ES2275335T3 - Expresion controlada altamente eficiente de genes exogenos en e.coli. - Google Patents

Abstract

Un sistema de represión de la traducción para usar en la clonación o expresión de un gen heterólogo específico, dicho sistema que comprende una proteína del represor de la traducción que codifica una región operativamente unida a un promotor constitutivo, y dicho gen heterólogo operativamente unido a un promotor inducible y un sitio de reconocimiento del represor, y donde el represor de la traducción controla la expresión de dicho gen heterólogo y donde el sitio de unión de la proteína represora incluye la secuencia de unión al ribosoma y el codón de iniciación, pero no cubre regiones codificadoras adicionales del gen heterólogo.

Description

Expresión controlada altamente eficiente de genes exógenos en E. coli.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un nuevo y mejorado sistema de vector de expresión de genes capaces de expresar genes exógenos, que incluyen genes tóxicos, en E. coli y otras células hospedantes. Más específicamente, la invención se refiere a sistemas de vectores de expresión de ajustada regulación altamente eficientes que usan la proteína de cubierta del bacteriófago MS2 (MS2CP) y el sitio de reconocimiento de MS2 para controlar la traducción del ARNm para cualquier gen clonado en una célula hospedante. Además, la invención se refiere a los sistemas de vectores de expresión que usan proteínas con control transcripcional, por ej. motA y asiA del bacteriófago T4, para regular la transcripción y proporcionar un sistema de promotor inducible por etapas que es mucho menos complicado y mucho más versátil que los sistemas no escalonados previamente descritos

Antecedentes de la invención

Las células procariotas se han convertido en el sistema de elección para la expresión de genes clonados que codifican polipéptidos eucarióticos y procarióticos, y existen numerosos sistemas de expresión para la expresión de productos génicos en la bacteria. La expresión de genes en E coli se ha establecido como la técnica clave para la comprensión de procesos moleculares y los sistemas de expresión de E. coli se han con vertido en un método estándar y popular para la producción y purificación a gran escala de proteínas exógenas. En gran medida, la tecnología ha proporcionado una fuente de proteínas en una cantidad y calidad que anteriormente fue difícil o imposible, de obtener mediante el aislamiento de fuentes naturales.

Se han descrito varios sistemas de expresión patentados para usar en huéspedes bacterianos. En algunos casos, los sistemas de expresión descritos se refieren a los sistemas de expresión generalizados, mientras que en otros casos, el sistema de expresión patentado se diseña para permitir una regulación relativamente ajustada, o se adapta individualmente para la expresión de una proteína particular. Ejemplos de tales patentes incluyen a la Patente Estadounidense No. 4.767.708 (construcción de un vector recombinante que contiene una ADN polimerasa I bacteriana clonada bajo el control de un promotor extraño regulado en forma positiva); Patente Estadounidense No. 4.503.142 (construcción de una clase de vectores de clonación y expresión basado en el uso del promotor/operador lac de E. coli); y la Patente Estadounidense No. 4.578.355 (uso del promotor P_{L} del bacteriófago lambda para construir vectores de alto nivel de expresión).

Otro sistema de expresión ampliamente usado referido al sistema de expresión del vector pET, emplea la poderosa ARN polimerasa T7 para transcribir genes de interés; Studier et al., J. Mol. Biol., 189:113-130 (1986). La ARN polimerasa T7 altamente selectiva para sus propios promotores y se desconoce si los promotores T7 están presentes en el ADN de E. coli. La T7 usa su polimerasa altamente selectiva para dirigir la transcripción a su propio ADN más que al del ADN huésped durante la infección y una relativamente pequeña cantidad de ARN polimerasa T7 proveniente de una copia clonada del gen1 de T7 es suficiente para dirigir la transcripción de alto nivel de un promotor T7 en un plásmido multicopia. Además, la ARN polimerasa T7 es por lo menos 5 veces más activo que la polimerasa de E. coli; Id. Muchos proteínas heterólogas se han expresado con éxito con altos rendimientos mediante el sistema pET; ver, por ej., Dietrich et al, Eur. J. Biochem, 201:399-407 (1991); Lathrop et al., Protein Expr. Purif., 3:512-517(1992); Aukhil et al., J. Biol. Chem., 268:2542-2553 (1993).

Desafortunadamente, estos y otros sistemas de expresión informados todavía sufren, en mayor o menor grado, de cosas tales como : 1) expresión no inducida que resulta de la pérdida de promotor; 2) incapacidad para controlar la expresión en el grado necesario, cuando el producto génico destruirá o bien dañará seriamente la célula hospedante si se expresa (más típicamente asociado con la expresión de genes eucarióticos en las bacterias); 3) la necesidad de depender para inducción de la expresión de las respuestas bioquímicas o mecanismos de inducción costosos o bien inadecuados; 4) incapacidad de expresar el gen de interés en un nivel suficiente y 5) inestabilidad del plásmido. Hasta que tales problemas se resuelvan adecuadamente y se superen con éxito, no se podrá apreciar o utilizar el pleno potencial de tales sistemas de expresión.

Todos los sistemas de promotores inducibles tienen un nivel residual de actividad o "pérdida de actividad" que conduce a una transcripción y expresión inadecuada de los genes que se clonan bajo el control del promotor. En la mayoría de los casos, esto no constituye un problema porque el producto génico producido es bien tolerado por la célula, i.e., el producto génico no es tóxico. Sien embargo, en los casos en el producto génico producid es tóxico o incluso letal para la célula, aun pequeñas proporciones de expresión puede ser perjudiciales. En efecto, existen ciertos genes tóxicos que han sido caracterizados como "inclonable" porque ellos son inestables en cualquier vector de clonación.

Studier, F.W., J. Mol. Biol., 219:37-44(1991) resolvieron el problema de la expresión defectuosa en los vectores pET por el desarrollo de la serie de vectores Lys. estos vectores albergan los genes para la lisozima T7, que se une a la ARN polimerasa T7 presente en la célula no inducida e impide que esta se transcriba a los genes blanco. Dubendorff y Studier, J. Mol Biol, 219;45-59(1991), resolvieron el problema mediante la provisión de copias adicionales de los elementos de control del operón lac de los plásmidos pET. Brown et al., Gene, 127;99-103 (1993) emplearon la inducción mediante la infección con un fago T7 mutante para clonar con éxito el gen POL3 tóxico. Desafortunadamente, estos y otros sistemas informados no consiguieron aliviar completamente el problema de la fuga o evitar los problemas de la inestabilidad del plásmido y la lisis celular asociada con altos niveles de lisozima y/o la infección con el fago. Peabody DS, J Biol, Chemistry, v265,10,1990, páginas 5686-9 describe células bacterianas CSH1 transformadas con dos promotores constitutivos.

La presente invención tal como se reivindica, trata y supera el problema de la pérdida de actividad del promotor utilizando las capacidades de represión de la traducción de la proteína de cubierta del bacteriófago M52. El bacteriófago M52 es un fago que contiene ARN con un ciclo de vida relativamente simple; Van Duin, J., Single-Stranded RNA Bacteriophages in the Bacteriophage Capítulo 4, págs. 117-167, Plenum Press, New York (1988). El ARN codifica cuatro genes, uno de los cuales es un gen de replicase que copia el genoma, otro de los cuales es un gen de la proteína cubierta multifuncional. A media que la concentración de la proteína aumenta en la célula, esta un dímero y se une a una estructura de horquilla que consiste en el sitio de unión del ribosoma y ATG del gen de replicasa. Esta unión luego inhibe también la traducción del gen de replicasa y cambia efectivamente el ciclo de vida para el empaquetamiento del genoma.

La secuencia de la proteína de cubierta MS2 ha sido publicada; Fiers et al., Nature, 260:500-507 (1976), se han aislado y caracterizado las mutantes de la proteína de cubierta, Peabody & Ely, Nucleic Acids Research, 20(7):1649-1655 (1992),y la construcción de un sistema de dos plásmidos para el análisis genético de la actividad de represión de la traducción de la proteína de cubierta ha sido descrita; Peabody, D., Journ. of Biol. Chem., 20(10)':5684-5689 (1990).

El bacteriófago MS2 no es el único fago conocido que tiene proteínas que se unen al ARN mensajero para inhibir la traducción. Por ejemplo, la proteína RegA del bacteriófago T4 y la proteína del gen V de M13 son dos de tales proteínas diferentes. Sin embargo, la diferencia clave, entre la proteína RegA, la proteína del gen V y la proteína de cubierta MS2 se relaciona con el lugar de los sitios de reconocimiento con respecto al sitio de iniciación de los genes. Por ejemplo, el sitio de reconocimiento de la proteína RegA comprende secuencias de la región codificadora del gen, de este modo se limita los genes que se pueden controlar con esta. La proteína del gen V reconoce una secuencia corriente arriba de la secuencia de unión al ribosoma y de este modo aún puede permitir un bajo nivel de iniciación de traducción. Para MS2, el sitio de unión no cubre las regiones codificadoras del gen pero incluye la secuencia de unión al ribosomas y el codón de iniciación. El sistema de MS2 de esta manera permite la represión más ajustada posible mientras que todavía permite que el sitio sea usado en forma universal.

El uso específico del sitio de reconocimiento de MS2CP y MS2 se describirá con más detalle en los ejemplos proporcionados en la presente memoria. tal como se demuestra en los ejemplos, el uso único del sistema MS2 permite a un experto en el arte resolver efectivamente el problema de la pérdida de productor asociada con la expresión de los genes heterólogos en la bacteria. Desde el punto de vista de la producción comercial, es particularmente útil porque generalmente no es favorable la pérdida de producto antes del punto de inducción. Y, como se relaciona con la capacidad de expresar en forma efectivamente los genes tóxicos, puede ser muy útil para los que trabajan en el campo, como algunos de estos genes, expresado en cantidades limitadas, pueden tener efectos benéficos.

Otro aspecto importante del diseño del sistema de expresión bacteriano es la regulación de la transcripción. Se sabe que en muchos organismos el tempo de la expresión génica se regula por la producción de proteínas específicas de control de la transcripción. Esto es particularmente cierto para varios bacteriófagos diferentes, ya que la evolución de sus ciclos de vida está regulada por la aparición de diferentes proteínas de transcripción que conducen a la expresión de todas las clases de genes correspondientes a este estadio de desarrollo. Por ejemplo, se ha sabido durante mucho tiempo que el bacteriófago T4 atraviesa su ciclo vital de esta manera, y recientemente se han dilucidado los mecanismos reales; Brody et al., FEMS Micro. Letters, 128:1-8 (1995). Este fago lítico tiene tres clases de genes: temprano, medio y tardío. Los promotores de genes tempranos son muy similares a los promotores potentes de E. coli y son reconocidos inmediatamente después de la infección por la ARN polimerasa. La acumulación de dos productos génicos tempranos, motA y asiA, cambia la transcripción al modo medio.

La proteína motA es una proteína de 23,5 kDa que guía a la ARN polimerasa a los promotores del medio de T4 al reconocer la secuencia de la región -30 de los promotores. La proteína asiA es una proteína de 10,5 kDa que originalmente se la consideraba una proteína del factor anti-sigma, es decir, que se unía al sigma 70 de E. coli y la hacía no funcional. Ahora se sabe, sin embargo, que la unión de asiA asigma 70 en realidad causa un cambio conformacional que anula el reconocimiento de la región -35 de los promotores de E. coli, y la proteína asiA puede actuar como un puente entre la proteína motA y la subunidad sigma 70. Además, la proteína asiA también inhibe el reconocimiento de los promotores tempranos de T4. Las motA y asiA son necesarias y suficientes para especificar la transcripción de los promotores medios de T4. Estos detalles se han determinado en ensayos de transcripción in vitro que emplean motA y asiA purificadas y ARN polimerasa de E coli no modificada; Ouhammouch et al., Proc. Natl. Acad. 92:1451-1455 (1995).

La presente invención proporciona un nuevo uso de los promotores medios T4 para regular la transcripción de cualquier gen clonado en una célula hospedante procariota. Las principales ventajas de este sistema promotor es que dirige la transcripción de los promotores específicos mientras que inhibe la transcripción de los promotores de E. coli, y de este modo minimiza la competición por el aparato de traducción e inhibe a la célula que responde a la producción de proteína blanco por la inducción de la transcripción de los genes de las proteasas. Mediante el sistema del promotor medio de T4 descrito en la presente memoria, también es posible expresar ciertas proteínas accesorias antes de la inducción de la proteína blanco en un ciclo de expresión "escalonado" que se puede inducir por una señal única, de este modo se reduce la complicada naturaleza de los protocolos de expresión actuales que generalmente requieren múltiples eventos de inducción para obtener tal expresión. Los sistemas específicos del promotor medio de T4 se describen en los ejemplos proporcionados en la presente memoria.

La presente invención, mediante la utilización del sistema MS2 para regular ajustadamente la traducción, y la utilización del promotor medio T4 para regular la transcripción, proporciona sistemas de vectores de expresión, regulados ajustadamente altamente eficientes capaces de expresar genes exógenos, que incluyen a los genes tóxicos, en E. coli y otras células hospedantes. Los sistemas descritos en la presente memoria, además de resolver los problemas asociados con otros sistemas conocidos proporciona, por primera vez, sistemas de promotores escalonados que son mucho más versátiles que los sistemas previamente descritos. Estos sistemas serán de gran valor para los que trabajan en el área del diseño de sistemas de expresión en bacterias.

Breve descripción de la invención

La presente invención, tal como se reivindica, proporciona un sistema de represión de la traducción para uso en la clonación o expresión de un gen heterólogo en células hospedantes, dicho sistema comprende un represor de la traducción operativamente unido a un promotor constitutivo. En una realización preferida, el represor de traducción es una proteína de cubierta de MS2.

La invención además proporciona, tal como se reivindica un proceso mejorado para la clonación o expresión de un gen heterólogo, dicho proceso comprende el cultivo; en condiciones adecuadas, de células hospedantes transformadas con un vector plásmido, dicho vector comprende una secuencia de ADN que codifica un promotor inducible, una secuencia de ADN que codifica un gen heterólogo unido a un sitio de reconocimiento de represión de la traducción, y una secuencia de ADN que codifica un represor de la traducción operativamente unido a un promotor constitutivo; donde dicho represor de la traducción controla la expresión de dicho gen heterólogo. En una realización preferida, el represor de la traducción es una proteína de cubierta MS2. En una realización, el vector también comprende una secuencia de ADN que codifica a genes tempranos 0.3 y 0.7 del bacteriófago T7 (SEC ID NO:2).

La invención además proporciona, tal como se reivindica, un proceso mejorado para la clonación o expresión de un gen heterólogo, dicho proceso comprende el cultivo; en condiciones adecuadas, de células hospedantes que han sido co-transformados con un primer vector plásmido que comprende una secuencia de ADN que codifica un promotor y dicho gen heterólogo unido a un sitio de reconocimiento de represión de traducción y un segundo vector plásmido que comprende una secuencia de ADN que codifica un represor de la traducción operativamente unido a un promotor constitutivo; donde dicho represor de la traducción controla la expresión de dicho gen heterólogo. En una realización preferida, el represor de la traducción es una proteína de cubierta de MS2.

La invención además proporciona, tal como se reivindica, un proceso mejorado para la clonación o expresión de un gen heterólogo, dicho proceso comprende el cultivo; en condiciones adecuadas, de células hospedantes que albergan una secuencia de ADN que codifica un represor de la traducción operativamente unido a un promotor constitutivo, transformado con un vector plásmido, dicho vector comprende una secuencia de ADN que codifica un promotor inducible y una secuencia de ADN que codifica dicho gen heterólogo unido a un sitio de reconocimiento de represión de traducción, donde dicho represor de la traducción controla la expresión de dicho gen heterólogo. En una realización preferida, el represor de la traducción es una proteína de cubierta de MS2.

La invención además proporciona, tal como se reivindica, un proceso mejorado para la clonación o expresión de un gen heterólogo, dicho proceso comprende el cultivo; en condiciones adecuadas, de células hospedantes que albergan una secuencia de ADN que codifica un promotor inducible que codifica dicho gen heterólogo unido a un sitio de reconocimiento de represión de traducción y una secuencia de ADN que codifica un represor de la traducción operativamente unido a un promotor constitutivo; donde dicho represor de la traducción controla la expresión de dicho gen heterólogo. En una realización preferida, el represor de la traducción es una proteína de cubierta de MS2.

La invención además proporciona tal como se reivindica, un "casete del gen 1 de T7 controlado por MS2", dicho casete que comprende una secuencia de ADN que codifica un promotor inducible, el sitio de reconocimiento de MS2 unido al gen 1 de T7 y el gen de la proteína de cubierta de MS2 bajo el control de un promotor constitutivo débil.

La invención además proporciona células hospedantes capaces expresar un gen heterólogo y que alberga un "casete del gen 1 de T7 controlado por MS2".

La invención además proporciona, tal como se reivindica, un proceso mejorado para la expresión de un gen heterólogo, dicho proceso comprende el cultivo en condiciones adecuadas, células hospedantes que albergan un "casete del gen 1 de T7 controlada por MS2" y transformada con un vector de expresión que contiene una secuencia de ADN que codifica dicho gen heterólogo bajo el control de un promotor T7.

La invención además proporciona una serie de células hospedantes capaces de clonar o expresar un gen heterólogo, dichas células hospedantes manipuladas genéticamente para producir concentraciones diferentes de MSC2CP.

La invención además proporciona un sistema de promotor inducible escalonado para la clonación o expresión de un gen heterólogo, dicho sistema comprende proteínas de control de transcripción regulada que dirige la transcripción de promotores específicos, mientras se inhibe la transcripción general de los promotores huésped bacterianos. En una realización preferida, las proteínas de control de transcripción son motA y asiA, y dichas proteínas está reguladas por MSC2CP.

La invención además proporciona, tal como se reivindica, un proceso mejorado para la clonación o expresión de un gen heterólogo, dicho proceso que comprende el cultivo; en condiciones adecuadas, de células hospedantes que han sido co-transformados con un primer vector plásmido que comprende una secuencia de ADN que codifica dicho gen heterólogo bajo el control unido de un promotor medio T4 y un segundo vector plásmido que comprende una secuencia de ADN que codifica un promotor inducible, secuencias de motA y asiA unidas a un sitio de reconocimiento de represor de la traducción, y un represor de la traducción operativamente unido a un promotor constitutivo; donde dicho represor de la de la traducción control la expresión de dichos genes de motA y asiA y donde dichos genes de motA y asiA dirigen la transcripción del promotor medio T4 mientras se inhibe la transcripción de dicho promotor inducible. En una realización preferida, el represor de la traducción es una proteína de cubierta MS2. En una realización, el segundo vector del plásmido también comprende una secuencia de ADN que codifica una proteína accesoria.

La invención además proporciona, tal como se reivindica, un proceso mejorado para la clonación o expresión de un gen heterólogo, dicho proceso que comprende el cultivo; en condiciones adecuadas, de células hospedantes que albergan una secuencia de ADN que codifica un promotor inducible, secuencias de motA y asiA unidas a un sitio de reconocimiento de represor de la traducción, y un represor de la traducción operativamente unido a un promotor constitutivo, transformado con un vector del plásmido que comprende una secuencia de ADN que codifica un gen heterólogo unido bajo el control T4 del promotor medio; donde dichos represores de la traducción controlan la expresión de dichos genes de motA y asiA; y donde dichos genes de motA y asiA dirigen la transcripción del promotor medio de T4 mientras se inhibe la transcripción de dicho promotor inducible. En una realización preferida, el represor de traducción es una proteína de cubierta de MS2.

La invención además proporciona un "casete de T4 basado en MS2", dicho casete que comprende una secuencia de ADN que codifica un promotor inducible, secuencias de motA y asiA unidas a un sitio de reconocimiento de MS2 y el gen de la proteína de cubierta MS2 bajo el control de un promotor constitutivo.

La invención además proporciona una célula hospedante procariota capaz de expresar un gen heterólogo y albergar un "casete de T4 basado en MS2".

La invención además proporciona, tal como se reivindica, un proceso mejorado para la clonación o expresión de un gen heterólogo, dicho proceso que, comprende el cultivo; en condiciones adecuadas, de células hospedantes que albergan un "casete de T4 basado en MS2" y transformadas con un vector de expresión que contiene una secuencia de ADN que codifica dicho gen heterólogo bajo el control de un promotor T4.

La revelación además proporciona la secuencia de ADN de la SEC ID NO:1 y la secuencia de ADN de la SEC ID NO:2.

Breve descripción de las ilustraciones

La Figura 1 es la secuencia génica completa (SEC ID NO:1) de la proteína de cubierta de tipo salvaje MS2 en los sistemas de la presente invención. El gen tiene un sitio NdeI en el extremo 5' y un sitio BamHI en el extremo 3'.

La Figura 2 es una fotografía de un gel de SDS que muestra los resultados de los experimentos de expresión wtMS2CP. La calle 1 es un clon positivo putativo no inducido de las células hospedantes BL21(DE3) (que contienen el gen wtMS2CP0 en pT7-7) cultivadas a O.D. de 0,6; las calles 2-14 son diferentes clones positivos putativos de las células hospedantes BL21(DE3) (que contienen el gen wtMS2CP0 en pT7-7) después de 4 horas de inducción a 37ºC. La calle 15 es de los marcadores arcoiris Amersham de bajo rango.

La Figura 3 es un diagrama esquemático de los vectores plásmidos pRIN desarrollados en la presente invención.

La Figura 4 es una fotografía de una transferencia western que muestra los resultados de un experimento de expresión y pérdida realizado con diferentes vectores de plásmidos pRIN en el cual se clonó el gen 1 de T7. Esta transferencia particular es un cultivo estacionario durante toda la noche y cada juego de calles es el gen 1 de gen 1 de T7, más o menos (m)una caja secuencia arriba del mismo vector. Los primeros tres conjuntos de calles usan pRIN11 (promotor PS4) con diferentes MS2CP. Los últimos tres conjuntos de calles usan el promotor pRIN20 (promotor lac UV5) con diferentes MS2CP. La calle 4 es el marcador de peso molecular Biorad de bajo rango.

La Figura 5 es una fotografía de una transferencia western que muestra los resultados de un experimento de expresión y pérdida realizado con diferentes vectores de plásmidos pRIN en el cual se clonó el gen el gen 1 de T7. Esta transferencia particular es un cultivo de pre-inducción de crecimiento exponencial (preI), y cada juego de calles es el gen 1 de T7, más o menos (m) una caja secuencia abajo, del mismo vector. Los primeros tres conjuntos de calles usan pRINII (promotor PS4) con diferentes MS2CP. Los últimos tres conjuntos de calles usan el promotor RIN20 (promotor lac UV5) con diferentes MS2CP. La calle 1 es el marcador de peso molecular Biorad de bajo rango.

La Figura 6 es una fotografía de una transferencia western que muestra los resultados de un experimento de expresión y pérdida realizado con varios vectores de plásmidos pRIN en el cual se clonó el gen 1 de T7. Esta transferencia particular es un cultivo inducido de IPTG cultivado a 25ºC, y cada conjunto de calles es una caja secuencia abajo o menos (m) del gen 1 en el mismo vector. Los primeros tres conjuntos de calles usan el pRIN11 (promotor de PS4) con diferentes MS2CPs. Los últimos tres conjuntos de calles usan pRIN20. (promotor UV5 lac) con diferentes MS2CP. La calle 2 es el marcador de peso molecular Biorad de bajo rango.

La Figura 7 es un diagrama esquemático de un " casete de T7 basado en MS2".

La Figura 8 es una foto de un gel de SDS que compara las características de la pérdida y expresión de la cepa que se comercializa como BL21(DE3) (calles 3-5), la cepa BL21(DE3) que contiene pLysS como vector secundario (calles 1-2), la cepa EE11-20 (calles 6-8) y la cepa E11-20 que contiene pLysS como vector secundario (calles 9-10). Las comparaciones se basaron en la expresión de NT-3 como producto génico blanco. Las calles 1, 5, 6 y 10 representan cultivos durante toda la noche (ON), las calles 4 y 7 representan cultivos de preinducción (preI) y las calles 2, 3, 8 y 9 representan cultivos de inducción (mediante IPTG a 28ºC) (I-28).

La Figura 9 es una foto de un gel de SDS que compara las características de pérdida y expresión de la cepa disponible en el comercio BL21(DE3) (calles 3-5), la cepa BL21(DE3) que contiene pLysS como vector secundario (calles 1-2), la cepa EE11-20 (calles 6-8), y la cepa EE11-20 que contiene pLysS como vector secundario (calles 9-10). Las comparaciones se basaron en la expresión de BDNF NT-3 como producto génico blanco. Las calles 1, 5, 6 y 10 representan cultivos durante toda la noche(ON), las calles 4 y 7 representan cultivos de preinducción (preI) y las calles 2, 3, 8 y 9 representan cultivos de inducción (mediante IPTG a 28ºC) (I-28).

La Figura 10 es una foto de un gel de SDS que compara las características de pérdida y expresión de la cepa disponible en el comercio BL21(DE3) (calles 3-5), la cepa BL21(DE3) que contiene pLysS como vector secundario (calles 1-2), la cepa EE11-20 (calles 6-8), y la cepa EE11-20 que contiene pLysS como vector secundario (calles 9-10). Las comparaciones se basaron en la expresión de BDNF 3 como producto génico blanco. Las calles 1, 5, 6 y 10 representan cultivos durante toda la noche(ON), las calles 4 y 7 representan cultivos de preinducción (preI) y las calles 2, 3, 8 y 9 representan cultivos de inducción (mediante IPTG a 28ºC) (I-28).

La Figura 11 es una foto de un gel de SDS que compara las características de pérdida y expresión de la cepa disponible en el comercio BL21(DE3) (calles 5-7); y la cepa EE11-11M (calles 2.-4). Las comparaciones se basaron en la expresión de BDNF como producto génico blanco. Las calles 4 y 5 representan cultivos durante toda la noche (ON), las calles 3 y 7 representan cultivos de preinducción (preI) y las calles 2 y 6 representan cultivos de inducción (mediante IPTG a 28ºC) (I-28). La calle 1 es el es el marcador de peso molecular Biorad de bajo rango.

La Figura 12 es una foto de un gel de SDS que compara las características de pérdida y expresión de la cepa disponible en el comercio EE11-11M que usa la expresión de NT-3 como producto génico blanco. La calle 5 representa el cultivo durante toda la noche (ON), la calle 4 representa los cultivos de preinducción (preI) y las calles 2 y 3 representan los cultivos de inducción mediante IPTG a 28ºC (I-28) o IPTG a 37ºC (1-37). La calle 1 es el es el marcador de peso molecular Biorad de bajo rango.

La Figura 13 es una foto de un gel de SDS que muestra un tiempo de inducción de fermentación de 16 litros de GCSF en pAMG25 en la cepa EE11-11M. La calle 1 es el cultivo en el tiempo de inducción. La calle 2 es el cultivo en el tiempo de inducción. Las calles 3-9 son los cultivos después de horas adicionales de crecimiento en presencia del inductor (IPTG), por ej., la calle 3 es después de 1 hora, la calle 4 es después de 2 horas, etc. La calle 10 es la de los marcadores arcoiris de peso molecular bajo de Amersham. La última calle es un marcador GCS.

La Figura 14 es una foto de un gel de SDS que muestra un tiempo de inducción de fermentación de 10 litros de leptina en pAMG25 en una cepa EE11-11M. La calle 1 es la de los marcadores arcoiris de peso molecular bajo de Amersham. La calle 2 es el cultivo en el tiempo de inducción. Las calles 3-8 son los cultivos después de horas adicionales de crecimiento en presencia del inductor (IPTG), por ej., la calle 3 es después de 1 hora, la calle 4 es después de 2 horas, etc. La calle 9 es un marcador de leptina.

La Figura 15 es una fotografía de una transferencia western que muestra los resultados de un experimento de expresión realizado mediante un sistema basado en MS2 en el cual se ha clonado el gen temprano 0.4 de T7. Las calles 2, 4, 6 y 8 representan cuatro cultivos diferentes de 0.4 que contienen los cultivos después de 4 horas de inducción a 42ºC. Las calles 3, 5, 7 y 9 son las muestras no inducidas de los mismos cultivos. La calle 1 es el marcador de peso molecular Biorad de bajo rango

La Figura 16 es una fotografía de un gel de SDS que muestra los resultados de un experimento de expresión realizado mediante un sistema basado en MS2 en el cual se ha clonado el gen temprano 0.6 de T7. Las calles 2 y 4 representan dos 0.6 diferentes que contienen cultivos no inducidos. Las calles 3 y 5 son las mismas muestras después de 4 horas de inducción a 42ºC. La calle 1 es el marcador de peso molecular Biorad de bajo rango.

La Figura 17 es la secuencia génica completa (SEC 30 ID NO2) del operón 3-7t construido para contener los genes tempranos (0.3-0.7) de T7.

La Figura 18 es una foto de un gel de SDS que compara la expresión de NDF alfa/beta en ausencia o presencia de las proteínas tempranas de T7. El operón 7-t estaba en pRIN 10 y fue inducido por un cambio de temperatura de 28ºC a 37ºC. NDF alfa/beta estaba en el plásmido pAMG33 y se induce por la adición de IPTG cuando la temperatura se cambia de vuelta a 28ºC. La mitad izquierda del gel es un tiempo de NDF alfa/beta en ausencia de los genes tempranos T7. La calle 1 es después de la inducción de las proteínas tempranas pero antes de la inducción de NDF alfa/beta. Las calles 2-4 son los cultivos después de horas adicionales de crecimiento en presencia de un inductor (IPTG), por ej, calle 2 es después de 1, calles 3 es después de 2 horas, etc. La calle 5 es la de los marcadores arcoiris de peso molecular bajo de Amersham. La mitad derecha del gel es un tiempo de expresión NDF alfa/beta en presencia de los genes tempranos T7. La calle 6 es después de la inducción de las proteínas tempranas antes de la inducción de NDF alfa/beta. Las calles 7-9 son los cultivos después de horas adicionales de crecimiento en presencia de un inductor (IPTG).

La Figura 19 es una foto de una transferencia western de un gel que compara la expresión de una versión truncada de la subunidad de telomerasa humana TP2 (301-941 TP2) en presencia o ausencia de las proteínas tempranas T7. El operón 3-7t estaba en pRIN10 y fue inducido por un cambio de temperatura de 28ºC a 37ºC. La 301-941 TP2 estaba en un plásmido pAMG22 y se induce por la adición de IPTG cuando la temperatura cambia de nuevo a 28ºC. La calle 1 es una muestra de preinducción de 301-941 TP2 en presencia de las proteínas tempranas de T7. La calle 2 es la expresión de 301-941 TP2 después de 2 horas de inducción en presencia de las proteínas tempranas de T7 a 28ºC. La calle 3 es la expresión de 301-941 TP2 después de 2 horas de inducción en presencia de las proteínas tempranas de T7 a 37ºC. La calle 4 es una muestra de preinducción de 301-941 TP2 en ausencia de las proteínas tempranas de T7. La calle 5 es la expresión de 301-941 TP2 después de 2 horas de inducción en ausencia de las proteínas tempranas de T7 a 37ºC.

La Figura 20 es una foto de una transferencia western de un gel que muestra la producción pasiva de variados niveles de la proteína de cubierta de MS2 por las cepas GM315, GM320, GM340 y GM350. las cepas se comparan contra la cepa progenitora de la cual se construyeron. La calle 1 representa un cultivo en fase log de GM315. Las calles 2, 4, 6, 8 y 10 son cepas progenitoras 393. Las calles 3 y 5 son GM320, la calle 7 es GM340, y la calle 9 es GM350.

La Figura 21 es una foto de un gel que muestra la expresión de la Hepatitis C polimerasa (HepCpol) en cepas que tienen variados niveles de la proteína de cubierta de MS2 (también comparan las fracciones solubles e insolubles de cada experimento de expresión). La calle 1 es la de los marcadores de peso molecular. La calle 2 es un extracto de célula total de un cultivo inducido de HepCpol en pAMG21 expresado en una cepa GM221 que contiene la proteína de cubierta de MS2. La calle 3 es la fracción insoluble de este experimento y la calle 4 es la fracción soluble. La calle 5 es un extracto celular total de un cultivo inducido de HepCpol en pAMG21 expresado en la cepa GM315 que contiene la proteína de cubierta de MS2. La calle 6 es la fracción insoluble de este experimento y la calle 7 es la fracción soluble. La calle 8 es un extracto celular total de un cultivo inducido de HepCpol en pAMG21 expresado en la cepa GM320 que contiene más proteína de cubierta de MS2 que en GM315. La calle 9 es la fracción insoluble de este experimento y la calle 10 es la fracción soluble.

La Figura 22 es la secuencia de ADN completa (SEC ID NO:3) del promotor medio de T4 PuvsX usado en los sistemas de la presente invención. El gen tiene un sitio AatII en el extremo 5' y un sitio ClaI en el extremo 3'.

La Figura 23 es la secuencia de ADN completa (SEC ID NO:4) del promotor medio de T4 PX usado en los sistemas de la presente invención. El gen tiene un sitio AatII en el extremo 5' y un sitio ClaI en el extremo 3'.

La Figura 24 es una foto de un gel de SDS que muestra las características de pérdida y expresión de pAMG13 mediante la expresión del gen 1 de T7 (bajo el control de un promotor lambda) como producto génico blanco. La calle 5 representa una muestra estacionaria que creció durante la noche a 28ºC, la calle 4 representa una muestra que fue inducida durante 4 horas a 42ºC, la calle 3 representa una muestra que fue inducida durante 4 horas a 37ºC, la calle 2 representa una muestra no inducida que creció a 26ºC a una D:O de 0.6, y la calle 1 es el marcador de peso molecular Biorad de bajo rango.

La Figura 25 es una foto de un gel de SDS que muestra las características de pérdida y expresión de pAMG13 en el cual el gen 1 de T7 se coexpresó con el operón T4 del pRIN10. La calle 4 representa una muestra estacionaria que creció durante la noche a 28ºC, la calle 3 representa una muestra que fue inducida durante 4 horas a 42ºC, la calle 2 representa una muestra que fue inducida durante 4 horas a 37ºC, y la calle 1 representa una muestra no inducida que creció a 28ºC a una D.O de 0,6.

La Figura 26 es una foto de un gel de SDS que muestra las características de pérdida y expresión de pAMGuvsX en el cual el gen 1 de T7 (bajo el control del promotor medio uvsXT4) se coexpresó con el operón T4 de pRIN10. La calle 4 representa una muestra estacionaria que creció durante la noche a 28ºC, la calle 3 representa una muestra que fue inducida a 42ºC, la calle 2 representa una muestra que fue inducida durante 4 horas a 37ºC, y la calle 1 representa una muestra no inducida que creció a 28ºC a una D.O de 0,6.

La Figura 27 es una foto de un gel de SDS que muestra las características de pérdida y expresión de pAMGuvsX en el cual el gen 1 de T7 se coexpresó con el operón T4 de pRIN11. La calle 5 representa una muestra estacionaria que creció durante la noche a 28ºC, la calle 4 representa una muestra que fue inducida a 42ºC, la calle 3 representa una muestra que fue inducida durante 4 horas a 37ºC, la calle 2 representa una muestra no inducida que creció a 28ºC a una D.O de 0,6 y la calle 1 es el marcador de peso molecular Biorad de bajo rango.

La Figura 28 es una foto de un gel de SDS que muestra las características de pérdida y expresión de pAMGuvSX en el cual NT-3 (bajo el control del promotor medio uvsX T4) se coexpresó con el operón T4 de pRIN10. La calle 4 representa una muestra que fue inducida a 42ºC, la calle 3 representa una muestra que fue inducida durante 4 horas a 37ºC, la calle 2 representa una muestra no inducida que creció a 28ºC a una D.O de 0,6 y la calle 1 es el marcador de peso molecular Biorad de bajo rango.

La Figura 29 es una foto de un gel de SDS que muestra las características de pérdida y expresión de pAMGuvSX en el cual BDNF (bajo el control del promotor medio uvsX T4) se coexpresó con el operón T4 de pRIN10. La calle 5 representa una muestra que fue inducida a 42ºC, la calle 3 representa una muestra que fue inducida durante 4 horas a 37ºC, la calle 3 representa una muestra que fue inducida a 28ºC, la calle 2 representa una muestra no inducida que creció a 28ºC a una D.O de 0,6 y la calle 1 es el marcador de peso molecular Biorad de bajo rango.

La Figura 30 es un diagrama esquemático de los vectores plásmidos pCB desarrollados en la presente invención.

La Figura 31 es un diagrama esquemático de los vectores plásmidos pAW desarrollados en la presente invención.

La Figura 32 es una foto de un gel de SDS que muestra las características de pérdida y expresión de pAMGX en el cual el gen 1 de T7 (bajo el control de l promotor medio T4 X) se coexpresó con pAW20. La calle 4 representa una muestra estacionaria que creció durante la noche a 28ºC, la calle 3 representa una muestra que fue inducida durante 4 horas a 28ºC, la calle 2 representa una muestra no inducida que creció a 28ºC a una D.O de 0,6 y la calle 1 es el marcador de peso molecular Biorad de bajo rango.

La Figura 33 es una foto de un gel de SDS que muestra las características de pérdida y expresión de pAMGX en el cual el SPI (bajo el control del promotor medio T4 X) se coexpresó con pAW20. La calle 3 representa una muestra que fue inducida durante 4 horas a 28ºC, la calle 2 representa una muestra no inducida que creció a 28ºC a una D.O de 0,6 y la calle 1 es el marcador de peso molecular Biorad de bajo rango.

La Figura 34 es una foto de un gel de SDS que muestra las características de pérdida y expresión de pAMGUVSY en el cual OPG (bajo el control del promotor medio de uvsX T4) se coexpresó con pAW20. La calle 4 representa una muestra que fue inducida durante 4 horas a 28ºC, la calle 2 representa una muestra no inducida que creció a 28ºC a una D.O de 0,6 y la calle 1 es el marcador de peso molecular Biorad de bajo rango.

La Figura 35 es una foto de un gel de SDS que muestra las características de pérdida y expresión de pAMGuvsX en el cual BDNF (bajo el control del promotor medio de uvsX T4) se coexpresó con pAW11. La calle 1 representa una muestra no inducida, la calle 2 representa una muestra inducida a 28ºC durante 4 horas y la calle 3 representa una muestra inducida a 37ºC durante 4 horas.

La Figura 36 es una foto de un gel de SDS que muestra las características de pérdida y expresión de pAMGuvsX en el cual OPG (bajo el control del promotor medio de uvsX T4) se coexpresó con pAW11. La calle 1 es la de los marcadores arcoiris de peso molecular bajo de Amersham. La calle 2 representa una muestra no inducida, la calle 3 representa una muestra inducida a 28ºC durante 4 horas y la calle 4 representa una muestra inducida a 37ºC durante 4 horas.

La Figura 37 es una foto de un gel de SDS que muestra las características de pérdida y expresión de pAMGuvsX en el cual NT3 OPG (bajo el control del promotor medio de uvsX T4) se coexpresó con pAW11. La calle 1 representa una muestra no inducida, la calle 2 representa una muestra inducida a 28ºC durante 4 horas y la calle 3 representa una muestra inducida a 37ºC durante 4 horas.

La Figura 38 es una foto de un gel de SDS que muestra las características de pérdida y expresión de pAMGX en el cual 3MNDF(bajo el control del promotor medio de X T4) se coexpresó con pAW11. La calle 1 representa una muestra no inducida, la calle 2 representa una muestra inducida a 28ºC durante 4 horas y la calle 3 representa una muestra inducida a 37ºC durante 4 horas.

La Figura 39 es una foto de un gel de SDS que muestra las características de pérdida y expresión de pAMGuvsX en el cual BDNF (bajo el control del promotor medio T4 uvsX) se coexpresó con un operón T4 pRIN10 que también contenía el gen 0.6 como proteína accesoria. La calle 5 representa una muestra que fue inducida durante 4 horas a 42ºC, la calle 4 representa una muestra que fue inducida durante 4 horas a 37ºC, la calle 3 representa una muestra inducida a 28ºC durante 4 horas a 28ºC, la calle 2 representa una muestra no inducida que creció a 28ºC a una D.O de 0,6 y la calle 1 es el marcador de peso molecular Biorad de bajo rango.

Descripción detallada de la invención

Para los propósitos de la presente invención, un "represor de la traducción" se define como una proteína capaz de unirse en forma específica a un sitio de reconocimiento en una porción de ARN e inhibir la traducción. En la presente invención, los sitios de reconocimiento de las proteínas de cubierta de MS2 y MS2 se usan para proporcionar un sistema del represor de traducción. Brevemente, la secuencia publicada de la MS2CP se usó para generar oligonucleótidos de los cuales se construyó el gen intacto. Luego, después de determinar que MS2CP fue tolerada a muy altos niveles en la E. coli sin ningún efecto aparente sobre el crecimiento celular, se colocó MS2CP bajo el control de un promotor constitutivo débil en plásmidos de variado número de copias. La idea consistió en producir en forma continua bajos niveles de MS2CP para que cualquiera de los genes clonados que tienen un sitio de reconocimiento MS2 se pudieran mantener completamente silentes hasta que fuera útil expresarlos.

Mediante este enfoque, se demostró que este sistema basado en MS2 se podría usar para proporcionar un sistema mejorado controlado en forma ajustada que incluye, por ej., el gen de la ARN polimerasa de T7. El gen 1 de T7 clonado proporciona una fuente de ARN polimerasa de T7 para dirigir la expresión selectiva de alto nivel de los genes blanco bajo el control de un promotor T7. Sin embargo, debido a que la ARN polimerasa de T7 es tan activa y selectiva, es importante controlar los niveles basales de ARN polimerasa de T7 activa, es decir cortar el gen 1 de T7 en el estado no inducido, para impedir la expresión prematura del gen blanco.

La estrategia usada en la presente invención, de este modo, incluye la clonación del gen 1 de T7con un sitio de reconocimiento MS2 unido a su secuencia codificadora, y la inserción de esta construcción en el cromosoma junto con una copia de la proteína de cubierta de MS2 bajo el control de un promotor constitutivo débil. Los dos genes se clonaron cola a cola para que los promotores para cada uno de ellos se orientaran en direcciones opuestas. Luego se demostró que las células hospedantes que contienen una copia cromosómica de esta construcción del "gen 1 de T7 controlado por MS2" permiten la producción efectiva de la ARN polimerasa de T7 que se luego se puede usar para conducir la expresión de un gen blanco.

Los genes blanco se examinaron con éxito en el sistema de la presente invención incluyeron el gen 1 de T7, factor neutrófico 3 (NT-3), factor neutrófico derivado del cerebro (BDNF), inhibidor de serina proteasa (SPI) y osteoprotegrina (OPG), factor de diferenciación neu (NDF) alfa/beta, polimerasa de hepatitis C, telomerasa humana y análogos de derivados y variantes de los mismos. Está contemplado que los diferentes sistemas controlados por MS2 pueden proporcionar un mejor control para cualquier gen clonado, tóxico o no tóxico, en una células hospedantes procariota.

Además se demostró que el sistema basado en MS2 se podría usar en forma estable y expresar ciertos genes tóxicos. Como se usó en la presente memoria, un gen tóxico es cualquier gen cuya expresión en la célula hospedante impedirá que la célula hospedante en cultivo logre el crecimiento logarítmico normal que hubiera logrado si no fuera por la expresión del gen tóxico. Como ejemplo de la presente invención, los genes tempranos del bacteriófago T7 se clonaron y expresaron, cono motA y asiA. Se sabe que varios de los genes tempranos del bacteriófago T7 son tóxicos; Studier and Rosenberg, J. Mol. Biol., 153:503-525 (1981). El gen 0.7, en particular, es letal ya que codifica una función que inhibe la ARN polimerasa de E coli. Actualmente también se sabe que motA y asiA son tóxicos; Hinton et al., Methods in Enzymol, 274:43-57 (1996). La capacidad para expresar tales genes es de valor significativo debido a que se ha demostrado que algunos de estos genes tiene un efecto positivo sobre la expresión del gen heterólogo en E. coli por infección con un fago. En otras palabras, hay ocasiones en que es útil tener una copia de estos genes clonados presente en la célula para la expresión inmediatamente antes de la expresión del gen blanco.

En los ejemplos proporcionados en la presente memoria, el gen 1 de T7 estaba bajo el control del promotor lac UV5; Fuller, F., Gene, 19:43-54 (1982), el promotor PS4; WO 95/267246 (Bartley et al.), publicado el 12 de octubre de 1995, y el promotor; Patente Estadounidense No. 5.196.318 (Baldwin et al.), presentada el 23 de marzo de 1993. En gran medida, sin embargo, el gen 1 de T7 podía haber estado bajo el control de cualquier promotor inducible, que incluye los promotores bacterianos tales como trp-, o lpp-; promotores de fago tales como lambda P_{L} o P_{R}; o promotores sintéticos tales como tac o trc.

También se desarrollan y describen en la presente memoria como efectivas para el sistema de la presente invención las formas mutantes de la MS2CP. Por ejemplo, se construyó una versión mutante de la MS2CP en la cual el codón para el residuo de valina en la posición 29 se ha cambiado por un codón para isoleucina. Esta mutación origina la capacidad de los dímeros de la proteína de cubierta para asociarse en los agregados de tamaño de la cápside; Peabody, D.S. and Ely, R., Nuc. Acid Res:, 22(7):1649-1555 (1992). Debido a que las proteínas de cubierta se unen a su ARNm blanco como un dímero y se considera que la multimerización de dímeros inhibe la asociación con el ARNm, se debería esperar que esta mutación aumente la concentración efectiva de los represores de la traducción presentes sin aumentar la real concentración de proteína al mantener más proteínas de cubierta en dímeros que en multímeros. Los expertos en el arte deben considerar que otras formas mutantes de los MS2CP podrían ser efectivas en los sistemas dela presente invención.

Si bien los ejemplos proporcionados en la presente memoria utilizan en forma específica el sistema del bacteriófago MS2, no sería inesperado que otros sistemas similares, por ej., Q\beta, GA, SP, R17, f2 y fr, se podrían usar como sistemas de represión de la traducción en forma similar.

Las células hospedantes que se usan y evalúan en la presente invención incluyeron la cepa de E coli B BL21(DE3) \pm pLysS y la cepa de E. coli K EE1120 + pLysS. Deberá ser evidente para un experto en el arte que otras cepas de E coli B y cepas de K comúnmente usadas podrían ser efectivas en la práctica de la presente invención. También se debe considerar que se podrían utilizar diferentes células hospedantes eucariotas en la práctica de la presente invención.

También se utilizan terminadores de transcripción potentes en los sistemas de la presente invención. Al insertar tales terminadores corriente arriba del promotor de interés (por ej., el promotor que dirige la expresión del gen 1 de T7), la transcripción por ultralectura de las secuencias promotoras crípticas se elimina, de este modo se proporciona un sistema de regulación más ajustada. Los terminadores T1T2; Amman et al., Gene, 25:167-178 (1983) se usaron en los ejemplos de la presente invención; sin embargo, existen otros terminadores potentes, por ej, t_{hp}; Nohno et al., Mol. Gen. Genet., 205:260-269 (1986) de los que claramente se puede esperar que actúen efectivamente en el sistema de la presente invención.

Si bien la ARN polimerasa de T7 se usó en los ejemplos de la presente invención, las ARN polimerasas equivalentes provenientes de fagos tipo T7 también podrían funcionar. Tales fagos se describen con detalle en el arte; ver por ej, Hausmann, R., The T7 Group in The Bacteriophages, capitulo 8,_{,}páginas 259-283, Plenum Press, New York (1988).

También se describe en la presente invención la construcción de un sistema para la activación d un promotor medio de T4 middle clonado in vivo mediante un operón construido especialmente que consiste en los genes motA y asiA bajo el control de un promotor inducible. La ventaja principal de este sistema promotor es que dirige la transcripción de promotores específicos mientras se inhibe la transcripción de los promotores de E. coli, que minimizan la competición por el aparato de traducción e inhiben a la célula que responde a la producción de proteínas blanco por inducción de transcripción de genes de proteasa. También se demostró que el sistema proporciona un ciclo de expresión "escalonado" que podría ser útil para, entre otros, expresar ciertas proteínas accesorias que pueden ser útiles para la producción de la proteína blanco.

Más específicamente, la idea fue que las proteínas accesorias se podrían clonar con un promotor que se induce de la misma manera que el promotor de motA y asiA , o pueden estar bajo el control del mismo promotor en una conformación de operón única. Cuando se da la señal de inducción se deberían producir simultáneamente estas proteínas accesorias y motA y asiA. Cuando motA y asiA alcanzaron niveles de saturación (iguales a o algo mayores que el número de moléculas de ARN polimerasa presentes) entonces la se debería inhibir la transcripción de los promotores de E. coli, finalizando esta etapa del ciclo de expresión. La ARN polimerasa luego se debería dirigir únicamente a los promotores medios de T4 que conducirían a la expresión de la proteína blanco. En la actualidad no existe un sistema disponible que pueda hacer este proceso en E. coli.

La capacidad para expresar tales proteínas accesorias de esta manera puede ser de gran beneficio para mejorar la expresión de las proteínas en los sistemas procariotas. Por ejemplo, Yasukawa et al., The Journal. of Biol. Chem., 270(432):25328-25331 (1995) informaron que la coproducción de la tioredoxina de E. coli (Trx) o las chaperonas de E. coli GroESL, aumentan la solubilidad de varias proteínas de vertebrados que se producen en E. coli (Trx es más efectiva). Este es un hallazgo importante y útil porque las proteínas eucariotas se producen frecuentemente en la E. coli como agregados insolubles y esta es una de las barreras para los estudios estructura macromolecular.

En la presente invención, los genes motA y asiA han sido clonados bajo el promotor lambda P_{L} y también se clonaron con el promotor derivado de lac. En gran medida, sin embargo, cualquier promotor inducible podría actuar, incluyendo a los promotores bacterianos tales como trp-, o lpp-; promotores de fagos tales como lambda P_{L} o P_{R} o promotores sintéticos tales como tac o trc.

Debido a que se halló que los promotores medios de T4 son "defectuosos", y , en gran medida, porque los genes tóxicos motA y asik necesitan un control cuidadoso, se combinaron las características del sistema MS2 y del sistema del promotor medio de T4. Se halló que los operones de motA/asiA son inclonables a menos que ambos genes se unieran a un sitio de reconocimiento de MS2. Los "casetes de T4 basados en MS2" óptimos se insertan en el cromosoma de la célula hospedante, de este modo contienen un promotor inducible motA-asiA con las secuencias de los genes motA y asiA (\pm secuencia de proteína accesoria) unidas a una secuencia de reconocimiento de la proteína de cubierta de MS2, y un gen de la proteína de cubierta de MS2 operativamente unido a un promotor constitutivo débil.

Al utilizar este sistema, el bajo nivel de producción de MS2CP impide la fuga del promotor medio de T4 y la producción de motA/asiA_{,} hasta que se produzca un evento de inducción que luego conduce la producción de motA, asiA (y la producción de proteína accesoria, si se requiriera) y cierra la transcripción en E coli, seguido por la producción del gen blanco conducida por los promotores medios de T4.

También se desarrolla y describe en la presente memoria una serie de cepas de E. coli que han sido manipuladas genéticamente para producir diferentes concentraciones de MS2CP. Estas cepas han tenido la proteína de cubierta de MS2 bajo el control de secuencias modificadas del promotor TET integradas dentro de su ADN cromosómico en sitios específicos. Las secuencias del promotor TET se modificaron mediante el cambio de bases en las regiones 10 y -35 para convertirlas en homólogas con la secuencia de consenso para estas regiones en los promotores de E. coli. Estos se han alterado por medio de oligonucleótidos para aleatorizar la secuencia del sitio de unión al ribosoma. Estos cambios permitieron la identificación de varias de las formas que producen altos niveles de proteína de cubierta de MS2 como se determinó en los análisis de transferencia western.

Las diferentes cepas que contienen MS2 de la presente invención se pueden utilizar para clonar a los genes tóxicos y otros que no se pueden clonar por la tecnología convencional. Por ejemplo, se ha determinado que, cuando se trabaja con genes tóxicos, el establecimiento del ligamiento inicial es el paso más sensible para la toxicidad y de este modo el paso más difícil en el proceso de clonación. Una vez que se ha aislado el clon estable, sin embargo, se puede transformar en otras líneas celulares sin incidentes. Empleando el GM350, se puede acoplar el gen tóxico o "inclonable" a un sitio de reconocimiento de MS2 y luego se usa el ligamiento para transformar el GM350. Debido a que GM350 tiene la mayor producción de proteína de cubierta de MS2; en efecto, se produce tanto MS2CP que la expresión después de la inducción se elimina efectivamente, el GM350 se puede usar para identificar y obtener un clon estable. Una vez que se ha obtenido el clon estable y se ha confirmado la secuencia, el plásmido recombinante se puede usar para transformar las otras cepas de MS2 que producen cantidades decrecientes de la proteína de cubierta. Se podría determinar la estabilidad del clon de cada cepa y la proteína finalmente se expresa en una de tales cepa. En los casos en que la toxicidad persiste con posterioridad a la obtención del clon inicial, los productores de bajo nivel de MS2CP, por ej., GM315 y GM320 podrían ser útiles para estabilizar esas construcciones.

Los siguientes ejemplos se ofrecen para ilustrar más plenamente la invención, pero se interpretan como una limitación del alcance de la misma. El Ejemplo 1 describe la construcción del gen de la proteína de cubierta MS2 de tipo salvaje (wtMS2CP) y luego proporciona los resultados del examen de wtMS2CP para determinar su capacidad de expresarse en E. coli, y cualquiera de los efectos que tal expresión presentó sobre el crecimiento de la célula. El Ejemplo 2 describe la construcción de dos versiones de mutantes del gen de la proteína de cubierta de MS2. El Ejemplo 3 describe la construcción de los vectores del plásmido pRIN que contienen mutantes wtMS20P o MS2CP para usar en el desarrollo de los sistemas de reopresión de la traducción. El Ejemplo 4 describe la clonación del gen 1 de T7 en los vectores del plásmido pRIN y el examen posterior de los vectores para la expresión y el sistema de pérdida. El Ejemplo 5 describe la inserción cromosómica de los "casetes del gen1 de T7 controlado por MS2" en el cromosoma de la célula hospedante, y luego se demuestra el uso de tales cepas huésped para expresar diferentes genes blanco además de proporcionar los resultados de las pruebas en las que las características de pérdida y expresión de las cepas recientemente desarrolladas se comparan con la ARN polimerasa de T7 disponible en el comercio que contiene las cepas. El Ejemplo 6 describe la fermentación a gran escala de las cepas recientemente desarrolladas a lata densidad. El Ejemplo 7 describe el uso del sistema de MS2 para clonar diferentes genes tempranos de T7. El Ejemplo 8 describe la prueba los genes tempranos de T7 para aumentar la producción de proteínas heterólogas. El Ejemplo 9 describe la inserción cromosómica del gen de la proteína de cubierta de MS2 bajo el control de varios promotores TET alterados para producir cepas manipuladas genéticamente para producir diferentes concentraciones de MS2CP y los resultados de las pruebas de estas cepas para determinarla la capacidad de clonar genes tóxicos. El Ejemplo 10 describe la construcción del plásmido pAMGuvxs, el plásmido pAMGX y los sistemas pRIN del operón de T4 emplea dos para desarrollar el sistema basado en el promotor medio de T4 que usa plásmidos multicopia. El Ejemplo 11 describe las pruebas de los sistemas de pAMGuvxs, pAMGX y pRIN del operón de T4 preparados y descritos en el Ejemplo 10. El Ejemplo 12 describe la clonación del operón de motA/asiA en plásmidos de copia única que contienen el sistema MS2. El Ejemplo 13 describe las pruebas de los plásmidos de copia única preparados y descritos en el Ejemplo 12. El Ejemplo 14 describe el uso del sistema basado en MS2/T4 para expresar en forma efectiva una proteína accesoria y por lo tanto aumentar la expresión de la proteína blanco.

Materiales y métodos

En los siguientes Ejemplos, se emplean los siguientes vectores de expresión/plásmidos bacterianos: pAMG13, pAMG21, pAMG22, pAMG2S, pAMG33, y 3002 nahG (cada uno de los cuales ha sido depositado previamente o se deposita en conexión con el archivo de esta solicitud); pT7-7; Tabor y Richardson, Proc. Natl. Acad Sci. USA, 82:1074-1078 (1985),pACYC184; Chang et al., J. Bacterial., 134:1141-1156 (1978); Rose; Nucleic Acid Res., 16:355 (1988a); pKK223-3; Amman et al., Gene, 25:167-178 (1983); pGP1-2; Tabor and Richardson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:1074-1078 (1985); y pSC101; Bernardi and Bernardi, Nuc. Acids Res., 12:9415-9426.

En los siguientes Ejemplos, se usaron los métodos proporcionados a menos que se indique lo contrario.

1. Ligamientos

Todos los ligamientos se llevaron a cabo en un volumen final de 40 \mul. Aproximadamente se usaron 50 ng a 500 ng de cada vector y de 500 ng a 2 pg de cada inserto. La ADN ligasa T4 se agregó a 1 unidad de la actividad y las reacciones se incubaron a 16ºC durante toda la noche. Las reacciones luego se precipitaron por la adición de acetato de amonio a 2,5M y se agregaron 2,5 volúmenes de etanol. La mezcla de reacción luego se incubó a -80ºC durante por lo menos 1 hora y luego se centrifugó a 15.000 rpm (a 4ºC) durante 30 minutos. El sedimento se resuspendió en los 40 \mul originales y se usó una alícuota de 4 \mul para la electroporación.

2. Fosforilación y apareamiento de oligonucleótidos

Se resuspendieron oligonucleótidos en agua a una concentración de 20 pmol/\mul. Se usó una alícuota de 12,5 \mul de cada oligonucleótido para la reacción de fosforilación. A esta solución se agrega 2 \mul de ATP, 2 \mul del buffer de ligamiento y 2,5 \mul de agua. La reacción comienza por la adición de 1 \mul de PNK y se incuba a 37ºC durante 1 hora. Luego las muestras se calientan a 65ºC durante 15 minutos. Los pares complementarios luego se mezclan y calientan a 100ºC durante 1 minuto y se dejan enfriar lentamente a temperatura ambiente y luego se colocan en hielo. En este punto de tiempo los oligonucleótidos apareados están listos para ligarse. Para las secuencias particularmente largas, se debería ordenar que dos oligonucleótidos abarquen la región completa y tenga 6-12 bases de complementariedad en los extremos 3'. Esto se usaría como templado y cebador (a 1 pmol/\mul de concentración final) en 100 \mul de reacciones PCR y después de la purificación por geles se debe digerir por restricción antes del ligamiento.

3. Reacciones de PCR

Se usaron habitualmente varios programas estándares para los procedimientos de PCR. Cuando se amplifican los genes o fragmentos de operón, el volumen de reacción fue 100 \mul. Una alícuota de 10 \mul de cada cebador a 10 pmol/\mul se agrega a cada reacción y se agrega el templado entre 50 ng a 250 ng. Las reacciones se corren durante 25 ciclos. El primer paso es 94ºC durante 30 segundos, luego 50ºC durante dos minutos seguidos por 72ºC durante tres minutos. Los fragmentos amplificados se purificaron por geles en geles de agarosa SeaKem GTG (FMC). El ADN se recuperó de la agarosa mediante Qiaex II (Qioagen Inc.)

Las reacciones de selección de colonias para identificar clones positivos se corren en volúmenes de 20 \mul. Los oligonucleótidos están presentes en la concentración final de 0,25 pmol/\mul. Las colonias se recogen mediante una punta de pipeta y se disuelven en la mezcla de reacción. Se retira una alícuota de 1 \mul y se usa para inocular un tubo de 5 ml de LB que contiene el antibiótico apropiado. Las reacciones de PCR se corren durante 30 ciclos. El primer paso es 94ºC durante 30 segundos seguidos por 30 segundos de apareamiento a 372C y 30 segundos de elongación a 72ºC. Para insertos grandes (>1000 bases) el tiempo de elongación se extiende a 1 minuto. Luego las reacciones se cargan en geles de agarosa (0,8-1,0%) y los positivos se identifican por la migración contra reacciones estándares y del vector simulador.

Ejemplo 1

Este Ejemplo describe la construcción del gen de la proteína de cubierta de MS2 de tipo salvaje (wtMS2CP) y luego proporciona los resultados de las prueba del wtMS2CP para determinar su capacidad para expresarse en E. coli, y cualquiera de los efectos que tal expresión presentó sobre el crecimiento de la célula hospedante.

La secuencia proteica publicada de la proteína de cubierta de MS2; Peabody, D., EMBO J., 12 (2):595-600 (1993) se usó para diseñar un gen que emplea codones de uso preferido en E. coli. Los oligonucleótidos 909-34 a. 909-53 (ver Tabla 1) se diseñaron y usaron para construir el, gen, y la secuencia génica completa se ilustra en la Figura 1. Los oligonucleótidos se diseñaron para incluir un sitio NdeI en el extremo 5' del gen y un sitio BamHI en el extremo 3'. Este gen luego se digirió por restricción con BamHI y NdeI y se clonó en el plásmido pT7-7; Tabor and Richardson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:1074-1078 (1985). Una vez que se ha identificado un clon positivo y la secuencia confirmada, este gen se subclonó en el plásmido 3002 nahG mediante los mismos sitios de restricción.

La cepa BL21(DE3) comercial (Novagen, Madison, WI) se usó para examinar la capacidad del wtMS2CP para expresarse en E. coli. La BL21(DE3) es una cepa de E. coli que contiene una copia cromosómica del gen de la ARN polimerasa de T/bajo el control del promotor lac UV5. Las colonias de BL21(DE3) que contiene el gen de wtMS2CP en pT7-7 se recogieron de las placas y se usan para inocular una alícuota de 5 ml de LB-amp en un tubo Falcon de 50 ml. Esta preparación se cultivó durante la noche a 28ºC con agitación. El cultivo durante toda la noche se usó para inocular el medio fresco a una dilución 1:100 (50 \mul a 5 ml) en un tubo de 15 ml. Estos se cultivaron a 28ºC con agitación a una D.O de aproximadamente 0,6.

La expresión del gen wtMS2CP se indujo por la adición de IPTG a 0,4 mM. La incubación se continuó a 37ºC con agitación durante 4 horas. Se retiró una muestra de 1 ml y las células se sedimentarán por centrifugación. Los sedimentos se resuspendieron en buffer de craqueo a 0,01 de unidades/R1 de DO y las muestras se hirvieron durante 5 minutos. Se cargó una alícuota de 6 \mul de cada muestra en un gen de poliacrilamida SDS 4-20% (Novex). El gel se tiñó con azul coomassie para visualizar las proteínas. Como se ilustra en la foto del gel (Figura 2), las calles 8, 10, 11 y 12 exhiben la producción de la wtMS2CP. Estos cultivos producidos alcanzaron una densidad óptica superior que los que no contenían versiones funcionales del gen MS2CP en pT7-7, de este modo se demuestra que la MS2CP se puede expresar efectivamente con ningún efecto evidente en el crecimiento de la célula hospedante.

Ejemplo 2

Este Ejemplo describe la construcción de dos versiones mutantes del gen de la proteína de cubierta de MS2.

Se construyó una versión mutante del gen de la proteína de cubierta de MS2 en el cual se ha modificado el codón para el residuo de valina en la posición 29 con un codón para isoleucina por PCR de superposición empleando los oligonucleótidos 1456-55 y 1456-56 (ver Tabla 1). Esta mutante particular se denominará de aquí en adelante
MS2CP-11.

Se construyó una versión mutante del gen de la proteína de cubierta de MS2 en el cual se ha modificado el codón para el residuo de cisteína en la posición 101 con un codón para arginina o PCR de superposición empleando los oligonucleótidos 1456-61 y 1456-52 (ver Tabla 1). Esta mutante particular se mencionará de aquí en adelante como MS2CP-14.

Ejemplo 3

Este Ejemplo describe la construcción de los vectores del plásmido pRIN que contienen las mutantes wtMS2CP o MS2CP para uso en el desarrollo del sistema de represión de la traducción. Los vectores pRIN son vectores multicopia (15 copias) basados en el plásmido pACYC184; Chang et al., J. Bacteriol., 334: 1141-1156 (1978); Rose, Nucleic Acid Res., 16:355 (1988a).

El plásmido pACYC184 se digirió con las enzimas de restricción XbaI y HindIII. Se diseñaron los oligonucleótidos 940-29 y 940-30 (ver Tabla 1) para ligarse en estos sitios mientras se introducen nuevos sitios únicos para uso posterior. Más específicamente, los oligonucleótidos apareados se clonaron en el corte del vector pACYC184, de este modo se destruyen los sitios XbaI y HindIII y se introducen en los sitios únicos PstI y SacI además de en un segundo sitio SphI. El plásmido luego se digirió con la enzima de restricción EagI y los oligonucleótidos 941-43 y 941-44 (ver Tabla 1) se clonaron en el vector que destruyó el sitio EagI y se introdujo en un sitio de restricción Aatli único.

El fragmento 1036-99 (ver Tabla 1) que contiene el gen de la proteína de cubierta de MS2 de tipo salvaje unido al promotor nahG se construyó a partir del clon 3002 nahG descrito en el Ejemplo 1, de manera tal que un sitio Sact estaba secuencia arriba de la secuencia promotora y un sitio HamiII estaba en el término del gen. Este fragmento luego se clonó en el vector derivado pACYC184 (descrito en el párrafo previo) de SacI a BamHI.

La secuencia promotora nahG luego se reemplazó con un promotor TET de la siguiente manera: se construyó un promotor TET sintético mediante los oligonucleótidos 1016-20 y 1016-21 (ver Tabla 1). El promotor se diseñó mediante la secuencia nativa del promotor TET para pACYC184 con una alteración de la introducción del sitio NdeI en el comienzo natural del gen TET. El promotor se ingresó en la construcción SacI a NdeI para que el gen de wtMS2CP se una en forma operativa al promotor TET.

Se construyó un fragmento de ADN que contenía las secuencias del terminador rrnB T1T2 por PCR mediante el plásmido pKK223-3; Amman et al., Gene, 25:167-178 (1983) como un templado y empleando los oligonucleótidos 1036-6 y 1053-71 (ver Tabla 1). Este fragmento se construyó para que tenga los sitios para las enzimas de restricción AatII y AvaI en los extremos. El vector derivado de pACYC184 descrito anteriormente se cortó con estas enzimas y el fragmento se ligó en el mismo.

Una versión sintética de un promotor lambda y el sitio de clonación múltiple del vector pAMG13 se cortaron de AatII a BamHI. Luego el vector derivado de pACYC184 descrito se cortó con estas enzimas y el fragmento del pAMG13 se ligó. El plásmido resultante se denominó pRIN10 (wt) (Figura 3). También se construyeron tres plásmidos derivados de pACYC184 similares, uno que contiene el promotor PS4 en vez del promotor lambda (denominado pRINil (wt)), uno que contiene el promotor lac UV5 en vez del promotor lambda (denominado pRIN20(wt)), y uno que contiene el promotor lux (denominado pRIN22(wt)) (Figura 3).

También se construyeron las construcciones pRIN que contienen las mutantes MS2C.P-11 y MS2CP-14. Los fragmentos de las formas mutantes, aún unidas al promotor TET, se generaron para tener un sitio SphI en el extremo del promotor y un BamHI en el extremo del gen mutante de MS2CP. Los plásmidos pRIN descritos anteriormente se cortaron con BamHI y SphI y la porción de plásmido se purificó con geles fuera del fragmento de wtMS2CP. Luego se ligaron los fragmentos mutantes mediante los sitios SphI y BamHI. Las construcciones que contienen la mutante MS2CP-11 se denominaron pRIN10(11), pRIN11(11), pRIN20(11)y PRIN22(11), y las construcciones que contienen la mutante MS2CP-14 se denominaron PRIN10 (14) pRIN11 (14)) y pRIN22(14).

Ejemplo 4

Este Ejemplo describe la clonación del gen 1 de T7 en diferentes vectores de plásmidos pRIN, y las exámenes posteriores de los plásmidos de vectores para determinar la expresión y la pérdida del sistema.

El gen 1 de T7 se clonó en varios de los plásmidos pRIN descritos anteriormente. El gen 1 de el gen T7 se construyó por PCR mediante los oligonucleótidos 949-1 y 949-2 (ver Tabla 1) para tener una secuencia de reconocimiento de una proteína de cubierta de MS2 ligada a su región codificadora. El templado usado fue el plásmido pGP1-2;- Tabor and Richardson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:1074-1078 (1985): El gen se clonó en diferentes plásmidos pRIN desde XbaI a BamHI. Los mutantes de MS2CP se examinaron para determinar su capacidad para inhibir la multimerización y de este modo conducir a un aumento de la concentración efectiva del represor de traducción. otro parámetro que se examinó fue la presencia o ausencia de una secuencia de la caja corriente abajo del gen 1 (oligonucleótido 1477-84) (ver Tabla 1) (se ha demostrado que esta secuencia aumenta la traducción por incremento de la unión al ribosoma; Sprengart et al., Nuc. Acids Res., 18 (7):1719-1723 (1990)).

Los cultivos durante toda la noche de las diversas construcciones se cultivaron en 5 ml de LB-cam en tubos de 50 ml a 28ºC. Estos se usaron para inocular 5 ml de porciones frescas de LB-cam en tubos de 15 ml con una dilución de 1:100. Estos se llevaron otra vez a un agitador a 28ºC. Se tomaron las muestras de los cultivos inmediatamente antes de la inducción, y el paso de inducción en este caso incluyó la adición del IPTG a una concentración final de 0,4 mM. La incubación de cultivos inducidos continuó durante 3 horas y se tomó de 1 ml las muestras. Todas las muestras se sedimentaron por centrifugación y los sedimentos se resuspendieron un buffer de craqueo. Después de hervir durante 5 minutos, se corrió una alícuota a 6 \mul de cada uno en un gen de poliacrilamida SDS 4-20% (Novex).

Luego la proteína se transfirió electroforéticamente a nitrocelulosa. Las transferencias se bloquearon durante la noche en blotto tween con 2% de leche en polvo descremada; Harlow & Lane, Immunoblotting in Antibodies; A-Laboratory Manual, Capítulo 12, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1988). Las transferencias se probaron durante una hora con un anticuerpo policlonal derivado de conejo para ARN polimerasa de T7. Después del lavado las transferencias se probaron con el anticuerpo de asno anti-conejo conjugado con peroxidasa de rábano picante (Amersham) durante 1 hora. Esta se lavó y trató con los reactivos ECL (Amersham) y se expuso a una película de rayos X. La exposición fue de 15 minutos para maximizar la sensibilidad. La película se desarrolló mediante un procesador de película Kodak.

Las Figuras 4-6 son fotografías de las transferencias western que muestran los resultados de los experimentos de pérdida y expresión realizados con diferentes construcciones. La Figura 4 es una transferencia de un cultivo estacionario de toda la noche, la Figura 5 es una transferencia de un cultivo de pre-inducción de crecimiento exponencial (preI) y la Figura 6 es una transferencia de un cultivo inducido por IPTG crecido a 28ºC. Tal como se evidencia en las fotos de las transferencias, es clara la presencia de la proteína de cubierta tiene un efecto muy importante sobre la perdida de actividad durante la noche (comparar Figura 4 y 5), y hay algo de reducción del nivel de la acumulación de proteínas en las células que muestran el mayor control de la pérdida. Más específicamente, la señal es más fuerte en las calles laterales de la izquierda de las transferencias y disminuye en las calles laterales de la derecha con una función de la rigidez y grado de control ejercido por los sistemas correspondientes; el promotor PS4 presenta mas perdida que el promotor lac UV5; la mutación de la caja corriente abajo reduce la pérdida pero tiene poco impacto sobre el nivel de inducción para el promotor PS4; las mutantes de MS2CP presentan un control más ajustado de la pérdida del gen 1 de T7 en cultivos de toda la noche y exponenciales que las de tipo salvaje; las mutantes impactan en el nivel de acumulación sobre la inducción, con los cultivos de toda la noche controlados más ajustadamente (lac UV5) que muestran niveles más bajos de ARN polimerasa después de la inducción; y mutante MS2CP14 parece tener un efecto mayor que la mutante MS2CP11, la cual es intermediaria entre wtMS2CP y MS2CP14.

Ejemplo 5

Este Ejemplo describe la inserción cromosómica de los "casetes del gen 1 de T7 controlado por MS2" en el cromosoma de la célula hospedante y luego se demuestra el uso de tales cepas huésped para expresar diferentes genes blanco además de proveer los resultados de las pruebas en las que se comparan las características de la pérdida y expresión de las cepas recientemente desarrolladas con las cepas que contienen ARN polimerasa de T7 disponibles en el comercio.

Un "casete del gen 1 de T7 controlado por MS2" (contiene las secuencias del terminador secuencia arriba, una secuencia del promotor inducible, el sitio de reconocimiento de MS2, el gen 1 de T7, el gen de la proteína de cubierta de MS2 (wtMS2CP, o MS2CP-11 o MS2CP-14) y un promotor constitutivo débil, por ej., TET) (ver Figura 7) se cortó de los diferentes plásmidos mediante las enzimas de restricción SphI y PpuMI, y luego se clonaron en una un vector M13 especialmente construido, MMEbg; Blum et al., J. Bacteriology, 171(1):538-546 (1889); Micheals, M.L., Gene, 93:1-7 (1990) para el sitio de integración específica en el cromosoma del huésped. Se obtuvieron diferentes casetes que contienen wtMS2CP, MS2CP-11, o MS2CP-14.

La integración procede mediante un mecanismo de recombinación forzada. Primero, los oligonucleótidos 1553-73 y 1553-74 (ver Tabla 1) se ligaron en los sitios BamHI y NotI de MMebg. Estos oligonucleótidos introducen sitios SphI y PpuMI en el vector. El "casete del gen 1 de T7 controlado por MS2" luego se ligó en los sitios SphI y PpuMI. Luego los ligamientos se transformaron en las células XL1 Blue al poner las células en 1 ml de SOC y se incuba con 150 \mul de MOCK de ligamiento y 150 \mul y 30 \mul de ligamiento de insertos con 300 \mul de cultivo XL1 Blue durante toda la noche + 3,5 ml de LB + Agar Top 0,8%. La mezcla se vertió en las placas con LB y se incubaron a 37ºC toda la noche. Las placas se recogieron en 100 \mul de 1X TE.

Los cultivos de toda la noche comenzaron antes de la detección por PCR con 70 \mul del fago resuspendido de las placas y 200 \mul de XL1 Blue ON en 5 ml de LB. Estos cultivos se agitaron a 37ºC toda la noche. Cada placa se examinó por PCR. Se usaron 2 \mul de la placa resuspendida en un 20 \mul de una reacción PCR. Se usaron los oligonucleótidos 305-3 y 305-14 (internos para el gen 1 de T7) (ver Tabla 1) para este examen. Los clones positivos se identificaron por reacciones corridas en el gel de agarosa 1,0%. Se centrifugó un alícuota de 1 ml de cada cultivo de toda la noche y se guardaron 800 \mul del sobrenadante con el fago en un tubo Eppendorf. Luego se incubó una alícuota de 200 \mul de cada sobrenadante a 70ºC durante 20 min. Luego se agregaron 100 \mul del fago tratado con calor a 500 \mul de una cepa autotrófica K de E coli con un genotipo de lac i^{Q} (denominado células F'tet/GM120) de un cultivo de toda la noche. (GM120 tiene el número de acceso ATCC 55784). Estas muestras se incubaron a 37ºC durante aproximadamente 1 hora. Luego se incubaron 25 \mul de F'tet/GM120 control, 25 \mul de fago tratado con calor solo, y 25 \mul de una dilución 1:10 de cada cruza en las placas LB+Kn^{40}. Luego las placas se incubaron a 37ºC durante toda la noche. Las colonias purificadas que resultaron de la cruza (o lisogenización) se estriaron dos veces en las placas B+Kn y se incubaron a 37ºC durante toda la noche. Luego las colonias se subcultivaron dos veces en 0,3% de hiel de buey y LB, y luego se agitó a 37ºC toda la noche. Luego las células se estriaron en las placas LB, junto con un cultivo réplica de LB a LB+Kn para identificar las colonias sensibles a kanamicina (el fago ya no debería estar presente en las colonias que son sensibles a la kanamicina).

Luego se realizó la prueba de PCR para examinar la inserción en el cromosoma de la siguiente manera: se recogió una colonia de una placa y se usó para inocular 20 \mul de mezcla de PCR mix (también se inocularon 5 ml de LB, empleando la misma punta, usado para un cultivo de toda la noche su se identificaron los positivos). Se corrieron 15 \mul de cada muestra de PCR en un gel de agarosa 1,0% para examinar los positivos. Cuando se identificaron los positivos por tamaño en el gel, los cultivos de toda la noche correspondientes comenzaron a agitarse a 37ºC. Estos luego se cultivaron en placas LB y se incubaron a 37ºC durante toda la noche.

Para curar las células del factor F', los cultivos provenientes de las colonias únicas de la placa de 5 ml de LB comenzaron a agitarse a 37ºC durante 4 horas. Luego se siguió un protocolo publicado para la cura mediante naranja de acridina; Miller, Experiments in molecular genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, páginas 104-106 (1972). Básicamente, se cultivan las células en LB y las placas réplica en LB+tetraciclina. Las células sensibles a tetraciclina se aislarán como F' negativo. Los cultivos de toda la noche de las colonias de estas placas se inician y luego se reinfectan con M13 mp18 para asegurar que el factor F' ya no está presente en las células. Luego se mezclan 300 \mul de los cultivos de toda la noche con agar top y se siembran con 2 \mul de M13 de solución patrón del fago mp18. No debería haber placas presentes. Dos cepas construidas mediante este protocolo se denominaron EE11-11M (promotor PS4) y EE11-20 (promotor lac UV5).

Se compararon las características de la pérdida y expresión de EE11-11M y EE11-20 con la cepa BL21(DE3) comercial (descrita previamente), que emplea la expresión del producto génico NT-3 o producto génico BDNF como un marcador. En el NT-3 (o BDNF) está presente en el vector pET22b disponible en el comercio (Novagen, Madison, WI) que también tiene un sitio lac.i entre el promotor T7 y el gen de interés, y transporta un gen lac i^{Q} para reducir la pérdida de expresión. También se compararon BL21(DE3) que contiene pLysS como un vector secundario vs. EE11-11M que contiene pLysS como vector secundario vs. EE11-20 que contiene pLysS como vector secundario (como se indicó previamente, pLysS transporta el gen de lisozima de T7 que inhibe la ARN polimerasa de T7 y es el camino recomendado para reducir la pérdida). Finalmente, también se usó un plásmido pAMG25 que contenía el gen de BDNF para comparar BL21(DE3) vs EE11-20.

Específicamente, los cultivos de toda la noche (5 ml) de LB+ antibiótico (Kn^{40} o Cm^{30}) en tubos Falcon de 50 ml comenzaron y estos cultivos se agitaron a 28ºC. Los tubos frescos de 5 ml LB + antibiótico en tubos de vidrio de 14 ml se inocularon con una dilución 1:100 del cultivo toda la noche. Los tubos se agitaron a 28ºC hasta que alcanzaran una DO = \sim0,8. Los cultivos de toda la noche continuaron agitando a 28ºC hasta la conclusión del experimento. Se tomaron alícuotas de cada muestra antes de la inducción. Los cultivos se indujeron por la adición de 20 \mul de IPTG 100mM (que dio la concentración final de 0,4 mM para IPTG). Los cultivos inducidos se incubaron a 28ºC con agitación durante 4 horas. Se retiró una muestra de 1 ml del cultivo y se centrifugaron en un tubo Eppendorf de 1,5 ml a 15.000 rpm (a 4ºC) (Tomy MTX-160) durante 5 minutos. Se decantó el sobrenadante y se retuvo el sedimento. Luego se resuspendieron los sedimentos en buffer de craqueo a DO 0,01 unidades/\mul. Luego las muestras se calentaron a 100ºC en un bloque térmico durante 5 minutos, luego se enfriaron durante 2-3 minutos y luego se cargaron 6 \mul de cada muestra en un gel de poliacrilamida SDS 4-20% de Tris Glicina en un buffer de corrida 1X Tris-Glicina con agregado de SDS 2%. El gel se corrió a 150V durante 1,3 horas. El gel se tiñó con azul coomassie para visualizar la proteína.

Como se ilustra en la Figura 8, que usa NT-3 como gen blanco, la cepa EE11-20 no tiene pérdida detectable en el cultivo de toda la noche (ON) o antes de la inducción (preI), mientras que la BL21(DE3) claramente tiene. Los niveles de inducción para NT-3 son comparables entre cepas. Mirando la Figura 9, que emplea BDNF como gen blanco, la EE11-20 otra vez no muestra pérdida de producto antes de la inducción, aunque BL21(DE3) lo hace claramente. EE11-20 tiene niveles reducidos de BDNF en pET22b que en BL21(DE3). Mirando la Figura 10, se advierte que los niveles de BDNF expresados mediante el vector pAMG25 eran similares para EE11-20 y BL21(DE3). Para cada uno de los experimentos ilustrado sen las Figuras 8-10, la presencia de pLysS redujo la pérdida pero también inhibió la expresión del producto (como se había informado previamente en la bibliografía científica). Finalmente, mirando las Figuras 11 y 12, se observa que EE11-11M no muestra pérdida de producto durante la noche o la preinducción pero produce niveles comparables de proteína en comparación con BL21(DE3). Además, la cepa EE11-11M es superior a la cepa EE11-20 en que la presencia de lac i en el vector no tiene efecto sobre la acumulación de proteínas y en efecto, puede producir niveles mayores de algunos productos (por ej., comparar las Figuras 8 y 12).

Es evidente a partir de estos resultados, que los elementos adicionales que se han introducido para controlar la pérdida de producto en las cepas disponibles en el comercio no son necesarios en las cepas desarrolladas en la presente invención, y la cepa de la presente invención muestra un mayor control de la pérdida y niveles comparables de la expresión de producto después de la inducción.

Ejemplo 6

Para determinar el impacto que la presencia de la proteína de cubierta de MS2 puede tener sobre la expresión de una proteína heteróloga en la fermentación de alta densidad, se examinaron diferentes productos. Inicialmente, las condiciones reflejaron las condiciones que se usaron para la reacción en pequeña escala, un matraz agitador, una inducción de baja densidad óptica. Se usó un cultivo exponencial (densidad óptica = 1,4) de EE11-11M que contiene GCSF en pAMG25 para inocular un fermentador de 10 litros. Este se cultivó a 28ºC a una densidad óptica de 0,8 y se indujo con la adición de IPTG. El cultivo se dejó crecer unas 10 horas adicionales después de la inducción se alcanza una densidad óptica final de 12 y se tomaron las muestras a cada hora. Como se ilustró en la Figura 13, no hay pérdida detectable en la preinducción de GCSF (calle 1) y la proteína se continúa produciendo durante toda la inducción.

Se realizó una segunda fermentación (mediante leptina en pAMG25) para examinar el rendimiento de la cepa EE11-11M a densidad alta. Se empleó un inóculo exponencial (densidad óptica = 1,32) para comenzar una fermentación de 10 litros. Este se cultivó a una densidad óptica de 10 a 28ºC. Luego el cultivo se indujo con la adición de IPTG. El crecimiento continuó durante 6 horas y el cultivo alcanzó una densidad óptica final de 41. Como se ilustró en la Figura 14, no hay pérdida evidente antes de la inducción y se produjo leptina durante todo el tiempo de inducción.

Estos experimentos muestran que la presencia de la proteína de cubierta de MS2 no tiene impacto negativo en al fermentación a gran escala o de alta densidad.

Ejemplo 7

Este Ejemplo describe el uso del sistema MS2 para clonar diferentes genes temprano T7. Los genes T7 se clonan solos y como un operón.

Los genes tempranos 0.4 y 0.6 del bacteriófago T7 se amplificaron por PCR mediante el ADN -356 de T7; Studier et al., J. Mol. Biol., 135:917-937 (1979); Dunn & Studier, J. Mol. Biol., 166:477-535 (1983) como un templado. Cada gen se construyó por PCR para tener un sitio EcoRI adyacente al primer codón del gen (oligonucleótidos 1049-5 y 1049-7) (ver Tabla 1), y se clonaron en pAMG13 que ha sido modificado para contener un sitio de reconocimiento de la proteína de cubierta de MS2 y una cola de polihistidina en marco con la región de clonación múltiple (oligonucleótidos 1035-30 y 1035-31) (ver Tabla 1). Se usaron oligonucleótidos 1482-18 y 1266-69 (ver Tabla 1) para el gen 0.4 y los oligonucleótidos 1266-71 y 1443-41 (ver Tabla 1) para el gen 0.6.

La proteína de cubierta de MS2 se proporcionó en forma trans de pRIN10. Las células electrocompetentes que contienen pRIN10 se transformaron por ligamientos de genes tempranos con pAMG13. Se identificaron los clones positivos por detección por PCR d colonias transformantes. Los cultivos positivos se incubaron durante la noche como iniciadores para los experimentos de expresión. Los tubos frescos de LS Kan/Cam se inocularon con una dilución de 1:100 (50 \mul a 5 ml) y se cultivaron a 28ºC x con agitación a una DO de aproximadamente 0,7. Estos se indujeron por el cambio a un agitador a 42ºC y la incubación continuó durante 4 horas. Se retiraron alícuotas de 1 ml y se sedimentaron las células. Los sedimentos se resuspendieron en buffer de craqueo a una DO de 0,01 unidades/\mul y se hirvieron durante 5 minutos, luego se enfriaron en hielo y se corrió una alícuota de 6 \mul de cada uno en gel de poliacrilamida con SDS 10-27%.

Luego la proteína se transfirió electroforéticamente a nitrocelulosa. Las transferencias se bloquearon toda la noche en blotto-tween con leche en polvo descremada 2%. Las transferencias se probaron durante una hora con un anticuerpo policlonal derivado de conejo para péptidos sintéticos basados en la secuencia esperada de la proteína. Este suero se diluyó 1 a 2000. Después del lavado las transferencias se probaron con el anticuerpo de asno anti-conejo conjugado con peroxidasa de rábano picante (Amersham) durante 1 hora. Esta se lavó y trató con los reactivos ECL (Amersham) y se expusieron a la película de rayos X. La exposición fue durante 4 minutos. La película se desarrolló mediante un procesador de película Kodak. Como se ilustró en la Figura 15, la expresión del gen 0.4 se obtuvo mediante un sistema controlado por MS2. Del mismo modo, se obtuvo la expresión del gen 0.6 (Figura 16).

Se construyeron dos versiones del gen 0.7: 1) se usaron los oligonucleótidos 1053-66 y 1266-73 (ver Tabla 1) para construir la versión de longitud completa del gen; y 2) los oligonucleótidos 1053-66 y 1266-72 (ver Tabla 1) se usaron para construir una versión truncada del gen. El truncamiento se basó en la versión mutante que había sido aislada mientras se trata de clonar la versión de longitud completa sin un sitio MS2 en una vector de copia única y tiene una mutación ocre en el codón 242. Esta detención temprana es similar a la mutación aislada del fago en el codón 243; Studier, F.W., J. Mol. Biol., 79:227-236 (1973), se demostró que la mutante ha perdido la actividad de corte pero retiene la actividad de quinasa; Michalewicz y Nicholson, Virology, 186:452-462 (1992).

También se construyó un operón de los genes tempranos por PCR secuencial. Los oligonucleótidos 1511-32, 1539-60, 1803-86, 1319-59, 1577-83, 1577-84, 1539-65, 1066-72 y 1435-93 (ver Tabla 1) se diseñaron para tener secuencias que se superponen a los genes adyacentes a cada gen temprano individual y también introduce un sitio MS2 adyacente al sitio de inicio de cada región codificadora. Cada gen se amplificó individualmente por PCR mediante estos oligonucleótidos. Luego se agregaron los genes tempranos juntos en forma secuencial. Los genes 0.4 y 0.5 se unieron primero por medio del empleado de ambos como templados y solo se usan los cebadores exteriores. Esto produjo un fragmento 0.4-0.5 que luego se usó con la mitad del templado con el fragmento 0.3 y los demás hasta que se generó una construcción de 0.3 a 0.7 completa, denominada operón 3-7t (SEC ID NO:2) (Figura 17). Para reducir adicionalmente la pérdida de los genes temprano del operón, las secuencias de "caja secuencia abajo" se mutaron en los genes 0.3, 0.6 y 0.7. La mayoría de estos cambios de bases realizados para reducir la homología "caja secuencia abajo"
fueron silentes, a pesar de que se produjo una sustitución conservadora de aminoácidos en cada uno de los genes.

Ejemplo 8

Este Ejemplo describe los resultados de los experimentos en los que el operón 3-7t construido y descrito usado en el Ejemplo 7 se usó para mejorar la expresión de las proteínas heterólogas en E. coli. Se compararon las características de expresión de los siguientes sistemas: 1) NDF alfa/beta clonado en pAMG33,y expresado en E. coli GM221, o con el operón 3-7t en pRIN10 expresado en E. coli GM221; 2) 301-941 TP2 clonado en pAMG22 y expresado en E. coli GM221, o con el operón 3-7t en pRIN10 y expresado en E. coli GM221.

Para cada experimento, se recogieron colonias únicas de las placas y se cultivaron en dos porciones de 5 ml de LB con Kanamicina o LB con Kanamicina y cloranfenicol. Los tubos se agitaron durante la noche a 28ºC. Se emplearon matrices de cuatro litros que contienen 1 litro de 2XYT con Kanamicina o 2XYT con Kanamicina y cloranfenicol. Estos se inocularon con los 10 ml del cultivo iniciador. Estos se cultivaron con agitación a 28ºC a una DO de 0.8. Luego los cultivos se cambiaron a 37ºC con agitación durante 1 hora. Estos luego se cambiaron otra vez a 28ºC y se llevaron a 0,4 mM con IPTG. Estos se cultivaron durante 3 horas adicionales como las muestras retiradas a cada hora. Las muestras de 1 ml se centrifugaron durante 5 minutos a 15K y 4ºC. Se decantó el sobrenadante y le sedimento se congeló. Se diluyeron 500 \mul de cada cultivo en 500 \mul de 2XYT y se tomó la densidad óptica. Los sedimentos luego se descongelaron y resuspendieron en el buffer de craqueo de 0,01 DO unidades/\mul. Luego se cargaron 6 \mul de estos sedimentos craqueados en gel de poliacrilamida SDS (4-20%). Después de la corrida a 150V durante 1,3 horas, se tiñeron los geles con azul coomassie para visualizar las proteínas.

Como se muestra en la Figura 18, la presencia de las proteínas tempranas de T7 protege al NDF alfa/beta de la proteo lisis. Cuando no hay proteínas tempranas de T7 presentes, el NDF alfa/beta está producido por 1 hora de inducción (calle 2) pero ya no detectable por horas de inducción (calle 3). Cuando las proteínas tempranas de T7 están pre-
sentes, hay más NDF alfa/beta detectable y continúa la acumulación durante las 3 horas de la inducción

\hbox{(calles 7-9).}

Como se muestra en la Figura 19 la célula hospedante no produce 301-941 TP2 después de la inducción en ausencia de las proteínas tempranas de T7 (calle 5). Cuando las proteínas tempranas de T7 están presentes, la producción de la proteína después de la inducción aumenta en forma espectacular (calles 2 y 3).

Ejemplo 9

Este ejemplo 9 describe la construcción y examen de una serie de cepas huésped procariotas que han sido manipulados genéticamente para producir concentraciones diferentes de MS2CP. Las cepas huésped tienen el MS2CP unido a un promotor TET modificado insertado en su cromosoma.

Construcción de cepas: Se construyó un casete de la variante de MS2CP-14 unida al promotor TET empleando los oligonucleótidos 1674-96 y 1674-97 (ver Tabla 1). Este casete se clonó en los sitios NotI y BamHI de MMebg para generar MMebg-MS2CP-14. Luego se optimizó el promotor TET en etapas: 1) la región -10 se tomó por consenso con PCR por superposición. Las mitades de mutantes se construyeron mediante los oligonucleótidos 1011-96 con 1784-89 y 1758-66 con 1674-97. Luego las mitades se sometieron a una PCR juntas empleando los oligonucleótidos 1674-96 y 1674-97. Estas luego se reclonaron en MMebg de NotI a BamHI para producir MMebg-MS2CP14 (-10); 2) la región -35 se llevó por consenso a producir un promotor TET completamente optimizado. Esto se realizó otra vez mediante la mitad de la reacción PCR donde el MMebg-MS2CP14 (-10) actuó como templado. Las mitades de mutantes se construyeron mediante un par de oligonucleótidos 1011-96 con 1784-88 y 1803-15 con 1674-97 (ver Tabla 1). Luego las dos mitades se sometieron a una PCR juntas empleando los oligonucleótidos 1674-96 y 1674-97. Este se reclonó en MMebg de NotI a BamHI para producir MMebg-MS2CP14 (completamente optimizado). Los MMebg-MS2CP14 (-10) y MMebg-MS2CP14 (completamente optimizados) presentaron un aumento de la producción de la proteína de cubierta de MS2 por encima de la construcción del promotor de tipo salvaje (pequeño aumento para la (-10) y un muy gran aumento para el complemente optimizado).

Para construir versiones del promotor mutante que podrían liberar niveles del intermediario de la proteína de cubierta de MS2 a las mutantes previamente descritas, se empleó una estrategia para aleatorizar la secuencia del sitio de unión al ribosoma (RBS). La secuencia de la región promotora que contiene el cambio de consenso -10 y el gen de la proteína de cubierta de MS2 hasta el sitio KpnI se usaron para diseñar a los oligonucleótidos 1822-01, 1822-02 y 1863-81. Estos oligonucleótidos se fosforilan y aparean con oligonucleótidos 1821-99, 1822-03, 1822-04 y 1822-05. El producto de ligamiento luego se actúa como templado de PCR mediante los oligonucleótidos 1822.06 y 1822-07. Este fragmento, que ahora está aleatorizado en la secuencia de unión al ribosoma puede ligar desde NotI a BamHI.

Para determinar el efecto de los cambios de sitios de unión al ribosoma sobre la producción de proteínas, se empleó un ensayo de beta galactosidasa. Específicamente, se construyó una fusión MS2CP-14-LacZ por la producción de un fragmento LacZ con los oligonucleótidos 1803-52 y 1803-53 el ligamiento en MMebg-MS2CP-14 desde KpnI a BamHI. Esta construcción contiene el promotor TET de tipo salvaje unido al comienzo del gen de la proteína de cubierta de MS2 que esta fusionado en marco con las dos genes de LacZ de beta galactosidasa. Los fragmentos RBS aleatorizados descritos en el párrafo anterior luego se ligaron en esta construcción desde NotI a KpnI. La fusión inicial y los ligamientos de fusión aleatorizados se integraron en el cromosoma siguiendo el protocolo descrito en el Ejemplo 5. La cepa huésped usada fue F'tet/393eElacZ145N que es deficiente en al actividad de beta galactosidasa. Los lisógenos resueltos se ensayaron para determinar la actividad beta galatosidasa como se describió; Miller, Experiments in molecular genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, páginas 352-355 (1972). Se identificaron una serie de mutantes con niveles variado de actividad. Tres de estas mutantes, números 1, 3 y 15 se seleccionaron para la producción de las cepas. La MMebg-MS2CP-14-LacZ que habían originado a estas cepas particulares digirieron KpnI a BamHI para eliminar la fusión a LacZ. Luego el gen MS2CP-14 se regeneró por ligamiento del fragmento KpnI a BamHI en estos vectores. Las cepas se construyeron a partir de estas tres mutantes y el MMebg-MS2CP-14 (completamente optimizado) por la integración en al cepa huésped 393. las cepas resultantes se denominaron GM315 (mutante1), GM320 (mutante 3), GM340 (mutante 15) y GM350 (completamente optimizado).

Exámenes de cepas para producir MS2CP. Se determinó la capacidad de estas cepas para producir la proteína de cubierta de MS2 por el análisis western de los cultivos exponenciales. Se recogieron colonias de cada cepa de las placas y se usaron para inocular 5 ml de LB. Estas se cultivaron con agitación a 30ºC a una densidad óptica de 0.7. Se tomó un ml de las muestras. Todas la muestras se sedimentaron por centrifugación y los sedimentos se resuspendieron en buffer de craqueo. Después de hervir durante 5 minutos, se corrió una alícuota de 6 \mul de cada muestra en un gel de poliacrilamida SDS 4-20% (Novex). Luego la proteína se transfirió electroforéticamente a nitrocelulosa. Las transferencias se bloquearon toda la noche en blotto-tween con leche en polvo descremada 2% Harlow & Lane, Immunoblotting in Antibodies, A Laboratory Manual, Chapter 12, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1988).. Las transferencias se probaron durante una hora con un anticuerpo policlonal derivado de conejo para la proteína de cubierta de MS2. Después del lavado las transferencias se probaron con el anticuerpo conjugado con peroxidasa de rábano picante anti-conejo burro (Amersham) durante 1 hora. Esta se lavó y trató con los reactivos ECL (Amersham) y se expusieron a la película de rayos X. La película se desarrolló mediante un procesador de película Kodak. Como se muestra en la Figura 20, el nivel de la proteína de cubierta de MS2 expresada en forma pasiva en la fase log de crecimiento es detecta-
ble por encima del umbral de a niveles bajos. en GM315 y GM320 y aumenta considerablemente en GM340 y GM350.

Clonación heteróloga de genes utilizando las cepas. Empleando técnicas convencionales, se halló que las fusiones de la cola his del N-terminal del gen ns5b de la hepatitis C (la Hep C polimerasa I) eran muy difíciles de clonar. Cuando se aislaron las versiones de longitud completa del gen, estas contenían mutaciones que conducían a detenciones tempranas de la traducción o que estaban en el ATG e impedían la iniciación de la traducción por completo. Para facilitar la clonación de este gen, se le unió una secuencia de reconocimiento de MS2 y las los ligamientos se usaron para transformar primero la cepa GM350. Se detectaron insertos de longitud completa, se secuenciaron y se determinó que eran los correctos.

El gen ns5b recombinante marcado con his obtenido de GM350 se colocó luego en el pAMG21 y se usó para transformar GM221, GM315 y GM320 (GM221 no contiene la proteína de cubierta de MS2 mientras que GM315 y GM320 producen niveles más bajos que GM350). Se halló que el gen era estable en las tres líneas celulares.

Luego se determinó la capacidad de diferentes cepas para producir la polimerasa de la hepatitis C marcada en la his. Los cultivos de toda la noche se usaron para inocular 50 ml de 2XYT en matraces erlenmeyer de 250 ml con una dilución de 1 a 100. Estos se cultivaron con agitación a 30ºC a una densidad óptica de 0,6. El vector pAMG21 contiene un promotor lux y de esta manera se logra la producción de la hepatitis C polimerasa por la adición de un autoinductor a una concentración final de 30 ng/ml. La incubación continúa durante 4 horas y se tomaron las muestras. Las células se sedimentaron por centrifugación. Los sedimentos se resuspendieron en 10 ml de PBS y esto de microfluidizó. Las muestras se centrifugaron para separar las fracciones solubles e insolubles. Estas se mezclaron con buffer de craqueo y las muestras se corrieron en geles SDS 4-20%. Después de la corrida a 150V durante 1,3 horas se tiñeron los geles azul coomassie para visualizar las proteínas.

Como se ilustra en la Figura 21, la hepatitis C polimerasa se producen las tres cepas. La mayoría de la proteína producida es insoluble. Puede haber una expresión algo mayor en las cepas que contienen la proteína de cubierta de MS2. Este Ejemplo muestra de este modo una manera en la cual se pueden emplear estas cepas: el mayor productor, GM350, se usa para clonar inicialmente el gen inestable; y una vez que se ha obtenido un clon estable y confirmado como correcto, este se puede transformar en las cepas restantes y también se puede determinar la capacidad para producir el producto proteico además de la estabilidad sustentable del gen.

Ejemplo 10

Este Ejemplo describe la construcción del vector plásmido pAMGuvxs, el vector del plásmido pAMGX y los vectores plásmidos del operón pRIN de T4 usados para desarrollar el sistema basado en el promotor medio de T4.

Los promotores medios de T4 del bacteriófago se construyeron sintéticamente mediante las secuencias publicadas de PuvsX y PX; Hinton, D.M., J. Biol. Chem., 266(27):18034-18044 (1991) (uvsX: oligonucleótidos 1084-66 y 1084-67 (ver Tabla 1), X: oligonucleótidos 1084-58 y 1084-69) (ver Tabla 1). El promotor PuvsX se reconstruyó para eliminar el sitio NdeI, que contiene (oligonucleótidos 1202-11 y 1550-85) (ver Tabla 1). Cada construcción se diseñó para tener sitios de restricción AatII y ClaI. La secuencia base completa de la construcción del promotor PuvsX se ilustra en la Figura 22, y la secuencia génica completa de la construcción del promotor PX se ilustra en la Figura 23. El plásmido pAMG13 se digirió con AatII y ClaI para eliminar el promotor sintético lambda y el vector se purificó por geles. Cada uno de los promotores medios de T4 luego se ligaron con este para crear los vectores de los plásmidos pAMGubsx y pAMGX.

El operón motA/asiA se construyó para que cada gen fuera precedido por una secuencia de reconocimiento de una proteína de cubierta de MS2. Las secuencias publicadas de motA; Uzan et al., Mol. Microbial., 4(9):1487-1496 (1990), y asiA; Orsini et al., Jour. Bacteriology, 175(1):85-93 (1993) se usaron para la construcción. En el comienza del fragmento estaba un sitio XbaI y en el extremo estaba un sitio XhoI (oligonucleótidos 1084-63, 1528-19, 1528-20, y 1733-53)(ver Tabla 1). Este fragmento se digirió con XbaI y XhoI y luego se ligó con varios vectores de plásmidos pRIN para proporcionar, por ejemplo, el vector del plásmido pRIN10 del operón T4, vector del plásmido pRIN11 del operón T4, etc.

Ejemplo 11

Este Ejemplo describe el examen de los vectores del plásmido pAMGuvxs, pAMGX y pRIN del operón T4 y se describen en el Ejemplo 10. Más específicamente, los experimentos de expresión se realizaron para examinar la capacidad de los sistemas para evitar la pérdida y permitir la expresión del producto génico. Se compararon las características de expresión y pérdida de los siguientes sistemas: 1) gen 1 de T7 clonado y expresado en E. coli huésped GM221 (ATCC No de acceso. 202077) que contiene el vector pAMG13 vector (es decir, gen 1 de T7 bajo el control del promotor lambda); 2) gen 1 de T7 clonado y expresado con pRIN del operón T4 en E. coli huésped GM221 que contiene pAMG13; 3) gen 1 de T7 clonado y coexpresado con el pRIN10 del operón T4 en E. coli huésped GM221 que contiene pAMGuvsX (es decir, gen 1 de T7 bajo el control del promotor medio de uvsX T4; 4) gen 1 de T7 clonado y coexpresado con el pRIN11 del operón T4 en E. coli huésped GM221 que contiene pAMGuvsX; 5) NT-3 clonado y coexpresado con el pRIN10 del operón T4 en E. coli huésped GM225 que contiene pAMGuvsX; y 6) BDNF clonado y coexpresado con el pRIN10 del operón T4 en E. coli huésped GM225 que contiene pAMGuvsX.

Para cada experimento, se escogieron colonias únicas de las placas y se cultivaron en 5 ml de 2XYT con cloranfenicol y kanamicina. Los tubos se agitaron durante toda la noche a 28ºC. Se ajustaron tubos de 50 ml con 5 ml de 2XYT con cloranfenicol y kanamicina. Los tubos frescos se inocularon con 50 \mul de los cultivos iniciadores. Estos tubos se cultivaron con agitación a 28ºC a una DO de 0,6-1,2. Los cultivos que contienen el promotor PS4 (pRlN11) se indujeron con 20 \mul de IPTG, mientras que los cultivos que contienen el promotor lambda (pAMG) se indujeron por el cambio a 37ºC o 42ºC. El tiempo de inducción para todos los experimentos de expresión fue de 4,0 horas. Se centrifugó 1 ml de cada cultivo durante 10 minutos. El sobrenadante se decantó y el sedimento se congeló. Se diluyeron 500 \mul de cada cultivo en 500 \mul de 2XYT y se tomó la densidad óptica. Los sedimentos luego se descongelaron y resuspendieron en buffer de craqueo a 0,01 unidades de DO/\mul. Luego se cargaron 6 \mul de estos sedimentos craqueados en gel de poliacrilamida SDS (4-20% o 16%). Después de la corrida a 150V durante 1,3 horas los geles se tiñeron con azul coomassie para visualizar las proteínas.

Los datos de las Figuras 24-29 se pueden sintetizar de la siguiente manera: 1) el vector pAMG13 es capaz, después de la inducción, de producir niveles abundantes de ARN polimerasa de T7 cuando el gen 1 de T7 está bajo el control del promotor lambda (ver calles 3 y 4, Figura 24); 2) los productos proteicos del operón T4 anulan en forma suficiente el reconocimiento del promotor lambda por la ARN polimerasa de E. coli (comparar calles 2 y 3 de la Figura 25 con las calles 3 y 4 de la Figura 24); 3) se pueden obtener abundantes niveles de ARN polimerasa de T7 en pAMGuvsX donde el gen 1 de T7 esta clonado y coexpresado con el pRIN10 del operón de T4 (comparar calles 3 y 4 de la Figura 24 con las calles 2 y 3 de la Figura 25); 4) coexpresión con el pRIN11 del operón T4 es tan efectivo para producir el gen 1 de T7 como es el con el pRIN10 del operón T4 (comparar calles 3 y 4 de la Figura 27 con las calles 2 y 3 de la Figura 26); y 5) también se pueden obtener abundantes niveles de NT-3 y BDNF de pAMGuvsX donde el NT-3/BINF esta clonado y coexpresado con el pRIN10 del operón T4 (comparar Figuras 28 y 29 con la Figura 26).

Ejemplo 12

Este Ejemplo describe la clonación del operón de motA/asiA en plásmidos de copia única que contienen el sistema MS2.

Los vectores de copia única se derivaron del pSC101; Bernardi and Bernardi, Nuc. Acids Res., 12:9415-9426. Este vector se digirió con NdeI y luego se recirculariza para producir el plásmido pSC101dNde. Un ligador de ADN que contiene los sitios Bg1II y NsiI se introdujo en el sitio EcoRI de este plásmido. Un fragmento del pAMG22 de NsiI a Bg1II que contiene T1T2, promotor PS4 y el sitio de clonación múltiple se clonó luego para crear el plásmido pT52. Luego el pTS2 se cortó con M1uI y Xmnl, los extremos se quitaron las puntas mediante un fragmento Klenow; Sambrook et al., Molecular cloning, a laboratory manual, Segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, páginas 5.40-5.41 (1989), y el plásmido se recircularizó para producir pTS2d. Los fragmentos de los vectores de plásmidos pRIN que contienen el promotor blanco, el sitio de reconocimiento MS2, gen MS2CP y el promotor TET se generaron por PCR mediante los oligonucleótidos 828-31 y 1553-72 (ver Tabla 1). Estos fragmentos se digirieron con AatIl y Bg1II y luego se ligaron en pTS2d para crear los vectores de plásmidos pCB (ver la Figura 30). El operón motA/asiA descrito en el Ejemplo 10 luego se clonó en estos vectores plásmidos pCB desde XbaI a XhoI para crear los vectores plásmidos pAw11 (ver la Figura 31).

Otro plásmido de pCB único se construyó mediante el promotor TET mutado para el control de la proteína de cubierta de MS2. Se construyó un casete del gen de la proteína de cubierta de MS2 unida al promotor TET por PCR mediante los oligonucleótidos 1870-97 y 1906-27(ver Tabla 1). Este fragmento se digirió XhoI a Bg1II y se ligó en pTS2d para crear pCB11. El operón motA/asiA descrito en el Ejemplo 10 luego se clonó en este vector desde XbaI a XhoI para crear pAW11 (promotor PS4).

Ejemplo 13

Este Ejemplo describe el examen de los vectores plásmidos pAW preparados y descritos en el Ejemplo 12. Los experimentos de expresión se realizaron en los genes del producto que se clonaron bajo los promotores del T4 uvsX o X. Se compararon las características de expresión y pérdida de los siguientes sistemas: 1) gen 1 de T7 clonado y coexpresado con pAW20 en E. coli GM221 que contiene pAMGX (es decir, el gen 1 de T7 bajo control del promotor T4 X; 2) SPI clonado y coexpresado con pAW20 E. coli GM225 que contiene pAMGX (es decir, SPI bajo control del promotor T4 X; 3) OPG clonado y coexpresado con pAW20 en E. coli GM225 que contiene pAMGuvsX (es decir, OPG bajo el control del promotor T4 uvsX); 4)BDNF clonado y coexpresado con pAW11 en E. coli GM225 que contiene pAMGuvsX (es decir, BDNF bajo el control del promotor T4 uvsX ); 5) OPG clonado y coexpresado con pAW11 en E. coli GM225 que contiene pAMGuvsX (es decir, OPG bajo el control del promotor de T4 X; 6) NT3 clonado y coexpresado con pAW11 en E. coli GM225 que contiene pAMGuvsX (es decir, NT3 bajo el control del promotor T4 uvsX; y 7) 3MNDF clonado y coexpresado con pAW11 en E. coli GM225 que contiene pAMGX (es decir, 3MNDF bajo el control del promotor X de T4).

Para cada experimento se escogieron colonias únicas de las placas y se cultivaron en 5 ml de 2XYT con tetraciclina y kanamicina. Los tubos se agitaron toda la noche a 28ºC. Se ajustaron tubos de 50 ml con 5 ml de 2XYT con tetraciclina y kanamicina. Los tubos frescos se inocularon con 50 \mul de los cultivos iniciadores. Estos tubos se cultivaron con agitación a 28ºC a una DO de 0,6-1,2. Los cultivos que contienen el promotor PS4 y los cultivos que contienen el promotor lac UV5 se indujeron con 20 \mul de IPTG, mientras que los cultivos que contienen el promotor lambda (pAMG) se indujeron por el cambio a 37ºC o 42ºC. El tiempo de inducción para todos los experimentos de expresión fue de 4,0 horas. Se centrifugó 1 ml de cada cultivo durante 10 minutos. El sobrenadante se decantó y el sedimento se congeló. Se diluyeron 500 \mul de cada cultivo en 500 \mul de LB y se tomó la densidad óptica. Los sedimentos luego se descongelaron y resuspendieron en buffer de craqueo 0,01 unidades de DO/\mul. Luego se cargaron 6 \mul de estos sedimentos craqueados en gel de poliacrilamida SDS (4-20% o 16%). Después de la corrida a 150V durante 1,3 horas los geles se tiñeron con azul coomassie para visualizar las proteínas.

Los datos de las Figuras 32-34 se pueden sintetizar de la siguiente manera: 1) se pueden obtener abundantes niveles del gen 1 de T7 en el pAMGX donde el n gen 1 de T7 está clonado y coexpresado con pAW20 (Figura 32); 2) se pueden obtener abundantes niveles de SPI en el pAMGX donde SPI está clonado y coexpresado con pAW20 (Figura 33); y 3) se pueden obtener abundantes niveles de OPG en pAMGuvsX donde OPG está clonado y coexpresado con pAW20 (Figura 34).

Los datos de las Figuras 35-38 se pueden sintetizar de la siguiente manera: 1) se pueden obtener abundantes niveles de BDNF en pAMGuvsX donde BDNF está clonado y coexpresado con pAW11 (Figura 35); 2) se pueden obtener abundantes niveles de OPG en el pAMGuvsX donde OPG está clonado y coexpresado con pAW11 (Figura 36); 3) se pueden obtener abundantes niveles de NT3 en pAMGuvsx donde NT3 está clonado y coexpresado con pAW11 (Figura 37); 4) se pueden obtener abundantes niveles de 3MNDF en pAMGX donde 3MNDF está clonado y coexpresado con pAW11 (Figura 38).

Debido a que el examen con los plásmidos pAW de copia única proporciona un sistema similar al que se produciría si el casete de T4 basado en MS2 se colocara en el cromosoma, está contemplado por la presente invención que cada uno de los elementos promotores medios de MS2-T4 requeridos se podrían colocar en el cromosoma de la célula hospedante para proporcionar un sistema efectivo de control ajustado.

Ejemplo 14

Este Ejemplo describe el uso de un sistema de T4 basado en MS2 para expresar en forma efectiva una proteína accesoria y por lo tanto mejora la expresión de una proteína blanco.

Un operón de T4 que contenía motA y asiA se construyó por PCR para tener un sitio XhoI en el comienzo, seguido por un sitio de reconocimiento de MS2 y un sitio BamHI en el extremo del gen asiA que está también precedido por un sitio de reconocimiento de MS2 (oligonucleótidos 1351-01 y 1260-86) (ver Tabla 1) Este fragmento luego se clonó en los sitios correspondientes de pRIN10 (que da el pRIN10 del operón de T4).

Se construyó el gen 0.6 de T7 para tener un sitio XbaI seguido por un sitio de reconocimiento de MS2 y finaliza con un sitio XhoI (oligonucleótidos 1443-41 y 1465-31) (ver Tabla 1). Este fragmento 0.6 luego se colocó en el pRIN10 del operón de T4 empelando los sitios correspondientes. Esto produce un plásmido (pRIN10 del operón de T4 0,6) que puede expresar al gen 0.6 y los factores de transcripción de T4. Luego se realizaron los experimentos de expresión (siguiendo el mismo protocolo experimental que se describe en el Ejemplo 11) empleando un sistema donde el BDNF estaba clonado y coexpresado con el pRIN10 del operón de T4 0,6 en E. coli huésped de GM225 que contiene pAMGuvsX (es decir, BDNF bajo el control del promotor medio de T4 uvsX).

Como se ilustra en la Figura 39, se podrían obtener abundantes niveles de BDNF mediante este sistema y los niveles obtenidos fueron superiores a los que se obtuvieron mediante un sistema del pRIN10 del operón de T4 carente del gen 0.6 (comparar las calles 4 y 5, Figura 29 a las calles 4 y 5, Figura 39). En consecuencia, la proteína accesoria (0.6) aumentó la expresión de la proteína blanco en un sistema de expresión promotor escalonado.

En la siguiente Tabla 1 se proporcionan los oligonucleótidos usados en los Ejemplos descritos en la presente memoria.

TABLA 1

1

2

3

4

5

Depósitos de ADN/células hospedantes

Las células hospedantes de E. coli K-12/GM350 se depositaron con el ATCC (American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, USA) el 20 de enero de 1999.

Las células hospedantes de E. coli K-12/GM225 han sido depositadas con el ATCC (American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, USA) el 27 de enero de 1998, y se asignó el No. de acceso 20281.

Las células hospedantes de E. coli K-12/GM225 que contienen el vector del plásmido pAMG13 han sido depositadas con el ATCC (American Type Culture Collection,120301 Parklawn Drive, Rockville, MD, USA) el 27 de enero de 1998 y se asignó el acceso No. 98641.

Las células hospedantes de E. coli K-12/GM225 que contienen el vector del plásmido pAMG25 han sido depositadas con el ATCC (American Type Culture Collection, 12301 ParklawnDrive, Rockville, MD, USA) el 27 de enero de 1998, y se asignó el acceso No. 98642.

Las células hospedantes de E. coli K-12/GM225 que contienen el vector del plásmido 3002 nahG han sido depositadas con el ATCC (American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, USA) el 27 de enero de 1998, y se asignó el acceso No. 98645.

Las células hospedantes de E. coli K-12/GM225 que contienen el vector del plásmido pRIN10 (wt) ATCC han sido depositadas con el (American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, USA) el 27 de enero de 1998, y se asignó el acceso No. 98639.

Las células hospedantes de E. coli EM11-11M ATCC han sido depositadas con el ATCC (American Type CultureCollection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, USA) el 27 de enero de 1998, y se asignó el acceso No. 202083.

Las células hospedantes de E. coli EE11-20 han sido depositadas con el ATCC (American Type CultureCollection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, USA) el 27 de enero de 1998, y se asignó el acceso No. 202082.

Las células hospedantes de E. coli K-12/GM225 que contienen el vector del plásmido pAMGuvsX han sido depositadas con el ATCC (American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, USA) el 27 de enero de 1998 y se asignó el acceso No. 98644.

Las células hospedantes de E. coli K-12/GM225 que contienen el vector del plásmido pAMGX han sido depositadas con el ATCC (American Type Culture Collection, 12301 ParklawnDrive, Rockville, MD; USA) el 27 de enero de 1998, y se asignó el acceso No. 98643.

Las células hospedantes de E. coli K-12/GM225 que contienen el vector del plásmido pRIN10 del operón T4 han sido depositadas con el ATCC (American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, USA) el 27 de enero de 1998, y se asignó el acceso No. 98640.

Las células hospedantes de E. coli K-12/GM225 que contienen el vector del plásmido pAW20 han sido depositadas con el ATCC (American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, USA) el 27 de enero de 1998, y se asignó el acceso No. 98638.

Las células hospedantes de E. coli K-12/FM-15 que contienen el vector del plásmido pAMG21 se depositaron con el ATCC (American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, USA) y se asignó el acceso No. 98113.

Las células hospedantes de K-12/GM221 que contienen el vector del plásmido pAMG33 se depositaron con el ATCC (American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, USA) el 20 de enero de 1999.

El vector plásmido pAMG22 ha sido depositado con el ATCC (American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, USA) el 28 de enero de 1998, y se asignó el acceso No. 98646.

La presente invención ha sido descrita en términos de realizaciones particulares halladas o propuestas para comprender modos preferidos para la práctica de la invención. Será apreciado por los expertos en la técnica, que a la luz de la presente revelación se pueden realizar numerosas modificaciones y cambios en las realizaciones particulares ejemplificadas sin apartarse del alcance de las reivindicaciones.

<110> BROWN, WILLIAM C.

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\vskip0.400000\baselineskip

<120> EXPRESIÓN CONTROLADA ALTAMENTE EFICIENTE DE GENES EXÓGENOS EN E. COLI

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<130> A-518

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\vskip0.400000\baselineskip

<140> NO ASIGNADO TODAVÍA

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<141> 1999-01-26

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\vskip0.400000\baselineskip

<150> 60/072, 794

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 1998-01-28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 98

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\vskip0.400000\baselineskip

<170> PatentIn Ver. 2.0

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 397

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<212> ADN

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<213> bacteri6fago MS2

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

\vskip1.000000\baselineskip

6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1851

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> bacteriófago de T7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

\vskip1.000000\baselineskip

7

8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 87

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> bacteriófago de T4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 87

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> bacteriófago de T4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucléotido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tatggcttct aacttcactc agttcgtact ggttcac

\hfill

37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucléotido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gccttgtcaa ccagtacgaa ctgagtgaag ttagaagcca

\hfill

40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucléotido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aacggcggta ccggcgatgt aactgttgca ccgtccaact tc

\hfill

42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atttgcgaag ttggacggtg caacagttac atcgccggta cc

\hfill

42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcaaatggcg ttgctgaatg gatttcttcc aactct

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucléotido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gctgcgagag ttggaagaaa tccattcagc aacgcc

\hfill

6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucléotido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgcagccagg cttacaaagt aacttgcagc gttcgccagt cc

\hfill

42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucléotido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgcagaggac tggcgaacgc tgcaagttac tttgtaagcc tg

\hfill

42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucléotido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tctgcacaaa accgaaaata caccatcaag gtagaa

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucléotido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgggacttct accttgatgg tctattttcg gttttg

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtcccgaaag ttgcgaccca gactgtaggc ggtgtcgaac tg

\hfill

42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucléotido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aaccggcagt tcgacaccgc ctaccgtctg ggtcgcaact tt

\hfill

42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucléotido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccggttgctg catggcgcag ctacctgaac atggaa

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucléotido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgtcagttcc atgttcaggt agctgcgcca tgcagc

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucléotido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctgactatcc cgattttcgc aaccaactct gactgtgaac tg

\hfill

42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucléotido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tacgatcagt tcacagtcag agttggttgc gaaaatcggg at

\hfill

42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucléotido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atcgtaaaag ctatgcaggg tctgctaaaa gat

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucléotido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

attgccatct tttagcagac cctgcatagc ttt

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucléotido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggcaatccaa ttccgtccgc aatcgctgca aactctggta tctactaata g

\hfill

51

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 49

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucléotido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gatcctatta gtagatacca gagtttgcac cgattgcgga cggaattgg

\hfill

49

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucléotido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgcaaatggc attgctgaat gg

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucléotido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccattcagca atgccatttg cg

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccaactctga ccgtgaact atcg

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgatcagttc acggtcagag ttgg

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucléotido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agctggtgag ctcgatcatt gggcatacgc atgctgcagc gc

\hfill

42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucléotido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tctaggcgct gcagcatgcg tatgcccaat gatcgagctc acc

\hfill

43

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<313> oligonucléotido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggccaatcgc gaattgacgt cacgttcaga att

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucléotido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggccaattct gaacgtgacg tcaattcgcg att

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucléotido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atgcatcgag ctcgattagg acatggggcc tcgct

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 69

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucléotido

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

11

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 66

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucléotido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

12

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucléotido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gattcccccg ggcaaataaa acgaaaggct cagtcgaaag ac

\hfill

42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucléotido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctgatcgcga cgtcttgtag aaacgcaaaa aggccatccg tcag

\hfill

44

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 63

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 38

13

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucléotido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgggatccgt cattacgcga acgcgaagtc cgactc

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 71

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 40

14

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 41

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggcccagtgc atgcctacgt gggtcctagt cgc

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gatcgcgact aggacccacg taggcatgca ctg

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucléotido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 43

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctgaatacgc tgaggcta

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucléotido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 44

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tcagccagta gtaacctt

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 49

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucléotido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 45

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcgcgcgaat tctttcgatc tactaccaac gtgcaatacg gtctgacc

\hfill

48

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 46

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucléotido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 46

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcgcgcgaat tctttcgaat gaagcactac gttatgccaa tccacacg

\hfill

48

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 61

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucléotido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 47

15

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 61

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 48

16

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 49

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 62

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 49

17

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcgcgcggat ccgagtctat cactcagcag attcta

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 51

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcgcgcggat ccctattatg agatagcgtt cagtgtgttg gc

\hfill

42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 52

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 69

<212 ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 52

\vskip1.000000\baselineskip

18

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 53

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucléotido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 53

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcgcgccggat ccctatcagc ccattaacat tgcgtc

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 54

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucléotido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 54

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcgcgcggat ccctatcatg cgacttcctc gacttc

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 55

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 68

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucléotido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 55

\vskip1.000000\baselineskip

19

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 56

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucléotido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 56

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cacgttggta gtagacatgg gtaatcctca tgttttact cttcatcctc ctcgtactcc

\hfill

60

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 57

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 58

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucléotido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 57

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtcggtaatg ttcatgggta atcctcatgt ttttatgaga tagcgttcag tgtgttgg

\hfill

58

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 58

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 56

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucléotido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 58

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agcatataca tgggtaatcc tcatgtttga gtctatcact cagcagattc taaagc

\hfill

56

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 59

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 59

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctgctgagtg atagactcaa acatgaggat tacccatgta tatgc

\hfill

45

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 63

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 60

20

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 61

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 63

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 61

21

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 62

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 62

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gaacgctatc tcataacgaa acatgaggat tacccatgaa cattaccg

\hfill

48

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 63

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 63

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcgcggatcc ctatcatgcg acttc

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 64

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 66

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 64

22

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 65

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 63

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 65

23

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 66

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 66

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcgcgcgacg tctgatagag tcaatgagtt aaaacacagt gatgttttgc gtaaagagat

\hfill

60

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 67

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 63

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 67

24

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 68

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 63

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 68

25

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 69

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 63

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucléotido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 69

26

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 70

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 63

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucléotido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 70

27

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 71

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucléotido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 71

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgtatcaatg tttttattca tgggtgatcc tc

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 72

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucléotido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 72

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atgaataaaa acattgatac agttcgtg

\hfill

28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 73

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucléotido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 73

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcgcgcctcg agctattatt tgttcgtata catctccagg tatcgata

\hfill

48

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 74

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucléotido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 74

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggatggcctt tttgcgtttc t

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 75

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucléotido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 75

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcgcgcagat ctgaagatct tattaatcag ataaaatatt tctaggcg

\hfill

48

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 76

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 63

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleotiflo

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 76

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,6cm

1000

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 77

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucléotido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 77

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcgcgcggat ccctattatt tgttcgtata catctccagg tatcgata

\hfill

48

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 78

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 65

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucléotido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 78

\hskip0,6cm

28

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 79

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucléotido

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 79

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcgcgcctcg agctattatg agatagcgtt cag

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 80

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucléotido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 80

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcgcgcgcat gcagatctgt atgcccaatg atcgagctgt tgtaattctc

\hfill

50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 81

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucléotido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 81

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcgcgcctcg agccgcggct attagtagat accagagttt gc

\hfill

42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 82

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucléotido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 82

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

caacacccag cggcgctgc gtatcaatga tcgagctgt

\hfill

39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 83

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucléotido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 83

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aagcttactc gaggatccct attagtagat accagagt

\hfill

38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 84

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucléotido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 84

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gctgccgctg ttagtcttcg ttcc

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 85

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucléotido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 85

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctaccgcatt atagcttatc gatgataagc t

\hfill

31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 86

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucléotido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 86

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgataagcta taatgcggta gtttacagtt aaa

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 87

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 58

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucléotido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 87

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttattcctcc ttgcgttagc aatttaactg tgataaacta ccgcattata gcttatcg

\hfill

58

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 88

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 79

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucléotido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 88

\vskip1.000000\baselineskip

29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 89

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucléotido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 89

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccaccaccgg gtaccgtcgt tttacaacgt cgtgactgg

\hfill

39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 90

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 90

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccaccacacg gatccttatt tttgacacca gaccaact

\hfill

38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 91

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 88

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 91

30

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 92

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 92

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gttcgtactg gttgacaacg gcggtaccca cagtgactat atgggtggca

\hfill

50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 93

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 93

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atcgatgata agctgtcaat aatgagaatt

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 94

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 94

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gttagcaatt taactgtgat aaactaccgc

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 95

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 95

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tcaaccagta cgaactgagt gaagttagaa

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 96

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 96

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cagcttatca tcgataagct ataatgcggt agttaatcac

\hfill

40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 97

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 97

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgacacacgg tcaatggttg g

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 98

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> oligonncleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 98

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgccacccat atagtcactg tgg

\hfill

23

Claims (16)

1. Un sistema de represión de la traducción para usar en la clonación o expresión de un gen heterólogo específico, dicho sistema que comprende una proteína del represor de la traducción que codifica una región operativamente unida a un promotor constitutivo, y dicho gen heterólogo operativamente unido a un promotor inducible y un sitio de reconocimiento del represor, y donde el represor de la traducción controla la expresión de dicho gen heterólogo y donde el sitio de unión de la proteína represora incluye la secuencia de unión al ribosoma y el codón de iniciación, pero no cubre regiones codificadoras adicionales del gen heterólogo.

2. El sistema de la reivindicación 1, done dicho represor de la traducción es la proteína de cubierta del bacteriófago MS2 (MS2CP).

3. Un proceso para la clonación o expresión de un gen heterólogo, dicho proceso que comprende:

cultivar en condiciones adecuadas, células hospedantes transformadas con un vector plásmido que comprende un sistema de acuerdo con la reivindicación 1, dicho vector que comprende una secuencia de ADN que codifica un promotor inducible, una secuencia de ADN que codifica dicho gen heterólogo unido a un sitio de reconocimiento del represor de la traducción y a dicho promotor inducible, y una secuencia de ADN que codifica un represor de la traducción operativamente unido a un promotor constitutivo, donde dicho represor de la traducción controla la expresión de dicho gen heterólogo, o

cultivar en condiciones adecuadas, células hospedantes que han sido co-transformadas con un primer vector plásmido que comprende un sistema de acuerdo con la reivindicación 1, dicho vector que comprende una secuencia de ADN que codifica un promotor inducible y dicho gen heterólogo unido a un sitio de reconocimiento del represor de la traducción y a dicho promotor inducible y un segundo vector plásmido que comprende una secuencia de ADN que codifica un represor de la traducción operativamente unido a un promotor constitutivo donde dicho represor de la traducción controla la expresión de dicho gen heterólogo; o

cultivar en condiciones adecuadas, células hospedantes que comprenden un sistema de acuerdo con la reivindicación 1, dichas células que albergan a una secuencia de ADN que codifica un represor de la traducción operativamente unido a un promotor constitutivo, transformado con un vector plásmido, dicho vector que comprende una secuencia de ADN que codifica un promotor inducible, y una secuencia de ADN que codifica dicho gen heterólogo unido a un sitio de reconocimiento del represor de la traducción y a dicho promotor inducible; donde dicho represor de la traducción controla la expresión de dicho gen heterólogo; o

cultivar en condiciones adecuadas, células hospedantes que comprenden un sistema de acuerdo con la reivindicación 1, dichas células que albergan a una secuencia de ADN que codifica un promotor inducible, una secuencia de ADN que codifica dicho gen heterólogo unido a un sitio de reconocimiento del represor de la traducción y a dicho promotor inducible, y a una secuencia de ADN que codifica un represor de la traducción operativamente unido a un promotor constitutivo; donde dicho represor de la traducción controla la expresión de dicho gen heterólogo.

4. Un proceso de la reivindicación 3, donde dicho represor de la traducción es una proteína de cubierta del bacteriófago MS2.

5. Un proceso de la reivindicación 3, donde dicho vector además comprende la SEC ID NO:2.

6. Un sistema de acuerdo con la reivindicación 1, dicho sistema es un "casete del gen 1 de T7 controlado por MS2", dicho casete que comprende una secuencia de ADN que codifica el gen 1 de T7, un promotor inducible, el sitio de reconocimiento de MS2 y el gen de la proteína de cubierta de MS2 bajo el control de un promotor constitutivo, dicho gen 1 de T7 unido a dicho promotor inducible y a dicho sitio de reconocimiento de MS2.

7. Una célula hospedante capaz de expresar el gen heterólogo y tener un "casete del gen 1 de T7 controlado por MS2", de acuerdo con la reivindicación 6, insertado en su cromosoma.

8. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 3, para expresar un gen heterólogo, dicho proceso que comprende:

cultivar en condiciones adecuadas, células hospedantes que tengan un "casete del gen 1 de T7 controlado por MS2", de acuerdo con la reivindicación 6, insertado en su cromosoma y transformado con un vector del plásmido que contiene una secuencia de ADN que codifica el gen heterólogo bajo el control de un promotor de T7.

9. Un proceso de la reivindicación 8, donde dicho gen heterólogo es un gen temprano de T7.

10. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 3 para la clonación o expresión de un gen heterólogo, dicho proceso que comprende:

cultivar en condiciones adecuadas, células hospedantes que han sido co-transformadas con un primer vector plásmido, que comprende un sistema de acuerdo con la reivindicación 1, dicho vector que comprende una secuencia de ADN que codifica dicho gen heterólogo bajo el control del promotor medio de T4, y un segundo vector plásmido que comprende una secuencia de ADN que codifica un promotor inducible, las secuencias génicas motA y asiA, cada una ligada a un sitio de reconocimiento del represor de la traducción y a dicho promotor inducible, y un represor de la traducción operativamente unido a un promotor constitutivo; donde dicho represor de la traducción controla la expresión de dichos genes motA y asiA, y donde dichos genes motA y asiA dirigen la transcripción del promotor medio de T4 mientras inhiben la transcripción de dicho promotor inducible.

11. Un proceso de la reivindicación 10, donde dicho segundo vector plásmido además comprende una secuencia de ADN que codifica una proteína accesoria.

12. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 3 para la clonación o expresión de un gen heterólogo, dicho proceso que comprende:

cultivar en condiciones adecuadas, células hospedantes que comprenden un sistema de acuerdo con la reivindicación 1, dichas células que albergan a una secuencia de ADN que codifica un promotor inducible, las secuencia génicas motA y asiaA cada una ligada a un sitio de reconocimiento del represor de la traducción y a dicho promotor inducible, y un represor de la traducción operativamente unido a un promotor constitutivo, transformado con un vector plásmido que comprende una secuencia de ADN que codifica dicho gen heterólogo unido al promotor medio de T4; donde dicho represor de la traducción controla la expresión de dichos genes motA y asiaA, y donde dichos genes motA y asiaA dirigen la transcripción desde el promotor medio de T4 mientras inhiben la transcripción de dicho promotor inducible.

13. Un proceso de cualquiera de las reivindicaciones 10-12, donde dicho represor de la traducción es una proteína de cubierta del bacteriófago MS2.

14. Un sistema de acuerdo con la reivindicación 1, dicho sistema es un "casete de T4 basado en MS2", dicho casete que comprende una secuencia de ADN que codifica un promotor inducible, las secuencia génicas motA y asiaA cada una ligada al sitio de reconocimiento de MS2 y a dicho promotor inducible, y el gen de la proteína de cubierta de MS2 bajo el control de un promotor constitutivo.

15. Una célula hospedante procariota capaz de expresar un gen heterólogo y que tiene un "casete de T4 basado en MS2", de acuerdo con la reivindicación 14, insertado en su cromosoma.

16. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 3 para la clonación o expresión de un gen heterólogo, dicho proceso que comprende:

cultivar en condiciones adecuadas, células hospedantes que tienen un "casete basado en MS2", de acuerdo con la reivindicación 6 o 14, insertado en su cromosoma y transformadas con un vector de expresión que contiene una secuencia de ADN que codifica dicho gen heterólogo bajo el control de un promotor de T4.