CN104703627A - 分子伴侣/引领蛋白融合蛋白 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了包含至少一种分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体的分子伴侣/引领蛋白家族聚合物,其中所述至少一种分子伴侣/引领蛋白家族单体含有外源生物活性序列。
Description
技术领域
本发明涉及包含具有外源生物活性序列之重组蛋白质单体的蛋白质聚合物。更特别地,本发明涉及包含至少一种分子伴侣/引领蛋白(chaperone/usher)家族多肽单体的分子伴侣/引领蛋白家族聚合物,其中所述至少一种分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体包含外源生物活性序列。
背景技术
体内蛋白质和其他胞外基质(ECM)组分形成了互连的网孔(mesh),细胞在其中整合并且相互作用。一种模拟这种天然构造的方式是通过交联人工聚合物来产生三维细胞培养系统。
细胞培养和组织工程领域取得了很好的进展,并且已经开发了多种ECM等同物。这些等同物中用于骨架的材料不同,因此能够在其中繁殖的细胞类型也不同。
纤连蛋白(FN)是一种介导细胞附着和生长的主要的ECM蛋白质。FN含有多种配体,包括介导细胞粘附的三肽RGD和肽PHSRN。天然来源的蛋白质(例如纤连蛋白)可用作体内细胞附着的骨架。但是,利用任何动物来源蛋白质的一个潜在问题是有可能传播疾病。
因此,已经提出了一系列再造天然三维组织的工程三维骨架。目前的三维骨架并不理想(7)。例如,难以产生特定细胞系或组织类型特异性的骨架;这些骨架之间还具有高的批与批可变性;在不影响这些骨架其他性质的情况下改变其单一的性质是复杂的。例如,如果希望改变特定骨架的粘度,可能最终同时改变粘附配体的密度和骨架的呈现方式或者孔隙率,这可能影响营养物通过骨架扩散的特性(11)。
因此,仍然需要提供改进的细胞培养环境。
发明概述
在一个方面,本发明提供了包含至少一种分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体的分子伴侣/引领蛋白家族聚合物,其中所述至少一种分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体包含外源生物活性序列。
优选地,所述生物活性序列基本上无免疫原性。
优选地,所述单体基本上不含天然存在的粘附基序。
优选地,所述单体是FG环长家族(FG loop long family)多肽单体,例如,选自Caf1、Saf1和Afa/Dr的FG环长家族多肽单体。更优选地,所述单体是Caf1多肽。更优选地,所述单体与SEQ ID NO:5的多肽具有至少70%同一性。
或者,所述单体是FG环短家族(FG loop short family)多肽单体,例如选自Fim和Pap的FG环短家族多肽单体。
优选地,所述生物活性序列选自细胞粘附识别基序、生长因子序列基序和蛋白酶位点。更优选地,所述生物活性序列是细胞粘附识别基序。更优选地,所述细胞粘附识别基序是胞外基质细胞粘附识别基序。更优选地,所述细胞粘附识别基序选自胶原蛋白、弹性蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白或生腱蛋白。优选地,所述细胞粘附识别基序包含氨基酸序列RGD。替代地或附加地,所述细胞粘附识别基序包含氨基酸序列PHSRN。
优选地,所述生物活性序列包含在所述单体内这样的位点处,所述位点包含在所述多肽折叠后的环结构内。
优选地,所述聚合物是级分1抗原聚合物(fraction 1 antigenpolymer),并且所述至少一种分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体是CAF1多肽单体。
优选地,所述聚合物包含至少一种另外的分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体,其中所述另外的分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体与所述包含外源生物活性序列的所述至少一种分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体至少有一个氨基酸不同。更优选地,所述另外的分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体是不具有所述外源生物活性序列的本文所述分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体。
优选地,所述另外的分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体是天然存在的CAF1多肽单体。更优选地,所述至少一种天然存在的CAF1多肽单体是鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis)CAF1多肽。仍更优选地,所述鼠疫耶尔森氏菌CAF1多肽具有SEQ ID NO:5的多肽序列。
优选地,所述另外的分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体包含这样的外源生物活性序列,其不同于所述至少一种分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体的所述外源生物活性序列。更优选地,所述至少一种分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体的所述外源生物活性序列是包含氨基酸序列RGD的细胞粘附识别基序,并且其中所述至少一种另外的分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体的所述外源生物活性序列是包含氨基酸序列PHSRN的细胞粘附识别基序。
在另一个方面,本发明提供了包含根据本发明的分子伴侣/引领蛋白家族聚合物的水凝胶。
优选地,所述水凝胶还包含交联剂。更优选地,所述交联剂是生物可降解的交联剂。或者,所述交联剂是不可降解的交联剂。
优选地,所述交联剂包含聚乙二醇。
在另一个方面,本发明提供了根据本发明的水凝胶作为细胞支持骨架的用途。
优选地,所述骨架是2D细胞支持骨架。或者,所述骨架是3D细胞支持骨架。
在另一个方面,本发明提供了包含根据本发明的水凝胶的伤口敷料。
在另一个方面,本发明提供了根据本发明的水凝胶,其用于治疗伤口。
优选地,所述伤口是慢性伤口,或者其中所述伤口是急性伤口。
在另一个方面,本发明提供了包含根据本发明的水凝胶的眼植入物(ocular implant)。
在另一个方面,本发明提供了根据本发明的水凝胶,其用于治疗眼损伤。
在另一个方面,本发明提供了用于制备包含至少一种分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体的分子伴侣/引领蛋白家族聚合物的方法,所述至少一种分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体包含外源源生物活性序列,所述方法包括:
i)将编码包含外源生物活性序列之分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体的核酸分子并入用于在宿主细胞中表达的表达载体中;以及
ii)用所述表达载体转染宿主细胞;
其中向所述宿主细胞提供编码分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体特异性之周质分子伴侣的核酸分子和编码分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体特异性之外膜引领蛋白的核酸分子,并且其中得到的经转染宿主细胞产生分子伴侣/引领蛋白家族聚合物。
优选地,所述生物活性序列基本上无免疫原性。
优选地,所述单体基本上不含天然存在的粘附基序。
优选地,所述分子伴侣/引领蛋白家族聚合物是级分1抗原聚合物,并且包含外源生物活性序列的所述至少一种分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体是CAF1多肽单体。更优选地,编码包含外源生物活性序列之CAF1多肽单体的所述核酸分子与SEQ ID NO:1的核苷酸序列具有至少70%同一性。
优选地,编码分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体特异性之周质分子伴侣的所述核酸分子编码CAF1特异性的周质分子伴侣,并且其中编码分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体特异性之外膜引领蛋白的所述核酸分子编码CAF1特异性的外膜引领蛋白。更优选地,编码CAF1特异性之周质分子伴侣的所述核酸分子与SEQ ID NO:2的核苷酸序列具有至少70%同一性。
优选地,编码CAF1特异性之外膜引领蛋白的所述核酸分子与SEQID NO:3的核苷酸序列具有至少70%同一性。
优选地,如下向所述宿主细胞提供编码CAF1特异性之周质分子伴侣的核酸分子:
i)将编码CAF1特异性之周质分子伴侣的核酸分子并入用于在宿主细胞中表达的表达载体中;以及
ii)用所述表达载体转染宿主细胞。
优选地,所述表达载体还包含编码含有细胞粘附识别基序之CAF1多肽单体的核酸分子。
优选地,如下向所述宿主细胞提供编码CAF1特异性之外膜引领蛋白的核酸分子:
i)将编码CAF1特异性之外膜引领蛋白的核酸分子并入用于在宿主细胞中表达的表达载体中;以及
ii)用所述表达载体转染宿主细胞。
更优选地,所述表达载体还包含编码含有细胞粘附识别基序之CAF1多肽单体的核酸分子和/或编码CAF1特异性之周质分子伴侣的核酸分子。
优选地,还向所述宿主细胞提供编码分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体特异性之表达调控子的核酸分子。更优选地,编码分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体特异性之表达调控子的所述核酸分子编码CAF1特异性的表达调控子。
优选地,编码CAF1特异性之表达调控子的所述核酸分子与SEQ IDNO:4的核苷酸序列具有至少70%同一性。
优选地,所述生物活性序列是细胞粘附识别基序。
优选地,所述宿主细胞是细菌细胞。更优选地,所述细菌细胞是革兰氏阴性细菌细胞。更优选地,所述细菌细胞是大肠杆菌(Escherichia coli.)。
在另一个方面,本发明提供了级分1抗原聚合物作为防污剂(antifouling agent)的用途。
在另一个方面,本发明提供了包含级分1抗原聚合物的防污组合物。
附图简述
下文参考附图进一步描述了本发明的一些实施方案,其中:
图1是包含温度调节的caf操纵子的卡那霉素抗性质粒pAH34L的示意图,其包含编码F1抗原的基因以及参与鼠疫耶尔森氏菌(Y.pestis)的细菌细胞表面上F1抗原的输出和组装的其他基因(3,12)。
图2是组装和输出到细菌细胞表面的F1纤维的示意图。Caf1M为蓝色;Caf1为红色或绿色;Caf1A为金黄色。在阶段1,F1亚单位(subunit)被分泌到周质中;在阶段2,在周质中形成Caf1M-Caf1复合物;在阶段3,F1纤维开始形成长的聚合物(延长过程)。聚合步骤释放Caf1M的一个分子(M)。Zaviolov和Knight报道过量的Caf1M分子被包装到了四聚体中(T)(15)。供体序列用箭头表示:Caf1M中的A1和G1链形成序列为蓝色,Caf1中的Gd链形成序列为红色或绿色。在Caf1M-Caf1复合物中,Caf1M的第一结构域与Caf1形成了融合杂桶(fused hetero-barrel)。
图3示出使用pAH34L载体作为模板进行的caf操纵子PCR扩增以及PCR产物的限制性消化的结果。a)PCR扩增。M,分子大小标志物(大小,左侧空白处);泳道1,caf操纵子。右侧空白处,PCR产物的大小。b)PCR产物的限制性消化。分子大小标志物(大小,左侧空白处);泳道1,利用BamHI限制酶消化的caf操纵子,显示出3731bp和1520bp两个条带;泳道2,利用HindIII消化的caf操纵子,显示出3490bp、1053bp和707bp三个条带;泳道3,利用EcoRI消化的caf操纵子,显示出5200bp的单个条带,这是因为不存在特异性EcoRI限制位点;泳道4,未消化的caf操纵子,显示出5200bp的单个条带。右侧空白处,以kb为单位的DNA片段的大小。
图4示出纯化的caf操纵子PCR产物及其限制性消化的特征。a)PCR产物的量化。M,分子大小标志物(大小,表格中);泳道U1,纯化的caf操纵子。b)PCR产物的限制性消化。M,分子大小标志物(大小,左侧空白处);泳道1,未消化的caf操纵子;泳道2,利用EcoRI消化的caf操纵子,显示出5200bp的单个条带,这是因为不存在特异性EcoRI限制位点;泳道3,利用BamHI限制酶消化的caf操纵子,显示出3731bp和1520bp两个条带;泳道4,利用HindIII消化的caf操纵子,显示出3490bp、1053bp和707bp三个条带。右侧空白处,DNA片段的大小(kb)。
图5示出克隆在质粒pGEM-T EASY-caf操纵子(pGEM-TF1)中的Caf1操纵子的代表性测序结果,表明caf操纵子以cafR基因序列开始,并且caf操纵子以caf1基因序列结束。a)使用Expasy工具(http://expasy.org/tools/dna.html)的cafR基因序列。b)使用Expasy工具(http://expasy.org/tools/dna.html)的caf1基因序列。使用通用引物如T7启动子引物(5′-AAT TCT AAT ACG ACT CAC TAT AGG-3′)或pUC/M13正向引物(5′-GTA AAA CGA CGG CCA GTG-3′)对通过pGEM-T EASY载体产生的ssDNA测序。
图6示出pGEM-TF1的限制性消化。凝胶电泳显示:M,分子大小标志物(大小,左侧空白处);泳道1,利用EcoRI消化的pGEM-TF1,显示出5.2Kb和3Kb两个条带;泳道2,未消化的pGEM-TF1,显示出8.2Kb的单个条带。(a)图示出caf操纵子插入物(5.2Kb)、pGEM-TEASY载体(3Kb)和EcoRI切割位点;(b)图示出caf操纵子插入物(5.2Kb)、pGEM-T EASY载体(3Kb)以及连接后得到的8.2Kb的质粒。
图7示出SDS-PAGE(左)和使用抗Caf1抗体的western印迹(右)。泳道1包含分子质量标志物蛋白质(箭头表示分子质量×103kda)。分析的样品(10μl)由在37℃培养过夜的细菌细胞培养物大肠杆菌(pgem-tf1)制备。将蛋白质样品在95℃加热5分钟,并向每一份样品添加等体积的SDS-PAGE缓冲液,然后将样品加样到12%SDS-PAGE凝胶上。将1个凝胶用考马斯蓝r250染色(泳道3),而另一个凝胶进行印迹。用抗Caf1抗体探测所得印迹(western印迹的泳道2),然后用具有4cn(4-氯-1-萘酚)的HRP山羊抗小鼠抗体(Sigma-Aldrich)显色溶液(colourdevelopment solution)进行显影。
图8示出纯化的caf1蛋白的肽消化的质谱法,表明基因产物是成熟Caf1减去前导肽。
图9示出使用Superdex 200凝胶过滤柱的校准曲线。上图示出分布系数与log分子质量之间的预期线性关系。下图示出校准蛋白质的实际洗脱曲线,表明约48ml的空隙体积。图9在上图示出利用蛋白质对凝胶过滤柱的校准,并且下图示出其洗脱谱。
图10示出Caf1蛋白纯化。a)Superdex 200FPLC上的凝胶过滤柱色谱。将caf1级分(fraction)施加到Superdex 200凝胶过滤FPLC柱。Caf1主峰靠近空隙体积,表明已经形成了长聚合物。b)SDS-Page凝胶。泳道1含有分子质量标志物蛋白质(箭头表示分子质量×103kDa)。在纯化Superdex 200之后制备分析的样品(10μL)。由主峰收集级分并且确认该峰中Caf1的存在。将蛋白质的每一级分在95℃下加热并保持5分钟,并向每一样品添加等体积的SDS-PAGE缓冲液,之后将样品加样到12%SDS-PAGE凝胶上。
图11示出使用分光光度计对经纯化Caf1蛋白浓度的测量。
图12示出caf1寡聚体的形成。将主要的Caf1纯化级分(图8)在95℃下加热45秒以诱导非共价聚合物的部分破碎。泳道1-5示出Caf1的寡聚化(使用新质粒pGEMTF1表达)。泳道6示出在本研究中用作对照的商业纯的重组F1(rF1)并且也在85℃下加热。
图13示出Caf1M:Caf1复合物。Caf1M,分子伴侣(绿色)以及Caf1,F1纤维(蓝色)。图是使用Pymol软件(http://www.pymol.org)使用已公布的PDB文件1P5U产生的。A)F1氨基酸序列示出用于并入RGDS肽的F1纤维的环(用鲜肉色、粉红色、橙色、深蓝色和黄色突出)。
图14示出测序结果,表明RGDS肽成功插入到了F1环中。上图:caf1基因序列(GenBank,登录号AY450847)的反向测序和blast的色谱图,使用Expasy工具(http://expasy.org/tools/dna.html)。下图:caf1基因序列(GenBank,登录号AY450847)的反向测序和blast的色谱图,使用Expasy工具(http://expasy.org/tools/dna.html)。使用通用引物T7启动子引物(5′-AAT TCT AAT ACG ACT CAC TAT AGG-3′)对由pGEM-TF1载体产生的ssDNA测序。
图15示出尺寸排阻色谱之后纯化的Caf1QDGN76RGDS突变体的级分。泳道2-9示出当样品在95℃下加热不同时间的Caf1QDGN76RGDS突变体寡聚体。
图16示出Caf1的纤维的电子透射显微图像。图像是使用PhillipsCM100电子透射显微镜获得的。用2%(w/v)乙酸双氧铀(uranyl acetate)对Caf1和Caf1-RGDS蛋白样品染色。所使用的图像放大率为130000×。
图17示出使用涂覆有Caf1和Caf1-RGDS蛋白的玻璃盖玻片的PCI2细胞粘附测定。图像是使用Zeiss荧光显微镜获得的。如在每一组图像旁边指出的,所使用的图像放大率为400×和200×。比率尺=20μm。染色剂为DAPI(蓝色)和若丹明鬼笔环肽(橙色)。
图18比较了纤连蛋白和本发明的经修饰CAF1聚合物中RGDS肽的结构。
图19示出本发明优选的交联方法的示意图。球体代表适于交联的赖氨酸残基位点。
图20示出扫描电子显微图像:A、B、D-CAF1∶4NHS-PEG(1∶5);C-CAF1∶4NHS-PEG(1∶2);A、B、C-2%戊二醛固定;D-冻干处理;E-附着在CAF1∶4NHS-PEG(1∶5)水凝胶上的大鼠成骨细胞。比例尺:50μm(A、B、C和D)和200μm(E)。
图21示出生长在涂覆有A)纤连蛋白和B)包含RDGS的CAF1之表面上的大鼠原代成骨细胞的SEM和荧光显微图像。比例尺:10μm。
图22是SEQ ID NO:1的核酸序列。
图23是SEQ ID NO:2的核酸序列。
图24是SEQ ID NO:3的核酸序列。
图25是SEQ ID NO:4的核酸序列。
图26是SEQ ID NO:5的氨基酸序列。
图27是SEQ ID NO:6的氨基酸序列。
图28是SEQ ID NO:7的氨基酸序列。
图29是SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
图30是SEQ ID NO:9的氨基酸序列。
图31是SEQ ID NO:10的核酸序列。
图32是SEQ ID NO:11的氨基酸序列。
图33是SEQ ID NO:12的核酸序列。
图34是SEQ ID NO:13的氨基酸序列。
图35是SEQ ID NO:14的核酸序列。
图36是SEQ ID NO:15的氨基酸序列。
图37是SEQ ID NO:16的核酸序列。
图38是SEQ ID NO:17的氨基酸序列。
图39是SEQ ID NO:18的核酸序列。
图40是SEQ ID NO:19的氨基酸序列。
图41是SEQ ID NO:20的核酸序列。
图42是SEQ ID NO:21的氨基酸序列。
图43是SEQ ID NO:22的核酸序列。
图44是SEQ ID NO:23的氨基酸序列。
图45是SEQ ID NO:24的核酸序列。
图46是SEQ ID NO:25的氨基酸序列。
图47是SEQ ID NO:26的核酸序列。
图48是SEQ ID NO:27的氨基酸序列。
图49是SEQ ID NO:28的核酸序列。
图50是SEQ ID NO:29的氨基酸序列。
图51是SEQ ID NO:30的核酸序列。
图52是SEQ ID NO:31的氨基酸序列。
图53是SEQ ID NO:32的核酸序列。
图54是SEQ ID NO:33的氨基酸序列。
图55是SEQ ID NO:34的核酸序列。
图56是SEQ ID NO:35的氨基酸序列。
图57是SEQ ID NO:36的核酸序列。
图58是SEQ ID NO:37的氨基酸序列。
图59是SEQ ID NO:38的核酸序列。
图60示出使用质粒pAH34L和pBAD33共表达Caf1 WT。表示的是在存在0.2%L-阿拉伯糖以及存在或不存在D-葡萄糖的情况下含有大肠杆菌(E.coli)TOP10/pBAD33_SD_Caf1、大肠杆菌TOP10/pAH34L和大肠杆菌TOP10/pBAD33_SD_Caf1+pAH34L的Falcon管的图像。图例:L,絮状层(Flocculentlayer);P,细胞沉淀。
图61示出Caf1的絮状层的大小与每种制备物的Caf1的相对密度之间的相互关系。Caf1系统分泌的蛋白质水平随着阿拉伯糖百分比的增加而增加,因此在高阿拉伯糖浓度下Caf1的表达增强。添加葡萄糖出乎意料地使蛋白质的产生提高而非降低,这可能是由于其充当了额外的碳源,并且其抑制作用在经过16小时的发酵运行后失去。
图62示出Caf1-FLAG表位NT蛋白表达的Western印迹。将来自上清液的异源Caf1蛋白样品在2×SDS样品缓冲液中于100℃下加热45秒或5分钟。也将2×SDS样品缓冲液中未加热的样品加样到SDS-PAGE凝胶上,(A)利用单克隆抗Caf1抗体探测pBAD33_SD_caf1 NT-FLAG+pAH34L的Caf1。(B)利用抗flag表位抗体探测pBAD33_SD_caf1NT-FLAG+pAH34L的FLAG表位。M,分子量标志物蛋白质(分子质量×103kDa);泳道1,未加热的pBAD33_SD_caf1 NT-FLAG+pAH34L样品;泳道2,在95℃下加热45秒的pBAD33_SD_caf1 NT-FLAG+pAH34L样品;泳道3,在95℃下加热5分钟的pBAD33_SD_caf1NT-FLAG+pAH34L样品;泳道4,未加热的pBAD33_SD_caf1NT-FLAG样品;泳道5,在95℃下加热45秒的pBAD33_SD_caf1NT-FLAG样品;泳道6,在95℃下加热5分钟的pBAD33_SD_caf1NT-FLAG样品;泳道7,未加热的pAH34L样品;泳道8,在95℃下加热45秒的pAH34L样品;泳道9,在95℃下加热5分钟的pAH34L样品。
图63示出Caf1-6His-NT蛋白表达的Western印迹。将来自上清液的异源Caf1蛋白样品在2×SDS样品缓冲液中于100℃下加热45秒和5分钟。也将2×SDS样品缓冲液中未加热的样品加样到SDS-PAGE凝胶上,(A)利用单克隆抗Caf1抗体探测pBAD33_SD_caf1-6His-NT+pAH34L的Caf1。(B)利用抗多组氨酸抗体探测pBAD33_SD_caf16His-NT+pAH34L的多组氨酸。M,分子量标志物蛋白质(分子质量×103kDa);泳道1,未加热的pBAD33_SD_caf1-6His-NT+pAH34L样品;泳道2,在95℃下加热45秒的pBAD33_SD_caf1-6His-NT+pAH34L样品;泳道3,在95℃下加热5分钟的pBAD33_SD_caf1-6His-NT+pAH34L样品;泳道4,未加热的pBAD33_SD_caf1-6His-NT样品;泳道5,在95℃下加热45秒的pBAD33_SD_caf1-6His-NT样品;泳道6,在95℃下加热5分钟的pBAD33_SD_caf1-6His-NT样品;泳道7,未加热的pAH34L样品;泳道8,在95℃下加热45秒的pAH34L样品;泳道9,在95℃下加热5分钟的pAH34L样品。
图64示出Caf1-6His-NT间隔区蛋白质表达的Western印迹。将来自上清液的异源Caf1蛋白样品在2×SDS样品缓冲液中于100℃下加热45秒和5分钟。也将2×SDS样品缓冲液中未加热的样品加样到SDS-PAGE凝胶上,(A)利用单克隆抗Caf1抗体探测pBAD33_SD_caf16His-NT间隔区+pAH34L的Caf1。(B)利用抗多组氨酸抗体探测pBAD33_SD_caf1-6His-NT间隔区+pAH34L的多组氨酸。M,分子量标志物蛋白质(分子质量×103kDa);泳道1,未加热的pBAD33_SD_caf1-6His-NT间隔区+pAH34L样品;泳道2,在95℃下加热45秒的pBAD33_SD_caf1-6His-NT间隔区+pAH34L样品;泳道3,在95℃下加热5分钟的pBAD33_SD_caf1-6His-NT间隔区+pAH34L样品;泳道4,未加热的pBAD33_SD_caf1 6His-NT间隔区样品;泳道5,在95℃下加热45秒的pBAD33_SD_caf1-6His-NT间隔区样品;泳道6,在95℃下加热5分钟的pBAD33_SD_caf1-6His-NT间隔区样品;泳道7,未加热的pAH34L样品;泳道8,在95℃下加热45秒的pAH34L样品;泳道9,在95℃下加热5分钟的pAH34L样品。
图65示出异源Caf1蛋白表达的Western印迹。将来自上清液的异源Caf1蛋白样品在2×SDS样品缓冲液中于100℃下加热45秒。M,分子量标志物蛋白质(分子质量×103kDa);泳道1,pBAD33_SD_caf1-PHSRN环1+pAH34L;泳道2,pBAD33_SD_caf1-Cys-NT+pAH34L;泳道3,pBAD33_SD_caf1-G35C环4+pAH34L;泳道4,pBAD33_SD_caf1-Q106C环2+pAH34L;泳道5,pBAD33_SD_caf1-PENFF-NT+pAH34L;泳道6,pBAD33_SD_caf1-PHSRN环3+pAH34L;泳道7,Caf1。
图66示出示例性的交联剂;(a)DTSSP交联剂结构;(b)NHS-PEG-NHS交联剂结构;(c)4臂NHS-PEG交联剂结构。
图67示出与4臂PEG-NHS交联的Caf1水凝胶的图像。(A)反应2分钟后形成的Caf1水凝胶(Caf1∶4臂PEG-NHS,交联比为1∶2)。(B)在添加PBS之后于聚丙烯微量离心管中Caf1水凝胶的溶胀。Caf1∶4臂PEG-NHS的交联比(w/w):管1,1∶10;管2,1∶5;管3,1∶3;管4,1∶2。
图68示出通过4-20%梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳对使用不同交联剂交联的Caf1蛋白的分析。图例:M分子量标志物蛋白质(分子量×103kDa);泳道1-4,与DTSSP交联的Caf1水凝胶;泳道5-8,与NHS-PEG-NHS交联的Caf1水凝胶;泳道9-12,与4臂PEG-NHS交联的Caf1水凝胶。本研究所使用的交联比为:泳道1-1∶10;泳道2-1∶5;泳道3-1∶3;泳道4-1∶2;泳道5-1∶10;泳道6-1∶5;泳道7-1∶3;泳道8-1∶2;泳道9-1∶10;泳道10-1∶5;泳道11-1∶3;泳道12-1∶2。利用考马斯亮蓝G-250染色剂对梯度聚丙烯酰胺凝胶进行染色。使用Precision PlusProtein标准。
图69示出与不同交联剂(w/w比为1∶10)交联的Caf1水凝胶的TEM图像。比例尺代表100nm。还示出交联的Caf1水凝胶网孔的大小分布。
图70示出Caf1水凝胶和对照(cpCaf1、4臂PEG-NHS和Caf1聚合物)的电子透射显微图像。所有试样负染色。比例尺表示100nm。
图71示出以不同交联比(w/w,交联剂:Caf1)与4臂PEG-NHS交联的Caf1聚合物的电子透射显微(transmission electron microscopy,TEM)图像。所有试样负染色。比例尺表示100nm。
图72示出与4臂PEG-NHS交联的Caf1水凝胶(w/w比1∶3)的扫描电子显微图像。
图73示出在冻干之后与4臂PEG-NHS交联的Caf1水凝胶(w/w比1∶3)的扫描电子显微图像。A:冻干过程之后Caf1水凝胶的碎片。B:Caf1水凝胶的原始图像。C:Caf1水凝胶孔的图像。D:通过Jmicrovision版本1.2.5(Roduit,2007)处理的图像。通过画线进行孔径测量,如呈现在图像上穿过水凝胶的孔的红线。计算孔的大小。该方程式获自Soliakov等,2010。
图74示出以(w/w比1∶3)与4臂PEG-NHS交联的Caf1水凝胶的环境扫描电子显微图像。A:Caf1水凝胶。B:Caf1水凝胶的原始图像。C:Caf1水凝胶。D:通过Jmicrovision版本1.2.5处理的图像。通过画线进行孔径测量,如呈现在图像上穿过水凝胶的孔的红线。
图75示出扫描电子显微图像,(A)小鼠3T3成纤维细胞。(B)大鼠原代成骨细胞。白色箭头表示细胞。细胞粘附在与4臂PEG-NHS交联的Caf1水凝胶(比1∶3)上。
发明详述
本发明人已经惊奇地鉴定由工程分子伴侣/引领蛋白单体制备的柔韧(flexible)蛋白质纳米纤维可用于产生真实的细胞微环境。柔性蛋白质纳米纤维可与无毒及无免疫原性的交联剂交联以产生根据本发明的水凝胶。在一个实施方案中,纳米纤维水凝胶由并入生物活性蛋白质序列的单体折叠单位构成。优选地,水凝胶是稳健(robust)的且是蛋白酶抗性的。
特别地,本发明人已经鉴定了分子伴侣/引领蛋白家族的聚合物,并且特别是包含单一或混合的单体亚单位类型(例如鼠疫耶尔森氏菌Caf1、沙门氏菌(Salmonella)Saf1和大肠杆菌Afa/Dr)的FG长环(FGL)家族成员表现出意料之外的与纤连蛋白的结构类似性,如图18所示。
使用Caf1单体级分1抗原聚合物作为模型,本发明人已经证明,当形成包含天然存在的分子伴侣/引领蛋白聚合物(例如级分1抗原聚合物)的水凝胶时,分子伴侣/引领蛋白家族的聚合物,特别是FG长环(FGL)家族成员,表现出细胞粘附抑制行为(没有任何证据表明细胞毒性)。分子伴侣/引领蛋白聚合物这种意料之外的特性使得其尤其可用作防污剂,其可用在防污组合物中。
但是,意料之外的是,本发明人已经发现向分子伴侣/引领蛋白单体(例如CAF1)中并入常用的生物活性序列(例如来自纤连蛋白的细胞粘附基序RGDS)足够逆转粘附抑制,这导致产生分子伴侣/引领蛋白聚合物(例如级分1抗原聚合物),其在形成水凝胶时促进细胞附着、生存和增殖(参见图20和21)。
因此,本发明聚合物的天然存在区域提供了可引入特定生物活性序列的表面,其中所得聚合物关于促进细胞附着、生存和/或增殖的行为由并入其中的特定生物活性序列决定。当本发明的聚合物被用在例如细胞培养和再生医学领域时,这些特性提供了显著的优点,因为对于促进或抑制(通过向聚合物中并入不同的生物活性序列的方式)细胞相互作用具有完全的自由。有利地,本发明聚合物因此可用于促进选择性细胞粘附和/或聚合物与靶标组分(例如,肽、蛋白质、交联单位、酶、抗体、细胞、试剂等)之间的选择性相互作用,具有低的或不具有靶标组分与聚合物的天然存在区域之间的背景相互作用。
本发明人已经惊奇地发现,包含外源生物活性序列的分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体可保持其聚合形式。本发明人已经使用突变的FG环长家族多肽单体、尤其是caf1单体(例如,包含外源(生物活性)序列如RGDS、FLAG标签、His标签等的caf1单体)证明了这一点。产生了包含一系列不同的实验外源序列的分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体。在每种情况下,这些实验单体都表现为保持其设想的聚合物形成的能力并且出乎意料地稳定。这表明,分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体的这种特性不限于特定外源序列,而是具有更普遍适用。
有利地,本发明的分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体可用于产生同源或异源(即,混合)聚合物。例如,混合聚合物可包含天然存在的单体和突变单体。或者,混合聚合物可包含两种不同的突变单体,任选地存在天然存在的单体。本发明人已经证明成功产生了包含野生型caf1单体和caf1突变形式的混合聚合物(参见,例如图62至65以及对应文本)。这些聚合物具有多种本文更详细讨论的优点。
分子伴侣-引领(CU)蛋白在细胞表面形成长的聚合毛(pili)。分子伴侣使分泌到周质中的单体稳定并且将其转移到位于外膜引领蛋白内生长聚合毛的末端,其将新生的聚合物转运到细胞表面。这种聚合机制被称为“供体链交换(donor strand exchange)”,并且首次在来自尿道致病性大肠杆菌的FimC-FimH分子伴侣-粘附素复合物中进行了描述。亚单位由β三明治免疫球蛋白结构域构成,其中C末端β-链被放置在了N末端,这时不能进行天然折叠。在体内,所述亚单位在分泌后首先通过插入来自分子伴侣的β-链部分地稳定。而通过用来自随后亚单位的N末端的“备用(spare)”反向平行β-链代替分子伴侣平行β-链来实现最终的稳定折叠,从而使其连接以形成链。
Caf 1(也被称为级分1抗原聚合物)是来自鼠疫细菌(鼠疫耶尔森氏菌)的CU蛋白质,其中其作为聚合毒力因子和疫苗组分。其由单体通过上述供体链交换(DSE)机制形成。Caf1非典型聚合物形成了被认为保护病原体不被吞噬的凝胶胶囊(gelatinous capsule)。
体内,级分1抗原聚合物的表达、组装和分泌是通过经典的分子伴侣-引领蛋白途径(5)进行的,并且通过被组织在caf操纵子内的一组4个基因介导。级分1抗原聚合物(CAF1单体)由caf1基因编码,其通过转录激活子caf1R基因进行温度调控。周质分子伴侣caf1M被用于组装由鼠疫病原体鼠疫耶尔森氏菌产生的F1荚膜,并且外膜蛋白质caf1A引领蛋白充当了组装平台/分泌机器(参见图1)(12、14、15)。
Miller及其同事(8)从包含重组低拷贝的含有caf操纵子的质粒pAH34L的大肠杆菌克隆和表达了Caf1(图3)。已经表明这种质粒pAH34L将是用于Caf1蛋白表达的良好系统。但是,由于其总大小(约11Kbp)和缺少方便的限制性位点,因此在这种质粒中难以使F1突变。
单体
在第一个方面,本发明提供了含有外源生物活性序列的分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体。
优选地,所述多肽是重组的或合成的,即通过本领域中公知的重组或合成生产技术产生。
本文使用的短语“分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体”是指在革兰氏阴性细菌的表面中常见的长聚合物蛋白纤维的多肽亚单位(优选主要的亚单位),其生物发生受分子伴侣/引领蛋白途径控制。
可以根据其高级结构将分子伴侣/引领蛋白家族聚合物分成两组。本发明的分子伴侣/引领蛋白家族多肽可以是FG环长家族成员(也称为非典型粘附家族)。FG环长(FGL)家族成员包括单一单体亚单位类型。鼠疫耶尔森氏菌Caf1、沙门氏菌Saf1和大肠杆菌Afa/Dr粘附是FGL或非典型粘附家族单体亚单位的实例,其形成薄的难以成像的聚合纤维。FG环短(FGS)家族成员(也称为典型粘附家族,以其分子伴侣的结构特性命名),可以由多至六种不同的单体亚单位构成。大肠杆菌Fim(类型1菌毛)和Pap(P菌毛)蛋白是FGS或典型粘附家族单体亚单位的实例,其呈现基于亚单位的紧密卷绕螺旋(wound helix)的杆状(rod-like)线性结构。本发明的分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体可以是FG环长(FGL)家族成员或FG环短(FGS)家族成员。
分子伴侣引领蛋白家族共有基础免疫球蛋白结构域折叠,并因此可以看成具有结构同源性。这也反映了其序列同源性。在类似结构的蛋白质之间(例如Pap和Fim家族之间),同源性的水平高,但是较宽的家族之间,这种同源性降低至认为不显著的水平,除非还考虑3D结构同源性。参考文献(18)的图2中提供了完全不同的分子伴侣引领蛋白家族内类似之处和不同之处的很好的描述。
优选地,分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体亚单位是Caf1多肽单体、Saf1多肽单体、Afa/Dr多肽单体,Fim A、H、G或F多肽单体或者PapA、G、F、E或K多肽单体。
来自鼠疫耶尔森氏菌之天然存在的Caf1多肽单体的氨基酸序列在SEQ ID NO:5中示出。所述序列长约150个氨基酸残基。所述多肽单体由具有SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的Caf1核酸分子编码。用21个氨基酸的可切割信号肽合成Caf1,其在单体转运通过内膜时被切割。
来自沙门氏菌之天然存在的Saf1多肽单体的氨基酸序列在SEQ IDNO:9中示出。所述序列长约145个氨基酸。所述多肽单体由具有SEQ IDNO:10所示核苷酸序列的Saf1核酸分子编码。
来自大肠杆菌之天然存在的Afa/Dr多肽单体的氨基酸序列在SEQID NO:11中示出。所述序列长约140个氨基酸。所述多肽单体由具有SEQID NO:12所示核苷酸序列的Afa/Dr核酸分子编码。
来自大肠杆菌之天然存在的Fim A多肽单体的氨基酸序列在SEQ IDNO:13中示出。所述序列长约150个氨基酸。所述多肽单体由具有SEQ IDNO:14所示核苷酸序列的Fim A核酸分子编码。
来自大肠杆菌之天然存在的Fim H多肽单体的氨基酸序列在SEQ IDNO:25中示出。所述序列长约150至200个氨基酸。所述多肽单体由具有SEQ ID NO:26所示核苷酸序列的Fim H核酸分子编码。
来自大肠杆菌之天然存在的Fim G多肽单体的氨基酸序列在SEQ IDNO:27中示出。所述序列长约150至200个氨基酸。所述多肽单体由具有SEQ ID NO:28所示核苷酸序列的Fim G核酸分子编码。
来自大肠杆菌之天然存在的Fim F多肽单体的氨基酸序列在SEQ IDNO:29中示出。所述序列长约150至200个氨基酸。所述多肽单体由具有SEQ ID NO:30所示核苷酸序列的Fim F核酸分子编码。
来自大肠杆菌之天然存在的Pap A多肽单体的氨基酸序列在SEQ IDNO:15中示出。所述序列长约150至200个氨基酸。所述多肽单体由具有SEQ ID NO:16所示核苷酸序列的Pap A核酸分子编码。
来自大肠杆菌之天然存在的Pap G多肽单体的氨基酸序列在SEQ IDNO:31中示出。所述序列长约300个氨基酸。所述多肽单体由具有SEQ IDNO:32所示核苷酸序列的Pap G核酸分子编码。
来自大肠杆菌之天然存在的Pap F多肽单体的氨基酸序列在SEQ IDNO:33中示出。所述序列长约150至200个氨基酸。所述多肽单体由具有SEQ ID NO:34所示核苷酸序列的Pap F核酸分子编码。
来自大肠杆菌之天然存在的Pap E多肽单体的氨基酸序列在SEQ IDNO:35中示出。所述序列长约150至200个氨基酸。所述多肽单体由具有SEQ ID NO:36所示核苷酸序列的Pap E核酸分子编码。
来自大肠杆菌之天然存在的Pap K多肽单体的氨基酸序列在SEQ IDNO:37中示出。所述序列长约150至200个氨基酸。所述多肽单体由具有SEQ ID NO:38所示核苷酸序列的Pap K核酸分子编码。
本文使用的术语“核酸分子”包括DNA分子(例如,cDNA或基因组DNA)和RNA分子(例如,mRNA)以及例如使用核苷酸类似物产生的DNA或RNA的类似物。核酸分子可以为单链的或双链的,但优选双链DNA。
本文使用的“天然存在的”是指自然界存在的多肽序列或者具有自然界存在的核苷酸序列(例如,编码天然蛋白质)的核酸分子(例如,RNA或DNA分子)。所述核酸分子包含编码蛋白质的开放阅读框,并且还可包含非编码的调控序列和内含子。术语“天然存在的”和“野生型”在本文中互换使用。
本文使用的术语“外源”是指不存在于或不天然存在于分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体序列内的异源多肽或核酸序列。应注意的是,外源多肽或核酸序列可包括与细胞的内源多肽序列或核酸序列相同或部分同源的多肽或核酸序列。本文使用的术语“内源”是指存在于和/或天然存在于分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体序列中的任何多肽或核酸序列。
在本发明的一个方面中,分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体包含外源序列。所述外源序列可以为生物活性序列或者任何其他期望的外源序列。
本文使用的“生物活性序列”是指具有特定生物学功能的肽序列。生物活性序列是本领域中公知的,并且可以来源于任何天然存在的多肽,包括ECM组分、细胞粘附分子、细胞表面受体、生长因子、细胞因子、趋化因子等。例如,生物活性序列可以介导细胞粘附(或细胞附着)、细胞生长和/或细胞分化(或细胞表型的诱导)。
在一个优选实施方案中,生物活性序列是细胞粘附识别基序、生长因子序列基序或蛋白酶位点。
优选地,细胞粘附识别基序是胞外基质细胞粘附识别基序,例如,来源于胞外基质组分(如胶原蛋白、弹性蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白、骨桥蛋白、玻连蛋白或生腱蛋白)的基序。优选地,细胞粘附识别基序来源于纤连蛋白,并且包含氨基酸序列RGD(Arg-Gly-Asp),更优选地包含RGDS(Arg-Gly-Asp-Ser)。或者,细胞粘附识别基序来源于纤连蛋白,并且包含氨基酸序列PHSRN(Pro-His-Ser-Arg-Asn)。
或者,细胞粘附识别基序来源于胶原蛋白I,并且包含氨基酸序列GTPGPQGIAGQRGVV。或者,细胞粘附识别基序来源于胶原蛋白IV,并且包含氨基酸序列MNYYSNS。或者,细胞粘附识别基序来源于层粘连蛋白,并且包含氨基酸序列YIGSR。或者,细胞粘附识别基序来源于层粘连蛋白,并且包含氨基酸序列IKVAV。或者,细胞粘附识别基序来源于纤连蛋白,并且包含氨基酸序列FHRRIKA。或者,细胞粘附识别基序来源于纤连蛋白,并且包含氨基酸序列LDVP。或者,细胞粘附识别基序来源于纤连蛋白,并且包含氨基酸序列IDAP。
或者,生物活性序列是生长因子序列基序,其来源于肾上腺髓质素(AM)、血管生成素(Angiopoietion,Ang)、自分泌游动性因子(Autocrinemotility factor)、骨形态发生蛋白(BMP)、脑衍生神经营养因子(BDNF)、表皮生长因子(EGF)、促红细胞生成素(EPO)、成纤维细胞生长因子(FGF)、胶质细胞系衍生神经营养因子(GDNF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、生长分化因子-9(GDF9)、肝细胞生长因子(HGF)、肝细胞瘤衍生生长因子(HDGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、迁移刺激因子、肌肉生长抑制素(myostatin,GDF-8)、神经生长因子(NGF)和其他神经营养蛋白、血小板衍生生长因子(PDGF)、促血小板生成素(TPO)、转化生长因子α(TGF-α)、转化生长因子β(TGF-β)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、血管内皮生长因子(VEGF)、Wnt信号转导通路、胎盘生长因子(PIGF)、胎牛生长激素(FBS)、IL-3和IL-6的IL-1辅因子(活化T细胞)、IL-2-T细胞生长因子(刺激IL-1合成、活化B细胞和NK细胞)、IL-3(刺激产生所有的非淋巴样细胞);IL-4生长因子(用于活化B细胞、静息T细胞和肥大细胞)、IL-5(诱导活化的B细胞和嗜酸性粒细胞的分化)、IL-6(刺激Ig合成,浆细胞的生长因子)、IL-7(前B细胞的生长因子)、神经细胞元生长因子(NGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)或骨形态发生蛋白2(BMP),例如包含KIPKASSVPTELSAISTLYL的生物活性序列。
或者,生物活性序列是来源于已知的基质金属蛋白酶切割位点的蛋白酶位点。
在一个优选实施方案中,包含生物活性序列的分子伴侣/引领蛋白家族肽单体与SEQ ID NO:5、9、11、13、15、25、27、29、31、33、35和37中任一的多肽具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的同一性(例如,整个长度上相同)。
本发明的包含生物活性序列的分子伴侣/引领蛋白家族肽单体表现出所述生物活性序列的生物活性,同时保持了分子伴侣/引领蛋白家族单体活性(例如,形成聚合蛋白质纤维的能力)。
如下进行序列之间序列同源性或同一性(这两个术语在本文中可互换使用)的计算。
为了确定两个氨基酸序列或两个核酸序列的同一性百分比,将序列比对以用于最佳比较目的(例如,可以向第一和第二氨基酸序列或核酸序列中的一个或两个引入空位(gap)以最佳比对,并且为了比较目的可忽略非同源序列)。在一个优选实施方案中,用于比较目的而比对的参考序列长度为参考序列长度的至少30%、优选至少40%、更优选至少50%、甚至更优选至少60%、并且甚至更优选至少70%、75%、80%、82%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。然后将对应氨基酸位置或核苷酸位置的氨基酸残基或核苷酸进行比较。当第一序列中的位置被第二序列中对应位置的相同氨基酸残基或核苷酸占据时,则这些分子在该位置相同(本文使用的氨基酸或核酸“同一性”等同于氨基酸或核酸“同源性”)。两个序列之间的同一性百分比是序列共有的相同位置数目的函数,并且考虑了为使两个序列最佳比对而需要引入的空位的数目以及每个空位的长度。
可使用数学算法来完成两个序列之间的序列比较和两个序列之间同一性百分比的确定。在一个优选实施方案中,使用Needleman等((1970)J.Mol.Biol.48:444-453)算法来测定两个氨基酸序列之间的同一性百分比,所述算法已经被并入了GCG软件包中的GAP程序中(可在http://www.gcg.com获得),使用BLOSUM 62矩阵或PAM250矩阵,并且空位权重为16、14、12、10、8、6或4以及长度权重为1、2、3、4、5或6。在另一个优选实施方案中,使用GCG软件包中的GAP程序(可在http://www.gcg.com获得)来测定两个核苷酸序列之间的同一性百分比,使用NWSgapdna.CMP矩阵,并且空位权重为40、50、60、70或80,以及长度权重为1、2、3、4、5或6。一组特别优选的参数(如果实施者不确定使用哪些参数来确定分子是否在本发明的序列同一性或同源性限制内,则可以使用的参数)是BLOSUM 62评分矩阵,其空位罚分为12,空位延长罚分为4,并且移码空位罚分为5。
可使用Meyers等((1989)CABIOS 4:11-17)的算法来测定两个氨基酸序列或核苷酸序列之间的同一性百分比,其已经被并入了ALIGN程序(2.0版)中,使用PAM120权重残基表,空位长度罚分为12并且空位罚分为4。
优选地,生物活性序列包含在分子伴侣/引领蛋白家族多肽内这样的位点处,所述位点包含在所述肽折叠后的环结构内。适于插入氨基酸的环区域与天然存在的Caf1多肽的氨基酸残基1、15、27-40、51-58、64-69、77-82、92-117、127-135相邻。Caf1合适的插入位点的实例在图26(对插入位点加下划线)中示出。更优选地,分子伴侣/引领蛋白家族多肽是CAF1多肽,并且生物活性序列包含在折叠的CAF1多肽的环5(QDGNN)内。或者,生物活性序列可以添加在多肽的N末端或C末端。或者,生物活性序列可合成地添加,例如,将合成肽分子连接到Caf1单体中改造的半胱氨酸残基上。
优选地,分子伴侣/引领蛋白多肽单体还包含亲和标签,所述亲和标签被插入到任意一个前述环位点中,但是优选多肽的N末端(或C末端)。
优选地,分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体包含两种或更多种如上文所述的生物活性序列。
聚合物
在一个方面,本发明涉及包含至少一种根据本发明的分子伴侣家族多肽单体的分子伴侣/引领蛋白家族聚合物。
本文使用的“分子伴侣/引领蛋白家族聚合物”是指通常发现于革兰氏阴性细菌表面上的包含单体多肽亚单位的长聚合蛋白质纤维,其生物发生受分子伴侣/引领蛋白途径的控制。
聚合物可以是混合聚合物(即,包含两种或更多种不同的单体单位的聚合物,例如,天然存在的Caf1单体和包含外源生物活性序列的caf1单体)
优选地,根据本发明的分子伴侣/引领蛋白家族聚合物,其包含至少一种另外的分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体,其中所述另外的分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体与包含外源生物活性序列的所述至少一种分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体至少有一个氨基酸不同。更优选地,所述另外的分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体是不具有所述外源生物活性序列的上述分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体。
混合聚合物具有许多优点。例如,混合聚合物可仅包含低密度的活性基序(例如,包含外源生物活性序列的单体),散布有非活性单体(例如,天然存在的单体或缺乏外源生物活性序列的单体)。聚合物中低密度的活性基序可足以促进期望的生物学活性(例如,促进细胞粘附到聚合物上)。如果包含活性基序(例如,外源生物活性序列)的单体在分泌途径中缓慢组装,则使用混合单体亚单位来产生聚合物可提高聚合物的表达水平。
在某些应用中,可能优选的是,本发明的单体和/或聚合物基本上无免疫原性。所述聚合物的很多用途(例如在如伤口愈合或眼植入物应用中用作体内细胞生长的骨架),将可能受益于使用不引起免疫应答的聚合物。
本发明的聚合物可包含基本上无免疫原性的分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体。替选地或另外地,本发明的聚合物可包含基本上无免疫原性的外源生物活性序列。
特别地,本发明的聚合物可包含来源于无免疫原性来源的外源生物活性序列。应理解,在本文的上下文中,“无免疫原性”来源应被认为是在随后可能被施用包含外源序列之聚合物的对象中不引起免疫应答的来源(例如,作为外源序列来源的多肽)。例如,在待向人对象施用聚合物的情况下,预期人多肽可提供外源多肽的合适无免疫原性来源,所述外源多肽继而也基本上无免疫原性。因此,本发明聚合物的合适实例可包含来源于哺乳动物来源(例如,人来源)的外源生物活性序列。
可以用来研究本发明聚合物的免疫原性(或其他方面)或者这些序列的外源生物活性序列或来源的多种测定是本领域技术人员公知的,并且对于技术人员来说,应用这些测定是简单的事情。
本发明合适的聚合物可包含不具有或者基本上不具有天然存在的粘附基序(例如,细胞粘附基序)的分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体。特别地,这些单体可不具有或基本上不具有允许人细胞粘附的位点。
或者,本发明的聚合物可包含其中外源生物活性序列提供唯一的细胞粘附(特别是人细胞粘附)基序/位点的分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体。如在本公开内容其他地方讨论的,某些分子伴侣/引领蛋白家族多肽(例如Caf1)抑制人细胞粘附的发现是新的并且是意料不到的。同样出人意料的是包含细胞粘附基序的外源生物活性序列可并入到这样的其他非粘附单体中,而不会不利地影响这些单体形成聚合物的能力。
优选地,分子伴侣/引领蛋白家族聚合物是级分1抗原聚合物,其包含天然存在的CAF1多肽单体和/或根据本发明之包含外源(生物活性)序列的CAF1多肽单体,或者由天然存在的CAF1多肽单体和/或根据本发明之包含外源(生物活性)序列的CAF1多肽单体组成。
本文互换使用的“级分1抗原聚合物”或“F1聚合物”是指CAF1单体亚单位的聚合物。所述聚合物通常由鼠疫耶尔森氏菌表达。所述聚合物长达1.5微米,并包含超过250个CAF1单体。F1聚合物的表达、组装和分泌通过经典的分子伴侣引领蛋白途径进行,并由组织在caf1操纵子中的一组4个基因所介导。F1荚膜(capsule)结构亚单位(CAF1单体)由caf1基因编码,其通过转录激活子caf1R基因进行温度调控。周质分子伴侣caf1M用于组装由鼠疫耶尔森氏菌所产生的F1荚膜,并且外膜蛋白质(caf1A引领蛋白)充当了基因产物的组装平台/分泌机器(参见图2)。
优选地,本发明的级分1抗原聚合物包含至少一种根据本发明的含有外源生物活性序列的CAF1多肽单体和至少一种天然存在的CAF1多肽单体(即,聚合物是混合聚合物)。
或者,分子伴侣/引领蛋白家族聚合物是级分1抗原聚合物,所述聚合物包含天然存在的CAF1多肽单体和/或含有根据本发明之外源生物活性序列的CAF1多肽单体,或者由天然存在的CAF1多肽单体和/或含有根据本发明之外源生物活性序列的CAF1多肽单体组成。更优选地,级分1抗原聚合物包含含有细胞粘附识别基序(例如RGD或PHSRN)的CAF1多肽单体或者由含有细胞粘附识别基序(例如RGD或PHSRN)的CAF1多肽单体组成。
或者,分子伴侣/引领蛋白家族聚合物是SAF1聚合物,所述聚合物包含天然存在的SAF1多肽单体和/或含有根据本发明之外源生物活性序列的SAF1多肽单体或者由天然存在的SAF1多肽单体和/或含有根据本发明之外源生物活性序列的SAF1多肽单体组成。
优选地,本发明的SAF1聚合物包含至少一种含有根据本发明之外源生物活性序列的SAF1多肽单体和至少一种天然存在的SAF1多肽单体。
或者,分子伴侣/引领蛋白家族聚合物是SAF1聚合物,所述聚合物包含天然存在的SAF1多肽单体和/或含有根据本发明之外源生物活性序列的SAF1多肽单体或者由天然存在的SAF1多肽单体和/或含有根据本发明之外源生物活性序列的SAF1多肽单体组成。更优选地,所述SAF1包含含有细胞粘附识别基序(例如RGD或PHSRN)的SAF1多肽单体或由含有细胞粘附识别基序(例如RGD或PHSRN)的SAF1多肽单体组成。
或者,分子伴侣/引领蛋白家族聚合物是Afa或Dr粘附聚合物,所述聚合物包含天然存在的Afa/Dr多肽单体和/或含有根据本发明之外源生物活性序列的Afa/Dr多肽单体或者由天然存在的Afa/Dr多肽单体和/或含有根据本发明之外源生物活性序列的Afa/Dr多肽单体组成。
优选地,本发明的Afa/Dr聚合物包含至少一种含有根据本发明之外源生物活性序列的Afa/Dr多肽单体和至少一种天然存在的Afa/Dr多肽单体。
或者,分子伴侣/引领蛋白家族聚合物是Afa/Dr聚合物,所述Afa/Dr聚合物包含天然存在的Afa/Dr多肽单体和/或含有根据本发明之外源生物活性序列的Afa/Dr多肽单体,或者由天然存在的Afa/Dr多肽单体和/或含有根据本发明之外源生物活性序列的Afa/Dr多肽单体组成。更优选地,所述Afa/Dr包含含有细胞粘附识别基序(例如RGD或PHSRN)的Afa/Dr多肽单体或者由含有细胞粘附识别基序(例如RGD或PHSRN)的Afa/Dr多肽单体组成。
优选地,分子伴侣/引领蛋白家族聚合物包含含有细胞粘附识别基序(例如RGD或PHSRN)的分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体或者由含有细胞粘附识别基序(例如RGD或PHSRN)的分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体组成。或者,所述聚合物包含含有生长因子序列基序或蛋白酶位点的多肽单体。
更优选地,分子伴侣/引领蛋白家族聚合物包含含有根据本发明之外源生物活性序列的第一分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体以及含有根据本发明之外源生物活性序列的第二分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体,其中所述第一单体和第二单体含有不同的外源生物活性序列。所述生物活性序列优选地选自细胞粘附识别基序、生长因子序列基序或蛋白酶位点。更优选地,所述分子伴侣/引领蛋白家族聚合物还包含天然存在的分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体。
优选地,当分子伴侣/引领蛋白家族聚合物具有影响细胞生长的特性(例如Afa型聚合物)时,则在并入外源生物活性序列之前修饰野生型聚合物以除去该活性可能是有用的。
水凝胶
在一个方面,本发明提供了包含根据本发明的分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体或根据本发明的分子伴侣/引领蛋白家族聚合物的水凝胶,或者由根据本发明的分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体或根据本发明的分子伴侣/引领蛋白家族聚合物组成的水凝胶。
本文使用的术语“水凝胶”是指由通过共价交联保持在一起的大分子网络组成的水溶胀性聚合基质。所述基质可以吸收大量的水以形成弹性凝胶。可通过水凝胶所处环境(例如通过pH、温度以及局部离子浓度和类型)来影响水凝胶的溶胀。优选地,所述水凝胶是不溶的。
可通过多个参数来表征水凝胶的溶胀状态,包括变化条件下的溶胀比、某些溶质的渗透系数以及水凝胶在预期使用条件下的机械行为。
优选地,将水凝胶的单体和/或聚合物交联从而提供基质的结构和物理完整性。所述交联可以由化学、物理或辐射交联引起。
在物理交联的情况下,连接可由氢键、范德华相互作用、离子键或者其组合产生。可通过将两种在原位组合之前一直物理分开的前体混合来起始物理交联,或者作为生理环境中的普遍条件(包括温度、pH、离子强度、其组合)的结果。
化学(共价)交联可通过任意的许多机制中完成,包括但不限于自由基聚合、缩合聚合、阴离子或阳离子聚合、逐步增长聚合、亲电子-亲核反应或其组合。
辐射交联可通过任意的许多机制实现,包括但不限于使水凝胶制品暴露于可见光辐射、红外辐射、紫外辐射、电子束辐射、伽马辐射或X射线辐射中的至少一种。
通常,通过化学或物理过程使聚合物组分交联从而使它们形成“网孔状”不溶性聚合物网络。
优选地,水凝胶包含交联剂。这些交联剂可包括例如单醛、二醛、次氯酸钠、二异氰酸酯/盐、二羧酸卤化物和氯代环氧化物。
优选地,交联剂包括聚(乙二醇)(PEG)。PEG是由重复的乙二醇单位构成的化学化合物,并已经被开发作为细胞骨架以及药物递送装置并建立治疗性蛋白质。然而,PEG通过自身无反应性、无毒、无免疫原性、可溶和高度柔韧的产生不溶性网络,这需要利用交联基团末端官能化。已经开发了许多化学方法来对PEG进行官能化,包括添加丙烯酸盐/酯、硫醇、胺、马来酰亚胺或乙烯砜反应基团。作为交联的网络,这些材料在生理条件下不可降解。聚乙二醇间隔区臂具有限定的结构和分子量,其确保了可重复的蛋白质修饰效果。另外,即使在高分子量下,其提供了高稳定性、降低的聚集趋势和免疫原性。
更优选地,交联剂是图19所示的4臂PEG琥珀酰亚胺基羧基甲基酯(创造性的PEG工作产物PSB-4654臂PEG-NHS(SG),MW 20k Da,间隔区臂长度为约参见图66(c))。本发明的一种优选交联方法也在图19中说明。
其他可能的交联剂包括但不限于:
(i)线性同源双功能短间隔区臂DTSSP(硫代-DSP)(3,3′-二硫代双[硫代琥珀酰亚胺基丙酸酯]),分子量为608.51,并且间隔区臂为约DTSSP是水溶性和硫醇可切割的(参见图66(a))。
(ii)线性同源双功能长间隔区臂NHS-PEG-NHS(O,O′-双[2-(N-琥珀酰亚胺基-琥珀酰氨基)乙基]聚乙二醇),分子量为10000,并且间隔区臂为约(参见图66(b))。
优选地,交联剂是生物可降解交联剂。有利地,这些交联剂使水凝胶生物可降解或可吸收。本文使用的术语“生物可降解”是指可以降解,优选可以在患者体内吸收和降解的材料或聚合物。或者,交联剂是不可降解的交联剂。
技术人员将容易鉴定根据本发明合适的交联剂与单体/聚合物的比。例如,但不限于可以使用1∶120、1∶5、1∶3或1∶2(单体:交联剂(w/w))的比。
用途
本发明的水凝胶和/或聚合物可用在细胞培养中。本发明人惊奇地发现水凝胶中存在本发明的分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体(或者本发明的聚合物)提高了细胞生存力并降低了细胞毒性。
在一个方面,本发明提供了本发明的水凝胶作为细胞支持骨架的用途。
本文使用的术语“骨架”是指允许细胞附着以及随后增殖和分化的任何材料。本文使用的“附着”、“附接”或“粘附”是指细胞直接或间接粘附到基底上以及细胞与其他细胞粘附。
本发明的骨架可以是纤维(即,1维)、细胞培养板(即,2维)或基质(即,3维)。2维细胞培养系统可提供用于研究细胞和组织形态发生的基础,还可用于检验外遗传因子是如何影响生理现象的以及用于研究细胞功能和与生物体外部的细胞微环境相互作用之间的动态关系。3维骨架可用于再产生天然的组织3维结构。
本发明的骨架特别用于基于细胞的测定和组织培养系统。
骨架可以是未接种的并且在其他情况下不含有细胞。或者,骨架可以接种有细胞。
本发明的聚合物和/或水凝胶具有多种生物医学应用。例如,本发明的聚合物和/或水凝胶可用作用于治疗伤口的材料,作为用于释放药物的载剂或者作为医学装置表面上的涂层。
因此,本发明的聚合物和/或水凝胶特别用于多种治疗环境中。特别地,本发明的水凝胶可用于向有此需要的组织递送细胞。在一个实施方案中,骨架用于向哺乳动物对象的眼睛递送细胞。或者,本发明的骨架用于向有此需要的哺乳动物对象的伤口基部(wound bed)递送细胞。
因此,本发明提供了本发明的水凝胶,其用作药物。
本发明还提供了本发明的聚合物作为药物的用途。本发明的聚合物可用在治疗伤口的方法中,例如,以与下文对于本发明的水凝胶的描述相同的方式用于伤口愈合。因此,本发明提供了本发明的聚合物,其用于治疗伤口(例如,皮肤伤口)。
还提供了治疗皮肤伤口的方法,其包括向有此需要的哺乳动物对象的皮肤、皮肤伤口或皮肤伤口基部中植入本发明的水凝胶。所述方法特别用于上皮再生(re-epithelialisation),并且特别用于皮肤上皮再生。术语“上皮再生”是指身体(包括皮肤)内部或身体外部之受损上皮的修复、更换、功能恢复和最终再生。
还提供了本发明的水凝胶,其用于治疗皮肤伤口。
本文使用的术语“伤口”是指损伤的组织,优选损伤的皮肤,其中皮肤或组织的完整性因为例如外力、差的健康状况、衰老、暴露于阳光、热、或化学反应或者由内部生理过程导致的损伤而被破坏。上皮(例如表皮)被破坏的伤口被认为是开放性伤口。伤口愈合是组织的覆盖层细胞再生的过程,优选通过上皮再生或重建。
引入能够支持正常皮肤细胞附着、迁移和增殖的水凝胶将通过向在伤口边缘未受影响的皮肤细胞提供立即可替代的基底以迁移通过来帮助加速伤口愈合。
本发明提供了治疗眼损伤的方法,其包括向有此需要的哺乳动物对象的眼中植入本发明的水凝胶。
还提供了本发明的水凝胶,其用于治疗眼损伤。
本文使用的术语“眼损伤”是指导致支持干细胞功能的基质微环境不足的病症,例如无虹膜、角膜炎、神经营养性角膜病变、圆锥角膜、Meesman营养不良、上皮基底膜营养不良和慢性limbitis;或者破坏角膜缘(limbal)干细胞的病症(例如局部性角膜缘干细胞缺陷)、总体性干细胞缺陷、眼疱疹、化学或热损伤、斯-约综合征、眼瘢痕类天疱疹、接触镜片磨损(contact lens wear)或微生物感染。
还提供了包含本发明之水凝胶的眼植入物。
在一个实施方案中,所述水凝胶在植入前接种有细胞(例如角膜细胞或干细胞)。或者,所述水凝胶可在植入后接种细胞。优选地,所述细胞是自体的(即,所述细胞来源于待治疗的个体)或者所述细胞可以是非自体的。
本发明还提供了药物组合物,其包含根据本发明的水凝胶以及可药用赋形剂、稀释剂或载体。在一个实施方案中,所述组合物还包含以下的一种或更多种:生长因子、脂质、基因等,或者用于改变伤口的酸度/碱度(pH)的化合物,或者用于改变移植细胞以及伤口/损伤边缘处那些细胞的生长和性能的化合物。
本文使用的术语“可药用载体”意指一种或更多种适于向人施用的相容性固体或液体填料、稀释剂或胶囊化物质(encapsulating substance)。当施用时,本发明的药物组合物以可药用剂型施用。这些剂型可以常规地包含可药用浓度的盐、缓冲剂、防腐剂、相容性载体、细胞因子和任选地其他治疗剂,优选用于伤口愈合的治疗剂(例如生长因子、肽、蛋白水解抑制剂、胞外基质组分、类固醇和细胞因子)。术语“载体”表示有机或无机的天然或合成成分,活性成分可以与其组合从而有利于应用。术语“可药用”意指不干扰活性成分之生物活性效果的无毒材料。术语“生理上可接受的”是指与生物系统(例如细胞、细胞培养物、组织或器官)相容的无毒材料。如本文使用的,可药用载体包括任何常规载体,例如E.W.Martin的Remington’s Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co,Easton,PA,第15版(1975)中描述的那些。
在另一个方面,提供了根据本发明的药物组合物,其用作药物例如用于治疗眼损伤、角膜替换或伤口愈合。
本发明的组合物或水凝胶以有效量施用或用于施用。“有效量”是单独或与其他剂量一起来产生预期响应的组合物或水凝胶的量。前述方法中使用的组合物或水凝胶优选为无菌的,并且包含在适于向患者施用的单位重量或体积下产生期望响应的有效量的活性成分。响应可以例如通过测量组合物或微生物-细胞复合物对伤口愈合或角膜修复之速率或程度的影响来测量。
在另一个方面,本发明的单体和/或聚合物可用在细胞培养仪器之中或之上(例如,以促进细胞粘附于细胞培养仪器的表面)。因此,在一个方面,本发明提供了包含根据本发明之单体和/或聚合物的细胞培养仪器(例如,细胞培养容器(例如培养皿、多孔板或细胞培养烧瓶);或者用于细胞培养的盖玻片)。优选地,所述单体和/或聚合物包含在根据本发明的水凝胶内。
载体(vector)
本发明包括用于产生重组分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体的表达载体。优选地,所述表达载体包含用于在细菌细胞中表达重组分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体所必需的那些遗传元件。在细菌细胞中转录和翻译所需的元件包括启动子、分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体的编码区和转录终止子。
本文使用的术语“表达载体”是指能够转运与之已经相连的另一种核酸的核酸分子。载体可能能够自主复制,或者其可能整合在宿主DNA中。载体可以包含用于插入重组DNA限制性酶位点,并且可以包含一种或更多种选择标志物。载体可以是以质粒、噬菌体或黏粒形式的核酸。
本文使用的“有效连接”是指下述控制序列中的一种或组合与编码序列在一起成为彼此之间的功能关系,例如,为了指导编码序列的表达的连接关系。
本文使用的“控制元件”是指能够控制基因表达的DNA或RNA元件。表达控制序列的实例包括启动子、增强子、沉默子、夏因-达尔加诺序列(Shine Dalgarno sequence)、TATA-盒、内部核糖体进入位点(IRES)、转录因子附着位点、转录终止子、聚腺苷酸化位点、RNA转运信号或者对于UV光介导的基因响应重要的序列。优选地,表达载体包含与待表达核酸序列有效连接的一个或更多个控制元件。优选地,控制元件是转录启动子元件。
本文的“启动子”和“转录启动子元件”可互换使用,是指DNA或RNA中与RNA聚合酶结合从而开始转录的核苷酸序列。启动子可以是诱导型或组成型表达的。或者,启动子处于阻抑物或刺激蛋白的控制之下。优选地,启动子是T7、T3、lac、lac UV5、tac、trc、[λ]PL、Sp6或UV诱导型启动子。更优选地,启动子是已知在细菌(例如大肠杆菌)中有功能的T7或T3启动子。在野生型Caf操纵子中,启动子是温度敏感的,其允许便宜地诱导蛋白质的产生。将其与具有另外的启动子的额外质粒偶联将允许控制单体的不同组合。
本文使用的“转录终止子”是指终止负责将DNA转录成RNA之RNA聚合酶的功能的DNA元件。优选的转录终止子的特征为前面是富含GC的双对称区的一系列T残基。更优选地,转录终止子是来自T7噬菌体的终止子序列。
表达载体的设计取决于这样的因素,如待转化宿主细胞的选择、期望蛋白质的表达水平等。可以将本发明的表达载体引入到宿主细胞中从而产生蛋白质或多肽。
本发明的表达载体可以是细菌表达载体(例如重组噬菌体DNA、质粒DNA或黏粒DNA),酵母表达载体(例如重组酵母表达载体)、用于在昆虫细胞中表达的载体(例如重组病毒表达载体如杆状病毒),或者用于在植物细胞中表达的载体(例如重组病毒表达载体如花椰菜花叶病毒CaMV、烟草花叶病毒TMV,或者重组质粒表达载体(如Ti质粒))。
最优选地,载体适于细菌表达,例如,适于在大肠杆菌、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、沙门氏菌(Salmonella)、葡萄球菌(Staphylocoocus)、链球菌(Streptococcus)等中表达。
优选地,载体能够在细菌细胞中传播并且稳定传递到后代中。
优选地,载体是细菌表达载体。优选地,所述表达载体是高拷贝数表达载体;或者,所述表达载体是低拷贝数表达载体,例如Mini-F质粒。
优选地,载体是包含T7启动子系统的细菌表达载体。或者,载体是包含tac启动子系统的细菌表达载体。
更优选地,载体是pGem表达载体。
在一个优选实施方案中,本发明的表达载体包含编码重组分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体的核酸分子,其中所述分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体是CAF1多肽单体,优选前述含有外源生物活性序列之本发明的重组多肽单体。最优选地,载体包含编码重组CAF1多肽单体的核酸分子,其中所述外源生物活性序列是前述细胞粘附识别基序。
或者,本发明的载体包含编码重组分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体的核酸分子,其中所述分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体是SAF1多肽单体,优选前述含有外源生物活性序列之本发明的重组多肽单体。最优选地,载体包含编码重组SAF1多肽单体的核酸分子,其中所述外源生物活性序列是前述细胞粘附识别基序。
或者,本发明的载体包含编码重组分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体的核酸分子,其中所述分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体是Afa/Dr多肽单体,优选前述含有外源生物活性序列之本发明的重组多肽单体。最优选地,载体包含编码重组Afa/Dr多肽单体的核酸分子,其中所述外源生物活性序列是前述细胞粘附识别基序。
在另一个实施方案中,表达载体还包含编码重组分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体特异性之周质分子伴侣的核酸分子。
本文使用的“重组分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体特异性的周质分子伴侣”是指对于重组分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体的分泌特异的周质分子伴侣。优选地,在细胞内,周质分子伴侣与重组分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体相互作用,形成稳定的分子伴侣-单体复合物,并且有助于单体从细胞质膜释放。更优选地,周质分子伴侣通过阻断活性位点来与单体相互作用,从而防止过早的单体-单体相互作用。
优选地,载体包含编码重组CAF1多肽单体的核酸分子和编码CAF1特异性之周质分子伴侣(例如CAF1M)的核酸分子。
优选地,编码CAF1特异性之周质分子伴侣的所述核酸分子编码多肽,所述多肽包含与SEQ ID NO:6的多肽具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性(例如,在整个长度上相同)的氨基酸序列或由这样的氨基酸序列组成。
或者,编码CAF1特异性之周质分子伴侣的所述核酸分子包含与SEQID NO:2的核酸分子具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性(例如,在整个长度上相同)的核苷酸序列或由这样的核苷酸序列组成。
或者,载体包含编码重组SAF1多肽单体的核酸分子和编码SAF1特异性之周质分子伴侣(例如,SAFB)的核酸分子。
优选地,编码SAF1特异性之周质分子伴侣的所述核酸分子编码多肽,所述多肽包含与SEQ ID NO:17的多肽具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性(例如,在整个长度上相同)的氨基酸序列或由这样的氨基酸序列组成。
或者,编码SAF1特异性之周质分子伴侣的所述核酸分子包含与SEQID NO:18的核酸分子具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性(例如,在整个长度上相同)的核苷酸序列或由这样的核苷酸序列组成。
或者,载体包含编码重组Afa/Dr多肽单体的核酸分子和编码Afa/Dr特异性之周质分子伴侣(例如,DraB)的核酸分子。
优选地,编码Afa/Dr特异性之周质分子伴侣的所述核酸分子编码多肽,所述多肽包含与SEQ ID NO:19的多肽具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性(例如,在整个长度上相同)的氨基酸序列或由这样的氨基酸序列组成。
或者,编码Afa/Dr特异性之周质分子伴侣的所述核酸分子包含与SEQ ID NO:20的核酸分子具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性(例如,在整个长度上相同)的核苷酸序列或由这样的核苷酸序列组成。
在另一个实施方案中,表达载体还包含编码重组分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体特异性之外膜引领蛋白的核酸分子。
本文使用的“重组分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体特异性的外膜引领蛋白”是指对于重组分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体的分泌特异的外膜引领蛋白。优选地,引领蛋白能够与分子伴侣/单体复合物结合并且起始聚合物的组装。在与分子伴侣/单体复合物结合之后,引领蛋白有助于单体从分子伴侣解离,从而暴露出活性位点用于单体-单体相互作用。以这种方式,单体通过引领蛋白作为转运到细胞表面的线性纤维生长。
优选地,载体包含编码重组CAF1多肽单体的核酸分子和编码CAF1特异性之外膜引领蛋白(例如,CAF1A)的核酸分子。
优选地,编码CAF1特异性之外膜引领蛋白的所述核酸分子编码多肽,多数多肽包含与SEQ ID NO:7的多肽具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性(例如,在整个长度上相同)的氨基酸序列或由这样的氨基酸序列组成。
或者,编码CAF1特异性之外膜引领蛋白的所述核酸分子包含与SEQID NO:3的核酸分子具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性(例如,在整个长度上相同)的核苷酸序列或由这样的核苷酸序列组成。
优选地,载体包含编码重组SAF1多肽单体的核酸分子和编码SAF1特异性之外膜引领蛋白(例如,SAFC)的核酸分子。
优选地,编码SAF1特异性之外膜引领蛋白的所述核酸分子编码多肽,所述多肽包含与SEQ ID NO:21的多肽具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性(例如,在整个长度上相同)的氨基酸序列或由这样的氨基酸序列组成。
或者,编码SAF1特异性之外膜引领蛋白的所述核酸分子包含与SEQID NO:22的核酸分子具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性(例如,在整个长度上相同)的核苷酸序列或由这样的核苷酸序列组成。
优选地,载体包含编码重组Afa/Dr多肽单体的核酸分子和编码Afa/Dr特异性之外膜引领蛋白(例如,DraC)的核酸分子。
优选地,编码Afa/Dr特异性之外膜引领蛋白的所述核酸分子编码多肽,所述多肽包含与SEQ ID NO:23的多肽具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性(例如,在整个长度上相同)的氨基酸序列或由这样的氨基酸序列组成。或者,编码Afa/Dr特异性之外膜引领蛋白的所述核酸分子包含与SEQ ID NO:24的核酸分子具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性(例如,在整个长度上相同)的核苷酸序列或由这样的核苷酸序列组成。
在另一个实施方案中,表达载体还包含编码重组分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体特异性之表达调控蛋白的核酸分子。
本文使用的“重组分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体特异性的表达调控蛋白”是指对于重组分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体的转录调控特异的表达调控蛋白。
优选地,载体包含编码CAF1多肽单体的核酸分子和编码CAF1特异性之表达调控蛋白(例如,CAF1R)的核酸分子。
优选地,编码CAF1特异性之表达调控蛋白的所述核酸分子编码多肽,所述多肽包含与SEQ ID NO:8的多肽具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性(例如,在整个长度上相同)的氨基酸序列或由这样的氨基酸序列组成。
或者,编码CAF1特异性之表达调控蛋白的所述核酸分子包含与SEQ ID NO:4的核酸分子具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性(例如,在整个长度上相同)的核苷酸序列或由这样的核苷酸序列组成。
优选地,载体包含编码重组SAF1多肽单体的核酸分子和编码SAF1特异性之表达调控蛋白的核酸分子。
更优选地,载体包含两种或更多种选自以下的核酸分子:i)编码重组分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体特异性之周质分子伴侣的核酸分子;ii)编码重组分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体特异性之外膜引领蛋白的核酸分子;和iii)编码重组分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体特异性之表达调控蛋白的核酸分子。
更优选地,编码重组CAF1多肽单体的所述核酸分子编码多肽,所述多肽包含与SEQ ID NO:5的多肽具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性(例如,在整个长度上相同)的氨基酸序列或由这样的氨基酸序列组成。或者,编码重组CAF1多肽单体的所述核酸分子包含与SEQ ID NO:1的核酸分子具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性(例如,在整个长度上相同)的核苷酸序列或由这样的核苷酸序列组成。
在另一个实施方案中,表达载体包含前述核酸分子,所述核酸分子包括了核苷酸序列中的特定改变,从而优化用于在宿主细胞中翻译的密码子和mRNA二级结构。优选地,使用适于在宿主细胞中表达的核酸密码子,例如可使用Calcgene,Hale,RS和Thomas G.Protein Exper.Purif.12,185-188(1998),UpGene,Gao,W等.Biotechnol.Prog.20,443-448(2004),或者Codon Optimizer,Fuglsang,A.Protein Exper.Purif.31,247-249(2003)来实现密码子优化。通过许多不同的实验方案,可以实现根据优选的密码子优化对核酸的修改,包括修饰一小部分密码子(Vervoort等Nucleic Acids Res.25:2069-2074(2000)),或者重写大部分的核酸序列,例如多至1000bp的DNA(Hale,RS和Thomas G.Protein Exper.Purif.12,185-188(1998))。可通过循环PCR实现对核酸序列的重写,其中通过延长重叠的寡核苷酸引物来产生期望的序列(Prodromou和Pearl,ProteinEng.5:827-829(1992))。较大段DNA的重写可能需要循环PCR的多至3个连续循环(Hale,RS和Thomas G.Protein Exper.Purif.12,185-188(1998),Te’o等,FEMS Microbiol.Lett.190:13-19,(2000))。
或者,可在宿主细胞中提高关联tRNA的水平。该提高可以通过增加各tRNA基因的拷贝数来实现,例如通过在相容性多拷贝质粒上将相关tRNA基因插入到宿主细胞中,或者可替代地将tRNA基因插入到表达载体自身中。当使用大肠杆菌表达系统时,可使用具有增强的argU表达(用于识别AGG/AGA)的大肠杆菌宿主细胞。另外,也可使用包含ilex(用于识别AUA)、leuW(用于识别CUA)、proL(用于识别CCC)或glyT(用于识别GGA)之tRNA基因的宿主细胞(Brinkmann等.Genes,85,109-114,(1989);Kane FJ.Curr.Opin.Biotechnol.6:494-500(1995);Rosenburg等,J.Bacteriol.175,716-722,(1993);Siedel等,Biochemistry,31,2598-2608,(1992))。
制备表达载体的分子技术是公知的。
可通过使用互为引物的寡核苷酸和本文所述核酸序列合成核酸分子来制备上述用于并入本发明表达载体的核酸分子。
已经开发了许多分子技术来通过互补的粘性末端将DNA有效连接到载体上。在一个实施方案中,可向待插入到载体DNA中的核酸分子添加互补的均聚物段(homopolymer tracts)。然后通过互补的均聚物尾(homopolymeric tail)之间的氢键使载体与核酸分子连接以形成重组DNA分子。
在一个替代的实施方案中,使用含有提供的一个或更多个限制性位点的合成接头使核酸分子与表达载体有效连接。在一个实施方案中,通过之前描述的限制性内切核酸酶消化来产生核酸分子。
或者,可使用含有不依赖于连接的克隆(ligation-independentcloning,LIC)位点的载体。然后可以将所需的PCR扩增核酸分子克隆到LIC载体中而不进行限制性消化或连接(Aslanidis和de Jong,Nucl.Acid.Res.18,6069-6074,(1990),Haun等,Biotechniques 13,515-518(1992)).
为了分离和/或修饰插入到所选的质粒中的目的核酸分子,优选使用PCR。可以消化用于序列PCR制备的合适引物以分离核酸分子所需的编码区,添加限制性内切核酸酶或LIC位点,将编码区放在期望的阅读框中。
在一个优选实施方案中,通过使用Saiki等(1988)Science 239,487-491所公开的聚合酶链式反应,利用合适的寡核苷酸引物来制备用于并入本发明之表达载体的核酸分子。扩增编码区,同时引物自身也并入到了扩增的序列产物中。在一个优选实施方案中,扩增引物包含限制性内切核酸酶识别位点,其允许将扩增序列产物克隆到合适载体中。
本发明的表达载体可包含单拷贝的前述核酸分子,或者多拷贝的前述核酸分子。
宿主细胞
在一个方面,本发明提供了用本发明的表达载体转化或转染的宿主细胞。
本文使用的“宿主细胞”是指特定对象细胞,并且也指这样的细胞的子代细胞或潜在子代细胞。由于突变或环境影响造成的某些改变可发生在后代中,这些子代可能事实上不同于亲代细胞,但是依然包括在本文所使用的该术语的范围内。
用于本发明的表达系统的宿主细胞可以是需氧细胞或者替代地为兼性厌氧细胞。优选地,所述细胞是细菌细胞。或者,所述细胞可以是酵母细胞(例如,毕氏酵母(Saccharomyces Pichia))、藻类细胞、昆虫细胞或植物细胞。
细菌宿主细胞包括革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌。合适的细菌宿主细胞包括但不限于革兰氏阴性细菌,例如肠杆菌(Enterobacteria)科的细菌,最优选大肠杆菌。对于本发明来说,大肠杆菌是最优选的细菌宿主细胞。在大肠杆菌中表达提供了相比其他表达系统许多的优点,特别是低开发成本和高产率。适于高蛋白质表达的细胞包括例如大肠杆菌W3110(大肠杆菌的B菌株)。大肠杆菌BL21、BL21(DE3)和BL21(DE3)pLysS、pLysE、DH1、DH4I、DH5、DH5I、DH5IF’、DH5IMCR、DH10B、DhlOB/p3、DH1IS、C600、HB101、JM101、JM105、JM109、JM110、K38、RR1、Y1088、Y1089、CSH18、ER1451、ER1647特别适于表达。大肠杆菌K12菌株也是优选的,因为这些菌株是非病原的标准实验室菌株,并且包括NovaBlue,JM109和DH5α大肠杆菌K12RV308、大肠杆菌K12C600、大肠杆菌HB101,参见例如Brown,Molecular Biology Labfax(Academic Press(1991))。
用于原核宿主中载体传播的标准技术是本领域技术人员公知的(参见,例如,Ausubel等,Short Protocols in Molecular Biology第3版(JohnWiley&Sons 1995)).
为了最大化重组蛋白质在大肠杆菌中的表达,本发明的表达载体可以在具有蛋白水解切割重组蛋白质之受损能力的宿主细菌中表达并入到所述表达载体内的核酸分子(Gottesman,S.,(1990)Gene ExpressionTechnology:Methods in Enzymology 185,Academic Press,San Diego,California,119-128)。或者,可以削弱(attenuate)并入到本发明的表达载体中的核酸分子以使得每一氨基酸的单独密码子是大肠杆菌中优先使用的那些(Wada等,(1992)Nucleic Acids Res.20:2111-2118)。可以通过标准DNA合成技术来进行本发明核酸序列的这种改变。
本发明的宿主细胞可用在用于产生分子伴侣/引领蛋白家族聚合物的表达系统中。
可通过常规转化或转染技术将本发明的表达载体引入到宿主细胞中。
本文使用的“转化”和“转染”是指本领域中已知的用于向宿主细胞中引入外源核酸的多种技术。通过本领域中的已知方法来完成用本发明的表达载体转化合适的宿主细胞,并且通常依赖于载体和宿主细胞二者的类型。所述技术包括但不限于磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE-右旋糖酐-介导的转染、脂质体转染法(lipofection)、化学穿孔(chemoporation)或电穿孔。
本领域中用于转化细菌宿主细胞的已知技术公开在例如以下文献中:Sambrook等(1989)Molecular Cloning,A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y;Ausubel等(1987)Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley and Sons,Inc.,NY;Cohen等(1972)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 69,2110;Luchansky等(1988)Mol.Microbiol.2,637-646。所有这些方法均通过引用并入本文。
可通过本领域中公知的技术鉴定成功转化的细胞,即包含本发明表达载体的那些细胞。例如,可以培养经本发明的表达载体转染的细胞以产生分子伴侣/引领蛋白家族成员。可通过本领域中公知的技术来检验细胞中表达载体DNA的存在。或者,可使用与之杂交的抗体来检测分子伴侣/引领蛋白家族成员或者其部分和片段的存在。
在一个优选实施方案中,本发明包括经转化宿主细胞的培养物。优选地,所述培养物是均一克隆的(clonally homogeneous)。
宿主细胞可以含有单拷贝的前述本发明表达载体,或者多拷贝的表达载体,即多拷贝的相同或不相同的表达载体。
聚合物产物
可使用利用包含前述核酸分子之表达载体转化的宿主细胞来产生(即,表达)分子伴侣/引领蛋白家族聚合物。
在一个方面,本发明提供了用于产生分子伴侣/引领蛋白家族聚合物的方法,所述聚合物包含含有外源生物活性序列的至少一种分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体,所述方法包括:i)将编码含有外源生物活性序列的分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体的核酸分子并入到用于在宿主细胞中表达的表达载体中;以及ii)用所述表达载体转染宿主细胞;其中向所述宿主细胞提供编码分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体特异性之周质分子伴侣的核酸分子和编码分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体特异性之外膜引领蛋白的核酸分子,并且其中得到的经转染宿主细胞产生分子伴侣/引领蛋白家族聚合物。
优选地,分子伴侣/引领蛋白家族聚合物是前述级分1抗原聚合物、SAF1聚合物或Afa/Dr聚合物。
优选地,编码含有外源生物活性序列的重组分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体的核酸分子编码前述含有外源生物活性序列的CAF1多肽单体、含有外源生物活性序列的SAF1多肽单体或者含有外源生物活性序列的Afa/Dr多肽单体。
优选地,所述生物活性序列是前述细胞粘附识别基序、生长因子序列基序或蛋白酶位点。
优选地,重组分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体特异性的所述周质分子伴侣是前述CAF1、SAF1或Afa/Dr特异性的周质分子伴侣。
优选地,重组分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体特异性的所述外膜引领蛋白是前述CAF1、SAF1或Afa/Dr特异性的外膜引领蛋白。
优选地,如下向宿主细胞提供编码分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体特异性之周质分子伴侣的核酸分子:将编码分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体特异性之周质分子伴侣的核酸分子并入到用于在宿主细胞中表达的表达载体中;以及用所述表达载体转染宿主细胞。所述表达载体与并入编码分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体之核酸分子的表达载体可以是相同的载体或不同的表达载体。
优选地,如下向宿主细胞提供编码分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体特异性之外膜引领蛋白的核酸分子:将编码分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体特异性之外膜引领蛋白的核酸分子并入到用于在宿主细胞中表达的表达载体中;以及用所述表达载体转染宿主细胞。所述表达载体与并入编码分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体之核酸分子的表达载体和/或并入编码分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体特异性周质分子伴侣之核酸分子的表达载体可以是相同的载体或不同的表达载体。
优选地,还向宿主细胞提供编码分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体特异性之表达调控子的核酸分子。优选地,重组分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体特异性的所述表达调控子是前述CAF1、SAF1或Afa/Dr特异性的周质分子伴侣。
优选地,如下向宿主细胞提供编码分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体特异性之表达调控子的核酸分子:将编码分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体特异性之表达调控子的核酸分子并入到用于在宿主细胞中表达的表达载体中;以及用所述表达载体转染宿主细胞。所述表达载体与并入编码分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体之核酸分子的表达载体和/或并入编码分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体特异性周质分子伴侣之核酸分子的表达载体和/或并入编码分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体特异性外膜引领蛋白之核酸分子的表达载体可以是相同的载体或不同的表达载体。
宿主细胞可以是任何宿主细胞。优选地,所述宿主细胞是前述革兰氏阴性细菌。
本发明包括用于利用本发明的前述表达载体来大规模生产分子伴侣/引领蛋白家族聚合物的表达系统。优选地,所述表达系统是大肠杆菌表达系统。
以技术人员熟悉的方式生长或培养本发明的经转化宿主细胞或者包含本发明表达载体的经转化宿主细胞,取决于宿主生物体。通常,宿主细胞生长在含有以下成分的液体培养基中:碳源,通常以糖类的形式;氮源,通常以有机氮源的形式(例如酵母提取物);或盐(例如硫酸铵)、痕量元素(例如铁、锰和镁的盐),以及维生素(如果适当的话),温度为0℃至100℃,优选10℃至60℃,同时通有氧气。
液体培养基的pH可以保持恒定(也就是说,在培养期间进行调节)或不保持恒定。培养物可以分批、半分批或持续生长。可以在发酵开始时提供或者半持续或持续地供给营养物。可通过技术人员已知的过程使产生的产物与生物体分离,例如通过提取、蒸馏、结晶、利用盐沉淀(如果适当的话)和/或色谱法。
已知培养方法的概述可以在Chmiel的教科书(Bioprozeβtechnik 1.Einführung in die Bioverfahrenstechnik[Bioprocess technology 1.Introduction to Bioprocess technology](Gustav Fischer Verlag,Stuttgart,1991))或者Storhas的教科书(Bioreaktoren und periphere Einrichtungen[Bioreactors and peripheral equipment](Vieweg Verlag,Brunswick/Wiesbaden,1994))中找到。
待使用的培养基必须适当地符合所讨论菌株的需求。对于多种微生物的培养基的描述可以在以下教科书中找到:“Manual of Methods forGeneral Bacteriology”of the American Society for Bacteriology(Washington D.C.,USA,1981)。
如上所述,这些可以根据本发明使用的培养基通常包含一种或更多种碳源、氮源、无机盐、维生素和/或痕量元素。
可以在需氧或无氧条件下培养经转化的宿主细胞。在需氧条件下,优选地,持续地从培养基中除去氧气,例如,通过添加还原剂或氧清除剂,或者通过用中性气体净化反应介质来实现。
本领域中用于大规模培养宿主细胞的已知技术在例如Bailey和Ollis(1986)Biochemical Engineering Fundamentals,McGraw-Hill,Singapore;或者Shuler(2001)Bioprocess Engineering:Basic Concepts,Prentice Hall中公开。所有这些技术通过引用并入本文。
可以在容器(例如生物反应器)中培养本发明的宿主细胞。生物反应器(例如发酵罐)是包含细胞或酶并且通常用于在工业规模上产生分子的容器。分子可以是重组蛋白质(例如,本发明的分子伴侣/引领蛋白家族聚合物)。通常,基于细胞的生物反应器包含目的细胞,并且包含进行反应所必需的全部营养物和/或辅因子。
因此,本发明提供了用于产生分子伴侣/引领蛋白家族聚合物的方法,所述聚合物包含至少一种含有外源生物活性序列的分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体,所述方法包括:i)提供包含本发明宿主细胞的容器,如前所述;以及ii)提供有利于含在所述容器中的细胞培养物表达重组分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体的细胞培养条件;以及iii)任选地从所述容器中收集分子伴侣/引领蛋白家族聚合物。
实施例
1.实验概述
1.1Caf1的亚克隆、表达和纯化
使用寡核苷酸引物对F1正向(5′-ATA AAT CGG TTC AGT GGCCTC AAC GCT GTG-′3)和F1反向(5′-GGT TAG GCT CAA AGT AGGATA ATT C-3′)、作为模板的编码caf操纵子的质粒pAH34L(9)((GenBank,登录号AY450847)以及产生平端片段的KOD HOT START DNA聚合酶(Novagen,UK)来通过PCR(30个扩增循环;95℃20秒,55℃10秒,70℃5分钟)(PCR Express,Hybaid,UK)扩增caf操纵子(约5.2Kb大小)。将获得的PCR产物加样到0.7%琼脂糖凝胶上,利用溴化乙锭(0.5μg/Ml)染色。在透射仪(波长254nm的UV光)(Gel-Doc Bio-RAD,UK)下使DNA可视化。使用无菌解剖刀片从琼脂糖凝胶上切下对应于caf操纵子的寡核苷酸的PCR产物。用QIA快速凝胶提取试剂盒和QIA快速PCR扩增试剂盒(Qiagen,UK)纯化提取的DNA带。在将纯化的DNA加样到含有溴化乙锭(0.5μg/Ml)的0.7%琼脂糖凝胶上后,在透射仪下可视化并使用Quantity one软件(Gel-Doc Bio-RAD,UK)进行定量。在将PCR产物亚克隆到新载体中之前,进行限制性分析以确认PCR产物的身份。然后,将纯化的PCR产物亚克隆到新载体中。最初,本发明人尝试将caf操纵子亚克隆到Psmart-HC-Amp和Psmart-LC-Kan载体(Lucigen,USA)中。Psmart-HC的拷贝数与Puc19类似,为约300-500拷贝每个细胞。Psmart-LC的拷贝数与Pbr322类似,为约15-30拷贝每个细胞。Psmart载体是预消化的,具有平的去磷酸化末端。小尺寸的Psmart载体(1.7-2.0Kb)可有利于大的插入DNA的亚克隆和诱变实验。在DNA纯化之后,必须用T4多核苷酸激酶(10U)(NEB,UK)处理PCR产物以向寡核苷酸添加5′-磷酸,从而允许随后的连接。在cloneSmart连接反应中,使预处理的Psmart载体与平的磷酸化插入物(200ng插入物)连接。所使用的阳性对照为λ/HcII插入物(500ng),并且还根据制造商说明书以及对于连接的建议(Lucigen,US)进行了没有插入物的阴性对照。在含有用于Psmart HC-Amp和LC-Kan中任一的合适抗生素的LB琼脂板上选择含有新重组质粒之大肠杆菌10G化学感受态细胞的转化体[F-mcrAD(mrr-hsdRMS-mcrBC)Φ80dlacZΔM15ΔlacX74endA1recA1araD139Δ(ara,leu)7697galUgalK rpsL nupGλ-tonA](Lucigen,USA)。将板在37℃下孵育过夜。之后,对caf操纵子的亚克隆进行改进,例如,在4℃下使孵育时间提高到24小时。使用pGem-T Easy(Promega,UK)进行亚克隆caf操纵子的第二次尝试。通过用EcoR V切割以及在两端添加3′端胸苷来制备高拷贝数的pGem-T Easy载体。插入位点的这些单3′-T突出端通过阻止载体的重新环化以及为PCR产物提供相容的突出端(Promega,UK)极大提高了PCR产物连接到小尺寸质粒(3Kb)中的效率。使用A加尾过程来修饰纯化的PCR产物,其使用平端酶根据制造商的说明书和对于A加尾过程的建议(来自Promega,UK的pGem-T EASY试剂盒)来向PCR产物上添加3′端‘A’突出端。根据制造商的说明书和对于连接反应的建议(来自Promega,UK的pGem-T EASY试剂盒)准备连接反应,其包括标准反应、阳性对照(对照插入DNA)和背景对照(无插入DNA),不同之处在于孵育时间和反应温度为4℃下24小时。之后,将连接反应在65℃下热变性10分钟。将含有新重组质粒(称为大肠杆菌(pGem-TF1))的大肠杆菌DH5α细胞转化体[F-Φ80lacZΔM15Δ(lacZYA-argF)U169deoR recA1endA1hsdR17(rk-,mk+)phoA supE44thi-1gyrA96relA1λ-](Invitrogen,UK)在含有100μL氨苄青霉素的LB琼脂板上进行选择,并且在所述LB琼脂板上涂有20μL的X-Gal(50mg/Ml)。将板在37℃下孵育过夜。第二天,从每个成功转化中挑取单个菌落并且引入到含有琼脂的管中以送去测序(Beckman Coulter Genomics-Formerly AgencourtBioscience and Cogenics,UK)。平行对来自质粒小量制备物的pGem-TF1质粒进行限制性分析。
对于蛋白质表达和纯化,用pGem-TF1转化大肠杆菌BL21(DE3)细胞(Invitrogen,UK)。制备细胞并且收获,如之前描述(8)进行蛋白质分离。简单地说,将细胞在37℃下震荡(170rpm)培养19小时。将细胞在4℃下以14000×g离心45分钟,并使细胞沉淀和絮状层(主要是Caf1)重悬在100Ml pH 7.6的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。在孵育30分钟后,将重悬物以14000×g离心30分钟,并将上清液调节到40%硫酸铵饱和度。在4℃下以14000×g离心30分钟后,使硫酸铵沉淀重悬在PBS中以27000×g离心,以除去不溶物质,然后使用0.22μm一次性过滤器(Millex,Millipore,UK)过滤灭菌。将caf1样品的100μL等分试样加到预先利用PBS平衡的FPLC Superdex 200柱(GE Healthcare)上。用相同缓冲液以0.5Ml/分钟的流量对caf1进行洗脱。收集峰级分并且通过12%SDS-PAGE凝胶和western印迹(使用针对F1的单克隆抗体)对caf1进行分析。将蛋白质样品送往纽卡斯尔大学(Newcastle University)的Pinnacle-Proteomics and Biological Mass spectrometry service以使用肽质量指纹图谱(PMF)过程来确认所研究蛋白质的身份。
1.2通过定点诱变、表达和纯化来构建Caf1-RGDS突变体
如用于大质粒的描述(XL Quickchange kit,Stratagene),使用Pfu聚合酶(Stratagene)通过PCR(18个扩增循环,95℃1分钟,95℃50秒,60℃50秒,68℃8.5分钟)(PCR Express,Hybaid,UK)在pGem-TF1中产生caf1基因内的突变。编码引物(较低情况下突变)在表1中示出:
表1:用于在caf1基因中产生突变的编码引物
用DpnI处理8.2Kb扩增产物。用DpnI处理的8.2Kb扩增产物转化大肠杆菌DH5α。对于来自每一构建体的一个转化体,确认突变caf1的完整序列((Beckman Coulter Genomics-Formerly Agencourt Bioscienceand Cogenics,UK)。
1.3电子透射显微术(TEM)
如之前的描述(10)制备蛋白质样品和负染色试样。简单地说,在蒸馏水中制备终浓度为50μg/ml的caf1WT和caf1RGDS突变蛋白质样品。向具有薄碳支持膜的电子显微镜网格上施加10μl样品小滴,保持10-20秒并且用滤纸吸干。然后使用3次20μl水的小滴冲掉缓冲液和盐,并通过添加20μl2%乙酸双氧铀溶液的小滴对其余碳吸附的蛋白质/佐剂进行负染色。用滤纸吸干负染色物并且使网格风干。在100Kv下操作的PhilipsCM100电子透射显微镜下研究负染色试样。将电子显微图像记录为标签图像文件格式(TIFF),常规的为×130000的图像放大率。
1.4细胞粘附测定
3T3成纤维细胞和PC12购自AmericanType Culture Collection(ATCC;http://www.lgcpromochematcc.com)并且如之前的描述(4)保存。为了包被Caf1,将100μL目的蛋白质(caf1WT和af1 RGDS突变体)以及对照添加至96孔板。使用BSA、OmpA-RGDS作为对照。未包被的孔也用作对照。将蛋白质在10mM PBS,pH 7.6中稀释以得到100μg/Ml的期望浓度。使用0.2μm过滤器过滤所有蛋白质溶液。使用96孔板的多通道移液管将每一种溶液吸取到培养板中。将板用parafilm封口膜密封并且在4℃下孵育过夜。将蛋白质溶液从板孔中吸出并且用10Mm PBS pH7.6洗涤孔一次。从孔中除去PBS并且将平板储存用于细胞培养。然后,在1000×g下5分钟收获3T3成纤维细胞。使细胞沉淀以浓度为2.5×106细胞/Ml重悬在具有钙和镁的10Mm PBS pH7.4中。将以浓度为1×106细胞/Ml的细胞用具有钙和镁的10mM PBS pH7.4洗涤两次。向每个孔添加100μL制备的细胞混悬液。将板于37℃放在孵育器中2小时。在孵育2小时后,通过翻转板来除去未附着的细胞。将细胞用具有钙和镁的10mMPBS pH7.4洗涤两次,持续5分钟,并且用PBS pH 7.4中的4%低聚甲醛(Sigma-Aldrich,UK)固定30分钟。除去低聚甲醛溶液,并且用PBSpH 7.4洗涤细胞3次,每次洗涤5分钟,然后用10μg/Ml的DAPI(Sigma-Aldrich,UK)在PBS pH 7.4中染色25分钟。除去DAPI溶液,并用PBS pH 7.4洗涤细胞3次,每次洗涤5分钟。之后,用若丹明-鬼笔环肽缀合物(200ng/Ml)(Sigma-aldrich)染色15分钟。然后,除去鬼笔环肽溶液,并将细胞用PBS pH 7.4洗涤3次,每次洗涤5分钟。向孔中填充PBS pH 7.4并且使用荧光计进行测量。对于使用荧光显微镜进行的细胞粘附测定,根据上述相同的方案,用caf1WT和caf1RGDS突变体包被玻璃盖玻片。之后,将1×105的PC12细胞添加至6孔培养板每个孔的无血清RPMI 1640培养基,所述每个孔包含包被有蛋白质的玻璃盖玻片。将细胞在37℃、5%CO2下保持在孵育器中3小时。3小时后,将培养物用2Ml无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS)(Cambrex)洗涤一次、固定并且如上所述染色。
2.结果
2.1.亚克隆caf操纵子
2.1.1.使用Pah34L载体作为模板对caf操纵子进行PCR扩增并且对PCR产物进行限制性消化
使用F1引物对和PCR循环条件通过PCR对包含鼠疫耶尔森氏菌caf操纵子的大肠杆菌质粒pAH34L(12)(约11Kbp大小)进行扩增,示出5.2Kb的条带(图3a)。用切割caf操纵子的HindIII和BamHI限制性酶和不切割caf操纵子的EcoRI对所得PCR产物进行消化(图3b)。
通过限制性分析确认了获得的PCR产物是caf操纵子。
2.1.2.caf操纵子纯化和量化以及限制性消化
在确认所获得的PCR产物是caf操纵子后,使用QIAGEN GelExtraction试剂盒对预期大小(5.2Kb)的DNA片段进行纯化,并且使用Quantity软件(Bio-Rad)进行量化(图4a)。然后,通过切割caf操纵子的HindIII和BamHI限制性酶以及不切割caf操纵子的EcoRI对DNA片段的身份和完整性进行确认(图4b)。
对PCR产物进行纯化,在电泳凝胶上出现了5.2Kb的单个条带,并且限制性分析表明所述条带是caf操纵子。从该纯化中,得到了64ng/μL经纯化的PCR产物。
2.1.3.pGem-TF1的测序
由pAH34L质粒的亚克隆实验允许本发明人构建携带caf操纵子的质粒pGem-T Easy。基因测序提供的结果表明克隆到pGem-T Easy中的caf操纵子的氨基酸序列(图5)与之前报道的来自鼠疫耶尔森氏菌菌株482质粒Pmt1 caf1操纵子完整序列(GenBank:AY450847.1)的序列相同。
测序结果显示了来自caf操纵子的Caf1和caf1R基因的完整和正确的序列。
2.1.4.pGem-TF1的限制性消化
使用在pGem-T EASY质粒中具有两个限制位点并且能够释放插入物的EcoRI限制性酶对凝胶进行限制性分析,显示两个条带:一个条带为3Kb,其可能对应于载体,而第二个条带超过5Kb,其可能对应于插入物(图6)。
使用释放插入物的EcoRI进行的限制性分析也确证了克隆的插入物具有正确的大小(预期大小为5.2Kb)。
2.1.5.SDS PAGE凝胶和western印迹
使用抗F1抗体(Avecia,UK)的SDS page和western印迹的结果(图7)显示了为15.5Kda的F1抗原的经报道分子质量(2),并且在western印迹中,在大肠杆菌/Pah34L以及大肠杆菌/pGem-T Easy的溶液中鉴定了与F1多克隆抗体反应的Mr为16,000的条带,这两种质粒均包含caf操纵子,分别在含有卡那霉素(50μg/Ml)和氨苄青霉素(100μg/Ml)的L培养液中于37℃下培养19小时。
使用抗F1抗体通过SDS PAGE和Western印迹来显示caf1的表达。
2.1.6.Caf1蛋白质的质谱法
为了确认12%SDS-page凝胶上15.5kDa条带的身份,将条带送去进行质谱法。获得的结果证实15.5kDa的条带是caf1(图8)。
2.2.Caf1蛋白表达和纯化
大肠杆菌BL21(DE3)(pGem-TF1)培养物的离心导致细菌细胞沉降,其上为可见絮状物质层。在预备实验中,表明该絮状物质主要是Caf1。可以通过在PBS中轻轻洗涤从细菌细胞表面除去附加的caf1。通过硫酸铵分级接着进行FPLC Superdex 200凝胶过滤色谱对caf1纯化,每升培养物产生约10mg的Caf1。
2.2.1.使用Superdex 200的尺寸排阻色谱和校准曲线
在本研究中使用FPLC Superdex 200凝胶过滤色谱柱(最大压力:3Mpa;流量:2Ml/分钟;流动相:pH 7.6的PBS缓冲液;注入样品体积:最大5Ml)来纯化caf1。在凝胶过滤柱的空隙体积(V0)(50.5ml)中和总体积(VT)中洗脱的Caf1为18ml。用于凝胶过滤色谱的标准蛋白质标志物在表2中示出。结果在图9中示出
表2-用于凝胶过滤色谱的标准蛋白质标志物
2.2.2.色谱图和SDS PAGE凝胶
将样品以2ml/分钟注入到Superdex 200凝胶过滤柱中,使用pH 7.6的PBS缓冲液作为流动相。将每一级分收集到Falcon管中。色谱图(图10a)示出加样到12%SDS-PAGE上的蛋白质洗脱物和收集的每一级分(图10b)。
2.2.3.通过UV分光光度计确定蛋白质浓度
使用分光光度计对纯化的蛋白质进行量化,如图11所示。
2.3.Caf1寡聚体的形成
在蛋白质纯化之后,本发明人制备了caf1寡聚体。将Caf1样品在95℃下孵育45秒(图12)。
2.4.使用定点诱变构建Caf1-RGDS突变体
表达和纯化
2.4.1.CafM:Caf1复合物和Caf1-RGDS突变体构建
使用PyMOL和登录号(GenBank,登录号AY450847)将RGDS肽插入到F1纤维模型结构的环中(图13)。使用OligoAnalyser 3.1软件设计诱变引物。
2.4.2.测序
在定点诱变之后,将每一成功转化的集落送去测序。以下示出了由Caf1MDN31GRG;DS34GN的基因测序获得的结果(图14)。
2.4.3.SDS PAGE凝胶
将纯化的Caf1QDGN76RGDS突变体蛋白质的级分加样到12%SDS-PAGE上(图15)。
2.5.电子透射显微法
使用电子透射显微镜捕捉来自pGem-TF1和pGem-TF1Caf1QDGN76RGDS的图像(图16)。
3.细胞生物学
3.1.使用荧光计对包被有caf1 WT或RGDS突变体之96孔板上的细胞粘附进行测量。
表3.使用caf1作为用于呈现RGDS肽之细胞培养物的骨架的初步结果表明对于3T3成纤维细胞具有一些作用。Orla 1是由不具有插入的细胞附着基序之大肠杆菌蛋白质OmpA的跨膜结构域组成的对照蛋白质。Cooke,M.J.,Zahir.T.,Phillips,S.R.,Shah,D.S.H.,Athey,D.,Lakey,J.H.,Shoichet,M.S.和Przyborski,S.A.(2010)′Neural differentiation regulatedby biomimetic surfaces presenting motifs of extracellular matrix proteins′,Journal of Biomedical Materials Research Part A,93A(3),第824-832页
3.2通过荧光显微术在包被有caf1WT或RGDS突变体的玻璃盖玻片上进行PC12细胞粘附测定
图17示出PC12细胞粘附测定的结果。
4.由不同类型的单体形成混合的Caf1聚合物
以下数据证明通过添加表达突变体Caf1的额外的质粒,可以向所得caf1聚合物中并入两种不同的单体类型。因此,复合性混合聚合物(即,异源聚合物)是可能的。
4.1使用两种相容的质粒pAH34L和pBAD33进行Caf1WT的共表达
描述了用于细胞培养的第二代骨架的设计和合成,其中相同骨架含有多种不同的ECM基序以增强细胞粘附(例如,来自纤连蛋白的PHSRN(以及不止一种细胞粘附基序,如Caf1-RGDS))或促进其他生物学过程,例如包含生长因子的分化。也可以并入特定的蛋白酶切割位点其可以被例如在细胞发育(包括迁移)的特定时间点由细胞分泌的金属蛋白酶识别和切割。
包含混合聚合物的骨架的产生可具有许多优点。骨架将通常仅需要可能被非活性单体稀释的低密度活性基序。如果具有基序的单体在分泌途径中缓慢组装的话,则这可提高聚合物的表达水平。
本发明人已经证明,可以通过分子伴侣/引领蛋白系统成功分泌散布着Caf1野生型的Caf1突变体(例如,具有附加基序或生物活性序列)。两种不同基因的同步表达被称为共表达,并且其通常用两种或更多种质粒实现,所述质粒各自携带有一种亚单位(例如,突变体caf1或野生型caf1)的基因和不同的选择标志物。质粒应具有不同的相容性复制子(19)。
本研究中使用的两种质粒是pAH34L和pBAD33,但是,也可是使用任何合适的质粒。pAH34L质粒(8)编码caf操纵子,而相容的pBAD33质粒仅编码caf基因。pAH34L caf1基因的表达是温度调控的,其在37℃下最大表达。低于该温度,caf1基因的表达水平降低。质粒pBAD33(20)是编码氯霉素抗性的低拷贝质粒,其含有araBAD(阿拉伯糖)操纵子的PBAD启动子以及编码该启动子的正调节子和负调节子的基因(araC)。
通过GeneArt将caf1基因克隆到pBAD33质粒中。然后本发明人在起始密码子AUG上游8碱基对处引入核糖体结合位点夏因-达尔加诺序列(AGGAGG)。质粒pAH34L含有ColE 1复制起始点,而质粒pBAD33含有pACYC184复制起始点。
该系统具有多个优点,包括(1)通过控制温度或阿拉伯糖浓度来调控caf1基因的表达和蛋白质的产生。可以通过在37℃或更高温度进行细胞培养来诱导pAH34L编码的caf1表达,并且通过使温度降至低于37℃来抑制。在23℃下,caf1基因的表达水平非常低。由pBAD33编码的caf1的表达水平可以通过变化的L-阿拉伯糖的浓度范围(通常为0.002-2%)来调节,并且可通过葡萄糖的存在(其抑制所述基因的表达)来将所述表达水平降低到极低的水平。该系统的另一个优点在于(2)其导致产生了杂合Caf1聚合物(Caf1突变体+Caf1WT)。
向各自含有5mL LB培养液并且补充有20μg/mL氯霉素、0.2%L-阿拉伯糖、100μg/mL氨苄青霉素以及100μg/mL氨苄青霉素和20μg/mL氯霉素抗生素二者的两组玻璃试管(每组三个)中接种分别用pBAD33_SD_Caf1、pAH34L或者pBAD33_SD_Caf1+pAH34L二者转化的大肠杆菌TOP10的单菌落。向一组试管添加0.2%葡萄糖,而另一组试管不添加葡萄糖。将所有玻璃试管在180rpm的旋转轮(rotationwheel)中于37℃孵育。当培养物达到对数生长中期(600nm的光密度为0.5-0.6)时,向每一个组中的各个玻璃试管添加三种不同浓度的L-阿拉伯糖:0.02%、0.2%和2%。在孵育16小时后,将细菌细胞培养物转移到15ml Falcon管中,并且在4℃下以3000rpm离心15分钟。对所有Falcon管拍照。立即使用尺测量Falcon管上沉淀和絮状层的大小(图60)。
图60示出本研究中测量培养物的絮状层和细胞沉淀的一些实例。尽管在含有大肠杆菌TOP10/pAH34L或大肠杆菌TOP10/pBAD33_SD_Caf1+pAH34L的所有管中都观察到了絮状层的存在,但是在含有0.2%D-葡萄糖的管中,絮状层比不添加D-葡萄糖的管中厚。在仅在含有大肠杆菌TOP10/pBAD33_SD_Caf1的管中,在存在或不存在D-葡萄糖的情况下,都没有观察到絮状层。
在存在或不存在D-葡萄糖的情况下,使用不同浓度(0%、0.02%、0.2%和2%)的L-阿拉伯糖进行相同的实验。使用移液管从每一个Falcon管中小心移出约4ml过量的LB培养基。使用移液管将含有剩余LB的絮状层小心地与细胞沉淀分开。将这一层的样品添加至SDS样品缓冲液,并且在100℃下加热5分钟,加样到12%SDS-PAGE凝胶上。将一个凝胶用考马斯亮蓝染色,而将另一个凝胶用于进行western印迹。使用抗Caf1抗体进行印迹探测Caf1,然后使用山羊抗小鼠IgA-辣根过氧化物缀合物检测结合的抗体。使用4CN(4-氯-1-萘酚)底物检测结合的抗体。
对western印迹膜进行扫描并且通过ImageJ软件进行分析以比较western印迹上条带的密度。测定条带相对密度的平均值和平均值的标准误差。所获得的用于量化絮状层中存在的Caf1的结果以及测量的絮状层的大小可以在图61中看到。图61示出絮状层大小与絮状层中存在的Caf1蛋白的量之间的关系。
4.2.与Caf1亚单位融合的异源蛋白质在大肠杆菌中的表达
通过插入以下使pBAD33中的caf1基因突变:(1)其N末端附近的6-组氨酸(Caf1-6HisNT);(2)Caf1的环1中的纤连蛋白中RGD协同序列(Caf1-PHSRN)的PHSRN基序(Caf1-PHSRN环1);(3)CafN末端的FLAG表位(DYKDDDDK)(caf1-FLAG表位NT);(4)Caf1 NT端的半胱氨酸(Caf1-Cys-NT);(5)Caf1的环4中的半胱氨酸(Caf1-G35C环4);Caf1的环2中的半胱氨酸(Caf1-Q106C环2);(6)Caf1N末端中金属蛋白酶13(MMP13)的PENFF切割位点(Caf1-PENFF-NT);(7)Caf1N末端的6-组氨酸,接着是间隔区连接肽(GGGGSGGGGS)(Caf1-6His-NT间隔区);(8)Caf1C末端的6-组氨酸(Caf1-6His-CT);(9)Caf1的环3中的PHSRN基序(Caf1-PHSRN环3)。caf1基因中的这些突变被设计为caf1基因的变体。通过GeneArt(Invitrogen Life Technologies)合成变体并且克隆到pBAD33载体中。
4.2.1.使用载体pBAD33和pAH34L进行Caf1突变体的共表达
通过GeneArt合成caf1基因(大小528bp,GenBank,登录号AY450847)突变体(表4)并且克隆到pBAD33载体中KpnI和XbaI限制位点之间;接着是两个终止密码子。
4.2.2小规模Caf1突变体共表达
分别使用补充有100μg/ml氨苄青霉素或20μg/ml氯霉素抗生素以及100μg/ml氨苄青霉素和20μg/ml氯霉素抗生素二者的LB培养液培养大肠杆菌TOP10/pBAD33_SD_Caf1突变体、大肠杆菌TOP10/pAH34L和大肠杆菌TOP10/pBAD33_SD_Caf1突变体+pAH34L。
将各自含有10mlLB培养液并且有所需抗生素的两组玻璃试管(每组三个)以180rpm震荡在37℃孵育,直到其600nm的光密度达到0.5-0.6。在测量光密度之后,向各个管添加0.2%的L-阿拉伯糖。第二天,在无菌条件下将细菌细胞培养物转移到15ml Falco管中。将培养物离心并且制备以通过上述SDS-PAGE和western印迹进行分析。该实验一式三份地进行。
表4.pBAD33中合成的基因的Caf1氨基酸序列
使用每一种pBAD33_SD_Caf1突变体的质粒DNA来转化具有或不具有pAH34L的大肠杆菌TOP10感受态细胞。作为阳性对照,仅使用pAH34L质粒DNA来转化大肠杆菌TOP10感受态细胞。将转化的细菌细胞培养在含有上述相关抗生素的L-琼脂上。将经转化的大肠杆菌TOP10感受态细胞之板上的单独菌落在37℃下培养在具有含相关抗生素的10mL溶源性培养液(LB)培养基的玻璃试管中,直到其600nm的光密度达到0.5-0.6。向每个玻璃试管添加终浓度0.2%的阿拉伯糖。使细菌细胞培养物在37℃下生长16小时。该孵育时间之后,将培养物在4℃下以3000rpm离心15分钟。使用尺测量絮状层和细胞沉淀(表5)。
表5表明,在用0.2%的L-阿拉伯糖诱导之后,需要pBAD33和pAH34L的共表达来在以下培养物中产生絮状层:
pBAD33_SD_caf1-FLAG表位NT+pAH34L、pBAD33_SD_caf1-G35C环4+pAH34L、pBAD33_SD_caf1-6His-NT间隔区+pAH34L、pBAD33_SD_caf1-6His-CT+pAH34L、pBAD33_SD_caf1-PHSRN环3+pAH34L。
在两个培养物pBAD33_SD_caf1-Q106C环2+pAH34L和pBAD33_SD_caf1-PHSRN环1+pAH34L中,诱导后未检测到絮状层。在pBAD33_SD_caf1-PENFF-NT+pAH34L培养物中,本发明人在诱导之前观察到了絮状层,但是在诱导之后未观察到絮状物。
与未诱导的培养物相比,pBAD33_SD_caf1-G35C环4+pAH34L的L-阿拉伯糖诱导的培养物中絮状层非常厚,这可表明突变体对聚合物的一些贡献。在pBAD33_SD_caf1-FLAG表位NT+pAH34L的情况下,诱导培养物中和非诱导培养物中之层的大小是类似的。如果仅使用层的大小作为Caf1共表达的指示,则将更加难以理解该结果。
因此,使用单克隆抗caf1抗体和单克隆抗FLAG表位抗体进行了western印迹以分析这些样品(图62)。对于pBAD33_SD_caf1-6His NT+pAH34L(图63)以及对于pBAD33_SD_caf1-6His-NT间隔区+pAH34L(图64)验证了类似结果。通过使用单克隆抗Caf1抗体探测Caf1以及使用单克隆抗聚组氨酸抗体探测聚组氨酸进行两个western印迹以分析最后这两种样品。使用单克隆抗Caf1抗体进行对pBAD33_SD_caf1 PHSRN环1+pAH34L、pBAD33_SD_caf1 Cys-NT+pAH34L、pBAD33_SD_caf1G35C环4+pAH34L、pBAD33_SD_caf1 Q106C环2+pAH34L、pBAD33_SD_caf1 PENFF-NT+pAH34L、pBAD33_SD_caf1 PHSRN环3+pAH34L的Western印迹(图65)。
表5.在用与编码Caf1 WT的pAH34L联合的质粒pBAD33_SD_caf1突变体转化的大肠杆菌TOP10细胞中测量的絮状层厚度。在分别用质粒pAH34L和用质粒pBAD33_SD_caf1突变体转化的大肠杆菌TOP10中进行了相同的测量。所有数据报道为三个独立实验的平均值±平均值的标准误差(S.E.M)
图62示出pBAD33_SD_caf1-FLAG表位NT+pAH34L样品含有通过抗Caf1抗体检测的Caf1蛋白(图62-A),并且其为聚合形式。在将样品于100℃下加热45秒后观察Caf1聚合物(western印迹A-泳道2)。在仅有pBAD33_SD_caf1-FLAG表位NT的样品中获得了不同的结果,其中没有检测到Caf1。在pAH34L样品中,检测到了聚合形式的Caf1(western印迹A-泳道8)。对相同样品进行western印迹,但是使用抗FLAG表位揭示了存在聚合形式的Caf1-FLAG表位NT(western印迹B-泳道2)。不编码Caf1-FLAG表位NT的pAH34L样品未被抗FLAG表位抗体染色(western印迹B-泳道7-9)。在含有pBAD33_SD_caf1-FLAG表位NT的样品中,仅检测到了一些弱的条带,其对应于单体形式的FLAG表位(western印迹B-泳道5和6)。
图63示出pBAD33_SD_Caf1-6His-NT+pAH34L样品含有通过抗Caf1抗体检测的Caf1蛋白(图63-A),并且其为聚合形式。在将样品于100℃下加热45秒后观察Caf1聚合物(western印迹A-泳道2)。在pBAD33_SD_Caf1-6His-NT样品中没有检测到Caf1。pAH34L样品含有聚合形式的Caf1(western印迹A-泳道8)。对相同样品进行western印迹,但是使用抗聚组氨酸揭示了存在非常少量的Caf1-6His-NT,并且为单体形式(western印迹B-泳道1-3)。pAH34L不编码Caf1-6His-NT,并且未检测到条带(western印迹B-泳道7-9)。在含有pBAD33_SD_caf1-6His-NT的样品中,仅检测到了一些非特异性条带(western印迹B-泳道4-6)。
图64示出pBAD33_SD_caf1-6His-NT间隔区+pAH34L样品含有通过抗Caf1抗体检测的Caf1蛋白(图64-A),并且其为聚合形式。在将样品于100℃下加热45秒后观察Caf1聚合物(western印迹A-泳道2)。在pBAD33_SD_Caf1-6His-NT间隔区样品中没有检测到Caf1。在pAH34L样品中,检测到了聚合形式的Caf1(western印迹A-泳道8)。对相同样品进行western印迹,但是使用抗聚组氨酸揭示了存在二聚和单体形式的Caf1-6His-NT间隔区(western印迹B-泳道1-3)。pAH34L不编码Caf1-6His-NT间隔区,并且因此在western印迹B-泳道7-9中未检测到条带。在含有pBAD33_SD_caf1-6His-NT间隔区的样品中,检测到了一些非特异性条带(western印迹B-泳道4-6)。
图65示出pBAD33_SD_caf1-PHSRN环1+pAH34L、pBAD33_SD_caf1-Cys-NT+pAH34L、pBAD33_SD_caf1-G35C环4+pAH34L、pBAD33_SD_caf1-PENFF-NT+pAH34L样品含有通过抗Caf1抗体检测的聚合Caf1蛋白。通过单克隆抗Caf1抗体检测聚合形式的纯化Caf1。pBAD33_SD_caf1-Q106C环2+pAH34L样品未通过单克隆抗Caf1抗体检测到,并且pBAD33_SD_caf1-PHSRN环3+pAH34L样品未产生梯带(ladder)。
4.3讨论
4.3.1.通过两种相容质粒pAH34L和pBAD33介导Caf1WT的共表达
本研究证明了用于共表达使用质粒pBAD33的caf1基因拷贝和使用质粒pAH34L的caf操纵子的系统,质粒pBAD33含有:(1)来自pACYC184载体的pBR322相容性p15A复制起始点和(2)对氯霉素抗生素的抗性,质粒pAH34L具有不同的复制起始点(ColE1)和抗生素抗性(卡那霉素),因此细胞如果生长在卡那霉素/氯霉素L-琼脂板上,则其可以保持两种质粒。基于絮状层的大小,通过两种相容性质粒转化并且生长在含有L-阿拉伯糖的培养基中的TOP10大肠杆菌细胞表达更高水平的caf1基因。这一点通过western印迹使用单克隆抗Caf1抗体得到了证实。
在另一些研究中,及其同事(16)通过电子显微术和PapA抗原的免疫印迹分析研究了PapA(主要的菌毛蛋白亚单位)的过度产生。为此,他们构建了仅过度产生PapA菌毛蛋白亚单位的质粒pPAP267并且将其引入到锚定含野生型pap操纵子(由负责papA菌毛蛋白表达的11个基因构成)之pPAP5的HB101细胞中,发现PapA的表达是仅具有pPap5时的10倍,而且菌毛也比野生型的长。这示出了共表达的可能性,但是产生的聚合物是同源的,而且没有直接证据证明pPAP5产物是聚合物。
在本研究中,可以通过L-阿拉伯糖浓度的范围(0.02%至2%)来调控Caf1的表达。caf1表达的水平随着L-阿拉伯糖浓度的升高而提高(图61)。在不存在L-阿拉伯糖的情况下,获得的caf1表达水平非常低。TOP10菌株(ara-)可以转运L-阿拉伯糖,但是无法对其进行代谢,这一点对于表达研究是重要的,因为细胞内L-阿拉伯糖的水平是恒定的并且不随时间而降低。
然而,在0.2%D-葡萄糖存在下,未实现对caf1表达的有效抑制。事实上,在一些具有葡萄糖的情况下,细胞生长得更好并且表达更多蛋白质。4.3.2用Caf1WT将Caf1-Flag和Caf1-6His-NT+间隔区共插入到聚合物中
本发明人已经开发了使用上述表达系统共表达Caf1突变体和Caf1WT(caf野生型)的方法。在本研究中,使用针对蛋白质的抗体通过western印迹对Caf1突变体的共表达进行了分析。
Caf1-FLAG与Caf1WT蛋白质共表达,导致产生了混合聚合物。据本发明人所知,这是第一次证明了这种混合聚合物。Zavialov等(21)已经提出了在大肠杆菌中异源表达重组蛋白质的方法。为此,他们制备了编码嵌合蛋白质的基因,其中例如,人白细胞介素-1β被引入到了Caf1信号肽和成熟Caf1亚单位之间,留下了Caf1亚单位的C末端可用于与分子伴侣Caf1M相互作用。但是,该系统不产生聚合物。
在本研究中,通过分子伴侣-引领蛋白系统介导,在大肠杆菌的表面上分泌的Caf1聚合物中检测到了Caf1-FLAG和Caf1-6His-NT间隔区(参见使用单克隆抗FLAG表位抗体的对FLAG表位的western印迹,图62)。进行的western印迹未显示出聚合物中存在不具有间隔区的Caf1-6His-NT。当Caf1WT与其他Caf1突变体(Caf1-PHSRN、Caf1-Cys(除了Q106C)和Caf1-PENFF)表达时,观察到了成功的聚合物形成。
5.交联Caf1水凝胶
使Caf1WT与三种交联剂共价交联,所述三种交联剂含有不同的间隔区臂长度(即,缀合分子之间的距离),以及末端不同数目的相同官能团N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)。
NHS酯与伯胺反应形成共价酰胺键。反应通常在室温下于pH 7.2-8.0的磷酸盐缓冲液中进行0.5小时。伯胺缓冲液(例如Tris-缓冲盐水)不相容,因为它们竞争反应;然而,在一些过程中,在缀合过程结束时添加Tris或甘氨酸缓冲液来淬灭(停止)反应是有用的。反应释放N-羟基琥珀酰亚胺(M.W.115),其可以通过渗析或脱盐容易地除去。
在本研究中,在胶凝(gelation)之后,在胶凝接着冻干之后,本发明人通过常规扫描电子显微法SEM,以及通过环境扫描电子显微术(ESEM)分析了Caf1WT水凝胶。ESEM方法是SEM的变化形式,其在低真空下工作,并且由于通过使用Peltier阶段保持样品温度的恒定来控制室内的水蒸汽压力,其能够保持样品的水合状态。另外,与需要包被样品以避免电荷积累的高真空SEM应用不同,制备样品时可不需要用碳或金进行包被。
5.1实验结果
5.1.1具有不同间隔区臂长度的CAF1WT的交联
使30mg/ml终浓度的Caf1蛋白与3、6、9和15mg/ml终浓度的DTSSP(Pierce)、NHS-PEG-NHS(Creative PAGWorks)和4臂NHS-PEG(Creative PEGWorks)溶液交联,这分别对应于1∶10、1∶5、1∶3、1∶2的交联比(w/w,交联剂:Caf1)。用于交联的方法与制造商的说明书一致。通过SDS-PAGE凝胶、电子透射显微术(TEM)、Caf1水凝胶与进行生存力/细胞毒性测定的哺乳动物细胞的生物相容性以及借助于扫描电子显微术(SEM)的形态研究来分析这些比之下的Caf1水凝胶在胶凝时间、溶胀、交联度方面的特征。
5.1.2胶凝时间
在密封条件下于室温监测Caf1水凝胶的胶凝速率30分钟,每分钟都进行搅拌。表6示出提高DTSSP交联剂的浓度不改变胶凝时间。30分钟后,反应未失去其流动性,例如,当轻轻翻转管时,管中的溶液沿着玻璃试管壁滑动而不是得到了凝胶,因此未确定胶凝时间(“N.D”)。然而,提高NHS-PEG-NHS(本文中也称为“2-臂-PEG-NHS”)的浓度稍微缩短了胶凝时间。通过添加4臂PEG-NHS,观察到胶凝时间更明显地缩短。4臂PEG-NHS的胶凝速率比2臂PEG-NHS快。例如,对于4臂PEG-NHS和NHS-PEG-NHS,最快的胶凝时间分别为2秒和24分钟。不过,仅基于这些简单的观察,我们注意到用不同交联剂交联的所有Caf1水凝胶得到的样品粘度比得上相应Caf1溶液的粘度。
5.1.3溶胀
基于对直径变化(溶胀前的初始直径与通过添加PBS溶胀后的最终直径之间的差异)的分析来测定与不同浓度的DTSSP、NHS-PEG-NHS和4臂PEG-NHS交联之Caf1水凝胶的溶胀,其随着交联剂浓度的降低而增加。对于与DTSSP(1∶10的交联比w/w)交联的Caf1水凝胶,该趋势更加明显。
表6-与DTSSP、NHS-PEG-NHS和4臂PEG-NHS水凝胶交联的Caf1在室温下胶凝时间(≤30分钟)的分析,以及落在塑料表面上的水凝胶的初始直径与添加PBS并且在37℃下孵育之后其最终直径之间的变化百分比。所有数据报道为三个独立实验的平均值百分比±平均值的标准误差(S.E.M)
图67示出与4臂PEG-NHS交联2分钟后的透明Caf1水凝胶(图67-A)以及Caf1水凝胶依赖于交联比的溶胀特性,在1∶10和1∶5时,比1∶3和1∶2时更高(图67-B)。
5.1.4交联度
用三种不同的交联剂处理Caf1聚合物,这些交联剂各自在交联剂的每一个末端具有NHS反应基团。NHS基团在pH 7-8.5时与赖氨酸的伯胺基团反应形成稳定的酰胺键。30分钟后终止反应。在交联之后,将样品在SDS样品缓冲液中于100℃孵育5分钟,并且加样到4-20%梯度聚丙烯酰胺凝胶上用于电泳。图68示出变性的Caf1蛋白样品并且揭示了交联度。在凝胶的底部,观察到了约15kDa的条带,其对应于未交联的单体。在Caf1与DTSSP交联的情况下,在25kDa和37kDa蛋白质标准标志物之间解析了二聚体条带(泳道1-4)。在Caf1与NHS-PEG-NHS交联的情况下,二聚体条带大致与37kDa的蛋白质标准标志物跑齐(泳道5-8)。与4臂PEG-NHS交联的Caf1具有在50kDa和75kDa蛋白质标准标志物之间解析的第二条带(泳道9至12)。其余的高分子量条带不能仅通过SDS-PAGE凝胶分析限定。使用不同交联剂提高交联比减少了Caf1单体级分。
表7示出通过使用image J软件的光密度分析法获得的相对密度的值。对交联级分和未交联级分进行分析。通过用Caf1蛋白样品的量(在不存在交联剂的情况下)减去Caf1蛋白样品(在存在一种交联剂的情况下)未交联级分来确定交联级分的理论值。根据理论值,提高交联剂的浓度增加了Caf1交联级分,并降低了Caf1未交联级分。例外情况是对于以1∶2的质量比与4臂PEG-NHS样品交联的Caf1,其表现为未交联级分和交联级分都降低。理论值高于所获得的交联级分值。
表7-通过ImageJ软件确定的Caf1未交联级分和交联级分相对光密度分析。所有数据报道为三个独立实验的平均值±平均值的标准误差(S.E.M)
*Caf1交联级分=Caf1游离分子-Caf1×交联剂X保持未交联的级分。
图69示出在1∶10的相同分子比(Caf1∶交联剂)下使用短间隔区DTSSP长间隔区NHS-PEG-NHS和具有4臂PEG-NHS的长间隔区交联之Caf1的TEM图像的实例。如上所述制备Caf1水凝胶,在胶凝化和在PBS pH 7.4中溶胀后,将Caf1水凝胶在nanopure水中稀释。通过Jmicrovision版本1.2.5(Roduit,2007)测定形成的水凝胶的大小。画出沿着水凝胶网格(水凝胶片)的周长的线。使用SPSS版本19构建图表。
TEM图像示出与DTSSP交联的Caf1水凝胶的小片,其具有76nm的平均大小和10至300nm的均匀的大小分布范围。与NHS-PEG-NHS交联的Caf1水凝胶具有393nm的平均大小和更加分散的大小分布,网格大小为10nm至600nm。与4臂PEG-NHS交联的Caf1水凝胶表现出254nm的平均大小和约20nm至1500nm的极端大小分布。
6生存力和细胞毒性测定
使用生存力/细胞毒性测定(Promega)评估细胞生存力和所使用材料的细胞毒性。第一部分测定同时测量两种蛋白酶活性:一种是细胞生存力的标志物,而另一种是细胞毒性的标志物。活细胞蛋白酶活性限于完整的活细胞,并且使用荧光细胞渗透性肽底物(甘氨酰基苯基丙氨酰基-氨基氟香豆素;GF-AFC)测量。所述底物进入完整细胞并且通过活细胞蛋白酶活性被切割产生与活细胞数量成比例的荧光信号。在失去细胞膜完整性之后,这种活细胞蛋白酶失活并且泄露到周围的培养基中。其次,使用荧光细胞非渗透性肽底物(双-丙氨酰基丙氨酰基-苯基丙氨酰基-若丹明110;双-AAF-R110)测量从失去膜完整性的细胞中释放的死细胞蛋白酶活性。由于双-AAF-R110不是细胞渗透性的,因此完整的活细胞基本不产生来自该底物的信号。
使用标准培养技术将大鼠原代成骨细胞培养在Caf1水凝胶(根据本发明制备)的表面上。24小时后,通过生存力/细胞毒性测定(Promega)测定生存力和膜完整性,其中使用荧光细胞渗透性肽底物(甘氨酰基苯基丙氨酰基-氨基氟香豆素;GF-AFC)测量完整的活细胞蛋白酶活性,并且通过细胞非渗透性肽底物(双-丙氨酰基丙氨酰基-苯基丙氨酰基-若丹明110;双-AAF-R110)测量死细胞蛋白酶活性。表8示出附着在Caf1水凝胶上的大鼠原代成骨细胞的生存力和细胞毒性百分比。通过70-80%生存力和低的细胞毒性百分比,证明了Caf1水凝胶上细胞耐受的2D培养。
表8-当附着在与以不同比与不同交联剂交联的Caf1水凝胶上时的细胞生存力和细胞毒性百分比
7.包含与4臂PEG-NHS交联的caf1聚合物的水凝胶
探究了Caf1聚合物与4臂PEG-NHS交联以形成水凝胶的能力。图70示出与4臂PEG-NHS交联的单体循环排列变换(circularly permuted)的Caf1变化(cpCaf1)(22)和Caf1聚合物二者以及仅单独4臂PEG-NHS和Caf1的TEM图像。
TEM图像(图70)显示与4臂PEG-NHS交联的单体循环排列变换的Caf1变化(cpCaf1)(22)不形成明显的凝胶样结构。仅观察到通过圆圈指示的非常小的结构。另外,单独4臂PEG-NHS和单独Caf1二者均不形成大的水凝胶网络。使用以不同交联比(w/w)与4臂PEG-NHS交联的Caf1聚合物使这些水凝胶网络开始明显的一些实例。
在上述胶凝之后,将以1∶3000000、1∶300000、1∶30000、1∶3000、1∶300、1∶60和1∶30的多种交联比(Caf1∶交联剂,w/w)与4臂PEG-NHS交联的Caf1聚合物样品在SDS样品缓冲液中于100℃加热5分钟,并且加样到SDS-PAGE上。扫描凝胶并且如上所述通过ImageJ版本1.46进行分析。通过ImageJ或示出在表9中的Caf1未交联级分来确定对应于Caf1交联级分的值。Caf1交联级分随交联剂浓度的升高而增加。
表9-通过ImageJ软件确定的Caf1未交联级分和交联级分的相对光密度分析。所有数据报道为三个独立实验的平均值±平均值的标准误差(S.E.M)
*Caf1交联级分=Caf1游离分子-Caf1×交联剂X保持未交联的级分。
TEM图像(图71)示出以1∶10(w/w,Caf1∶交联剂)与4臂PEG-NHS交联的Caf1聚合物形成了比图70中更稠的水凝胶结构。然而,所形成的水凝胶具有尺寸比100nm小得多的孔的广泛分布。随着交联剂的增加,水凝胶的结构变得更加紧密。在1∶2的比之下,水凝胶表现为具有不可见孔的无定形结构。
7.1通过扫描电子显微术(SEM)的Caf1水凝胶形态
图72示出以1∶3的比与4臂PEG-NHS交联的Caf1水凝胶具有非常紧密的结构,因此未确定孔的直径。然而,它们似乎是纳米级别的。第一SEM图像示出Caf1水凝胶被分成了多个片。接下来的SEM图像揭示了这些Caf1水凝胶片的内部。
图73示出表现为网格样构造的Caf1冻干水凝胶,其呈现3μm至22μm的孔径,平均孔径为8±0.003μm。
通过ESEM可视化未处理的水合Caf1水凝胶。在ESEM中,水凝胶暴露于最低干燥的饱和水蒸气环境,其允许研究天然水合状态下的水凝胶的孔结构。水合Caf1水凝胶表现出100nm至600nm的纳米孔。平均孔大小为约300±0.005nm,但是观察到的大小分布似乎相对较宽。Caf1蛋白水凝胶的空隙空间大于脱水Caf1水凝胶(图72)。
8通过SEM的Caf1水凝胶上的哺乳动物细胞形态
使用标准培养条件将小鼠3T3成纤维细胞和大鼠原代成骨细胞培养在根据本发明制备的Caf1WT水凝胶的表面上。24h小时后,将细胞固定在2%戊二醛中、脱水并且用金包被以通过常规SEM可视化。在2D培养中,与成骨细胞相比,更多成纤维细胞表现出延长的形态(图75)。大部分成骨细胞表现为圆形形态,仅少量细胞表现为明显展开在包被有Caf1水凝胶的表面上。用于产生水凝胶的Caf1是不具有粘附特性的WTcaf1(如本文讨论的)。从本文示出的数据可以推断,向WT caf1中引入RGD型基序可提高成纤维细胞的相互作用。重要地是,本发明人在这一阶段已经表明凝胶是无细胞毒性的。
9实施例5至8的一般讨论
9.1与4臂PEG-NHS交联的Caf1蛋白形成了凝胶样物质
使用管翻转(tube-inversion)法在室温下制备Caf1水凝胶。胶凝时间视觉上估计对于NHS-PEG-NHS为24至27分钟,而对于4臂PEG-NHS为2至22分钟,取决于交联剂的浓度。这两种交联剂的浓度越高,胶凝时间越短。Caf1与不同浓度DTSSP的反应由于不能观察到固体凝胶所以不允许在视觉上评估胶凝时间(表6)
因此,与NHS-PEG-NHS和DTSSP相比,4臂PEG-NHS的胶凝速率显著更快。4臂PEG-NHS的胶凝速率的提高可能是由于4臂PEG的结构影响其与Caf1的伯胺基反应的能力。
本文提供的数据表明4臂PEG-NHS的结构对于在数分钟内形成凝胶是重要的。以1∶5、1∶3和1∶2的比(w/w)与4臂PEG-NHS交联的Caf1蛋白分别在5、4和2分钟形成水凝胶(表6)。不过,使用相同的蛋白质:交联剂比和在密封条件下,与DTSSP交联的Caf1蛋白即使在30分钟后依然不是凝胶样物质(表9)。根据可得到的文献以及产品说明书中的描述,确定交联反应时间为30分钟。交联剂在链的末端含有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯,其立即与蛋白质的伯胺(-NH2)反应,并且可在水相溶液中迅速水解。
与线性PEG-NHS(NHS-PEG-NHS)交联的Caf1水凝胶在相同比和制备条件下,形成水凝胶的效率较低。在这种情况下,胶凝时间比与4臂PEG-NHS交联慢(表6)。可能是,在胶凝过程中Caf1与DTSSP或NHS-PEG之间的反应需要额外的时间以形成更紧密的结构。
本文报道的胶凝时间为分钟级别,其比得上使用PEG水凝胶的其他研究。
9.2溶胀
与DTSSP、NHS-PEG-NHS和4臂PEG-NHS交联的Caf1水凝胶滴(drop)的直径随着添加至反应的交联剂的增加而几乎不变。这意味着如果提高交联剂的浓度,则所测量滴的初始直径与在37℃下的PBS中16小时后同一滴的最终直径之间的差异较小,那么,两个直径之间的差异与初始直径的比就比如果我们添加较少交联剂来与Caf1聚合物反应时的比小,即,具有较低交联剂浓度的Caf1水凝胶将比具有较高浓度交联剂的Caf1水凝胶展开得更小。
相比之下,例如,以1∶10的交联比与DTSSP交联的Caf1水凝胶的直径变化(61.2%)比使用相同的交联比与NHS-PEG-NHS(40.3%)和4臂PEG-NHS(24.2%)交联的Caf1水凝胶的二者的直径变化都要大(表6)。不受该理论的限制,该结果表明水凝胶溶胀是交联剂网络结构的函数,这与之前的研究一致。
9.3与4臂PEG-NHS交联的Caf1水凝胶表现出更高的交联度(图68)
在Caf1水凝胶于室温交联30分钟后,将10μl的每一水凝胶在SDS样品缓冲液的存在下于100℃加热5分钟,并加样到4-20%梯度凝胶上,以及以相同浓度使用不具有任何交联剂的对照Caf1蛋白以形成Caf1水凝胶。用卡马斯亮蓝对凝胶染色、扫描并且通过ImageJ版本1.46软件进行分析。将对应于未交联的Caf1样品(对照)中之Caf1单体的约15kDa的条带在随后分析中用作参考。测定与不同交联剂以不同浓度交联的Caf1样品中Caf1单体条带的相对密度。对于每个样品所获得的值与对于参考样品所获得的值之间的比使得能够确定每一条待计算条带的相对密度。由于存在对应于Caf1单体的约15kDa的单个条带,因此使用单体的计算比使用二聚体、三聚体等的相对量的计算更精确。因为高分子量条带相对密度的计算更复杂。这些被认为是单个条带并且设计为“Caf1交联级分”。
在凝胶的底部,约15kDa的条带应当对应于未交联的Caf1单体。在Caf1与DTSSP交联的情况下,在25kDa和37kDa蛋白质标准标志物之间解析的条带可能对应于通过一分子DTSSP(608.51Da)连接的Caf1二聚体(35kDa)(泳道1-4)。在Caf1与NHS-PEG-NHS交联的情况下,具有约37kDa的蛋白质标准标志物的条带可能对应于通过一分子NHS-PEG-NHS(10kDa)连接的Caf1二聚体(泳道5-8)。与4臂PEG-NHS交联的Caf1具有在50kDa和75kDa蛋白质标准标志物之间解析的第二条带,其可能对应于通过一分子4臂PEG-NHS(20kDa)连接的Caf1二聚体(35kDa)(泳道9至12)。其余的高分子量条带不能仅通过SDS-PAGE凝胶分析限定。在使用不同交联剂提高交联比减少了Caf1单体级分。测定由Caf1和交联剂形成之复合物的质量的一种更精确技术可以是质谱,但是改变附着到单体的交联剂的水平将使其变得困难。
通过从Caf1参考中减去所分析的每一样品之Caf1未交联级分的值来计算交联级分的理论值。随着交联剂浓度的增加,Caf1交联级分也增加。在最高浓度的4臂PEG-NHS(20000Da)的情况下,高分子量的Caf1交联级分不被允许完全地通过梯度凝胶,因此计算的Caf1交联级分的值(0.28)高于计算的理论值(0.84)。
9.4与DTSSP交联的Caf1水凝胶表现出高度紧密的结构,然而NHS-PEG-NHS和4臂PEG-NHS形成了多孔骨架。高浓度4臂PEG-NHS导致了更加紧密的结构(图69至71)
与短臂长交联剂(例如DTSSP)交联的Caf1聚合物促进了Caf1纤维之间的更紧密接触,并提高了Caf1自组装的概率。因此,通过TEM获得的图像显示了紧密的Caf1水凝胶,其反映了这种Caf1纤维的接近(图69-A)。
与可以更好地分隔Caf1纤维的长间隔区NHS-PEG-NHS交联的Caf1聚合物获得了不同的结果。通过TEM观察到了大的Caf1水凝胶网格(图69-B)。
当使用具有分别含有官能团(NHS)的4条臂的甚至更长的间隔区时,由于可用于反应的NHS基团和Caf1上赖氨酸残基的数目,Caf1与4臂PEG-NHS之间的相互作用频繁。在NHS-PEG-NHS上,结构更致密(图69-C)。TEM观察显示了水凝胶网格(水凝胶片)。不受该理论的约束,这可能是由于:(1)用于TEM分析的水凝胶的制备;(2)Caf1聚合物长度的差异;(3)通过Caf1和交联剂反应获得的交联位点的数目(图69)。可能大的水凝胶网格是由于Caf1聚合物和交联剂之间形成的化学相互作用的高稳定性。似乎与NHS-PEG-NHS交联的Caf1水凝胶比与4臂PEG-NHS交联的Caf1水凝胶更稳定和更柔韧,后者形成了具有更多交联位点的更硬的网络。
由于形成了凝胶样网络的事实,因此对4臂PEG-NHS进一步表征。
Soliakov及其同事(10)发现仅由Caf1获得的Caf1水凝胶为至多约1.5μm长的聚合形式,其由许多单体构成,这些单体各自含有8个赖氨酸,所述赖氨酸可与存在于交联剂末端的NHS官能团相互作用。在Caf1单体形式中,就如在仅4臂PEG-NHS的其他对照中那样,看不到这种大的网络(图70)。圆圈指示的小点可能对应于Soliakov及其同事(10)分析的为Caf1单体的珠样结构。
不受该理论的限制,高度多孔的水凝胶(图71)可有利地溶胀和吸取水,并且作为用于细胞培养的骨架也可允许营养物、氧气通过孔。TEM图像确认了Caf1水凝胶的形成依赖于交联剂浓度和结构。
9.5根据所使用的技术,Caf1水凝胶表现出不同的孔径(图73和74)
通过SEM和ESEM评估Caf1水凝胶的孔径。通过临界点干燥制备用于通过SEM分析的样品,并且使用有差异的乙醇浓度脱水,其可能造成网络的一些倒塌。获得的孔径为纳米级别,而冻干的水凝胶表现出8±0.003μm平均孔径的更大孔(可以参见图73)。
然后通过ESEM分析Caf1水凝胶以避免脱水过程。图像显示出了具有300nm平均孔径的网格样网络结构(可以参见图74)。
9.6Caf1WT水凝胶对于细胞是无毒的,但是促进低的细胞粘附
通过测量细胞生存力以及在包被有与4臂PEG-NHS(w/w交联比为1∶2)交联的Caf1水凝胶的玻璃盖玻片表面上的展开来检查细胞水凝胶相互作用。接种在Caf1水凝胶上的活原代成骨细胞表现出很少的延长的扩展,且大部分细胞为圆形。未测试小鼠3T3成纤维细胞的生存力。不过,明显的是,当接种在Caf1水凝胶上时,更多成纤维细胞表现为延长的形态。可通过添加细胞粘附肽(例如,RGDS)以及并入蛋白水解降解位点(例如金属蛋白酶切割位点)来提高细胞的粘附和展开。
在本申请的整个说明书和权利要求书中,词语“包括”和“包含”及其变化形式意指“包括但不限于”,并且其并不旨在(并且也未)排除其他部分、添加物、组分、整体或步骤。在本申请的整个说明书和权利要求书中,未用数量词限制的名词也包括复数,除非上下文另有需要。具体地,当使用不定冠词时,应将本申请理解为包括复数以及单数,除非上下文另有需要。
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读者应注意与本申请同时或在本申请之前提交的与本申请相关的所有文件和文献以及与本申请一起向公众查阅开放的文件和文献,并且所有这些文件和文献的内容都通过引用而并入本文。
参考文献
1-Abramov,V.M.,Vasiliev,A.M.,Khlebnikov,V.S.,Vasilenko,R.N.,Kulikova,N.L.,Kosarev,I.V.,Ishchenko,A.T.,Gillespie,J.R.,Millett,I.S.,Fink,A.L.and Uversky,V.N.(2002)Structural and functional properties of Yersinia pestis Caf1 capsular antigen andtheir possible role in fulminant development of primary pneumonic plague.J ProteomeRes.1(4):307-15
2-Galyov,E.E.,Smirnov,Oyu,Karlishev,A.V.,Volkovoy,K.I.,Denesyuk,A.I.,Nazimov,I.V.,Rubtsov,K.S.,Abramov,V.M.,Dalvadyanz,S.M.and Zav’yalov,V.P.(1990)Nucleotide sequence of the Yersinia pestis gene encoding F1 antigen and the primarystructure of the protein.Putative T and B cell epitopes.FEBS Lett..277(1-2):230-2
3-Garmory,H.S.,Leckenby,M.W.,Griffin,K.F.,Elvin,S.J.,Taylor,R.R.,Hartley,M.G.,Hanak,J.A.J.,Williamson,E.D.And Cranenburgh,R.M.(2005)Antibiotic-FreePlasmid Stabilization by Operator-Repressor Titration for Vaccine Delivery by Using LiveSalmonella nteric Serovar Typhimurium.Infection and immunity.73(4):2005-2011
4-Greene,L.A.And Tischler,A.S.(1976)Establishment of a Noradrenergic Clonal Lineof Rat Adrenal Pheochromocytoma Cells Which Respond to Nerve Growth Factor.ProcNatl Acad Sci U S A.73(7):2424-8.
5-Hung,D.L.,Knight,S.D.,Woods,R.M.,Pinkner,J.S.and Huitgren,S.J.(1996)Moiecular basis of two subfamilies of immunogiobulin-like chaperones.EMBO Journal.15(15)3792-3805.
6-Lindler,L.E.,and Tall,B.D.(1993)Yersinia pestis Ph 6 antigen forms fimbriae and isinduced by intracellular association with macrophages.Molecular Microbilogy 8(2).311-324.
7-Lutolf,M.P.(2009)Integration column:Artificial ECM:expanding the cell biologytoolbox in 3D.Integrative Biology.1(3):235-241
8-Miller J.,Williamson E.D.,Lakey J.H.,Pearce M.J.,Jones S.M.,Titball R.W.Macromolecular organisation of recombinant Yersinia pestis F1 antigen and the effect ofstructure on immunogenicity.(1998)FEMS Immunol Med Microbiol.21(3):213-21
9-Moron M.,Garmory H.S.,Perkins S.D.,O’Dowd A.M.,Griffin K.F.,Turner A.K.,Bennett A.M.,Titball R.W.(2004)A Salmonella nteric serovar Typhi vaccine expressingYersinia pestis F1 antigen on its surface provides protection against plague inmice.Vaccine.22(20):2524-32.
10-Soliakov A.,Harris J.R.,Watkinson A.,Lakey J.H.(2010)The structure of Yersiniapestis Caf1 polymer in free and adjuvant bound states.Vaccine.28(35):5746-54.
11-Tibbitt,M.,Anseth,K.S.(2009) Hydrogels as Extracellular Matrix mimics for 3D cellculture.Biotechnology and Bioenginnering.103(4):655-663
12-Titball R.W.,Howells A.M.,Oyston P.C.,Williamson E.D.(1997)Expression of theYersinia pestis capsular antigen (F1 antigen) on the surface of an aroA mutant ofSalmonella typhimurium induces high levels of protection against plague.InfectiousImmunology.65(5):1926-30
13-Williams,R.C.,Gewurz,H.And Quie,P.G.(1972)Effects of fraction 1 from Yersiniapestison phagocytosis in vitro.Journal of infectious diseases.126(3):235-241.
14-Zaviolov,A.V.,Kersley,J.,Korpela,T.,V.P.,Maclntyre,S.and Knight,S.D(2002)Donor strand complementation mechanism in the biogenesis of non-pilus systems.Molecular Microbiology.45(4):983-995.
15-Zavialov,A.V.and Knight,S.D.(2007)A novel self-capping mechanism controlsaggregation of periplasmic chaperone Caf1M.Molecular Microbiology.64(1):153-164.
16-Baga,M.,Norgren,M.& Normark,S.(1987).BIOGENESIS OF ESCHERICHIA-COLIPAP PILl-PAPH,A MINOR PILIN SUBUNIT INVOLVED IN CELL ANCHORING ANDLENGTH MODULATION.Cell49,241-251.
17-Zavialov,A.V.,Batchikova,N.V.,Korpela,T.,Petrovskaya,L.E.,Korobko,V.G.,Kersley,J.,Maclntyre,S.&Zav′yalov,V.P.(2001).Secretion of recombinant proteins viathe chaperone/usher pathway in Escherichia coli.Applied and Environmental Microbiology67,1805-1814.
18-Piatek,R.,Zalewska,B.,Bury,K.and Kur,J.(2005)′The chaperone-usher pathway ofbacterial adhesin biogenesis-from molecular mechanism to strategies of anti-bacterialprevention and modem vaccine design′,Acta Biochimica Polonica,52(3),pp.639-646.
19-Scheich,Christoph;Kummel,Daniel;Soumailakakis,Dimitri;Heinemann,Udo;Bussow,Konrad(2007)“Vectors for co-expression of an unrestricted number of proteins.”Nucleic acids research,vol35,issue6
20-Guzman,Lm;Belin, D;Carson,Mj;et al.(1995)“Tight regulation,modulation,andhigh-level expression by vectors containing the arabinose p-bad promoter”journal ofbacteriology Volume:177 Issue:14 Pages:4121-4130
21-Zavialov,AV;Batchikova,NV;Korpela,T;etal.(2001)-“Secretion of recombinantproteins via the chaperone/usher pathway in Escherichia coli”,Applied And EnvironmentalMicrobiology,Volume:67 Issue:4 Pages:1805-1814.
22-Chalton,D.A.,Musson,J.A.,Flick-Smith,H.,Walker,N.,McGregor,A.,Lamb,H.K.,Williamson,E.D.,Miller,J.,Robinson,J.H.and Lakey,J.H.(2006)′Immunogenicity of aYersinia pestis vaccine antigen monomerized by circular permutation′,Infection andImmunity,74(12),pp.6624-6631.
以下编号的段落中描述了本发明的另一些实施方案:
段落1.含有外源生物活性序列的分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体。
段落2.根据段落1所述的多肽,其中所述多肽是FG环长家族多肽单体。
段落3.根据段落2所述的多肽,其中所述多肽选自Caf1、Saf1和Afa/Dr。
段落4.根据段落3所述的多肽,其中所述多肽是Caf1多肽。
段落5.根据段落4所述的多肽,其中所述多肽与SEQ ID NO:5的多肽具有至少70%同一性。或者所述多肽与缺少前21个氨基酸残基之SEQID NO:5的多肽具有至少70%同一性。
段落6.根据段落1所述的多肽,其中所述多肽是FG环短家族多肽单体。
段落7.根据段落6所述的多肽,其中所述多肽选自Fim和Pap。
段落8.根据段落1至7中任一项所述的多肽,其中所述生物活性序列选自细胞粘附识别基序、生长因子序列基序和蛋白酶位点。
段落9.根据段落8所述的多肽,其中所述生物活性序列是细胞粘附识别基序。
段落10.根据段落9所述的多肽,其中所述细胞粘附识别基序是胞外基质细胞粘附识别基序。
段落11.根据段落10所述的多肽,其中所述细胞粘附识别基序来自胶原蛋白、弹性蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白、骨桥蛋白、玻连蛋白或生腱蛋白。
段落12.根据段落11所述的多肽,其中所述细胞粘附识别基序包含氨基酸序列RGD。
段落13.根据段落11所述的多肽,其中所述细胞粘附识别基序包含氨基酸序列PHSRN。
段落14.根据段落1至13中任一项所述的多肽,其中所述生物活性序列包含在所述多肽中这样的位点处,所述位点包含在所述多肽折叠后的环结构内。
段落15.分子伴侣/引领蛋白家族聚合物,其包含根据段落1至14中任一项所述的至少一种分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体。
段落16.根据段落15所述的分子伴侣/引领蛋白家族聚合物,其中所述聚合物是级分1抗原聚合物,并且所述至少一种分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体是CAF1多肽单体.
段落17.根据段落15或段落16所述的分子伴侣/引领蛋白家族聚合物,其中所述外源生物活性序列是含有氨基酸序列RGD的细胞粘附识别基序。
段落18.根据段落15至17中任一项所述的分子伴侣/引领蛋白家族聚合物,其还包含至少一种天然存在的CAF1多肽单体。
段落19.根据段落18所述的分子伴侣/引领蛋白家族聚合物,其中所述至少一种天然存在的CAF1多肽单体是鼠疫耶尔森氏菌CAF1多肽。
段落20.根据段落19所述的分子伴侣/引领蛋白家族聚合物,其中所述鼠疫耶尔森氏菌CAF1多肽具有SEQ ID NO:5的多肽序列。或者,所述鼠疫耶尔森氏菌CAF1多肽具有缺少前21个氨基酸残基之SEQ IDNO:5的多肽序列。
段落21.根据段落15至20中任一项所述的分子伴侣/引领蛋白家族聚合物,其还包含根据权利要求1至14中任一项所述的至少一种另外的多肽单体,其中所述至少一种另外的多肽单体的所述外源生物活性序列不同于所述至少一种分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体的所述外源生物活性序列。
段落22.根据段落21所述的分子伴侣/引领蛋白家族聚合物,其中所述至少一种分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体的所述外源生物活性序列是含有氨基酸序列RGD的细胞粘附识别基序,并且其中所述至少一种另外的多肽单体的所述外源生物活性序列是含有氨基酸序列PHSRN的细胞粘附识别基序。
段落23.水凝胶,其包含根据段落1至14中任一项所述的多肽或根据段落15至22中任一项所述的分子伴侣/引领蛋白家族聚合物。
段落24.根据段落23所述的水凝胶,其还包含交联剂。
段落25.根据段落24所述的水凝胶,其中所述交联剂是生物可降解交联剂。
段落26.根据段落24所述的水凝胶,其中所述交联剂是不可降解的交联剂。
段落27.根据段落24所述的水凝胶,其中所述交联剂包含聚乙二醇。
段落28.根据段落24至27中任一项所述的水凝胶用作细胞支持骨架的用途。
段落29.根据段落28所述的用途,其中所述骨架是2D细胞支持骨架。或者,所述骨架是1D细胞支持骨架。
段落30.根据段落28所述的用途,其中所述骨架是3D细胞支持骨架。
段落31.伤口敷料,其包含根据段落23至27中任一项所述的水凝胶。
段落32.根据段落23至27中任一项所述的水凝胶,其用于处理伤口。
段落33.根据段落32所用的水凝胶,其中所述伤口是慢性伤口,或者其中所述伤口是急性伤口。
段落34.眼植入物,其包含根据段落23至27中任一项所述的水凝胶。
段落35.根据段落23至27中任一项所述的水凝胶,其用于治疗眼损伤。
段落36.用于产生分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体的表达载体,其包含有效连接的以下元件:
a)转录启动子元件;
b)编码含有外源生物活性序列之分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体的核酸分子;以及
c)转录终止子。
段落37.根据段落36所述的表达载体,其中编码含有外源生物活性序列之分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体的所述核酸分子编码CAF1多肽单体。
段落38.根据段落37所述的表达载体,其中所述外源生物活性序列是细胞粘附识别基序。
段落39.根据段落37或段落38所述的表达载体,其中所述核酸分子与SEQ ID NO:1的核苷酸序列具有至少70%同一性。
段落40.根据段落36至39中任一项所述的表达载体,其还包含编码分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体特异性之周质分子伴侣的核酸分子。
段落41.根据段落40所述的表达载体,其中编码分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体特异性之周质分子伴侣的所述核酸分子编码CAF1特异性的周质分子伴侣。
段落42.根据段落41所述的表达载体,其中编码CAF1特异性之周质分子伴侣的所述核酸分子与SEQ ID NO:2的核苷酸序列具有至少70%同一性。
段落43.根据段落36至42中任一项所述的表达载体,其还包含编码分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体特异性之外膜引领蛋白的核酸分子。
段落44.根据段落43所述的表达载体,其中编码分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体特异性之外膜引领蛋白的所述核酸分子编码CAF1特异性的外膜引领蛋白。
段落45.根据段落44所述的表达载体,其中编码CAF1特异性之外膜引领蛋白的所述核酸分子与SEQ ID NO:3的核苷酸序列具有至少70%同一性。
段落46.根据段落36至45中任一项所述的表达载体,其还包含编码分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体特异性之表达调控蛋白的核酸分子。
段落47.根据段落46所述的表达载体,其中编码分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体特异性之表达调控蛋白的所述核酸分子编码CAF1特异性的表达调控蛋白。
段落48.根据段落47所述的表达载体,其中编码CAF1特异性之表达调控蛋白的所述核酸分子与SEQ ID NO:4的核苷酸序列具有至少70%同一性。
段落49.用根据段落36至48中任一项所述的表达载体宿主转化的宿主细胞。
段落50.根据段落49所述的宿主细胞,其中所述细胞是细菌细胞。
段落51.根据段落50所述的宿主细胞,其中所述细菌细胞是革兰氏阴性细菌细胞。
段落52.根据段落51所述的宿主细胞,其中所述细菌细胞是大肠杆菌。
段落53.用于产生包含至少一种含有外源生物活性序列之分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体的分子伴侣/引领蛋白家族聚合物的方法,所述方法包括:
i)将编码含有外源生物活性序列之分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体的核酸分子并入用于在宿主细胞中表达的表达载体中;以及
ii)用所述表达载体转染宿主细胞;
其中向所述宿主细胞提供编码分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体特异性之周质分子伴侣的核酸分子和编码分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体特异性之外膜引领蛋白的核酸分子,并且其中得到的经转染宿主细胞产生分子伴侣/引领蛋白家族聚合物。
段落54.根据段落53所述的方法,其中所述分子伴侣/引领蛋白家族聚合物是级分1抗原聚合物,并且所述至少一种含有外源生物活性序列的分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体是CAF1多肽单体。
段落55.根据段落54所述的方法,其中编码含有外源生物活性序列之CAF1多肽单体的所述核酸分子与SEQ ID NO:1的核苷酸序列具有至少70%同一性。
段落56.根据段落54或段落55所述的方法,其中编码分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体特异性之周质分子伴侣的所述核酸分子编码CAF1特异性的周质分子伴侣,并且其中编码分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体特异性之外膜引领蛋白的所述核酸分子编码CAF1特异性的外膜引领蛋白。
段落57.根据段落56所述的方法,其中编码CAF1特异性之周质分子伴侣的所述核酸分子与SEQ ID NO:2的核苷酸序列具有至少70%同一性。
段落58.根据段落56或段落57所述的方法,其中编码CAF1特异性之外膜引领蛋白的所述核酸分子与SEQ ID NO:3的核苷酸序列具有至少70%同一性。
段落59.根据段落56至58中任一项所述的方法,其中如下向所述宿主细胞提供编码CAF1特异性之周质分子伴侣的所述核酸分子:
i)将编码CAF1特异性之周质分子伴侣的所述核酸分子并入用于在宿主细胞中表达的表达载体中;以及
ii)用所述表达载体转染宿主细胞。
段落60.根据段落59所述的方法,其中所述表达载体还包含编码含有细胞粘附识别基序之CAF1多肽单体的核酸分子。
段落61.根据段落59至60中任一项所述的方法,其中如下向所述宿主细胞提供编码CAF1特异性之外膜引领蛋白的所述核酸分子:
i)将编码CAF1特异性之外膜引领蛋白的所述核酸分子并入用于在宿主细胞中表达的表达载体中;以及
ii)用所述表达载体转染宿主细胞。
段落62.根据段落61所述的方法,其中所述表达载体还包含编码含有细胞粘附识别基序之CAF1多肽单体的核酸分子和/或编码CAF1特异性之周质分子伴侣的核酸分子。
段落63.根据段落53至62中任一项所述的方法,其中还向所述宿主细胞提供编码分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体特异性之表达调控子的核酸分子。
段落64.根据段落63所述的方法,其中编码分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体特异性之表达调控子的所述核酸分子编码CAF1特异性的表达调控子。
段落65.根据段落63或段落64所述的方法,其中编码CAF1特异性之表达调控子的所述核酸分子与SEQ ID NO:4的核苷酸序列具有至少70%同一性。
段落66.根据段落53至65中任一项所述的方法,其中所述生物活性序列是细胞粘附识别基序。
段落67.根据段落53至66中任一项所述的方法,其中所述宿主细胞是细菌细胞。
段落68.根据段落67所述的方法,其中所述细菌细胞是革兰氏阴性细菌细胞。
段落69.根据段落68所述的方法,其中所述细菌细胞是大肠杆菌。
段落70.用于产生包含至少一种含有外源生物活性序列之分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体的分子伴侣/引领蛋白家族聚合物的方法,所述方法包括:
i)提供容器,所述容器包含根据段落49至52中任一项所述的宿主细胞;
ii)提供有利于所述容器中包含的细胞培养物表达分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体的细胞培养条件;以及任选地
iii)从所述容器中收集分子伴侣/引领蛋白家族聚合物。
段落71.级分1抗原聚合物作为防污剂的用途。
段落72.防污组合物,其包含级分1抗原聚合物。
段落73.参考附图的本文所述分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体。
段落74.参考附图的本文所述分子伴侣/引领蛋白家族聚合物。
段落75.参考附图的本文所述水凝胶。
段落76.参考附图的本文所述伤口敷料。
段落77.参考附图的本文所述伤口敷料。
段落78.参考附图的本文所述眼植入物。
段落79.参考附图的本文所述表达载体。
段落80.参考附图的本文所述转化的宿主细胞。
段落81.参考附图的本文所述用于产生分子伴侣/引领蛋白家族聚合物的方法。
Claims (64)
1.分子伴侣/引领蛋白家族聚合物,其包含至少一种分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体,其中所述至少一种分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体含有外源生物活性序列。
2.根据权利要求1所述的分子伴侣/引领蛋白家族聚合物,其中所述生物活性序列基本上无免疫原性。
3.根据权利要求1或2所述的分子伴侣/引领蛋白家族聚合物,其中所述单体基本上不含天然存在的粘附基序。
4.根据前述权利要求中任一项所述的分子伴侣/引领蛋白家族聚合物,其中所述单体是FG环长家族多肽单体。
5.根据权利要求4所述的分子伴侣/引领蛋白家族聚合物,其中所述单体选自Caf1、Saf1和Afa/Dr。
6.根据权利要求5所述的分子伴侣/引领蛋白家族聚合物,其中所述单体是Caf1多肽。
7.根据权利要求6所述的分子伴侣/引领蛋白家族聚合物,其中所述单体与SEQ ID NO:5的多肽具有至少70%同一性。
8.根据权利要求1至3中任一项所述的分子伴侣/引领蛋白家族聚合物,其中所述单体是FG环短家族多肽单体。
9.根据权利要求8所述的分子伴侣/引领蛋白家族聚合物,其中所述单体选自Fim和Pap。
10.根据前述权利要求中任一项所述的分子伴侣/引领蛋白家族聚合物,其中所述生物活性序列选自细胞粘附识别基序、生长因子序列基序和蛋白酶位点。
11.根据权利要求10所述的分子伴侣/引领蛋白家族聚合物,其中所述生物活性序列是细胞粘附识别基序。
12.根据权利要求11所述的分子伴侣/引领蛋白家族聚合物,其中所述细胞粘附识别基序是胞外基质细胞粘附识别基序。
13.根据权利要求11所述的分子伴侣/引领蛋白家族聚合物,其中所述细胞粘附识别基序选自胶原蛋白、弹性蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白或生腱蛋白。
14.根据权利要求13所述的分子伴侣/引领蛋白家族聚合物,其中所述细胞粘附识别基序包含氨基酸序列RGD。
15.根据权利要求13所述的分子伴侣/引领蛋白家族聚合物,其中所述细胞粘附识别基序包含氨基酸序列PHSRN。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的分子伴侣/引领蛋白家族聚合物,其中所述生物活性序列包含在所述单体内这样的位点处,所述位点包含在所述多肽折叠后的环结构内。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的分子伴侣/引领蛋白家族聚合物,其中所述聚合物是级分1抗原聚合物,并且所述至少一种分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体是CAF1多肽单体。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的分子伴侣/引领蛋白家族聚合物,其中所述聚合物包含至少一种另外的分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体,其中所述另外的分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体与所述含有外源生物活性序列的至少一种分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体至少有一个氨基酸不同。
19.根据权利要求18所述的分子伴侣/引领蛋白家族聚合物,其中所述另外的分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体是不具有所述外源生物活性序列的前述权利要求所述分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体。
20.根据权利要求18或19所述的分子伴侣/引领蛋白家族聚合物,其中所述另外的分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体是天然存在的CAF1多肽单体。
21.根据权利要求20所述的分子伴侣/引领蛋白家族聚合物,其中所述至少一种天然存在的CAF1多肽单体是鼠疫耶尔森氏菌(Yersiniapestis)CAF1多肽。
22.根据权利要求21所述的分子伴侣/引领蛋白家族聚合物,其中所述鼠疫耶尔森氏菌CAF1多肽具有SEQ ID NO:5的多肽序列。
23.根据权利要求18所述的分子伴侣/引领蛋白家族聚合物,其中所述另外的分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体包含这样的外源生物活性序列,其不同于所述至少一种分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体的所述外源生物活性序列。
24.根据权利要求23所述的分子伴侣/引领蛋白家族聚合物,其中所述至少一种分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体的所述外源生物活性序列是包含氨基酸序列RGD的细胞粘附识别基序,并且其中所述至少一种另外的分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体的所述外源生物活性序列是包含氨基酸序列PHSRN的细胞粘附识别基序。
25.水凝胶,其包含根据权利要求1至24中任一项所述的分子伴侣/引领蛋白家族聚合物。
26.根据权利要求25所述的水凝胶,其还包含交联剂。
27.根据权利要求26所述的水凝胶,其中所述交联剂是生物可降解交联剂。
28.根据权利要求26所述的水凝胶,其中所述交联剂是不可降解的交联剂。
29.根据权利要求26所述的水凝胶,其中所述交联剂包含聚乙二醇。
30.根据权利要求25至29中任一项所述的水凝胶作为细胞支持骨架的用途。
31.根据权利要求30所述的用途,其中所述骨架是2D细胞支持骨架。
32.根据权利要求30所述的用途,其中所述骨架是3D细胞支持骨架。
33.伤口敷料,其包含根据权利要求25至29中任一项所述的水凝胶。
34.根据权利要求25至29中任一项所述的水凝胶,其用于处理伤口。
35.根据权利要求34所用的水凝胶,其中所述伤口是慢性伤口,或者其中所述伤口是急性伤口。
36.眼植入物,其包含根据权利要求25至29中任一项所述的水凝胶。
37.根据权利要求25至29中任一项所述的水凝胶,其用于治疗眼损伤。
38.用于产生包含至少一种含有外源生物活性序列之分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体的分子伴侣/引领蛋白家族聚合物的方法,所述方法包括:
i)将编码含有外源生物活性序列之分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体的核酸分子并入用于在宿主细胞中表达的表达载体中;以及
ii)用所述表达载体转染宿主细胞;
其中向所述宿主细胞提供编码所述分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体特异性之周质分子伴侣的核酸分子和编码所述分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体特异性之外膜引领蛋白的核酸分子,并且其中得到的经转染宿主细胞产生分子伴侣/引领蛋白家族聚合物。
39.根据权利要求38所述的方法,其中所述生物活性序列基本上没有免疫原性。
40.根据权利要求38或权利要求39所述的方法,其中所述单体基本上不含天然存在的粘附基序。
41.根据权利要求38至40中任一项所述的方法,其中所述分子伴侣/引领蛋白家族聚合物是级分1抗原聚合物,并且所述含有外源生物活性序列的至少一种分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体是CAF1多肽单体。
42.根据权利要求41所述的方法,其中编码包含外源生物活性序列的所述CAF1多肽单体的所述核酸分子与SEQ ID NO:1的核苷酸序列具有至少70%同一性。
43.根据权利要求41或42所述的方法,其中编码分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体特异性之周质分子伴侣的所述核酸分子编码CAF1特异性的周质分子伴侣,并且其中编码分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体特异性之外膜引领蛋白的所述核酸分子编码CAF1特异性的外膜引领蛋白。
44.根据权利要求43所述的方法,其中编码CAF1特异性之周质分子伴侣的所述核酸分子与SEQ ID NO:2的核苷酸序列具有至少70%同一性。
45.根据权利要求43或权利要求44所述的方法,其中编码CAF1特异性之外膜引领蛋白的所述核酸分子与SEQ ID NO:3的核苷酸序列具有至少70%同一性。
46.根据权利要求43至45中任一项所述的方法,其中如下向所述宿主细胞提供编码CAF1特异性之周质分子伴侣的核酸分子:
i)将编码CAF1特异性之周质分子伴侣的核酸分子并入用于在宿主细胞中表达的表达载体中;以及
ii)用所述表达载体转染宿主细胞。
47.根据权利要求46所述的方法,其中所述表达载体还包含编码含有细胞粘附识别基序之CAF1多肽单体的核酸分子。
48.根据权利要求43至47中任一项所述的方法,其中如下向所述宿主细胞提供编码CAF1特异性之外膜引领蛋白的核酸分子:
i)将编码CAF1特异性之外膜引领蛋白的核酸分子并入用于在宿主细胞中表达的表达载体中;以及
ii)用所述表达载体转染宿主细胞。
49.根据权利要求48所述的方法,其中所述表达载体还包含编码含有细胞粘附识别基序之CAF1多肽单体的核酸分子和/或编码CAF1特异性之周质分子伴侣的核酸分子。
50.根据权利要求38至49所述的方法,其中还向所述宿主细胞提供编码分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体特异性之表达调控子的核酸分子。
51.根据权利要求50所述的方法,其中编码分子伴侣/引领蛋白家族多肽单体特异性之表达调控子的所述核酸分子编码CAF1特异性的表达调控子。
52.根据权利要求50或权利要求51所述的方法,其中编码CAF1特异性之表达调控子的所述核酸分子与SEQ ID NO:4的核苷酸序列具有至少70%同一性。
53.根据权利要求38至52中任一项所述的方法,其中所述生物活性序列是细胞粘附识别基序。
54.根据权利要求38至53中任一项所述的方法,其中所述宿主细胞是细菌细胞。
55.根据权利要求54所述的方法,其中所述细菌细胞是革兰氏阴性细菌细胞。
56.根据权利要求55所述的方法,其中所述细菌细胞是大肠杆菌(Escherichia coli)。
57.级分1抗原聚合物作为防污剂的用途。
58.防污组合物,其包含级分1抗原聚合物。
59.参考附图的本文所述分子伴侣/引领蛋白家族聚合物。
60.参考附图的本文所述水凝胶。
61.参考附图的本文所述伤口敷料。
62.参考附图的本文所述眼植入物。
63.参考附图的本文所述用于产生分子伴侣/引领蛋白家族聚合物的方法。
64.参考附图的本文所述防污组合物。
Applications Claiming Priority (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
GB1210286.9 | 2012-06-11 | ||
GBGB1210286.9A GB201210286D0 (en) | 2012-06-11 | 2012-06-11 | Recombinant polypeptide |
GB1300529.3 | 2013-01-11 | ||
GBGB1300529.3A GB201300529D0 (en) | 2013-01-11 | 2013-01-11 | Recombinant polypeptide |
PCT/GB2013/051524 WO2013186545A2 (en) | 2012-06-11 | 2013-06-11 | Recombinant polypeptide |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN104703627A true CN104703627A (zh) | 2015-06-10 |
Family
ID=48626083
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201380039320.1A Pending CN104703627A (zh) | 2012-06-11 | 2013-06-11 | 分子伴侣/引领蛋白融合蛋白 |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US9862750B2 (zh) |
EP (1) | EP2858675A2 (zh) |
JP (1) | JP6896216B2 (zh) |
CN (1) | CN104703627A (zh) |
WO (1) | WO2013186545A2 (zh) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN105802900A (zh) * | 2016-04-11 | 2016-07-27 | 杭州睿凯生物科技有限公司 | 一种促进细胞在材料表面及内部贴附生长的组分和方法 |
CN113804667A (zh) * | 2021-09-23 | 2021-12-17 | 上海交通大学 | 一种新型可膨胀生物样本的水凝胶及其应用 |
Families Citing this family (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP2858675A2 (en) | 2012-06-11 | 2015-04-15 | University Of Newcastle Upon Tyne | Recombinant polypeptide |
JP6481165B2 (ja) * | 2013-08-30 | 2019-03-13 | 日本放送協会 | 化合物および有機エレクトロルミネッセンス素子 |
WO2023064638A2 (en) * | 2021-10-15 | 2023-04-20 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Compositions and methods for treating skin conditions |
WO2023220196A1 (en) * | 2022-05-10 | 2023-11-16 | Avery Digital Data, Inc. | Electronic devices and methods for scalable cellular engineering and screening |
CN116199909B (zh) * | 2023-03-14 | 2024-02-27 | 四川大学 | 一种在酸性条件下通过网络收缩快速形成水凝胶的方法 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2000066756A1 (en) * | 1999-05-04 | 2000-11-09 | Timo Korpela | Microbial protein expression system |
WO2002059156A2 (en) * | 2000-12-22 | 2002-08-01 | Medimmune, Inc. | Therapeutic compounds structurally-linked to bacterial polypeptides |
Family Cites Families (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB9705787D0 (en) | 1997-03-20 | 1997-05-07 | Thrombosis Res Inst | Modified dendroaspins |
WO1999057276A1 (en) | 1998-04-30 | 1999-11-11 | Gyre Ltd. | Multifunctional adhesin proteins and their display in microbial cells |
AU3897200A (en) | 1999-03-18 | 2000-10-04 | Hope Heart Institute, The | Endothelial cell stimulation by a complex of fibronectin and vascular endothelial growth factor |
EP1474167A4 (en) * | 2001-11-30 | 2006-03-22 | Univ Maryland | NOVEL PROTEINS IN ENTERO-AGREGATIVE ESCHERICHIA COLI (EAEC) USED FOR THE DIAGNOSIS AND THERAPY OF EAEC INFECTIONS |
US8404252B2 (en) | 2007-07-11 | 2013-03-26 | Fraunhofer Usa, Inc. | Yersinia pestis antigens, vaccine compositions, and related methods |
ES2423798T3 (es) * | 2010-11-19 | 2013-09-24 | Universitätsklinikum Freiburg | Hidrogeles de PEG disolubles sensibles a estímulos biofuncionalizados |
EP2858675A2 (en) | 2012-06-11 | 2015-04-15 | University Of Newcastle Upon Tyne | Recombinant polypeptide |
-
2013
- 2013-06-11 EP EP13728816.3A patent/EP2858675A2/en active Pending
- 2013-06-11 CN CN201380039320.1A patent/CN104703627A/zh active Pending
- 2013-06-11 US US14/407,424 patent/US9862750B2/en active Active
- 2013-06-11 WO PCT/GB2013/051524 patent/WO2013186545A2/en active Application Filing
- 2013-06-11 JP JP2015516681A patent/JP6896216B2/ja active Active
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2000066756A1 (en) * | 1999-05-04 | 2000-11-09 | Timo Korpela | Microbial protein expression system |
WO2002059156A2 (en) * | 2000-12-22 | 2002-08-01 | Medimmune, Inc. | Therapeutic compounds structurally-linked to bacterial polypeptides |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
ULRICH HERSEL,ET AL.: "RGD modified polymers:biomaterials for stimulated cell adhesion and beyond", 《BIOMATERIALS》 * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN105802900A (zh) * | 2016-04-11 | 2016-07-27 | 杭州睿凯生物科技有限公司 | 一种促进细胞在材料表面及内部贴附生长的组分和方法 |
CN113804667A (zh) * | 2021-09-23 | 2021-12-17 | 上海交通大学 | 一种新型可膨胀生物样本的水凝胶及其应用 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP2858675A2 (en) | 2015-04-15 |
US20150299272A1 (en) | 2015-10-22 |
JP6896216B2 (ja) | 2021-06-30 |
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WO2013186545A2 (en) | 2013-12-19 |
WO2013186545A3 (en) | 2014-02-13 |
US9862750B2 (en) | 2018-01-09 |
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RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |