ES2861275T3 - Composiciones y métodos para la expresión y la purificación de péptidos usando un sistema de secreción de tipo III - Google Patents

Composiciones y métodos para la expresión y la purificación de péptidos usando un sistema de secreción de tipo III Download PDF

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Abstract

Un método para producir un péptido de interés, que comprende cultivar una línea celular que comprende una construcción de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico de FlgM, una secuencia de ácido nucleico que codifica un sitio de escisión de enterocinasa (ETK), un promotor ParaBAD y una secuencia de ácido nucleico de interés que codifica una toxina neuroactiva, y en donde la línea celular procede de bacterias seleccionadas del grupo que consiste en una cepa de tipo silvestre de Salmonella enterica serovariedad Typhimurium, una cepa mutante de Salmonella enterica serovariedad Typhimurium, Escherichia coli o Yersinia.

Description

DESCRIPCIÓN
Composiciones y métodos para la expresión y la purificación de péptidos usando un sistema de secreción de tipo III Referencia cruzada a solicitudes relacionadas
Referencia al listado de secuencias
El listado de secuencias enviado el 3 de junio de 2015 como un archivo de texto llamado "21101-0290U1_updated_sequence_listing.txt", creado el 1 de junio de 2015 y que tiene un tamaño de 18912 bytes se adjunta a la presente memoria descriptiva.
Campo de la invención
La invención desvelada se refiere, en general, al uso de FlgM en un sistema de secreción de tipo III para la expresión de un péptido de interés.
Antecedentes
Aunque se han logrado grandes avances en la expresión recombinante de proteínas, la expresión eficiente de determinadas clases de proteínas sigue siendo una dificultad. Estas incluyen los polipéptidos pequeños, farmacológicamente activos muy estables con una alta densidad de enlaces transversales de disulfuro. Un grupo importante dentro de esta clase general incluye los polipéptidos presentes en venenos de animales. Aunque varios linajes filogenéticos diferentes han desarrollado venenos de forma independiente, todos los polipéptidos hallados han desarrollado de manera convergente un conjunto común de propiedades que les permiten ser excepcionalmente estables tras su inyección en otro organismo. Estos polipéptidos son de cada vez más interesantes porque muchos de ellos tienen una actividad farmacológica novedosa y, por lo tanto, sirven como ligandos útiles en la investigación básica o tienen aplicaciones diagnósticas y terapéuticas directas. Uno de estos péptidos, MVIIA, un péptido de 25 aminoácidos con tres enlaces disulfuro, se ha convertido en un fármaco aprobado para el dolor incoercible.
Cuando se intenta la expresión recombinante de polipéptidos pequeños ricos en disulfuro, los rendimientos son generalmente bajos. Un problema fundamental es que cuando los niveles de expresión son altos, las altas concentraciones resultantes de polipéptido en la célula conducen a la formación de agregados intermoleculares y los polipéptidos recombinantes se encuentran principalmente en cuerpos de inclusión. La capacidad de recuperar el polipéptido de un cuerpo de inclusión en una forma biológicamente activa no es predecible y requiere etapas adicionales que varían dependiendo del polipéptido expresado.
Breve sumario
La presente invención está definida por el método de la reivindicación 1.
En el presente documento se desvelan composiciones y métodos para superar los obstáculos actuales de producción y purificación de polipéptidos ricos en cisteína. Se desvela la caracterización de diversos factores de control de la expresión génica flagelar, condiciones iónicas, fase de crecimiento celular y eliminación de proteasas celulares o competidores de secreción con el fin de mejorar el rendimiento de la proteína secretada.
En el presente documento se desvelan métodos para utilizar la proteína FlgM flagelar como vector para la secreción de pequeños, polipéptidos farmacológicamente activos altamente estables que contienen una alta densidad de restos de cisteína, que forman enlaces transversales de disulfuro en el producto maduro. Por ejemplo, se proporciona un sistema de secreción bacteriana para la expresión recombinante de p-conotoxina SIIIA en Salmonella typhimurium.
También se desvelan en el presente documento cepas bacterianas que pueden usarse para producir altos rendimientos de proteína secretada con el fin de purificar proteínas mediante T3S flagelar.
Se desvelan composiciones y métodos para la producción y purificación de polipéptidos usando un sistema flagelar bacteriano.
Se desvelan construcciones que comprenden una secuencia de ácido nucleico de FlgM, un sitio de escisión y una secuencia de ácido nucleico de interés. Las construcciones pueden comprender además una secuencia de ácido nucleico que codifica un marcador de purificación. El marcador de purificación puede ser poli-histidina.
La secuencia de ácido nucleico de FlgM de las construcciones desveladas puede ser FlgM de tipo silvestre. El sitio de escisión puede ser un sitio de escisión por proteasa del virus del grabado del tabaco (TEV) o un sitio de escisión por enterocinasa (ETK).
La secuencia de ácido nucleico de interés de las construcciones desveladas puede codificar un péptido rico en cisteína. El péptido rico en cisteína puede ser una toxina neuroactiva, tal como un conopéptido. El conopéptido puede ser una p-conotoxina tal como SIIIA.
Las construcciones desveladas pueden tener el sitio de escisión entre la secuencia de ácido nucleico de FlgM y la secuencia de ácido nucleico de interés. El orden de las secuencias en las construcciones puede ser la secuencia de ácido nucleico de FlgM, la secuencia de ácido nucleico que codifica un marcador de purificación, el sitio de escisión y la secuencia de ácido nucleico de interés. El orden de las secuencias en las construcciones puede ser la secuencia de ácido nucleico que codifica un marcador de purificación, la secuencia de ácido nucleico de FlgM, el sitio de escisión y la secuencia de ácido nucleico de interés. El orden de las secuencias en las construcciones también puede incluir la secuencia de ácido nucleico que codifica un marcador de purificación que está en dirección C-terminal con respecto a la secuencia de ácido nucleico de interés.
Las construcciones desveladas también pueden comprender un promotor ParaBAD.
También se describen polipéptidos que comprenden FlgM, un sitio de escisión y un péptido de interés. Los polipéptidos pueden comprender además un marcador de purificación. El marcador de purificación puede ser polihistidina.
El FlgM en los polipéptidos desvelados puede ser FlgM de tipo silvestre. El sitio de escisión puede ser un sitio de escisión de proteasa de TEV o un sitio de escisión de ETK.
El péptido de interés en los polipéptidos desvelados puede ser un péptido rico en cisteína. El péptido rico en cisteína puede ser una toxina neuroactiva tal como un conopéptido. El conopéptido puede ser una p-conotoxina tal como SIIIA.
Los polipéptidos desvelados pueden tener el sitio de escisión entre el FlgM y el péptido de interés. El orden de las secuencias en los polipéptidos puede ser que el FlgM esté en dirección N-terminal con respecto al marcador de purificación, el marcador de purificación esté en dirección N-terminal con respecto al sitio de escisión y el sitio de escisión esté en dirección N-terminal con respecto al péptido de interés. El orden de las secuencias en el polipéptido puede ser que el marcador de purificación esté en dirección N-terminal con respecto a FlgM, FlgM esté en dirección N-terminal con respecto al sitio de escisión y el sitio de escisión esté en dirección N-terminal con respecto al péptido de interés. En algunos aspectos, el marcador de purificación está en dirección C-terminal con respecto al péptido de interés.
También se desvelan líneas celulares recombinantes que comprenden cualquiera de las construcciones desveladas. La línea celular recombinante puede proceder de una cepa de tipo silvestre de Salmonella entérica serovariedad Typhimurium.
El genoma de las líneas celulares recombinantes desveladas puede comprender una alteración de uno o más genes de flagelina o de proteínas asociadas al gancho. El o los genes de flagelina se pueden seleccionar del grupo que consiste en flgK, flgL, fliC, fljB y fliD.
Las líneas celulares recombinantes desveladas pueden comprender una alteración de uno o más inhibidores del complejo proteico regulador maestro de FlhD4C2 flagelar. Los inhibidores del complejo proteico regulador maestro de FlhD4C2 flagelar se pueden seleccionar del grupo que consiste en fimZ, srgD, hdfR, rbsR, ompR, clpX, clpP, lrhA, ydiV, dskA, ecnR, fliT y rcsB.
Las líneas celulares recombinantes desveladas pueden comprender una mutación para aumentar la transcripción o traducción del gen fliA de la chaperona de FlgMT3S.
También se desvelan métodos para producir un péptido de interés que comprenden cultivar una línea celular que comprende cualquiera de los polipéptidos desvelados en medios de cultivo, en donde el polipéptido comprende el péptido de interés. Los métodos pueden incluir además purificar el péptido de interés del medio de cultivo. Los métodos pueden usar una línea celular que comprenda cualquiera de las construcciones desveladas.
La purificación del péptido de interés puede comprender una columna de afinidad tal como columna de afinidad a28. Los métodos desvelados pueden usar una línea celular que comprende un sistema de secreción flagelar de tipo III (T3 S) de Salmonella enterica serovariedad Typhimurium para secretar el polipéptido que comprende el péptido de interés.
Los métodos desvelados pueden usar una línea celular que comprende una alteración en uno o más genes de proteínas asociadas al gancho de flagelina. El o los genes de flagelina o proteínas asociadas al gancho se pueden seleccionar del grupo que consiste en flgK, flgL, fliC, fljB y fliD.
Los métodos desvelados pueden usar una línea celular que comprende una alteración de uno o más inhibidores del complejo proteico regulador maestro de FlhD4C2 flagelar. Los inhibidores del complejo proteico regulador maestro de FlhD4C2 flagelar se pueden seleccionar del grupo que consiste en fimZ, srgD, hdfR, rbsR, ompR, clpX, clpP, IrhA, ydiV, dskA, ecnR, fliT y rcsB.
Los métodos desvelados pueden usar una línea celular que comprende una mutación para aumentar la transcripción o traducción del gen fliA de chaperona de FlgM T3 S.
Se expondrán ventajas adicionales del método y composiciones desvelados en parte en la siguiente descripción y, en parte, se entenderán a partir de la descripción o pueden aprenderse por la práctica del método y composiciones desvelados. Las ventajas del método y composiciones desvelados se realizarán y obtendrán mediante los elementos y combinaciones señalados en particular en las reivindicaciones adjuntas. Debe entenderse que tanto la descripción general anterior como la siguiente descripción detallada son ilustrativas y explicativas.
Breve descripción de los dibujos
Los dibujos adjuntos, que constituyen parte de la presente memoria descriptiva, ilustran varias realizaciones del método y composiciones desvelados y, junto con la descripción, sirven para explicar los principios del método y composiciones divulgados.
La figura 1 muestra el diseño de un sistema de secreción flagelar de tipo III para la secreción de conotoxinas SIIIA. (A) Modelo: Una fusión traslacional de FlgM-SIIIA es un sustrato de secreción del T3SS bacteriano. La construcción de fusión se secreta a través del T3SS específico flagelar a través del canal flagelar al medio de cultivo a través de estructuras flagelares que son competentes para secreción de FlgM. Se induce expresión de FlgM-SIIIA tras la adición de arabinosa y es independiente de la expresión del gen flagelar de clase I y II. Durante el ensamblaje de HBB, FlgM permanece dentro del citosol y actúa como un factor anti-a28 que previene la transcripción de genes de clase III, p. ej., genes que codifican la subunidad de flagelina FliC o las proteínas del estator MotAB. La estructura de HBB se completa en 30 minutos, lo que coincide con un cambio de especificidad del sustrato dentro del aparato de secreción flagelar (indicado por un asterisco naranja en la figura) de la secreción de sustrato de temprana a tardía. Esto da lugar a la secreción de FlgM y sustratos necesarios durante la fase final del ensamblaje de los flagelos. ME: membrana externa, PG: capa de peptidoglucanos, MI: membrana interna. (B) Expresión y secreción de la proteína de fusión FlgW-SIIIA. Se precipitó FlgM-SIIIA secretado usando TCA y se muestran inmunotransferencias con anticuerpos contra FlgM para fracciones celulares y de sobrenadante. Las bandas proteicas de fusiones nativas de FlgM (triángulo abierto) y FlgM-SITIA (triángulo relleno) están marcadas junto a la mancha. Las construcciones 1-3 (etiquetadas como c1-c3) representan las siguientes fusiones de proteínas: c1 = H6-FlgM-TEV-SIIIA, c2 = FlgM-TEV-SIIIA-H6, c3 = FlgM-H6-TEV-SIIIA. Se ensayaron las eficiencias de secreción de tres construcciones de FlgM-SIIIA que variaban en su posición del marcador de poli-histidina. Se muestran los niveles de secreción para TH437 (peso, carril 1), TH4885 (AfliF, carril 2), TH5139 (AFlgM, carril 3), TH10874 (Para::FlgM-FKF, carril 4), TH15705 (fliA* Para::construcción 1, carril 5), TH15706 (fliA* Para::construcción 2, carril 6) y TH15707 (fliA * Para::construcción 3, carril 7). Las bandas de FlgM de tipo silvestre en el carril 5-7 eran visibles tras una exposición prolongada. (C) Se expresó FlgM-H6-TEV-SIIIA a partir del promotor de arabinosa y la secreción se comparó en un fondo de filAwt (carril 2), fliA* (H14D, carril 3) y AfliCD (carril 4). Se muestra secreción de FlgM de tipo silvestre expresado a partir de su promotor nativo en el carril 1 (TH437, etiquetado ts).
La figura 2 muestra la purificación y electrofisiología de la conotoxina recombinante SIIIA y la secreción de toxinas de diversos organismos a través del T3SS flagelar. (A) El sobrenadante de una cepa que expresa y secreta SIIIA recombinante fusionado con FlgM (TH15707 fliA* (H14D) AaraBAD1036::FlgM-H6-TEV-SIIIA) se filtró y se unió a una columna Ni2+-IDA como se describe en el ejemplo 1. La matriz se lavó después de la unión (WI-W3) y se eluyó FlgM-SIIIA en tres etapas con tampón de elución que contenía imidazol (E1-E3). Para la detección de transferencia de Western, las muestras se precipitaron con TCA. Debido al aumento de la concentración de FlgM-SIIIA en las fracciones de elución, solo se usó una décima parte del volumen para la precipitación con TCA de las fracciones de elución 1-3. (B) El SIIIA recombinante bloquea el canal de sodio NaV1.2 regulado por tensión. Se expuso un ovocito de Xenopus que expresaba NaV1.2 de rata a rSIIIA 10 pM mientras se supervisaban las corrientes de sodio como se describe en el ejemplo 1. Corrientes registradas antes de la exposición a la toxina (control, trazo gris) y después de ~20 min de exposición a rSIIIA 10 pM (trazo negro). Cada trazo representa el promedio de cinco respuestas. La diferencia de los valores máximos entre los dos trazos corresponde al efecto inhibidor que rSIIIA tiene sobre el canal Na V1.2. (C) FlgM-H6-TEV se fusionó traduccionalmente con seis toxinas diferentes de caracoles cónicos y una toxina de cada uno de anémona de mar, escorpión, araña y serpiente, y FlgM-H6 se fusionó con (D) la difteria de Corynebacterium diphtheriae (véase también la tabla 3 para una lista detallada). Las toxinas se expresaron en un fondo de poligancho de Salmonella. Se analizó la secreción del fragmento A de la toxina diftérica de la cepa TH16229 de Salmonella usando tres repeticiones biológicas independientes (marcadas 1-3). Se realizó secreción de toxinas recombinantes como se ha descrito anteriormente.
La figura 3 muestra el efecto del fondo de poligancho de Salmonella sobre la secreción. (A) Inmunotinción del fondo de poligancho TH16778 usado para la secreción de fusiones de FlgM-H6-TEV-toxina. Parte superior izquierda: Membrana teñida con FM-64. Parte superior derecha: ADN teñido con Hoechst. Parte inferior izquierda: Complejos flagelares de gancho-cuerpo basal (flgE::3xHA) marcados con anticuerpos antihemaglutinina acoplados a Alexa Fluor-488. La barra de escala es de 5 |jm. (B) Las proteínas secretadas se precipitaron usando TCA y se muestran inmunotransferencias con anticuerpos contra FlgM y FliK para fracciones celulares y de sobrenadantes. Las bandas proteicas de fusiones nativas de FlgM (triángulo abierto) y FlgM-SIIIA (triángulo relleno) están marcadas junto a la mancha. Los niveles de secreción se compararon midiendo la intensidad densitométrica de las bandas detectadas usando ImageJ. Los valores de secreción relativos a la secreción en un fondo de tipo silvestre de Para (primer carril) se muestran debajo de la banda correspondiente. La figura 4 muestra secreción de FlgM en condiciones de sobreexpresión de ParaBAD. Análisis de transferencia de Western de fracciones de sobrenadantes de cepas que sobreexpresan FlgM del promotor cromosómico araBAD (ParaBAD-FlgM+). Los cultivos de una noche se diluyeron 100 veces en medio lB, se incubaron a 37 °C durante 2 horas, seguido de la adición de arabinosa al 0,2 % para inducir ParaBAD-FlgM+. Después de 5 horas de incubación a 37 °C, las células se separaron del sobrenadante mediante centrifugación y se añadió TCA al sobrenadante celular para precipitar la proteína secretada (véase el ejemplo 2). Para el análisis de proteínas secretadas, se cargaron 100 unidades de DO de muestra en cada carril. Para el análisis de proteínas de células completas, se cargaron 50 unidades de DO de muestra. Se usó el anticuerpo anti-FlgM para determinar los niveles de FlgM secretado y de células completas (FlgM secretado = FlgM Se, FlgM de células completas = FlgM CC, arabinosa al 0,2 % = Ara).
La figura 5 muestra el efecto de la expresión del operón flhDC sobre los niveles de FlgM secretado y la movilidad celular. (A) Se determinaron los niveles secretados de FlgM en cepas afectadas en la expresión del operón de flhDC mediante análisis cuantitativo de transferencia de Western usando anticuerpo anti-FlgM para detectar FlgM en el sobrenadante del medio de cultivo gastado, (FigM secretado = FlgM Se, FlgM soluble celular = FlgM So, FlgM insoluble celular = FlgM Inso y DnaK celular completo = DnaK CC). (B) Niveles secretados relativos de FlgM. (C) Fenotipo de natación en placas de agar blando de la cepa THl8649 (APflhDC8089::tetR- PtetA AaraBAD115::FlgM+) sin inductores añadidos, 1 pg/ml de anhidrotetraciclina (ATc,) añadido tanto ATc como arabinosa (Ara) al 0,2 % añadidos. (D) Ensayo de movilidad en diversos fondos mutantes representados con AaraBAD11156:: FlgM en ausencia y presencia de arabinosa al 0,2 % añadida.
La figura 6 muestra el efecto de alelos de fliA(a28) en los niveles de FlgM secretado y la movilidad celular. (A) Se determinaron los niveles secretados de FlgM determinado en cepas que portan diferentes alelos del gen estructural de a28 fliA mediante análisis cuantitativo de transferencia de Western usando anticuerpo anti-FlgM para detectar FlgM en el sobrenadante del medio de cultivo gastado. (FlgM secretado = FlgM Se, FlgM celular completo = FlgM CC, FliA celular completo = FliA CC y DnaK celular completo = DnaK CC). (B) Niveles secretados relativos de FlgM. (C) Ensayo de movilidad en diversos fondos mutantes representados con AaraBAD1156::FlgM+ en ausencia y presencia de arabinosa al 0,2 % añadida.
La figura 7 muestra el efecto de la supresión de sustrato tardío flagelar, fase de crecimiento y mutaciones fljBenx vh2 en los niveles de FlgM secretado y la movilidad celular. (A) Se determinaron los niveles secretados de FlgM en cepas que portan diferentes mutantes de supresión de genes de sustrato tardío de flagelos (flgK, flgL, fliC, fliD y fljB), mutantes de fase de crecimiento (Ahin-5717, Ahin-5718) y mutantes fljBenx vh2 mediante análisis de transferencia de Western cuantitativo usando anticuerpo anti-FlgM para detectar FlgM en el sobrenadante del medio de cultivo gastado, (FlgM secretado = FlgM Se, FlgM soluble celular = FlgM So, FlgM insoluble celular = FlgM Inso y DnaK celular completo = DnaK CC). (B) Niveles secretados relativos de FlgM. (C) Ensayo de movilidad en diversos fondos mutantes representados con AaraBAD1156::FlgM+ en ausencia y presencia de arabinosa al 0,2 % añadida.
La figura 8 muestra los efectos de las mutaciones de supresión de chaperona de T3S de flagelos tardíos sobre los niveles de FlgM secretado y la movilidad celular. (A) Se determinaron los niveles secretados de FlgM en cepas que portan diferentes alelos mutantes de supresión de los genes flgN de chaperona de T3S flagelar, genes estructurales flis y fliT mediante análisis cuantitativo de transferencia de Western usando anticuerpo anti-FlgM para detectar FlgM en el sobrenadante del medio de cultivo gastado, (FlgM secretado = FlgM Se, FlgM celular completo = FlgM CC y DnaK celular completo = DnaK CC). (B) Niveles secretados relativos de FlgM. La figura 9 muestra los efectos de las mutaciones de supresión de mutaciones Spi-1 y Spi-2 sobre los niveles de FlgM secretado y la movilidad celular. (A) Se determinaron los niveles secretados de FlgM en cepas que portan alelos mutantes de supresión de los genes Spi1 o Spi2 mediante análisis cuantitativo de transferencia de Western usando anticuerpo anti-FlgM para detectar FlgM en el sobrenadante del medio de cultivo gastado, (FlgM secretado = FlgM Se, FlgM celular completo = FlgM CC y DnaK celular completo = DnaK CC). (B) Niveles secretados relativos de FlgM. (C) Ensayo de movilidad en diversos fondos mutantes representados con AaraBAD1156:: FlgM en ausencia y presencia de arabinosa al 0,2 % añadida.
La figura 10 muestra los efectos de los alelos mutantes de la proteasa celular sobre los niveles de FlgM secretado y la movilidad celular. (A) Se determinaron los niveles secretados de FlgM en cepas portadoras de alelos mutantes por supresión de los genes de ompT, degP, clpA, clpX o clpP con y sin un operón flhDC funcional mediante análisis de transferencia de Western cuantitativo usando anticuerpo anti-FlgM para detectar FlgM en el sobrenadante del medio de cultivo gastado, (FlgM secretado = FlgM Se, FlgM celular completo = FlgM CC y DnaK celular completo = DnaK CC). (B) Los niveles secretados relativos de FlgM en los fondos flhD+C+ y flhDC nulo y el nivel de acumulación relativo de FlgM en células completas en fondo flhDC nulo. (C) Ensayo de movilidad en diversos fondos mutantes representados con AaraBAD1156: FlgM en ausencia y presencia de arabinosa al 0,2 % añadida.
La figura 11 muestra los efectos de las fuerzas iónicas de NaCl y KCl sobre los niveles de FlgM secretado y la movilidad celular. (A) Se determinaron los niveles secretados de FlgM en medio con NaCl y KCl añadidos a las concentraciones representadas por análisis de transferencia de Western cuantitativo usando anticuerpo anti-FlgM para detectar FlgM en el sobrenadante del medio de cultivo gastado, (FlgM secretado = FlgM Se, FlgM soluble celular = FlgM So, FlgM insoluble celular = FlgM Inso y DnaK celular completo = DnaK CC). (B) Niveles secretados relativos de FlgM. (C) Ensayo de movilidad en diversos fondos mutantes representados con AaraBAD1156:: FlgM+ en ausencia y presencia de arabinosa al 0,2 % añadida.
La figura 12 muestra los efectos de diferentes mutaciones combinadas sobre los niveles de FlgM secretado. (A) Se determinaron los niveles secretados de FlgM en cepas que portaban diferentes mutaciones combinadas representadas por análisis cuantitativo de transferencia de Western usando anticuerpo anti-FlgM para detectar FlgM en el sobrenadante del medio de cultivo gastado (FlgM secretado = FlgM Se, FlgM celular completo = FlgM CC y DnaK celular completo = DnaK CC). (B) Niveles secretados relativos de FlgM.
La figura 13 muestra los efectos de diferentes mutaciones combinadas sobre los niveles de FlgM-6H-TEV-8-SVIE secretado y FlgM-6H-ETK-8-SVIE. (A) Se determinaron los niveles secretados de FlgM-6His-TEV-8-SVIE y FlgM-6His-ETK-8-SVIE en cepas que portaban diferentes mutaciones combinadas representadas por análisis de transferencia de western cuantitativo usando anticuerpo anti-FlgM para detectar FlgM-6His-TEV-8-SVIE y FlgM-6His-ETK-8-SVIE en el sobrenadante del medio de cultivo gastado (FlgM-6His-TEV-8-SVIE secretado = FlgM-6His-TEV-SVIE Se, FlgM-6His-ETK-8-SVIE secretado = FlgM-6His-ETK-8-SVIE Se, FlgM secretado = FlgM Se y DnaK celular completo = DnaK CC). (B) Niveles secretados relativos de FlgM-6His-TEV-8-SVIE y FlgM-6His-ETK-S-SVIE.
La figura 14 muestra proteínas secretadas de tipo III. Se procesó un gel de SDS teñido con coomassie del medio de cultivo gastado de células de Salmonella en cepas de tipo silvestre y mutantes. Carril 1 tipo silvestre, carril 2 mot, carril 3 fliK, carril 4 flhD, carril 5 flhD invA. La figura 15 muestra el sistema de inyectisoma SPI1 de Salmonella. (A) Todos los genes necesarios para la estructura y el ensamblaje del inyectisoma SPI1 se agrupan en el cromosoma. (B) Los genes de SPI1 están bajo el control del operón maestro flagelar flhDC, lo que conduce a la transcripción sucesiva de los reguladores de FliZ, HilD y HilA y HilA es necesario para la transcripción del gen del inyectisoma. (C) La finalización del cuerpo basal del inyectisoma (IBB) es seguida del ensamblaje de (D) la aguja y (E) el translocón.
La figura 16 muestra las estructuras flagelar y del inyectisoma SPI1. Las estructuras muestran similitudes generales en la estructura con fuertes homologías con las proteínas componentes basales y asociadas a la secreción.
Descripción detallada
El método y composiciones desvelados pueden entenderse más fácilmente por referencia a la siguiente descripción detallada de las realizaciones particulares y el ejemplo incluido en la misma y a las figuras y su descripción previa y la siguiente.
Debe entenderse que el método y las composiciones desvelados no se limitan a métodos sintéticos específicos, técnicas analíticas específicas o reactivos particulares a menos que se especifique lo contrario y, como tales, pueden variar. También debe entenderse que la terminología usada en el presente documento es únicamente con el fin de describir realizaciones particulares y no se pretende que sea limitante.
A. Definiciones
Se entiende que el método y las composiciones desvelados no se limitan a la metodología, los protocolos y los reactivos concretos descritos, ya que estos pueden variar. También debe entenderse que la terminología usada en el presente documento tiene el fin de describir únicamente realizaciones específicas y no se pretende que limite el alcance de la presente invención, que estará limitada únicamente por las reivindicaciones adjuntas.
A menos que definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen los mismos significados que entiende habitualmente un experto en la materia a la que pertenecen el método y las composiciones divulgados. Aunque puede usarse cualquier método y material similares o equivalentes a los descritos en el presente documento en la práctica o prueba del presente método y composiciones, los métodos, dispositivos y materiales particularmente útiles son como se describen. El análisis de las referencias indica lo que afirman sus autores y los solicitantes se reservan el derecho a cuestionar la precisión y pertinencia de los documentos citados. Se entenderá claramente que, aunque se hace referencia a varias publicaciones en la presente memoria, dicha referencia no constituye una admisión de que ninguno de estos documentos forme parte del conocimiento general habitual en la técnica.
Cabe destacar que, como se usan en el presente documento y en las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular "un", "uno/una" y "el/la" incluyen referencias en plural, salvo que el contexto indique claramente otra cosa. Por tanto, por ejemplo, la referencia a "un polipéptido" incluye una pluralidad de dichos polipéptidos, la referencia a "la línea celular" es una referencia a una o más líneas celulares y equivalentes de las mismas conocidas por los expertos en la materia, y así sucesivamente.
"Opcional" o "de forma opcional" significa que el acontecimiento, circunstancia o material posteriormente descrito, puede producirse o estar presente o no y que la descripción incluye casos en los que el acontecimiento, circunstancia o material se produce o está presente y casos en los que no se produce o no está presente.
En el presente documento los intervalos se pueden expresar como desde "aproximadamente" un valor concreto y/o hasta "aproximadamente" otro valor concreto. Cuando se expresa un intervalo de este tipo, también se contempla y se considera desvelado específicamente el intervalo desde el valor concreto y/o hasta el otro valor concreto a menos que el contexto indique específicamente otra cosa. De manera similar, cuando los valores se expresan como aproximaciones, mediante el uso del antecedente "aproximadamente", se entenderá que el valor concreto constituye otra realización contemplada específicamente que debería considerarse desvelada a menos que el contexto indique específicamente otra cosa. Se entenderá además que los criterios de valoración de cada uno de los intervalos son significativos tanto en relación con el otro criterio de valoración como independientemente del otro criterio de valoración a menos que el contexto indique específicamente otra cosa. Por último, debe entenderse que todos los valores individuales y subintervalos de valores contenidos dentro de un intervalo desvelado explícitamente también se contemplan de manera específica y deben considerarse desvelados a menos que el contexto indique específicamente otra cosa. Lo anterior se aplica independientemente de si, en casos concretos, algunas o todas estas realizaciones se desvelan de manera explícita.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones de la presente memoria descriptiva, la palabra "comprender" y variaciones de la palabra, tales como "que comprende" y "comprende", significa "incluyendo, pero sin limitación" y no se pretende que excluya, por ejemplo, otros aditivos, componentes, elementos integrantes o etapas. En particular, en los métodos que se indica que comprenden una o más etapas u operaciones, se contempla específicamente que cada etapa comprende lo que se enumera (a menos que esa etapa incluya una expresión limitante, tal como "que consiste en"), lo que significa que no se pretende que cada etapa excluya, por ejemplo, otros aditivos, componentes, elementos integrantes o etapas que no se enumeran en la etapa.
El término "vector" se refiere a una secuencia de ácido nucleico capaz de transportar a una célula otro al que se ha unido la secuencia de vector. La expresión "vector de expresión" incluye cualquier vector, (p. ej., un plásmido, cósmido o cromosoma de fago) que contenga una construcción génica en una forma adecuada para su expresión por una célula (p. ej., unida a un elemento de control de la transcripción). "Plásmido" y "vector" se usan indistintamente, ya que el plásmido es una forma de vector usada habitualmente.
La expresión "secuencia de interés" o "secuencia de ácido nucleico de interés" puede significar una secuencia de ácido nucleico (p. ej., un gen capaz de codificar un péptido rico en cisteína), que es parcial o totalmente heterólogo, es decir, extraño, con respecto a una célula en la que se introduce.
La expresión "secuencia de interés" o "secuencia de ácido nucleico de interés" también puede significar una secuencia de ácido nucleico, que es parcial o totalmente homóloga con respecto a un gen endógeno de la célula en la que se introduce, pero que está diseñada para insertarse en el genoma de la célula de tal manera que altere el genoma (p. ej., se inserta en una ubicación que difiere de la del gen natural o su inserción da lugar a "una introducción génica"). Por ejemplo, una secuencia de interés puede ser ADNc, ADN o ARNm.
Un "péptido de interés" o "proteína de interés" significa una secuencia peptídica o polipeptídica (p. ej., un péptido rico en cisteína), que se expresa a partir de una secuencia de interés o secuencia de ácido nucleico de interés.
La expresión "unido operativamente a" se refiere a la relación funcional de un ácido nucleico con otra secuencia de ácido nucleico. Los promotores, potenciadores, sitios de detención de la transcripción y la traducción y otras secuencias señal son ejemplos de secuencias de ácido nucleico unidas operativamente a otras secuencias. Por ejemplo, el enlace operativo de ADN a un elemento de control de la transcripción puede referirse a la relación física y funcional entre el a Dn y el promotor, de modo que la transcripción de dicho ADN se inicia a partir del promotor por una ARN polimerasa que reconoce específicamente, se une y transcribe el ADN.
Los términos "transformación" y "transfección" significan la introducción de un ácido nucleico, p. ej., un vector de expresión, en una célula receptora, incluyendo la introducción de un ácido nucleico en el ADN cromosómico de dicha célula.
También se desvelan elementos de control de la transcripción (ECT). Los ECT son elementos capaces de impulsar la expresión de secuencias de ácido nucleico unidas operativamente a los mismos. Las construcciones desveladas en el presente documento comprenden al menos un ECT. Los ECT pueden ser opcionalmente constitutivos o regulables.
Se desvelan materiales, composiciones y componentes que se pueden usar para, se pueden usar junto con, se pueden usar en la preparación de o son productos del método y composiciones desvelados. Estos y otros materiales se desvelan en el presente documento y se entiende que cuando se desvelan combinaciones, subconjuntos, interacciones, grupos, etc. de estos materiales, aunque puede no desvelarse explícitamente una referencia específica a cada una de diversas combinaciones colectivas e individuales y permutaciones de estos compuestos, cada uno se contempla específicamente y se describe en el presente documento. Por ejemplo, si se desvela y analiza una construcción y se analizan varias modificaciones que pueden realizarse a varias moléculas, incluyendo la construcción, todas y cada una de las combinaciones y permutaciones de la construcción y las modificaciones que sean posibles se contemplan de manera específica salvo que se indique específicamente lo contrario. Por tanto, si se desvela una clase de moléculas A, B y C, así como una clase de moléculas D, E y F y se desvela un ejemplo de una molécula de combinación, A-D, entonces, incluso si cada una no se enumera individualmente, cada una se contempla individual y colectivamente. Por tanto, en este ejemplo, cada una de las combinaciones A-E, A-F, B-D, B­ E, B-F, C-D, C-E y C-F se contemplan específicamente y deben considerarse desveladas a partir de la divulgación de A, B y C; D, E y F; y la combinación ilustrativa A-D. De forma análoga, cualquier subconjunto o combinación de estos también se contempla y se desvela de manera específica. Por tanto, por ejemplo, el subgrupo de A-E, B-F y C­ E se contemplan específicamente y deben considerarse desvelados a partir de la divulgación de A, B y C; D, E y F; y la combinación ilustrativa A-D. Este concepto se aplica a todos los aspectos de la presente solicitud, incluyendo, pero sin limitación, las etapas en los métodos para fabricar y usar las composiciones desveladas. Por tanto, si existen diversas etapas adicionales que se pueden realizar, se entiende que cada una de estas etapas adicionales se puede realizar con cualquier realización específica o combinación de realizaciones de los métodos desvelados, y que cada una de dichas combinaciones se contempla específicamente y debe considerarse desvelada
Los expertos en la materia reconocerán, o serán capaces de determinar sin utilizar más que la experimentación rutinaria, muchos equivalentes de las realizaciones específicas del método y las composiciones descritos en el presente documento. Se pretende que dichos equivalentes estén abarcados por las siguientes reivindicaciones. B. Flagelos de bacterias
Muchas bacterias utilizan flagelos para moverse de manera dirigida, ya sea alejándose de entornos de tensión o hacia nutrientes, O2, luz y otros estímulos positivos. El flagelo bacteriano es una máquina celular compleja que requiere más de 30 productos génicos para su construcción. Para Salmonella entérica existen actualmente más de 60 genes implicados en la biogénesis y función de sus flagelos. Estos genes están organizados en una jerarquía transcripcional de 3 clases de promotores. En la cima de la jerarquía transcripcional flagelar está el operón flhDC que codifica las proteínas reguladoras maestras FlhD y FlhC, que forman un complejo de activación transcripcional, heteromultimérico. El complejo FlhD4C2 dirige la ARN polimerasa a70 para transcribir a partir de promotores flagelares de clase 2. Los genes flagelares de clase 2 codifican proteínas necesarias para la estructura y ensamblaje de un motor rotatorio denominado cuerpo basal del gancho (HBB), un intermedio estructural clave en el ensamblaje del flagelo. El HBB incluye el sistema de secreción flagelar de tipo III (T3S), que exporta proteínas flagelares del citoplasma a través de la estructura en crecimiento durante el ensamblaje. Además de la expresión del gen de HBB, la transcripción flagelar de clase 2 produce a28 (FliA) y FlgM. Estas son proteínas reguladoras que acoplan la transcripción de los promotores flagelares de clase 3 para completar el HBB. La proteína a28 es un factor de transcripción específico flagelar que dirige la ARN polimerasa para transcribir a partir de los promotores flagelares de clase 3. Los genes de clase 3 incluyen los genes estructurales del filamento flagelar y genes del sistema de transducción de señales quimiosensoriales que controla la dirección de la rotación flagelar según las concentraciones cambiantes de ligandos extracelulares. Antes de completar e1HBB, FlgM se une a a28 y evita la transcripción del promotor flagelar de clase 3. Tras completar el HBB, un cambio en la especificidad del sustrato flagelar de T3S da lugar a secreción de FlgM e iniciación de la transcripción dependiente de a28 a partir de promotores flagelares de clase 3. Los requisitos de la señal de secreción para los sustratos de T3S siguen estando poco definidos, pero todos los sustratos utilizan una señal de secreción peptídica N-terminal que tiene una estructura desordenada y, a diferencia de la secreción de tipo II, no se escinde durante el proceso de secreción. La secreción de sustrato se ve facilitada con frecuencia por el suministro asistido por chaperona de T3S al aparato de secreción. La proteína FlgM tiene 97 aminoácidos de longitud y su secreción depende de una señal de secreción N-terminal. La secreción de FlgM aumenta en gran medida por su chaperona de secreción, a28, que se une a la mitad C-terminal de FlgM.
Debido a que FlgM es un sustrato pequeño de T3S y no forma parte de la estructura flagelar final, se puede utilizar como vehículo para dirigir la secreción de proteínas con fines de purificación. Se puede utilizar la fusión de péptidos extraños con el extremo C de FlgM para dirigir su secreción al periplasma o al medio extracelular. El sistema de secreción de tipo III de FlgM se puede utilizar para expresar y purificar proteínas recombinadas.
Se desvelan construcciones y métodos que utilizan un sistema de expresión que aprovecha el sistema de secreción flagelar de Salmonella entérica serovar Typhimurium (Salmonella typhimurium) y evita el problema de los cuerpos de inclusión de la expresión de péptidos pequeños recombinantes.
C. Construcciones de ácido nucleico
Se desvelan construcciones de ácido nucleico que comprenden una secuencia de ácido nucleico de FlgM, un sitio de escisión y una secuencia de ácido nucleico de interés. Las construcciones pueden comprender además una secuencia de ácido nucleico que codifica un marcador de purificación.
El orden de la secuencia de ácido nucleico de FlgM, el sitio de escisión y la secuencia de ácido nucleico de interés puede variar. En algunos aspectos, el orden de las secuencias puede ser, de 5' a 3', la secuencia de ácido nucleico de FlgM, la secuencia de ácido nucleico que codifica un marcador de purificación, el sitio de escisión y la secuencia de ácido nucleico de interés. En algunos aspectos, el orden de las secuencias puede ser, de 5' a 3', la secuencia de ácido nucleico que codifica un marcador de purificación, la secuencia de ácido nucleico de FlgM, el sitio de escisión y la secuencia de ácido nucleico de interés. En algunos aspectos, el orden de las secuencias puede ser, de 5' a 3', la secuencia de ácido nucleico de FlgM, el sitio de escisión, la secuencia de ácido nucleico que codifica un marcador de purificación y la secuencia de ácido nucleico de interés. En algunos aspectos, el orden de las secuencias puede ser, de 5' a 3', la secuencia de ácido nucleico de FlgM, el sitio de escisión, la secuencia de ácido nucleico de interés y la secuencia de ácido nucleico que codifica un marcador de purificación. Por tanto, la secuencia de ácido nucleico que codifica un marcador de purificación puede estar en dirección 5' o 3' con respecto a la secuencia de ácido nucleico de interés.
1. FlgM
Las construcciones desveladas comprenden una secuencia de ácido nucleico de FlgM. La secuencia de ácido nucleico de FlgM puede ser FlgM de tipo silvestre. En algunos aspectos, la secuencia de ácido nucleico de FlgM puede ser una secuencia mutante de FlgM. La secuencia mutante de FlgM puede tener una o más mutaciones de nucleótidos en comparación con FlgM de tipo silvestre. En algunos aspectos, las mutaciones no cambian la secuencia de aminoácidos codificada. En algunos aspectos, las mutaciones en la secuencia de ácido nucleico mutante de FlgM no afectan a la capacidad del péptido FlgM codificado para actuar como vector para la secreción del péptido codificado por la secuencia de ácido nucleico de interés.
2. Sitio de escisión
Las construcciones desveladas pueden comprender un sitio de escisión entre la secuencia de ácido nucleico de FlgM y la secuencia de ácido nucleico de interés. El sitio de escisión puede ser un sitio de escisión por proteasa del virus del grabado del tabaco (TEV) o un sitio de escisión por enterocinasa (ETK). Pueden usarse otros sitios de escisión conocidos por los expertos en la materia. Aunque el sitio de escisión se encuentra entre la secuencia de ácido nucleico de FlgM y la secuencia de ácido nucleico de interés, el sitio de escisión no siempre tiene que ser contiguo a esas secuencias. En otras palabras, una secuencia que codifica un marcador de purificación puede estar directamente antes o después del sitio de escisión.
El sitio de escisión puede ser un sitio de escisión por proteasa. Por lo tanto, la secuencia de ácido nucleico del sitio de escisión puede codificar un sitio de escisión por proteasa. El sitio de escisión no es un sitio de escisión por nucleasa y, por tanto, las secuencias de ácido nucleico presentes en las construcciones no se escinden. El sitio de escisión permite la escisión del polipéptido codificado por las construcciones desveladas. La escisión del polipéptido codificado por las construcciones desveladas puede liberar el péptido de interés (codificado por el ácido nucleico de interés) del péptido de FlgM (codificado por la secuencia de ácido nucleico de FlgM).
3. Secuencia de ácido nucleico de interés
Las construcciones desveladas comprenden una secuencia de ácido nucleico de interés. La secuencia de ácido nucleico de interés puede codificar un péptido de interés para expresar y purificar usando el sistema de FlgM proporcionado en el presente documento.
En algunos aspectos, la secuencia de ácido nucleico de interés codifica un péptido rico en cisteína o un péptido rico en disulfuro. La expresión recombinante de polipéptidos pequeños ricos en disulfuro da lugar a rendimientos generalmente bajos. La sobreexpresión de estos polipéptidos puede conducir a la formación de agregados intermoleculares y los polipéptidos recombinantes pueden encontrarse en los cuerpos de inclusión. Debido a que la recuperación de los polipéptidos de los cuerpos de inclusión puede ser difícil y llevar mucho tiempo, estos polipéptidos ricos en disulfuro se purifican mejor usando el sistema de expresión de FlgM desvelado en el presente documento.
En algunos aspectos, la secuencia de ácido nucleico de interés codifica un péptido rico en cisteína o un péptido rico en disulfuro, en donde el polipéptido rico en disulfuro o rico en cisteína es una toxina neuroactiva. La toxina neuroactiva puede ser cualquier toxina neuroactiva. En algunos aspectos, la toxina neuroactiva puede ser una toxina procedente de conoideo (es decir, una toxina de un conoideo). En algunos aspectos, la toxina neuroactiva puede ser un conopéptido. El conopéptido puede ser una p-conotoxina. Los ejemplos de p-conotoxinas incluyen, pero sin limitación, SIIIA.
4. Marcador de purificación
Las construcciones desveladas pueden comprender además una secuencia que codifica un marcador de purificación. Los ejemplos de marcadores de purificación incluyen, pero sin limitación, poli-histidina, glutatión S-transferasa (GST), Myc, HA, FLAG y proteína de unión a maltosa (MBP). Por tanto, se desvelan secuencias de ácido nucleico que codifican estos marcadores de purificación. Los marcadores de purificación y las secuencias de ácido nucleico que los codifican son bien conocidos en la técnica.
5. Promotor
Las construcciones desveladas también pueden comprender elementos de control de la transcripción (ECT). Los ECT son elementos capaces de impulsar la expresión de secuencias de ácido nucleico unidas operativamente a los mismos. Las construcciones desveladas en el presente documento comprenden al menos un ECT. Los ECT pueden ser opcionalmente constitutivos o regulables. Por ejemplo, se desvelan en el presente documento construcciones que comprenden un promotor ParaBAD. El promotor ParaBAD es un promotor inducible por arabinosa. Esto permite que la expresión de las secuencias de ácido nucleico cadena abajo del promotor se active o desactive en presencia o ausencia de arabinosa.
Los ECT regulables pueden comprender una secuencia de ácido nucleico capaz de unirse a un dominio de unión de una proteína de fusión expresada a partir de una construcción reguladora de modo que el dominio de represión de la transcripción actúe para reprimir la transcripción de una secuencia de ácido nucleico contenida dentro del ECT regulable.
Como alternativa, la construcción que comprende el ECT regulable puede comprender además la secuencia de ácido nucleico capaz de codificar una proteína de fusión represora controlable por fármacos (tal como una inducible por fármacos) que comprende un dominio de unión a ADN y un dominio de represión de la transcripción. En dicha disposición, la secuencia de ácido nucleico capaz de codificar una proteína de fusión represora controlable por fármacos (tal como una inducible por fármacos) está en la misma construcción que el ECT regulable al que se une la proteína de fusión represora.
Los ECT regulables pueden comprender opcionalmente una secuencia diana reguladora. Las secuencias diana reguladoras pueden comprender una secuencia de ácido nucleico capaz de unirse a un dominio de unión de una proteína de fusión expresada a partir de una construcción reguladora de modo que un dominio de represión de la transcripción actúe para reprimir la transcripción de una secuencia de ácido nucleico contenida dentro del ECT regulable. Las secuencias diana reguladoras pueden comprender una o más secuencias operadoras tet (tetO). Las secuencias diana reguladoras pueden unirse operativamente a otras secuencias, incluyendo, pero sin limitación, una secuencia TATA o una secuencia de ácido nucleico que codifica GAL-4.
La presencia de un ECT regulable y una secuencia reguladora, bien si están en la misma construcción o en una diferente, permite la expresión inducible y reversible de las secuencias unidas operativamente al ECT regulable. Como tal, el ECT regulable puede proporcionar un medio para inducir e invertir selectivamente la expresión de una secuencia de interés.
Los ECT regulables pueden ser regulados por, por ejemplo, tetraciclina o doxiciclina. Asimismo, los ECT pueden comprender opcionalmente al menos una secuencia operadora tet.
D. Polipéptidos
También se desvelan en el presente documento polipéptidos codificados por las construcciones de ácido nucleico desveladas anteriormente y en otras partes del presente documento. Por ejemplo, se desvelan en el presente documento polipéptidos que comprenden FlgM, un sitio de escisión y un péptido de interés. Los polipéptidos pueden comprender además un marcador de purificación.
En los polipéptidos desvelados, el FlgM puede estar en dirección N-terminal con respecto al marcador de purificación, el marcador de purificación puede estar en dirección N-terminal con respecto al sitio de escisión y el sitio de escisión puede estar en dirección N-terminal con respecto al péptido de interés. Como alternativa, el marcador de purificación puede estar en dirección N-terminal con respecto a FlgM, FlgM puede estar en dirección N-terminal con respecto al sitio de escisión y el sitio de escisión puede estar en dirección N-terminal con respecto al péptido de interés. En algunos aspectos, el marcador de purificación puede estar en dirección C-terminal con respecto al péptido de interés.
Por tanto, el orden del polipéptido puede ser, por ejemplo, 1) marcador-FlgM-sitio de escisión-péptido de interés, 2) FlgM-marcador-sitio de escisión-péptido de interés, 3) FlgM-sitio de escisión-marcador-péptido de interés o 4) FlgM-sitio de escisión-péptido de interés-marcador.
1. FlgM
Los polipéptidos desvelados comprenden FlgM. El FlgM puede ser FlgM de tipo silvestre. En algunos aspectos, el FlgM puede ser un FlgM mutante. El FlgM mutante puede tener una o más mutaciones de aminoácidos en comparación con FlgM de tipo silvestre. En algunos aspectos, las mutaciones en el FlgM mutante no afectan a la capacidad de FlgM para actuar como vector para la secreción del péptido de interés.
2. Sitio de escisión
Los polipéptidos desvelados pueden comprender un sitio de escisión entre el FlgM y el péptido de interés. El sitio de escisión puede ser un sitio de escisión de proteasa de TEV o un sitio de escisión de ETK. Aunque el sitio de escisión está entre el FlgM y el péptido de interés, el sitio de escisión no siempre tiene que ser contiguo con FlgM y el péptido de interés. En otras palabras, un marcador de purificación puede estar directamente antes o después del sitio de escisión.
El sitio de escisión puede ser un sitio de escisión por proteasa. El sitio de escisión permite la escisión del polipéptido. La escisión del polipéptido puede liberar el péptido de interés del FlgM.
3. Péptido de interés
Los polipéptidos desvelados comprenden un péptido de interés. El péptido de interés puede ser un péptido que se exprese usando el sistema de FlgM proporcionado en el presente documento.
En algunos aspectos, el péptido de interés puede ser un péptido rico en cisteína o un péptido rico en disulfuro. Los péptidos ricos en disulfuro o ricos en cisteína pueden ser una toxina neuroactiva. La toxina neuroactiva puede ser cualquier toxina neuroactiva. En algunos aspectos, la toxina neuroactiva puede ser una toxina procedente de conoideo (es decir, una toxina de un conoideo). En algunos aspectos, la toxina neuroactiva puede ser un conopéptido. El conopéptido puede ser una p-conotoxina. Los ejemplos de p-conotoxinas incluyen, pero sin limitación, SIIIA.
El péptido de interés puede variar de tamaño. En algunos aspectos, el péptido de interés puede tener una longitud de 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 100 aminoácidos. En algunos aspectos, el péptido de interés puede tener una longitud de 5, 10, 15, 20, 25, 30 o 35 aminoácidos. El péptido de interés puede variar de tamaño. En algunos aspectos, el péptido de interés puede tener una longitud de 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 o 1000 aminoácidos. En algunos aspectos, el péptido de interés puede tener una longitud de 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550 o 600 aminoácidos.
4. Marcador de purificación
Los polipéptidos desvelados pueden comprender además un marcador de purificación. Los ejemplos de marcadores de purificación incluyen, pero sin limitación, poli-histidina, glutatión S-transferasa (GST), Myc, HA, FLAG y proteína de unión a maltosa (MBP).
El marcador de purificación se puede usar para purificar el polipéptido después de que se haya secretado en el medio de cultivo a través del sistema de secreción de FlgM.
E. Líneas celulares
Se desvelan las líneas celulares recombinantes proporcionadas en las tablas 1 y 4.
También se desvelan en el presente documento líneas celulares recombinantes que comprenden cualquiera de las construcciones desveladas que comprenden una secuencia de ácido nucleico de FlgM, un sitio de escisión y una secuencia de ácido nucleico de interés. En algunos aspectos, las líneas celulares recombinantes pueden comprender una o más de las siguientes secuencias: secuencia de ácido nucleico de FlgM, un sitio de escisión y una secuencia de ácido nucleico de interés. En algunos aspectos, las líneas celulares recombinantes pueden tener una mutación de la construcción que comprende la secuencia de ácido nucleico FlgM, un sitio de escisión y una secuencia de ácido nucleico de interés.
Las líneas celulares recombinantes pueden proceder de una cepa de tipo silvestre de Salmonella entérica serovariedad Typhimurium. En algunos aspectos, la línea celular recombinante puede proceder de una cepa mutante de Salmonella entérica serovariedad Typhimurium. Las líneas celulares recombinantes pueden proceder de otras especies bacterianas entéricas. Por ejemplo, las líneas celulares recombinantes pueden proceder de E. coli o Yersinia.
Se desvelan líneas celulares recombinantes, en donde el genoma de la línea celular recombinante comprende una alteración de uno o más genes de flagelina o de proteínas asociadas al gancho. El o los genes de flagelina se pueden seleccionar del grupo que consiste en flgK, flgL, fliC, fljB y fliD.
Se desvelan líneas celulares recombinantes, en donde la línea celular comprende una alteración de uno o más inhibidores del complejo proteico regulador maestro de FlhD4C2 flagelar. Los inhibidores del complejo proteico regulador maestro de FlhD4C2 flagelar se pueden seleccionar del grupo que consiste en fimZ, srgD, hdfR, rbsR, ompR, clpX, clpP, lrhA, ydiV, dskA, ecnR, fliT y resB. Junto con a70, FlhD4C2 activa la transcripción de promotores de clase II, incluyendo los de fliA, FlgM, y genes para el ensamblaje del cuerpo basal del gancho. La inhibición de FlhD4C2 puede dar lugar a una reducción de FlgM o del número de estructuras de cuerpos basales del gancho. Por lo tanto, las líneas celulares recombinantes que tienen una alteración de uno o más inhibidores del complejo de proteína reguladora maestra de FlhD4C2 flagelar puede afectar positivamente a la secreción de polipéptidos desvelados.
Las líneas celulares recombinantes pueden comprender una mutación para aumentar la transcripción o traducción del gen fliA de la chaperona de FlgMT3S. FliA se considera un gen de la chaperona de FlgM T3S porque filA codifica a28 y a28 se une a FlgM y protege FlgM de la proteólisis en el citoplasma de la célula. Por lo tanto, una mutación que aumenta la transcripción o traducción del gen fliA puede conducir a más o mejor secreción de FlgM. Además, como se desvela en las construcciones del presente documento, FlgM es parte de un polipéptido que también contiene un péptido de interés. Por tanto, más o mejor secreción de FlgM conduce a más o mejor secreción del péptido de interés. En algunos aspectos, las mutaciones en el gen fliA dieron lugar a una mutación H14N, H14D, T1381 o E203D en el a28 codificado,
También se desvelan combinaciones de cualquiera de las líneas celulares desveladas. Estas cepas de combinación pueden comprender cualquiera de las construcciones desveladas que tienen una secuencia de ácido nucleico de FlgM, un sitio de escisión y una secuencia de ácido nucleico de interés.
F. Métodos
Se desvelan métodos para producir un péptido de interés que comprenden cultivar una línea celular en medios de cultivo en donde la línea celular comprende cualquiera de los polipéptidos desvelados que contienen FlgM, un sitio de escisión y el péptido de interés. Los métodos pueden incluir además purificar el péptido de interés del medio de cultivo.
Los métodos desvelados pueden incluir líneas celulares que comprenden cualquiera de las construcciones de ácido nucleico desveladas que contienen una secuencia de ácido nucleico de FlgM, un sitio de escisión y una secuencia de ácido nucleico de interés. La secuencia de ácido nucleico de interés codifica el péptido de interés que se produce. La etapa de purificar el péptido de interés puede incluir una columna de afinidad. En algunos aspectos, la columna de afinidad puede ser una columna de afinidad de a28. La columna de afinidad puede ser cualquier columna diseñada para purificar el péptido de interés o el polipéptido de interés que contiene el péptido de interés usando una atracción entre uno de los péptidos en el polipéptido y una molécula en la columna de afinidad. Por ejemplo, se puede usar una columna de afinidad de a28 porque a28 se une a FlgM que está en el polipéptido que también contiene el péptido de interés. La columna de afinidad también puede basarse en el marcador de purificación presente en el polipéptido. En algunos aspectos, la columna de afinidad puede tener anticuerpos que se unen a FlgM, el marcador de purificación o el péptido de interés.
La purificación del péptido de interés puede incluir la purificación del polipéptido que comprende FlgM, un sitio de escisión y el péptido de interés.
El péptido de interés se puede escindir usando el sitio de escisión presente entre FlgM y el péptido de interés. El péptido de interés se puede escindir antes, después o durante la purificación. Por ejemplo, el uso de las líneas celulares desveladas que tienen un polipéptido que incluye FlgM, un sitio de escisión y el péptido de interés permite que FlgM dirija el polipéptido y se secrete a través de un sistema de secreción flagelar de tipo III en el medio en el que se cultivan las células. El péptido de interés se puede escindir del resto del polipéptido añadiendo una proteasa específica para el sitio de escisión del polipéptido. El péptido de interés puede después purificarse del medio de cultivo. Como alternativa, el péptido de interés se puede purificar junto con el resto del polipéptido que comprende el péptido de interés. Después de la purificación, se puede escindir el polipéptido y liberarse el péptido de interés. Como alternativa, el péptido de interés se puede escindir durante la purificación. El polipéptido se puede unir a la columna de afinidad durante la purificación y, mientras esté unido, el polipéptido se puede escindir liberando el péptido de interés del polipéptido restante.
Las líneas celulares de los métodos desvelados pueden ser cualquiera de las líneas celulares recombinantes desveladas. En algunos aspectos, las líneas celulares pueden tener un sistema de secreción flagelar de tipo III (T3S) de Salmonella entérica serovariedad Typhimurium para secretar el polipéptido que comprende el péptido de interés. En algunos aspectos, las líneas celulares pueden tener una alteración de uno o más genes de flagelina o genes de proteínas asociadas al gancho. El o los genes de flagelina o proteínas asociadas al gancho se pueden seleccionar del grupo que consiste en flgK, flgL, fliC, fljB y fliD. En algunos aspectos, las líneas celulares pueden tener una alteración de uno o más inhibidores del complejo proteico regulador maestro de FlhD4C2 flagelar. Los inhibidores del complejo proteico regulador maestro de FlhD4C2 flagelar se pueden seleccionar del grupo que consiste en fimZ, srgD, hdfR, rbsR, ompR, clpX, clpP, lrhA, ydiV, dskA, ecnR, flit y resB. En algunos aspectos, las líneas celulares pueden tener una mutación para aumentar la transcripción o traducción del gen fliA de la chaperona de FlgMT3S. G. Kits
Los materiales descritos anteriormente, así como otros materiales, se pueden envasar juntos en cualquier combinación adecuada como un equipo útil para realizar, o ayudar a realizar, los métodos desvelados. Es útil que los componentes del equipo en un equipo dado estén diseñados y adaptados para su uso juntos en el método desvelado. Por ejemplo, se desvelan equipos para producir un péptido de interés, comprendiendo el equipo una de las líneas celulares recombinantes desveladas. Los equipos también pueden contener medios de cultivo.
Los equipos desvelados también pueden incluir materiales para purificar el péptido de interés. Por ejemplo, los equipos pueden incluir una columna de afinidad para purificar el péptido de interés basándose en el marcador de purificación presente en el polipéptido.
Ejemplos
A. Ejemplo 1 Purificación selectiva de péptidos neuroactivos recombinantes usando el sistema de secreción flagelar de tipo MI.
En este trabajo, se utilizó la proteína flagelar FlgM como vector para la secreción de los polipéptidos pequeños, farmacológicamente activos, muy estables que contienen una alta densidad de restos de cisteína, que forman enlaces transversales de disulfuro en el producto maduro. Como estudio de viabilidad, se diseñó un sistema de secreción bacteriana para la expresión recombinante de p-conotoxina SIIIA en Salmonella typhimurium. Usando el aparato de secreción flagelar de tipo III (T3S), la conotoxina recombinante se secretó selectivamente en el medio de cultivo, como se muestra en la figura 1.
1. Materiales y métodos
i. Cepas bacterianas, plásmidos y medios.
Las cepas bacterianas ilustrativas que se pueden usar se enumeran en la tabla 1. Las células se cultivaron en medio Luria-Bertani (LB) y, cuando fue necesario, se complementaron con ampicilina (100 pg/ml) o tetraciclina (15 pg/ml). El fago transductor generalizado de S. typhimurium P22 HT105/1 int-201 se usó en cruces de transducción.
Tabla 1: Ce as usadas en este estudio.
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continuación
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ii. Construcción de fusiones de FlgM-toxina expresadas cromosómicamente.
SIIIA se amplificó en una reacción de PCR de relleno de novo usando un cebador largo SIIIA_long_fw (CAGAACTGCTGCAACGGCGGCTGCAGCAGCAAATGGTGCCGCGATCATGCG CGCTGCTGCGGCCGC; SEQ ID NO: 1) que abarca los 66 pares de bases que codifican SIIIA (QNCCNGGCSSKWCRDHARCCGR; SEQ ID NO: 2). La secuencia de SIIIA se diseñó según el uso codónico óptimo de Salmonella typhimurium. La secuencia de 66 pb se hizo bicatenaria con la ayuda de un cebador inverso corto (SIIIA_short_rv: GCGGCCGCAGCAGCGCGCATG; SEQ ID NO: 3) iniciando el relleno desde el extremo 3' del cebador molde.
Se insertaron un sitio de escisión para la proteasa de TEV (ENLYFQG; SEQ ID NO: 4) y un marcador de polihistidina (H6 codificada por (CAt Ca C)3; SeQ ID NO: 5) durante la amplificación de flgM y SIIIA en diversas posiciones, lo que dio lugar a tres construcciones diferentes (denominadas construcciones 1-3),
A continuación, se explicará el procedimiento de construcción de la construcción 1 a modo de ejemplo con más detalle, La construcción 2 y la construcción 3 se diseñaron de forma correspondiente (véase tabla 2 para las secuencias de los cebadores). El gen flgM se amplificó a partir de ADN genómico (TH2788) usando los cebadores directos 1_HS1_FkeM_fw y los cebadores inversos 1_HS2_FlgM_rv. Los cebadores inversos codificaban un saliente de 18 pb que era homólogo a la secuencia de SIIIA 5' (véase anteriormente). Para aumentar la longitud de la región homóloga, se amplificó SIIIA a partir del molde sintetizado previamente con los cebadores 1_HS3_SIIIA_fw y 1_HS4_SIIIA_rv, añadiendo un solapamiento adicional de 10 pb con homología con la secuencia del sitio de escisión de proteasa de TEV. Los productos de PCR de FlgM y SIIIA se purificaron y se usaron en una PCR de fusión posterior como molde junto con los cebadores directos 1_HS1_FlgM_fw y los cebadores inversos 1_HS4_SIIIA_rv. Este método permite la fusión de dos productos de PCR que comparten una homología de (en el caso de la construcción 1) 28 pares de bases, lo que da lugar a una construcción de fusión de flgM-SIIIA larga. Todas las construcciones contenían un sitio de restricción 5-BamH1 y un 3'-EcoR1 para la clonación en pUC18, lo que da lugar a los vectores de subclonación (pHS1 (pUC18 BamHI-His6-FlgM-TEV-SIIIA-EcoRI), pHS2 (pUC18 BamHI-FlgM-TEV-SIIIA-His6-EcoRI) y pHS3 (pUC18 BamHI-FlgM-His6-TEV-SIIIA-E-coRI).
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continuación
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continuación
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Todas las fusiones de flgM-SIIIA se amplificaron a partir de los vectores de subclonación respectivos con cebadores que tenían regiones homólogas para el locus de flgM nativo o el locus de arabinosa (AaraBAD), respectivamente. Se construyeron inserciones cromosómicas usando recombinación mediada por A-Red.
La expresión de SIIIA en Salmonela dio lugar a un péptido recombinante que carecía de modificaciones postraduccionales que normalmente están presentes en condiciones fisiológicas. Estas incluyen un piroglutamato N-terminal neutro, amidación C-terminal y escisión de un fragmento de dos restos denominado SIIIApre. Sin embargo, según estudios funcionales sobre la p-conotoxina GIIIA relacionada, la potencia de SIIIA está determinada por la lisina en la posición 11 y, por lo tanto, no se ve afectada por ninguna variación de secuencia N- y C-terminal.
Todas las demás toxinas de diversos organismos (caracoles, arañas, serpientes y anémona de mar) se construyeron de forma correspondiente y sus secuencias se enumeran en la tabla 3 y la tabla 2.
Tabla 3: Toxinas usadas en este estudio.
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El fragmento A de la toxina diftérica (DTA Y65A) se amplificó a partir del plásmido pTH794 con los cebadores DTA-FlgM_fw (ACTCGCTCATTCGCGAGGCGCAGAGCTACTTACAGAGTA.AAGGCAGCTCTC ACCACCACC; SEQ ID NO: 10) y DTA-FlgM_rv (TTCATCAACGCGCCCCCCATGGGACGCGTTTTTAGA GGCATTAACGGTTACCTGC AC AAG; SEQ ID NO: 11). La amplificación de DTA incluyó un marcador de poli-histidina (Ha) con un conector de GSS antes del marcador de His y un conector de SSGLVPR entre el marcador de His y el primer aminoácido de DTA. El DTA se insertó cromosómicamente mediante recombinación mediada por A-Red. La inserción se llevó a cabo en un fondo de AaraBAD::FlgM+. DTA se dirigió delante del codón de parada de flgM lo que lugar a una fusión traduccional de FlgM-DTA.
Mi. Expresión recombinante y purificación de conotoxina SIMA.
Se seleccionaron cepas que expresaban fusiones de conotoxina SIIIA de una única colonia reciente y se cultivaron en 10 ml de LB durante una noche. Los cultivos de una noche se diluyeron 1:100 en 11 medios nuevos y se dejaron crecer durante seis horas. Si fue adecuado, se indujo la expresión de SIIIA después de las dos primeras horas mediante la adición de arabinosa al 0,2 %. Las células se sedimentaron mediante centrifugación (7000 rpm) y el sobrenadante que contenía FlgM-SIIIA se pasó a través de un filtro de polietersulfona de 0,22 ^m (Coming, NY, USA), una membrana de baja unión a proteínas para la eliminación de bacterias residuales. Para purificación adicional, se usó una columna de flujo por gravedad (Bio-Rad) empaquetada con 3 g de resina Ni-IDA (Protino Ni-IDA, Machery-Nagel) y las proteínas marcadas por afinidad se eluyeron en condiciones nativas a pH 7,5 con un tampón que contenía imidazol 250 mM.
iv. Ensayo de secreción.
Se diluyeron cultivos de una noche 1:100 en LB y se cultivaron durante dos horas a 37 °C antes de inducir la expresión de la fusión de FlgM-toxina respectiva añadiendo L-arabinosa al 0,2 %. Las células se mantuvieron a 37 °C durante cuatro horas más, mientras se expresaban las proteínas de fusión. Después de un total de seis horas, Se determinó la densidad óptica (DO) a 600 nm para todas las cepas.
Se centrifugaron alícuotas de dos ml del cultivo celular resultante durante 10 min a 4 °C y 7000 rpm para obtener, para cada alícuota, un sedimento y sobrenadante. El sobrenadante se filtró a través de un filtro de baja unión a proteínas con un tamaño de poro de 0,2 pm (filtro de jeringa Acrodisk, PALL Life Sciences) para eliminar las células restantes. Como alternativa, las alícuotas se centrifugaron dos veces a velocidad máxima para eliminar las células residuales. Las proteínas secretadas en el sobrenadante filtrado o centrifugado dos veces se precipitaron mediante la adición de t Ca (concentración final al 10%). Las muestras de sobrenadante se resuspendieron en tampón de muestra SDS 2x (Tris 100 mM pH 6,8, SDS al 4 %, glicerol al 10 %, p-mercaptoetanol al 2 %, EDTA 25 mM, azul de bromofenol al 0,04 %) y se ajustaron a 20 unidades DO600 por pl. La fracción de sedimento celular se suspendió en tampón de muestra SDS 2x, cuyo volumen se ajustó para producir 20 unidades DO600 por ul.
v. SDS-PAGE y transferencia de Western.
Las fusiones de FlgM-toxina expresadas de lisado de células completas y sobrenadante de cultivo se sometieron a electroforesis en gel de poliacrilamida SDS y se analizaron mediante inmunotransferencia usando anticuerpos policlonales anti-FlgM y policlonales anti-FliK (conejo) para la detección. Los complejos de antígeno-anticuerpo se visualizaron mediante detección quimioluminiscente o infrarroja usando el sistema de captura de imágenes LI-COR Odyssey. Para el desarrollo quimioluminiscente, se usaron anticuerpos secundarios de cabra anticonejo (Bio-Rad) conjugados con peroxidasa de rábano picante (HRP) y un equipo de detección ECL (Amersham Biosciences). Para la detección por infrarrojos, se usó secundario anti-IRDve690 de conejo (LI-COR). Se realizaron mediciones densitométricas de las bandas de FlgM-SIIIA y FliK usando ImageJ 1.45s para Mac OS X.
vi. Escisión por proteasa de TEV.
Se escindió SIIIA de los sustratos de secreción flagelar usando proteasa AcTEV (Invitrogen). Se añadieron 450 U de proteasa de TEV a 15 ml de la fracción de elución, que corresponde a las proteínas secretadas de un cultivo de 750 ml. Se realizó escisión durante una noche a temperatura ambiente en tampón de elución que contenía ditiotreitol (DTT) 1 mM y EDTA 0,5 mM.
vii. Plegado de SIIIA.
Se plegó SIIIA recombinante en tampón de Tris 0,1 M, pH 7,5 usando glutatión oxidado 1 mM (GSSG) y EDTA 0,1 mM. Se dejó que la reacción de plegado transcurriera durante una noche a temperatura ambiente y se inactivó mediante la adición de ácido fórmico hasta una concentración final del 8 %.
viii. Extracción en fase sólida de SIIIA.
Se usaron columnas de extracción en fase sólida C18 (Supelclean LC-18, Supelco) para eliminar el péptido oxidado de los otros componentes de las reacciones de plegado y escisión. A continuación, el péptido aislado se secó y se purificó mediante HPLC en un cromatógrafo Waters 600, equipado con un detector de absorbancia de longitud de onda doble y una columna analítica C18 Vydac. La separación por HPLC se realizó con un gradiente lineal de acetonitrilo del 4,5 % al 31,5 % (ac) (0,9 % de cambio por minuto), manteniendo TFA al 0,1 % constantemente. Esto permitió la purificación del producto de plegamiento correcto; la masa se validó mediante espectrometría de masas de desorción/ionización por láser asistida por matriz - tiempo de vuelo (MALDI-TOF).
ix. Electrofisiología de canales Nav de mamíferos.
La actividad funcional de SIIIA recombinante se evaluó electrofisiológicamente con ovocitos de Xenopus que expresaban Nav1.2. En resumen, el ovocito se colocó en una cámara de registro de 30 pl perfundida con ND96 y se sometió a pinzamiento de tensión con dos electrodos. Se usó un potencial de retención de -80 mV y se realizó la activación de los canales de sodio modificando gradualmente el potencial a -10 mV durante 50 ms cada 20 segundos. Se realizó exposición a la toxina en un baño estático para conservar el péptido, como se indica a continuación. Antes de la aplicación de la toxina, se detuvo la perfusión del baño y se registraron las respuestas de control. A continuación, se aplicó el péptido (3 pl a 10 veces la concentración final) al baño, que se agitó durante 5 segundos usando una micropipeta. Se obtuvieron registros del inicio del bloqueo por el péptido durante aproximadamente 20 minutos, después de lo cual se reanudó la perfusión con ND96 para eliminar el péptido sin unir mientras se supervisaba la velocidad de recuperación del bloqueo durante aproximadamente 20 minutos, Se ajustó la evolución temporal del inicio del bloqueo con respecto a una función exponencial simple para obtener la constante de velocidad observada del bloqueo, kobs. La velocidad de recuperación del bloqueo durante el lavado de péptidos fue demasiado lenta para medir por ajuste de curvas, de modo que el k f se calculó a partir del nivel de recuperación después de 20 min de lavado y asumiendo una desintegración exponencial del bloqueo. Todos los registros se obtuvieron a temperatura ambiente.
x. Inmunotinción.
Se realizó un análisis de microscopia fluorescente.
2. Resultados y análisis.
Se sintetizan conotoxinas en el conducto del veneno de los caracoles cónicos marinos y los canales iónicos diana, incluyendo los canales de sodio regulados por tensión (VGSC). SIIIA es una p-conotoxina de Conus striatus que inhibe los VGSC resistentes a tetrodotoxina (TTX) en ranas y VGSC sensibles a TTX en roedores. La p-conotoxina SIIIA se une al sitio 1 de la subunidad a de los VGSC y, de este modo, ocluye el poro del canal y bloquea la conductancia del sodio. En condiciones fisiológicas existen dos formas de SIIIA: una forma precursora y un péptido maduro, que se ha modificado procesando los restos de glicina-arginina C-terminales a un grupo amino y cambiando el resto de glutamina N-terminal a piroglutamato. En el presente documento, se expresaron de forma recombinante dos formas de SIIIA, el péptido precursor y un péptido que se parece más a la forma madura fisiológica (glutamato N-terminal en lugar de piroglutamato). En preparaciones de mamíferos, p-SIIIA bloquea eficazmente los canales de sodio neuronales tales como Nav1.2 y 1.6, y el subtipo de músculo esquelético Nav1.4. Debido a que SIIIA se dirige a los VGSC y tiene potente actividad analgésica en ratones, se puede usar para la investigación médica y el descubrimiento de fármacos. La ventaja fundamental en el desarrollo de un sistema de expresión bacteriano T3SS es que, después de la traducción, los polipéptidos se translocan a través de un canal de secreción estrecho en la estructura flagelar y, de este modo, evitan el problema de la agregación en los cuerpos de inclusión. La secreción de polipéptidos evita la agregación intermolecular en el citoplasma. Se forman enlaces disulfuro intramoleculares a medida que la cadena polipeptídica sale del entorno reductor del citoplasma bacteriano y entra en un entorno extracelular oxidante.
Se evaluó la eficacia con la que diferentes construcciones actúan como sustratos de secreción de tipo III. La pretoxina SIIIA ("p-SIIIApre" en la tabla 3 y denominada en lo sucesivo "rSIIIA") es un péptido pequeño de 22 aminoácidos que se fusionó con FlgM con un sitio de escisión de TEV N-terminal delante de SIIIA. Para garantizar una secreción adecuada y disminuir la posibilidad de interferencia con la señal de secreción estructural de FlgM, se diseñaron tres construcciones diferentes con un marcador de poli-histidina en diferentes posiciones. Todas las construcciones se expresaron cromosómicamente a partir del promotor inducible por arabinosa ParaBAD La figura 1B muestra el perfil de secreción de las tres construcciones. La construcción 3 (FlgM-H6-TEV-SIIIA) presentó el producto de secreción más prominente; la construcción 2 (FlgM-TEV-SIIIA-H6) presentó el nivel de secreción más bajo. Esta clasificación de secreciones fue uniforme en todos los fondos probados, algunos de los cuales portaban una mutación (fla* o H14D) en el gen estructural fliA de a28 que mejora la estabilidad de esta proteína chaperona de secreción de FlgM. Los niveles de FlgM eran muy bajos en una cepa incapaz de formar una estructura flagelar (AfliF) en comparación con los de una cepa de tipo silvestre.
El factor de transcripción específico del flagelo a28 actúa como una chaperona para facilitar la secreción de FlgM. Como se muestra en la figura Cc, a28 H14D, con su estabilidad mejorada, aumentó los niveles de FlgM-SIIIA intracelular y secretado, a28 H41D también aumenta la estabilidad de FlgM. Esta es la causa del aumento de los niveles de FlgM-SIIIA en el fondo de fliA* (figura 1C, carriles 2 y 3). También se probó el efecto de la eliminación de los sustratos de secreción flagelar tardía (y los posibles competidores de secreción) FliC y FliD (AfliCD). Los genes fliC y flid se transcriben de forma divergente. Sin embargo, el gen flid está en un operón con fliT, que codifica el inhibidor FliT de toda expresión génica flagelar. Por tanto, la eliminación de AfliCD da lugar a la eliminación de los competidores de secreción para FlgM además de incrementar el número de estructuras basales flagelares. El efecto neto fue una mayor producción y secreción tanto de FlgM como de FlgM-SIIIA de la célula (figura 1C, carriles 2 y 4).
Como FlgM-H6-TEV-SINA mostró el nivel más alto de secreción, esta construcción se usó para experimentos de purificación adicionales. La fusión de SIIIA se expresó a partir de un promotor inducible por arabinosa para permitir la sincronización del alto nivel de expresión con la finalización de los sistemas de secreción flagelar. El FlgM-H6-TEV-SIIIA secretado se separó del cultivo de células bacterianas mediante centrifugación y se obtuvo del sobrenadante en condiciones nativas mediante cromatografía de afinidad con níquel. Como se muestra en la figura 2A, FlgM-H6-TEV-SNIA se unió eficazmente a las resinas de Ni-IDA y se eluyó con tampón de elución que contenía imidazol. Después de la concentración de la fracción eluida, se escindió rSIIIA de la señal de secreción de FlgM-H6-TEV usando proteasa de TEV. El análisis de transferencia de Western y la tinción con Coomassie demostraron que la escisión de TEV finalizaba después de 3 horas a temperatura ambiente.
Como con todos los péptidos ricos en cisteína, la formación de enlaces disulfuro nativos es un proceso implicado en la generación de SIIIA biológicamente activo. Sin embargo, las condiciones óptimas de tampón de la proteasa de TEV pueden ser ditiotreitol (DTT) 1 mM. Este agente redox proporciona potencia reductora para la proteasa de TEV pero al mismo tiempo puede reducir los enlaces S-S en el péptido de interés. Por este motivo, rSIIIA se replegó antes del análisis electrofisiológico. El replegamiento se llevó a cabo en un tampón redox de glutatión oxidado y reducido, permitiendo reacciones de intercambio de tiol-disulfuro en condiciones que se sabe que favorecen la formación de los enlaces disulfuro nativos.
Pruebas de la forma precursora de rSIIIA en ovocitos de Xenopus que expresan Nav1.2 de rata demostraron que su actividad funcional era similar a la del SIIIA sintetizado químicamente. Se registraron las corrientes de sodio en respuesta a la despolarización. La figura 2B presenta los resultados de un experimento representativo en el que rSIIIA bloqueó la conductancia de Nav1.2 [compárese la corriente máxima del ovocito antes (trazo gris) y después de la exposición a rSIIIA (trazo negro)]. Se evaluó la cinética del inicio del bloqueo después de la exposición a rSIIIA 10 pM y la recuperación del bloqueo después de su lavado. La constante de velocidad observada para el inicio del bloqueo (kobs) y la constante de velocidad para la recuperación del bloqueo (koff) fueron, respectivamente, 0,17 ± 0,04 min'1 y 0,0043 ± 0,0004 min’1 (media ± DT, n = 3 ovocitos). El valor de Koff es cercano al observado con SIIIA sintetizado químicamente; sin embargo, el valor de Kobs es aproximadamente seis veces menor que el observado con SIIIA sintetizado químicamente. La diferencia en kobs se debe a la disparidad en las secuencias de los dos péptidos (arrastre de glicina N-terminal después de la escisión de TEV y ausencia de modificaciones postraduccionales).
Además de la secreción de pretoxina SIIIA, se probaron varias otras toxinas de diversos organismos, tales como araña (GsMTx4), escorpión (clorotoxina), serpiente (calciseptina), caracoles (u>-MVIIA, u>-GVIA, contulacina-G, a-Vc1.1, conantocina-G, SIIIA maduro) y anémona de mar (Shk) para determinar la expresión recombinante y la secreción posterior en un enfoque complementario (véase tabla 3 para una lista detallada). Aunque hubo diferencias en los niveles celulares y las eficiencias de secreción, los resultados mostrados en la figura 2C demuestran que todas las toxinas probadas se secretaron en el sobrenadante de cultivo. También se probó la secreción de la subunidad catalítica inestable de 190 aminoácidos de longitud de la toxina diftérica fusionada con FlgM (figura 2D). La degradación proteolítica que se observó dentro de la fracción citosólica no se produjo una vez que la proteína fue secretada por la célula.
Para una optimización adicional de la cepa de secreción de Salmonella, se construyó un mutante de poli-gancho no móvil que tenía las siguientes características: Carecía del SPI-1 relacionado con el flagelo (AprgH-hilA,) sistema de virulencia, así como todos los genes flagelares de clase 3 (AflgKL, AfljB-T, AFIgMN, Aaer-mcpC, PmotA, AmotA-cheZ, AmcpA, AmcpB, Atsr) que podrían disminuir o interferir con la secreción flagelar de tipo III de la fusión de toxina de interés. Además, la cepa albergaba una mutación en el promotor de flHD (P*fhD) y tenía suprimidos los reguladores negativos del regulador maestro flagelar FlhD4C2 (AlrhA, AycdiV, AecnR). LrhA actúa como regulador negativo de la transcripción de flhDC al unirse directamente a la región promotora del regulador maestro. La proteína de dominio EAL YdiV regula postraduccionalmente la actividad de la proteína FlhD4C2 dirigiéndose al complejo para la degradación dependiente de ClpXP y, de este modo, influye negativamente en la actividad del promotor flagelar de clase 2 dependiente de FlhDC. Las inserciones de transposones en esos reguladores negativos de FlhDC aumentan la expresión del gen flagelar.
Como se muestra mediante el marcaje fluorescente de las estructuras del gancho flagelar en la figura 3A, estas mutaciones dieron lugar a un aumento aproximadamente doble de las estructuras de secreción flagelar por célula en comparación con las células de tipo silvestre, lo que a su vez condujo a un aumento sustancial de la tasa de secreción de proteínas flagelares. Las tasas de secreción de FliK y FlgM-SIIIA (construcción 3) fueron aproximadamente dos veces más altas en el fondo de poli-gancho en comparación con las de los fondos de tipo silvestre y fliA* (fig. 3B).
Una gran ventaja de este sistema es el flujo de trabajo. Después de la inducción con arabinosa, las células bacterianas expresan polipéptidos recombinantes y posteriormente secretan la toxina al medio. A diferencia de la purificación de neuropéptidos por métodos tradicionales, esto hace que sea innecesario lisar las células para purificar las toxinas. En cambio, el SIIIA recombinante se secretó selectivamente a través del T3SS flagelar y se acumuló en el sobrenadante de cultivo. Después de varias horas de producción, las células se eliminaron mediante centrifugación y filtración sencillas. Otros aspectos de este sistema son las chaperonas de secreción de tipo III que facilitan la secreción o aumentan la estabilidad de los sustratos de secreción. Los sustratos de secreción de tipo III se secretan habitualmente en un estado desplegado o parcialmente plegado, que con frecuencia se logra mediante la interacción de las chaperonas con la estructura secundaria de la proteína secretada. Ya que SIIIA se fusionó con FlgM, un sustrato de secreción de tipo III, estaba protegido del plegado prematuro por la interacción con FliA (a28), la chaperona de secreción de tipo III afín de FlgM. Para la expresión recombinante desvelada, se usó FlgM de longitud completa, que aumentó la eficiencia de secreción debido a la presencia de su sitio de unión a chaperona FliA.
El sistema desvelado proporciona un método fácil de usar para la purificación de toxinas complicada, una tarea que va más allá del rendimiento y la solubilidad de los péptidos, pero también permite que los péptidos y proteínas sean accesibles en un estado activo y correctamente plegado.
B. Ejemplo 2 Análisis de factores que afectan a la secreción de proteína FlgM de Salmonella.
En este trabajo, se inició un nuevo enfoque que usa un sistema de expresión que evita el problema del cuerpo de inclusión de la expresión de péptidos pequeños recombinantes. Aprovecha el sistema de secreción flagelar de Salmonella entérica serovariedad Typhimurium (Salmonella typhimurium) que se ha mostrado que exporta proteínas no flagelares si se fusiona con señales de secreción flagelar, p. ej., proteína de gancho FlgE o flagelina FliC. El sistema de secreción flagelar es un miembro de una familia de sistemas de secreción bacterianos de tipo III que secretan selectivamente proteínas del citoplasma al medio externo. Casi todos los sistemas de secreción de tipo III caracterizados hasta ahora son necesarios para la secreción de determinantes de virulencia para varios patógenos vegetales y animales o para la secreción de proteínas necesarias para la estructura y función del flagelo bacteriano. El flagelo bacteriano está compuesto por un filamento helicoidal externo, que se extiende muchas longitudes corporales desde la superficie celular, unido a un motor rotativo incluido dentro de la pared celular y las membranas celulares. Para Salmonella, un sistema quimiosensorial controla la dirección en el sentido de las agujas del reloj y en el sentido contrario a las agujas del reloj de la rotación flagelar, lo que permite que la bacteria migre hacia atrayentes, tales como nutrientes, o en sentido contrario a repelentes que son perjudiciales para la bacteria.
La especificidad para la secreción de sustrato flagelar está determinada principalmente por una señal de secreción de péptido N-terminal que tiene una estructura desordenada. Muchos sustratos de secreción también requieren una chaperona de secreción específica para facilitar la secreción. Un sustrato de secreción flagelar, FlgM, es una proteína reguladora que acopla el ensamblaje flagelar a la expresión génica, a28, un factor de transcripción específico para los promotores flagelares, dirige la transcripción de genes específicamente necesarios después de la finalización del motor flagelar y, de este modo, induce la expresión del filamento y los genes quimiosensoriales. FlgM se une a a28 y previene su asociación con la ARN polimerasa. La finalización del motor flagelar da lugar a un cambio en la especificidad del sustrato del aparato de secreción flagelar, cambiando de la secreción de proteínas necesarias para el ensamblaje del motor a la secreción tardía de sustrato de proteínas necesarias en el ensamblaje de filamentos. FlgM en sí mismo es un sustrato de secreción tardía y su secreción libera a28, lo que le permite transcribir el filamento y los genes quimiosensoriales solo tras la finalización del motor. Al mismo tiempo, el factor de transcripción a28 actúa como chaperona de secreción que facilita la secreción de su inhibidor, FlgM.
En este trabajo, se utilizó la proteína flagelar FlgM como vector para la secreción de los polipéptidos pequeños, farmacológicamente activos, muy estables que contienen una alta densidad de restos de cisteína, que forman enlaces transversales de disulfuro en el producto maduro. Se creó un sistema de secreción bacteriana para la expresión recombinante de p-conotoxina SIIIA en Salmonella typhimurium. Usando el aparato de secreción flagelar de tipo III (T3S), la conotoxina recombinante se secretó selectivamente en el medio de cultivo.
1. Materiales y métodos
i. Cepas de bacterias y condiciones de crecimiento.
Todas las cepas usadas en este estudio son derivadas de LT2, una cepa de tipo silvestre Salmonella enterica serovariedad Typhimurium, y se enumeran en la tabla 4. Todas las cepas se construyeron durante el transcurso de este estudio. La construcción de la cepa utilizó transducción generalizada mediada por P22 o mutagénesis dirigida mediada por A Red. Para cepas con el operón flhDC expresado a partir de su promotor nativo, se indujo la expresión del gen flagelar mediante dilución de l0o veces a partir de cultivos estacionarios durante una noche en medio LB reciente (10 g de triptona Bacto, 5 g de extracto de levadura de Bacto y 5 g de NaCl por litro). Para cepas con el operón flhDC expresado desde el promotor teta del transposón Tn 10 (APflhDC-8089::tetR-PtetA), se indujo la expresión del gen flagelar mediante la adición del análogo de tetraciclina anhidro-tetraciclina (1 pg/ml). Para todas las cepas usadas en este estudio, el operón de utilización de arabinosa araBAD, se reemplazó con el gen FlgM+ o las fusiones de genes FlgM FlgM-6His-TEV-ó-SVIE o FlgM-6His-ETK-ó-SVIE (AaraBAD::FlgM+, AaraBAD::FlgM-6His-TEV-Q-SVIE o AaraBAD::FlgM-6Hi-ETK-5-SVIEI, respectivamente). Esto permitió la inducción de la producción de FlgM, FlgM-6His-TEV-8-SVIE y FlgM-6His-ETK-8-SVIE del promotor ParaBAD mediante la adición de L-arabinosa al medio de cultivo. Se añadió arabinosa a una concentración final del 0,2 % dos horas después de la inducción del operón flhDC. Después de otras 5 horas, los cultivos se centrifugaron a 10000 g durante 30 min para sedimentar las células. El sobrenadante se filtró con un filtro de baja unión a proteínas de 0,2 pm (filtro de jeringa Acrodisk, PALL Life Sciences) para eliminar las células restantes. Las proteínas secretadas en el sobrenadante filtrado se precipitaron mediante la adición de TCA (ácido tricloroacético) hasta una concentración final del 10 %. El sedimento celular se resuspendió en PBS frío (solución salina tamponada con fosfato) que contenía PMSF (fluoruro de fenilmetilsulfonilo) 5 mM, seguido de sonificación para lisar la suspensión celular. El lisado celular se analizó directamente para detectar proteína de célula completa o se separó en análisis de fracciones solubles e insolubles mediante centrifugación de 30 min (15000 g) a 4 °C. Para probar el efecto de diferentes concentraciones de NaCl y KCl en la secreción de FlgM, se preparó medio LB sin NaCl y se añadieron NaCl o KCl a las concentraciones deseadas.
____________________________ Tabla 4: Cepas y derivados de LT2.______________________ Cepa Genotipo
TH17831 AaraBD1124::HgM-6His-TEV-5-SVIE
TH18353 AaraBAD1124::HgM-6His-TEV-5-SVIE DclpX::tetRA
TH18500 AaraBAD1156::FlgM+
TH18527 AaraBAD1156::FlgM+ AclpX::tetRA
TH18528 AaraBAD1156::FlgM+ AflhDC::FKF
TH18549 AaraBAD1156::FlgM+ AflhDC::FKF AclpX::tetRA
TH18624 AaraBAD1156::FlgM+ AfliA5805::tetRA
TH18636 AaraBAD1156::FlgM+ fliA8088(H14D, R91C, L207P)
TH18647 AaraBAD1124::FlgM-6His-TEV-5-SVIE AnnhD c8089:.(tetR-P,etA)
TH18649 AaraBAD1156::FlgM+ AamD c8089::(tetR-PtetA)
TH18704 AaraBAD1156:: FlgM+ AinvH-sprB: .FKF(ASpi-l)
TH18729 AaraBAD1156::FlgM+ AfliC7715::tetRA
TH18730 AaraBAD1156::FlgM+ AompT.Km
TH18731 AaraBAD1156::FlgM+ AclpA74::FKF
TH18732 AaraBAD1156::FlgM+ AsseA-ssaU::FKF(ASpi-2)
TH18733 AaraBAD1156::FlgM+ AclpP::mini-Tn5
TH18737 AaraBAD1156::FlgM+ AfliA5999(R91C, L207P)
TH18739 AaraBAD1156::FlgM+ fliA5225(H14D)
TH18752 AaraBAD1156::FlgM+ AydiV251::tetRA
TH18769 AaraBAD1124::FlgM-6His-TEV-5-SVIE AfliT:: Km
TH18778 AaraBAD1136::FlgM+ fliA5228(V33E)
TH18780 AaraBAD1156::FlgM+ fliA5223(T138\)
TH18782 AaraBAD1156::FlgM+ fliA5224(E203D)
TH18787 AaraBAD1156::FlgM+ AFlgM5628::FKF
TH18788 AaraBAD1156::FlgM+ AfliT::FKF
TH18790 AaraBAD1156::FlgM+ AflgK7665
TH18793 AaraBAD1156::FlgM+ AflgL7666
TH18796 AaraBAD1156::FlgM+ AfliD5630::FRT
TH18798 AaraBAD1156::FlgM+ AdegP::tetRA
TH18822 AaraBAD1156::FlgM+ AcsrA101::Cm
TH18823 AaraBAD1156::FlgM+ AdksA:.FKF
TH18824 AaraBAD1156::FlgM+ ArcsB::tetRA
TH18830 AaraBAD1124::FlgM-6His-TEV-5-SVIE ArcsB::tetRA
TH18850 AaraBAD1156::FlgM+ AlrhA
TH 18880 AaraBAD1124::FlgM-6His-TEV-5-SVIE PmDc7793
TH18881 AaraBAD1156::FlgM+ PmDc7793
TH18897 AaraBAD1156::FlgM+ fliA5240(L199R)
TH18973 AaraBAD1156::FlgM+ AecnR5::FCF
TH 19086 AaraBAD1156::FlgM+ AflgN5626:: FKF
TH19087 AaraBAD1156::FlgM+ AfliST5775::FCF
TH 19099 AaraBAD1156::FlgM+ Ahin-fljA7731::tetRA
TH19104 AaraBAD1156::FlgM+ AflgN5626::FKF Afli.ST5775::FCF
TH 19106 AaraBAD1156::FlgM+ AfliS5728::FRT
TH19113 AaraBAD1156::FlgM+ Ahin-fljA7731::tetRA AfliC7861::FCF
TH19116 AaraBAD1164::FlgM-6His-ETK-5-SVIE
TH19118 AaraBAD1164::FlgM-6Hiv-ETK-5-SVIE PfhDC7793
TH19120 AaraBAD1164::FlgM-6His-ETK-5-SVIE AlrhA AecnR4::FRT AfliB-T7771 PmDc7793
AydiV252 Ahin-fljA7752 AFlgMN7753 AgKL7770
TH19145______ AaraBAD1164::FlgM-6His-ETK-5-SVIE PmDC7793 AFlgM5628::FKF AclpX80::tetRA ______________________________________ (continuación)____________________________________ Cepa__________ Genotipo_______________________________________________________________ TH19149 AaraBAD1156::FlgM+ AflgKL5636::FKF
TH19320 AaraBAD1156::Flg.M+ fliA5226(H14N)
TH19323 AarABAD1156::FlgM+ AclpA74::FKF AflhDC8040::tetRA
TH19324 AaraBAD1156::FlgM+ AclpP::mini-Tn5 AflhDC8040::tetRA
TH19325 AaraBAD1156::FlgM+ AdegP::tetRA AflhDC::FKF
TH19326 AaraBAD1156::FlgM+ Ahin-fljA7731:tetRA AfliC7861::FCF AflgKL5739::FKF TH19481 AaraBAD1156::FlgM+ AfliS8156
TH19673 AaraBAD1124::HgM-6His-TEV-5-STVIE ArcsB::tetRA AfliT::Km
TH19675 AaraBAD1124::FlgM-6His-TEV-5-SVIEArcsB::tetRA PlhDc7793
TH20042 AaraBAD1156::FlgM+Ahin-5717::FRT
TH20043 AaraBAD1156::FlgM+ Ahin-5717::FRT AfliC7715::tetRA
TH20044 AaraBAD1124::FlgM-6His-TEV-5-SVIE PmDc7793 ArcsB::tetRA AFlgM5628::FKF TH20047 AaraBAD1156::FlgM+ fljBenx vh2
TH20048 AaraBAD1124::FlgM-6His-TEV-5-SVIE fljBenx vh2
TH20049 AaraBAD1156::FlgM+ fljBenx vh2 AfliC7715::tetRA
TH20050 AaraBAD1124::FlgM-6His-TEV-5-SVIE fljBenx vh2 AfliC7715::tetRA
TH20053 AaraBAD1156::FlgM+ fljBenx vh2 Pmcc7768::tetRA
TH20055 AaraBAD1156::FlgM+ fliA8176 (-18 a 1G reemplazado por ataaAGGAGGtaaataA) TH20056 AaraBAD1124::FlgM-6His-TEV-5-SVIE fliA8176
TH20057 AaraBAD1156:: FlgM+ Ahin-5718::FRT
TH20058 AaraBAD1156::FlgM+ fljBenx vh2 APflhDC8089::(tetR-PtetA)
TH20059 AaraBAD1156::FlgM+ Ahin-5718::FRT AfliC7715::tetRA
TH20060 AaraBAD1156::FlgM+ AfliC7861::FCF fljBenx vh2 APrihDc8089::(tetR-PtetA)
TH20061 AaraBAD1156::FlgM+ fliA8177(H14N, R91C, L207P)
TH20062 AaraBAD1156::FlgM+ fliA8178(GTG:ATG, H14N)
TH20063 AaraBAD1156::FlgM+ fljBenx vh2 AP flhDc8089::(tetR-PtetA) AclpX::Tn10dCm TH20064 AaraBAD1156::FlgM+ fljBenx vh2 AclpX::Tn10dCm
TH20065 AaraBAD1156::FlgM+ fljBenx vh2 AydiV251::tetRA
TH20066 AaraBAD1156::FlgM+ fljBenx vh2 AfliA5805::tetRA
TH20067 AaraBAD1156::FlgM+ fljBenx vh2 AfliB-T7727::tetRA
TH20068 AaraBAD1156::FlgM+ fljBenx vh2 AfliC7715::tetRA AclpX::Tn10dCm
TH20069 AaraBAD1156::FlgM+ fliA8179(GTG:ATG)
TH20071 AaraBAD1156::FlgM+ fljBenx vh2 fliA8176 AfliC7861::FCF
TH20072 AaraBAD1156::FlgM+ fljBenx vh2 APrihDc8089::(tetR-PtetA) AfliA5805::tetRA TH20073 AaraBAD1156::FlgM+ fljBenx vh2 fliA8176 AfliC7861::FCF AclpX72::FKF
TH20074 AaraBAD1156::FlgM+ AFlgMN7753 AflgKL7770 Atrg-7774 AycgR7775 AfliB-T7771 AhinfljA7752 fliA8176
TH20075 AaraBAD1124::FlgM-6His-TEV-5-SVIE fljBenx vh2 AfliB-T7727::tetRA
TH20077 AaraBAD1124::FlgM-6His-TEV-5-SVIE fljBenx vh2 AclpX80::tetRA
TH20078 AaraBAD1156::FlgM+ fliA8176 AFlgM5794::FCF
TH20079 AaraBAD1156::FlgM+ fljBenx vh2 APrihDc8089::(tetR-PtetA) AfliA5805::tetRA motA5461::MudJ
TH20080 AaraBAD1156::FlgM+ fljBenx vh2 APmDc8089::(tetR-PtetA) motA5461::MudJ fliA8176 AfliC7861:: FCF
TH20081 AaraBAD1156::FlgM+ fliA5226H14N AfliC7861::FCF
TH20082 AaraBAD1156::FlgM+ fljBenx vh2 APrihDc8089::(tetR-PtetA) motA5461::MudJ fliA5226 AfliC7861:: FCF
TH20083 AaraBAD1124::FlgM-6His-TEV-5-SVIE fljBenx vh2 APfihDc8089::(tetR-PtetA) _______________AclpX::Tn10dCm_________________________________________________________
ii. Ensayos de transferencia de Western.
Se analizaron los niveles de proteínas secretadas, solubles, insolubles o de células completas mediante transferencia de Western. Se determinaron los niveles expresados de DnaK, FlgM y a28 en los lisados de células completas y los sobrenadantes de cultivo mediante SDS-PAGE usando geles en gradiente al 14% (BIO-RAD). Se cargaron análisis de cepas que contienen construcción de AaraBAD::FlgM+, equivalentes de 50 y 100 unidades de DO para las fracciones celular y sobrenadante, respectivamente. Para analizar las cepas para determinar la secreción de FlgM-6His-TEV-8-SVIE y FlgM-6H-ETK-8-SVIE, Se cargaron 50 y 300 unidades de DO para las fracciones celular y sobrenadante, respectivamente. Se usaron anticuerpos anti-DnaK (ratón), anti-S28 y anti-FlgM (conejo) para la detección. Se usó DnaK como control de patrón proteico para la concentración de carga y para la presencia de proteína en el sobrenadante debido a la lisis celular. Para visualizar complejos de antígeno-anticuerpo, se usaron anticuerpos secundarios anti-IRDye690 de conejo y anti-IRDye800 de ratón (LI-COR). Se realizaron medidas densitométricas de las bandas de FlgM, a28 y DnaK usando el programa informático del sistema de captura de imágenes infrarrojas LI-COR Odyssey. Todos los ensayos se realizaron por triplicado en muestras de cultivo.
Mi. Ensayo de movilidad.
Los ensayos de movilidad utilizaron placas de triptona de agar blando (por litro: 10 g de triptona Bacto, 5 g de NaCl, 3 g de agar Bacto). Se recogió una colonia bacteriana con un palillo de dientes y se pinchó a través del agar blando seguido de incubación a 37 °C durante aproximadamente 5 horas. Si fue necesario, se añadió arabinosa (0,2 %) o anhidro-tetraciclina (1 pg/ml) para inducción de operón ParaBAD o flhDC, respectivamente.
2. Resultados
I. Se secreta FlgM producido a partir de ParaBAD::FlgM.
FlgM se secreta a través de un HBB completo en el medio de cultivo gastado externo. Se ha mostrado que la fusión de proteínas extrañas al extremo C de FlgM se puede usar con fines de purificación de proteínas sin la necesidad de lisar las células antes de la purificación. Con el fin de desarrollar el sistema flagelar T3S para la purificación de proteínas usando FlgM como una señal de secreción, se caracterizaron los aspectos conocidos de la producción y secreción de FlgM para maximizar la producción de proteínas usando este sistema. El gen FlgM se transcribe a partir de un promotor flagelar de clase 2 en el operón flgAMN. Esto da lugar a producción de FlgM durante el ensamblaje inicial de HBB. FlgM producido de clase 2 se une proteína a28, el producto del gen fliA, que también se produce a través de la transcripción de clase 2 en uno de dos transcritos de fliAZ. Tras finalizar e1HBB, un cambio en la especificidad del sustrato de secreción del sistema flagelar T3S da lugar a secreción de FlgM e iniciación de la transcripción de clase 3 dependiente de a28. FlgM y a28 continúan produciéndose a partir transcritos de FlgMN y fliAZ dependientes de a28, respectivamente. Aproximadamente el 80 % de la transcripción de FlgM en estado estacionario es de su promotor de clase 3. Ya que FlgM es un factor anti-a28, su producción a través del promotor de clase 3 está bajo autoinhibición. En este ejemplo, se eliminó la transcripción génica de FlgM de la autoinhibición de FlgM mediante el uso de una construcción con el gen FlgM transcrito del promotor de araBAD cromosómico inducible por arabinosa (ParaBAD). Esto se logró mediante una supresión dirigida del operón cromosómico araBAD seguido de la inserción del gen FlgM+ en su lugar. Esto dio lugar a la inducción dependiente de arabinosa de la producción de FlgM en cepas donde el inductor de arabinosa no se degrada debido a la supresión de los genes estructurales de araBAD. Se produjo FlgM transcrito a partir de ParaBAD en presencia de arabinosa y se secretó a niveles superiores a FlgM producido y secretado a partir de sus promotores nativos (figura 4). Una cepa de supresión de fliF, que no forma estructuras flagelares, fue incapaz de secretar FlgM inducido por ParaBAD (figura 4). Estos resultados indican que las señales de secreción de péptidos intrínsecos de FlgM son suficientes para nivel alto de secreción de FlgM y se puede usar el sistema T3S dependiente flagelar para secreción de FlgM.
ii. Las mutaciones que afectan a la actividad de FlhD4C2 también afectan a la secreción de FlgM.
El operón flhDC está en la parte superior de la jerarquía transcripcional flagelar. La regulación de flhDC es compleja y hay seis sitios de inicio de transcripción conocidos dentro de la región promotora de flhDC. Cambios en las secuencias -10 para los sitios de inicio de la transcripción P1 y P4 dentro de la región promotora de flhDC a la secuencia canónica TATAAT (el alelo PfiHDc7793) dio lugar a la duplicación del número de estructuras de HBB por célula y un aumento de la producción y secreción de la proteína del gancho flagelar. Otras mutaciones que dan lugar a un aumento de la secreción de proteína de gancho y un aumento de las estructuras de HBB por célula dieron lugar a una reducción de la expresión o la eliminación de inhibidores conocidos del control transcripcional o postranscripcional del operón flhDC. Se probaron los efectos de mutaciones reguladoras de flhDC en la secreción de FlgM transcrito a partir de ParaBAD. Los inhibidores transcripcionales y postranscripcionales conocidos de la expresión de flhDC incluidos en este ejemplo fueron EcnR, RscB, LrhA, FliT, DskA e YdiV. EcnR es responsable de la autorrepresión mediada por FlhDC. El complejo FlhD4C2 dirige la transcripción de ecnR, que a su vez da lugar a la represión de la transcripción de flhDC en concierto con la proteína RcsB. RcsB, que regula la síntesis de polisacáridos capsulares y varios genes en respuesta al daño de la membrana y la pared celular, es un represor de la transcripción de flhDC. LrhA también es un regulador de flhDC que se ha demostrado que se une dentro de la región promotora de flhDC para inhibir la transcripción del operón flhDC. FliT se transcribe a partir de promotores flagelares tanto de clase 2 como de clase 3. FliT se une al complejo FlhD4C2 y evita la activación de la transcripción flagelar de clase 2. FliT también es la chaperona de secreción de la proteína de recubrimiento de filamentos flagelares FliD. La secreción de FliD después de la finalización de HBB acopla la inhibición de la transcripción de clase 2 adicional por FlhD4C2 a la finalización de HBB. La proteína DskA actúa con ppGpp para inhibir la transcripción de flhDC. DskA también puede estimular la traducción de rpoS, que puede inhibir la transcripción de flhDC a través de un mecanismo mediado por RpoS. YdiV es un regulador postranscripcional que dirige FlhD4C2 a la proteasa ClpXP para su degradación en respuesta a cambios en las condiciones de crecimiento de los nutrientes. Como control, se usó CsrA, que es un regulador positivo de la estabilidad del ARNm de flhDC. El alelo Pfihüo8089 se construyó reemplazando la región de control del promotor flhDC con un casete tetR-Pteta del transposón Tn10. Esto dio lugar a la colocación del operón flhDC bajo el control del promotor tetA, que puede ser inducida por la adición del análogo de tetraciclina anhidro-tetraciclina. También se probaron los cambios positivos para promotores canónicos P1 y P4 de flhDC que incrementan la producción y secreción de ganchos (el alelo Pfhoo7793). Los efectos de las mutaciones reguladoras de flhDC en los niveles de proteína FlgM secretada expresada a partir de ParaBAD se muestran en la figura 5.
La supresión del operón estructural flhDC o supresión del gen csrA, que es necesaria para la estabilidad del ARNm de flhDC, no tenía FlgM detectable en la fracción secretada y FlgM acumulado en el citoplasma. Mutaciones defectuosas en inhibidores transcripcionales y postranscripcionales conocidos de la expresión de flhDC dieron lugar a un aumento de los niveles de FlgM secretado, como lo hizo también la presencia del alelo positivo para el promotor Pflhüo7793. Los niveles secretados de FlgM en las cepas mutantes Pflhüo7793, PflhDC80899(tetR-PtetA-flhDC), fliT, rcsB y ecnR fueron 4,5, 4,5, 3,8, 4,7 y 4 veces mayor que los del tipo silvestre, respectivamente. Los niveles secretados de FlgM eran menores en cepas mutantes de ydiV, IrhA y dskA en 2, 1,5 y 2,7 veces en comparación con el tipo silvestre, respectivamente (figura 5B). Para cada cepa probada, los niveles celulares acumulados de FlgM eran inversamente proporcionales a los niveles secretados de FlgM. De manera significativa, el reemplazo de la región promotora de flhDC con promotor de tetA y región reguladora del transposón Tn 10 permitió la producción de FlgM secretado a niveles que cumplen o superan los niveles secretados de FlgM observados en mutantes con pérdida de función para los reguladores negativos de expresión de flhDC que se probaron. La inducción de flhDC en el prlhüC8089 (tetR-Pteta-flhDC) también confirió movilidad en placas de natación (figura 5C).
En cepas que carecen de reguladores negativos de flhDC, los fenotipos de natación en placas de agar blando indicaron una mayor movilidad en comparación con el LT2 de tipo silvestre (figura 5D). Se observaron niveles sustanciales de movilidad en las mismas cepas con FlgM sobreexpresado de ParaBAD (figura 5D). FlgM inhibe a28 a una estequiometría de 1:1. Inducción de FlgM de ParaBAD puede prevenir toda la transcripción del promotor flagelar de clase 3 dependiente de a28, especialmente en el fondo de LT2 de tipo silvestre. Esta observación llevó a la conclusión de que el FlgM celular sobreexpresado se agregaba en una forma inactiva. Por tanto, el componente celular de FlgM se analizó a partir de fracciones tanto solubles como insolubles del sedimento celular en el análisis de transferencia de Western de los niveles de FlgM secretado y celular. Aunque FlgM es una proteína soluble la mayor parte del FlgM celular producido en condiciones de sobreexpresión era insoluble (figura 5A), lo que indica que un exceso de FlgM celular entró en cuerpos de inclusión y la movilidad observada en condiciones inductoras de FlgM indicaron que la forma insoluble de FlgM no estaba activa.
iii. El efecto de la chaperona de FlgM T3S, ct28, en la secreción de FlgM.
La finalización del HBB coincide con un cambio de especificidad de sustrato flagelar de T3S de sustratos de secreción de tipo varilla-gancho a sustratos de secreción tardía o de tipo filamentoso. Los sustratos de secreción tardía incluyen proteínas de unión de gancho-filamento (FlgK y FlgL), proteína de recubrimiento del filamento (FliD), las proteínas de filamento expresadas alternativamente (FliC o FljB) y el factor anti-a28 FlgM. La secreción eficiente de cada sustrato de secreción tardía requiere la ayuda de una chaperona de T3S afín. Estos incluyen FlgN (para FlgK y FlgL), FliT (para FliD), FliS (para FliC y FljB) y a28 (para FlgM). Las chaperonas de T3S se dividen en tres clases: i) las que se unen y protegen los sustratos de la proteólisis en el sistema antes de la secreción, ii) las que facilitan la secreción del sustrato y iii) las que estabilizan y facilitan la secreción. La proteína a28 está en la última categoría; protege FlgM de la proteólisis en el citoplasma y facilita la secreción de FlgM supuestamente ayudando a localizar FlgM en la base del flagelo. Un mutante de a28 con dos sustituciones de aminoácidos que lo vuelven defectuoso en el reconocimiento de las secuencias promotoras -10 y -35 (R91C y L207P) conserva su actividad de chaperona de T3S para secreción de FlgM. Esto indicó que la función de chaperona de T3S de a28 fue un proceso separado de su actividad de transcripción.
La proteína a28 contiene 3 de las 4 regiones conservadas en todos los factores sigma constitutivos de tipo a70: regiones 2, 3 y 4, que se dividen a su vez en las subregiones 2.1,2.2, 2.3, 2.4, 3.1, 3.2, 4.1 y 4.2. Las regiones 2.1, 3.1, 3.2 y 4.1 están implicadas en la unión a la ARN polimerasa central, mientras que las regiones 2.4 y 4.2 son necesarias para el reconocimiento de las regiones -10 y -35 de las secuencias promotoras, respectivamente. Se mostró que FlgM interactúa con las tres regiones de a28 en una estructura cocristalina de FlgM:o28. Además, se ubicaron mutaciones de sustitución de un solo aminoácido que eran defectuosas en inhibición por FlgM de la transcripción flagelar dependiente de a28 se localizó en las regiones 2.1, 3.1, 4.1 y 4.2. Estos se designaron mutantes de derivación de FlgM porque en las cepas defectuosas para la formación de HBB dieron lugar a la transcripción del promotor flagelar de clase 3, que normalmente es inhibida por FlgM en el fondo de fliA+. Los mutantes de derivación de FlgM de a28 eran de dos clases. La mayoría eran defectuosos en la unión a FlgM, pero dos alelos, H14D y H14N, dieron lugar cada uno a una proteína a28 con mayor estabilidad, que fue suficiente para superar la inhibición por FlgM.
Se probaron los efectos de mutantes de derivación de FlgM en las regiones 2, 3 y 4 de a28 sobre la secreción de FlgM expresado a partir de ParaBAD (figura 6A y 6B). Los mutantes de la región 2.1 incluían e1H14D y e1H14N, que dan lugar a mayor estabilidad de las proteínas y el alelo V33E, que es defectuoso en la unión a FlgM. Los otros mutantes de derivación de FlgM probados incluyeron el alelo T138I de la región 3.1 y L199R de la región 4.1 y E203D en el punto de inicio de la región 4.2.
El alelo fliA nulo mostró una fuerte reducción de la secreción de FlgM a un nivel que era el 5 % de la cepa fliA+. El alelo V33E y L199R dio lugar a un nivel de secreción de FlgM que era del 12% y el 59% del tipo silvestre, respectivamente. Los alelos H14D y H14N presentaron niveles de FlgM secretado que fueron 2,1 y 1,5 veces superiores a los observados para el tipo silvestre. Los alelos T138I y E203D, que son defectuosos en la unión a FlgM, dieron lugar a un aumento de los niveles de FlgM secretado de 1,2 y 1,4 veces del tipo silvestre, respectivamente. También se probó el mutante doble defectuoso en la unión al promotor de fliA (R91C L207P) y en comparación con el tipo silvestre mostró un nivel de FlgM secretado del 39%. Las sustituciones de R91C L207P defectuosas en la unión al promotor también se combinaron con la sustitución de estabilidad aumentada de H14D y se observaron niveles de FlgM entre los observados solo con el mutante doble R91C L207P o el mutante simple H14D.
Para FliA de tipo silvestre, H14N, H14D, R91C L207P y H14D R91C L207P, el nivel de FliA en la células era coherente con el nivel secretado de FlgM (figura 6A). El nivel secretado de FlgM estaba relacionado con la concentración de FliA dentro de la célula. Por lo tanto, se introdujeron otros mutantes, que potencialmente aumentarían la concentración intracelular de FliA, para ver si pueden afectar a la secreción de FlgM. Estos mutantes incluían un cambio de codón de inicio de fliA de GTG a ATG que se combinó con la sustitución de estabilización de H14N o con un cambio de la secuencia de unión de ribosoma (RBS) de fliA a una secuencia canónica (CRBS). Todos estos cambios dieron lugar a un aumento de los niveles intracelulares de FliA y niveles de FlgM secretado de 2 a 4 veces los de tipo silvestre (figura 6A y 6B). La supresión del gen FlgM cromosómico en el fondo de mutante doble de CRBS ATG de fliA dio lugar a una reducción de ambos de FliA intracelular y FlgM secretado. Por tanto, el exceso de a28 producido en el fondo de mutante doble de CRBS ATG de fliA puede implicar la expresión de FlgM cromosómico además de FlgM expresado en ParaBAD para contribuir a la estabilidad de a28, que mejora la secreción de FlgM. Esto es coherente con los resultados que muestran que FlgM no solo actúa como un factor anti-sigma sino que también protege FliA contra la degradación.
En la figura 6C, se muestran ensayos de movilidad de los mutantes de fliA en condiciones de inducción de FlgM. El alelo fliA nulo y mutantes que contienen los alelos R91C L207P, que no pueden transcribir promotores flagelares de clase 3 y, por lo tanto, no pueden producir flagelina, son inmóviles en cualquier condición. Los mutantes de sustitución de ATG, H14N, H14D, mostraron tamaños de enjambre aumentados en las placas de movilidad en comparación con el tipo silvestre. Se ha informado de que V33E, T1381, L199R y E203D tienen actividades transcripcionales flagelares en presencia de FlgM que son 8,0, 31, 45 y 7 veces mayores que el tipo silvestre, respectivamente, y sus fenotipos de movilidad en placas de natación en condiciones inductoras de FlgM se correlacionan con estos niveles. Los mutantes dobles H14N ATG y CRBS ATG mostraron una menor movilidad en las placas de natación, aunque tienen niveles celulares más altos de a28 que la cepa de tipo silvestre.
iv. El efecto de los competidores del sustrato de secreción de T3S flagelar tardío en secreción de FlgM.
El informe inicial de la secreción de FlgM tras la finalización de HBB presentó datos cualitativos que muestran que los niveles de FlgM secretado eran mayores en las cepas que carecían de proteína del filamento, un posible competidor de secreción para FlgM. Se probaron los efectos de eliminar los posibles competidores del sustrato de secreción tardío en los niveles de FlgM secretado, para determinar si su eliminación mejoraría el rendimiento de FlgM secretado. El número de subunidades de sustrato tardío en el flagelo ensamblado es de aproximadamente 11 para cada una de las proteínas de unión de gancho-filamento FlgK y FlgL, 5 para la proteína de recubrimiento de filamentos FliD y, dependiendo de la longitud del filamento, hasta 20000 para FliC o FljB. Los resultados presentados en las figuras 7A y 7B muestran que la eliminación de FlgK, FlgL o FliD tuvo poco o ningún efecto sobre los niveles de FlgM secretado, mientras que la eliminación de los sustratos del filamento dio lugar a un aumento de los niveles de FlgM secretado hasta 1,9 veces más que el tipo silvestre. Este resultado muestra que los niveles de sustrato de T3S tardío no son un factor limitante significativo en la secreción de FlgM a través de los flagelos.
También se probaron los efectos de la variación de la fase flagelar en la secreción de FlgM (figura 7A y 7B). Salmonella entérica expresa alternativamente uno de los dos genes de subunidades de flagelina, fliC o fljB. Las cepas que portan el alelo hin-5717 están bloqueadas en el modo de expresión FliCON FljBOFF de flagelina mientras que las cepas que portan el alelo hin-5718 son FliCOFF FljBON. El fljBenx vh2 es una reliquia histórica que también es FliCON FljBOFF, y resultó del reemplazo de la región hin-fljBA de la cepa de S. enterica LT2 con la misma región de Salmonella abortus-equi bloqueada en el modo fliCON FljBOFF. El nivel de secreción de FlgM en una cepa que porta el alelo hin-5717 fue similar al de la cepa de tipo silvestre. La supresión del gen fliC en el fondo de hin-5717 dio lugar a un aumento de 1,9 veces en FlgM secretado en comparación con el tipo silvestre. La presencia del alelo de hin-5718 solo aumentó los niveles de FlgM secretado en 1,9 veces y la eliminación adicional del gen fliC en este fondo aumentó adicionalmente el nivel de FlgM secretado 2,7 veces por encima del de tipo silvestre a pesar de que no se produce flagelina FliC en el fondo de hin-5718. Sin embargo, se produce ARNm de fliC, pero no se traduce, en el fondo de hin-5718, lo que muestra que el ARNm de fliC tiene un efecto negativo sobre la secreción de proteínas de FlgM. Los niveles secretados de FlgM en el fondo de fljBenx vh2 fueron 2,9 veces mayores que en la cepa de tipo silvestre y una mayor eliminación del gen fliC en este fondo aumentó los niveles de FlgM secretado a 4,3 veces el de tipo silvestre.
v. El efecto de las chaperonas flagelares tardías de T3S en la secreción de FlgM.
También se probaron los efectos de eliminar las chaperonas de secreción tardía FlgN, FliS y FliT en los niveles secretados de FlgM expresado desde ParaBAD para determinar si compiten con a28 para la entrega de FlgM al sistema de secreción flagelar para su exportación. Además, las chaperonas de T3S están asociadas con funciones reguladoras en ausencia de sus sustratos de secreción afines. FlgN, la chaperona de T3S para FlgK y FlgL, inhibe la traducción de ARNm de FlgM. a28 es un factor de transcripción para los promotores flagelares de clase 3 y FliT actúa como un factor anti-FlhD4C2. No se ha indicado que FliS solo tenga una función reguladora en ausencia de sus sustratos de secreción afines FliC y FljB.
La eliminación de FlgN tuvo poco efecto sobre la secreción de FlgM (figura 8A y 8B). FlgK y FlgL tampoco tuvieron un efecto significativo sobre los niveles de FlgM secretado (véase figura 7A y 7B). La eliminación de FliT, que también se indica en la figura 4, dio lugar a un aumento de 4 veces en los niveles de FlgM secretado. No se usaron alelos de fliT que separen su actividad anti-FlhD4C2 de su actividad chaperona. Por tanto, el aumento de los niveles de FlgM secretado se debe a la mejora de la actividad de FlhD4C2 en ausencia de FliT. Se observó un aumento de 3 veces de los niveles de FlgM secretado en ausencia de FliS. Sin embargo, fliS se transcribe en un operón cadena arriba del gen fliT. Por tanto, cualquier efecto polar de los alelos de fliS en fliT da lugar a un aumento de los niveles de FlgM secretado debido a disminución de la expresión génica de fliT.
vi. La supresión de la isla de patogenia 1 de Salmonella (Spi1) da lugar a un aumento de los niveles de FlgM secretado.
El operón flhDC es el operón maestro tanto del regulón flagelar como de los genes de Spi1. El regulón Spi1 codifica los genes necesarios para la estructura y el ensamblaje del sistema T3S del inyectisoma Spi 1. El gen fliZ se transcribe en el operón fliAZ y FliZ activa la transcripción de hilD, cuyo producto activa a su vez la transcripción de Spi1. Un producto génico activado por HilD, RtsB, actúa para reprimir la transcripción de flhDC lo que proporciona un bucle de retroalimentación para todo el regulón flagelar-Spil. Se probaron los efectos de las supresiones de sistemas de virulencia de Salmonella tanto Spi 1 como Spi2 en los niveles secretados de FlgM sobreexpresado (desde PamBAü). La pérdida de Spi1 dio lugar a una disminución de los niveles secretados de FlgM al 55 % de los de tipo silvestre a pesar de que las células no se cultivaron en condiciones inductoras de Spi1, mientras que la pérdida de Spi2 no tuvo un efecto significativo sobre los niveles secretados de FlgM (figura 9A y 9b ).
vii. Efecto de la eliminación de proteasa en los niveles secretados de FlgM.
Una técnica habitual usada para mejorar la producción de proteínas del citoplasma es la eliminación de proteasas celulares. Además, proteasas presentes en la membrana externa, tales como OmpT, pueden disminuir la producción de proteínas por degradación después de la lisis celular. Las proteínas ClpA y ClpX interactúan con diferentes sustratos para suministro a la serina proteasa ClpP para su degradación. DegP es una proteasa periplásmica que presenta una amplia especificidad de sustrato. DegP se dirige exclusivamente contra proteínas desplegadas, mal ubicadas, híbridas y recombinantes que se pliegan incorrectamente por sobreexpresión en el periplasma.
Los resultados de la eliminación de proteasa en los niveles secretados de FlgM se muestran en la figura 10. La eliminación de OmpT dio lugar a un ligero aumento de la producción de FlgM secretado, mientras que la pérdida de DegP tuvo poco efecto. La eliminación de ClpA, ClpX y ClpP aumentó la producción de secreción de FlgM en 1,7, 5,4 y 6,1 veces en comparación con el tipo silvestre, respectivamente (figuras 10A y 10B). Esto es coherente con las observaciones que FlhD4C2 es un sustrato para la degradación dirigida por YdiV por el sistema de proteasa ClpXP. Como control de la lisis celular, la supresión de flhDC en los fondos mutantes de proteasa no mostró FlgM detectable en la fracción secretada. En este fondo, el nivel celular de FlgM no se vio afectado por la pérdida de la mutación DegP, mientras que los alelos nulos de mutación de clpA, clpX y clpP en el fondo de flhDC aumentaron la acumulación intracelular de FlgM en 1,3, 1,5 y 2,1 veces, respectivamente (figura 10B). Los resultados indican que ClpA, ClpX y ClpP están implicados en la degradación de FlgM independiente de FlhDC; el aumento de la secreción de FlgM en la cepa clpA nula se debió al aumento del nivel celular de FlgM solo. Los efectos de la proteasa ClpXP en presencia de flhD+ flhC+ se debieron tanto a la estabilidad de FlgM como a la estabilidad de FlhD4C2. Esto es coherente con el aumento de movilidad observado en las cepas mutantes de clpP y clpX (figura 10C).
viii. Efecto de la fuerza iónica sobre los niveles de FlgM secretado.
La alta osmolaridad aumentó la transcripción del gen invA de Spi1 en S. enterica y se produjo secreción de tipo III dependiente de Spi1 solo en bacterias cultivadas en condiciones de alta salinidad. Se probaron los efectos del aumento de NaCI o KCl sobre los niveles secretados de FlgM producido por ParaBAD-FlgM+. Los niveles secretados de FlgM aumentaron cuando la concentración de NaCI se elevó a 200 mM y después disminuyó a concentraciones de 400 y 600 mM. Con NaCl 200 mM, el nivel secretado de FlgM fue 3,7 veces mayor que el nivel con NaCl 100 mM (figuras 11A y 11B), que está cerca de la concentración de NaCl en un medio LB convencional (86 mM). Por tanto, la concentración de NaCl en medio LB no es óptima para secreción de FlgM. KCl tuvo un efecto similar en los niveles de FlgM secretado, KCl 200 y 400 mM produjo los mayores niveles de FlgM secretado en 3,2 y 3,6 veces en comparación con el nivel de FlgM secretado con NaCl 100 mM. Esto se debe a los efectos sobre la solubilidad de FlgM en el citoplasma. El aumento de la fuerza iónica también tuvo un efecto positivo sobre la movilidad en agar blando, aunque este se suprimió en condiciones de inducción de FlgM debido a la inhibición de la transcripción flagelar de clase 3 dependiente de a28 (figura 11C).
ix. Efecto de múltiples condiciones en la secreción de FlgM.
Los resultados individuales descritos anteriormente que mejoraron el rendimiento de FlgM secretado se combinaron para obtener una cepa y condiciones que maximizaran este rendimiento en condición de sobreexpresión de FlgM por ParaBAD::FlgM+ (figura 12a y 12B). Algunas de estas cepas, tales como flj'Benx vh2 y cepas que contienen clpX, cepas que contienen flhD8089, proporcionan los mayores niveles de secreción de FlgM. Todas ellas producen niveles de FlgM secretado aproximadamente 5 veces superiores a los del tipo silvestre. En estas cepas, solo una cantidad mínima de FlgM se acumuló dentro de la célula, lo que muestra que la expresión y estabilidad de FlgM celular era limitante.
x. Uso de FlgM como una señal de TTS para secretar 5-SVIE.
La proteína 5-SVIE es un péptido pequeño producido por un caracol cónico marino venenoso e inhibe los canales de sodio en los sistemas neuromusculares de los vertebrados. Este péptido de 31 aminoácidos (DGCSSGGTFCGIHPGLCCSEFCFLWCITFID) es hidrófobo y contiene 6 restos de cisteína que forman 3 pares de enlaces disulfuro intramoleculares. La naturaleza hidrófoba del péptido y el requisito de formación de múltiples enlaces disulfuro para producir una conformación activa de 5-SVIE son un impedimento para el plegamiento adecuado cuando este péptido se sobreexpresa en E. coli. Por tanto, se probó la producción de 5-SVIE en una forma activa a través de la secreción mediada por FlgM. Debido a que la secreción de la célula se inicia con el extremo N de FlgM, la secuencia de 5-SVIE de la fusión FlgM-5-SVIE saldría de la célula al salir del ribosoma: del extremo N al extremo C. Esto puede facilitar el plegamiento adecuado y la formación de disulfuro de 5-SVIE en una conformación activa. Fusiones C-terminales de 5-SVIE con FlgM marcado con hexa-His (6His) con sitios de escisión de proteasa TEV o ETK insertados entre las dos proteínas se expresaron a partir del locus de expresión cromosómico ParaBAD. El 6His facilita la purificación usando una columna de afinidad de Ni-agarosa y los sitios de escisión de TEV y ETK son reconocidos por la proteasa y la enterocinasa de TEV, respectivamente, lo que permite que el 5-SVIE secretado se separe de su señal de secreción de FlgM.
Todos los mutantes individuales seleccionados aumentaron la secreción de FlgM-6H-TEV-5-SVIE (véase figura 13A y 13B). Los niveles secretados de niveles de proteínas de fusión expresados por ParaBAD aumentaron en los fondos mutantes que produjeron un aumento de los niveles de FlgM secretado. Los niveles secretados de FlgM-6H-TEV-5-SVI E en las cepas flhD7793 (TH18880), flhD8089 (TH18647), fliT (TH18769), rcsB (TH18830), clpX (TH18353) y flA(CRBS ATG) (TH20056) fueron 16,8, 10,9, 9,4, 6,3, 16,7 y 16,6 veces en comparación con el tipo silvestre (TH17831). Se combinaron diferentes mutaciones entre sí, para probar los niveles de secreción de FlgM-6H-TEV-5-SVIE. En las múltiples cepas de fondo mutantes flhD7793rcsB (TH19675), flhD7793rcsB FlgM (TH20044), rcsB fiT(TH19673), fljBenx vh2 fliB-T(TH20075), fljBenx vh2 fliC (TH20050), fljBenx vh2 clpX(TH20077) y flhD8089 fljBenx vh2 clpX (TH20044) eran 34, 17, 49, 16,7, 11,7, 28,2 y 52,7 veces mayores que el del tipo silvestre. Cuando se insertó 6His-ETK entre FlgM y SVIE, las cepas flhD7793 (TH19118), flhD7793 FlgM (TH19122), flhD7793 FlgM clpX (TH19145) y flhD7793 lrhA fliB-TydiVhin-fljA flgMN flgKL (TH19120) aumentaron los niveles de secreción de FlgM-6H-ETK-5-SVIE hasta 19, 8,5, 17 y 110 veces mayores que el del tipo silvestre. Excepto para la cepa flhD7793 lrhA fliB-T ydiV hin-fljA flgMN flgKL (TH19120), la adición de NaCl 100 mM dio lugar a un aumento de los niveles de secreción de la proteína de fusión siendo las cepas TH19118 (flhD7793), TH19122 (flhD7793 FlgM) y TH19145 (flhD7793 FlgM clpX) 3,3, 1,5, 2,2 y 2,4 veces mayores que el tipo silvestre.
3. Análisis
Los sistemas de secreción de tipo III (T3S) del flagelo y el inyectisoma proporcionan un conducto para la producción y purificación de proteínas recombinantes que se fusionan con la señal de T3S. Puede haber una señal peptídica desordenada N-terminal y un acoplamiento a la fuerza motriz protónica como combustible de secreción. Muchos, pero no todos los sustratos de T3S pueden utilizar chaperonas de T3S afines por su estabilidad en el citoplasma y/o como pilotos de secreción para dirigir el sustrato de T3S al aparato de secreción en la membrana citoplasmática. Otra característica de los sistemas T3S es la capacidad de experimentar un cambio de especificidad de secreción de especificidad de sustrato de secreción temprana a tardía. En el sistema flagelar, esto sucede tras finalizar el crecimiento del gancho extracelular que tiene más de 40 nm de longitud, lo que da lugar a la transición a la secreción y ensamblaje de sustrato de tipo filamento. La proteína FlgM es una parte integral de la transición de la terminación del gancho al ensamblaje del filamento. FlgM es un sustrato de secreción flagelar de tipo filamento tardío y un factor anti-a28. FlgM es una proteína pequeña, de 97 aminoácidos. La mitad N-terminal de FlgM incluye la señal de T3S mientras que la mitad C-terminal incluye el dominio de interacción anti-a28. Se ha mostrado que la fusión de proteínas recombinantes con el extremo C de FlgM permitiría su secreción y purificación sin la necesidad de lisar las células antes de la purificación. Se examinaron las condiciones que facilitan la producción y secreción de FlgM. Estas condiciones se aplicaron después para producir las proteínas de recombinación FlgM-6His-TEV-8-SVIE y FlgM-6His-ETK-8-SVIE para producir y purificar estas proteínas sin lisis celular usando FlgM como vector para dirigir la secreción de las proteínas -8-SVIE de la célula a través del sistema de T3S flagelar.
FlgM y las construcciones de fusión FlgM-8-SVIE se sobreexpresaron a partir del promotor cromosómico ParaBAD reemplazando la región codificante de araBAD con el FlgM o regiones codificantes de fusión FlgM-8-SVIE. Mediante la eliminación de araBAD se garantizó que el inductor de arabinosa no se consumiera como fuente de carbono. Este sistema de inducción resultó suficiente para producir FlgM en cantidades superiores a las que la célula podría secretar (figura 5). A continuación, las células se manipularon mediante la introducción de mutaciones que aumentan la estabilidad y secreción de FlgM para aumentar la producción de FlgM secretada.
Se examinó el efecto de las mutaciones que aumentan el número de sistemas de T3S flagelares por célula sobre los niveles de FlgM secretado. Estas incluyeron mutaciones nulas en reguladores negativos de la transcripción de flhDC (ecnR, rcsB, IrhA, dskA) y flhDC alelos positivos para el promotor Pf^ dc7793 y PfhDc8089. También se probaron alelos nulos de fliT e ydiV que inhiben la función de FlhD4C2 a nivel postranscripcional. Se había mostrado previamente que dichas mutaciones aumentan la producción y secreción de la proteína del gancho flagelar en el periplasma. Todos los fondos mutantes probados dieron lugar a un aumento de los niveles de FlgM secretado. El alelo PflhDc8089 es un reemplazo de la región promotora de flhDC con una región promotora tetA inducible, que elimina el sitio de acción de todos los reguladores negativos conocidos de la transcripción de flhDC. El alelo PflhDc8089 también coloca la transcripción de flhDC bajo inducción por tetraciclina y sus análogos. Sin el inductor, las células no eran móviles en la placa de natación, lo que indica que flhDC no se transcribió. FlgM no se secretó en la cepa mutante csrA nula, ya que CsrA puede estabilizar ARNm de flhDC.
Se exploraron los efectos de diversos alelos de la chaperona de FlgM T3S a28 codificada por el gen fliA. Estos incluyeron alelos de derivación de FlgM de fliA que permiten la transcripción de clase 3 en presencia de FlgM, el mutante doble defectuoso en unión al promotor R91C L207P, el mutante del codón de inicio ATG (de GTG) y un mutante de secuencia de unión al ribosoma canónico (marcado CRBS). Los alelos de derivación de FlgM H14D, H14N, V33E, T138I, L199R y E203D tienen todos afinidades similares por RNAP con una Kd medida para RNAP central de 2,0, 1,9, 0,7, 0,8, 1,2 y 1,4 nM, respectivamente, en comparación con 0,9 para a28 de tipo silvestre. Las afinidades relativas por FlgM de H14D y H14N son iguales que las de tipo silvestre, mientras que los alelos V33E, T138I, L199R y E203D tienen afinidades reducidas 10, 20, 600 y 10 veces, respectivamente. El alelo V33E mostró los niveles más bajos de FlgM secretado mientras que L199R tenía aproximadamente la mitad del nivel secretado de FlgM que el tipo silvestre. Sin embargo, el bajo nivel celular del alelo de V33E a28 muestra que un a28 limitante es responsable de la reducción de los niveles de FlgM secretado observados. La afinidad reducida de T138I y V203E por FlgM no es un factor limitante en condiciones de sobreexpresión de FlgM (de ParBAD). La mutación doble defectuosa en la unión del promotor R91C L207P dio lugar a una reducción de los niveles celulares de a28 que correspondían a un nivel reducido de FlgM secretado mientras que los alelos H14D y H14N tuvieron el efecto contrario. Los alelos H14D y H14N dieron lugar a celulares elevados de a28 y correspondían a niveles aumentados de FlgM secretado. La adición de H14D o H14N al mutante doble R91C L207P dio lugar a un aumento de los niveles de a28 y niveles secretados de FlgM. El ATG con o sin la sustitución adicional de H14N o el mutante de la secuencia canónica de unión al ribosoma (ATG CRBS) dieron todos lugar a niveles elevados de a28 celular y FlgM secretado. Estos resultados muestran que el aumento de los niveles celulares de a28 da lugar a un aumento correspondiente de la secreción de FlgM en condiciones de sobreexpresión de FlgM.
La eliminación de competidores de secreción tardía de secreción de FlgM o sus chaperonas afines tuvieron resultados desiguales. De los 4 competidores de secreciones FlgK, FlgL, FliD y FliC/FljB solo la eliminación de los sustratos de secreción tardía del filamento FliCtFljB tuvo un efecto significativo de secreción de FlgM. La cantidad de subunidades de filamentos en el flagelo es aproximadamente 1000 veces mayor que la de los otros tres componentes. La eliminación de la chaperona de secreción de FliD FliT también aumentó la secreción de FlgM independiente de su función en el aumento de la estabilidad de FliD. FliT es un regulador de la activación del promotor de FlhD4C2 y su eliminación da lugar a un aumento de los conductos de secreción de HBB por célula. La eliminación de la proteína chaperona del filamento T3S, FliS, dio lugar a un aumento de 3 veces en los niveles de FlgM secretado mientras que la eliminación de la chaperona FlgK y FlgL T3S no tuvo ningún efecto. Como fliS y fliT se cotranscriben en el mismo operón (fliS está cadena arriba de fliT), cualquier mutación de supresión de fliS puede afectar a la expresión génica de fliT. Un alelo mutante de variación de fase flagelar, fljBenx vh2, mostró un aumento significativo de los niveles de FlgM secretado en comparación con el alelo hin-5717. También se observó aumento de los niveles de FlgM secretado en el Spi1, incluso cuando las células se cultivaron en condiciones no inductoras de Spi1.
La eliminación de proteasas celulares también produjo resultados mixtos en la secreción de FlgM. La proteasa ClpXP regula el número de flagelos por célula mediante la degradación del complejo FlhD4C2, que está dirigida por la proteína YdiV. YdiV se produce durante condiciones de crecimiento de nutrientes deficientes. YdiV se une al componente FlhD del FlhD4C2, lo que evita una mayor interacción entre FlhD4C2 y el ADN. YdiV dirige, a continuación, FlhD4C2 a la proteasa ClpXP para su degradación. La eliminación de ClpX o ClpP dio lugar a un aumento de los niveles secretados de FlgM. También se probó la eliminación de las proteasas DegP u OmpT para determinar los efectos sobre la secreción de FlgM y no se observó ningún efecto.
La última variable probada con respecto a niveles secretados de FlgM sobreexpresado fue la fuerza iónica. La secreción de tipo III fue inducida por alta osmolaridad. Se probó el efecto de la concentración de NaCl y KCl en la secreción de FlgM y se observó que la adición de NaCl a 200 mM o KCl a 200-400 mM dio lugar a un aumento de aproximadamente 4 veces en los niveles de FlgM secretado en comparación con NaCl 100 mM, que está cerca de la concentración de NaCl en LB (0,5 % u 86 mM). El efecto de NaCl se debió al aumento del potencial de la fuerza motriz protónica. Sin embargo, se observó el mismo efecto con la adición de KCl, que muestra que es simplemente la fuerza iónica la que controla los niveles secretados de FlgM. La fuerza iónica puede dar lugar a una mayor estabilidad de FlhD4C2.
Después de determinar los efectos de diferentes mutaciones sobre los niveles secretados de FlgM las observaciones se combinaron para construir algunas cepas que maximizan la cantidad de FlgM secretado de la célula. Todas las cepas que contienen fliB-T, clpX o flhD8089 aumentaron la secreción de FlgM aproximadamente 5 veces mayor que la de la cepa de tipo silvestre, y la combinación no aumentó adicionalmente la secreción de FlgM. Esto se debe a que se secretó casi todo el FlgM y solo una cantidad mínima de FlgM se acumuló en la célula. Por tanto, cuando se combinaron diferentes mutaciones, el nivel de expresión del FlgM se convirtió en factor limitante del nivel de secreción de FlgM.
Por último, un péptido pequeño rico en disulfuro contoxina 8-SVIE se fusionó con FlgM, para probar si el péptido se puede secretar y cómo las mutaciones y la concentración de iones afectan a su secreción. Tanto FlgM-6His-TEV-5-SVIE como FlgM-6His-ETK-8-SVIE pueden secretarse al medio y las mutaciones que estimularon la secreción de FlgM' también aumentó la secreción de estas proteínas de fusión. Algunos mutantes combinados tales como la cepa rcsB fliT y la cepa flhD8089 fljBenx vh2 clpX aumentaron la secreción de FlgM-6H-TEV-8-SVIE aproximadamente 50 veces en comparación con el tipo silvestre. Otra cepa combinada flhD7793 IrhA ecnR fliB-TydiVhin-fljA flgKL FlgMN aumentó la secreción de FlgM-6H-ETK-8-SVIE más de 100 veces en comparación con la cepa de tipo silvestre. La adición de NaCl 100 mM al medio LB puede aumentar la secreción de FlgM-6H-ETK-8-SVIE en la cepa flhD7793, la cepa flhD7793 FlgM y la cepa flhD7793 FlgM clpX. Estos resultados indicaron que FlgM se puede usar como señal de T3S para expresar y purificar proteínas que son difíciles o imposibles de realizar a través del sistema de sobreexpresión de E. coli.
C. Ejemplo 3 Producción de proteínas a gran escala dependientes de tipo III mediante secreción directa en el medio de cultivo.
El uso de FlgM como señal de secreción para facilitar la secreción de proteínas previamente difíciles de producir, tales como conopéptidos con numerosos enlaces disulfuro y la subunidad A de la toxina diftérica, que no es detectable en el citoplasma debido a su inestabilidad, demuestra la utilidad de este sistema para la producción de proteínas y la purificación de proteínas que de otro modo no se producirían.
Usando la tecnología lambda RED para el direccionamiento cromosómico, este sistema puede revolucionar la construcción de cepas genéticas bacterianas. En el fondo genético deseado el operón araBAD puede ser reemplazado por un elemento tetRA. El elemento tetRA puede ser los genes tetR y tetA del transposón Tn10 que codifican una bomba de eflujo de tetraciclina (TetA), que confiere resistencia a la tetraciclina y al represor TetR. Esto se puede lograr mediante la amplificación por PCR del elemento tetRA que usa oligonucleótidos de 48 unidades. Un ologo tiene 40 bases de homología con el lado 5' del comienzo del gen araB seguido de 18 bases que pueden amplificarse desde el extremo 5'-tetR de tetRA. El segundo tiene 40 bases de homología con el lado 3' del comienzo del gen araB seguido de 18 bases que pueden amplificarse desde el extremo 3-tetA de tetRA. La amplificación por PCR de ADN que contiene tetRA produce el elemento tetRA flanqueado por 40 bases de homología con la diana. La introducción del fragmento amplificado en una cepa que expresa los genes de recombinación lambda (RED) da lugar a la recombinación usando las 40 bases de homología flanqueante que da lugar a la supresión de los genes araBAD que son reemplazados por tetRA (AaraBAD::tetRA donde A es la nomenclatura genética para la supresión y :: es la nomenclatura genética para la inserción). La ventaja del elemento tetRA es que se puede seleccionar a favor y en contra. La presencia del elemento tetRA en el cromosoma confiere resistencia a tetraciclina, pero también confiere sensibilidad al ácido fusárico. Por tanto, cuando la secuencia codificante de FlgM se amplifica por PCR con las mismas 40 bases de homología 5' con araB y 3' con araD en presencia de lambda RED y se siembra en placas en medio de ácido fusárico, esto selecciona la recombinación que reemplaza el tetRA de AaraBAD::tetRA con la secuencia FlgM+ que da lugar a AaraBAD::FlgM+ donde el gen FlgM+ se transcribe ahora a partir del promotor araBAD inducible por arabinosa. A continuación, por el mismo método se coloca tetRA cadena abajo de FlgM+ en araBAD lo que da lugar a AaraBAD::FlgM+-tetRA seguido de reemplazo de ese tetRA con proteína X lo que da lugar a una fusión FlgM-X que se expresa mediante la adición de arabinosa al medio de cultivo. Usando este sistema, cualquier fusión de cualquier proteína con FlgM con inducción de arabinosa se puede construir con secuencias de escisión por proteasa intermedias para facilitar la purificación final de una proteína de interés.
1. Optimizaciones de cepas y condiciones.
Se pueden identificar cepas de secreción óptimas. El alelo positivo para el promotor del promotor de flhDC, flhD7793, y el alelo resultante del reemplazo del promotor de flhDC con el promotor tetA inducible por anhidrotetraciclina (AnTc), flhD8089, cada uno da lugar a un aumento sustancial de la secreción de FlgM que es mayor que la observada por la eliminación de inhibidores de transcripción de flhDC: FliT, LrhA, DskA, RcsB o EcnR (figura 5a ). El operón flhDC inducible por AnTc (el alelo flhD8089) es notable porque se suprime para los sitios de unión de todas las proteínas inhibidoras conocidas y depende solo de AnTc para su expresión. El alelo flhD8089 se puede combinar con el alelo H14N fliA(o28) de la chaperona de secreción de FlgM, que mostró el mayor efecto positivo en la secreción de FlgM (figura 6A). Una combinación adicional con un alelo mutante de proteasa clpX puede aumentar la secreción (figura 10A). El uso de este fondo genético en una cepa que también expresa una proteína de interés fusionada con la señal de secreción flagelar de tipo III FlgM puede aumentar la producción de la proteína de interés, especialmente si se cultiva en presencia de NaCl o KCl 200 mM (figura 11A).
2. La columna de purificación de a 28.
La proteína a28 es el producto del gen fliA y el chaperón de secreción de tipo III para FlgM. El aumento de los niveles de a28 da lugar al aumento de los niveles de sustrato de proteína fusionada con FlgM secretada (fig. 6A). La proteína a28 también se puede usar para un sistema de purificación de proteínas. La Kd aparente del complejo FlgM-o28 es 2x10-10M. Esta afinidad notablemente alta significa que la purificación de FlgM puede dar lugar a la purificación conjunta de a28 y viceversa. Se ha construido FlgM fusionado con un dominio de unión a quitina (CBD) intercalado por un sitio de autoescisión de inteína. Cuando se vertieron extractos de células que expresan esta quimera de fusión sobre una columna de quitina, la quimera FlgM-inteína-CBD en complejo con a28 unido a la columna. La adición de un agente reductor catalizó la autoescisión de inteína que libera el complejo de FlgM-o28 purificado. La preparación de una columna de quitina unida por a28-CBD puede usar este aspecto. El medio de cultivo gastado de la quimera FlgM-inteína-X producida a partir de la cepa de secreción flagelar de los inventores, donde X es la proteína de interés, se puede verter sobre una columna de este tipo. La inducción de la autoescisión de inteína puede liberar proteína X en forma pura. Esto puede proporcionar un sistema de producción de proteínas de alto rendimiento y bajo coste.
Las proteínas que deben permanecer en condiciones oxidativas para mantener una conformación activa pueden tener una secuencia de escisión por proteasa, tal como enterocinasa, que se escinde en condiciones oxidativas, en lugar de la inteína.
El sistema y los métodos desvelados también se pueden desarrollar en E. coli para obtener la secreción y producción de proteínas con el sistema T3S flagelar de E. coli que se logró en Salmonella. Esto se puede ampliar para incluir otras cepas, tales como cepas termotolerantes. Las proteínas de cepas termotolerantes se usan con frecuencia en estudios cristalográficos y de RMN debido al aumento de la estabilidad de las proteínas a altas temperaturas que facilitan el análisis estructural.
Se puede desarrollar un sistema T3S de inyectisoma SPI1 para la producción de proteínas. Las proteínas SipA, SipB y SipC son secretadas en niveles altos por el sistema T3S de inyectisoma SPI1 (figura 14). Estas proteínas pueden probarse para determinar si pueden usarse para facilitar la secreción de proteínas en construcciones de fusión y desarrollar un sistema de producción de proteínas similar al sistema flagelar. La producción de Spi1 está bajo el control de HilD y se ha determinado que la expresión controlada de hiLD+ del promotor ParaBAD inducible por arabinosa da lugar a altos niveles de producción de ARNm de Spi1.
E. coli tiene esencialmente el T3S flagelar idéntico a Salmonella, lo que facilita la reconstrucción de la cepa de secreción óptima en E. coli. Sin embargo, E. coli carece del sistema SPI1 y, por tanto, el conjunto completo de genes de SPI1 se puede insertar en el cromosoma de E. coli. Como se muestra en la figura 15A, los genes de SPI1 están organizados en una única "isla de patogenia" que puede amplificarse e insertarse en el cromosoma de E. coli usando la tecnología lambda RED. Se pueden usar los genes del aparato de exportación y del complejo de agujas, mientras que el gen de hilA+ se insertará en el locus araBAD para permitir la inducción de SPI1 por arabinosa. El sistema SPI1 también se puede usar para desarrollar un sistema de purificación de proteínas de membrana. Este sistema puede revolucionar la producción y caracterización de proteínas de membrana. El sistema SP11 funciona insertándose en la membrana citoplásmica de células hospedadoras a través de su punta de translocón (véase figura 16). Se puede modificar la longitud de la aguja del inyectisoma para desarrollar una aguja funcional mínima que sea lo más corta posible pero que aún permita la formación e inserción normales de translocón en la membrana de células hospedadoras. Puede resultar beneficioso minimizar la longitud de la aguja a través de la que debe pasar una proteína de membrana. Esto se puede acoplar a la translocación de la secreción de proteínas de membrana usando el sistema SPI1 en vesículas de membrana artificial.
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Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un método para producir un péptido de interés, que comprende cultivar una línea celular que comprende una construcción de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico de FlgM, una secuencia de ácido nucleico que codifica un sitio de escisión de enterocinasa (ETK), un promotor ParaBAD y una secuencia de ácido nucleico de interés que codifica una toxina neuroactiva, y
    en donde la línea celular procede de bacterias seleccionadas del grupo que consiste en una cepa de tipo silvestre de Salmonella entérica serovariedad Typhimurium, una cepa mutante de Salmonella entérica serovariedad Typhimurium, Escherichia coli o Yersinia.
    2. El método de la reivindicación 1, en donde la construcción comprende la secuencia de ácido nucleico de FlgM, un marcador hexa-His (6His), una secuencia de ácido nucleico que codifica el sitio de escisión de ETK y el promotor ParaBAD, y en donde la toxina neuroactiva codificada por la secuencia de ácido nucleico de interés es 8-SVIE.
    3. El método de las reivindicaciones 1 o 2, en donde la construcción comprende además una secuencia de ácido nucleico que codifica un marcador de purificación, en donde el marcador de purificación es opcionalmente polihistidina o en donde la secuencia de ácido nucleico que codifica un marcador de purificación está opcionalmente en dirección C-terminal con respecto a la secuencia de ácido nucleico de interés, o en donde el orden de las secuencias es
    (a) la secuencia de ácido nucleico de FlgM, la secuencia de ácido nucleico que codifica un marcador de purificación, el sitio de escisión y la secuencia de ácido nucleico de interés, o
    (b) la secuencia de ácido nucleico que codifica un marcador de purificación, la secuencia de ácido nucleico de FlgM, el sitio de escisión y la secuencia de ácido nucleico de interés.
    4. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde la secuencia de ácido nucleico de FlgM es FlgM de tipo silvestre y el sitio de escisión está entre la secuencia de ácido nucleico de FlgM y la secuencia de ácido nucleico de interés.
    5. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde el péptido es un polipéptido que comprende FlgM, un sitio de escisión, un péptido de interés y un marcador de purificación, y en donde el péptido de interés es 8-SVIE.
    6. El método de la reivindicación 5, en donde el marcador de purificación es polihistidina.
    7. El método de las reivindicaciones 5 o 6, en donde el FlgM es FlgM de tipo silvestre.
    8. El método de cualquiera de las reivindicaciones 5-7, en donde
    (a) el sitio de escisión está entre el FlgM y el péptido de interés, o
    (b) el FlgM está en dirección N-terminal con respecto al marcador de purificación, el marcador de purificación está en dirección N-terminal con respecto al sitio de escisión y el sitio de escisión está en dirección N-terminal con respecto al péptido de interés, o
    (c) el marcador de purificación está en dirección N-terminal con respecto a FlgM, FlgM está en dirección N-terminal con respecto al sitio de escisión y el sitio de escisión está en dirección N-terminal con respecto al péptido de interés, o
    (d) el marcador de purificación está en dirección C-terminal con respecto al péptido de interés.
    9. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en donde el genoma de la línea celular comprende
    (a) una alteración de uno o más genes de flagelina o de proteínas asociadas al gancho, en donde el o los genes de flagelina opcionalmente se seleccionan del grupo que consiste en flgK, flgL, fliC, fljB y fliD, o
    (b) una alteración de uno o más inhibidores del complejo proteico regulador maestro de FlhD4C2 flagelar, en donde los inhibidores del complejo proteico regulador maestro de FlhD4C2 flagelar opcionalmente se seleccionan del grupo que consiste en fimZ, srgD, hdfR, rbsR, ompR, clpX, clpP, lrhA, ydiV, dskA, ecnR, fliT y rcsB, o
    (c) en donde la línea celular comprende una mutación para aumentar la transcripción o la traducción del gen fliA de chaperona de FlgM T3S.
    10. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-9, que comprende además purificar el péptido de interés del medio de cultivo, en donde la purificación del péptido de interés comprende opcionalmente una columna de afinidad, en donde la columna de afinidad es opcionalmente un columna de afinidad de a28.
    11. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en donde la línea celular comprende un sistema de secreción flagelar de tipo III (T3S) de Salmonella enterica serovariedad Typhimurium para secretar el polipéptido que comprende el péptido de interés.
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