JP2015522566A - 組換えポリペプチド - Google Patents
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Abstract
Description
i)外因性生理活性配列を含むシャペロン/アッシャーファミリーポリペプチドモノマーをコードする核酸分子を、宿主細胞において発現させるための発現ベクターに組み込むステップと、
ii)宿主細胞に発現ベクターをトランスフェクトするステップと
を含み、
前記宿主細胞に、シャペロン/アッシャーファミリーポリペプチドモノマーに特異的なペリプラズムシャペロンをコードする核酸分子と、シャペロン/アッシャーファミリーポリペプチドモノマーに特異的な外膜アッシャータンパク質をコードする核酸分子とを与え、こうして得られたトランスフェクト宿主細胞がシャペロン/アッシャーファミリーポリマーを産生する、方法を提供する。
i)CAF1に特異的なペリプラズムシャペロンをコードする核酸分子を、宿主細胞において発現させるための発現ベクターに組み込むステップと、
ii)宿主細胞に発現ベクターをトランスフェクトするステップと
により、CAF1に特異的なペリプラズムシャペロンをコードする核酸分子を与える。
i)CAF1に特異的な外膜アッシャータンパク質をコードする核酸分子を、宿主細胞において発現させるための発現ベクターに組み込むステップと、
ii)宿主細胞に発現ベクターをトランスフェクトするステップと
により、CAF1に特異的な外膜アッシャータンパク質をコードする核酸分子を与える。
第一の態様では、本発明は外因性生理活性配列を含むシャペロン/アッシャーファミリーポリペプチドモノマーを提供する。
一態様では、本発明は、本発明による少なくとも1つのシャペロンファミリーポリペプチドモノマーを含むシャペロン/アッシャーファミリーポリマーに関する。
一態様では、本発明は、本発明によるシャペロン/アッシャーファミリーポリペプチドモノマーまたは本発明によるシャペロン/アッシャーファミリーポリマーを含むまたはからなるハイドロゲルを提供する。
(i)直鎖ホモ二機能性、短スペーサーアーム、DTSSP(サルフォ−DSP)(3,3’−ジチオビス[スルフォサクシニミジルプロピオン酸])分子量608.51でスペーサーアームおよそ12.0Å。DTSSPは水溶性でありチオール切断可能である(図66(a)参照)
(ii)直鎖ホモ二機能性、長スペーサーアーム、NHS−PEG−NHS(O,O’−ビス[2−(N−サクシニミジル−サクシニルアミノ)エチル]ポリエチレングリコール)分子量10000でスペーサーアームおよそ197Å(図66(b)参照)
が含まれるがこれらに限定されない。
本発明のハイドロゲルおよび/またはポリマーは、細胞培養において使用することができる。本発明者らは、驚くべきことに、ハイドロゲル中での本発明のシャペロン/アッシャーファミリーポリペプチドモノマー(または本発明のポリマー)の存在は、細胞生存率を増大させ細胞傷害性を減少させることを見出した。
本発明は、組換えシャペロン/アッシャーファミリーポリペプチドモノマーを産生するための発現ベクターを含む。好ましくは、発現ベクターは、細菌細胞内での組換えシャペロン/アッシャーファミリーポリペプチドモノマーの発現に必要な遺伝要素を含む。細菌細胞中での転写および翻訳に必要な要素には、プロモーター、シャペロン/アッシャーファミリーポリペプチドモノマーのコード領域、および転写終結因子が含まれる。
一態様では、本発明は、本発明の発現ベクターで形質転換されたまたはトランスフェクトされた宿主細胞を提供する。
上に記載される核酸分子を含む発現ベクターにより形質転換された宿主細胞を使用して、シャペロン/アッシャーファミリーポリマーを産生する(すなわち、発現する)ことができる。
1.1 Caf1のサブクローニング、発現および精製
cafオペロン(サイズは約5.2Kb)は、オリゴヌクレオチドプライマーペアF1フォワード(5’−ATA AAT CGG TTC AGT GGC CTC AAC GCT GTG−3’)およびF1リバース(5’−GGT TAG GCT CAA AGT AGG ATA ATT C−3’)、鋳型としてcafオペロンをコードするプラスミドpAH34L(9)(GenBank受託番号AY450847)ならびに平滑末端断片を生じるKOD HOT START DNAポリメラーゼ(Novagen、UK)を使用して、PCR(30増幅サイクル;95℃で20秒間、55℃で10秒間、70℃で5分間)(PCR Express、Hybaid、UK)により増幅した。得られたPCR産物は臭化エチジウム(0.5ug/Ml)で染色された0.7%アガロースゲル上に負荷した。DNAはトランスイルミネーター(波長254nmの紫外線)(Gel−Doc Bio−RAD、UK)上で可視化した。cafオペロンに対応するオリゴヌクレオチドのPCR産物は、無菌外科用メスの刃を使用してアガロースゲルから切除した。抽出されたDNAバンドはQIAquickゲル抽出キットおよびQIAquick PCR精製キット(Qiagen、UK)で精製した。その後、精製したDNAは臭化エチジウム(0.5μg/Ml)を含有する0.7%アガロースゲル上に負荷し、トランスイルミネーター上で可視化し、Quantity oneソフトウェア(Gel−Doc Bio−RAD、UK)を使用して定量化した。PCR産物を新しいベクターにサブクローニングする前に、制限解析を実施してPCR産物の同一性を確認した。次に、精製PCR産物を新しいベクターにサブクローニングした。最初、本発明者らはcafオペロンをPsmart−HC−AmpおよびPsmart−LC−Kanベクター(Lucigen、USA)にサブクローニングしようと企てた。Psmart−HCのコピー数はPuc19に類似して、細胞あたり約300〜500コピーである。Psmart−LCのコピー数はPbr322に類似して、細胞あたり約15〜30コピーである。Psmartベクターは前消化し、平滑脱リン酸化末端を有する。小さなサイズのPsmartベクター(1.7〜2.0Kb)であれば大きなインサートDNAのサブクローニングおよび変異誘発実験を容易にすることができる。DNA精製後、PCR産物はT4ポリヌクレオチドキナーゼ(10U)(NEB、UK)で処理して5’−リン酸をオリゴヌクレオチドに付加し、それに続くライゲーションを可能にしなければならない。クローンSmartライゲーション反応では、前処理Psmartベクターに平滑末端リン酸化インサート(200ngのインサート)をライゲートする。使用する陽性対照はラムダ/Hcllインサート(500ng)であり、インサートなしの陰性対照もライゲーションのための製造業者の使用説明書および推奨(Lucigen、US)に従って実施した。新しい組換えプラスミドを含有する大腸菌10G化学的にコンピテントな細胞の形質転換体[F−mcrA D(mrr−hsdRMS−mcrBC)Φ80dlacZΔM15 ΔlacX74 endA1 recA1araD139 Δ(ara,leu)7697 galU galK rpsL nupGλ−tonA](Lucigen、USA)は、Psmart HC−AmpおよびLC−Kanのいずれかに対して適切な抗生物質を含有するLB寒天プレート上で選択した。プレートは37℃で一晩インキュベートした。その後、インキュベーション時間を4℃で24時間まで増加するなどのcafオペロンをサブクローニングするための改良を加えた。cafオペロンをサブクローニングする第二の企てはpGem−T Easy(Promega、UK)を使用して行った。高コピー数pGem−T Easyベクターは、それをEcoRVで切断し、3’末端チミジンを両末端に付加することにより調製した。挿入部位でのこれらの単一3’−Tオーバーハングは、ベクターの再環状化を防ぎPCR産物に適合性のオーバーハングを与えることにより、小サイズプラスミド(3Kb)中へのPCR産物のライゲーションの効率を大幅に改善する(Promega、UK)。精製PCR産物はAテーリング法を使用して改変され、この方法はAテーリング法(Promega製のpGem−T EASYキット、UK)のための製造業者の使用説明書および推奨に従って平滑末端酵素を使用して増幅されたPCR産物上に3’末端‘A’オーバーハングを付加する。ライゲーション反応(Promega製のpGem−T EASYキット、UK)のための製造業者の使用説明書および推奨に従って、標準反応、陽性対照(対照インサートDNA)およびバックグランド対照(インサートDNAなし)を含むライゲーション反応物を調製し、例外は4℃での24時間の反応のためのインキュベーション時間と温度であった。その後、ライゲーション反応物は65℃で10分間熱変性した。大腸菌(pGem−TF1)と名付けられた新しい組換えプラスミドを含有する大腸菌DH5α細胞[F−Φ80lacZΔM15 Δ(lacZYA−argF)U169 deoR recA1 endA1 hsdR17(rk−、mk+)phoA supE44 thi−1 gyrA96 re/A1λ−](インビトロgen、UK)の形質転換体は100μLのアンピシリンを含有するLB寒天プレート上で選択し、20μLのX−Gal(50mg/Ml)をLB寒天プレート上に広げた。プレートは37℃で一晩インキュベートした。次の日、それぞれの成功した形質転換から単一コロニーを選び、塩基配列決定に送る(Beckman Coulter Genomics−Formerly Agencourt Bioscience and Cogenics、UK)ために寒天を含有する管に導入した。平行して、プラスミドミニプレップ由来のpGem−TF1プラスミドの制限解析を実施した。
caf1遺伝子内の変異は、大きなプラスミドについて(XL Quickchangeキット、Stratagene)使用して記載の通りに、Pfuポリメラーゼ(Stratagene)(18増幅サイクル;95℃で1分間、95℃で50秒間、60℃で50秒間、68℃で8.5分間)(PCR Express、Hybaid、UK)を使用してpGem−TF1中に作りだした。コードプライマー(小文字での変異)は表1に示す通りであった。
タンパク質試料およびネガティブ染色検体は前述の通りに調製した(10)。手短に言えば、caf1−WTおよびcaf1−RGDS変異タンパク質試料は蒸留水中で最終濃度50μg/mlになるように調製した。薄炭素支持フィルム付の電子顕微鏡グリッドを10μl試料液滴に適用し、10〜20秒間保持し、フィルターペーパーで水気を切った。次に、バッファーおよび塩を20μlの水滴を3回使用して洗い流し、残った炭素吸着タンパク質/アジュバンドは2%酢酸ウラニル液を20μl液滴を添加することによりネガティブ染色した。ネガティブ染色はフィルターペーパーで水気を切り、グリッドは空気乾燥させておいた。ネガティブ染色検体は、100Kvで作動させるPhilips CM100透過型電子顕微鏡で調べた。電子顕微鏡写真は、常に画像倍率130000でタグ付き画像ファイルフォーマット(TIFF)に記録した。
3T3線維芽細胞およびPC12をアメリカ合衆国培養細胞系統保存機関(ATCC、http://www.lgcpromochematcc.com)より購入し前述の通りに維持した(4)。Caf1タンパク質被覆のために、対象のタンパク質(caf1 WTおよびcaf1 RGDS変異体)および対照の100μLを96ウェルプレートに添加した。BSA、OmpA−RGDSは対照として使用した。非被覆ウェルも対照として使用した。タンパク質は10mMのPBS(pH7.6)中に希釈し、所望の濃度、100μg/Mlを得た。タンパク質溶液はすべて0.2μmフィルターを使用して濾過した。それぞれの溶液は、96ウェルプレート用のマルチチャンネルピペットを使用して培養プレートにピペットで移した。プレートはパラフィンで密封し、4℃で一晩インキュベートした。タンパク質溶液はプレートウェルから吸引し、10mMのPBS(pH7.6)でウェルを一度洗浄する。PBSはウェルから除き、プレートは細胞培養のために取っておいた。次に、3T3線維芽細胞は1000×gで5分間収穫した。細胞ペレットはカルシウムおよびマグネシウムを含む10mMのPBS(pH7.4)中に2.5×106細胞/Mlの濃度で再懸濁させた。細胞はカルシウムおよびマグネシウムを含む10mMのPBS(pH7.4)で1×106細胞/Mlの濃度で二度洗浄した。100μLの調製細胞懸濁液をそれぞれのウェルに添加した。プレートは37℃で2時間インキュベーター中に置いた。2時間のインキュベーション後、付着しなかった細胞はプレートを反転させて取り除いた。細胞はカルシウムおよびマグネシウムを含む10mMのPBS(pH7.4)で5分間二度洗浄し、PBS(pH7.4)中4%パラホルムアルデヒド(Sigma−Aldrich、UK)で30分間固定化した。パラホルムアルデヒド液を取り除き、細胞はPBS(pH7.4)で洗浄ごとに5分間三回洗浄し、その後PBS(pH7.4)中10μg/MlのDAPI(Sigma−Aldrich、UK)で25分間染色した。DAPI溶液を取り除き、細胞はPBS(pH7.4)で洗浄ごとに5分間三回洗浄した。その後、細胞はコンジュゲートされたローダミン−ファロイジン(200ng/Ml)(Sigma−aldrich)で15分間染色した。次に、ファロイジン液は取り除き、細胞はPBS(pH7.4)で洗浄ごとに5分間三回洗浄した。ウェルはPBS(pH7.4)を充填し、測定は蛍光光度計を使用して実現した。蛍光顕微鏡を使用する細胞接着アッセイでは、ガラスカバーグラスは、上記と同じプロトコールに従ってcaf1−WTおよびcaf1−RGDS変異体で被覆した。その後、タンパク質で被覆されたガラスカバーグラスを含有する6ウェル培養プレートのウェルあたり、1×105のPC12細胞を血清なしのRPMI1640培地に添加した。細胞は、インキュベーター中37℃、5%CO2で3時間維持した。3時間後、培養物は2Mlの無菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)(Cambrex)で一度洗浄し、上記の通りに固定化し、染色した。
2.1 cafオペロンをサブクローニングする
2.1.1 鋳型としてPah34Lベクターを使用するcafオペロンのPCR増幅およびPCR産物の制限消化
ペスト菌cafオペロンを含む、大腸菌プラスミドpAH34L(12)(サイズは約11Kbp)の、F1ペアのプライマーおよびPCRサイクル条件を使用するPCRによる増幅は、5.2Kbのバンドを示している(図3a)。こうして得られたPCR産物は、cafオペロンとEcoRIを切断するがcafオペロンは切断しないHindIIIとBamHI制限酵素で消化した(図3b)。
得られたPCR産物がcafオペロンであることを確認した後、予想されるサイズ(5.2Kb)のDNA断片はQIAGENゲル抽出キットを使用して精製し、Quantity One(登録商標)ソフトウェア(Bio−Rad)を使用して定量化した(図4a)。次に、DNA断片の同一性および完全性は、cafオペロンとEcoRIを切断するがcafオペロンは切断しないHindIIIとBamHI制限酵素を用いた制限分析により確かめた(図4b)。
pAH34Lプラスミドからのサブクローニング実験により、発明者らはcafオペロンを担持するプラスミドpGem−T Easyを構築することができた。遺伝子塩基配列決定により与えられる結果により、pGem−T Easyにクローニングされたcafオペロンのアミノ酸配列(図5)は、ペスト菌株482プラスミドPmt1−caf1オペロン完全配列(GenBank:AY450847.1)由来の以前報告された配列と同一であることが示されている。
pGem−T EASYプラスミドに2つの制限部位を有しインサートを放出することができるEcoRI制限酵素を使用する制限分析ゲルは、2つのバンド、1つはベクターに対応する可能性のある3Kbのバンドを、第二のバンドはインサートに相当する可能性のある5Kbを超えるバンドを示した(図6)。
抗F1抗体(Avecia、UK)を使用するSDS−pageおよびウェスタンブロッティングの結果(図7)では、15.5KdaであるF1抗原の報告されている分子量(2)およびウェスタンブロットでは、それぞれカナマイシン(50μg/Ml)およびアンピシリン(100μg/Ml)を含有するLブロスにおいて37℃で19時間増殖された、大腸菌/Pah43Lの溶液および大腸菌pGem−T Easyの溶液(両方のプラスミドがcafオペロンを含有する)でもF1ポリクローナル抗体と反応している16000のMrを有するバンドが確認された。
12%SDS−pageゲル上で15.5kDaのバンドの同一性を確認するため、バンドは質量分析に送られた。得られた結果では、15.5kDaのバンドはcaf1であることが確かめられた(図8)。
大腸菌BL21(DE3)(pGem−TF1)培養物の遠心分離により細菌細胞の沈降が生じその上では凝集物の層が見えた。予備実験では、この凝集物は主にCaf1であることが明らかにされた。余分なcaf1はPBSで穏やかに洗浄することにより細菌細胞の表面から取り除くことができた。caf1は硫酸アンモニウム分取により精製し、続いてFPLC Superdex200ゲル濾過クロマトグラフィーにかけ、培養物1リットル当たりおよそ10mgのCaf1が生じた。
FPLC Superdex200ゲル濾過クロマトグラフィーカラム(最大圧力:3Mpa;流速:2Ml/分;移動相:PBSバッファー(pH7.6);注入試料量:最大5Ml)をこの研究で使用してcaf1を精製した。Caf1は空隙容量(V0)(50.5ml)のゲル濾過カラムに溶出し、全容量(VT)は18mlであった。ゲル濾過クロマトグラフィー用の標準タンパク質マーカーは表2に提示されている。結果は図9に示している。
試料は、移動相としてPBSバッファー(pH7.6)を使用してSuperdex200ゲル濾過カラムに2ml/分で注入した。それぞれの画分はファルコンチューブに収集した。クロマトグラム(図10a)では、タンパク質溶出が示され、収集されたそれぞれの画分は12%SDS−PAGEに負荷した(図10b)。
図11に示すように、精製したタンパク質は分光光度計を使用して定量した。
タンパク質精製後、本発明者らはcaf1オリゴマーを調製した。Caf1試料は95℃で45秒間インキュベートした(図12)。
<発現および精製>
2.4.1 CafM:Caf1複合体およびCaf1−RGDS変異体構築
PyMOLおよびアクセス番号(GenBank、受託番号AY450847)RGDSを使用して、ペプチドをF1線維モデル構造のループ中に挿入した(図13)。変異原性プライマーはOligoAnalyser3.1ソフトウェアを使用して設計した。
部位特異的変異誘発後、それぞれの成功した形質転換のコロニーは塩基配列決定のために送った。Caf1MDN31GRG;DS34GNの遺伝子塩基配列決定から得られた結果は下に示している(図14)。
精製Caf1QDGN76RGDS変異タンパク質の画分は12%SDS−PAGE上に負荷した(図15)。
pGem−TF1およびpGem−TF1 Caf1QDGN76RGDSの画像は透過型電子顕微鏡を使用して捕捉した(図16)。
3.1 蛍光光度計を使用したcaf1−WTまたはRGDS変異体で被覆された96ウェルプレート上への細胞接着の測定
図17はPC12細胞接着アッセイの結果を示している。
以下のデータは、変異Caf1を発現している追加のプラスミドを加えることにより、2つの異なるモノマー型を結果としてのcaf1ポリマーに組み込むことが可能であることを実証している。したがって、複合混合ポリマー(すなわち、異種ポリマー)が可能である。
同じスキャフォールドが、細胞接着を増強する(例えば、フィブロネクチン由来のPHSRN(およびCaf1−RGDSの場合と同じように1つの細胞接着モチーフだけではない))または増殖因子を包含する分化などの他の生物学的プロセスを促進するいくつかの異なるECMモチーフを含有する細胞培養のための第二世代のスキャフォールドの設計および合成を説明する。例えば、移動を含む細胞発生の特定の時点に細胞により分泌されるメタロプロテイナーゼが認識し切断することができる特定のプロテアーゼ切断可能部位も組み込むことができる。
pBAD33中のcaf1遺伝子は、(1)そのN末端近くの6ヒスチジン(Caf1−6HisNT);(2)Caf1のループ1におけるフィブロネクチン中のRGD相乗作用配列であるPHSRNモチーフ(Caf1−PHSRN)(Caf1−PHSRNループ1);(3)Caf1のN末端におけるFLAGエピトープ(DYKDDDDK)(caf1−FLAGエピトープNT);(4)Caf1のNT末端におけるシステイン(Caf1−Cys−NT);(5)Caf1のループ4におけるシステイン(Caf1−G35Cループ4);Caf1のループ2におけるシステイン(Caf1−Q106Cループ2);(6)Caf1のN末端におけるメタロプロテイナーゼ13(MMP13)のPENFF切断部位(Caf1−PENFF−NT);(7)Caf1のN末端における6ヒスチジンそれに続くスペーサー連結ペプチド(GGGGSGGGGS)(Caf1−6His−NTスペーサー);(8)Caf1のC末端における6ヒスチジン(Caf1−6His−CT);(9)Caf1のループ3におけるPHSRNモチーフ(Caf1−PHSRNループ3)の挿入により変異させた。caf1遺伝子におけるこれらの変異はcaf1遺伝子のバリアントとして設計された。バリアントを合成し、GeneArt(インビトロgen Life Technologies)によりpBAD33ベクター中にクローニングした。
caf1遺伝子(サイズが528bp;GenBank、受託番号AY450847)変異体はGeneArtにより合成し(表4)pBAD33ベクターのKpnlとXbal制限部位間にクローニングし、2つの停止コドンが続いた。
100μg/mlのアンピシリンまたは20μg/mlのクロラムフェニコール抗生物質および100μg/mlのアンピシリンと20μg/mlのクロラムフェニコール抗生物質の両方を補充したLBブロスを、それぞれ大腸菌TOP10/pBAD33_SD_Caf1変異体、大腸菌TOP10/pAH34Lおよび大腸菌TOP10/pBAD33_SD_Caf1変異体+pAH34Lを培養するために使用した。
4.3.1 Caf1 WTの共発現は2つの適合性プラスミド、pAH34LおよびpBAD33により媒介された
この研究は、(1)pACYC184ベクター由来のpBR322適合性p15A複製起点および(2)クロラムフェニコール抗生物質に対する耐性を含有するプラスミドpBAD33を使用するcaf1遺伝子のコピーならびに異なる複製起点(ColE1)および抗生物質耐性(カナマイシン)を有するプラスミドpAH34Lを使用するcafオペロンの共発現のための系を実証しており、したがって細胞はカナマイシン/クロラムフェニコールL寒天プレート上で増殖される場合両方のプラスミドを維持することができる。綿状層のサイズに基づいて、2つの適合性プラスミドにより形質転換されLアラビノースを含有する培地で増殖させたTOP10大腸菌細胞はより高レベルのcaf1遺伝子を発現した。このことは、モノクローナル抗Caf1抗体を使用するウェスタンブロットにより確かめられた。
本発明者らは、上述の発現系を使用するCaf1変異体のCaf1−WT(caf野生型)と一緒の共発現へのアプローチを開発した。Caf1変異体の共発現の分析は、本研究のタンパク質に対する抗体を使用するウェスタンブロットにより実施した。
Caf1−WTは、異なるスペーサーアーム長(すなわち、コンジュゲート分子間の距離)およびその末端に異なる数の同じ官能基N−ヒドロキシサクシニミド(NHS)を含有する3つのクロスリンカーと、共有結合的架橋をしていた。
5.1.1 異なるスペーサーアーム長を用いたCAF1−WTの架橋
最終濃度30mg/mlのCaf1タンパク質を、それぞれ架橋率(w/w、クロスリンカー対Caf1)1対10、1対5、1対3、1対2に対応する最終濃度3、6、9および15mg/mlのDTSSP(Pierce)、NHS−PEG−NHS(Creative PAGWorks)および4アームNHS−PEG(Creative PEGWorks)溶液を用いて架橋した。架橋のために使用した方法は製造業者の使用説明書に従った。これらの比のCaf1ハイドロゲルは、SDS−PAGEゲル、透過型電子顕微鏡(TEM)、生存率/細胞傷害性アッセイを実施してのCaf1ハイドロゲルと哺乳動物細胞との生体適合性および走査型電子顕微鏡(SEM)により調べる形態学により分析するそのゲル化時間、膨潤、架橋の程度に関して特徴付けた。
Caf1ハイドロゲルのゲル化速度は室温で30分間、毎分撹拌しながら密封条件下でモニターした。表6は、DTSSPクロスリンカーの濃度を増加させてもゲル化時間に変化はなかったことを示している。30分後、反応はその流動性を失わず、例えば、管をわずかに反転させると、管中の溶液はガラス試験管の壁に沿って滑ったがゲルを生じることはなく、したがってゲル化時間を確定しなかった(「N.D」)。しかし、NHS−PEG−NHS(本明細書では「2アームPEG−NHS」とも呼ばれる)の濃度を増加させるとゲル化時間がわずかに減少した。ゲル化時間のさらに目に見える減少は、4アームPEG−NHSの添加により観察された。4アームPEG−NHSのゲル化速度は、2アームPEG−NHSよりも速かった。例えば、4アームPEG−NHSとNHS−PEG−NHSの最も速いゲル化時間はそれぞれ2秒と24分であった。にもかかわらず、これらの簡単な観察のみに基づいても、異なるクロスリンカーと架橋したすべてのCaf1ハイドロゲルによりCaf1の対応する溶液の粘度に匹敵する試料粘度が得られることに我々は注目した。
DTSSP、NHS−PEG−NHSおよび4アームPEG−NHSを用いて異なる濃度で架橋したCaf1ハイドロゲルの膨潤は、クロスリンカー濃度の減少と共に増加する径の変化(膨潤前の最初の径とPBSの添加による膨潤後の最終径の間の差)の分析に基づいて決定した。この傾向はDTSSPと架橋したCaf1ハイドロゲルでより明白であった(w/w、1対10の架橋比)。
Caf1ポリマーは、それぞれがクロスリンカーのそれぞれの末端のNHS反応基を提示している3つの異なるクロスリンカーで処理した。NHS基はpH7〜8.5でリジンの一級アミン基と反応して安定なアミド結合を形成する。この反応は30分後に終止させた。架橋後、試料は100℃、5分間SDS試料バッファー中でインキュベートし、電気泳動のために4〜20%勾配ポリアクリルアミド上に負荷した。図68は変性Caf1タンパク質試料を示しており、架橋の程度を明らかにした。ゲルの下ではおよそ15kDaのバンドが観察され、非架橋モノマーに対応していた。DTSSPで架橋したCaf1の場合、ダイマーバンドは、25と37kDaタンパク質標準マーカーの間で分離している(レーン1〜4)。NHS−PEG−NHSで架橋したCaf1の場合、ダイマーバンドは、ほぼ37kDaタンパク質標準マーカーと伴行していた(レーン5〜8)。4アームPEG−NHSと架橋しているCaf1は、50と75kDaタンパク質標準マーカーの間で分離している第二のバンドを提示している(レーン9から12)。残りの高分子量バンドは、SDS−PAGEゲル分析だけでは定義することはできない。異なるクロスリンカーを使用して架橋率を増大させるとCaf1モノマー画分が減少した。
生存率/細胞傷害性アッセイ(Promega)を使用して使用した材料の細胞生存率および細胞傷害性を評価する。アッセイの第一部分は2つのプロテアーゼ活性を同時に測定し、1つは細胞生存率のマーカー、もう1つは細胞傷害性のマーカーである。生細胞プロテアーゼ活性は無傷の生細胞に制限されており、蛍光発生、細胞浸透性ペプチド基質(グリシルフェニルアラニル−アミノフルオロクマリン;GF−AFC)を使用して測定する。基質は無傷の細胞に入り、生細胞プロテアーゼ活性により切断され、生細胞の数に比例する蛍光シグナルを発生する。この生細胞プロテアーゼは、細胞膜統合性が失われ周囲の培養培地に漏出すると不活性になる。第二の蛍光発生、細胞不透過性ペプチド基質(ビス−アラニルアラニル−フェニルアラニル−ローダミン110;ビス−AAF−R110)を使用して、膜統合性を失った細胞から放出される死細胞プロテアーゼ活性を測定する。ビス−AAF−R110は膜透過性ではないため、無傷の生細胞により発生するこの基質からのシグナルは基本的にない。
4アームPEG−NHSで架橋したCaf1ポリマーのハイドロゲルを形成する能力を調査した。図70は、Caf1のモノマー循環置換バリエーション(cpCaf1)(22)と4アームPEG−NHSで架橋したCaf1ポリマーの両方、4アームPEG−NHSのみおよびCaf1単独のTEM画像を示している。
図72は、非常に緻密な構造を有する1対3の比で4アームPEG−NHSで架橋したCaf1ハイドロゲルを示しており、したがってポアの径は決められなかった。しかし、ポアはナノメーターの桁だと思われる。最初のSEM画像はいくつかの小片に壊れたCaf1ハイドロゲルを示している。次のSEM画像はこれらのCaf1ハイドロゲル小片の内部を示している。
マウス3T3線維芽細胞およびラット初代骨芽細胞を、本発明に従って作製したCaf1−WTハイドロゲルの表面上で標準培養条件を使用して培養した。24時間後、細胞は2%のグルタルアルデヒドに固定し、脱水し、金被覆して従来のSEMにより視覚化した。二次元培養物では、骨芽細胞よりも多くの線維芽細胞が細長い形態を呈した(図75)。大多数の骨芽細胞が円形形態を示し、Caf1ハイドロゲルで被覆された表面上に目に見える広がりを示す細胞はごくわずかである。ハイドロゲルを作製するために使用されたCaf1は非接着特性(本明細書で考察される通りの)を有するWT−caf1であった。本明細書に示されるデータから、RGD型モチーフをWT−caf1中へ導入すれば線維芽細胞相互作用は増大すると結論付けることが可能である。この段階で重要なことに、本発明者らはゲルが細胞傷害性ではないことを示した。
9.1 4アームPEG−NHSと架橋したCafタンパク質はゲル様物質を形成した。
Caf1ハイドロゲルは管反転法を使用して室温で調製した。ゲル化時間は、クロスリンカー濃度に応じて、NHS−PEG−NHSでは24〜27分以内、4アームPEG−NHSでは2〜22分以内であると視覚的に評価された。これら2つのクロスリンカーの濃度が高いほど、ゲル化時間は速くなる。Caf1と異なる濃度のDTSSPとの反応では、固体ゲルが観察されなかったために、ゲル化時間の視覚的評価はできなかった(表6)。
DTSSP、NHS−PEG−NHSおよび4アームPEG−NHSで架橋したCaf1ハイドロゲルの液滴の径は、反応に添加したクロスリンカーが増加するにつれほとんど変化しなかった。これは、クロスリンカーの濃度を増加する場合、Caf1ポリマーとの反応に添加したクロスリンカーがもっと少ない場合よりも、測定された液滴の最初の径とPBS中37℃で16時間後の同じ液滴の最終的な径の間の差は小さく、したがって2つの径の差と最初の径の間の比はさらに小さい、すなわち、クロスリンカー濃度が少ないCaf1ハイドロゲルはクロスリンカーの濃度がもっと多いCaf1ハイドロゲルよりも広がりが少ないことを意味する。
室温で30分間のCaf1ハイドロゲル架橋後、10μlのそれぞれのハイドロゲルはもちろんCaf1ハイドロゲルの形成のために使用したのと同じ濃度でクロスリンカーのない対照Caf1タンパク質をSDS試料バッファーの存在下、100℃で5分間加熱し、4〜20%勾配ゲル上に負荷した。ゲルはクーマシーブリリアントブルーで染色し、ImageJバージョン1.46ソフトウェアによりスキャンし分析した。非架橋Caf1試料中のCaf1モノマー(対照)に対応するおよそ15kDaのバンドはそれに続く分析のための基準として使用した。様々な濃度の異なるクロスリンカーで架橋したCaf1試料中のCaf1モノマーバンドの相対密度を決定した。試料ごとに得られた値と基準試料について得られた値間の比により、計算するバンドごとの相対密度の決定が可能であった。モノマーを使用する計算は、Caf1モノマーに対応する約15kDaの単一バンドが存在するため、ダイマー、トリマー、等の相対量を使用するよりも正確であった。高分子量バンドについての相対密度の計算のほうが複雑だったからである。これらは単一バンドと見なし、「Caf1架橋画分」と呼んだ。
DTSSPなどの短アーム長クロスリンカー(12.0Å)で架橋したCaf1ポリマーはCaf1線維間のさらに密接な接触を促進し、Caf1自己集合の可能性を増大する。したがって、TEMにより得られた画像は、このCaf1線維近接を反映する緻密なCaf1ハイドロゲルを明らかにした(図69−A)。
Caf1ハイドロゲルのポア径はSEMおよびESEMにより評価した。SEMにより分析した試料は臨界点乾燥により調製し、網目のある程度の崩壊を引き起こすことがある差次的エタノール濃度を使用して脱水した。得られたポア径はナノメーターの桁であり、凍結乾燥ハイドロゲルは平均ポア径が8±0.003μmであるもっと大きなポアを提示した(図73に見ることができる)。
細胞ハイドロゲル相互作用は、細胞生存率を測定し4アームPEG−NHSで架橋したCaf1ハイドロゲル(w/w 1対2の架橋比)で被覆したガラスカバーグラス表面上に広げることにより調べた。Caf1ハイドロゲル上に播種した生存可能な初代骨芽細胞はほとんど細長い拡張を示さず、細胞の大半は丸い形状をしていた。マウス3T3線維芽細胞は生存率について試験しなかった。にもかかわらず、Caf1ハイドロゲル上に播種した場合にはより多くの線維芽細胞が細長い形態を示すことが見て取れた。細胞接着および延展は細胞接着性ペプチド(例えば、RGDS)を添加しメタロプロテイナーゼ切断部位などのタンパク質分解部位も組み込むことにより改善することができた。
パラグラフ1.外因性生理活性配列を含むシャペロン/アッシャーファミリーポリペプチドモノマー。
a)転写プロモーターエレメント
b)外因性生理活性配列を含むシャペロン/アッシャーファミリーポリペプチドモノマーをコードする核酸分子、および
c)転写終結因子
が作動可能に連結されたエレメントを含む発現ベクター。
i)外因性生理活性配列を含むシャペロン/アッシャーファミリーポリペプチドモノマーをコードする核酸分子を、宿主細胞において発現させるための発現ベクターに組み込むステップと、
ii)宿主細胞に発現ベクターをトランスフェクトするステップと
を含み、
前記宿主細胞にシャペロン/アッシャーファミリーポリペプチドモノマーに特異的なペリプラズムシャペロンをコードする核酸分子とシャペロン/アッシャーファミリーポリペプチドモノマーに特異的な外膜アッシャータンパク質をコードする核酸分子とを与え、こうして得られたトランスフェクト宿主細胞がシャペロン/アッシャーファミリーポリマーを産生する
方法。
i)CAF1に特異的なペリプラズムシャペロンをコードする核酸分子を、宿主細胞において発現させるための発現ベクターに組み込むステップと、
ii)宿主細胞に発現ベクターをトランスフェクトするステップと
によりCAF1に特異的なペリプラズムシャペロンをコードする核酸分子を与える、パラグラフ56から58のいずれか1つに記載の方法。
i)CAF1に特異的な外膜アッシャータンパク質をコードする核酸分子を、宿主細胞において発現させるための発現ベクターに組み込むステップと、
ii)宿主細胞に発現ベクターをトランスフェクトするステップと
によりCAF1に特異的な外膜アッシャータンパク質をコードする核酸分子を与える、パラグラフ56から60のいずれか1つに記載の方法。
i)パラグラフ49から52のいずれか1つに記載の宿主細胞を含む容器を提供するステップと、
ii)容器に含有される細胞培養物によるシャペロン/アッシャーファミリーポリペプチドモノマー発現を促進する細胞培養条件を提供するステップと、任意選択により
iii)容器からシャペロン/アッシャーファミリーポリマーを収集するステップとを含む方法。
Claims (64)
- 少なくとも1つのシャペロン/アッシャーファミリーポリペプチドモノマーを含むシャペロン/アッシャーファミリーポリマーであって、前記少なくとも1つのシャペロン/アッシャーファミリーポリペプチドモノマーが外因性生理活性配列を含む、シャペロン/アッシャーファミリーポリマー。
- 前記生理活性配列が、実質的に非免疫原性である、請求項1に記載のシャペロン/アッシャーファミリーポリマー。
- 前記モノマーには、天然に存在する接着モチーフが実質的にない、請求項1または2に記載のシャペロン/アッシャーファミリーポリマー。
- 前記モノマーが、FGループ長ファミリーポリペプチドモノマーである、請求項1〜3のいずれか1項に記載のシャペロン/アッシャーファミリーポリマー。
- 前記モノマーが、Caf1、Saf1およびAfa/Drからなる群から選択される、請求項4に記載のシャペロン/アッシャーファミリーポリマー。
- 前記モノマーが、Caf1ポリペプチドである、請求項5に記載のシャペロン/アッシャーファミリーポリマー。
- 前記モノマーが、配列番号5のポリペプチドと少なくとも70%同一である、請求項6に記載のシャペロン/アッシャーファミリーポリマー。
- 前記モノマーが、FGループ短ファミリーポリペプチドモノマーである、請求項1〜3のいずれか1項に記載のシャペロン/アッシャーファミリーポリマー。
- 前記モノマーが、FimおよびPapからなる群から選択される、請求項8に記載のシャペロン/アッシャーファミリーポリマー。
- 前記生理活性配列が、細胞接着認識モチーフ、増殖因子配列モチーフおよびプロテアーゼ部位からなる群から選択される、請求項1〜9のいずれか1項に記載のシャペロン/アッシャーファミリーポリマー。
- 前記生理活性配列が、細胞接着認識モチーフである、請求項10に記載のシャペロン/アッシャーファミリーポリマー。
- 前記細胞接着認識モチーフが、細胞外マトリックス細胞接着認識モチーフである、請求項11に記載のシャペロン/アッシャーファミリーポリマー。
- 前記細胞接着認識モチーフが、コラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、ラミニンまたはテネイシンから選択される、請求項11に記載のシャペロン/アッシャーファミリーポリマー。
- 前記細胞接着認識モチーフが、アミノ酸配列RGDを含む、請求項13に記載のシャペロン/アッシャーファミリーポリマー。
- 前記細胞接着認識モチーフが、アミノ酸配列PHSRNを含む、請求項13に記載のシャペロン/アッシャーファミリーポリマー。
- 前記生理活性配列が、前記ポリペプチドがフォールディングされるとループ構造内に含まれる部位において前記モノマー内に含まれる、請求項1〜15のいずれか1項に記載のシャペロン/アッシャーファミリーポリマー。
- 前記ポリマーが画分1抗原ポリマーであり、前記少なくとも1つのシャペロン/アッシャーファミリーポリペプチドモノマーがCAF1ポリペプチドモノマーである、請求項1〜16のいずれか1項に記載のシャペロン/アッシャーファミリーポリマー。
- 前記ポリマーが、少なくとも1つのさらなるシャペロン/アッシャーファミリーポリペプチドモノマーを含み、前記さらなるシャペロン/アッシャーファミリーポリペプチドモノマーが、外因性生理活性配列を含む前記少なくとも1つのシャペロン/アッシャーファミリーポリペプチドモノマーとは少なくとも1つのアミノ酸が異なる、請求項1〜17のいずれか1項に記載のシャペロン/アッシャーファミリーポリマー。
- 前記さらなるシャペロン/アッシャーファミリーポリペプチドモノマーが、請求項1〜18に記載される前記外因性生理活性配列のないシャペロン/アッシャーファミリーポリペプチドモノマーである、請求項18に記載のシャペロン/アッシャーファミリーポリマー。
- 前記さらなるシャペロン/アッシャーファミリーポリペプチドモノマーが、天然に存在するCAF1ポリペプチドモノマーである、請求項18または19に記載のシャペロン/アッシャーファミリーポリマー。
- 前記少なくとも1つの天然に存在するCAF1ポリペプチドモノマーが、ペスト菌CAF1ポリペプチドである、請求項20に記載のシャペロン/アッシャーファミリーポリマー。
- 前記ペスト菌CAF1ポリペプチドが、配列番号5のポリペプチド配列を有する、請求項21に記載のシャペロン/アッシャーファミリーポリマー。
- 前記さらなるシャペロン/アッシャーファミリーポリペプチドモノマーが、前記少なくとも1つのシャペロン/アッシャーファミリーポリペプチドモノマーの前記外因性生理活性配列とは明確に異なる外因性生理活性配列を含む、請求項18に記載のシャペロン/アッシャーファミリーポリマー。
- 前記少なくとも1つのシャペロン/アッシャーファミリーポリペプチドモノマーの前記外因性生理活性配列が、アミノ酸配列RGDを含む細胞接着認識モチーフであり、前記少なくとも1つのさらなるシャペロン/アッシャーファミリーポリペプチドモノマーの前記外因性生理活性配列が、アミノ酸配列PHSRNを含む細胞接着認識モチーフである、請求項23に記載のシャペロン/アッシャーファミリーポリマー。
- 請求項1〜24のいずれか1項に記載のシャペロン/アッシャーファミリーポリマーを含むハイドロゲル。
- 架橋剤をさらに含む、請求項25に記載のハイドロゲル。
- 前記架橋剤が生分解性架橋剤である、請求項26に記載のハイドロゲル。
- 前記架橋剤が非分解性架橋剤である、請求項26に記載のハイドロゲル。
- 前記架橋剤がポリエチレングリコールを含む、請求項26に記載のハイドロゲル。
- 細胞支持スキャフォールドとしての、請求項25〜29のいずれか1項に記載のハイドロゲルの使用。
- 前記スキャフォールドが二次元細胞支持スキャフォールドである、請求項30に記載の使用。
- 前記スキャフォールドが三次元細胞支持スキャフォールドである、請求項30に記載の使用。
- 請求項25〜29のいずれか1項に記載のハイドロゲルを含む創傷ドレッシング。
- 創傷の処置において使用するための、請求項25〜29のいずれか1項に記載のハイドロゲル。
- 前記創傷が慢性創傷である、または、前記創傷が急性創傷である、請求項34に記載の使用のためのハイドロゲル。
- 請求項25〜29のいずれか1項に記載のハイドロゲルを含む眼移植片。
- 眼損傷の処置において使用するための請求項25〜29のいずれか1項に記載のハイドロゲル。
- 外因性生理活性配列を含む少なくとも1つのシャペロン/アッシャーファミリーポリペプチドモノマーを含むシャペロン/アッシャーファミリーポリマーを産生するための方法であって、
i)外因性生理活性配列を含むシャペロン/アッシャーファミリーポリペプチドモノマーをコードする核酸分子を、宿主細胞において発現させるための発現ベクターに組み込むステップと、
ii)宿主細胞に前記発現ベクターをトランスフェクトするステップと
を含み、
前記宿主細胞に、前記シャペロン/アッシャーファミリーポリペプチドモノマーに特異的なペリプラズムシャペロンをコードする核酸分子と、前記シャペロン/アッシャーファミリーポリペプチドモノマーに特異的な外膜アッシャータンパク質をコードする核酸分子とを与え、得られたトランスフェクト宿主細胞がシャペロン/アッシャーファミリーポリマーを産生する、方法。 - 前記生理活性配列が、実質的に非免疫原性である、請求項38に記載の方法。
- 前記モノマーには、天然に存在する接着モチーフが実質的にない、請求項38または請求項39に記載の方法。
- 前記シャペロン/アッシャーファミリーポリマーが画分1抗原ポリマーであり、外因性生理活性配列を含む前記少なくとも1つのシャペロン/アッシャーファミリーポリペプチドモノマーがCAF1ポリペプチドモノマーである、請求項38〜40のいずれか1項に記載の方法。
- 外因性生理活性配列を含むCAF1ポリペプチドモノマーをコードする前記核酸分子が、配列番号1のヌクレオチド配列に対して少なくとも70%の同一性を有する、請求項41に記載の方法。
- 前記シャペロン/アッシャーファミリーポリペプチドモノマーに特異的なペリプラズムシャペロンをコードする前記核酸分子が、CAF1に特異的なペリプラズムシャペロンをコードし、前記シャペロン/アッシャーファミリーポリペプチドモノマーに特異的な外膜アッシャータンパク質をコードする前記核酸分子が、CAF1に特異的な外膜アッシャータンパク質をコードする、請求項41または42に記載の方法。
- CAF1に特異的な前記ペリプラズムシャペロンをコードする前記核酸分子が、配列番号2のヌクレオチド配列に対して少なくとも70%の同一性を有する、請求項43に記載の方法。
- CAF1に特異的な前記外膜アッシャータンパク質をコードする前記核酸分子が、配列番号3のヌクレオチド配列に対して少なくとも70%の同一性を有する、請求項43または請求項44に記載の方法。
- i)CAF1に特異的なペリプラズムシャペロンをコードする前記核酸分子を、前記宿主細胞において発現させるための発現ベクターに組み込むステップと、
ii)前記宿主細胞に前記発現ベクターをトランスフェクトするステップと
により、CAF1に特異的なペリプラズムシャペロンをコードする前記核酸分子を前記宿主細胞に与える、請求項43〜45のいずれか1項に記載の方法。 - 前記発現ベクターが、細胞接着認識モチーフを含むCAF1ポリペプチドモノマーをコードする前記核酸分子をさらに含む、請求項46に記載の方法。
- i)CAF1に特異的な前記外膜アッシャータンパク質をコードする前記核酸分子を、前記宿主細胞において発現させるための発現ベクターに組み込むステップと、
ii)前記宿主細胞に前記発現ベクターをトランスフェクトするステップと
により、CAF1に特異的な前記外膜アッシャータンパク質をコードする前記核酸分子を前記宿主細胞に与える、請求項43〜47のいずれか1項に記載の方法。 - 前記発現ベクターが、細胞接着認識モチーフを含むCAF1ポリペプチドモノマーをコードする前記核酸分子および/またはCAF1に特異的なペリプラズムシャペロンをコードする前記核酸分子をさらに含む、請求項48に記載の方法。
- 前記宿主細胞に、前記シャペロン/アッシャーファミリーポリペプチドモノマーに特異的な発現調節因子をコードする核酸分子をさらに与える、請求項38〜49に記載の方法。
- 前記シャペロン/アッシャーファミリーポリペプチドモノマーに特異的な発現調節因子をコードする前記核酸分子が、CAF1に特異的な発現調節因子をコードする、請求項50に記載の方法。
- CAF1に特異的な前記発現調節因子をコードする前記核酸分子が、配列番号4のヌクレオチド配列に対して少なくとも70%の同一性を有する、請求項50または51に記載の方法。
- 前記生理活性配列が、細胞接着認識モチーフである、請求項38〜52のいずれか1項に記載の方法。
- 前記宿主細胞が、細菌細胞である、請求項38〜53のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細菌細胞が、グラム陰性細菌細胞である、請求項54に記載の方法。
- 前記細菌細胞が、大腸菌である、請求項55に記載の方法。
- 防汚剤としての画分1抗原ポリマーの使用。
- 画分1抗原ポリマーを含む防汚組成物。
- 添付図面を参照して本明細書に記載されるシャペロン/アッシャーファミリーポリマー。
- 添付図面を参照して本明細書に記載されるハイドロゲル。
- 添付図面を参照して本明細書に記載される創傷ドレッシング。
- 添付図面を参照して本明細書に記載される眼移植片。
- 添付図面を参照して本明細書に記載されるシャペロン/アッシャーファミリーポリマーを産生するための方法。
- 添付図面を参照して本明細書に記載される防汚組成物。
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