ES2259440T3 - Procedimiento de produccion de bacterias de polipeptidos heterologos con enlaces disulfuros. - Google Patents

Abstract

SE PROPORCIONA UN PROCEDIMIENTO PARA PRODUCIR UN POLIPEPTIDO HETEROLOGO EN BACTERIAS, EL CUAL COMPRENDE: (A) CULTIVAR CELULAS BACTERIANAS, LAS CUALES COMPRENDEN ACIDO NUCLEICO QUE CODIFICA UNA PROTEINA DSBA O DSBC, ACIDO NUCLEICO QUE CODIFICA EL POLIPEPTIDO HETEROLOGO, UNA SECUENCIA DE SEÑAL PARA SECRECION TANTO DE LA PROTEINA DSBA O DSBC COMO EL POLIPEPTIDO HETEROLOGO, Y UN PROMOTOR INDUCIBLE PARA TANTO EL ACIDO NUCLEICO QUE CODIFICA LA PROTEINA DSBA O DSBC COMO EL ACIDO NUCLEICO QUE CODIFICA EL POLIPEPTIDO HETEROLOGO, BAJO CONDICIONES POR LAS QUE LA EXPRESION DEL ACIDO NUCLEICO QUE CODIFICA LA PROTEINA DSBA O DSBC ES INDUCIDA ANTES DE LA INDUCCION DE LA EXPRESION DEL ACIDO NUCLEICO QUE CODIFICA EL POLIPEPTIDO HETEROLOGO, Y BAJO CONDICIONES POR LAS QUE TANTO EL POLIPEPTIDO HETEROLOGO Y LA PROTEINA DSBA O DSBC SON SEGREGADAS EN EL PERIPLASMA DE LA BACTERIA O EL POLIPEPTIDO HETEROLOGO ES SEGREGADO EN EL MEDIO EN EL QUE LAS CELULAS BACTERIANAS SON CULTIVADAS; Y (B) RECUPERAR EL POLIPEPTIDO HETEROLOGO DEL PERIPLASMA O DEL MEDIO DE CULTIVO.

Description

Procedimiento de producción de bacterias de polipéptidos heterólogos con enlaces disulfuros.

Antecedentes de la invención Campo de la invención

Esta invención trata de un procedimiento para producir y secretar polipéptidos en bacterias sobreproduciendo y secretando una proteína DsbA o DsbC.

Descripción de divulgaciones relacionadas

Se han realizado muchos estudios en el campo del plegamiento de las proteínas desde la publicación pionera de Anfinsen y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU, 47: 1309-1314 (1961) que demuestra que, in vitro, una ribonucleasa reducida y desnaturalizada podía replegarse hasta una enzima activa con la formación de los puentes disulfuro adecuados. Después, se descubrió un catalizador responsable del plegamiento oxidativo en eucariotas, llamado proteína disulfuro isomerasa (PDI).

Se han descrito dos tipos de proteínas que pueden ayudar en el plegamiento de las proteínas: chaperonas moleculares no catalíticas que presumiblemente impiden que unas interacciones inapropiadas provoquen la agregación y otros sucesos diferentes a un correcto plegamiento, y catalizadores para los dos pasos del plegamiento de las proteínas, isomerización cis-trans propilo y la formación de puentes disulfuro. Mientras que aún falta una evidencia clara de la necesidad in vivo de la actividad propilo isomerasa, el aislamiento relativamente reciente de mutantes con una gran falta de formación de puentes disulfuro ha confirmado que este último paso del plegamiento está catalizado in vivo.

La PDI se ha implicada en la formación de puentes disulfuro y en la reorganización a través de datos in vitro. Creighton y col., J. Mol. Biol., 142: 43-62 (1980); Freedman y col., Biochem. Soc. Symp., 55: 167-192 (1989). Véase además Bardwell y Beckwith, Cell, 74: 769-771 (1993). Además, se han identificado mutantes de levadura en PDI no pueden formar puentes disulfuro en la carboxipeptidasa de tipo serina (Y), lo que indica la importancia de PDI en la formación de puentes disulfuro in vivo. LaMantia y Lennarz, Cell, 74: 899-908 (1993). En procariotas, las mutaciones en un gen específico del periplasma de E. coli por tres grupos de investigación independientes demuestra una drástica disminución pleiotrópica en la tasa de formación de puentes disulfuro en las proteínas secretadas. La proteína codificada por este gen se denominó de varias formas como DsbA (puente disulfuro) en Bardwell y col., Cell, 67: 581-589 (1991) y Missiakas y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 7084-7088 (1993), y como PpfA (fosfatasa periplásmica/formación proteica) en Kamitani y col., EMBO J., 11: 57-62 (1992). Denominado en lo sucesivo como Dsb. Las proteínas secretadas afectadas por esta disminución en el intervalo de formación de puentes disulfuro desde proteínas endógenas de E. coli como por ejemplo la fosfatasa alcalina y OmpA hasta proteínas recombinantes de mamífero, uroquinasa y activador del plasminógeno tisular. Ahora parece claro que la formación de puentes disulfuro es un proceso catalizado tanto en eucariotas como en procariotas. Para una revisión sobre PDI y DsbA, véase Bardwell y Beckwith, Cell, citado con anterioridad (1993).

La proteína DsbA tiene un puente disulfuro altamente reactivo, similar a la disulfuro isomerasa. Noiva y Lennarz, J. Biol. Chem., 267: 3553-3556 (1992); Bulleid, Adv. Prot., 44: 125-150 (1993). Recientemente se ha resuelto la estructura cristalizada (Martin y col., Nature, 365: 464-468 [1993]) y se ha determinado su potencial de oxido-reducción. Wunderlich y Glockshuber, Prot. Sci., 2: 717-726 (1993). Es un oxidante significativamente más poderoso que la tiorredoxina citoplásmica y se asemeja más a las disulfuro isomerasas eucariotas. Se ha descubierto que una DsbA sin plegar estabiliza el puente disulfuro reactivo aproximadamente en 18,9 kJmol^{-1}. Zapun y col., Biochemistry, 32: 5083-5092 (1993). Este resultado se interpreta como un indicador de que el puente disulfuro desestabiliza la forma replegada de DsbA, confiriéndole de este modo su alto contenido energético.

El gen de una segunda proteína implicada en la formación de puentes disulfuro, llamada dsbB, fue clonada por dos grupos independientes. Bardwell y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 1038-1042 (1993) y Missiakas y col., 1993, citado con anterioridad. DsbB una proteína transmembrana integral de la membrana interna. Parece que está implicada en la reoxidación de DsbA y así puede formar parte de una cadena que une un paso de transferencia de electrones con la formación de puentes disulfuro en el periplasma. Bardwell y col., citado con anterioridad (1993). Recientemente se ha identificado un tercer gen para la formación de puentes disulfuro, dsbC. Missiakas y col., EMBO J., 13: 2013-2020 (1994); Shevchik y col., EMBO J., 13: 2007-2012 (1994). Codifica una proteína periplásmica de 26 kDa que puede sustituir funcionalmente a DsbA.

Se ha demostrado que DsbA es necesaria para la formación rápida de puentes disulfuro de proteínas periplásmicas de E. coli in vivo e in vitro. Se descubrió lo mismo para la producción de proteínas recombinantes eucariotas en el periplasma de E. coli, por ejemplo, serina proteasas diferentes (Bardwell y col., citado con anterioridad [1993]), fragmentos de anticuerpos (Knappik y col., Bio/Technology, 11: 77-83 [1993]), y fragmentos de un receptor de un linfocito T. La fracción de moléculas recombinantes que se pliega correctamente puede ser inferior que en el caso de las proteínas periplásmicas naturales, y depende en gran medida de la secuencia. La sobreproducción de DsbA no ayudó a aumentar la proporción de fragmentos de anticuerpos periplásmicos correctamente plegados (Knappik y col., citado con anterioridad), lo que indica que hay otros pasos que limitan su plegamiento en el periplasma. Además, el plegamiento de inhibidor de Ragi de la \alpha-amilasa/tripsina en el periplasma no mejoró cuando se coexpresó el gen bsbA y la proteína DsbA se cosecretó sin glutatión reducido presente en el medio de crecimiento, pero se observó un aumento en la cantidad de inhibidor correctamente plegado mediante la coexpresión de bsbA junto con la adición de glutatión reducido al medio. Wünderlich y Glockshuber, J. Biol. Chem., 268: 24547-24550 (1993). Además, Wünderlich y Glockshuber demostraron que no había un aumento en la acumulación total de una proteína inhibidora de \alpha-amilasa/tripsina.

Wülfing y Plückthun, Molecular Microbiology, 12: 685-692 (1994) produjeron fragmentos funcioanles de un receptor de linfocito T (TCR) en el periplasma de E. coli mediante una ligera sobreproducción de DsbA y las proteínas de choque térmico de E. coli a baja temperatura. Esto ultimo se logró mediante la sobreexpresión de rpoH, que codifica el factor sigma de choque térmico, sigma^{32}. Esto aumentó el rendimiento de los plegamientos de los fragmentos de TCR en el periplasma en aproximadamente dos órdenes de magnitud. Ahora se sabe que el rendimiento se produce en ausencia de la sobreproducción de rpoH. Las patentes de EE.UU. N.º 5.270.181 y 5.292.646 desvelan la producción recombinante de proteínas heterólogas expresándolas como una proteína de fusión con una proteína similar a la tiorredoxina (como el dominio de PDI similar a la tiorredoxina) para una alta estabilidad y solubilidad. El documento JP60-38771 publicado el 15 de febrero de 1994, desvela la expresión de un gen PDI unido a una preprosecuencia de la albúmina sérica humana y la coexpresión de este gen unido y un gen foráneo que codifica un polipéptido. El documento WO93/25676 publicado el 23 de diciembre de 1993 desvela la producción de proteínas recombinantes con puentes disulfuro usando una PDI, preferentemente una PDI de levadura. El documento EP293.793 publicado el 7 de diciembre de 1988 desvela un polipéptido con actividad PDI que asegura una distribución de los puentes disulfuro natural en las proteínas recombinantes. El documento WO94/08012 publicado el 14 de abril de 1994 desvela una secreción creciente de los productos génicos sobreexpresados por la coexpresión de una proteína chaperona, como por ejemplo una proteína de choque térmico o una PDI. El documento EP509.841 publicado el 21 de octubre de 1992 desvela un aumento de la secreción de una albúmina sérica humana a partir de células de levadura usando un sistema de coexpresión que implica una PDI y una proteína.

Hay una necesidad continua para aumentar la producción total de proteínas secretadas en procariotas.

Por lo tanto, es un objeto de esta invención el proporcionar un procedimiento para incrementar la producción de polipéptidos usando un procedimiento viable económicamente que implique la regulación fisiológica del medio intracelular para una acumulación potenciada de los polipéptidos foráneos en las bacterias.

Este objeto y otros objetos serán aparentes para los expertos en la materia.

Descripción de la invención

Por consiguiente, la presente invención ofrece un procedimiento para producir un polipéptido heterólogo en bacterias como se describe en la reivindicación 1.

La sobreexpresión y secreción de las proteínas bacterianas DsbA o DsbC tiene como resultado un aumento significativo en la cantidad de polipéptido heterólogo producido en el periplasma de la bacteria o en el medio de cultivo. En el ejemplo específico que se muestra a continuación, la sobreexpresión y la secreción de la proteína DsbA de E. coli resultó en un gran aumento de la producción total de IGF-I humano depositado en cuerpos de inclusión en el espacio periplásmico de E. coli. Además, este aumento en la producción total se logra cultivando en ausencia de glutatión en el medio y sin coexpresar o sobreexpresar el factor de transcripción de choque térmico de E.coli, RpoH.

Mientras que se ha sugerido que DsbA está implicada en el plegamiento de las proteínas periplásmicas y de la pared externa de E. coli, no se sabe si la sobreexpresión del gen que codifica esta proteína afectaría por sí mismo, a las proteínas humanas secretadas. Tampoco se sabía si la sobreexpresión del gen dsbA produciría unos niveles mayores de actividad asociada a DsbA. Si se hubiera visto algún efecto, se esperaría que unos mayores niveles de actividad DsbA promovieran el propio plegamiento del polipéptido IGF-I y resultara en unos mayores niveles de monómero IGF-I soluble plegado. Por el contrario, se observó un aumento significativo en la producción total de IGF-I, debido a un aumento en la deposición de polipéptido IGF-I en agregados insolubles, y la producción de proteínas correctamente plegadas soluble disminuyera. Dado que existen procedimientos eficaces para plegar estos agregados insolubles en polipéptidos con actividad biológica, este aumento de polipéptidos insolubles es un resultado muy
útil.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 representa los plásmidos empleados en la construcción de pJJ42, usado para producir IGF-I, a saber, pBKIGF-2B, pJJ41, y pKMtacII.

La figura 2 representa la construcción del plásmido pJJ40 usado para producir IGF-I.

La figura 3 representa la construcción del plásmido pBKIGF2B-A usado para producir IGF-I.

Descripción detallada de las formas de realización preferentes A. Definiciones

Como se usa en la presente memoria descriptiva, "dsbA" y "dsbC" se refieren a genes que codifican las proteínas periplásmicas de bacterias conocidas en la bibliografía, como proteínas DsbA o DsbC, respectivamente. Pueden ser de cualquier origen bacteriano, siendo un ejemplo el gen dsbA de E. coli como se describe en Bardwell y col., citado con anterioridad (1991) y Kamitani y col., citado con anterioridad, y el gen dsbC de E. coli como se describe en Missiakas y col., 1994, citado con anterioridad. Los genes dsbA y dsbC y sus productos como se usan en la presente memoria descriptiva no incluyen PDI ni otra proteína eucariota que funcione como un proteína disulfuro isomerasa, incluyendo las desveladas en las patentes de EE.UU. N.º 5.270.181 y 5.292.646; y los documentos JP60-38771; WO93/25676; EP293.793; WO94/08012; y EP509.841, todos citados con anterioridad. DsbA y DsbC difieren en mucho respecto a PDI. Por ejemplo, DsbA y DsbC conservan su actividad isomerasa en ausencia de un tampón redox, mientras que PDI necesita un tampón redox para su actividad isomerasa. Además, DsbA y DsbC tienen pesos moleculares, por análisis de secuencia, de 21 kDa y 25 kDa, respectivamente, y contienen dos y cuatro residuos de cisteína, respectivamente, mientras que PDI tiene un peso molecular por análisis de secuencia de 57 Kda y contiene seis residuos de cisteína.

Como se usa en la presente memoria descriptiva, "secuencia señal" o "polipéptido señal" se refieren a un péptido que puede usarse para secretar el polipéptido heterólogo en el periplasma o en el medio de cultivo de las bacterias o secretar las proteínas DsbA o DsbC en el periplasma. Las señales para el polipéptido heterólogo pueden ser homólogas a las de bacterias, o pueden ser heterólogas, incluyendo señales nativas al polipéptido que se está produciendo en la bacteria. Para dsbA y dsbC, la secuencia señal es típicamente la que es endógena a las células bacterianas, aunque no tiene por qué serlo mientras sea eficaz para su propósito.

Un producto génico "sobreexpresado" es uno que se expresa a niveles superiores a los de expresión normal endógena para ese producto génico. Se puede conseguir, por ejemplo, introduciendo una construcción recombinante que dirija la expresión de un producto génico en una célula hospedadora, o alterando los niveles basales de expresión de un producto génico endógeno, por ejemplo, induciendo su transcripción.

Los promotores usados en esta invención son promotores "inducibles", es decir, promotores que dirigen la transcripción a una tasa superior o inferior tras la unión de un factor de transcripción. "Factores de transcripción" como se usa en la presente memoria descriptiva incluyen cualquier factor que pueda unirse a una región reguladora o de control de un promotor y por lo tanto, afectar a su transcripción. La síntesis o la capacidad de unión al promotor de un factor de transcripción en la célula hospedadora se puede controlar exponiendo la célula hospedadora a un "inductor" o eliminando del medio un inductor del medio de la célula hospedadora. Por consiguiente, para regular la expresión de un promotor inducible, se añade o se elimina un inductor del medio de crecimiento de la célula hospedadora.

Como se usa en la presente memoria descriptiva, la frase "inducir la expresión" significa aumentar la cantidad de transcripción de genes específicos exponiendo las células con dichos genes a un efector o inductor.

Un "inductor" es un agente químico o físico que, cuando se añade a una población celular, aumentará la cantidad de transcripción de los genes específicos. Por lo general, son moléculas pequeñas cuyos efectos son específicos para operones o grupos de genes particulares, y pueden incluir azúcares, fosfatos, alcoholes, iones metálicos, hormonas, calor, frío y similares. Por ejemplo, el Isopropiltio-\beta-galactósido (IPTG) y la lactosa son inductores del promotor tacII, y la L-arabinosa es un inductor adecuado para el promotor del operón arabinosa. El promotor del gen pho, como phoA y pho5, es inducible por bajas concentraciones de fosfato en el medio.

El polipéptido heterólogo producido por los procedimientos de la invención se selecciona del grupo formado por activador del plasminógeno tipo tisular, gp120 del VIH, ADNasa, factor de crecimiento insulinoide I, factor de crecimiento insulinoide II, factor de crecimiento insulinoide I cerebral, relaxina, insulina, proinsulina, uroquinasa, neurotrofina 3, neurotrofina 4, neurotrofina 5, neurotrofina 6 o factor de crecimiento nervioso. En formas de realización preferentes, el polipéptido heterólogo se un polipéptido humano.

Como se usa en la presente memoria descriptiva "IGF-I" se refiere a un factor de crecimiento insulinoide de cualquier especie, incluyendo bovino, ovino porcino, equino, y preferentemente humano, en una secuencia nativa o una forma variante y producida recombinantemente. En procedimiento preferente, el IGF-I se clona y su ADN se expresa, por ejemplo, mediante el procedimiento descrito en el documento EP128.733 publicado el 19 de diciembre de 1984.

La expresión "secuencias de control" se refiere a secuencias de ADN necesarias para la expresión de una secuencia codificadora enlazada operativamente en un organismo hospedador particular. Las secuencias de control que son adecuadas para bacterias incluyen el promotor de la fosfatasa alcalina, opcionalmente una secuencia operadora y un sitio de unión a ribosomas.

Un ácido nucleico está "enlazado operativamente" cuando se coloca funcionalmente a continuación de otra secuencia nucleotídica. Por ejemplo, se enlaza operativamente al ADN de una presecuencia o de una secuencia líder de secreción el ADN de un polipéptido si se expresa como una preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o un potenciador están enlazados operativamente a una secuencia codificadora si afectan a la transcripción de la secuencia; o se enlaza operativamente un centro de unión a ribosomas a una secuencia codificadora si se coloca de modo que facilita la traducción. Generalmente, "enlazado operativamente" significa que las secuencias de ADN que se están enlazando son contiguas y, en el caso de una secuencia líder se secreción, contigua y en pauta de lectura. El enlace está acompañado de una ligación en los sitios de restricción convenientes. Si tales sitios no existen, se usan adaptadores o ligadores oligonucleotídicos sintéticos según la práctica habitual.

Las expresiones como se usa en la presente memoria descriptiva, "célula" y "línea celular" se usan indistintamente y todas las denominaciones que incluyan progenie. Así, las palabras "transformantes" o "células transformadas" incluyen la célula sujeto primaria y los cultivos derivados de ésta independientemente del número de transferencias. Se entiende además que puede que no toda la progenie sea precisamente idéntica en su contenido de ADN, debido a mutaciones deliberadas o involuntarias. Se incluye la progenie mutante que tenga la misma funcionalidad o actividad biológica que la analizada en la célula originalmente transformada. Cuando se empleen denominaciones distintas, se aclarará en el contexto.

La técnica de la "reacción en cadena de la polimerasa" o "PCR", en el contexto de la presente memoria descriptiva, se refiere por lo general a un procedimiento en el que se amplifican pequeñas cantidades de un ácido nucleico específico, ARN y/o ADN, tal como se describe en la patente de EE.UU. Nº 4.683.195 concedida el 28 de julio de 1987. Normalmente, la información sobre la secuencia obtenida en los extremos de la región de interés o posterior a esos puntos debe estar disponible, se pueden diseñar dichos cebadores oligonucleotídicos, los cuales tienen que ser idénticos o similares a la secuencia de las hebras complementarias del molde que va a amplificarse. Los nucleótidos terminales 5' de los dos cebadores pueden coincidir con los extremos del material amplificado. La PCR puede usarse para amplificar secuencias específicas de ARN, secuencias específicas de ADN del ADN genómico total y ADNc transcrito a partir del ARN celular total, bacteriófagos o secuencias plasmídicas, etc. Véase en general Mullis y col., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 51: 263 (1987); Erlich, ed., PCR Technology, (Stockton Press, NY, 1989). Para una revisión reciente sobre avances en la PCR, véase Erlich y col., Science, 252: 1643-1650 (1991).

Como se usa en la presente memoria descriptiva, la PCR se considera un ejemplo, aunque no el único, de procedimiento de reacción de una polimerasa de ácido nucleico para amplificar una muestra de una prueba de ácido nucleico que comprende el uso de un ácido nucleico como cebador y una polimerasa de ácido nucleico para amplificar o generar un fragmento específico de ácido nucleico.

B. Modos de realización de la invención

En el procedimiento de la presente memoria descriptiva, la expresión de los genes dsbA o dsbC se induce justo antes (inmediatamente antes de) la expresión del gen heterólogo. Tanto el polipéptido heterólogo como las proteínas DsbA o DsbC se secretan en el periplasma o el polipéptido heterólogo se secreta en el medio de cultivo de la bacteria en la que se ha introducido el ácido nucleico que codifica estos polipéptidos. Preferentemente, el polipéptido se recupera a partir del periplasma de las bacterias.

El ácido nucleico dsbA o dsbC puede ser ADNc o ADN genómico a partir de la fuente bacteriana, y generalmente es la secuencia nativa. Idóneamente se coloca separado del ácido nucleico que codifica el polipéptido heterólogo si los ácidos nucleicos están en el mismo vector, es decir, no están enlazados. Además, el ácido nucleico que codifica DsbA o DsbC y el ácido nucleico que codifica el polipéptido heterólogo están cada uno bajo el control de diferentes promotores inducibles de modo que la inducción puede producirse en el orden secuencial necesario. El ácido nucleico ácido nucleico las proteínas DsbA o DsbC y el ácido nucleico que codifica el polipéptido heterólogo se pueden integrar en el genoma de la célula hospedadora o pueden estar contenidos en plásmidos de replicación autónoma.

Si DsbA o DsbC son productos nativos de la célula hospedadora y si se conocen los factores que controlan la expresión de estos genes nativos, dichos factores pueden ser manipulados para lograr una sobreexpresión de los genes dsbA o dsbC, por ejemplo, mediante la inducción de la transcripción del promotor natural usando moléculas inductoras conocidas, mediante la mutación del ácido nucleico que controla o reprime la expresión del producto génico para producir una cepa mutante que sobreexprese por inducción el producto génico, mediante mutaciones dirigidas que desrepriman la síntesis o la función de factores que normalmente reprimen la transcripción del producto génico y similares.

En una forma de realización alternativa, la bacteria comprende dos vectores diferentes que contienen el ácido nucleico que codifica las proteínas DsbA o DsbC y el ácido nucleico que codifica el polipéptido heterólogo.

En una forma de realización alternativa, el ácido nucleico que codifica las proteínas DsbA o DsbC y el ácido nucleico que codifica el polipéptido heterólogo están contenidos en el mismo vector pero bajo el control de distintos promotores inducibles y secuencias señal diferentes.

El ácido nucleico heterólogo (por ejemplo, ADNc o ADN genómico) se introduce idóneamente en un vector de replicación de expresión en bacterias bajo el control de un promotor adecuado para bacterias. Para este propósito hay muchos vectores disponibles y la selección del vector apropiado dependerá principalmente del tamaño del ácido nucleico que se va a introducir en el vector y de la célula hospedadora particular que se vaya a transformar con el vector. Cada vector contiene varios componentes dependiendo de su función (amplificación de ADN o expresión de ADN) y de la célula hospedadora particular con la que sea compatible. Los componentes del vector para la transformación bacteriana generalmente incluyen, pero no se limitan a, uno o más de los siguientes componentes: una secuencia señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores y un promotor inducible.

En general, con la célula hospedadora se usan vectores plasmídicos con un replicón y secuencias de control que proceden de especies compatibles con la célula hospedadora. El vector normalmente tiene un sitio de replicación, así como secuencias marcadoras que sean capaces de ofrecer una selección fenotípica de las células transformadas. Por ejemplo, E. coli normalmente se transforma con pBR322, un plásmido que procede de una especie de E. coli (véase por ejemplo, Bolivar y col., Gene, 2: 95 [1977]). pBR322 contiene genes de resistencia a la ampicilina y a la tetraciclina y ofrece así un medio sencillo de identificar las células transformadas. El plásmido pBR322, u otros plásmidos microbianos o fágicos, además deben contener, o están modificados para que contengan, promotores que puedan ser usados por el organismo microbiano para la expresión de genes marcadores de selección.

El ADN que codifica el polipéptido de interés en la presente memoria descriptiva se puede expresar no sólo directamente, sino además como una fusión con otro polipéptido, preferentemente una secuencia señal u otro polipéptido que tenga un sitio de corte en el extremo N terminal del polipéptido maduro. En general, la secuencia señal puede ser un componente del vector, o puede formar parte del ADN que codifica el polipéptido que se inserta en el vector. La secuencia señal heteróloga seleccionada debe ser una que la célula hospedadora reconozca y procese (es decir, cortada por una peptidasa señal). Para las células bacterianas hospedadoras que no reconozcan ni procesen la secuencia señal del polipéptido, la secuencia señal se sustituye por una secuencia señal bacteriana seleccionada, por ejemplo, del grupo formado por las secuencias señal de la fosfatasa alcalina, de la

\hbox{penicilinasa, de Ipp, o de la enterotoxina II
termoestable.}

Tanto los vectores de expresión como los de clonación contienen una secuencia nucleotídica que hace que el vector pueda replicarse en una más células hospedadoras seleccionadas. Generalmente, en los vectores de clonación esta secuencia es una que hace que el vector se replique independientemente del ADN cromosómico de la célula hospedadora, e incluye orígenes de replicación o secuencias de replicación autónoma. Tales secuencias son muy conocidas para una variedad de bacterias. El origen de replicación para el plásmido pBR322 es adecuado para la mayoría de bacterias Gram negativas.

Los vectores de expresión y clonación generalmente también contienen un gen de selección, también llamado marcador de selección. Este gen codifica una proteína necesaria para la supervivencia o el crecimiento de célula hospedadoras crecidas en un medio de cultivo de selección. Las células hospedadoras que no estén transformadas con el vector que contiene el gen de selección no sobrevivirán en el medio de cultivo. Los genes de selección típicos codifican proteínas que (a) confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato o tetraciclina, (b) complementan deficiencias auxotróficas, o (c) proporcionan nutrientes esenciales no disponibles en el medio complejo, por ejemplo, el gen que codifica la D-alanina racemasa para bacilos. Un ejemplo de un esquema de selección utiliza un fármaco que inhiba el crecimiento de una célula hospedadora. Las células que se han transformado correctamente con el gen heterólogo producen una proteína que confiere una resistencia al fármaco y de este modo sobreviven al régimen de selección.

Además, el vector de expresión para producir un polipéptido heterólogo contiene un promotor inducible que es reconocido por el organismo bacteriano hospedador y está enlazado operativamente al ácido nucleico que codifica el polipéptido de interés. Además contiene un promotor inducible diferente enlazado operativamente al ácido nucleico que codifica las proteínas DsbA o DsbC. Los promotores inducibles adecuados para su uso con células hospedadoras bacterianas incluyen los sistemas promotores de la \beta-lactamasa y del operón lactosa (Chang y col., Nature, 275: 615 [1978]; Goeddel y col., Nature, 281: 544 [1979]), el sistema promotor del operón arabinosa (Guzman y col., J. Bacteriol., 174: 7716-7728 [1992]), sistema promotor de la fosfatasa alcalina, un sistema promotor del operón triptófano (trp) (Goeddel, Nucleic Acids Res., 8: 4057 [1980] y documento EP36.776) y promotores híbridos como el promotor tac (deBoer y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80: 21-25 [1983]). Sin embargo, también son adecuados otros promotores inducibles bacterianos. Se han publicado sus secuencias nucleotídicas, posibilitándose así que un experto en la materia pueda ligarlas al ADN que codifica el polipéptido de interés o a los genes dsbA o dsbC (Siebenlist y col., Cell, 20: 269 [1980]) usando enlazadores o adaptadores para incluir cualquier sitio de restricción necesario.

Los promotores para su uso en sistemas bacterianos contienen generalmente además una secuencia Shint-Daigamo (S.D.) enlazada operativamente al ADN que codifica el polipéptido de interés. El promotor puede eliminarse del ADN de origen bacteriano mediante la digestión con un enzima de restricción e insertarse en el vector que contiene el ADN deseado.

La construcción de vectores adecuados que contienen uno o más de los componentes anteriormente enumerados emplea técnicas de ligación estándar. Los plásmidos o los fragmentos de ADN aislados se cortan, se rellenan y se religan de la forma deseada para generar los plásmidos necesarios.

Para analizar y confirmar las secuencias correctas en los plásmidos construidos, las mezclas de ligación se usan típicamente para transformar la cepa 294 de E. coli K12 (ATCC 31.446) u otras cepas adecuadas de E. coli, y se selecciona a los transformantes correctos por su resistencia en medios con ampicilina o tetraciclina cuando sea apropiado. Se preparan los plásmidos a partir de los transformantes, se analizan mediante digestión con endonucleasas de restricción y/o se secuencia por el método de Sanger y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74: 5463-5467 (1977) o el de Messing y col., Nucleic Acids Res., 9: 309 (1981) o con el método de Maxam y col., Methods in Enzymology, 65: 499 (1980).

Las bacterias adecuadas para este propósito incluyen arqueobacterias y eubacterias, especialmente eubacterias y más preferentemente enterobacterias. Los ejemplos de bacterias útiles incluyen Escherichia, Enterobacter, Azotobacter, Erwinia, Bacillus, Pseudomonas, Klebsiella, Proteus, Salmonella, Serratia, Shigella, Rhizobia, Vitreoscilla, y Paracoccus. Las células hospedadoras adecuadas de E. coli incluyen E. coli W3110 (ATCC 27.325), E. coli 294 (ATCC 31.446), E. coli B, y E. coli X1776 (ATCC 31.537). Estos ejemplos son ilustrativos y no limitantes. Se pueden usar células mutantes de cualquiera de las bacterias antes mencionadas. Es necesario, por supuesto, seleccionar la bacteria apropiada teniendo en cuenta la replicabilidad del replicón en las células bacterianas. Por ejemplo, las especies de E. coli, Serratia, o Salmonella se pueden usar idóneamente como hospedador cuando se usan plásmidos muy conocidos como pBR322, pBR325, pACYC177, o pKN410 para incluir el replicón.

La cepa de E. coli W3110 es un hospedador preferente o un hospedador parental porque es una cepa hospedadora común para las fermentaciones de productos de ADN recombinante. Preferentemente, la célula hospedadora debe secretar cantidades mínimas de enzimas proteolíticos. Por ejemplo, la cepa W3110 se puede modificar para crear una mutación genética en los genes que codifican las proteínas, incluyendo los ejemplos de tales células hospedadoras la cepa 1A2 de E. coli W3110 que tiene el genotipo completo tonA\Delta; la cepa 9E4 de E. coli W3110, que tiene el genotipo completo tonA\Delta ptr3; la cepa 27C7 de E. coli W3110 (ATCC 55.244), que tiene el genotipo completo tonAD ptr3 phoA\DeltaE15 \Delta(argF-lac)169 ompT\Delta degP41kan^{r}; la cepa 37D6 de E. coli W3110, que tiene el genotipo completo tonA\Delta ptr3; la cepa 27C7 de E. coli W3110 (ATCC 55.244), que tiene el genotipo completo tonA\Delta ptr3 phoA\DeltaE15 \Delta(argF-lac)169 ompT\Delta degP41kan^{r} rbs7\Delta ilvG; La cepa 40B4 de E. coli W3110, que es la cepa 37D6 sin la mutación en el gen de resistencia a la kanamicina degP; la cepa 33D3 de E. coli W3110, que tiene el genotipo completo tonA ptr3 lacI^{q} LacL8 ompT degP kanr; La cepa 36F8 de E. coli W3110, que tiene el genotipo completo tonA phoA \Delta(argF-lac) ptr3 degP kanR ilvG+, y es resistente a la temperatura a 37°C; y una cepa de E. coli que tiene las proteasas periplásmicas mutantes desveladas en la patente de EE.UU. N.º 4.946.783 concedida el 7 de agosto de 1990.

Las células hospedadoras se transfectan y preferentemente se transforman con los vectores de expresión anteriormente descritos y se cultivan en medios con nutrientes convencionales modificados según sea necesario para inducir a los promotores, seleccionar a los transformantes, o amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas.

Transfección se refiere a la asimilación de un vector de expresión por la célula hospedadora tanto si expresan como si alguna secuencia codificadora. Cualquier experto en la materia conoce numerosos procedimientos de transfección, por ejemplo, con CaPO_{4} y por electroporación. Una transfección exitosa generalmente se reconoce cuando aparece cualquier indico de la funcionalidad del vector en la célula hospedadora.

Transformación significa introducir ADN en un organismo de modo que el ADN se pueda replicar, ya sea como un elemento extracromosómico como por integración cromosómica. Dependiendo de la célula hospedadora empleada, la transformación se realiza usando técnicas habituales apropiadas para tales células. El tratamiento con calcio que emplea cloruro de calcio, como se describe en el apartado 1.82 de Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual [New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989], se usa generalmente para células bacterianas que contienen paredes celulares considerables. Otro procedimiento de transformación emplea Polietilenglicol/DMSO como se describe en Chung y Miller, Nucleic Acids Res., 16: 3580 (1988). Otro procedimiento adicional es el uso de la técnica denominada electroporación.

Las células bacterianas usadas para producir el polipéptido heterólogo de interés para los propósitos de esta invención se cultivan en un medio adecuado e el que los promotores del ácido nucleico que codifica el polipéptido heterólogo y del ácido nucleico que codifica las proteínas DsbA o DsbC puede ser inducido artificialmente como se describe generalmente, por ejemplo en Sambrook y col., citado con anterioridad. En las patentes de EE.UU. N.º 5.304.472 y 5.342.763 se ofrecen ejemplos de medios adecuados.

También se puede incluir cualquier complemento necesario como fuentes de carbono, nitrógeno, y fosfatos inorgánicos a las concentraciones apropiadas introducidos individualmente o como una mezcla con otros complementos o medio como una fuente de nitrógeno compleja. El pH del medio puede ser cualquier pH entre 5-9, dependiendo principalmente del organismo hospedador. Preferentemente, el medio no contiene glutatión reducido y las bacterias no se cultivan de modo que sobreexpresen el ácido nucleico que codifica el factor de transcripción de choque térmico RpoH.

Para la inducción, las células típicamente se cultivan hasta una cierta densidad óptica, por ejemplo, a una absorbancia a 550 de 60-80, punto en el que se inicia la inducción (por ejemplo, por la adición de un inductor, por la privación de un componente del medio, etc), para inducir la expresión de los genes dsbA o dsbC. Cuando se alcanza una densidad óptica superior, por ejemplo, una absorbancia a 550 de 80-100, se efectúa la inducción del segundo promotor del polipéptido heterólogo.

La expresión génica se puede medir en una muestra directamente, por ejemplo, por una inmunotransferencia tipo Northern convencional para cuantificar la transcripción del ARNm. Thomas, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 77: 5201-5205 (1980). Se pueden emplear varias etiquetas, más comúnmente radioisótopos, particularmente P^{32}. Sin embargo, se pueden emplear además otras técnicas, como por ejemplo el uso de nucleótidos modificados con biotina para su introducción en un polinucleótido. La biotina sirve entonces como un lugar de unión a avidina o anticuerpos, que se pueden etiquetar con una amplia variedad de etiquetas, como por ejemplo radionucleidos, fluoróforos, enzimas o similares.

Los procedimientos para observar si se secreta un producto génico expresado o sobreexpresado son fácilmente disponibles para los profesionales cualificados. Una vez se separa el medio de cultivo de las células hospedadoras, por ejemplo, por centrifugación o por filtración, el producto génico puede detectarse en el medio de cultivo sin células aprovechándose de propiedades conocidas características del producto génico. Tales propiedades pueden incluir las diferentes propiedades inmunológicas, enzimáticas o físicas del producto génico.

Por ejemplo, si un producto génico sobreexpresado tiene una actividad enzimática única, se puede llevar a cabo una valoración de esa actividad en el medio de cultivo usado por las células hospedadoras. Además, cuando haya disponibles anticuerpos reactivos contra un producto génico dado, tales anticuerpos se pueden usar para detectar el producto génico en un ensayo inmunológico conocido (por ejemplo, como en Harlowe y col., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1988).

El producto génico secretado también se puede detectar usando pruebas que distingan polipéptidos por sus propiedades físicas características como por ejemplo su peso molecular. Para detectar propiedades físicas del producto génico, se pueden etiquetar todos los polipéptidos recién sintetizados por la célula hospedadora, por ejemplo, con un radioisótopo. Los isótopos radiactivos comunes que se pueden usar para etiquetar los polipéptido sintetizados en una célula hospedadora incluyen comunes tritio (H^{3}), carbono-14 (C^{14}), azufre-35 (S^{35}), y similares. Por ejemplo, la célula hospedadora puede crecer en un medio con metionina-S^{35} o cisteína-S^{35}, y una cantidad significativa de la etiqueta de S^{35} se incorporará preferentemente en cualquier polipéptido recién sintetizado, incluyendo el polipéptido heterólogo sobreexpresado. El medio de cultivo que contiene el S^{35} se elimina después y las células se lavan y se colocan en un medio de cultivo nuevo no radiactivo. Después de mantener a las células en el medio nuevo durante un tiempo y en las condiciones suficientes para permitir la secreción del polipéptido heterólogo etiquetado radiactivamente con S^{35} expresado, se recoge el medio de cultivo y se separar de las células hospedadoras. El peso molecular del polipéptido etiquetado secretado en el medio de cultivo se puede determinar después mediante procedimientos conocidos, por ejemplo, electroforesis en gel de poliacrilamida. Tales procedimientos u otros procedimientos para detectar productos génicos secretados, se recogen en Goeddel, D.V. (ed.) 1990, Gene Expression Technology, Methods in Enzymology, Vol. 185 (Academic Press), y Sambrook y col., citado con
anterioridad.

Para la secreción de un producto génico expresado o sobreexpresado, la célula hospedadora se cultiva en condiciones suficientes para la secreción del producto génico. Dichas condiciones incluyen, por ejemplo, condiciones de temperatura, nutrientes y densidad celular que permitan la secreción de la célula. Además, dichas condiciones son aquellas bajo las cuales la célula pueda realizar sus funciones celulares básicas de transcripción, traducción y el paso de proteínas desde un compartimiento celular a otro, como saben los expertos en la materia.

Al poner en práctica el procedimiento de esta invención, la producción de polipéptido total generalmente aumenta, mientras que la producción de polipéptido soluble no cambia o disminuye, es decir, la producción de polipéptido insolubles (agregados) aumenta.

El polipéptido heterólogo de interés se recupera a partir del periplasma o del medio de cultivo como un polipéptido secretado. A menudo se prefiere purificar el polipéptido de interés a partir de proteínas o polipéptidos de células recombinantes y a partir de proteínas DsbA o DsbC para obtener preparaciones del polipéptido de interés que sean sustancialmente homogéneas. Como primer paso, se centrifuga el medio de cultivo o el lisado para eliminar partículas de restos celulares. A continuación se separan las membranas y las fracciones proteicas solubles si fuera necesario. El polipéptido después se puede purificar a partir de la fracción proteica soluble y a partir de la fracción de membranas del lisado del cultivo, dependiendo de si el polipéptido está unido a la membrana, es soluble o está presente en forma de agregados. El polipéptido después se solubiliza y se repliega, y se purifica a partir de las proteínas y polipéptidos solubles contaminantes. En un forma de realización preferente, se aísla el agregado se, después de una etapa de solubilización y plegamiento simultanea, como se desvela en la patente de EE.UU. N.º 5.288.931.

Otro procedimiento preferente para aislar polipéptidos exógenos a partir de una compleja mezcla biológica que contiene polipéptidos y otros productos no polipeptídicos contenidos en un caldo de fermentación, como por ejemplo el descrito anteriormente, implica el contacto de reactivos con las células, preferentemente con el cultivo celular, que contiene el polipéptido en una conformación diferente a la nativa, de modo que pueda tener lugar una extracción o un aislamiento acuso. Preferentemente el procedimiento supone la adición directa de reactivos al matraz de fermentación después de que el polipéptido haya sido producido por medios recombinantes, evitándose así los pasos adicionales de la recogida, homogenización y la centrifugación para obtener el polipéptido. Mientras que los elementos particulados restantes pueden eliminarse mediante la homogenización de Gaulin y una resuspensión, una filtración o una combinación de ambas, este procedimiento utiliza un sistema de extracción con fases múltiples para la purificación de los polipéptidos recombinantes a partir de los elementos particulados restantes.

En particular, se prefiere este procedimiento para polipéptidos heterólogos que formen cuerpos refractores en el periplasma de las células. En este sistema, al medio que contiene el polipéptido se añade uno o más desnaturalizantes (agente caotrópico), como la urea, el clorhidrato de guanidina, y/o una base, y un agente reductor, como el ditiotreitol o la cisteína, y después se añaden al medio las especies que forman fases. Una vez se haya añadido este segundo grupo de reactivos al medio, se forman fases múltiples en las que una fase está enriquecida con el polipéptido y tiene poca biomasa sólida y poco ácido nucleico. Preferentemente, el sistema tiene dos o cuatro fases, y más preferentemente, estando una enriquecida en el polipéptido y la otra en biomasa sólida y ácido nucleico. Preferentemente, el polipéptido deseado migra a la fase superior de modo que la fase superior está enriquecida en el polipéptido y tiene poca biomasa sólida y poco ácido nucleico.

Específicamente, después de que se termina la fermentación, el cultivo celular se pone en contacto con uno o más agentes caotrópicos, un agente reductor opcional, y reactivos formadores de fases de modo que se forman fases múltiples, una de las cuales está enriquecida en el polipéptido de interés. Es preferente añadir un agente caotrópico y un agente reducto primero para extraer el polipéptido de las células y mantener su solubilidad en el medio antes de añadir los reactivos formadores de fases. Además, ya que el polipéptido de interés pueda extraerse a partir de (y enriquecerse en) cualquier fase, preferentemente se recupera de la fase superior.

Más preferentemente, el agente caotrópico y el agente reductor opcional se añaden directamente al caldo de fermentación del matraz de fermentación antes de aislar el polipéptido de modo que los reactivos permitan permeabilizar a las células y solubilizar el polipéptido y que difunda al medio. El agente reductor se añade si el polipéptido contiene al menos un grupo sulfhidrilo. Los ejemplos de agentes reductores adecuados, incluyen el ditiotreitol (DTT), el \beta-mercaptoetanol (BME), la cisteína, el tioglicolato y el borohidruro de sodio. La cantidad de agente reductor presente en el tampón dependerá principalmente del tipo de agente reductor y del agente caotrópico, el tipo y el PH del tampón empleado, y del tipo y concentración del polipéptido en el tampón. Una cantidad eficaz de agente reductor es la que es suficiente para eliminar la agregación intermolecular mediada por disulfuro. Por ejemplo, con IGF-I 0,5-6 mg/ml en una solución amortiguadora a pH 7,5-10,5 con urea 1-4 M, la concentración de DTT es de aproximadamente 1-20 mM, y la concentración de cisteína es de aproximadamente 10-50 mM. El agente reductor preferido es el DTT aproximadamente a 2-10 mM o al cisteína aproximadamente a 30-50 mM.

Los agentes caotrópicos adecuados para la práctica de este procedimiento de extracción incluyen, por ejemplo, urea y sales de guanidina o tiocianato, más preferentemente urea, clorhidrato de guanidina o tiocianato de sodio. La cantidad de agente caotrópico que se necesita en el tampón depende, por ejemplo, del tipo de agente caotrópico y del polipéptido presente. La cantidad de agente caotrópico que se debe añadir al caldo de fermentación será lo suficientemente alta para extraer el polipéptido de las células y mantener su solubilidad en el medio. Si el polipéptido se debe extraer a partir de la fase superior, la cantidad de agente caotrópico debe ser suficientemente baja de modo que después de la adición de las especies formadoras de fases, la densidad no aumente hasta un punto en que los sólidos asciendan en lugar de precipitar. Generalmente, la concentración de agente caotrópico es de aproximadamente 0,1 a 9 M, preferentemente de aproximadamente 0,5 a 9 M, más preferentemente de aproximadamente 0,5 a 6 M, y más preferentemente de aproximadamente 0,5 a 3 M. Además, preferentemente el agente caotrópico se añade al medio de cultivo antes que los reactivos formadores de fases. El agente caotrópico preferente en la presente memoria descriptiva es la urea aproximadamente a 1,5-2,5 M, más preferentemente aproximadamente a 2 M, o el clorhidrato de guanidina aproximadamente a 0,5-3 M. Más preferentemente, el agente caotrópico es la
urea.

La concentración del polipéptido en la solución acuosa a la que se añade el agente reductor y el caotrópico debe ser tal que el polipéptido pueda recuperarse con un máximo rendimiento. La cantidad exacta que se debe emplear depende, por ejemplo, del tipo de polipéptido y de las concentraciones y tipos de los otros ingredientes de la solución acuosa, en particular, el agente reductor, el agente caotrópico, las especies formadoras de fases y el pH. Para polipéptidos en general, la concentración preferente de polipéptido es de aproximadamente 0,1 a 15 mg/ml. La concentración preferente de IGF-1 (que resulta de la máxima producción de IGF-1 de desnaturalizado o no nativo) está en el intervalo de 0,5-6 mg por ml, más preferentemente 1,5-5 mg/ml.

Los tipos de especies formadores de fases que se emplean en la presente memoria descriptiva dependen de muchos factores, incluyendo el tipo de polipéptido y los ingredientes del caldo de fermentación que están tratando. Las especies se deben seleccionar de modo que el polipéptido no precipite y que una fase sea más hidrófoba que la otra de modo que el polipéptido se localice en la fase más hidrófoba y la biomasa sólida y el ácido nucleico precipitarán en la fase más hidrófoba.

Las especies formadoras de fases pueden ser una combinación de agentes, incluyendo combinaciones de polímeros (polímero-polímero), combinaciones de sales de polímeros, sal-solvente y combinaciones de polímero-solvente. Los polímeros adecuados son tanto los polímeros altamente hidrófilos como los menos hidrófilos, es decir, cualquier polímero formador de fases conocido en la técnica. Los ejemplos incluyen el polietilenglicol o sus derivados, incluyendo varios pesos moleculares de PEG como PEG 4000, PEG 6000 y PEG 8000, derivados del PEG descritos, por ejemplo, en Grunfeld y col., Appl. Biochem. Biotechnol., 33: 117-138 (1992), polivinilpirrolidona (PVP), en un intervalo de peso molecular preferente de aproximadamente 36.000 a 360.000, almidones como el dextrano (por ejemplo, dextrano 70 y 500), dextrinas, y maltodextrinas (preferentemente de un peso molecular entre aproximadamente 600 y 5.000), sacarosa, y polímero de Ficoll-400™ (u copolímero de sacarosa y epiclorohidrina). El polímero preferido de la presente memoria descriptiva es el polietilenglicol, o un polisacárido como un dextrano. El polímero más preferido de la presente memoria descriptiva es PEG de diferentes pesos moleculares o una combinación de PEG-polipropilenglicol o un copolímero.

Los ejemplos de solventes orgánicos adecuados incluyen etilenglicol, glicerol, dimetil sulfóxido, alcohol polivínilico, dimetilformamida, dioxano y alcoholes como metanol, etanol y 2-propanol. Tales solventes son aquellos que, cuando se añaden a la solución acuosa, aumentan la hidrofobicidad de la solución.

Las sales pueden ser inorgánicas u orgánicas y preferentemente no deben producir la precipitación del polipéptido. Las sales que contienen elementos de transición no son preferentes y tienden a producir la precipitación del polipéptido. Los aniones se seleccionan porque tengan el potencial de formar sistemas de fases múltiples. Los ejemplos incluyen el sulfato de amonio, el fosfato dibásico de potasio, el sulfato de sodio, el fosfato de amonio, el citrato de potasio, el fosfato de magnesio, el fosfato de sodio, el sulfato de potasio, el sulfato de magnesio, el sulfato de calcio, el citrato de calcio, el sulfato de manganeso, el fosfato de manganeso, etc. Los tipos de sales que son útiles en los sistemas acuosos bifásicos se evalúan con más profundidad en Zaslavskii y col., J. Chrom., 439: 267-281 (1988). Las sales preferentes de la presente memoria descriptiva son los sulfatos, los fosfatos o los citratos y son metales alcalinos o alcalinotérreos. Más preferentes son los sulfatos y los citratos, y más preferentes son los sulfatos ya que tienen menos limitaciones de pH con los sulfatos. Las sales más preferidas en la presente memoria descriptiva son el sulfato de sodio y el citrato de sodio.

Las cantidades de especies formadoras de fases que se deben añadir al polipéptido de interés para obtener un sistema de fases múltiples satisfactorio, son aquellas que ya se conocen en la técnica. La cantidad de especies formadoras de fases y agregadas al polipéptido dependerán de factores como, por ejemplo, la cantidad de agente caotrópico y de agente reductor, si los hubiera, ya presentes en el caldo de fermentación, la naturaleza del medio de cultivo celular, del tipo de células usadas en la fermentación, el tipo de polipéptido que se esté tratando, si el polipéptido se va a recuperar a partir de de la fase inferior o la superior, y del tipo(s) de especies formadoras de fases que se estén añadiendo. La concentración general de polímero empleado es de aproximadamente un 5% (p/p) hasta el límite de solubilidad del polímero y la concentración de sal empleada es de aproximadamente un 3% (p/p) hasta el límite de solubilidad de la sal, dependiendo del tamaño de la relación fase-volumen que se necesite. La relación fase-volumen debe ser suficiente como para que quede espacio para la biomasa sólida. El tipo y la cantidad de especies formadoras de fases que sean eficaces se puedes determinar por diagramas de fase y evaluando el resultado final, es decir, el grao de pureza y la producción del polipéptido de interés. Si las especies formadoras de fases son una combinación de polímero-sal, preferentemente la concentración de sal añadida es de aproximadamente 4-15% (p/p) y la concentración de polímero es de aproximadamente 5-18% (p/p) de modo que el polipéptido deseado estará en una fase opuesta de la que contiene la biomasa sólida y el ácido nucleico.

Si el sistema deseado es uno en el que el polipéptido se distribuye en la fase superior y la biomasa sólida y el ácido nucleico en la fase inferior, entonces hay una ventana de concentraciones de especies formadoras de fases. Cuando se añaden cantidades superiores de agente caotrópico para mantener las solubilización, se necesitan cantidades mayores de especies formadoras de fases. Sin embargo, una alta concentración de estos reactivos aumentará la densidad de la solución. Una alta densidad hará que la biomasa sólida precipite menos rápido. Una densidad demasiado alta hará que la biomasa sólida flote en la superficie. Por lo tanto, las concentraciones de agente caotrópico y de especies formadoras de fases deben ser lo suficientemente altas para mantener un polipéptido completamente solubilizado, pero no tan bajas que permitan que la biomasa sólida precipite sobre la fase inferior.

Si se debe recuperar el polipéptido de la fase superior, típicamente, la concentración de sal será de aproximadamente 4-7% (p/p) y la concentración de polímero será de aproximadamente 12-18% (p/p), dependiendo de, por ejemplo, el tipo de sal, el polímero y el polipéptido. Si se añade cualquier solvente orgánico como especie formadora de fases, como etanol, se añade preferentemente en una concentración de aproximadamente 10 a 30% (volumen/volumen) de la solución, dependiendo de, por ejemplo, el tipo de polipéptido y de alcohol y si existen otras especies formadoras de fases, preferentemente a una concentración de aproximadamente 20% (v/v).

Las condiciones del extracto para poner en contacto el cultivo celular con los distintos reactivos dependerá de, por ejemplo, el pH del tampón, los tipos de reactivos formadores de fases y el tipo y concentración de agente caotrópico y reductor. La temperatura de reacción generalmente es aproximadamente de 20-40ºC, más preferentemente a temperatura ambiente. El paso de contacto se realizará generalmente durante al menos 30 minutos, preferentemente entre aproximadamente 30 minutos y 12 horas dependiendo de si se producen reacciones secundarias, más preferentemente entre aproximadamente 30 minutos y 8 horas, y más preferentemente entre aproximadamente 30 minutos y 1,5 horas.

El grado de desplegamiento del polipéptido heterólogo se determina idóneamente mediante cromatografía del polipéptido no nativo, incluyendo una cromatografía de interacción hidrófoba o una cromatografía de intercambio iónico. Un área máxima creciente para el material no nativo indica cuánto polipéptido no nativo hay presente.

Una vez se haya establecido el sistema de fases múltiples, una fase estará enriquecida en el polipéptido y con pocas partículas y células fragmentadas que comprenden la biomasa sólida y los ácidos nucleicos. En un sistema de dos fases, la fase superior está enriquecida preferentemente con el polipéptido mientras que la fase inferior está enriquecida con las partículas y células fragmentadas. El polipéptido se puede recuperar fácilmente por separación de fases. Este paso de recuperación puede realizarse decantando la fase superior, drenando la fase inferior o por centrifugación. El polipéptido después se puede aislar a partir de la fase en la que esté contenido cambiando el pH de la fase de modo que el polipéptido precipite o añadiendo un solvente adecuado, con lo cual el polipéptido precipitado se recupera adecuadamente por centrifugación o por filtración como una pasta semilíquida. Alternativamente, el polipéptido puede recuperarse a partir de la fase que contiene el polímero por reextracción mediante la adición de un polímero, una sal o un solvente adecuados. En el caso de IGF-I, el polipéptido se recupera a partir de la fase con polímero aislada bajando el pH de modo que el IGF-I precipita, resultando en una producción de IGF-I de más o menos aproximadamente un 97%. Las proteínas DsbA o DsbC se deben separar del polipéptido en esta etapa.

Una vez obtenido de la fase líquida del sistema de fases múltiples, o en una etapa posterior de purificación, el polipéptido se repliega correctamente hasta lograr una conformación activa. Un procedimiento de plegamiento adecuado que se puede utilizar es el siguiente.

Después de solubilizar el polipéptido y de extraerlo por el sistema de extracción de fases múltiples de la presente memoria descriptiva, se transfiere o diluye en un tampón que contiene el solvente, el agente caotrópico, la sal y una cantidad mínima de una sal de cobre o de manganeso. Este tampón aumenta inesperadamente el rendimiento del plegamiento del polipéptido procedente de cualquier tipo de célula hospedadora. Este tampón tiene un pH de aproximadamente 7 a 12, dependiendo principalmente del tipo de polipéptido y del agente reductor, preferentemente de aproximadamente 8 a 11, más preferentemente un pH de 8,5 a 11 y más preferentemente de 8,5 a 10,5.

Un ingrediente clave del tampón es un solvente alcohólico o aprótico polar a una concentración de aproximadamente 5-40% (v/v), preferentemente de 10 a 30% (volumen/volumen) de la solución, dependiendo, por ejemplo, del tipo de polipéptido y de solvente, y de la concentración de agente caotrópico. Es más preferente a una concentración de aproximadamente 20% (v/v).

Un segundo ingrediente clave en este tampón es un metal alcalinotérreo, alcalino o una sal de amonio, que está presente en una concentración de aproximadamente 0,2 a 3 M, preferentemente de 0,2 a 2 M, dependiendo principalmente de la concentración de agente caotrópico, de la concentración de solvente y del tipo de metal alcalinotérreo o alcalino, o de la sal de amonio y del polipéptido empleado. Por ejemplo, si el catión es el sodio, el potasio, o el amonio, la concentración es de aproximadamente 0,5 a 3 M, pero si el catión es magnesio, la concentración es de aproximadamente 0,2 a 1 M.

Un tercer ingrediente clave del tampón es una cantidad eficaz de agente caotrópico. La cantidad de dicho agente caotrópico dependerá principalmente de la concentración de metal alcalinotérreo o alcalino, de la sal de amonio o de la concentración de solvente, del tipo específico de metal alcalinotérreo o alcalino, o de sal de amonio empleados, del tipo específico de agente caotrópico empleado, y del tipo de polipéptido, así como del pH del tampón, pero en general oscilará desde aproximadamente 0,1 hasta 9 M, preferentemente entre aproximadamente 0,5 y 6 M, y más preferentemente entre aproximadamente 1,5 y 4 M. En lo que respecta a los agentes caotrópicos específicos, se utiliza urea, preferentemente entre específico aproximadamente 0,1 y 2 M de clorhidrato de guanidina, y preferentemente entre aproximadamente 1 y 3 M, más preferentemente entre aproximadamente 1-2,5 M, y más preferentemente aproximadamente 2 M.

Un cuarto ingrediente clave del tampón es una cantidad eficaz de sal de un metal de transición seleccionada entre sales de cobre y manganeso, de modo que se produzca una oxidación y un replegamiento. La cantidad de sal de cobre y manganeso depende principalmente del tipo de metal de transición y del polipéptido empleados y del nivel de oxígeno presente. A menos adición de flujo de oxígeno o a un menor nivel de oxígeno, se pueden emplear una cantidad mayor de sal de cobre o de manganeos. La concentración de sal de cobre o de manganeso es típicamente entre aproximadamente 0,01 y 15 pM, preferentemente entre aproximadamente 0,01 y 10 pM, más preferentemente entre aproximadamente 0,01 y 5 pM e incluso más preferentemente entre aproximadamente 0,01 y 0,05 pM. Los intervalos antes indicados como preferentes son particularmente preferidos para el IGF-I. Si la concentración aumenta por encima de 15 pM, inesperadamente la producción de polipéptido correctamente plegado disminuye drásticamente. Más preferentemente, al concentración de una sal de cobre o de manganeso es de aproximadamente 0,5 pM. La sal de metal de transición puede estar desde este momento presente en el tampón si la adición de una sal de metal de transición exógena, por ejemplo, si es un residuo de la fermentación, o se puede añadir al tampón, o ambas
posibilidades.

El tampón puede ser cualquiera de los enumerados anteriormente para la lista de soluciones amortiguadora, prefiriéndose CAPSO, glicina, y CAPS a pH 8,5-11, particularmente a una concentración de aproximadamente 20 mM, y más preferentemente CAPSO y glicina. El polipéptido se puede diluir con el tampón de replegamiento, preferentemente al menos cinco veces, más preferentemente al menos aproximadamente diez veces. Alternativamente, el polipéptido se puede dializar frente al tampón de replegamiento. El replegamiento se lleva a cabo típicamente a aproximadamente 0-45°C, preferentemente aproximadamente 20-40°C, más preferentemente aproximadamente 23-37°C, y más preferentemente aproximadamente 25ºC durante al menos aproximadamente una hora. La temperatura preferida aparentemente no se ve afectada por los niveles de sal, solvente y agente caotrópico, pero se pueden ver afectada por la presencia de sacarosa y glicerol, en cuyo caso se debe mantener por encima de los 20°C. La solución contiene además opcionalmente un agente reductor y un osmolito.

El agente reductor se selecciona idóneamente de los descritos anteriormente para el paso de solubilización en el intervalo de concentración dado. Su concentración dependerá esencialmente de las concentraciones de la sal de metal alcalinotérreo, metal alcalino o de amonio, del polipéptido y del solvente. Preferentemente, la concentración de agente reductor es de aproximadamente 0,5 a 8 mM, más preferentemente de aproximadamente 1-5 mM, aún más preferente de aproximadamente 0,5-2 mM. Los agentes reductores preferidos son el DTT y la cisteína.

El osmolito opcional es preferentemente sacarosa (en una concentración de aproximadamente 0,25-1 M) o glicerol (en una concentración de aproximadamente 1-4 M). Más preferentemente, la concentración de sacarosa es de aproximadamente 1 M y la concentración de glicerol es de aproximadamente 4 M.

La concentración inicial de polipéptido es el tampón de plegamiento es tal que la relación de conformación correctamente plegada frente a la incorrecta se maximizará, según se determina por HPLC, RIA u otro ensayo biológico. La concentración exacta dependerá de, por ejemplo, el tipo de polipéptido empleado. La concentración preferente de polipéptido (que resulta en la producción máxima de conformación correctamente plegada) está en el intervalo de aproximadamente 0,1 a 15 mg/ml, más preferentemente de aproximadamente 0,1 a 6 mg/ml y más preferentemente de aproximadamente 0,2 a 5 mg/ml.

Además, se incorpora una fuente de oxígeno como por ejemplo aire o gas de oxígeno o se introduce de otro modo en el tampón de modo que efectúe la oxidación junto con la sal de cobre o de manganeso. El oxígeno puede estar presente en el tampón en cualquier momento, incluyendo antes que

\hbox{añadir el
polipéptido o de cualquier otro reactivo al tampón.}

La cantidad de fuente de oxígeno introducida dependerá, por ejemplo, del tipo de matraz utilizado, del tipo y de la concentración de polipéptido, del tipo de fuente de oxígeno, del tipo y de la cantidad de sal de cobre o de manganeso, del tipo y de la cantidad de agente reductor presente, si lo hubiera y del tipo y cantidad de agente caotrópico presente así como del pH del tampón. Generalmente, la fuente de oxígeno se introducirá por medios pasivos (por ejemplo, como aire en el espacio superior en una relación de espacio de aire a volumen de fluido de 2:1), usando un agitador. Alternativamente, la fuente de oxígeno se puede introducir por burbujeo a través de un rociador. La tasa de introducción de oxígeno debe ser suficiente para permitir el plegamiento finalice preferentemente entre aproximadamente 1 a 12 horas, más preferentemente entre aproximadamente 1 a 6 horas y más preferentemente entre aproximadamente 1 a 3 horas. La adición de oxígeno molar es proporcional a la concentración de agente reductor y de polipéptido, pero inversamente proporcional a la concentración de la sal de cobre o de manganeso. La tasa de oxidación está limitada por el nivel de catalizador, no por la tasa de adición de oxígeno. Se necesita una tasa de rociado mayor para un mayor volumen de plegamiento.

El grado de replegamiento que se produce hasta esta segunda incubación se determina idóneamente por una valoración con RIA del polipéptido o por un análisis HPLC, usando, por ejemplo, una columna de C-18 Vydac o Baker, con una valoración con RIA creciente o un tamaño de pico de polipéptido correctamente plegado que se correlaciona directamente con cantidades crecientes de conformación polipeptídica biológicamente activa presente en el tampón. La incubación se realiza para maximizar la producción de conformación polipeptídica correctamente plegada y la relación de conformación polipeptídica correctamente plegada frente a la conformación polipeptídica incorrectamente plegada recuperada, según se determina en un RIA o por HPLC, y para minimizar la producción de polipéptidos asociados multiméricos, como se determina por balance de masas.

Los siguientes procedimientos son ejemplos de procedimientos de purificación adecuados: el fraccionamiento o la inmunoafinidad o las columnas de intercambio iónico; la precipitación con etanol; la HPLC de fase reversa; la cromatografía en sílice, o una resina de intercambio catiónico; electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS (SDS-PAGE), la precipitación con sulfato de amonio y la filtración en gel usando, por ejemplo, Sephadex G-75.

Los siguientes ejemplos se ofrecen a modo de ilustración y no a modo de limitación.

Ejemplo I

La secuencia nucleotídica dsbA se amplificó usando técnicas de PCR desde p16-1 (Bardwell y col., citado con anterioridad, 1991) y se añadió un sitio XbaI en el extremo 5' y un sitio ClaI en el extremo 3' de la secuencia que codifica DsbA. Este fragmento de ADN se digirió con los enzimas de restricción apropiados y se ligó con un fragmento de 1,0 Kb PstI-XbaI de pKMTacII (deBoer y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80: 21-25 [1983]) y un fragmento de 3,6-kb ClaI-PstI de pBKIGF-28 (Patente de EE.UU. N.º 5.342.763). El plásmido resultante, pJJ41 (véase la figura 1), contiene el gen dsbA bajo el control del promotor tacII y confiere resistencia frente a la ampicilina y la tetraciclina. Este plásmido se digirió con ClaI y los extremos se rellenaron con el fragmento Klenow y desoxinucleótidos.

Después de la inactivación del fragmento Klenow y de la extracción del ADN digerido, el ADN se digirió posteriormente con ScaI y el fragmento de 1,5 kb que contiene el extremo 5' del gen de la \beta-lactamasa y se purificó el elemento TacII-dsbA. Éste se ligo con un fragmento de 4,6 kb de un pBKIGF-2B digerido con EcoRI y rellenado, que había sido además digerido con ScaI. Este fragmento de pBKIGF-2B contenía el extremo 3' del gen de la \beta-lactamasa, permitiendo la detección por la resistencia frente a la ampicilina así como secuencias de ADN para la resistencia a la tetraciclina y la producción de IGF-I. Este plásmido se denominó pJJ42 (véase la figura 1).

Se transformó una cepa 33D3 de E. coli (con el genotipo W3110 tonA ptr3 lacI^{q} LacL8 ompT degP kan^{r}) con este plásmido. Esta cepa se construyó en varios pasos usando técnicas implicadas en la trasnducción con el fago Plkc, derivado del P1 (J. Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor, NY, Cold Spring Harbor Laboratory, 1972) y genética de transposones (Kleckner y col., J. Mol. Biol., 116: 125-159 [1977]). La célula hospedadora de partida era la E. coli K-12 W3110, que es una cepa K-12 que es F^{-} lambda^{-}(Bachmann, Bact. Rev., 36: 525-557 [1972]; Bachmann, "Derivations and Genotypes of Some Mutant Derivatives of Escherichia coli K-12," p. 1190-1219, in F. C. Neidhardt y col., ed., Escherichia coli and Salmonella typhimurium: Cellular and Molecular Biology, vol. 2, American Society for Microbiology, Washington, D.C., 1987).

La introducción de la mutación tonA (fhuA) y la putación ptr3 en el genoma se describe con detalle en la patente de EE.UU. N.º 5.304.472 concedida el 19 de abril de 1994. LA cepa resultante se denominó 9E4. Las mutaciones laclq (Muller-Hill y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 59: 1259 [1968]) y lacL8 (Scaife y Beckwith, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 31: 403 [1967]) fueron introducidas en la cepa 9E4 por cotransducción con proC. En primer lugar, se introdujo una inserción Tn5 enlazada en proC y una mutación phoADE15 (Sarthy, A. y col., J. Bacteriol., 145: 288-292 [1981]). La transducción con P1 a la prototrofía de prolina restauró el gen ProC y el gen phoA y además se introdujeron las mutaciones lacI^{q} lacL8. La mutación lacI^{q} produce una sobreproducción del represor lac en comparación con la cepa silvestre. La presencia de la mutación lacI^{q} puede observarse en placas LB con el sustrato cromogénico 5-bromo-4-cloro-3-indolil-\beta-D-galactósido (X-gal). En estas placas, una cepa lacI^{+} será de color azul claro, mientras que una cepa lacI^{q} será incolora. La mutación LacL8 es un mutación en un promotor que produce unos niveles más bajos de los enzimas del operón lac. La presencia de la mutación lacL8 se puede detectar en un medio MacConkey con un 1% de lactosa como colonias con un centro rojo oscuro y un color beige alrededor.

La introducción de la deleción ompT y de la mutación degP en la cepa se describe con detalle en la patente de EE.UU. N.º 5.304.472.

La cepa final 33D3 es resistente a los fagos T1 y \diameter80, carece de tres proteasas, sobreproduce el represor lac y produce niveles inferiores a los niveles de enzimas del operón lac cuando se induce.

Las células 33D3 que contienen el pJJ42 se cultivaron después en un fermentador de 10 litros bajo condiciones idénticas a la producción de IGF-I como se describe en la patente de EE.UU. N.º 5.304.472, Ejemplo II, I x condiciones nutritivas. Cuando la densidad óptica (A550) del cultivo alcanzó 60, se añadió el IPTG o la lactosa en las cantidades indicadas a continuación para inducir el promotor tacII, incrementándose así la expresión de dsbA. El medio de crecimiento se diseñó para eliminar el fosfato y para que la inducción del promotor phoA ocurriera a una densidad óptica (A550) de 80 a 100. La producción total de IGF-I se midió por una cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) como se describe en la patente de EE.UU. N.º 5.304.472.

Los resultados se muestran en la siguiente tabla I.

TABLA 1

Ciclo de fermentación	Condiciones	g/l de IGF-I
S1968	pBKIGF-2B, sin inductor	3,0
S1963	pJJ42, IPTG 0,05 mM	4,8
S1964	pJJ42, IPTG 1,0 mM	4.8
S1959	pJJ42, 1,0% de lactosa	4,0

Los resultados muestran que la sobreexpresión del gen dsbA en el periplasma de la bacteria mejora la producción de IGF-I en todos los ciclos que se indujeron con uno u otro inductor. El aumento en la acumulación de IGF-I fue de aproximadamente el 60%. El IGF-I correctamente plegado se puede recuperar con un alto rendimiento por extracción líquido-líquido seguida de un replegamiento aeróbico como se describe anteriormente o por los procedimientos descritos en la patente de EE.UU. N.º 5.288.931.

Ejemplo II

La secuencia nucleotídica dsbA se amplificó usando técnicas de PCR a partir del genoma de E. coli (Missiakas y col., citado con anterioridad, [1994]) y se añadió un sitio XbaI en el extremo 5' y un sitio ClaI en el extremo 3' de la secuencia que codifica DsbC. Este fragmento de ADN se digirió con los enzimas de restricción apropiados y se ligó con un fragmento de 1,0 Kb PstI-XbaI de pKMTacII (de Boer y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80: 21-25 [1983]) y un fragmento de 3,6-kb ClaI-PstI de pBKIGF-28 (Patente de EE.UU. N.º 5.342.763). El plásmido resultante, pJJ37 (véase la figura 2), contiene el gen dsbC bajo el control del promotor tacII y confiere resistencia frente a la ampicilina y la tetraciclina. Este plásmido se digirió con ClaI y los extremos se rellenaron con el fragmento Klenow y desoxinucleótidos.

Después de la inactivación del fragmento Klenow y de la extracción del ADN digerido, el ADN se digirió posteriormente con ScaI y el fragmento de 1,5 kb que contiene el extremo 5' del gen de la \beta-lactamasa y se purificó el elemento TacII-dsbC. Éste se ligo con un fragmento de 4,6 kb de un pBKIGF-2B digerido con EcoRI y rellenado, que había sido además digerido con ScaI. Este fragmento de pBKIGF-2B contenía el extremo 3' del gen de la \beta-lactamasa, permitiendo la detección por la resistencia frente a la ampicilina así como secuencias de ADN para la resistencia a la tetraciclina y la producción de IGF-1. Este plásmido se denominó pJJ40 (véase la figura 2).

Se transformó la cepa 33D3 de E. coli con este plásmido pJJ40, como se describe anteriormente. Las células 33D3 que contienen el pJJ40 se cultivaron después en un fermentador de 10 litros bajo condiciones idénticas a la producción de IGF-I como se describe en la patente de EE.UU. N.º 5.304.472, Ejemplo II, 1 x condiciones nutritivas. Cuando la densidad óptica (A550) del cultivo alcanzó 60, se añadió el IPTG o la lactosa en las cantidades indicadas a continuación para inducir el promotor tacII, incrementándose así la expresión de dsbA. El medio de crecimiento se diseñó para eliminar el fosfato y para que la inducción del promotor phoA ocurriera a una densidad óptica (A550) de 80 a 100. La producción total de IGF-I se midió por un análisis HPLC como se describe en la patente de EE.UU. N.º 5.304.472.

Los resultados son que el 1% de lactosa produjo 4 g/l de IGF-I frente al control, pBKIGF-2B, sin inductor, como se muestra en la anterior tabla 1. El IGF-I correctamente plegado se puede recuperar con un alto rendimiento a través de un extracción líquido-líquido seguida de un replegamiento aeróbico como se describe anteriormente.

Ejemplo III

Se clonó el gen dsbA en el vector pBAD18 (figura 3) que contiene un promotor del operón arabinosa inducible clonado (Guzman y col., citado con anterioridad) que sobreexpresa el gen en respuesta a la presencia de arabinosa en el medio. El gen dsbA se amplificó por PCR, con sitios de restricción en los extremos para facilitar su clonación. Se colocó un sitio EcoRI en el extremo 5' y un sitio KpnI en el extremo 3'. El vector en el que se clonó dsbA se digirió con los mismos enzimas y se ligó e producto de PCR dsbA con el vector digerido para originar el pBADJ2 (figura 3). El plásmido pBADJ2 se digirió con ClaI y HindIII y los extremos se hicieron romos con el uso del fragmento Klenow de la polimerasa I. Se purificó un fragmento de 1,9 kb que codifica el promotor del operón arabinosa y dsbA. Este promotor del operón arabinosa con el gen dsbA se clonaron después en el sitio EcoRV del plásmido de producción de IGF-I pBKIGF-2B como se describe anteriormente. La dirección de la transcripción de dsbA era la misma que para IGF-I. Este plásmido se denominó pBKIGF2B-A.

Después se transformó la cepa 36F8 de E. coli (con el genotipo W3110 tonA phoA D(argF^{-}lac) ptr3 degP kan^{R} ilvG^{+} con el plásmido pBKIGF2B-A, y siendo resistentes a la temperatura a 37°C. Esta cepa se construyó en varios pasos usando las mismas técnicas básicas descritas anteriormente. La célula hospedadora de partida para la construcción 27A7, se describe con detalle la patente de EE.UU. N.º 5.304.472.

Después, se introdujo la mutación degP41 kan^{r} 27A7. Esta mutación está descrita en la patente de EE.UU. N.º 5.304.472. La cepa resultante se denominó 27B4. La cepa 27B4 apenas crece en un medio LB a 37°C y 42°C. Se obtuvo un aislado resistente a la temperatura a 37°C seleccionando una colonia que crecía mejor. Esta cepa se denominó 35E7.

Después se introdujo la deleción de un gen implicado en el metabolismo de la ribosa en la cepa 35E7 por cotransducción con PI con una inserción enlazada usando Tn10 en el gen ilv. Se transdujo la auxotrofía isoleucina/valina a la prototrofía usando el fago PI crecido en una cepa con la mutación ilvG2096^{R} (Lawther y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78: 922-925 [1981]), que repara un cambio en la pauta de lectura que hace que la cepa silvestre de E. coli K-12 sea sensible a la valina. El locus ilvG2096^{R} se confirmó por la resistencia de la célula hospedadora 36F8 a 40 pg/ml de valina. La deleción rbs también se reparó durante este paso, produciendo una cepa capaz de usar la ribosa como fuente de carbono.

La cepa final 36F8 es resistente a los fagos T1 y \diameter80, carece de dos proteasas, no sobreproduce la fosfatasa alcalina tras la eliminación del fosfato del medio, crece bien a 37°C y no es susceptible a la toxicidad por valina.

Las células 36F8 que contienen el plásmido pBKIGF2B-A se cultivaron después en un fermentador de 10 litros bajo condiciones idénticas a la producción de IGF-I descritas en la patente de EE.UU. N.º 5.304.472, citada con anterioridad, 1 x condiciones nutritivas, Ejemplo III. Cuando el cultivo alcanzó una densidad óptica (A550) de 80, se añadió un 1% (p/v) de L-arabinosa. Esto indujo la expresión de dsbA y produjo la secreción de la proteína DsbA en el periplasma. El medio de crecimiento se diseñó para eliminar el fosfato y para que la inducción del promotor phoA ocurriera a una densidad óptica (A550) de 100. La producción

\hbox{total de IGF-I se midió por un
análisis HPLC como en el Ejemplo I.}

Los resultados se muestran en la siguiente tabla 2:

TABLA 2

Ciclo de fermentación	Condiciones	g/l de IGF-I
1	pBKIGF2B-A, 1,5% de arabinosa	6,1
2	pBKIGF2B-A, 1,0% de arabinosa	7,6
3	pBKIGF2B-A, 1,0% de arabinosa	7,2
4	pBKIGF2B-A, 0,5% de arabinosa	6,6
5	procesamiento de IGF-I periplásmico
	típico	3,7

Los resultados muestran que la sobreexpresión del gen dsbA en el periplasma de la bacteria mejora la producción total (soluble insoluble) de IGF-I en todos los ciclos que implicaban al promotor del operón arabinosa y DsbA. Este aumento en la acumulación de IGF-I fue aproximadamente el doble usando un 1% de L-arabinosa. El IGF-I correctamente plegado se puede recuperar por extracción líquido-líquido y por un replegamiento como se describe anteriormente o por los procedimientos descritos en la patente de EE.UU. N.º 5.288.931.

No se observó el aumento de producción para DsbB, ya que las células que sobreexpresaban dsbB con un plásmido muy similar no mostraron el incremento. Además, si el ADN de dsbA, y el ADN de IGF-I se coexpresaban usando el mismo promotor, la producción total de IGF-I descendía en comparación con un control sin el gen dsbA (pRKIGF-2B).

Claims (15)

1. Procedimiento para producir un polipéptido heterólogo en bacterias que comprende:

(a) el cultivo de células bacterianas en ausencia de glutatión, cuyas células comprenden un ácido nucleico que codifica una proteína DsbA o DsbC, un ácido nucleico que codifica el polipéptido heterólogo, una secuencia señal para la secreción de las DsbA y DsbC, y el polipéptido heterólogo, y promotores inducibles tanto para el ácido nucleico que codifica la proteína DsbA como la DsbC y el ácido nucleico que codifica el polipéptido heterólogo bajo condiciones a través de las cuales la expresión del ácido nucleico que codifica las proteínas DsbA o DsbC está inducido antes de la inducción de la expresión del ácido nucleico del polipéptido heterólogo, y bajo condiciones a través de las cuales tanto el polipéptido heterólogo como las proteínas DsbA o DsbC se secretan en el periplasma de la bacteria o del polipéptido heterólogo o el polipéptido heterólogo se secreta en el medio en el se cultivan las bacterias.

(b) la recuperación del polipéptido heterólogo a partir del periplasma o del medio de cultivo, y

(c) el replegamiento del polipéptido heterólogo en una conformación activa,

en el que el polipéptido heterólogo es un activador del plasminógeno tipo tisular, gp120 del VIH, ADNasa, factor de crecimiento insulinoide I, factor de crecimiento insulinoide II, factor de crecimiento insulinoide I cerebral, relaxina, insulina, proinsulina, uroquinasa, neurotrofina 3, neurotrofina 4, neurotrofina 5, neurotrofina 6 o factor de crecimiento nervioso.

2. Procedimiento según la reivindicación 1 en el que el polipéptido heterólogo es un polipéptido humano.

3. Procedimiento según la reivindicación 1 en el que las células bacterianas son células de eubacterias.

4. Procedimiento según la reivindicación 3 en el que las células eubacterias son células de enterobacteriáceas.

5. Procedimiento según la reivindicación 3 en el que las células eubacterias son células de E. coli.

6. Procedimiento según la reivindicación 1 en el que se expresa el ácido nucleico que codifica DsbA.

7. Procedimiento según la reivindicación 1 en el que el polipéptido se recupera a partir del periplasma de las células bacterianas.

8. Procedimiento según la reivindicación 1 en el que después de recuperar el polipéptido, se separa la proteína DsbA o DsbC del polipéptido.

9. Procedimiento según la reivindicación 1 en el que las células bacterianas se transforman con uno o dos vectores de expresión que contienen el ácido nucleico que codifica las proteínas DsbA o DsbC y el ácido nucleico que codifica el polipéptido heterólogo.

10. Procedimiento según la reivindicación 9 en el que las células bacterianas se transforman con dos vectores que contienen respectivamente el ácido nucleico que codifica las proteínas DsbA o DsbC y el ácido nucleico que codifica el polipéptido heterólogo.

11. Procedimiento según la reivindicación 9 en el que el ácido nucleico que codifica las proteínas DsbA o DsbC y el ácido nucleico que codifica el polipéptido heterólogo están contenidos en un vector con el que se transforman las células bacterianas.

12. Procedimiento según la reivindicación 1 en el que la inducción de la expresión del ácido nucleico que codifica DsbA o DsbC se lleva a cabo añadiendo un inductor al medio de cultivo.

13. Procedimiento según la reivindicación 12 en el que el inductor es IPTG, lactosa o L-arabinosa.

14. Procedimiento según la reivindicación 1 en el que la producción de polipéptido total aumenta como resultado del procedimiento, y la producción de polipéptido soluble no cambia o disminuye.

15. Procedimiento según la reivindicación 1 en el que el cultivo se lleva a cabo sin aumentar los niveles de expresión del ácido nucleico que codifica un factor de transcripción de choque térmico por encima de los niveles endógenos de expresión de dicho ácido nucleico.