 유전자의 서열에 삽입되고, 상기 Ag85a 유전자는 진핵세포 발현 벡터 pVAXI에 삽입된다. 상기 발명의 조성물은 마우스 및 원숭이에서 면역계를 유도하기에 유용하다.
상기 국제 특허는 결핵만을 제어하기 위한 키메라 백신을 개시하였다. 또한, 키메라 작제물이 발현하는 항원은 복합 키메라 항원이었다. 그러나, 본 발명은 리슈마니아증 및 결핵 모두를 제어하는데 유용한 키네신 모터 도메인 및 esat-6 유전자의 키메라를 제공한다. 또한, 상기 작제물은 키메라 펩티드의 발생 대신에 키메라 작제물로부터 두 유전자의 개별적 발현이 가능하도록 디자인된다.
2003년 1월 29일에 공표된 Soto 등의 유럽특허 제EP1279679호는 면역화된 개체 또는 세포군에서 항원에 대한 면역 반응을 자극하기 위한 조성물 및 방법에 관하여 개시하고 있다. 상기 조성물은 DNA 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열로 이루어진 Lip2a 리슈마니아로 명명되는 단백질을 포함한다. 상기 발명의 조성물은 상기 조성물이 접종된 개체에서 체액성 또는 세포성 반응을 촉진하는데 유용하다. 또한, 상기 발명은 키메라 분자 또는 SEQ ID No.1 및 SEQ IO No.2를 다루고 있지 않다.
1997년 10월 7일에 공표된 Olafson의 미국 특허 제5,674,503호는 리슈마니아증에 대한 면역 반응을 유도할 수 있는 펩티드 및 이의 사용방법에 관하여 개시하고 있다. 상기 발명은 펩티드 또는 면역원을 생리학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제와 함께 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 그러나, 본 발명은 펩티드를 다루고 있지 않다.
1998년 4월 7일에 공표된 Content 등의 미국 특허 제 5,736,524호는 폴리뉴클레오티드 결핵 백신에 대하여 개시하고 있다. 상기 발명은 인간과 같은 포유동물을 포함하여, 생채내 (in vivo)에서 척추동물에게 직접 도입되는 경우, 상기 동물 내에서 인코딩된 단백질의 발현을 유도하는 DNA 작제물을 제공한다. 그 결과, 상기 발명의 설명에 나타난 바와 같이, 결핵균 감염에 대한 보호 면역 반응을 발생시키기 위한 목적으로 결핵균 폴리뉴클레오티드에 대한 면역 반응을 유도한다.
상기 특허는 DNA 백신을 개시하였지만 키메라를 다루고 있지 않다. 또한, 상기 DNA 백신은 결핵을 제어하는 데에만 유용하다.
발명의 목적
본 발명의 주목적은 인도 풍토병으로서, 두 가지의 중요한 세포내 병원체인 결핵 및 리슈마니아증에 대한 예방 및 치료레 사용될 수 있는 키메라 DNA 백신을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 리슈마니아 도모바니 균주 MHOM/IN/KE-16/1998의 인도 분리주 (Indian isolate) 유래의 키네신 유전자의 모터 도메인 영역 및 결핵균 Rv 균주의 esat-6 영역을 이용함에 있다.
본 발명의 다른 목적은 SEQ ID. No.l 및 SEQ ID. No.2로 나타낸 유전자들을 SEQ ID No.3으로 나타낸 자가분열 펩티드를 코딩하는 유전자의 양측에 라이게이션 (ligation)시킴으로써 키메라 분자를 발생시키는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 진핵세포 기관 (리보솜, tRNAs, 및 기타 번역 인자들)에 의해 번역할 수 있는 DNA 백신 벡터 pVAX-I (Invitrogen)에 상기 키메라 분자를 클로닝하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 작제물의 시험관내 (in vitro) 발현을 연구하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 BALB/c 마우스 모델, 고등동물 및 최종적으로 인간에서 SEQ ID NO:1 및 SEQ IO NO:2로 구성되는 DNA 키메라 백신 작제물의 면역원성을 연구하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 투여시 포유동물 및 인간을 마이코박테리움 (Mycobacterium spp) 및 리슈마니아 (Leishmania spp)로부터 보호하는 DNA 백신 후보물질로서, 전사조절요소에 작동가능하게 연결된 상기 작제물로 구성되는 DNA 백신 후보물질을 제공하는 것이다.
발명의 설명
본 발명에 따르면, 결핵균의 esat-6 영역 및 리슈마니아 도노바니의 키네신 영역이 DNA 백신 벡터 pVAK-1에서 자가절단 펩티드(self-cleaving peptide)의 양측에 함께 클로닝되어 있는 DNA 작제물의 신규한 재조합 키메라로서, 전사 프로모터에 작동가능하게 연결되어 포유동물의 세포 내에서 자가복제 및 발현할 수 있는 DNA 작제물의 재조합 키메라가 제공된다.
또한, 본 발명에 따르면, DNA 작제물의 신규한 재조합 키메라의 제조방법으로서,
a) 무작위 MHC Class-1 결합 펩티드 예측 서버 (Promiscuous MHC Class-1 Binding Peptide Prediction)를 이용하여 키네신 모터 도메인 및 esat-6 도메인의 예측되는 단백질 서열을 분석하는 단계,
b) 상기 키네신 모터 도메인 및 esat-6 도메인의 유전자 코딩 증폭 단계를 행하는 단계,
c) 서열분석용 pGEM-T® 벡터에 키네신 esat-6-유전자 영역을 클로닝하는 단계,
d) pVAX-1 벡터에서 방향성 클로닝 (directional cloning)에 의해 키메라 작제물을 발생시키는 단계,
e) 무세포 번역 시스템을 이용한 상기 클론 유래의 키네신 모터 도메인 및 esat-6 도메인의 시험관내 발현 분석 단계 및 상기 작제물을 이용한 면역원성 연구, 비장세포 증식 및 사이토카인 연구를 행하는 단계를 포함하는 제조방법이 제공된다.
도면의 간단한 설명
도 1: (A) 무작위 MHC Class-1 펩티드 예측 서버 (Promiscuous MHC Class-1 Binding Peptide Prediction)를 이용한 키네신 모터 도메인 및 ESAT-6 도메인의 예측되는 단백질 서열 분석을 나타낸다.
도 2: (A) 키네신 모터 도메인의 증폭 결과, B) east-6 영역의 증폭을 나타낸다.
도 3: 리슈마니아 도노바니의 키네신 유전자 모터 도메인 영역 및 결핵균의 esat-6 영역이 서열분석 및 확인을 위해 pGEM-T® 벡터에 각기 클로닝되어 있는 클론의 제한 (restriction) 분석을 나타낸다. 레인 M: lOObp 분자량 마커 (MBI Fermentas); 레인 1 및 4: 삽입물로서 키네신 모터 도메인을 갖는 클론; 레인 5: 삽입물로서 esat-6 (RV-3875) 유전자를 갖는 클론; 레인 2, 3 및 6: 빈 (empty) 플라스미드.
도 4: 키메라 분자 키메라 작제물의 발생 및 이들의 특이적 제한 부위를 나타낸다.
도 5: 키메라 작제물을 갖는 pVAX-1-LOMT 벡터의 지도 (map)를 나타낸다.
도 6: 키네신 모터 도메인 영역 및 esat-6 영역이 자가절단 (self-cleaving) FMDV-2A 펩티드의 양측에 함께 클로닝되어 있는 키메라 pVAX-l® 클론의 제한 분석을 나타낸다. 레인 1, 2 및 5: 키네신을 갖는 키메라 (BstX1 및 Apa1); 레인 3: 키네신 및 FMDV를 갖는 키메라 (BamH1 및 Apa1); 레인 4, 6 및 7: esat-6를 갖는 키메라 (HindⅢ 및 BamH1); 레인 8: 100 bp 마커 (MBI®).
도 7A 및 도 7B: 키네신 모터 도메인 영역 및 esat-6 영역이 클로닝되어 있는 개개의 pVAX-1® 클론의 제한 분석을 나타낸다. 도 7A에서, 레인 1: 100 bp 마커 (MBI®); 레인 2 및 3: 키네신을 갖는 pVAXl; 레인 4 및 5: 빈 플라스미드; 도 7B에서, 레인 1: 100 bp 마커 (MBI®); 레인 2 및 3: 빈 플라스미드; 레인 4 및 5: esat-6을 갖는 pVAXl.
도 8: 무세포 번역 시스템을 이용한 클론의 시험관내 (in - vitro) 발현 분석을 나타낸다.
(A) 키네신 모터 도메인의 시험관내 발현의 웨스턴 블롯 (Western Blot) 분석을 나타낸다. 레인 M: 사전염색된 분자량 마커 (MBI®); 레인 1 및 2: 키메라 작제물로부터 키네신의 시험관내 발현; 레인 3: 개개의 키네신-pVAXl 작제물의 시험관내 발현; 레인 4: VL 양성 환자의 혈청으로 프로브 (probe)된 정제 rLvacc.
(B) ESAT-6 도메인의 시험관내 발현의 웨스턴 블롯 분석을 나타낸다. 레인 M: 사전염색된 분자량 마커 (NEB®); 레인 1 및 2; 키메라 작제물로부터 ESAT-6의 시험관내 발현; 레인 3: 개개의 ESAT-6-pVAXl 작제물로부터 ESAT-6의 시험관내 발현; 레인 4: TB 양성 환자의 혈청으로 프로브된 정제 ESAT-6.
도 9: 비장세포 (splenocyte) 증식 어세이 (assay)를 나타낸다.
도 10: 백신접종에 대한 IFN-γ, IL-2 및 IL-4 반응을 나타낸다.
도 11: 키메라 백신 작제물이 주사된 마우스 군에서 키네틴 모터 도메인 및 ESAT-6에 대한 DTH 반응을 나타낸다.
서열 목록에 있는 서열의 간단한 설명
SEQ ID NO : 1은 리슈마니아 도노바니 균주 MHOM/IN/KE-16/1998의 인도 분리주 유래의 키네신 모터 도메인 유전자의 뉴클레오티드 서열이다.
SEQ ID NO : 2는 결핵균 Rv 균주 유래의 esat-6 유전자의 뉴클레오티드 서열이다.
SEQ ID NO : 3은 구제역 바이러스 (FMDV) 유래의 2A 펩티드 유전자 서열의 뉴클레오티드 서열이다.
SEQ ID NO : 4는 키네신 모터 도메인 유전자, esat-6 유전자 및 FMDV 2A 펩티드 유전자를 포함하는 전장 (full length) 키메라 작제물의 뉴클레오티드 서열이다.
SEQ ID NO : 5는 키메라 작제물의 아미노산 서열이다.
SEQ ID NO : 6은 합성 올리고뉴클레오티드 LF의 서열이고, SEQ ID NO : 7은 합성 뉴클레오티드 LR의 서열이고, SEQ ID NO : 8은 합성 뉴클레오티드 ESAT-P의 서열이고, SEQ ID NO : 9는 합성 뉴클레오티드 ESAT-R의 서열이다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 류시마니아증 및 결핵의 제어를 위한 단일 백신 후보물질을 제공한다. 또한, 본 발명은 인간과 같은 포유동물을 포함하여 척추동물의 생체내로 직접도입되는 경우 상기 동물내에서 두 개의 인코딩된 단백질의 발현을 동시에 유도하는 플라즈마 작제물 분자를 제공한다. 본 발명의 구현예는 SEQ ID NO. 3의 양 측에 접합되고 포유동물 발현벡터 pVAX-1에서 클로닝되는, SEQ ID NO. 1 및 SEQ ID NO. 2의 작제물을 포함한다. 상기 플라스미드는 진핵세포 기관(리보솜, tRNAs, 및 기타 번역 인자)에 의해 번역될 수 있는 경우, 세포에 흡수되어 핵내로 이동된다. 플라스미드 DNA의 흡수 효율 및 발현은 낮을 수 있지만, T 세포 및 B 세포 모두에서 면역 반응을 일으키기에 충분하다는 많은 증거들이 있다.
유전자 생성물이 아닌 유전자로 면역화하는 경우 몇 가지 장점들이 있다. 첫째는 천연 또는 거의 천연의 항원이 비교적 간단하게 면역계에 제시될 수 있다는 점이다. 박테리아, 효모, 또는 표유동물의 세포에서 재조합적으로 발현된 포유동물의 단백질은 흔히 적절한 면역원성을 확보하기 위해 광범위한 처리를 필요로 한다. DNA 면역화의 두 번째 이점은 면역원이 MHC class I 경로에 들어가서 세포독성 T 세포 반응을 일으킬 수 있다는 점이다.
임의의 백신의 개발을 위한 첫 번째 단계는, 백신 개발을 위한 특정 후보물질을 선택하는 것이다. 이전의 연구 및 SEQ ID No. 5에서 나타낸 아미노산의 인-실리코 분석 (in-silico analysis)에 기초하여, 본 발명자들은 여러가지 HLA 타입에 대한 에피토프 (epotope)를 예측하는 MHC-1 예측 소프트웨어를 이용하여 키메라 DNA 백신의 후보물질로서 키네신 모터 도메인 및 ESAT-6 도메인을 선택하였다 (도 1).
우선, Kala-azar 환자의 임상 시료로부터 NNN 배지의 전편모형으로서 기생충을 분리하고, 그 다음 10 % 열 불활성화 FCS를 함유하는 배지 199에서 25 ℃로 성장을 위해 적응시켰다. 일상유지를 위해, 기생충을 함유하는 접종원의 시료를 10% FCS가 첨가된 4 ml의 배지 199와 함께 배양 튜브내로 무균적으로 도입하였다. 상기 튜브를 25 ℃의 BOD 배양기에 위치시키고, 정기적 간격으로 현미경을 이용하여 성장을 모니터하였다.
기생충의 대량 배양을 위해, 기생충 함유 접종물의 시료를 500 ml 조직 배양 플라스크내의 10 % FCS를 함유하는 20 ml의 M199에 무균적으로 도입하고, 25 ℃의 냉각된 배양기에서 중간 대수기 (mid log phase)(7 - 10일)까지 배양하였다. 그 다음, 그 기생충을 수확하고 핵 DNA 분리에 사용하였다.
중간 대수기의 기생충을 냉동 원심분리기에서 5000 rpm의 원심분리에 의해 수확하였다. 기생충 핵 DNA를 약간 변형된 표준 프로토콜에 따라 분리하였다. 대략 1-5 × 109 개의 전편모형을 10배 체적의 용해 완충액 (NaCl,100 mM, Tris-HCl, 1O mM (pH 8.0), EDTA 1O mM, 프로테이나제 K/ml 100 pg, 사코실 1.5 %)에서 60 ℃로 3시간 동안 용해시켰다.
운동핵 DNA 네트워크를 27,000×g에서 1시간 동안 원심분리에 의해 침전시켰고, TE 완충액 (Tris-HCl (pH 8.0) 1O mM, EDTA (pH 8.0) 1 mM)에서 다시 현탁되었다. kDNA의 침전 후에 남아있는 상청액으로부터 핵 DNA를 분리하였다. 단백질을 더 절단하기 위해 그 상청액을 65 ℃에서 밤새 배양하였다. 동일한 부피의 페놀/클로로포름 혼합물을 첨가하고 완전히 혼합한 다음, 5000 rpm에서 15분간 원심분리로 침전시킴으로써, 핵 DNA를 페놀/클로로포름으로 몇 회 추출하였다. 1/10th 체적의 3M-아세트산나트륨 및 2배 체적의 100 % 에탄올을 첨가하고 잘 혼합함으로써 상기 핵 DNA를 침전시키고, -20 ℃에서 1시간 동안 배양하였다. 상기 혼합물을 4 ℃에서 30분간 5000 rpm으로 원심분리하여 침전시켰다. 그 펠릿을 70 % 에탄올로 세척하고, 건조시켰으며, TE 완충액에 다시 현탁시켰다. 상기 DNA의 농도 및 순도는 260/280 nm에서 OD를 분석함으로써 측정하였다. 상기 DNA를 사용시까지 70 ℃에서 저장하였다.
마찬가지로, 결핵균의 Rv 균주를 LJ 배지상에서 유지시켰다. DNA 분리를 위해, 몇 개의 분리된 콜로니들을 LJ 배지로부터 선택하고, TE 완충액에서 다시 현탁시켰다. 표준 프로토콜에 따라 DNA 분리를 수행하였다. 100 μl의 펠릿 배양균을 400 μl의 TE 완충액에 현탁시키고 DNA 분리를 진행하였다. 그 다음, 그 시료를 100 ℃에서 비등하였고, 그 다음, 라이소자임, SDS 및 프로테이나제 K로 처리하였다. 그 다음, 상기 시료를 볼텍싱하고 CTAB와 함께 배양하였다. 그 핵 DNA를, 동일한 부피의 페놀/클로로포름 혼합물을 첨가하고, 완전히 혼합한 다음, 10,000 rpm으로 5분간 원심분리하여 페놀/클로로포름으로 몇 번 추출하였다. 그 핵 DNA를 이소프로판올을 이용하여 침전시켰다. 그 혼합물을 4 ℃에서 10,000 rpm으로 5분간 원심분리하여 침전시켰다. 그 펠릿을 70% 에탄올로 세척하였고, 건조시킨 후, TE 완충액에 다시 현탁하였다.
50 ng의 분리된 핵 DNA를 이용하여 키네신 및 esat-6 유전자의 증폭을 위한 PCR을 하기와 같이 실시하였다. 키네신 유전자의 경우, 프라이머는 키네신 유전자 (가입번호: AY615866)에 대한 유전자 은행 (GenBank)의 서열 데이터에 기초하여 디자인하였다. 리슈마니아 도노바니 KE-16 균주로부터 이용가능한 키네신 유전자 서열은 길이가 2967 bp이고, 추정 (putative) ATG 출발 코돈과 함께 위치 361로부터 ORF를 갖고 위치 2967의 최종 염기까지 연장된다. SEQ ID No. 6 및 SEQ ID No. 7의 프라이머는 키네신 모터 도메인 영역을 증폭시키기 위해 디자인하였다. esat-6 영역의 증폭을 위해, 국제 특허 공개 제WO/2005/061730호에 기재된 것으로 SEQ ID No. 8 및 9에서 나타낸 프라이머를 약간 변형하여 사용하였다.
에어로졸이 없는 피펫 팁을 이용하고 전-PCR 및 후-PCR 생성물을 각기 유지시킴으로써, 앰플리콘의 오염을 회피하였다. 모든 PCR 반응은 음성 대조군 세트와 함께 표준 프로토콜을 이용하여 수행하였다.
키네신 모터 도메인의 증폭을 위한 칵테일은 10×Taq 완충액 5.00 μl, 1.2 mM dNTPs 8,00 μl, 정방향 프라이머 (25 μM) 1.00 μl, 역방향 프라이머 (25μM) l.OOμl, O.5 μl Taq DNA 폴리머라아제 (5U/μl), 템플릿 (template) DNA 3.00 μl, 멸균수 (체적을 50.00 μl로 만들기 위함)을 포함한다. 그 튜브를 열 사이클러 (MJ Research, USA)에 위치시킨 다음, 30 사이클을 증폭시켰다.
마찬가지로, esat-6 영역의 증폭은 10×Taq 완충액 2,5 μl, 1.25 mM dNTPs 4.00 μl, 정방향 프라이머 (2nM) 0.5 μl, 역방향 프라이머 (2nM) 0.5 μl, 0.5 μl Taq DNA 폴리머라아제 (5U/μl), 템플릿 DNA 5.OOμl, 멸균수 (체적을 25.00 μl로 만들기 위함)을 이용하여 수행하였다. 그 튜브를 열 사이클러 (MJ Research, USA)에 위치시킨 다음, 30 사이클을 증폭시켰다.
증폭된 PCR 생성물을 아가로스 겔 전기영동으로 분해하였다. 상기 겔을 자외선 투영기 (UVP)를 이용하여 시각화하였다 (도 2A 및 2B).
PCR 증폭 후 키네신 및 esat-6 유전자를 TA 클로닝 벡터에 클로닝하였다. 상기 PCR 증폭 DNA를 아가로스 겔 상에서 분해하고, 관련 밴드를 함유하는 부분을 무균 매스(scalpel)를 이용하여 절개하였다. 그 DNA를 겔 용출 키트 (gel elute kit) (Qiagen, Germany)를 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 상기 겔로부터 용출시켰다. 용출된 DNA의 농도를 분광계를 이용하여 260 nm의 흡광도에서 측정하였다.
관련 겔 정제 PCR 생성물을 pGEMT-Easy 벡터에 직접 라이게이션하였다. 0.5 ml 마이크로 원심분리 튜브에서, 하기의 성분들을 첨가하였다 : 2×급속 라이게이션 완충액 5μl, pCEM-T Easy 벡터 (50 ng), 2.00 μl DNA (200 ng), 1.00 μl T4 DNA 리가아제 (3U/μl), 물 (체적을 10.00 μl까지 만들기 위함). 부드럽게 혼합한 후, 상기 튜브를 4 ℃에서 밤새 배양하고 70 ℃에서 10분간 가열하였다. 상기 시료를 형질전환에 앞서 -20 ℃에서 보관하였다.
그 다음, 상기 라이게이션된 혼합물을 열 충격 처리에 의해 형질전환시켰다. 염화칼슘 방법을 이용하여 컴피턴트 (competent) 세포 JM-109를 제조하였다. 대략 5 μl의 라이게이션 혼합물을 컴피턴트 세포(200 μl)와 함께 부드럽게 혼합하고, 얼음에서 30분간 배양하였다. 배양 후, 그 세포를 42 ℃로 설정된 42 ℃의 워터배쓰 세트에 90초간 두었고 (열 충격), 즉시 얼음으로 옮겼다.
800 μl의 LB 배지를 상기 세포에 첨가하고, 교반하면서 (150 rpm) 37 ℃에서 90분간 유지시켰다. 그 세포를 100 μg/ml의 암피실린 (ampocillin)을 함유하는 LB 아가 플레이트 상에서 16 μl의 X-gal 및 lO μl의 1M IPTG로 염색하였다. 상기 플레이트를 37 ℃에서 12 내지 16 시간 동안 배양하였다. 백색 콜로니를 선택하여 삽입 (insert)을 검사하였다.
스크리닝을 위해, 알칼리성 용해 방법을 이용하여 플라스미드를 분리하였다. 이를 위해, 멸균 이쑤시개로 콜로니를 채집하고, 5 ml의 새로운 배지에 접종하였다. 밤새 성장시킨 배양균을 펠릿화하고, 그 세포를 50 mM 글루코스, 25mM tris-Cl, 1OmM EDTA (pH-8.0)에 다시 현탁시켰으며, 상기 펠릿을 현탁한 후, 그 세포를 NaOH 및 1% SDS로 용해시키고, 그 용액을 포타슘 아세테이트 및 빙초산의 첨가에 의해 중화시켰다. 그 세포 용해물을 12000 RPM으로 5분간 원심분리하여 펠릿을 침전시켰다. 그 다음, 그 상청액을, 동일한 부피의 페놀/클로로포름 혼합물을 첨가함으로써 페놀/클로로포름으로 수 회 추출하였다. 마지막으로, 그 플라스미드 DNA를 이소프로판올로 침전시켰다. 그 혼합물을 4 ℃에서 5 분간 10,000 rpm으로 원심분리하여 침전시켰다. 그 펠릿을 70 % 에탄올로 세척하고, 건조시켰으며, TE 완충액에 다시 현탁하였다.
벡터의 다중 클로닝 부위에 접하는 적절한 제한효소 부위를 이용하여 상기 재조합 플라스미드의 제한효소 분석을 실시하였다. 상기 반응은 다음과 같이 실행하였다: 플라스미드 DNA 16.00 μl (2μg), 1O×반응 완충액 4.00 μl, 제한효소 O.5 μL (2 units), 멸균수 (체적을 40.00μl까지 만들기 위함). 상기 반응을 37 ℃에서 6 내지 8 시간 동안 배양하고, 그 생성물을 표준 분자량 마커와 함께 1.5 % 아가로스 겔 상에서 분석하였다 (도 3). 제한 절단에 의해 검출되는 바와 같이 삽입물을 함유하는 양성 클론을 서열분석에 이용하고 글리세롤 스톡으로 보존하였다.
모든 서열분석은 자동화 DNA 서열분석장치 (ABI Prism version 7.0)에서 사슬 종결 방법 (chain termination method)에 따라 실시하였다. 상기 서열은 Clustal W (multile alignment of various sequence files), MHC 예측 소프트웨어와 같은 여러가지 소프트웨어를 이용하여 분석하였다. 이와 더불어, 여러 웹사이트로부터 BLAST 옵션을 이용하여 서열 상동성을 조사하였다.
서열 변이에 따라, 그 다음 수행한 것은 키메라 분자를 발생시키는 것이었다 (도 4 및 도 5). 이를 위해, SEQ ID No. 1 및 SEQ ID No. 2에 나타낸 클로닝된 단편을 적절한 제한효소로 절단하여 잘라내었다. 또한, SEQ ID No. 3에서 나타낸 FMDV 2A 단편을 절단하고, SEQ ID No. 1 및 2와 함께 라이게이션하였다 (도 4). 상기 반응은 다음과 같이 실행하였다: 10×완충액 - 2.5 μl, 키네신 모터 도메인 - 8 μl (lμg), esat-6 유전자 - 6 μl (lμg), FMDV 2A 영역 - 3 μl (1μg), T4 DNA 리가아제 - 1.5 μl (6 units), 및 멸균수 (25 μl의 체적을 만들기 위함). 상기 라이게이션 반응은 4 ℃에서 밤새 진행하였다.
발생한 키메라 분자를 정제하고, pVAXl 벡터 (pVAXl-LDMT)와 함께 라이게이션하였다. 상기 반응은 다음과 같이 수행하였다: 1O×완충액 - 2.0 μl, 키메라 분자 - 15 μl (6 μg), pVAX-l 벡터 - 2 μl (2 μg), T4 DNA 리가아제 - 1.0 μl (5 Units), 및 멸균수 (20 μl의 체적을 만드는 양) (도 5). 라이게이션 이후, 재조합 결핍 및 엔도뉴클레아제 (endonuclease) 결핍 DH5 α-E. coli 균주를 전술한 프로토콜에 따라 pVAXl-LDMT를 이용하여 형질전환하였다. 그 클론을 카나마이신 플레이트상에서 선별하고 플라스미드 DNA를 분리했으며, BstXl 및 Apal (키네신 모터 도메인), BamH1 및 Apa1 (키네신 및 FMDV 영역), BamH1 및 HindⅢ (esat-6 유전자)로 절단하여 삽입물을 확인하였다 (도 6). 또한, 서열분석을 이용하여 확인하였다. 상기 키메라 작제물의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID No. 4에 나타내었다. SEQ ID No. 4로부터 해독된 아미노산 서열은 SEQ ID No. 5에 나타내었다.
키메라 작제물 이외에도, 전술한 프로토콜을 이용하여 pVAX-1 벡터에 SEQ ID No. 1 및 SEQ ID No. 2를 삽입함으로써 개개의 작제물을 발생시켰다. 상기 개개의 작제물은 키메라 백신의 효능을 개개의 백신 후보물질의 효능과 비교하기 위한 것이었다 (도 7A 및 도 7B).
서열이 적당히 라이게이션 및 발현되었는지를 확인하기 위하여, TNT 결합 전사/번역 시스템 (Promega)을 이용하여 시험관내 발현 분석을 수행하였다. 상기 반응은 다음과 같이 수행하였다: TNT 급속 마스터 믹스 (quick master mix) 40 μl, 정제된 키메라 - pVAX1 작제물 (pVAXl-LDMT) - 5μl, 뉴클레아제가 없는 물 (50 μl의 체적을 만드는 양).
키네신 모터 도메인 및 ESAT-6 도메인의 발현을 확인하기 위하여, 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. 단백질의 시험관내 반응 혼합물을 16 % 트리신 SDS-PAGE 상에서 분해하고, 반-건조 블롯팅 장치 (Bio-Rad®, USA)를 이용하여 제조사의 지시에 따라 니트로셀룰로스 막 (Millipore)으로 옮겼다. 상기 막을 5 % 탈지유로 블로킹하고, PBS (pH 7.0, 0.1 % Tween-20)으로 각각 10분간 세 번 세척한 다음, 실온에서 환자 혈청 및 토끼 혈청의 1:50 희석액 (PBS에서, pH 7.0, 1 % BSA)과 함께 1 시간 동안 배양하였다. 상기 막을 PBS (pH 7.0, 0.1 % Tween-20)로 세 번 세척한 다음, 비오틴-결합 항-인간 IgG의 1:1000 희석액 (PBS에서, pH 7.0, 1% BSA)과 함께 실온에서 1 시간 동안 배양하였다. 2차 항체와 함께 배양한 후, 상기 막을 세척한 다음, 겨자무과산화효소 (horseradish peroxidase)에 결합된 1차 기질 아비딘 (avidine)과 반응시켰다. PBS (pH 7.0, 0.1 % Tween-20)로 각각 10분간 세 번 세척한 후, 그 블롯을 기질로서 DAB (Amresco) 및 0.1 % H2O2를 이용하여 발색시키고, 밴드를 막 상에서 직접 시각화하였다 (도 8A 및 도 8B).
동물 윤리 위원회로부터 윤리적 승인을 받은 후, 동종번식 BALB/c 마우스 모델에서 상기 키메라 백신에 대한 면역원성 연구를 수행하였다. 이 연구에서 6 내지 8주령의 BALB/c 마우스를 사용하였다. DNA 접종 2일 전에, 대퇴사두근에 0.25% 부피바카인 히드로클로라이드 (bupivacaine hydrochloride)를 함유하는 100 μl의 용액을 주사하여, 차후의 DNA 흡수를 강화하였다. 각각 6 마리씩 4 개의 군을 백신접종 연구, 세포 증식, 사이토카인 생성 및 항체 반응에 사용하였다. 제1군의 마우스에는 키메라 작제물을 주사하였다. 제2군 및 제3군에는 개개의 키네신 모터 도메인 및 esat-6 작제물을 각각 주사하였다. 빈 플라스미드 (empty plasmid)를 주사한 마우스는 대조군으로 이용하였다. DNA 접종을 위하여, PBS 내의 100 μg의 DNA 작제물을 상기 부피바카인을 주사한 부위와 동일한 근육 부위에 주사하였다. 면역화 2주 후에, 동물에게 추가 접종 (booster dose)을 실시하였다. 마지막 주사후 2주째에, 마우스를 희생시키고 각 군의 마우스로부터 비장을 무균적으로 적출하였다.
비장은 RPMI 1640 배지를 함유하는 멸균 접시 상에서 무균 조건하에 마우스로부터 제거하였다. 상기 비장을 10 ml 주사기의 플런저 (plunger)의 원반형 바닥을 이용하여 분쇄함으로써 단일 세포 현탁액을 제조하였다. 5 - 10 ml의 RPMI-1640 배지를 현탁액에 첨가하고 균질하게 혼합하였다. 상기 접시를 2분간 건드리지 않는 상태로 유지시키고, 그 투명한 상청액을 서서히 피펫으로 제거하였다. 세포를 250xg으로 4 ℃에서 10분간 원심분리 (Sigma Centrifuge)하여 펠릿을 얻었다. 적혈구 및 비장세포를 함유하는 상기 펠릿을 모았다. 상기 펠릿을 0.9 % 염화암모늄으로 1회 세척하여 적혈구를 용해하였다. 남아있는 비장세포를 10 % FCS 및 0.05 μM 2-머캅토에탄올을 함유하는 RPMI 1640에서 2.5×lO6 cells/ml의 밀도로 다시 현탁하였다. 이로부터 5×1O5 세포를 96-웰 플레이트에서 10 % FCS를 갖는 200 μl의 RPMI 1640에 첨가하였다. 상기 세포를 1 μg/well의 미토겐 (콘카발린 A (Concavalin A), 키네신 및 ESAT-6 항원을 이용하여 자극하였다. 그 다음, 상기 세포를 5 % CO2 및 95 % 습도를 함유하는 분위기에서 37 ℃로 48 시간 동안 배양하였다. MTT [3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸리움 브로마이드 (Sigma Aldrich, St, Louis, MO, USA)] 분석방법을 약간 변형한 방법 [57]을 이용하여 증식을 측정하였다. 간략하게, MTT 용액 (10 μl, 5 mg/ml)을 200 μl의 배지에 첨가하고 37 ℃에서 3 시간 동안 배양하였다. 배양 후, 그 배양 배지를 제거하고, 암청색 포마잔 (formazan) 결정을 산성 이소프로판올 (이소프로판올 내의 100 μl의 0.04 N HCl)에 용해시켰다. ELISA 플레이트 리더 (Biotek Instruments, USA)를 이용하여, 색의 형성을 570 nm에서 측정하였다. 콘카발린 A를 이용한 웰은 양성 대조군으로 이용하였고, 어떠한 자극제도 없는 웰은 음성 대조군으로 이용하였다 (도 9).
또한, 엔도젠 (Endogen) 마우스 IFN-γ, IL-2 및 IL-4 ELISA 키트 (Pierce Biotechnology, Inc. USA)를 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라, 배양 상청액내의 IFN-γ, IL-2 및 IL-4의 수준을 측정하였다 (도 10).
상기의 실험 결과로, 키메라 DNA 백신 접종이 발현된 단백질에 대하여 세포 면역 반응을 발생시켜, 유의적으로 높은 수준의 lFN-γ 및 IL-2 (TH-1) 및 낮은 수준의 IL-4 (TH-2)를 생성한다는 것을 밝혀냈다. 또한, 관찰 결과, 키메라 DNA를 이용한 백신접종은 ESAT-6 또는 키네신 모터 단백질을 인코딩하는 개개의 백신 분자보다 더 우수한 세포 면역을 발생시켰다 (도 9 및 도 10).
본 명세서에 기재된 관찰 결과는 상기 키메라 백신이 리슈마니아 도노바니 및 결핵균 동시감염 (co-infection)에 대해 효과적인 백신 방법을 나타낼 수 있음을 알려준다. 또한, 두 개의 유전자를 동시 발현시키면, 강한 세포 면역이 발생함으로써, 두 개의 단백질이 서로에 대하여 면역증강 효과를 나타낸다는 것을 알 수 있다. 더 나아가, 상기의 관찰 결과를 확증하기 위해 보호 연구가 필요하다.
이하, 본 발명을 하기의 실시예를 참조하여 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명의 범위가 이러한 실시예로 제한되는 것은 아니다.
실시예
1:
키메라
작제물의
개발을 위한 유전자의 선택
키메라 백신 작제물의 개발 과정에서 첫 번째 단계는 유전자의 분리를 포함한다. 이러한 작제물의 제조를 위해 세 개의 유전자 영역을 선택하였다. 이는 결핵균의 esat-6 유전자, 리슈마니아 도노바니의 키네신 모터 도메인 영역, 및 구제역 바이러스 2A 펩티드 유전자 서열을 포함한다.
esat-6 유전자에 의해 코딩되는 ESAT-6 항원은 결핵균 배양 여과액에서 발견되는 주요 분비 단백질들 중 하나이고, 결핵 환자 및 각종 동물 모델에서 감염 초기 단계에서 세포 매개 면역의 주요한 표적이다. 결핵균의 esat-6 유전자는 esat-6 다중유전자 과 (family)에 속하고, esat-6 부위의 클러스터 (cluster)의 5개의 카피 (copy)를 갖는다. 이러한 클러스터들은 CFP-10 (Ihp) 및 ESAT-6 (esat -6) 유전자 과 (분비된 T-세포 항원을 인코딩함)의 유전자뿐만 아니라, 분비되는 세포벽-관련 서브틸리신 (subtilisin)-유사 세린 프로테아제, 추정적 ABC 트랜스포터, ATP-결합 단백질 및 기타 막-관련 단백질을 인코딩하는 유전자를 함유한다. 이러한 막과 관련되고 에너지를 제공하는 단백질은 ESAT-6 및 CFP-1O 단백질 과의 구성원들을 분비하는 기능을 하고, 상기 프로테아제는 분비된 펩티드의 처리에 관여할 수 있다. 또한 이러한 유전자 클러스터는 마이코박테리움의 다른 종들 사이에서 보존되었다. 따라서, esat-6 유전자 부위에 기초한 재조합 백신을 개발하는 것은 마이코박테리움의 다른 병원성 균주에 대한 보호 반응 또한 제공할 수 있다.
백신 개발에 적절한 후보물질로서 ESAT-6의 효능을 확인하기 위한 많은 연구들이 이미 수행되어 왔다. ESAT-6에 기초하여 현재까지 개발된 백신 중에는 esat-6 유전자가 삽입된 재조합 BCG, esat-6 서브유닛 (subunit) 백신, 및 후보물질로서 결핵균 유전자 MPT64, AG85B 및 ESAT-6를 갖는 복합 DNA 백신이 있다. 이와 같이 개발된 백신은 모두 양호한 효능을 나타냈으며, 향후 결핵균에 대한 백신접종의 후보물질 중 하나일 수 있다.
후보물질로 선택된 리슈마니아 도노바니의 키네신 모터 도메인 영역은 마우스 모델에서 Th-1 특이적 반응을 유도하는 것으로 이미 알려져 있다. 이 외에도, 이전의 인-실리코 분석 결과, 상기 키네신 모터 도메인 영역은 그의 펩티드 서열 [4]에서 MHC-I & II 결합 에피토프 (epitope) 클러스터를 갖는 것으로 확인되었다. 리슈마니아 도노바니의 키네신 모터 도메인을 코딩하는 유전자는 카네신 단백질 상과 (superfamily)의 구성원이다. 리슈마니아 도노바니에서 상기 키네신 모터 도메인은 소낭, 소기관, 거대 단백질 복합체, 및 세포골격 단편과 같은 여러가지 카고 (cargo)의 세포내 운반 및 세포 분열에 중요한 역할을 하는 것으로 밝혀졌으며, 뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열 수준 모두 천연에서 고도로 보존되었기 때문에, 다른 리슈마니아 종과의 80-90 %의 동일성, 트리파노소마 (trypanosome), 마우스 및 인간과 같은 유기체에서는 35-45 % 동일성을 갖는 것으로 확인되었다. 이의 전형적인 역할 외에도, 최근 본 발명자들은 키네신 유전자의 면역우성 반복 영역이 리슈마니아증의 진단에 고도로 민감하고 특이적이며, Ld-rkEl6으로 명명되었음을 확인하였다. Ld-rKE16은 대조 혈청에서 위양성 (false positive) 반응 없이 매우 (100%) 특이적인 것으로 확인되었다. 인도, 파키스탄 및 터키의 VL 및 PKDL 확진 환자 유래의 혈청을 이용하여 ELISA 방법으로 Ld-rKE16 항원을 분석한 결과 100 % 민감성을 나타내었다.
이전의 발견에 기초하여, 본 발명자들은 두 개의 무작위 MHC Class-I 결합 펩티드 예측 서버를 이용하여 키네신의 인-실리코 분석을 수행하였다. 상기 서버는 신경 네트워크를 이용하고, 에피토프의 생리화학적 특성에 기초하여 특이적 에피토프를 예측한다. 연구 결과, 키네신 모터 도메인 영역에서 세포독성 T-세포에 대해 높은 친화력을 갖는 MHC-I 결합 에피토프의 클러스터를 확인하였다 (도 1). 상기 실험으로 키네신이 유망한 리슈마니아 백신 후보물질이라는 것을 알 수 있었다.
구제역 바이러스의 2A 펩티드는 키네신과 esat-6 유전자 사이의 링커 (linker) 단백질로서 작용한다. 이러한 유전자를 선택한 이유는 이러한 서열에 의해 코딩되는 펩티드가 자동단백질가수분해 (autoproteolytic) 요소로 작용하여 esat-6 유전자 및 키네신 유전자 모두의 개개의 발현을 가능하게 하기 때문이다. 이의 고유한 특성은 상이한 유전자들의 키메라 발현에 유용하다는 것이다.
실시예
2:
키네신
모터 도메인 및
esat
-6 유전자의 분리를 위한
프라이머
디자인
키네신 모터 도메인 및 esat-6 유전자의 코딩 영역을 증폭할 수 있는 프라이머를 개발하였다. 상기 프라이머는 특정 벡터에 효율적인 클로닝을 위해 제한 부위를 포함하도록 디자인된다. 키네신 모터 도메인의 증폭을 위한 프라이머 서열은 SEQ ID No. 6 및 7에 표시된다. 마찬가지로, esat-6 영역의 증폭을 위한 프라이머 서열은 SEQ ID No. 8 및 9에서 표시된다.
Pfu DNA 폴리머라아제를 이용하여 증폭시킨 후, pGEM-T 벡터에 클로닝시키고, 정제하였으며, 자동화 서열분석장치를 이용하여 분석하였다 (도 3). 마지막으로, 제한 부위가 있는 특정 어뎁터 서열을 이용하여 자가분열 펩티드 (FMDV의 2A 펩티드)의 양측에 함께 접합시키자, 키메라 분자로부터 두 유전자의 개개의 발현이 가능하게 되었다. FMDV 2A 펩티드의 합성에 관한 상세한 것은 아래에서 언급하기로 한다.
실시예
3:
FMDV
2A 펩티드의 합성
전술한 목적을 위하여, 90 % 이상의 분열 활성을 갖는 FMDV 서열을 데이터베이스 검색에 기초하여 선택하였다. 마지막으로, 벡터에 클로닝하기 위한 길이 및 제한 지도에 기초하여, 97 % 분열 활성을 갖는 58 bp 서열을 스위스의 microsynth로부터 인공적으로 합성하였다. 상기 유전자의 서열은 SEQ ID No.3에 나타내었다.
실시예
4:
키메라
분자의 발생
SEQ ID No. 1 및 SEQ ID No. 2에서 나타낸 클로닝된 단편을 제한효소로 절단하여 잘라내었다. 또한, SEQ ID No. 3으로 디자인한 FMDV 2A 단편을 절단하고, SEQ ID No, 1 및 2와 함께 라이게이션하였다 (도 4). 상기 라이게이션 반응은 다음과 같이 수행하였다: 10×완충액 - 2.5 μl, 키네신 모터 도메인 - 8 μl (1 μg), esat-6 유전자 - 6 μl (1g), FMDV 2A 영역 - 3μ(1 μg), T4 DNA 리가아제 - l.5μl (6 units), 및 멸균수 (25 μl의 체적을 만드는 양). 상기 라이게이션 반응을 4 ℃에서 밤새 진행시켰다.
실시예
5: 벡터의 선택 및
pVAX
-1® 벡터 내에
키메라
유전자 및 개개의 유전자의
클로닝
강한 포로모터 하에서 결핵균의 esat-6 영역 및 리슈마니아 도노바니의 키네신 모터 도메인 영역을 포유동물의 발현 벡터 내로 도입하여 유전자의 발현을 유도함으로써, 결핵균 및 리슈마니아 도노바니의 단백질을 발현하는 DNA 백신을 제조하였다. 상기 선택한 벡터는 Invitrogen사의 pVAX-1®로서, 일부 박테리아 균주 (바람직하게는 대장균)을 이용하여 쉽게 스크리닝될 수 있는 셔틀 벡터 (shuttle vector)이다. 이러한 용도에 적합한 벡터의 또 다른 특징은, 광범위한 포유동물 세포에서 높은 수준의 발현을 위한 CMV 프로모터, 효율적인 전사 종결 및 mRNA의 폴리아데닐화 (polyadenylation)를 위한 BGH 폴리아데닐화 시그날 (signal), 카나마이신 저항성 유전자를 가짐으로써, 알레르기 반응을 최소화한다는 것이며, 마지막으로 가장 중요한 특징으로 감염성 질환의 예방을 위한 DNA 백신으로서의 적용은 FDA에 의해 규정되었다.
pVAX-1 내에 키메라 분자를 클로닝하는 것은 기본적인 클로닝 방법을 이용하여 수행하였다. 키메라 분자 및 pVAXl 벡터는 모두 제한 절단을 통해 선형화하였다. 상기 분자들을 T4 DNA 리가아제를 이용하여 라이게이션하였다. 상기 반응은 다음과 같이 수행하였다: 1O×완충액 - 2.0 μl, 키메라 분자 - 15 μl (6 μg), pVAX-1 벡터 - 2 μl (2μg), T4 DNA 리가아제 - 1.0 μl ( 5 Units), 및 멸균수 (20 μl의 체적을 만드는 양) (도 5). 라이게이션 이후, 재조합 결핍 및 엔도뉴클라아제 결핍 DH5 α-E.coli 균주를 전술한 프로토콜에 따라 pVAXl- LDMT를 이용하여 형질전환하였다.
키메라 작제물 이외에도, 전술한 바와 같이 프로토콜을 이용하여 esat-6 및 및 키네신 모터 도메인 유전자를 pVAX-1 내에 클로닝하여 개개의 작제물들을 발생시켰다. 발생한 모든 재조합 분자들은 항생제 압력 선별을 이용하여 스크리닝하였다. 마지막으로, 상기 재조합 콜로니로부터 플라스미드 DNA를 정제하였다. 상기 방법은 알칼리성 용해, RNase 처리, 이소프로판올 침전 및 끝으로 적절한 정제 키트를 이용한 정제를 포함한다.
상기 정제된 플라스미드 분자의 추가적인 분석은 제한 절단 (도 6 및 7) 및 서열분석을 이용하여 수행하였다.
실시예
6: 클론의
시험관내
(
In
-
Vitro
) 발현 분석
ESAT-6 및 키네신 모터 도메인을 발현시키기 위한 재조합 키메라 작제물의 능력을, TNT 결합 전사/번역 시스템 (Promega)을 이용히여 제조사의 지시에 따라 연구하였다. TNT는 시험관내 단백질 합성을 위해 결합 전사/번역 반응을 이용한다. 전사 및 번역은 반응에서 동시에 일어나며, RNA 폴리머라아제가 템플릿 유전자를 전사하는 때에, TNT에 의해 제공된 리보솜은 초기 mRNA의 5'- 말단을 번역하기 시작한다.
키네신 모터 도메인 및 ESAT-6 도메인의 발현을 확인하기 위하여, 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. 단백질의 시험관내 반응 혼합물을 16 % 트리신 SDS-PAGE 상에서 분해하고, 반-건조 블롯팅 장치 (Bio-Rad®, USA)를 제조사의 지시에 따라 이용하여 니트로셀룰로스 막 (Millipore)으로 옮겼다. 상기 막을 5 % 탈지유로 블로킹하고, PBS (pH 7.0, 0.1 % Tween-20)로 각각 10 분씩 세 번 세척한 다음, 실온에서 환자 혈청 및 토끼 혈청의 1:50 희석액 (PBS, pH 7.0, 1 % BSA)과 함께 1 시간 동안 배양하였다. 상기 막을 PBS (pH 7.0, 0.1 % Tween-20)으로 세 번 세척한 다음, 비오틴-결합 항-인간 IgG 1:1000 희석액 (PBS, pH 7.0, 1 % BSA)과 함께 실온에서 1 시간 동안 배양하였다. 2차 항체와 함께 배양한 후, 상기 막을 세척한 다음 겨자무과산화효소에 결합된 1차 기질 아비딘과 반응시켰다. PBS (pH 7.0, 0.1 % Tween-20)를 이용하여 각 10분씩 2번 씻은 후, 그 블롯을 기질로서 DAB (Amresco) 및 0.1 % H2O2를 이용하여 발색시키고, 그 밴드를 막 상에서 직접 시각화하였다 (도 8A 및 도 8B).
실시예
7:
키메라
및 개개의
작제물의
면역원성
BALB/c 마우스 모델을 이용한 키메라 작제물의 면역원성에 관한 연구는 진행중에 있다. 이 연구는 BALB/c 마우스를 백신접종한 다음, IFN-γ, IL-2 및 IL-4 반응을 측정하는 것을 포함한다. 비장은 RPMI 1640 배지를 함유하는 멸균 접시 상에서 무균 조건하에 백신접종된 마우스로부터 제거하였다. 상기 비장을 10 ml 주사기 플런저의 원반형 바닥으로 분쇄하여 단일 세포 현탁액을 제조하였다. 5 내지 10 ml의 RPMI-1640 배지를 여기에 첨가하고 균질해지도록 혼합하였다. 상기 접시를 2분간 건드리지 않은 상태로 유지시키고, 그 투명한 상청액을 서서히 피페팅하여 제거하였다. 세포를 250 xg로 4 ℃에서 10분간 원심분리 (Sigma Centrifuge)하여 펠릿을 얻었다. 적혈구 및 비장세포를 함유하는 상기 펠릿을 수집하고, 0.9 % 염화암모늄으로 세척하여 적혈구를 용해시켰다. 남아있는 세포를 10 % FCS 및 0.05 μM 2-머캅토에탄올을 함유하는 RPMI 1640에서 2.5×lO6 cells/ml의 밀도로 다시 현탁시키고, 96-웰플레이트 내의 200 μl 부분 표본 (alizuots) (5×1O5 세포)으로 나누었다. 미토켄 (콘카발린 A) 및 키네신을 첨가하고, 콘카발린 A의 웰 농도 당 1, 5 & 10 μg로 및 키네신 및 ESAT-6의 웰 농도 당 5 및 10 μg의 ESAT-6 항원을 각 웰에 첨가한 후, 상기 세포를 5 % CO2 및 95 % 습도를 함유하는 분위기에서 37 ℃로 3일간 배양하였다. 테트라졸륨 (MTT) 어세이를 이용하여 증식을 측정하였다 (도 9).
실시예
8: 백신접종에 따른 마우스의
비장세포
배양액에서
IFN
-γ,
IL
-2 및 IL-4의 검출
마우스로부터 분리한 비장세포 배양액을 96-웰 배양 플레이트에 놓고, 웰당 5×105 세포를 넣었으며, 항원/미토겐을 삼중 웰에 첨가하였다. 48 시간 후, 사이토카인 결정 (determination)을 위해 각 웰로부터 상청액을 조심스럽게 수확하였다. 엔도겐 마우스 IFN-γ, IL-2 및 IL-4 효소-결합 면역흡착제 어세이 키트 (Pierce Biotechnology, Inc. USA)를 제조사의 지시에 따라 이용하여, 상청액 내의 IFN-γ, IL-2 및 IL-4를 결정하였다. 상기 어세이는 20-3000 pg/ml의 범위 내에서 IFN-γ을 검출하기 위해 보정하였다 (도 10).
실시예
9: 지연형 과민 (
Delayed
Type
Hypersensitivity
:
DTH
) 반응
DTH 반응을 위해, 천연 BALB/c 마우스 또는 키메라 백신 작제물이 주사된 마우스에서 족저 종창 (footpad swelling)을 측정하였다. 추가 접종 2개월 후, 각 동물의 후족저 (hind footpad)에, 20 μl의 PBS 내의 리슈마니아 도노바니 및 결핵균의 전체 가용성 단백질 20 μg을 주사하였다. 족저 종창은 여러 시기에 다이얼 캘리퍼 (dial caliper)로 측정하였으며, 그 결과를 항원이 접종된 족저의 두께와 20 μl의 PBS가 접종된 족저의 두께 사이의 차이로 나타내었다 (도 11).
SEQ
ID
No
. 1-
키네신
모터 도메인 뉴클레오티드 영역-
5'ATGCACCCTTCCACTGTGCGGCGTGAGGCGGAGCGGGTGAAGGTGTCGGTGCGCGTGCGCCCCCTAAACGAACGTGAAAACAATGCCCCGGAAGGGACGAAAGTGACCGTTGCGGCGAAACAGGCGGCCGCCGTGGTGACGGTCAAGGTCCTGGGAGGCAGCAACAACAGCGGCGCCGCCGAGTCGATGGGGACTGCAAGGCGGGTAGCGCAGGACTTTCAGTTCGACCACGTGTTCTGGTCTGTGGAGACGCCGGACGCGTGCGGCGCGACCCCCGCGACGCAGGCAGACGTGTTCCGGACGATCGGGTACCCGCTGGTGCAGCACGCGTTCGACGGGTTCAACTCGTGCTTGTTTGCGTACGGGCAGACAGGGAGCGGGAAGATGTACACGATGATGGGCGCGGACGTGAGCGCGCTTAGTGGTGAGGGCAACGGCGTGACGCCGCGGATCTGCCTGGAGATCTTTGCGCGGAAGGCGAGCGTGGAGGCGCAGGGGCACTCGCGGTGGATCGTGGAGCTGGGGTACGTGGAGGTGTACAACGAGCGCGTGTCGGACCTGCTTGGGAAGCGGAAGAAGGGTGTGAAGGGCGGCGGCGAGGAGGTGTACGTGGACGTGCGCGAGCACCCGAGCCGCGGCGTGTTCCTGGAGGGGCAGCGGCTGGTGGAGGTTGGGAGCCTGGACGATGTTGTGCGGCTGATCGAGATCGGCAACGGCGTGCGGCACACCGCTTCAACGAAGATGAACGACCGGAGCAGCCGGAGCCACGCGATCATCATGCTGCTGCTGCGCGAGGAGCGGACGATGACGACGAAGAGCGGGGAGACGATCCGTACTGCCGGCAAGAGCAGCCGCATGAACCTTGTGGACCTTGCGGGGTCTAAGCGCGTGGCGCAGTCGCAGGTGGAGGGGCAGCAGTTCAAGGAGGCGACGCACATCAACCTGTCGCTGACGACGCTCGGGCGCGTGATCGAC 3'
SEQ
ID
No
. 2-
esat
-6
뉴클레오티드 영역
5'TGACAGAGCAGCAGTGGAATTTCGCGGGTATCGAGGCCGCGGCAAGCGCAATCCAGGGAAATGTCACGTCCATATTCCCTCCTTGACGAGGGGAAGCAGTCCCTGACCAAGCTCGCAGCGGCCTGGGGCGGTAGCGGTTCGGAGGCGTCCAGGGTGTCCAGCAAAAATGGGACGCCACGGCTACCGAGCTGAACAACGCGCTGCAGAACCTGGCGCGGACGATCAGCGAAGCCGGTCAGGCAATGGCTTCGACCGAAGGCAACGTCACTGGGATGTTCGCA 3'
SEQ
ID
No
. 3
FMDV
2A 영역-
SEQ
ID
No
. 4
키메라
작제물의
완전한 뉴클레오티드 서열
SEQ
ID
No
. 5
키메라
작제물의
완전한 아미노산 서열
ESAT
-6 도메인
MTEQQWNFAGIEAAASAIQGNVTSIHSLLDEGKQSLTKLAAAWGGSGSEAYQGVQQKWDATATELNNALQNLARTISEAGQAMASTEGNVTGMFA
FMDV
2A 도메인
RAEGRGSLLTCGDVEENPGP
키네신
모터 도메인
MHPSTVRREAERVKVSVRVRPLNERENNAPEGTKVTVAAKQAAAVVTVKVLGGSNNSGAAESMGTARRVAQDFQFDHVFWSVETPDACGATPATQADVFRTIGYPLVQHAFDGFNSCLFAYGQTGSGKMYTMMGADVSALSGEGNGVTPRICLEIFARKASVEAQGHSRWIVELGYVEVYNERVSDLLGKRKKGVKGGGEEVYVDVREHPSRGVFLEGQRLVEVGSLDDVVRLIEIGNGVRHTASTKMNDRSSRSHAIIMLLLREERTMTTKSGETIRTAGKSSRMNLVDLAGSKRVAQSQVEGQQFKEATHINLSLTTLGRVID
SEQ
ID
No
. 6 & 7
키네신
모터 도메인 영역의 증폭을 위한
LF
및
LR
의 합성 올리고뉴클레오티드-
(유전자 은행에 제출된 가입번호 AY615886인 레슈마니아 도노바니 KE-16 균주의 키네신 유전자 서열로부터 선택된 프라이머로서, 361-1335 bp를 증폭시킴)
SEQ
ID
No
. 8
and
9
esat
-6
유전자의 증폭을 위한 합성
올리고튜클레오티드
ESAT
-F 및
ESAT
-R-
(유전자 은행에 제출된 가입번호 AF420491의 결핵균 균주의 ESAT-6 유전자 서열로부터 선택된 프라이머로서, 14-301 bp를 증폭시킴).
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<213> Leishmania donovani
<400> 1
atgcaccctt ccactgtgcg gcgtgaggcg gagcgggtga aggtgtcggt gcgcgtgcgc 60
cccctaaacg aacgtgaaaa caatgccccg gaagggacga aagtgaccgt tgcggcgaaa 120
caggcggccg ccgtggtgac ggtcaaggtc ctgggaggca gcaacaacag cggcgccgcc 180
gagtcgatgg ggactgcaag gcgggtagcg caggactttc agttcgacca cgtgttctgg 240
tctgtggaga cgccggacgc gtgcggcgcg acccccgcga cgcaggcaga cgtgttccgg 300
acgatcgggt acccgctggt gcagcacgcg ttcgacgggt tcaactcgtg cttgtttgcg 360
tacgggcaga cagggagcgg gaagatgtac acgatgatgg gcgcggacgt gagcgcgctt 420
agtggtgagg gcaacggcgt gacgccgcgg atctgcctgg agatctttgc gcggaaggcg 480
agcgtggagg cgcaggggca ctcgcggtgg atcgtggagc tggggtacgt ggaggtgtac 540
aacgagcgcg tgtcggacct gcttgggaag cggaagaagg gtgtgaaggg cggcggcgag 600
gaggtgtacg tggacgtgcg cgagcacccg agccgcggcg tgttcctgga ggggcagcgg 660
ctggtggagg ttgggagcct ggacgatgtt gtgcggctga tcgagatcgg caacggcgtg 720
cggcacaccg cttcaacgaa gatgaacgac cggagcagcc ggagccacgc gatcatcatg 780
ctgctgctgc gcgaggagcg gacgatgacg acgaagagcg gggagacgat ccgtactgcc 840
ggcaagagca gccgcatgaa ccttgtggac cttgcggggt ctaagcgcgt ggcgcagtcg 900
caggtggagg ggcagcagtt caaggaggcg acgcacatca acctgtcgct gacgacgctc 960
gggcgcgtga tcgac 975
<210> 2
<211> 282
<212> DNA
<213> Mycobacterium tuberculosis
<400> 2
atgacagagc agcagtggaa tttcgcgggt atcgaggccg cggcaagcgc aatccaggga 60
aatgtcacgt ccatattccc tccttgacga ggggaagcag tccctgacca agctcgcagc 120
ggcctggggc ggtagcggtt cggaggcgtc cagggtgtcc agcaaaaatg ggacgccacg 180
gctaccgagc tgaacaacgc gctgcagaac ctggcgcgga cgatcagcga agccggtcag 240
gcaatggctt cgaccgaagg caacgtcact gggatgttcg ca 282
<210> 3
<211> 80
<212> DNA
<213> Foot-and-mouth disease virus
<400> 3
gcggatccag agccgagggc aggggaagtc ttctaacatg cggggacgtg gaggaaaatc 60
ccccaatgca ttggatgcat 80
<210> 4
<211> 299
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Chimeric Construct-esat-6
<400> 4
cccaagctta tgacagagca gcagtggaat ttcgcgggta tcgaggccgc ggcaagcgca 60
atccagggaa atgtcacgtc catattccct ccttgacgag gggaagcagt ccctgaccaa 120
gctcgcagcg gcctggggcg gtagcggttc ggaggcgtcc agggtgtcca gcaaaaatgg 180
gacgccacgg ctaccgagct gaacaacgcg ctgcagaacc tggcgcggac gatcagcgaa 240
gccggtcagg caatggcttc gaccgaaggc aacgtcactg ggatgttcgc aggatccgc 299
<210> 5
<211> 80
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Chimeric Construct-FMDV
<400> 5
gcggatccag agccgagggc aggggaagtc ttctaacatg cggggacgtg gaggaaaatc 60
ccccaatgca ttggatgcat 80
<210> 6
<211> 993
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Chimeric Construct_kinesin
<400> 6
ccaatgcatt ggatgcaccc ttccactgtg cggcgtgagg cggagcgggt gaaggtgtcg 60
gtgcgcgtgc gccccctaaa cgaacgtgaa aacaatgccc cggaagggac gaaagtgacc 120
gttgcggcga aacaggcggc cgccgtggtg acggtcaagg tcctgggagg cagcaacaac 180
agcggcgccg ccgagtcgat ggggactgca aggcgggtag cgcaggactt tcagttcgac 240
cacgtgttct ggtctgtgga gacgccggac gcgtgcggcg cgacccccgc gacgcaggca 300
gacgtgttcc ggacgatcgg gtacccgctg gtgcagcacg cgttcgacgg gttcaactcg 360
tgcttgtttg cgtacgggca gacagggagc gggaagatgt acacgatgat gggcgcggac 420
gtgagcgcgc ttagtggtga gggcaacggc gtgacgccgc ggatctgcct ggagatcttt 480
gcgcggaagg cgagcgtgga ggcgcagggg cactcgcggt ggatcgtgga gctggggtac 540
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ggcggcggcg aggaggtgta cgtggacgtg cgcgagcacc cgagccgcgg cgtgttcctg 660
gaggggcagc ggctggtgga ggttgggagc ctggacgatg ttgtgcggct gatcgagatc 720
ggcaacggcg tgcggcacac cgcttcaacg aagatgaacg accggagcag ccggagccac 780
gcgatcatca tgctgctgct gcgcgaggag cggacgatga cgacgaagag cggggagacg 840
atccgtactg ccggcaagag cagccgcatg aaccttgtgg accttgcggg gtctaagcgc 900
gtggcgcagt cgcaggtgga ggggcagcag ttcaaggagg cgacgcacat caacctgtcg 960
ctgacgacgc tcgggcgcgt gatcgacggg ccc 993
<210> 7
<211> 95
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Chimeric Construct-ESAT-6 Domain
<400> 7
Met Thr Glu Gln Gln Trp Asn Phe Ala Gly Ile Glu Ala Ala Ala Ser
1 5 10 15
Ala Ile Gln Gly Asn Val Thr Ser Ile His Ser Leu Leu Asp Glu Gly
20 25 30
Lys Gln Ser Leu Thr Lys Leu Ala Ala Ala Trp Gly Gly Ser Gly Ser
35 40 45
Glu Ala Tyr Gln Gly Val Gln Gln Lys Trp Asp Ala Thr Ala Thr Glu
50 55 60
Leu Asn Asn Ala Leu Gln Asn Leu Ala Arg Thr Ile Ser Glu Ala Gly
65 70 75 80
Gln Ala Met Ala Ser Thr Glu Gly Asn Val Thr Gly Met Phe Ala
85 90 95
<210> 8
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Chimeric Construct-FMDV 2A Domain
<400> 8
Arg Ala Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu
1 5 10 15
Asn Pro Gly Pro
20
<210> 9
<211> 325
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Chimeric Construct-Kinesin Motor Domain
<400> 9
Met His Pro Ser Thr Val Arg Arg Glu Ala Glu Arg Val Lys Val Ser
1 5 10 15
Val Arg Val Arg Pro Leu Asn Glu Arg Glu Asn Asn Ala Pro Glu Gly
20 25 30
Thr Lys Val Thr Val Ala Ala Lys Gln Ala Ala Ala Val Val Thr Val
35 40 45
Lys Val Leu Gly Gly Ser Asn Asn Ser Gly Ala Ala Glu Ser Met Gly
50 55 60
Thr Ala Arg Arg Val Ala Gln Asp Phe Gln Phe Asp His Val Phe Trp
65 70 75 80
Ser Val Glu Thr Pro Asp Ala Cys Gly Ala Thr Pro Ala Thr Gln Ala
85 90 95
Asp Val Phe Arg Thr Ile Gly Tyr Pro Leu Val Gln His Ala Phe Asp
100 105 110
Gly Phe Asn Ser Cys Leu Phe Ala Tyr Gly Gln Thr Gly Ser Gly Lys
115 120 125
Met Tyr Thr Met Met Gly Ala Asp Val Ser Ala Leu Ser Gly Glu Gly
130 135 140
Asn Gly Val Thr Pro Arg Ile Cys Leu Glu Ile Phe Ala Arg Lys Ala
145 150 155 160
Ser Val Glu Ala Gln Gly His Ser Arg Trp Ile Val Glu Leu Gly Tyr
165 170 175
Val Glu Val Tyr Asn Glu Arg Val Ser Asp Leu Leu Gly Lys Arg Lys
180 185 190
Lys Gly Val Lys Gly Gly Gly Glu Glu Val Tyr Val Asp Val Arg Glu
195 200 205
His Pro Ser Arg Gly Val Phe Leu Glu Gly Gln Arg Leu Val Glu Val
210 215 220
Gly Ser Leu Asp Asp Val Val Arg Leu Ile Glu Ile Gly Asn Gly Val
225 230 235 240
Arg His Thr Ala Ser Thr Lys Met Asn Asp Arg Ser Ser Arg Ser His
245 250 255
Ala Ile Ile Met Leu Leu Leu Arg Glu Glu Arg Thr Met Thr Thr Lys
260 265 270
Ser Gly Glu Thr Ile Arg Thr Ala Gly Lys Ser Ser Arg Met Asn Leu
275 280 285
Val Asp Leu Ala Gly Ser Lys Arg Val Ala Gln Ser Gln Val Glu Gly
290 295 300
Gln Gln Phe Lys Glu Ala Thr His Ile Asn Leu Ser Leu Thr Thr Leu
305 310 315 320
Gly Arg Val Ile Asp
325
<210> 10
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic oligonucleotide LF for amplification of Kinesin Motor
Domain Region
<400> 10
ccaatgcatt ggatgcaccc ttccactgtg cgg 33
<210> 11
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonuclotide LR for amplification of Kinesin Motor
Domain Region
<400> 11
gggcccgtcg atcacgcgcc cgagcgtcgt 30
<210> 12
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic oligonucleotide-ESAT-F for amplification of esat-6 gene
<400> 12
cccaagctta tgacagagca gcagtgga 28
<210> 13
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic oligonucleotide-ESAT-R amplification of esat-6 gene
<400> 13
gcggatcctg cgaacatccc agtgacg 27
Claims (6)
- 결핵균 (Mycobacterium tuberculosis)의 esat-6 영역 및 리슈마니아 도노바니 (Leishmania donovani)의 키네신 영역이 DNA 백신 벡터 pVAX-1 내의 자가절단 펩티드의 양측에 함께 클로닝 (cloning)되어 있는 DNA 작제물의 신규한 재조합 키메라로서, 키메라 작제물이 전사 프로모터에 작동가능하게 연결됨으로써 포유동물의 세포 내에서 자가복제 및 발현할 수 있는 DNA 작제물의 신규한 재조합 키메라.
- 제 1 항에 있어서,
상기 DNA 작제물의 신규한 재조합 키메라가 리슈마니아 도노바니 유래의 키네신 모터 도메인의 DNA 서열 및 결핵균 유래의 esat-6 도메인의 DNA 서열을 포함하는 약학적으로 허용가능한 면역자극제제를 제공하는 것인,
DNA 작제물의 신규한 재조합 키메라. - 제 1 항에 있어서,
상기 DNA 작제물의 신규한 재조합 키메라가 약학적 조성물로서 유효량으로 경피 투여되는 경우 온혈 동물에서 면역 반응을 자극하는 방법을 제공하는 것인,
DNA 작제물의 신규한 재조합 키메라. - 제 1 항에 있어서,
상기 DNA 작제물의 신규한 재조합 키메라가 두 후보물질 유전자에 대해 강한 TH-1형 면역 반응을 발생시키는 것인,
DNA 작제물의 신규한 재조합 키메라. - 제 1 항에 있어서, 상기 DNA 작제물의 신규한 재조합 키메라가 내장 리슈마니아증 및 결핵을 동시에 치료 및 제어하는 백신 후보물질로 사용될 수 있는 것인,
DNA 작제물의 신규한 재조합 키메라. - DNA 작제물의 신규한 재조합 키메라의 제조방법으로서,
a) 무작위 MHC Class-1 결합 펩티드 예측 서버 (Promiscuous MHC Class-1 Binding Peptide Prediction)를 이용하여 키네신 모터 도메인 및 esat-6 도메인의 예측되는 단백질 서열을 분석하는 단계,
b) 상기 키네신 모터 도메인 및 esat-6 도메인의 유전자 코딩 증폭 단계를 행하는 단계,
c) 키네신 esat-6 유전자 영역을 서열분석용 pGEM-T® 벡터에 클로닝하는 단계,
d) pVAX-1 벡터에서 방향성 클로닝 (directional cloning)에 의해 키메라 작제물을 발생시키는 단계,
e) 무세포 번역 시스템을 이용한 상기 클론 유래의 키네신 모터 도메인 및 esat-6 도메인의 시험관내 발현 분석 단계 및 상기 작제물을 이용한 면역원성 연구, 비장세포 증식 및 사이토카인 연구를 행하는 단계를 포함하는,
DNA 작제물의 신규한 재조합 키메라의 제조방법.
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