ES2275335T3 - Expresion controlada altamente eficiente de genes exogenos en e.coli. - Google Patents
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Abstract
Un sistema de represión de la traducción para usar en la clonación o expresión de un gen heterólogo específico, dicho sistema que comprende una proteína del represor de la traducción que codifica una región operativamente unida a un promotor constitutivo, y dicho gen heterólogo operativamente unido a un promotor inducible y un sitio de reconocimiento del represor, y donde el represor de la traducción controla la expresión de dicho gen heterólogo y donde el sitio de unión de la proteína represora incluye la secuencia de unión al ribosoma y el codón de iniciación, pero no cubre regiones codificadoras adicionales del gen heterólogo.
Description
Expresión controlada altamente eficiente de
genes exógenos en E. coli.
La presente invención se refiere a un nuevo y
mejorado sistema de vector de expresión de genes capaces de
expresar genes exógenos, que incluyen genes tóxicos, en E.
coli y otras células hospedantes. Más específicamente, la
invención se refiere a sistemas de vectores de expresión de ajustada
regulación altamente eficientes que usan la proteína de cubierta
del bacteriófago MS2 (MS2CP) y el sitio de reconocimiento de MS2
para controlar la traducción del ARNm para cualquier gen clonado en
una célula hospedante. Además, la invención se refiere a los
sistemas de vectores de expresión que usan proteínas con control
transcripcional, por ej. motA y asiA del bacteriófago T4, para
regular la transcripción y proporcionar un sistema de promotor
inducible por etapas que es mucho menos complicado y mucho más
versátil que los sistemas no escalonados previamente descritos
Las células procariotas se han convertido en el
sistema de elección para la expresión de genes clonados que
codifican polipéptidos eucarióticos y procarióticos, y existen
numerosos sistemas de expresión para la expresión de productos
génicos en la bacteria. La expresión de genes en E coli se ha
establecido como la técnica clave para la comprensión de procesos
moleculares y los sistemas de expresión de E. coli se han con
vertido en un método estándar y popular para la producción y
purificación a gran escala de proteínas exógenas. En gran medida,
la tecnología ha proporcionado una fuente de proteínas en una
cantidad y calidad que anteriormente fue difícil o imposible, de
obtener mediante el aislamiento de fuentes naturales.
Se han descrito varios sistemas de expresión
patentados para usar en huéspedes bacterianos. En algunos casos,
los sistemas de expresión descritos se refieren a los sistemas de
expresión generalizados, mientras que en otros casos, el sistema de
expresión patentado se diseña para permitir una regulación
relativamente ajustada, o se adapta individualmente para la
expresión de una proteína particular. Ejemplos de tales patentes
incluyen a la Patente Estadounidense No. 4.767.708 (construcción de
un vector recombinante que contiene una ADN polimerasa I bacteriana
clonada bajo el control de un promotor extraño regulado en forma
positiva); Patente Estadounidense No. 4.503.142 (construcción de
una clase de vectores de clonación y expresión basado en el uso del
promotor/operador lac de E. coli); y la Patente
Estadounidense No. 4.578.355 (uso del promotor P_{L} del
bacteriófago lambda para construir vectores de alto nivel de
expresión).
Otro sistema de expresión ampliamente usado
referido al sistema de expresión del vector pET, emplea la poderosa
ARN polimerasa T7 para transcribir genes de interés; Studier et
al., J. Mol. Biol., 189:113-130 (1986). La ARN
polimerasa T7 altamente selectiva para sus propios promotores y se
desconoce si los promotores T7 están presentes en el ADN de E.
coli. La T7 usa su polimerasa altamente selectiva para dirigir
la transcripción a su propio ADN más que al del ADN huésped durante
la infección y una relativamente pequeña cantidad de ARN polimerasa
T7 proveniente de una copia clonada del gen1 de T7 es suficiente
para dirigir la transcripción de alto nivel de un promotor T7 en un
plásmido multicopia. Además, la ARN polimerasa T7 es por lo menos 5
veces más activo que la polimerasa de E. coli; Id. Muchos
proteínas heterólogas se han expresado con éxito con altos
rendimientos mediante el sistema pET; ver, por ej., Dietrich et
al, Eur. J. Biochem, 201:399-407 (1991);
Lathrop et al., Protein Expr. Purif.,
3:512-517(1992); Aukhil et al., J.
Biol. Chem., 268:2542-2553 (1993).
Desafortunadamente, estos y otros sistemas de
expresión informados todavía sufren, en mayor o menor grado, de
cosas tales como : 1) expresión no inducida que resulta de la
pérdida de promotor; 2) incapacidad para controlar la expresión en
el grado necesario, cuando el producto génico destruirá o bien
dañará seriamente la célula hospedante si se expresa (más
típicamente asociado con la expresión de genes eucarióticos en las
bacterias); 3) la necesidad de depender para inducción de la
expresión de las respuestas bioquímicas o mecanismos de inducción
costosos o bien inadecuados; 4) incapacidad de expresar el gen de
interés en un nivel suficiente y 5) inestabilidad del plásmido.
Hasta que tales problemas se resuelvan adecuadamente y se superen
con éxito, no se podrá apreciar o utilizar el pleno potencial de
tales sistemas de expresión.
Todos los sistemas de promotores inducibles
tienen un nivel residual de actividad o "pérdida de actividad"
que conduce a una transcripción y expresión inadecuada de los genes
que se clonan bajo el control del promotor. En la mayoría de los
casos, esto no constituye un problema porque el producto génico
producido es bien tolerado por la célula, i.e., el producto génico
no es tóxico. Sien embargo, en los casos en el producto génico
producid es tóxico o incluso letal para la célula, aun pequeñas
proporciones de expresión puede ser perjudiciales. En efecto,
existen ciertos genes tóxicos que han sido caracterizados como
"inclonable" porque ellos son inestables en cualquier vector
de clonación.
Studier, F.W., J. Mol. Biol.,
219:37-44(1991) resolvieron el
problema de la expresión defectuosa en los vectores pET por el
desarrollo de la serie de vectores Lys. estos vectores albergan los
genes para la lisozima T7, que se une a la ARN polimerasa T7
presente en la célula no inducida e impide que esta se transcriba a
los genes blanco. Dubendorff y Studier, J. Mol Biol,
219;45-59(1991), resolvieron el
problema mediante la provisión de copias adicionales de los
elementos de control del operón lac de los plásmidos pET. Brown
et al., Gene, 127;99-103 (1993)
emplearon la inducción mediante la infección con un fago T7 mutante
para clonar con éxito el gen POL3 tóxico. Desafortunadamente, estos
y otros sistemas informados no consiguieron aliviar completamente
el problema de la fuga o evitar los problemas de la inestabilidad
del plásmido y la lisis celular asociada con altos niveles de
lisozima y/o la infección con el fago. Peabody DS, J Biol,
Chemistry, v265,10,1990, páginas 5686-9 describe
células bacterianas CSH1 transformadas con dos promotores
constitutivos.
La presente invención tal como se reivindica,
trata y supera el problema de la pérdida de actividad del promotor
utilizando las capacidades de represión de la traducción de la
proteína de cubierta del bacteriófago M52. El bacteriófago M52 es
un fago que contiene ARN con un ciclo de vida relativamente simple;
Van Duin, J., Single-Stranded RNA Bacteriophages in
the Bacteriophage Capítulo 4, págs. 117-167, Plenum
Press, New York (1988). El ARN codifica cuatro genes, uno de los
cuales es un gen de replicase que copia el genoma, otro de los
cuales es un gen de la proteína cubierta multifuncional. A media
que la concentración de la proteína aumenta en la célula, esta un
dímero y se une a una estructura de horquilla que consiste en el
sitio de unión del ribosoma y ATG del gen de replicasa. Esta unión
luego inhibe también la traducción del gen de replicasa y cambia
efectivamente el ciclo de vida para el empaquetamiento del
genoma.
La secuencia de la proteína de cubierta MS2 ha
sido publicada; Fiers et al., Nature,
260:500-507 (1976), se han aislado y
caracterizado las mutantes de la proteína de cubierta, Peabody &
Ely, Nucleic Acids Research,
20(7):1649-1655 (1992),y la construcción de
un sistema de dos plásmidos para el análisis genético de la
actividad de represión de la traducción de la proteína de cubierta
ha sido descrita; Peabody, D., Journ. of Biol. Chem.,
20(10)':5684-5689 (1990).
El bacteriófago MS2 no es el único fago conocido
que tiene proteínas que se unen al ARN mensajero para inhibir la
traducción. Por ejemplo, la proteína RegA del bacteriófago T4 y la
proteína del gen V de M13 son dos de tales proteínas diferentes.
Sin embargo, la diferencia clave, entre la proteína RegA, la
proteína del gen V y la proteína de cubierta MS2 se relaciona con
el lugar de los sitios de reconocimiento con respecto al sitio de
iniciación de los genes. Por ejemplo, el sitio de reconocimiento de
la proteína RegA comprende secuencias de la región codificadora del
gen, de este modo se limita los genes que se pueden controlar con
esta. La proteína del gen V reconoce una secuencia corriente arriba
de la secuencia de unión al ribosoma y de este modo aún puede
permitir un bajo nivel de iniciación de traducción. Para MS2, el
sitio de unión no cubre las regiones codificadoras del gen pero
incluye la secuencia de unión al ribosomas y el codón de iniciación.
El sistema de MS2 de esta manera permite la represión más ajustada
posible mientras que todavía permite que el sitio sea usado en
forma universal.
El uso específico del sitio de reconocimiento de
MS2CP y MS2 se describirá con más detalle en los ejemplos
proporcionados en la presente memoria. tal como se demuestra en los
ejemplos, el uso único del sistema MS2 permite a un experto en el
arte resolver efectivamente el problema de la pérdida de productor
asociada con la expresión de los genes heterólogos en la bacteria.
Desde el punto de vista de la producción comercial, es
particularmente útil porque generalmente no es favorable la pérdida
de producto antes del punto de inducción. Y, como se relaciona con
la capacidad de expresar en forma efectivamente los genes tóxicos,
puede ser muy útil para los que trabajan en el campo, como algunos
de estos genes, expresado en cantidades limitadas, pueden tener
efectos benéficos.
Otro aspecto importante del diseño del sistema
de expresión bacteriano es la regulación de la transcripción. Se
sabe que en muchos organismos el tempo de la expresión génica se
regula por la producción de proteínas específicas de control de la
transcripción. Esto es particularmente cierto para varios
bacteriófagos diferentes, ya que la evolución de sus ciclos de vida
está regulada por la aparición de diferentes proteínas de
transcripción que conducen a la expresión de todas las clases de
genes correspondientes a este estadio de desarrollo. Por ejemplo,
se ha sabido durante mucho tiempo que el bacteriófago T4 atraviesa
su ciclo vital de esta manera, y recientemente se han dilucidado
los mecanismos reales; Brody et al., FEMS Micro. Letters,
128:1-8 (1995). Este fago lítico tiene tres
clases de genes: temprano, medio y tardío. Los promotores de genes
tempranos son muy similares a los promotores potentes de E.
coli y son reconocidos inmediatamente después de la infección
por la ARN polimerasa. La acumulación de dos productos génicos
tempranos, motA y asiA, cambia la transcripción al modo medio.
La proteína motA es una proteína de 23,5 kDa que
guía a la ARN polimerasa a los promotores del medio de T4 al
reconocer la secuencia de la región -30 de los promotores. La
proteína asiA es una proteína de 10,5 kDa que originalmente se la
consideraba una proteína del factor anti-sigma, es
decir, que se unía al sigma 70 de E. coli y la hacía no
funcional. Ahora se sabe, sin embargo, que la unión de asiA asigma
70 en realidad causa un cambio conformacional que anula el
reconocimiento de la región -35 de los promotores de E. coli,
y la proteína asiA puede actuar como un puente entre la proteína
motA y la subunidad sigma 70. Además, la proteína asiA también
inhibe el reconocimiento de los promotores tempranos de T4. Las motA
y asiA son necesarias y suficientes para especificar la
transcripción de los promotores medios de T4. Estos detalles se han
determinado en ensayos de transcripción in vitro que emplean
motA y asiA purificadas y ARN polimerasa de E coli no
modificada; Ouhammouch et al., Proc. Natl. Acad.
92:1451-1455 (1995).
La presente invención proporciona un nuevo uso
de los promotores medios T4 para regular la transcripción de
cualquier gen clonado en una célula hospedante procariota. Las
principales ventajas de este sistema promotor es que dirige la
transcripción de los promotores específicos mientras que inhibe la
transcripción de los promotores de E. coli, y de este modo
minimiza la competición por el aparato de traducción e inhibe a la
célula que responde a la producción de proteína blanco por la
inducción de la transcripción de los genes de las proteasas.
Mediante el sistema del promotor medio de T4 descrito en la
presente memoria, también es posible expresar ciertas proteínas
accesorias antes de la inducción de la proteína blanco en un ciclo
de expresión "escalonado" que se puede inducir por una señal
única, de este modo se reduce la complicada naturaleza de los
protocolos de expresión actuales que generalmente requieren
múltiples eventos de inducción para obtener tal expresión. Los
sistemas específicos del promotor medio de T4 se describen en los
ejemplos proporcionados en la presente memoria.
La presente invención, mediante la utilización
del sistema MS2 para regular ajustadamente la traducción, y la
utilización del promotor medio T4 para regular la transcripción,
proporciona sistemas de vectores de expresión, regulados
ajustadamente altamente eficientes capaces de expresar genes
exógenos, que incluyen a los genes tóxicos, en E. coli y
otras células hospedantes. Los sistemas descritos en la presente
memoria, además de resolver los problemas asociados con otros
sistemas conocidos proporciona, por primera vez, sistemas de
promotores escalonados que son mucho más versátiles que los
sistemas previamente descritos. Estos sistemas serán de gran valor
para los que trabajan en el área del diseño de sistemas de expresión
en bacterias.
La presente invención, tal como se reivindica,
proporciona un sistema de represión de la traducción para uso en la
clonación o expresión de un gen heterólogo en células hospedantes,
dicho sistema comprende un represor de la traducción operativamente
unido a un promotor constitutivo. En una realización preferida, el
represor de traducción es una proteína de cubierta de MS2.
La invención además proporciona, tal como se
reivindica un proceso mejorado para la clonación o expresión de un
gen heterólogo, dicho proceso comprende el cultivo; en condiciones
adecuadas, de células hospedantes transformadas con un vector
plásmido, dicho vector comprende una secuencia de ADN que codifica
un promotor inducible, una secuencia de ADN que codifica un gen
heterólogo unido a un sitio de reconocimiento de represión de la
traducción, y una secuencia de ADN que codifica un represor de la
traducción operativamente unido a un promotor constitutivo; donde
dicho represor de la traducción controla la expresión de dicho gen
heterólogo. En una realización preferida, el represor de la
traducción es una proteína de cubierta MS2. En una realización, el
vector también comprende una secuencia de ADN que codifica a genes
tempranos 0.3 y 0.7 del bacteriófago T7 (SEC ID NO:2).
La invención además proporciona, tal como se
reivindica, un proceso mejorado para la clonación o expresión de un
gen heterólogo, dicho proceso comprende el cultivo; en condiciones
adecuadas, de células hospedantes que han sido
co-transformados con un primer vector plásmido que
comprende una secuencia de ADN que codifica un promotor y dicho gen
heterólogo unido a un sitio de reconocimiento de represión de
traducción y un segundo vector plásmido que comprende una secuencia
de ADN que codifica un represor de la traducción operativamente
unido a un promotor constitutivo; donde dicho represor de la
traducción controla la expresión de dicho gen heterólogo. En una
realización preferida, el represor de la traducción es una proteína
de cubierta de MS2.
La invención además proporciona, tal como se
reivindica, un proceso mejorado para la clonación o expresión de un
gen heterólogo, dicho proceso comprende el cultivo; en condiciones
adecuadas, de células hospedantes que albergan una secuencia de ADN
que codifica un represor de la traducción operativamente unido a un
promotor constitutivo, transformado con un vector plásmido, dicho
vector comprende una secuencia de ADN que codifica un promotor
inducible y una secuencia de ADN que codifica dicho gen heterólogo
unido a un sitio de reconocimiento de represión de traducción,
donde dicho represor de la traducción controla la expresión de dicho
gen heterólogo. En una realización preferida, el represor de la
traducción es una proteína de cubierta de MS2.
La invención además proporciona, tal como se
reivindica, un proceso mejorado para la clonación o expresión de un
gen heterólogo, dicho proceso comprende el cultivo; en condiciones
adecuadas, de células hospedantes que albergan una secuencia de ADN
que codifica un promotor inducible que codifica dicho gen heterólogo
unido a un sitio de reconocimiento de represión de traducción y una
secuencia de ADN que codifica un represor de la traducción
operativamente unido a un promotor constitutivo; donde dicho
represor de la traducción controla la expresión de dicho gen
heterólogo. En una realización preferida, el represor de la
traducción es una proteína de cubierta de MS2.
La invención además proporciona tal como se
reivindica, un "casete del gen 1 de T7 controlado por MS2",
dicho casete que comprende una secuencia de ADN que codifica un
promotor inducible, el sitio de reconocimiento de MS2 unido al gen
1 de T7 y el gen de la proteína de cubierta de MS2 bajo el control
de un promotor constitutivo débil.
La invención además proporciona células
hospedantes capaces expresar un gen heterólogo y que alberga un
"casete del gen 1 de T7 controlado por MS2".
La invención además proporciona, tal como se
reivindica, un proceso mejorado para la expresión de un gen
heterólogo, dicho proceso comprende el cultivo en condiciones
adecuadas, células hospedantes que albergan un "casete del gen 1
de T7 controlada por MS2" y transformada con un vector de
expresión que contiene una secuencia de ADN que codifica dicho gen
heterólogo bajo el control de un promotor T7.
La invención además proporciona una serie de
células hospedantes capaces de clonar o expresar un gen heterólogo,
dichas células hospedantes manipuladas genéticamente para producir
concentraciones diferentes de MSC2CP.
La invención además proporciona un sistema de
promotor inducible escalonado para la clonación o expresión de un
gen heterólogo, dicho sistema comprende proteínas de control de
transcripción regulada que dirige la transcripción de promotores
específicos, mientras se inhibe la transcripción general de los
promotores huésped bacterianos. En una realización preferida, las
proteínas de control de transcripción son motA y asiA, y dichas
proteínas está reguladas por MSC2CP.
La invención además proporciona, tal como se
reivindica, un proceso mejorado para la clonación o expresión de un
gen heterólogo, dicho proceso que comprende el cultivo; en
condiciones adecuadas, de células hospedantes que han sido
co-transformados con un primer vector plásmido que
comprende una secuencia de ADN que codifica dicho gen heterólogo
bajo el control unido de un promotor medio T4 y un segundo vector
plásmido que comprende una secuencia de ADN que codifica un
promotor inducible, secuencias de motA y asiA unidas a un sitio de
reconocimiento de represor de la traducción, y un represor de la
traducción operativamente unido a un promotor constitutivo; donde
dicho represor de la de la traducción control la expresión de dichos
genes de motA y asiA y donde dichos genes de motA y asiA dirigen la
transcripción del promotor medio T4 mientras se inhibe la
transcripción de dicho promotor inducible. En una realización
preferida, el represor de la traducción es una proteína de cubierta
MS2. En una realización, el segundo vector del plásmido también
comprende una secuencia de ADN que codifica una proteína
accesoria.
La invención además proporciona, tal como se
reivindica, un proceso mejorado para la clonación o expresión de un
gen heterólogo, dicho proceso que comprende el cultivo; en
condiciones adecuadas, de células hospedantes que albergan una
secuencia de ADN que codifica un promotor inducible, secuencias de
motA y asiA unidas a un sitio de reconocimiento de represor de la
traducción, y un represor de la traducción operativamente unido a
un promotor constitutivo, transformado con un vector del plásmido
que comprende una secuencia de ADN que codifica un gen heterólogo
unido bajo el control T4 del promotor medio; donde dichos represores
de la traducción controlan la expresión de dichos genes de motA y
asiA; y donde dichos genes de motA y asiA dirigen la transcripción
del promotor medio de T4 mientras se inhibe la transcripción de
dicho promotor inducible. En una realización preferida, el represor
de traducción es una proteína de cubierta de MS2.
La invención además proporciona un "casete de
T4 basado en MS2", dicho casete que comprende una secuencia de
ADN que codifica un promotor inducible, secuencias de motA y asiA
unidas a un sitio de reconocimiento de MS2 y el gen de la proteína
de cubierta MS2 bajo el control de un promotor constitutivo.
La invención además proporciona una célula
hospedante procariota capaz de expresar un gen heterólogo y albergar
un "casete de T4 basado en MS2".
La invención además proporciona, tal como se
reivindica, un proceso mejorado para la clonación o expresión de un
gen heterólogo, dicho proceso que, comprende el cultivo; en
condiciones adecuadas, de células hospedantes que albergan un
"casete de T4 basado en MS2" y transformadas con un vector de
expresión que contiene una secuencia de ADN que codifica dicho gen
heterólogo bajo el control de un promotor T4.
La revelación además proporciona la secuencia de
ADN de la SEC ID NO:1 y la secuencia de ADN de la SEC ID NO:2.
La Figura 1 es la secuencia génica completa (SEC
ID NO:1) de la proteína de cubierta de tipo salvaje MS2 en los
sistemas de la presente invención. El gen tiene un sitio NdeI en el
extremo 5' y un sitio BamHI en el extremo 3'.
La Figura 2 es una fotografía de un gel de SDS
que muestra los resultados de los experimentos de expresión
wtMS2CP. La calle 1 es un clon positivo putativo no inducido de las
células hospedantes BL21(DE3) (que contienen el gen wtMS2CP0
en pT7-7) cultivadas a O.D. de 0,6; las calles
2-14 son diferentes clones positivos putativos de
las células hospedantes BL21(DE3) (que contienen el gen
wtMS2CP0 en pT7-7) después de 4 horas de inducción
a 37ºC. La calle 15 es de los marcadores arcoiris Amersham de bajo
rango.
La Figura 3 es un diagrama esquemático de los
vectores plásmidos pRIN desarrollados en la presente invención.
La Figura 4 es una fotografía de una
transferencia western que muestra los resultados de un experimento
de expresión y pérdida realizado con diferentes vectores de
plásmidos pRIN en el cual se clonó el gen 1 de T7. Esta
transferencia particular es un cultivo estacionario durante toda la
noche y cada juego de calles es el gen 1 de gen 1 de T7, más o
menos (m)una caja secuencia arriba del mismo vector. Los
primeros tres conjuntos de calles usan pRIN11 (promotor PS4) con
diferentes MS2CP. Los últimos tres conjuntos de calles usan el
promotor pRIN20 (promotor lac UV5) con diferentes MS2CP. La calle 4
es el marcador de peso molecular Biorad de bajo rango.
La Figura 5 es una fotografía de una
transferencia western que muestra los resultados de un experimento
de expresión y pérdida realizado con diferentes vectores de
plásmidos pRIN en el cual se clonó el gen el gen 1 de T7. Esta
transferencia particular es un cultivo de
pre-inducción de crecimiento exponencial (preI), y
cada juego de calles es el gen 1 de T7, más o menos (m) una caja
secuencia abajo, del mismo vector. Los primeros tres conjuntos de
calles usan pRINII (promotor PS4) con diferentes MS2CP. Los últimos
tres conjuntos de calles usan el promotor RIN20 (promotor lac UV5)
con diferentes MS2CP. La calle 1 es el marcador de peso molecular
Biorad de bajo rango.
La Figura 6 es una fotografía de una
transferencia western que muestra los resultados de un experimento
de expresión y pérdida realizado con varios vectores de plásmidos
pRIN en el cual se clonó el gen 1 de T7. Esta transferencia
particular es un cultivo inducido de IPTG cultivado a 25ºC, y cada
conjunto de calles es una caja secuencia abajo o menos (m) del gen
1 en el mismo vector. Los primeros tres conjuntos de calles usan el
pRIN11 (promotor de PS4) con diferentes MS2CPs. Los últimos tres
conjuntos de calles usan pRIN20. (promotor UV5 lac) con diferentes
MS2CP. La calle 2 es el marcador de peso molecular Biorad de bajo
rango.
La Figura 7 es un diagrama esquemático de un "
casete de T7 basado en MS2".
La Figura 8 es una foto de un gel de SDS que
compara las características de la pérdida y expresión de la cepa
que se comercializa como BL21(DE3) (calles
3-5), la cepa BL21(DE3) que contiene pLysS
como vector secundario (calles 1-2), la cepa
EE11-20 (calles 6-8) y la cepa
E11-20 que contiene pLysS como vector secundario
(calles 9-10). Las comparaciones se basaron en la
expresión de NT-3 como producto génico blanco. Las
calles 1, 5, 6 y 10 representan cultivos durante toda la noche
(ON), las calles 4 y 7 representan cultivos de preinducción (preI) y
las calles 2, 3, 8 y 9 representan cultivos de inducción (mediante
IPTG a 28ºC) (I-28).
La Figura 9 es una foto de un gel de SDS que
compara las características de pérdida y expresión de la cepa
disponible en el comercio BL21(DE3) (calles
3-5), la cepa BL21(DE3) que contiene pLysS
como vector secundario (calles 1-2), la cepa
EE11-20 (calles 6-8), y la cepa
EE11-20 que contiene pLysS como vector secundario
(calles 9-10). Las comparaciones se basaron en la
expresión de BDNF NT-3 como producto génico blanco.
Las calles 1, 5, 6 y 10 representan cultivos durante toda la
noche(ON), las calles 4 y 7 representan cultivos de
preinducción (preI) y las calles 2, 3, 8 y 9 representan cultivos de
inducción (mediante IPTG a 28ºC) (I-28).
La Figura 10 es una foto de un gel de SDS que
compara las características de pérdida y expresión de la cepa
disponible en el comercio BL21(DE3) (calles
3-5), la cepa BL21(DE3) que contiene pLysS
como vector secundario (calles 1-2), la cepa
EE11-20 (calles 6-8), y la cepa
EE11-20 que contiene pLysS como vector secundario
(calles 9-10). Las comparaciones se basaron en la
expresión de BDNF 3 como producto génico blanco. Las calles 1, 5, 6
y 10 representan cultivos durante toda la noche(ON), las
calles 4 y 7 representan cultivos de preinducción (preI) y las
calles 2, 3, 8 y 9 representan cultivos de inducción (mediante IPTG
a 28ºC) (I-28).
La Figura 11 es una foto de un gel de SDS que
compara las características de pérdida y expresión de la cepa
disponible en el comercio BL21(DE3) (calles
5-7); y la cepa EE11-11M (calles
2.-4). Las comparaciones se basaron en la expresión de BDNF como
producto génico blanco. Las calles 4 y 5 representan cultivos
durante toda la noche (ON), las calles 3 y 7 representan cultivos
de preinducción (preI) y las calles 2 y 6 representan cultivos de
inducción (mediante IPTG a 28ºC) (I-28). La calle 1
es el es el marcador de peso molecular Biorad de bajo rango.
La Figura 12 es una foto de un gel de SDS que
compara las características de pérdida y expresión de la cepa
disponible en el comercio EE11-11M que usa la
expresión de NT-3 como producto génico blanco. La
calle 5 representa el cultivo durante toda la noche (ON), la calle
4 representa los cultivos de preinducción (preI) y las calles 2 y 3
representan los cultivos de inducción mediante IPTG a 28ºC
(I-28) o IPTG a 37ºC (1-37). La
calle 1 es el es el marcador de peso molecular Biorad de bajo
rango.
La Figura 13 es una foto de un gel de SDS que
muestra un tiempo de inducción de fermentación de 16 litros de GCSF
en pAMG25 en la cepa EE11-11M. La calle 1 es el
cultivo en el tiempo de inducción. La calle 2 es el cultivo en el
tiempo de inducción. Las calles 3-9 son los cultivos
después de horas adicionales de crecimiento en presencia del
inductor (IPTG), por ej., la calle 3 es después de 1 hora, la calle
4 es después de 2 horas, etc. La calle 10 es la de los marcadores
arcoiris de peso molecular bajo de Amersham. La última calle es un
marcador GCS.
La Figura 14 es una foto de un gel de SDS que
muestra un tiempo de inducción de fermentación de 10 litros de
leptina en pAMG25 en una cepa EE11-11M. La calle 1
es la de los marcadores arcoiris de peso molecular bajo de
Amersham. La calle 2 es el cultivo en el tiempo de inducción. Las
calles 3-8 son los cultivos después de horas
adicionales de crecimiento en presencia del inductor (IPTG), por
ej., la calle 3 es después de 1 hora, la calle 4 es después de 2
horas, etc. La calle 9 es un marcador de leptina.
La Figura 15 es una fotografía de una
transferencia western que muestra los resultados de un experimento
de expresión realizado mediante un sistema basado en MS2 en el cual
se ha clonado el gen temprano 0.4 de T7. Las calles 2, 4, 6 y 8
representan cuatro cultivos diferentes de 0.4 que contienen los
cultivos después de 4 horas de inducción a 42ºC. Las calles 3, 5, 7
y 9 son las muestras no inducidas de los mismos cultivos. La calle
1 es el marcador de peso molecular Biorad de bajo rango
La Figura 16 es una fotografía de un gel de SDS
que muestra los resultados de un experimento de expresión realizado
mediante un sistema basado en MS2 en el cual se ha clonado el gen
temprano 0.6 de T7. Las calles 2 y 4 representan dos 0.6 diferentes
que contienen cultivos no inducidos. Las calles 3 y 5 son las mismas
muestras después de 4 horas de inducción a 42ºC. La calle 1 es el
marcador de peso molecular Biorad de bajo rango.
La Figura 17 es la secuencia génica completa
(SEC 30 ID NO2) del operón 3-7t construido para
contener los genes tempranos (0.3-0.7) de T7.
La Figura 18 es una foto de un gel de SDS que
compara la expresión de NDF alfa/beta en ausencia o presencia de
las proteínas tempranas de T7. El operón 7-t estaba
en pRIN 10 y fue inducido por un cambio de temperatura de 28ºC a
37ºC. NDF alfa/beta estaba en el plásmido pAMG33 y se induce por la
adición de IPTG cuando la temperatura se cambia de vuelta a 28ºC.
La mitad izquierda del gel es un tiempo de NDF alfa/beta en ausencia
de los genes tempranos T7. La calle 1 es después de la inducción de
las proteínas tempranas pero antes de la inducción de NDF
alfa/beta. Las calles 2-4 son los cultivos después
de horas adicionales de crecimiento en presencia de un inductor
(IPTG), por ej, calle 2 es después de 1, calles 3 es después de 2
horas, etc. La calle 5 es la de los marcadores arcoiris de peso
molecular bajo de Amersham. La mitad derecha del gel es un tiempo de
expresión NDF alfa/beta en presencia de los genes tempranos T7. La
calle 6 es después de la inducción de las proteínas tempranas antes
de la inducción de NDF alfa/beta. Las calles 7-9 son
los cultivos después de horas adicionales de crecimiento en
presencia de un inductor (IPTG).
La Figura 19 es una foto de una transferencia
western de un gel que compara la expresión de una versión truncada
de la subunidad de telomerasa humana TP2 (301-941
TP2) en presencia o ausencia de las proteínas tempranas T7. El
operón 3-7t estaba en pRIN10 y fue inducido por un
cambio de temperatura de 28ºC a 37ºC. La 301-941
TP2 estaba en un plásmido pAMG22 y se induce por la adición de IPTG
cuando la temperatura cambia de nuevo a 28ºC. La calle 1 es una
muestra de preinducción de 301-941 TP2 en presencia
de las proteínas tempranas de T7. La calle 2 es la expresión de
301-941 TP2 después de 2 horas de inducción en
presencia de las proteínas tempranas de T7 a 28ºC. La calle 3 es la
expresión de 301-941 TP2 después de 2 horas de
inducción en presencia de las proteínas tempranas de T7 a 37ºC. La
calle 4 es una muestra de preinducción de 301-941
TP2 en ausencia de las proteínas tempranas de T7. La calle 5 es la
expresión de 301-941 TP2 después de 2 horas de
inducción en ausencia de las proteínas tempranas de T7 a 37ºC.
La Figura 20 es una foto de una transferencia
western de un gel que muestra la producción pasiva de variados
niveles de la proteína de cubierta de MS2 por las cepas GM315,
GM320, GM340 y GM350. las cepas se comparan contra la cepa
progenitora de la cual se construyeron. La calle 1 representa un
cultivo en fase log de GM315. Las calles 2, 4, 6, 8 y 10 son cepas
progenitoras 393. Las calles 3 y 5 son GM320, la calle 7 es GM340,
y la calle 9 es GM350.
La Figura 21 es una foto de un gel que muestra
la expresión de la Hepatitis C polimerasa (HepCpol) en cepas que
tienen variados niveles de la proteína de cubierta de MS2 (también
comparan las fracciones solubles e insolubles de cada experimento
de expresión). La calle 1 es la de los marcadores de peso molecular.
La calle 2 es un extracto de célula total de un cultivo inducido de
HepCpol en pAMG21 expresado en una cepa GM221 que contiene la
proteína de cubierta de MS2. La calle 3 es la fracción insoluble de
este experimento y la calle 4 es la fracción soluble. La calle 5 es
un extracto celular total de un cultivo inducido de HepCpol en
pAMG21 expresado en la cepa GM315 que contiene la proteína de
cubierta de MS2. La calle 6 es la fracción insoluble de este
experimento y la calle 7 es la fracción soluble. La calle 8 es un
extracto celular total de un cultivo inducido de HepCpol en pAMG21
expresado en la cepa GM320 que contiene más proteína de cubierta de
MS2 que en GM315. La calle 9 es la fracción insoluble de este
experimento y la calle 10 es la fracción soluble.
La Figura 22 es la secuencia de ADN completa
(SEC ID NO:3) del promotor medio de T4 PuvsX usado en los sistemas
de la presente invención. El gen tiene un sitio AatII en el extremo
5' y un sitio ClaI en el extremo 3'.
La Figura 23 es la secuencia de ADN completa
(SEC ID NO:4) del promotor medio de T4 PX usado en los sistemas de
la presente invención. El gen tiene un sitio AatII en el extremo 5'
y un sitio ClaI en el extremo 3'.
La Figura 24 es una foto de un gel de SDS que
muestra las características de pérdida y expresión de pAMG13
mediante la expresión del gen 1 de T7 (bajo el control de un
promotor lambda) como producto génico blanco. La calle 5 representa
una muestra estacionaria que creció durante la noche a 28ºC, la
calle 4 representa una muestra que fue inducida durante 4 horas a
42ºC, la calle 3 representa una muestra que fue inducida durante 4
horas a 37ºC, la calle 2 representa una muestra no inducida que
creció a 26ºC a una D:O de 0.6, y la calle 1 es el marcador de peso
molecular Biorad de bajo rango.
La Figura 25 es una foto de un gel de SDS que
muestra las características de pérdida y expresión de pAMG13 en el
cual el gen 1 de T7 se coexpresó con el operón T4 del pRIN10. La
calle 4 representa una muestra estacionaria que creció durante la
noche a 28ºC, la calle 3 representa una muestra que fue inducida
durante 4 horas a 42ºC, la calle 2 representa una muestra que fue
inducida durante 4 horas a 37ºC, y la calle 1 representa una muestra
no inducida que creció a 28ºC a una D.O de 0,6.
La Figura 26 es una foto de un gel de SDS que
muestra las características de pérdida y expresión de pAMGuvsX en
el cual el gen 1 de T7 (bajo el control del promotor medio uvsXT4)
se coexpresó con el operón T4 de pRIN10. La calle 4 representa una
muestra estacionaria que creció durante la noche a 28ºC, la calle 3
representa una muestra que fue inducida a 42ºC, la calle 2
representa una muestra que fue inducida durante 4 horas a 37ºC, y
la calle 1 representa una muestra no inducida que creció a 28ºC a
una D.O de 0,6.
La Figura 27 es una foto de un gel de SDS que
muestra las características de pérdida y expresión de pAMGuvsX en
el cual el gen 1 de T7 se coexpresó con el operón T4 de pRIN11. La
calle 5 representa una muestra estacionaria que creció durante la
noche a 28ºC, la calle 4 representa una muestra que fue inducida a
42ºC, la calle 3 representa una muestra que fue inducida durante 4
horas a 37ºC, la calle 2 representa una muestra no inducida que
creció a 28ºC a una D.O de 0,6 y la calle 1 es el marcador de peso
molecular Biorad de bajo rango.
La Figura 28 es una foto de un gel de SDS que
muestra las características de pérdida y expresión de pAMGuvSX en
el cual NT-3 (bajo el control del promotor medio
uvsX T4) se coexpresó con el operón T4 de pRIN10. La calle 4
representa una muestra que fue inducida a 42ºC, la calle 3
representa una muestra que fue inducida durante 4 horas a 37ºC, la
calle 2 representa una muestra no inducida que creció a 28ºC a una
D.O de 0,6 y la calle 1 es el marcador de peso molecular Biorad de
bajo rango.
La Figura 29 es una foto de un gel de SDS que
muestra las características de pérdida y expresión de pAMGuvSX en
el cual BDNF (bajo el control del promotor medio uvsX T4) se
coexpresó con el operón T4 de pRIN10. La calle 5 representa una
muestra que fue inducida a 42ºC, la calle 3 representa una muestra
que fue inducida durante 4 horas a 37ºC, la calle 3 representa una
muestra que fue inducida a 28ºC, la calle 2 representa una muestra
no inducida que creció a 28ºC a una D.O de 0,6 y la calle 1 es el
marcador de peso molecular Biorad de bajo rango.
La Figura 30 es un diagrama esquemático de los
vectores plásmidos pCB desarrollados en la presente invención.
La Figura 31 es un diagrama esquemático de los
vectores plásmidos pAW desarrollados en la presente invención.
La Figura 32 es una foto de un gel de SDS que
muestra las características de pérdida y expresión de pAMGX en el
cual el gen 1 de T7 (bajo el control de l promotor medio T4 X) se
coexpresó con pAW20. La calle 4 representa una muestra estacionaria
que creció durante la noche a 28ºC, la calle 3 representa una
muestra que fue inducida durante 4 horas a 28ºC, la calle 2
representa una muestra no inducida que creció a 28ºC a una D.O de
0,6 y la calle 1 es el marcador de peso molecular Biorad de bajo
rango.
La Figura 33 es una foto de un gel de SDS que
muestra las características de pérdida y expresión de pAMGX en el
cual el SPI (bajo el control del promotor medio T4 X) se coexpresó
con pAW20. La calle 3 representa una muestra que fue inducida
durante 4 horas a 28ºC, la calle 2 representa una muestra no
inducida que creció a 28ºC a una D.O de 0,6 y la calle 1 es el
marcador de peso molecular Biorad de bajo rango.
La Figura 34 es una foto de un gel de SDS que
muestra las características de pérdida y expresión de pAMGUVSY en
el cual OPG (bajo el control del promotor medio de uvsX T4) se
coexpresó con pAW20. La calle 4 representa una muestra que fue
inducida durante 4 horas a 28ºC, la calle 2 representa una muestra
no inducida que creció a 28ºC a una D.O de 0,6 y la calle 1 es el
marcador de peso molecular Biorad de bajo rango.
La Figura 35 es una foto de un gel de SDS que
muestra las características de pérdida y expresión de pAMGuvsX en
el cual BDNF (bajo el control del promotor medio de uvsX T4) se
coexpresó con pAW11. La calle 1 representa una muestra no inducida,
la calle 2 representa una muestra inducida a 28ºC durante 4 horas y
la calle 3 representa una muestra inducida a 37ºC durante 4
horas.
La Figura 36 es una foto de un gel de SDS que
muestra las características de pérdida y expresión de pAMGuvsX en
el cual OPG (bajo el control del promotor medio de uvsX T4) se
coexpresó con pAW11. La calle 1 es la de los marcadores arcoiris de
peso molecular bajo de Amersham. La calle 2 representa una muestra
no inducida, la calle 3 representa una muestra inducida a 28ºC
durante 4 horas y la calle 4 representa una muestra inducida a 37ºC
durante 4 horas.
La Figura 37 es una foto de un gel de SDS que
muestra las características de pérdida y expresión de pAMGuvsX en
el cual NT3 OPG (bajo el control del promotor medio de uvsX T4) se
coexpresó con pAW11. La calle 1 representa una muestra no inducida,
la calle 2 representa una muestra inducida a 28ºC durante 4 horas y
la calle 3 representa una muestra inducida a 37ºC durante 4
horas.
La Figura 38 es una foto de un gel de SDS que
muestra las características de pérdida y expresión de pAMGX en el
cual 3MNDF(bajo el control del promotor medio de X T4) se
coexpresó con pAW11. La calle 1 representa una muestra no inducida,
la calle 2 representa una muestra inducida a 28ºC durante 4 horas y
la calle 3 representa una muestra inducida a 37ºC durante 4
horas.
La Figura 39 es una foto de un gel de SDS que
muestra las características de pérdida y expresión de pAMGuvsX en
el cual BDNF (bajo el control del promotor medio T4 uvsX) se
coexpresó con un operón T4 pRIN10 que también contenía el gen 0.6
como proteína accesoria. La calle 5 representa una muestra que fue
inducida durante 4 horas a 42ºC, la calle 4 representa una muestra
que fue inducida durante 4 horas a 37ºC, la calle 3 representa una
muestra inducida a 28ºC durante 4 horas a 28ºC, la calle 2
representa una muestra no inducida que creció a 28ºC a una D.O de
0,6 y la calle 1 es el marcador de peso molecular Biorad de bajo
rango.
Para los propósitos de la presente invención, un
"represor de la traducción" se define como una proteína capaz
de unirse en forma específica a un sitio de reconocimiento en una
porción de ARN e inhibir la traducción. En la presente invención,
los sitios de reconocimiento de las proteínas de cubierta de MS2 y
MS2 se usan para proporcionar un sistema del represor de
traducción. Brevemente, la secuencia publicada de la MS2CP se usó
para generar oligonucleótidos de los cuales se construyó el gen
intacto. Luego, después de determinar que MS2CP fue tolerada a muy
altos niveles en la E. coli sin ningún efecto aparente sobre
el crecimiento celular, se colocó MS2CP bajo el control de un
promotor constitutivo débil en plásmidos de variado número de
copias. La idea consistió en producir en forma continua bajos
niveles de MS2CP para que cualquiera de los genes clonados que
tienen un sitio de reconocimiento MS2 se pudieran mantener
completamente silentes hasta que fuera útil expresarlos.
Mediante este enfoque, se demostró que este
sistema basado en MS2 se podría usar para proporcionar un sistema
mejorado controlado en forma ajustada que incluye, por ej., el gen
de la ARN polimerasa de T7. El gen 1 de T7 clonado proporciona una
fuente de ARN polimerasa de T7 para dirigir la expresión selectiva
de alto nivel de los genes blanco bajo el control de un promotor
T7. Sin embargo, debido a que la ARN polimerasa de T7 es tan activa
y selectiva, es importante controlar los niveles basales de ARN
polimerasa de T7 activa, es decir cortar el gen 1 de T7 en el
estado no inducido, para impedir la expresión prematura del gen
blanco.
La estrategia usada en la presente invención, de
este modo, incluye la clonación del gen 1 de T7con un sitio de
reconocimiento MS2 unido a su secuencia codificadora, y la inserción
de esta construcción en el cromosoma junto con una copia de la
proteína de cubierta de MS2 bajo el control de un promotor
constitutivo débil. Los dos genes se clonaron cola a cola para que
los promotores para cada uno de ellos se orientaran en direcciones
opuestas. Luego se demostró que las células hospedantes que
contienen una copia cromosómica de esta construcción del "gen 1
de T7 controlado por MS2" permiten la producción efectiva de la
ARN polimerasa de T7 que se luego se puede usar para conducir la
expresión de un gen blanco.
Los genes blanco se examinaron con éxito en el
sistema de la presente invención incluyeron el gen 1 de T7, factor
neutrófico 3 (NT-3), factor neutrófico derivado del
cerebro (BDNF), inhibidor de serina proteasa (SPI) y
osteoprotegrina (OPG), factor de diferenciación neu (NDF) alfa/beta,
polimerasa de hepatitis C, telomerasa humana y análogos de
derivados y variantes de los mismos. Está contemplado que los
diferentes sistemas controlados por MS2 pueden proporcionar un
mejor control para cualquier gen clonado, tóxico o no tóxico, en una
células hospedantes procariota.
Además se demostró que el sistema basado en MS2
se podría usar en forma estable y expresar ciertos genes tóxicos.
Como se usó en la presente memoria, un gen tóxico es cualquier gen
cuya expresión en la célula hospedante impedirá que la célula
hospedante en cultivo logre el crecimiento logarítmico normal que
hubiera logrado si no fuera por la expresión del gen tóxico. Como
ejemplo de la presente invención, los genes tempranos del
bacteriófago T7 se clonaron y expresaron, cono motA y asiA. Se sabe
que varios de los genes tempranos del bacteriófago T7 son tóxicos;
Studier and Rosenberg, J. Mol. Biol.,
153:503-525 (1981). El gen 0.7, en
particular, es letal ya que codifica una función que inhibe la ARN
polimerasa de E coli. Actualmente también se sabe que motA y
asiA son tóxicos; Hinton et al., Methods in Enzymol,
274:43-57 (1996). La capacidad para expresar
tales genes es de valor significativo debido a que se ha demostrado
que algunos de estos genes tiene un efecto positivo sobre la
expresión del gen heterólogo en E. coli por infección con un
fago. En otras palabras, hay ocasiones en que es útil tener una
copia de estos genes clonados presente en la célula para la
expresión inmediatamente antes de la expresión del gen blanco.
En los ejemplos proporcionados en la presente
memoria, el gen 1 de T7 estaba bajo el control del promotor lac
UV5; Fuller, F., Gene, 19:43-54
(1982), el promotor PS4; WO 95/267246 (Bartley et al.),
publicado el 12 de octubre de 1995, y el promotor; Patente
Estadounidense No. 5.196.318 (Baldwin et al.), presentada el
23 de marzo de 1993. En gran medida, sin embargo, el gen 1 de T7
podía haber estado bajo el control de cualquier promotor inducible,
que incluye los promotores bacterianos tales como trp-, o lpp-;
promotores de fago tales como lambda P_{L} o P_{R}; o
promotores sintéticos tales como tac o trc.
También se desarrollan y describen en la
presente memoria como efectivas para el sistema de la presente
invención las formas mutantes de la MS2CP. Por ejemplo, se
construyó una versión mutante de la MS2CP en la cual el codón para
el residuo de valina en la posición 29 se ha cambiado por un codón
para isoleucina. Esta mutación origina la capacidad de los dímeros
de la proteína de cubierta para asociarse en los agregados de tamaño
de la cápside; Peabody, D.S. and Ely, R., Nuc. Acid Res:,
22(7):1649-1555 (1992). Debido a que las
proteínas de cubierta se unen a su ARNm blanco como un dímero y se
considera que la multimerización de dímeros inhibe la asociación
con el ARNm, se debería esperar que esta mutación aumente la
concentración efectiva de los represores de la traducción presentes
sin aumentar la real concentración de proteína al mantener más
proteínas de cubierta en dímeros que en multímeros. Los expertos en
el arte deben considerar que otras formas mutantes de los MS2CP
podrían ser efectivas en los sistemas dela presente invención.
Si bien los ejemplos proporcionados en la
presente memoria utilizan en forma específica el sistema del
bacteriófago MS2, no sería inesperado que otros sistemas similares,
por ej., Q\beta, GA, SP, R17, f2 y fr, se podrían usar como
sistemas de represión de la traducción en forma similar.
Las células hospedantes que se usan y evalúan en
la presente invención incluyeron la cepa de E coli B
BL21(DE3) \pm pLysS y la cepa de E. coli K EE1120 +
pLysS. Deberá ser evidente para un experto en el arte que otras
cepas de E coli B y cepas de K comúnmente usadas podrían ser
efectivas en la práctica de la presente invención. También se debe
considerar que se podrían utilizar diferentes células hospedantes
eucariotas en la práctica de la presente invención.
También se utilizan terminadores de
transcripción potentes en los sistemas de la presente invención. Al
insertar tales terminadores corriente arriba del promotor de interés
(por ej., el promotor que dirige la expresión del gen 1 de T7), la
transcripción por ultralectura de las secuencias promotoras
crípticas se elimina, de este modo se proporciona un sistema de
regulación más ajustada. Los terminadores T1T2; Amman et al.,
Gene, 25:167-178 (1983) se usaron en los
ejemplos de la presente invención; sin embargo, existen otros
terminadores potentes, por ej, t_{hp}; Nohno et al., Mol. Gen.
Genet., 205:260-269 (1986) de los que
claramente se puede esperar que actúen efectivamente en el sistema
de la presente invención.
Si bien la ARN polimerasa de T7 se usó en los
ejemplos de la presente invención, las ARN polimerasas equivalentes
provenientes de fagos tipo T7 también podrían funcionar. Tales fagos
se describen con detalle en el arte; ver por ej, Hausmann, R., The
T7 Group in The Bacteriophages, capitulo 8,_{,}páginas
259-283, Plenum Press, New York (1988).
También se describe en la presente invención la
construcción de un sistema para la activación d un promotor medio
de T4 middle clonado in vivo mediante un operón construido
especialmente que consiste en los genes motA y asiA bajo el control
de un promotor inducible. La ventaja principal de este sistema
promotor es que dirige la transcripción de promotores específicos
mientras se inhibe la transcripción de los promotores de E.
coli, que minimizan la competición por el aparato de traducción
e inhiben a la célula que responde a la producción de proteínas
blanco por inducción de transcripción de genes de proteasa. También
se demostró que el sistema proporciona un ciclo de expresión
"escalonado" que podría ser útil para, entre otros, expresar
ciertas proteínas accesorias que pueden ser útiles para la
producción de la proteína blanco.
Más específicamente, la idea fue que las
proteínas accesorias se podrían clonar con un promotor que se induce
de la misma manera que el promotor de motA y asiA , o pueden estar
bajo el control del mismo promotor en una conformación de operón
única. Cuando se da la señal de inducción se deberían producir
simultáneamente estas proteínas accesorias y motA y asiA. Cuando
motA y asiA alcanzaron niveles de saturación (iguales a o algo
mayores que el número de moléculas de ARN polimerasa presentes)
entonces la se debería inhibir la transcripción de los promotores
de E. coli, finalizando esta etapa del ciclo de expresión. La
ARN polimerasa luego se debería dirigir únicamente a los promotores
medios de T4 que conducirían a la expresión de la proteína blanco.
En la actualidad no existe un sistema disponible que pueda hacer
este proceso en E. coli.
La capacidad para expresar tales proteínas
accesorias de esta manera puede ser de gran beneficio para mejorar
la expresión de las proteínas en los sistemas procariotas. Por
ejemplo, Yasukawa et al., The Journal. of Biol. Chem.,
270(432):25328-25331 (1995) informaron que la
coproducción de la tioredoxina de E. coli (Trx) o las
chaperonas de E. coli GroESL, aumentan la solubilidad de
varias proteínas de vertebrados que se producen en E. coli
(Trx es más efectiva). Este es un hallazgo importante y útil porque
las proteínas eucariotas se producen frecuentemente en la E.
coli como agregados insolubles y esta es una de las barreras
para los estudios estructura macromolecular.
En la presente invención, los genes motA y asiA
han sido clonados bajo el promotor lambda P_{L} y también se
clonaron con el promotor derivado de lac. En gran medida, sin
embargo, cualquier promotor inducible podría actuar, incluyendo a
los promotores bacterianos tales como trp-, o lpp-; promotores de
fagos tales como lambda P_{L} o P_{R} o promotores sintéticos
tales como tac o trc.
Debido a que se halló que los promotores medios
de T4 son "defectuosos", y , en gran medida, porque los genes
tóxicos motA y asik necesitan un control cuidadoso, se combinaron
las características del sistema MS2 y del sistema del promotor
medio de T4. Se halló que los operones de motA/asiA son inclonables
a menos que ambos genes se unieran a un sitio de reconocimiento de
MS2. Los "casetes de T4 basados en MS2" óptimos se insertan en
el cromosoma de la célula hospedante, de este modo contienen un
promotor inducible motA-asiA con las secuencias de
los genes motA y asiA (\pm secuencia de proteína accesoria) unidas
a una secuencia de reconocimiento de la proteína de cubierta de
MS2, y un gen de la proteína de cubierta de MS2 operativamente unido
a un promotor constitutivo débil.
Al utilizar este sistema, el bajo nivel de
producción de MS2CP impide la fuga del promotor medio de T4 y la
producción de motA/asiA_{,} hasta que se produzca un evento de
inducción que luego conduce la producción de motA, asiA (y la
producción de proteína accesoria, si se requiriera) y cierra la
transcripción en E coli, seguido por la producción del gen
blanco conducida por los promotores medios de T4.
También se desarrolla y describe en la presente
memoria una serie de cepas de E. coli que han sido
manipuladas genéticamente para producir diferentes concentraciones
de MS2CP. Estas cepas han tenido la proteína de cubierta de MS2
bajo el control de secuencias modificadas del promotor TET
integradas dentro de su ADN cromosómico en sitios específicos. Las
secuencias del promotor TET se modificaron mediante el cambio de
bases en las regiones 10 y -35 para convertirlas en homólogas con
la secuencia de consenso para estas regiones en los promotores de
E. coli. Estos se han alterado por medio de oligonucleótidos
para aleatorizar la secuencia del sitio de unión al ribosoma. Estos
cambios permitieron la identificación de varias de las formas que
producen altos niveles de proteína de cubierta de MS2 como se
determinó en los análisis de transferencia western.
Las diferentes cepas que contienen MS2 de la
presente invención se pueden utilizar para clonar a los genes
tóxicos y otros que no se pueden clonar por la tecnología
convencional. Por ejemplo, se ha determinado que, cuando se trabaja
con genes tóxicos, el establecimiento del ligamiento inicial es el
paso más sensible para la toxicidad y de este modo el paso más
difícil en el proceso de clonación. Una vez que se ha aislado el
clon estable, sin embargo, se puede transformar en otras líneas
celulares sin incidentes. Empleando el GM350, se puede acoplar el
gen tóxico o "inclonable" a un sitio de reconocimiento de MS2 y
luego se usa el ligamiento para transformar el GM350. Debido a que
GM350 tiene la mayor producción de proteína de cubierta de MS2; en
efecto, se produce tanto MS2CP que la expresión después de la
inducción se elimina efectivamente, el GM350 se puede usar para
identificar y obtener un clon estable. Una vez que se ha obtenido el
clon estable y se ha confirmado la secuencia, el plásmido
recombinante se puede usar para transformar las otras cepas de MS2
que producen cantidades decrecientes de la proteína de cubierta. Se
podría determinar la estabilidad del clon de cada cepa y la
proteína finalmente se expresa en una de tales cepa. En los casos en
que la toxicidad persiste con posterioridad a la obtención del clon
inicial, los productores de bajo nivel de MS2CP, por ej., GM315 y
GM320 podrían ser útiles para estabilizar esas construcciones.
Los siguientes ejemplos se ofrecen para ilustrar
más plenamente la invención, pero se interpretan como una
limitación del alcance de la misma. El Ejemplo 1 describe la
construcción del gen de la proteína de cubierta MS2 de tipo salvaje
(wtMS2CP) y luego proporciona los resultados del examen de wtMS2CP
para determinar su capacidad de expresarse en E. coli, y
cualquiera de los efectos que tal expresión presentó sobre el
crecimiento de la célula. El Ejemplo 2 describe la construcción de
dos versiones de mutantes del gen de la proteína de cubierta de
MS2. El Ejemplo 3 describe la construcción de los vectores del
plásmido pRIN que contienen mutantes wtMS20P o MS2CP para usar en
el desarrollo de los sistemas de reopresión de la traducción. El
Ejemplo 4 describe la clonación del gen 1 de T7 en los vectores del
plásmido pRIN y el examen posterior de los vectores para la
expresión y el sistema de pérdida. El Ejemplo 5 describe la
inserción cromosómica de los "casetes del gen1 de T7 controlado
por MS2" en el cromosoma de la célula hospedante, y luego se
demuestra el uso de tales cepas huésped para expresar diferentes
genes blanco además de proporcionar los resultados de las pruebas en
las que las características de pérdida y expresión de las cepas
recientemente desarrolladas se comparan con la ARN polimerasa de T7
disponible en el comercio que contiene las cepas. El Ejemplo 6
describe la fermentación a gran escala de las cepas recientemente
desarrolladas a lata densidad. El Ejemplo 7 describe el uso del
sistema de MS2 para clonar diferentes genes tempranos de T7. El
Ejemplo 8 describe la prueba los genes tempranos de T7 para
aumentar la producción de proteínas heterólogas. El Ejemplo 9
describe la inserción cromosómica del gen de la proteína de
cubierta de MS2 bajo el control de varios promotores TET alterados
para producir cepas manipuladas genéticamente para producir
diferentes concentraciones de MS2CP y los resultados de las pruebas
de estas cepas para determinarla la capacidad de clonar genes
tóxicos. El Ejemplo 10 describe la construcción del plásmido
pAMGuvxs, el plásmido pAMGX y los sistemas pRIN del operón de T4
emplea dos para desarrollar el sistema basado en el promotor medio
de T4 que usa plásmidos multicopia. El Ejemplo 11 describe las
pruebas de los sistemas de pAMGuvxs, pAMGX y pRIN del operón de T4
preparados y descritos en el Ejemplo 10. El Ejemplo 12 describe la
clonación del operón de motA/asiA en plásmidos de copia única que
contienen el sistema MS2. El Ejemplo 13 describe las pruebas de los
plásmidos de copia única preparados y descritos en el Ejemplo 12.
El Ejemplo 14 describe el uso del sistema basado en MS2/T4 para
expresar en forma efectiva una proteína accesoria y por lo tanto
aumentar la expresión de la proteína blanco.
En los siguientes Ejemplos, se emplean los
siguientes vectores de expresión/plásmidos bacterianos: pAMG13,
pAMG21, pAMG22, pAMG2S, pAMG33, y 3002 nahG (cada uno de los cuales
ha sido depositado previamente o se deposita en conexión con el
archivo de esta solicitud); pT7-7; Tabor y
Richardson, Proc. Natl. Acad Sci. USA,
82:1074-1078 (1985),pACYC184; Chang et
al., J. Bacterial., 134:1141-1156 (1978);
Rose; Nucleic Acid Res., 16:355 (1988a);
pKK223-3; Amman et al., Gene,
25:167-178 (1983); pGP1-2; Tabor and
Richardson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
82:1074-1078 (1985); y pSC101; Bernardi and
Bernardi, Nuc. Acids Res.,
12:9415-9426.
En los siguientes Ejemplos, se usaron los
métodos proporcionados a menos que se indique lo contrario.
Todos los ligamientos se llevaron a cabo en un
volumen final de 40 \mul. Aproximadamente se usaron 50 ng a 500
ng de cada vector y de 500 ng a 2 pg de cada inserto. La ADN ligasa
T4 se agregó a 1 unidad de la actividad y las reacciones se
incubaron a 16ºC durante toda la noche. Las reacciones luego se
precipitaron por la adición de acetato de amonio a 2,5M y se
agregaron 2,5 volúmenes de etanol. La mezcla de reacción luego se
incubó a -80ºC durante por lo menos 1 hora y luego se centrifugó a
15.000 rpm (a 4ºC) durante 30 minutos. El sedimento se resuspendió
en los 40 \mul originales y se usó una alícuota de 4 \mul para
la electroporación.
Se resuspendieron oligonucleótidos en agua a una
concentración de 20 pmol/\mul. Se usó una alícuota de 12,5 \mul
de cada oligonucleótido para la reacción de fosforilación. A esta
solución se agrega 2 \mul de ATP, 2 \mul del buffer de
ligamiento y 2,5 \mul de agua. La reacción comienza por la adición
de 1 \mul de PNK y se incuba a 37ºC durante 1 hora. Luego las
muestras se calientan a 65ºC durante 15 minutos. Los pares
complementarios luego se mezclan y calientan a 100ºC durante 1
minuto y se dejan enfriar lentamente a temperatura ambiente y luego
se colocan en hielo. En este punto de tiempo los oligonucleótidos
apareados están listos para ligarse. Para las secuencias
particularmente largas, se debería ordenar que dos oligonucleótidos
abarquen la región completa y tenga 6-12 bases de
complementariedad en los extremos 3'. Esto se usaría como templado
y cebador (a 1 pmol/\mul de concentración final) en 100 \mul de
reacciones PCR y después de la purificación por geles se debe
digerir por restricción antes del ligamiento.
Se usaron habitualmente varios programas
estándares para los procedimientos de PCR. Cuando se amplifican los
genes o fragmentos de operón, el volumen de reacción fue 100 \mul.
Una alícuota de 10 \mul de cada cebador a 10 pmol/\mul se
agrega a cada reacción y se agrega el templado entre 50 ng a 250 ng.
Las reacciones se corren durante 25 ciclos. El primer paso es 94ºC
durante 30 segundos, luego 50ºC durante dos minutos seguidos por
72ºC durante tres minutos. Los fragmentos amplificados se
purificaron por geles en geles de agarosa SeaKem GTG (FMC). El ADN
se recuperó de la agarosa mediante Qiaex II (Qioagen Inc.)
Las reacciones de selección de colonias para
identificar clones positivos se corren en volúmenes de 20 \mul.
Los oligonucleótidos están presentes en la concentración final de
0,25 pmol/\mul. Las colonias se recogen mediante una punta de
pipeta y se disuelven en la mezcla de reacción. Se retira una
alícuota de 1 \mul y se usa para inocular un tubo de 5 ml de LB
que contiene el antibiótico apropiado. Las reacciones de PCR se
corren durante 30 ciclos. El primer paso es 94ºC durante 30 segundos
seguidos por 30 segundos de apareamiento a 372C y 30 segundos de
elongación a 72ºC. Para insertos grandes (>1000 bases) el tiempo
de elongación se extiende a 1 minuto. Luego las reacciones se
cargan en geles de agarosa (0,8-1,0%) y los
positivos se identifican por la migración contra reacciones
estándares y del vector simulador.
Este Ejemplo describe la construcción del gen de
la proteína de cubierta de MS2 de tipo salvaje (wtMS2CP) y luego
proporciona los resultados de las prueba del wtMS2CP para determinar
su capacidad para expresarse en E. coli, y cualquiera de los
efectos que tal expresión presentó sobre el crecimiento de la célula
hospedante.
La secuencia proteica publicada de la proteína
de cubierta de MS2; Peabody, D., EMBO J., 12
(2):595-600 (1993) se usó para diseñar un gen que
emplea codones de uso preferido en E. coli. Los
oligonucleótidos 909-34 a. 909-53
(ver Tabla 1) se diseñaron y usaron para construir el, gen, y la
secuencia génica completa se ilustra en la Figura 1. Los
oligonucleótidos se diseñaron para incluir un sitio NdeI en el
extremo 5' del gen y un sitio BamHI en el extremo 3'. Este gen
luego se digirió por restricción con BamHI y NdeI y se clonó en el
plásmido pT7-7; Tabor and Richardson, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 82:1074-1078 (1985). Una
vez que se ha identificado un clon positivo y la secuencia
confirmada, este gen se subclonó en el plásmido 3002 nahG mediante
los mismos sitios de restricción.
La cepa BL21(DE3) comercial (Novagen,
Madison, WI) se usó para examinar la capacidad del wtMS2CP para
expresarse en E. coli. La BL21(DE3) es una cepa de
E. coli que contiene una copia cromosómica del gen de la ARN
polimerasa de T/bajo el control del promotor lac UV5. Las colonias
de BL21(DE3) que contiene el gen de wtMS2CP en
pT7-7 se recogieron de las placas y se usan para
inocular una alícuota de 5 ml de LB-amp en un tubo
Falcon de 50 ml. Esta preparación se cultivó durante la noche a 28ºC
con agitación. El cultivo durante toda la noche se usó para
inocular el medio fresco a una dilución 1:100 (50 \mul a 5 ml) en
un tubo de 15 ml. Estos se cultivaron a 28ºC con agitación a una
D.O de aproximadamente 0,6.
La expresión del gen wtMS2CP se indujo por la
adición de IPTG a 0,4 mM. La incubación se continuó a 37ºC con
agitación durante 4 horas. Se retiró una muestra de 1 ml y las
células se sedimentarán por centrifugación. Los sedimentos se
resuspendieron en buffer de craqueo a 0,01 de unidades/R1 de DO y
las muestras se hirvieron durante 5 minutos. Se cargó una alícuota
de 6 \mul de cada muestra en un gen de poliacrilamida SDS
4-20% (Novex). El gel se tiñó con azul coomassie
para visualizar las proteínas. Como se ilustra en la foto del gel
(Figura 2), las calles 8, 10, 11 y 12 exhiben la producción de la
wtMS2CP. Estos cultivos producidos alcanzaron una densidad óptica
superior que los que no contenían versiones funcionales del gen
MS2CP en pT7-7, de este modo se demuestra que la
MS2CP se puede expresar efectivamente con ningún efecto evidente en
el crecimiento de la célula hospedante.
Este Ejemplo describe la construcción de dos
versiones mutantes del gen de la proteína de cubierta de MS2.
Se construyó una versión mutante del gen de la
proteína de cubierta de MS2 en el cual se ha modificado el codón
para el residuo de valina en la posición 29 con un codón para
isoleucina por PCR de superposición empleando los oligonucleótidos
1456-55 y 1456-56 (ver Tabla 1).
Esta mutante particular se denominará de aquí en adelante
MS2CP-11.
MS2CP-11.
Se construyó una versión mutante del gen de la
proteína de cubierta de MS2 en el cual se ha modificado el codón
para el residuo de cisteína en la posición 101 con un codón para
arginina o PCR de superposición empleando los oligonucleótidos
1456-61 y 1456-52 (ver Tabla 1).
Esta mutante particular se mencionará de aquí en adelante como
MS2CP-14.
Este Ejemplo describe la construcción de los
vectores del plásmido pRIN que contienen las mutantes wtMS2CP o
MS2CP para uso en el desarrollo del sistema de represión de la
traducción. Los vectores pRIN son vectores multicopia (15 copias)
basados en el plásmido pACYC184; Chang et al., J. Bacteriol.,
334: 1141-1156 (1978); Rose, Nucleic Acid Res.,
16:355 (1988a).
El plásmido pACYC184 se digirió con las enzimas
de restricción XbaI y HindIII. Se diseñaron los oligonucleótidos
940-29 y 940-30 (ver Tabla 1) para
ligarse en estos sitios mientras se introducen nuevos sitios únicos
para uso posterior. Más específicamente, los oligonucleótidos
apareados se clonaron en el corte del vector pACYC184, de este modo
se destruyen los sitios XbaI y HindIII y se introducen en los sitios
únicos PstI y SacI además de en un segundo sitio SphI. El plásmido
luego se digirió con la enzima de restricción EagI y los
oligonucleótidos 941-43 y 941-44
(ver Tabla 1) se clonaron en el vector que destruyó el sitio EagI y
se introdujo en un sitio de restricción Aatli único.
El fragmento 1036-99 (ver Tabla
1) que contiene el gen de la proteína de cubierta de MS2 de tipo
salvaje unido al promotor nahG se construyó a partir del clon 3002
nahG descrito en el Ejemplo 1, de manera tal que un sitio Sact
estaba secuencia arriba de la secuencia promotora y un sitio HamiII
estaba en el término del gen. Este fragmento luego se clonó en el
vector derivado pACYC184 (descrito en el párrafo previo) de SacI a
BamHI.
La secuencia promotora nahG luego se reemplazó
con un promotor TET de la siguiente manera: se construyó un
promotor TET sintético mediante los oligonucleótidos
1016-20 y 1016-21 (ver Tabla 1). El
promotor se diseñó mediante la secuencia nativa del promotor TET
para pACYC184 con una alteración de la introducción del sitio NdeI
en el comienzo natural del gen TET. El promotor se ingresó en la
construcción SacI a NdeI para que el gen de wtMS2CP se una en forma
operativa al promotor TET.
Se construyó un fragmento de ADN que contenía
las secuencias del terminador rrnB T1T2 por PCR mediante el
plásmido pKK223-3; Amman et al., Gene,
25:167-178 (1983) como un templado y
empleando los oligonucleótidos 1036-6 y
1053-71 (ver Tabla 1). Este fragmento se construyó
para que tenga los sitios para las enzimas de restricción AatII y
AvaI en los extremos. El vector derivado de pACYC184 descrito
anteriormente se cortó con estas enzimas y el fragmento se ligó en
el mismo.
Una versión sintética de un promotor lambda y el
sitio de clonación múltiple del vector pAMG13 se cortaron de AatII
a BamHI. Luego el vector derivado de pACYC184 descrito se cortó con
estas enzimas y el fragmento del pAMG13 se ligó. El plásmido
resultante se denominó pRIN10 (wt) (Figura 3). También se
construyeron tres plásmidos derivados de pACYC184 similares, uno
que contiene el promotor PS4 en vez del promotor lambda (denominado
pRINil (wt)), uno que contiene el promotor lac UV5 en vez del
promotor lambda (denominado pRIN20(wt)), y uno que contiene
el promotor lux (denominado pRIN22(wt)) (Figura 3).
También se construyeron las construcciones pRIN
que contienen las mutantes MS2C.P-11 y
MS2CP-14. Los fragmentos de las formas mutantes,
aún unidas al promotor TET, se generaron para tener un sitio SphI en
el extremo del promotor y un BamHI en el extremo del gen mutante de
MS2CP. Los plásmidos pRIN descritos anteriormente se cortaron con
BamHI y SphI y la porción de plásmido se purificó con geles fuera
del fragmento de wtMS2CP. Luego se ligaron los fragmentos mutantes
mediante los sitios SphI y BamHI. Las construcciones que contienen
la mutante MS2CP-11 se denominaron
pRIN10(11), pRIN11(11), pRIN20(11)y
PRIN22(11), y las construcciones que contienen la mutante
MS2CP-14 se denominaron PRIN10 (14) pRIN11 (14)) y
pRIN22(14).
Este Ejemplo describe la clonación del gen 1 de
T7 en diferentes vectores de plásmidos pRIN, y las exámenes
posteriores de los plásmidos de vectores para determinar la
expresión y la pérdida del sistema.
El gen 1 de T7 se clonó en varios de los
plásmidos pRIN descritos anteriormente. El gen 1 de el gen T7 se
construyó por PCR mediante los oligonucleótidos
949-1 y 949-2 (ver Tabla 1) para
tener una secuencia de reconocimiento de una proteína de cubierta
de MS2 ligada a su región codificadora. El templado usado fue el
plásmido pGP1-2;- Tabor and Richardson, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 82:1074-1078
(1985): El gen se clonó en diferentes plásmidos pRIN desde XbaI a
BamHI. Los mutantes de MS2CP se examinaron para determinar su
capacidad para inhibir la multimerización y de este modo conducir a
un aumento de la concentración efectiva del represor de traducción.
otro parámetro que se examinó fue la presencia o ausencia de una
secuencia de la caja corriente abajo del gen 1 (oligonucleótido
1477-84) (ver Tabla 1) (se ha demostrado que esta
secuencia aumenta la traducción por incremento de la unión al
ribosoma; Sprengart et al., Nuc. Acids Res., 18
(7):1719-1723 (1990)).
Los cultivos durante toda la noche de las
diversas construcciones se cultivaron en 5 ml de
LB-cam en tubos de 50 ml a 28ºC. Estos se usaron
para inocular 5 ml de porciones frescas de LB-cam en
tubos de 15 ml con una dilución de 1:100. Estos se llevaron otra
vez a un agitador a 28ºC. Se tomaron las muestras de los cultivos
inmediatamente antes de la inducción, y el paso de inducción en este
caso incluyó la adición del IPTG a una concentración final de 0,4
mM. La incubación de cultivos inducidos continuó durante 3 horas y
se tomó de 1 ml las muestras. Todas las muestras se sedimentaron
por centrifugación y los sedimentos se resuspendieron un buffer de
craqueo. Después de hervir durante 5 minutos, se corrió una alícuota
a 6 \mul de cada uno en un gen de poliacrilamida SDS
4-20% (Novex).
Luego la proteína se transfirió
electroforéticamente a nitrocelulosa. Las transferencias se
bloquearon durante la noche en blotto tween con 2% de leche en
polvo descremada; Harlow & Lane, Immunoblotting in
Antibodies; A-Laboratory Manual, Capítulo 12,
Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1988). Las transferencias se
probaron durante una hora con un anticuerpo policlonal derivado de
conejo para ARN polimerasa de T7. Después del lavado las
transferencias se probaron con el anticuerpo de asno
anti-conejo conjugado con peroxidasa de rábano
picante (Amersham) durante 1 hora. Esta se lavó y trató con los
reactivos ECL (Amersham) y se expuso a una película de rayos X. La
exposición fue de 15 minutos para maximizar la sensibilidad. La
película se desarrolló mediante un procesador de película
Kodak.
Las Figuras 4-6 son fotografías
de las transferencias western que muestran los resultados de los
experimentos de pérdida y expresión realizados con diferentes
construcciones. La Figura 4 es una transferencia de un cultivo
estacionario de toda la noche, la Figura 5 es una transferencia de
un cultivo de pre-inducción de crecimiento
exponencial (preI) y la Figura 6 es una transferencia de un cultivo
inducido por IPTG crecido a 28ºC. Tal como se evidencia en las
fotos de las transferencias, es clara la presencia de la proteína de
cubierta tiene un efecto muy importante sobre la perdida de
actividad durante la noche (comparar Figura 4 y 5), y hay algo de
reducción del nivel de la acumulación de proteínas en las células
que muestran el mayor control de la pérdida. Más específicamente,
la señal es más fuerte en las calles laterales de la izquierda de
las transferencias y disminuye en las calles laterales de la
derecha con una función de la rigidez y grado de control ejercido
por los sistemas correspondientes; el promotor PS4 presenta mas
perdida que el promotor lac UV5; la mutación de la caja corriente
abajo reduce la pérdida pero tiene poco impacto sobre el nivel de
inducción para el promotor PS4; las mutantes de MS2CP presentan un
control más ajustado de la pérdida del gen 1 de T7 en cultivos de
toda la noche y exponenciales que las de tipo salvaje; las mutantes
impactan en el nivel de acumulación sobre la inducción, con los
cultivos de toda la noche controlados más ajustadamente (lac UV5)
que muestran niveles más bajos de ARN polimerasa después de la
inducción; y mutante MS2CP14 parece tener un efecto mayor que la
mutante MS2CP11, la cual es intermediaria entre wtMS2CP y
MS2CP14.
Este Ejemplo describe la inserción cromosómica
de los "casetes del gen 1 de T7 controlado por MS2" en el
cromosoma de la célula hospedante y luego se demuestra el uso de
tales cepas huésped para expresar diferentes genes blanco además de
proveer los resultados de las pruebas en las que se comparan las
características de la pérdida y expresión de las cepas
recientemente desarrolladas con las cepas que contienen ARN
polimerasa de T7 disponibles en el comercio.
Un "casete del gen 1 de T7 controlado por
MS2" (contiene las secuencias del terminador secuencia arriba,
una secuencia del promotor inducible, el sitio de reconocimiento de
MS2, el gen 1 de T7, el gen de la proteína de cubierta de MS2
(wtMS2CP, o MS2CP-11 o MS2CP-14) y
un promotor constitutivo débil, por ej., TET) (ver Figura 7) se
cortó de los diferentes plásmidos mediante las enzimas de
restricción SphI y PpuMI, y luego se clonaron en una un vector M13
especialmente construido, MMEbg; Blum et al., J.
Bacteriology, 171(1):538-546 (1889);
Micheals, M.L., Gene, 93:1-7 (1990)
para el sitio de integración específica en el cromosoma del huésped.
Se obtuvieron diferentes casetes que contienen wtMS2CP,
MS2CP-11, o MS2CP-14.
La integración procede mediante un mecanismo de
recombinación forzada. Primero, los oligonucleótidos
1553-73 y 1553-74 (ver Tabla 1) se
ligaron en los sitios BamHI y NotI de MMebg. Estos oligonucleótidos
introducen sitios SphI y PpuMI en el vector. El "casete del gen 1
de T7 controlado por MS2" luego se ligó en los sitios SphI y
PpuMI. Luego los ligamientos se transformaron en las células XL1
Blue al poner las células en 1 ml de SOC y se incuba con 150 \mul
de MOCK de ligamiento y 150 \mul y 30 \mul de ligamiento de
insertos con 300 \mul de cultivo XL1 Blue durante toda la noche +
3,5 ml de LB + Agar Top 0,8%. La mezcla se vertió en las placas con
LB y se incubaron a 37ºC toda la noche. Las placas se recogieron en
100 \mul de 1X TE.
Los cultivos de toda la noche comenzaron antes
de la detección por PCR con 70 \mul del fago resuspendido de las
placas y 200 \mul de XL1 Blue ON en 5 ml de LB. Estos cultivos se
agitaron a 37ºC toda la noche. Cada placa se examinó por PCR. Se
usaron 2 \mul de la placa resuspendida en un 20 \mul de una
reacción PCR. Se usaron los oligonucleótidos 305-3
y 305-14 (internos para el gen 1 de T7) (ver Tabla
1) para este examen. Los clones positivos se identificaron por
reacciones corridas en el gel de agarosa 1,0%. Se centrifugó un
alícuota de 1 ml de cada cultivo de toda la noche y se guardaron 800
\mul del sobrenadante con el fago en un tubo Eppendorf. Luego se
incubó una alícuota de 200 \mul de cada sobrenadante a 70ºC
durante 20 min. Luego se agregaron 100 \mul del fago tratado con
calor a 500 \mul de una cepa autotrófica K de E coli con
un genotipo de lac i^{Q} (denominado células F'tet/GM120) de un
cultivo de toda la noche. (GM120 tiene el número de acceso ATCC
55784). Estas muestras se incubaron a 37ºC durante aproximadamente 1
hora. Luego se incubaron 25 \mul de F'tet/GM120 control, 25
\mul de fago tratado con calor solo, y 25 \mul de una dilución
1:10 de cada cruza en las placas LB+Kn^{40}. Luego las placas se
incubaron a 37ºC durante toda la noche. Las colonias purificadas
que resultaron de la cruza (o lisogenización) se estriaron dos veces
en las placas B+Kn y se incubaron a 37ºC durante toda la noche.
Luego las colonias se subcultivaron dos veces en 0,3% de hiel de
buey y LB, y luego se agitó a 37ºC toda la noche. Luego las células
se estriaron en las placas LB, junto con un cultivo réplica de LB a
LB+Kn para identificar las colonias sensibles a kanamicina (el fago
ya no debería estar presente en las colonias que son sensibles a la
kanamicina).
Luego se realizó la prueba de PCR para examinar
la inserción en el cromosoma de la siguiente manera: se recogió una
colonia de una placa y se usó para inocular 20 \mul de mezcla de
PCR mix (también se inocularon 5 ml de LB, empleando la misma
punta, usado para un cultivo de toda la noche su se identificaron
los positivos). Se corrieron 15 \mul de cada muestra de PCR en un
gel de agarosa 1,0% para examinar los positivos. Cuando se
identificaron los positivos por tamaño en el gel, los cultivos de
toda la noche correspondientes comenzaron a agitarse a 37ºC. Estos
luego se cultivaron en placas LB y se incubaron a 37ºC durante toda
la noche.
Para curar las células del factor F', los
cultivos provenientes de las colonias únicas de la placa de 5 ml de
LB comenzaron a agitarse a 37ºC durante 4 horas. Luego se siguió un
protocolo publicado para la cura mediante naranja de acridina;
Miller, Experiments in molecular genetics, Cold Spring Harbor
Laboratory Press, páginas 104-106 (1972).
Básicamente, se cultivan las células en LB y las placas réplica en
LB+tetraciclina. Las células sensibles a tetraciclina se aislarán
como F' negativo. Los cultivos de toda la noche de las colonias de
estas placas se inician y luego se reinfectan con M13 mp18 para
asegurar que el factor F' ya no está presente en las células. Luego
se mezclan 300 \mul de los cultivos de toda la noche con agar top
y se siembran con 2 \mul de M13 de solución patrón del fago mp18.
No debería haber placas presentes. Dos cepas construidas mediante
este protocolo se denominaron EE11-11M (promotor
PS4) y EE11-20 (promotor lac UV5).
Se compararon las características de la pérdida
y expresión de EE11-11M y EE11-20
con la cepa BL21(DE3) comercial (descrita previamente), que
emplea la expresión del producto génico NT-3 o
producto génico BDNF como un marcador. En el NT-3
(o BDNF) está presente en el vector pET22b disponible en el comercio
(Novagen, Madison, WI) que también tiene un sitio lac.i entre el
promotor T7 y el gen de interés, y transporta un gen lac i^{Q}
para reducir la pérdida de expresión. También se compararon
BL21(DE3) que contiene pLysS como un vector secundario vs.
EE11-11M que contiene pLysS como vector secundario
vs. EE11-20 que contiene pLysS como vector
secundario (como se indicó previamente, pLysS transporta el gen de
lisozima de T7 que inhibe la ARN polimerasa de T7 y es el camino
recomendado para reducir la pérdida). Finalmente, también se usó un
plásmido pAMG25 que contenía el gen de BDNF para comparar
BL21(DE3) vs EE11-20.
Específicamente, los cultivos de toda la noche
(5 ml) de LB+ antibiótico (Kn^{40} o Cm^{30}) en tubos Falcon
de 50 ml comenzaron y estos cultivos se agitaron a 28ºC. Los tubos
frescos de 5 ml LB + antibiótico en tubos de vidrio de 14 ml se
inocularon con una dilución 1:100 del cultivo toda la noche. Los
tubos se agitaron a 28ºC hasta que alcanzaran una DO = \sim0,8.
Los cultivos de toda la noche continuaron agitando a 28ºC hasta la
conclusión del experimento. Se tomaron alícuotas de cada muestra
antes de la inducción. Los cultivos se indujeron por la adición de
20 \mul de IPTG 100mM (que dio la concentración final de 0,4 mM
para IPTG). Los cultivos inducidos se incubaron a 28ºC con agitación
durante 4 horas. Se retiró una muestra de 1 ml del cultivo y se
centrifugaron en un tubo Eppendorf de 1,5 ml a 15.000 rpm (a 4ºC)
(Tomy MTX-160) durante 5 minutos. Se decantó el
sobrenadante y se retuvo el sedimento. Luego se resuspendieron los
sedimentos en buffer de craqueo a DO 0,01 unidades/\mul. Luego
las muestras se calentaron a 100ºC en un bloque térmico durante 5
minutos, luego se enfriaron durante 2-3 minutos y
luego se cargaron 6 \mul de cada muestra en un gel de
poliacrilamida SDS 4-20% de Tris Glicina en un
buffer de corrida 1X Tris-Glicina con agregado de
SDS 2%. El gel se corrió a 150V durante 1,3 horas. El gel se tiñó
con azul coomassie para visualizar la proteína.
Como se ilustra en la Figura 8, que usa
NT-3 como gen blanco, la cepa
EE11-20 no tiene pérdida detectable en el cultivo
de toda la noche (ON) o antes de la inducción (preI), mientras que
la BL21(DE3) claramente tiene. Los niveles de inducción para
NT-3 son comparables entre cepas. Mirando la Figura
9, que emplea BDNF como gen blanco, la EE11-20 otra
vez no muestra pérdida de producto antes de la inducción, aunque
BL21(DE3) lo hace claramente. EE11-20 tiene
niveles reducidos de BDNF en pET22b que en BL21(DE3). Mirando
la Figura 10, se advierte que los niveles de BDNF expresados
mediante el vector pAMG25 eran similares para
EE11-20 y BL21(DE3). Para cada uno de los
experimentos ilustrado sen las Figuras 8-10, la
presencia de pLysS redujo la pérdida pero también inhibió la
expresión del producto (como se había informado previamente en la
bibliografía científica). Finalmente, mirando las Figuras 11 y 12,
se observa que EE11-11M no muestra pérdida de
producto durante la noche o la preinducción pero produce niveles
comparables de proteína en comparación con BL21(DE3). Además,
la cepa EE11-11M es superior a la cepa
EE11-20 en que la presencia de lac i en el vector no
tiene efecto sobre la acumulación de proteínas y en efecto, puede
producir niveles mayores de algunos productos (por ej., comparar
las Figuras 8 y 12).
Es evidente a partir de estos resultados, que
los elementos adicionales que se han introducido para controlar la
pérdida de producto en las cepas disponibles en el comercio no son
necesarios en las cepas desarrolladas en la presente invención, y
la cepa de la presente invención muestra un mayor control de la
pérdida y niveles comparables de la expresión de producto después
de la inducción.
Para determinar el impacto que la presencia de
la proteína de cubierta de MS2 puede tener sobre la expresión de
una proteína heteróloga en la fermentación de alta densidad, se
examinaron diferentes productos. Inicialmente, las condiciones
reflejaron las condiciones que se usaron para la reacción en pequeña
escala, un matraz agitador, una inducción de baja densidad óptica.
Se usó un cultivo exponencial (densidad óptica = 1,4) de
EE11-11M que contiene GCSF en pAMG25 para inocular
un fermentador de 10 litros. Este se cultivó a 28ºC a una densidad
óptica de 0,8 y se indujo con la adición de IPTG. El cultivo se dejó
crecer unas 10 horas adicionales después de la inducción se alcanza
una densidad óptica final de 12 y se tomaron las muestras a cada
hora. Como se ilustró en la Figura 13, no hay pérdida detectable en
la preinducción de GCSF (calle 1) y la proteína se continúa
produciendo durante toda la inducción.
Se realizó una segunda fermentación (mediante
leptina en pAMG25) para examinar el rendimiento de la cepa
EE11-11M a densidad alta. Se empleó un inóculo
exponencial (densidad óptica = 1,32) para comenzar una fermentación
de 10 litros. Este se cultivó a una densidad óptica de 10 a 28ºC.
Luego el cultivo se indujo con la adición de IPTG. El crecimiento
continuó durante 6 horas y el cultivo alcanzó una densidad óptica
final de 41. Como se ilustró en la Figura 14, no hay pérdida
evidente antes de la inducción y se produjo leptina durante todo el
tiempo de inducción.
Estos experimentos muestran que la presencia de
la proteína de cubierta de MS2 no tiene impacto negativo en al
fermentación a gran escala o de alta densidad.
Este Ejemplo describe el uso del sistema MS2
para clonar diferentes genes temprano T7. Los genes T7 se clonan
solos y como un operón.
Los genes tempranos 0.4 y 0.6 del bacteriófago
T7 se amplificaron por PCR mediante el ADN -356 de T7; Studier
et al., J. Mol. Biol.,
135:917-937 (1979); Dunn & Studier, J.
Mol. Biol., 166:477-535 (1983) como un
templado. Cada gen se construyó por PCR para tener un sitio EcoRI
adyacente al primer codón del gen (oligonucleótidos
1049-5 y 1049-7) (ver Tabla 1), y se
clonaron en pAMG13 que ha sido modificado para contener un sitio de
reconocimiento de la proteína de cubierta de MS2 y una cola de
polihistidina en marco con la región de clonación múltiple
(oligonucleótidos 1035-30 y 1035-31)
(ver Tabla 1). Se usaron oligonucleótidos 1482-18 y
1266-69 (ver Tabla 1) para el gen 0.4 y los
oligonucleótidos 1266-71 y 1443-41
(ver Tabla 1) para el gen 0.6.
La proteína de cubierta de MS2 se proporcionó en
forma trans de pRIN10. Las células electrocompetentes que contienen
pRIN10 se transformaron por ligamientos de genes tempranos con
pAMG13. Se identificaron los clones positivos por detección por PCR
d colonias transformantes. Los cultivos positivos se incubaron
durante la noche como iniciadores para los experimentos de
expresión. Los tubos frescos de LS Kan/Cam se inocularon con una
dilución de 1:100 (50 \mul a 5 ml) y se cultivaron a 28ºC x con
agitación a una DO de aproximadamente 0,7. Estos se indujeron por
el cambio a un agitador a 42ºC y la incubación continuó durante 4
horas. Se retiraron alícuotas de 1 ml y se sedimentaron las
células. Los sedimentos se resuspendieron en buffer de craqueo a una
DO de 0,01 unidades/\mul y se hirvieron durante 5 minutos, luego
se enfriaron en hielo y se corrió una alícuota de 6 \mul de cada
uno en gel de poliacrilamida con SDS 10-27%.
Luego la proteína se transfirió
electroforéticamente a nitrocelulosa. Las transferencias se
bloquearon toda la noche en blotto-tween con leche
en polvo descremada 2%. Las transferencias se probaron durante una
hora con un anticuerpo policlonal derivado de conejo para péptidos
sintéticos basados en la secuencia esperada de la proteína. Este
suero se diluyó 1 a 2000. Después del lavado las transferencias se
probaron con el anticuerpo de asno anti-conejo
conjugado con peroxidasa de rábano picante (Amersham) durante 1
hora. Esta se lavó y trató con los reactivos ECL (Amersham) y se
expusieron a la película de rayos X. La exposición fue durante 4
minutos. La película se desarrolló mediante un procesador de
película Kodak. Como se ilustró en la Figura 15, la expresión del
gen 0.4 se obtuvo mediante un sistema controlado por MS2. Del mismo
modo, se obtuvo la expresión del gen 0.6 (Figura 16).
Se construyeron dos versiones del gen 0.7: 1) se
usaron los oligonucleótidos 1053-66 y
1266-73 (ver Tabla 1) para construir la versión de
longitud completa del gen; y 2) los oligonucleótidos
1053-66 y 1266-72 (ver Tabla 1) se
usaron para construir una versión truncada del gen. El truncamiento
se basó en la versión mutante que había sido aislada mientras se
trata de clonar la versión de longitud completa sin un sitio MS2 en
una vector de copia única y tiene una mutación ocre en el codón
242. Esta detención temprana es similar a la mutación aislada del
fago en el codón 243; Studier, F.W., J. Mol. Biol.,
79:227-236 (1973), se demostró que la mutante ha
perdido la actividad de corte pero retiene la actividad de quinasa;
Michalewicz y Nicholson, Virology, 186:452-462
(1992).
También se construyó un operón de los genes
tempranos por PCR secuencial. Los oligonucleótidos
1511-32, 1539-60,
1803-86, 1319-59,
1577-83, 1577-84,
1539-65, 1066-72 y
1435-93 (ver Tabla 1) se diseñaron para tener
secuencias que se superponen a los genes adyacentes a cada gen
temprano individual y también introduce un sitio MS2 adyacente al
sitio de inicio de cada región codificadora. Cada gen se amplificó
individualmente por PCR mediante estos oligonucleótidos. Luego se
agregaron los genes tempranos juntos en forma secuencial. Los genes
0.4 y 0.5 se unieron primero por medio del empleado de ambos como
templados y solo se usan los cebadores exteriores. Esto produjo un
fragmento 0.4-0.5 que luego se usó con la mitad del
templado con el fragmento 0.3 y los demás hasta que se generó una
construcción de 0.3 a 0.7 completa, denominada operón
3-7t (SEC ID NO:2) (Figura 17). Para reducir
adicionalmente la pérdida de los genes temprano del operón, las
secuencias de "caja secuencia abajo" se mutaron en los genes
0.3, 0.6 y 0.7. La mayoría de estos cambios de bases realizados para
reducir la homología "caja secuencia abajo"
fueron silentes, a pesar de que se produjo una sustitución conservadora de aminoácidos en cada uno de los genes.
fueron silentes, a pesar de que se produjo una sustitución conservadora de aminoácidos en cada uno de los genes.
Este Ejemplo describe los resultados de los
experimentos en los que el operón 3-7t construido y
descrito usado en el Ejemplo 7 se usó para mejorar la expresión de
las proteínas heterólogas en E. coli. Se compararon las
características de expresión de los siguientes sistemas: 1) NDF
alfa/beta clonado en pAMG33,y expresado en E. coli GM221, o
con el operón 3-7t en pRIN10 expresado en E.
coli GM221; 2) 301-941 TP2 clonado en pAMG22 y
expresado en E. coli GM221, o con el operón
3-7t en pRIN10 y expresado en E. coli
GM221.
Para cada experimento, se recogieron colonias
únicas de las placas y se cultivaron en dos porciones de 5 ml de LB
con Kanamicina o LB con Kanamicina y cloranfenicol. Los tubos se
agitaron durante la noche a 28ºC. Se emplearon matrices de cuatro
litros que contienen 1 litro de 2XYT con Kanamicina o 2XYT con
Kanamicina y cloranfenicol. Estos se inocularon con los 10 ml del
cultivo iniciador. Estos se cultivaron con agitación a 28ºC a una DO
de 0.8. Luego los cultivos se cambiaron a 37ºC con agitación
durante 1 hora. Estos luego se cambiaron otra vez a 28ºC y se
llevaron a 0,4 mM con IPTG. Estos se cultivaron durante 3 horas
adicionales como las muestras retiradas a cada hora. Las muestras
de 1 ml se centrifugaron durante 5 minutos a 15K y 4ºC. Se decantó
el sobrenadante y le sedimento se congeló. Se diluyeron 500 \mul
de cada cultivo en 500 \mul de 2XYT y se tomó la densidad óptica.
Los sedimentos luego se descongelaron y resuspendieron en el buffer
de craqueo de 0,01 DO unidades/\mul. Luego se cargaron 6 \mul
de estos sedimentos craqueados en gel de poliacrilamida SDS
(4-20%). Después de la corrida a 150V durante 1,3
horas, se tiñeron los geles con azul coomassie para visualizar las
proteínas.
Como se muestra en la Figura 18, la presencia de
las proteínas tempranas de T7 protege al NDF alfa/beta de la proteo
lisis. Cuando no hay proteínas tempranas de T7 presentes, el NDF
alfa/beta está producido por 1 hora de inducción (calle 2) pero ya
no detectable por horas de inducción (calle 3). Cuando las proteínas
tempranas de T7 están pre-
sentes, hay más NDF alfa/beta detectable y continúa la acumulación durante las 3 horas de la inducción
sentes, hay más NDF alfa/beta detectable y continúa la acumulación durante las 3 horas de la inducción
\hbox{(calles 7-9).}
Como se muestra en la Figura 19 la célula
hospedante no produce 301-941 TP2 después de la
inducción en ausencia de las proteínas tempranas de T7 (calle 5).
Cuando las proteínas tempranas de T7 están presentes, la producción
de la proteína después de la inducción aumenta en forma espectacular
(calles 2 y 3).
Este ejemplo 9 describe la construcción y examen
de una serie de cepas huésped procariotas que han sido manipulados
genéticamente para producir concentraciones diferentes de MS2CP. Las
cepas huésped tienen el MS2CP unido a un promotor TET modificado
insertado en su cromosoma.
Construcción de cepas: Se construyó un
casete de la variante de MS2CP-14 unida al promotor
TET empleando los oligonucleótidos 1674-96 y
1674-97 (ver Tabla 1). Este casete se clonó en los
sitios NotI y BamHI de MMebg para generar
MMebg-MS2CP-14. Luego se optimizó el
promotor TET en etapas: 1) la región -10 se tomó por consenso con
PCR por superposición. Las mitades de mutantes se construyeron
mediante los oligonucleótidos 1011-96 con
1784-89 y 1758-66 con
1674-97. Luego las mitades se sometieron a una PCR
juntas empleando los oligonucleótidos 1674-96 y
1674-97. Estas luego se reclonaron en MMebg de NotI
a BamHI para producir MMebg-MS2CP14 (-10); 2) la
región -35 se llevó por consenso a producir un promotor TET
completamente optimizado. Esto se realizó otra vez mediante la
mitad de la reacción PCR donde el MMebg-MS2CP14
(-10) actuó como templado. Las mitades de mutantes se construyeron
mediante un par de oligonucleótidos 1011-96 con
1784-88 y 1803-15 con
1674-97 (ver Tabla 1). Luego las dos mitades se
sometieron a una PCR juntas empleando los oligonucleótidos
1674-96 y 1674-97. Este se reclonó
en MMebg de NotI a BamHI para producir MMebg-MS2CP14
(completamente optimizado). Los MMebg-MS2CP14 (-10)
y MMebg-MS2CP14 (completamente optimizados)
presentaron un aumento de la producción de la proteína de cubierta
de MS2 por encima de la construcción del promotor de tipo salvaje
(pequeño aumento para la (-10) y un muy gran aumento para el
complemente optimizado).
Para construir versiones del promotor mutante
que podrían liberar niveles del intermediario de la proteína de
cubierta de MS2 a las mutantes previamente descritas, se empleó una
estrategia para aleatorizar la secuencia del sitio de unión al
ribosoma (RBS). La secuencia de la región promotora que contiene el
cambio de consenso -10 y el gen de la proteína de cubierta de MS2
hasta el sitio KpnI se usaron para diseñar a los oligonucleótidos
1822-01, 1822-02 y
1863-81. Estos oligonucleótidos se fosforilan y
aparean con oligonucleótidos 1821-99,
1822-03, 1822-04 y
1822-05. El producto de ligamiento luego se actúa
como templado de PCR mediante los oligonucleótidos 1822.06 y
1822-07. Este fragmento, que ahora está aleatorizado
en la secuencia de unión al ribosoma puede ligar desde NotI a
BamHI.
Para determinar el efecto de los cambios de
sitios de unión al ribosoma sobre la producción de proteínas, se
empleó un ensayo de beta galactosidasa. Específicamente, se
construyó una fusión MS2CP-14-LacZ
por la producción de un fragmento LacZ con los oligonucleótidos
1803-52 y 1803-53 el ligamiento en
MMebg-MS2CP-14 desde KpnI a BamHI.
Esta construcción contiene el promotor TET de tipo salvaje unido al
comienzo del gen de la proteína de cubierta de MS2 que esta
fusionado en marco con las dos genes de LacZ de beta galactosidasa.
Los fragmentos RBS aleatorizados descritos en el párrafo anterior
luego se ligaron en esta construcción desde NotI a KpnI. La fusión
inicial y los ligamientos de fusión aleatorizados se integraron en
el cromosoma siguiendo el protocolo descrito en el Ejemplo 5. La
cepa huésped usada fue F'tet/393eElacZ145N que es deficiente en al
actividad de beta galactosidasa. Los lisógenos resueltos se
ensayaron para determinar la actividad beta galatosidasa como se
describió; Miller, Experiments in molecular genetics, Cold
Spring Harbor Laboratory Press, páginas 352-355
(1972). Se identificaron una serie de mutantes con niveles variado
de actividad. Tres de estas mutantes, números 1, 3 y 15 se
seleccionaron para la producción de las cepas. La
MMebg-MS2CP-14-LacZ
que habían originado a estas cepas particulares digirieron KpnI a
BamHI para eliminar la fusión a LacZ. Luego el gen
MS2CP-14 se regeneró por ligamiento del fragmento
KpnI a BamHI en estos vectores. Las cepas se construyeron a partir
de estas tres mutantes y el
MMebg-MS2CP-14 (completamente
optimizado) por la integración en al cepa huésped 393. las cepas
resultantes se denominaron GM315 (mutante1), GM320 (mutante 3),
GM340 (mutante 15) y GM350 (completamente optimizado).
Exámenes de cepas para producir MS2CP. Se
determinó la capacidad de estas cepas para producir la proteína de
cubierta de MS2 por el análisis western de los cultivos
exponenciales. Se recogieron colonias de cada cepa de las placas y
se usaron para inocular 5 ml de LB. Estas se cultivaron con
agitación a 30ºC a una densidad óptica de 0.7. Se tomó un ml de las
muestras. Todas la muestras se sedimentaron por centrifugación y los
sedimentos se resuspendieron en buffer de craqueo. Después de
hervir durante 5 minutos, se corrió una alícuota de 6 \mul de
cada muestra en un gel de poliacrilamida SDS 4-20%
(Novex). Luego la proteína se transfirió electroforéticamente a
nitrocelulosa. Las transferencias se bloquearon toda la noche en
blotto-tween con leche en polvo descremada 2%
Harlow & Lane, Immunoblotting in Antibodies, A Laboratory
Manual, Chapter 12, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1988)..
Las transferencias se probaron durante una hora con un anticuerpo
policlonal derivado de conejo para la proteína de cubierta de MS2.
Después del lavado las transferencias se probaron con el anticuerpo
conjugado con peroxidasa de rábano picante
anti-conejo burro (Amersham) durante 1 hora. Esta se
lavó y trató con los reactivos ECL (Amersham) y se expusieron a la
película de rayos X. La película se desarrolló mediante un
procesador de película Kodak. Como se muestra en la Figura 20, el
nivel de la proteína de cubierta de MS2 expresada en forma pasiva
en la fase log de crecimiento es detecta-
ble por encima del umbral de a niveles bajos. en GM315 y GM320 y aumenta considerablemente en GM340 y GM350.
ble por encima del umbral de a niveles bajos. en GM315 y GM320 y aumenta considerablemente en GM340 y GM350.
Clonación heteróloga de genes utilizando las
cepas. Empleando técnicas convencionales, se halló que las
fusiones de la cola his del N-terminal del gen ns5b
de la hepatitis C (la Hep C polimerasa I) eran muy difíciles de
clonar. Cuando se aislaron las versiones de longitud completa del
gen, estas contenían mutaciones que conducían a detenciones
tempranas de la traducción o que estaban en el ATG e impedían la
iniciación de la traducción por completo. Para facilitar la
clonación de este gen, se le unió una secuencia de reconocimiento de
MS2 y las los ligamientos se usaron para transformar primero la
cepa GM350. Se detectaron insertos de longitud completa, se
secuenciaron y se determinó que eran los correctos.
El gen ns5b recombinante marcado con his
obtenido de GM350 se colocó luego en el pAMG21 y se usó para
transformar GM221, GM315 y GM320 (GM221 no contiene la proteína de
cubierta de MS2 mientras que GM315 y GM320 producen niveles más
bajos que GM350). Se halló que el gen era estable en las tres líneas
celulares.
Luego se determinó la capacidad de diferentes
cepas para producir la polimerasa de la hepatitis C marcada en la
his. Los cultivos de toda la noche se usaron para inocular 50 ml de
2XYT en matraces erlenmeyer de 250 ml con una dilución de 1 a 100.
Estos se cultivaron con agitación a 30ºC a una densidad óptica de
0,6. El vector pAMG21 contiene un promotor lux y de esta manera se
logra la producción de la hepatitis C polimerasa por la adición de
un autoinductor a una concentración final de 30 ng/ml. La incubación
continúa durante 4 horas y se tomaron las muestras. Las células se
sedimentaron por centrifugación. Los sedimentos se resuspendieron
en 10 ml de PBS y esto de microfluidizó. Las muestras se
centrifugaron para separar las fracciones solubles e insolubles.
Estas se mezclaron con buffer de craqueo y las muestras se corrieron
en geles SDS 4-20%. Después de la corrida a 150V
durante 1,3 horas se tiñeron los geles azul coomassie para
visualizar las proteínas.
Como se ilustra en la Figura 21, la hepatitis C
polimerasa se producen las tres cepas. La mayoría de la proteína
producida es insoluble. Puede haber una expresión algo mayor en las
cepas que contienen la proteína de cubierta de MS2. Este Ejemplo
muestra de este modo una manera en la cual se pueden emplear estas
cepas: el mayor productor, GM350, se usa para clonar inicialmente
el gen inestable; y una vez que se ha obtenido un clon estable y
confirmado como correcto, este se puede transformar en las cepas
restantes y también se puede determinar la capacidad para producir
el producto proteico además de la estabilidad sustentable del
gen.
Este Ejemplo describe la construcción del vector
plásmido pAMGuvxs, el vector del plásmido pAMGX y los vectores
plásmidos del operón pRIN de T4 usados para desarrollar el sistema
basado en el promotor medio de T4.
Los promotores medios de T4 del bacteriófago se
construyeron sintéticamente mediante las secuencias publicadas de
PuvsX y PX; Hinton, D.M., J. Biol. Chem.,
266(27):18034-18044 (1991) (uvsX:
oligonucleótidos 1084-66 y 1084-67
(ver Tabla 1), X: oligonucleótidos 1084-58 y
1084-69) (ver Tabla 1). El promotor PuvsX se
reconstruyó para eliminar el sitio NdeI, que contiene
(oligonucleótidos 1202-11 y 1550-85)
(ver Tabla 1). Cada construcción se diseñó para tener sitios de
restricción AatII y ClaI. La secuencia base completa de la
construcción del promotor PuvsX se ilustra en la Figura 22, y la
secuencia génica completa de la construcción del promotor PX se
ilustra en la Figura 23. El plásmido pAMG13 se digirió con AatII y
ClaI para eliminar el promotor sintético lambda y el vector se
purificó por geles. Cada uno de los promotores medios de T4 luego se
ligaron con este para crear los vectores de los plásmidos pAMGubsx
y pAMGX.
El operón motA/asiA se construyó para que cada
gen fuera precedido por una secuencia de reconocimiento de una
proteína de cubierta de MS2. Las secuencias publicadas de motA; Uzan
et al., Mol. Microbial.,
4(9):1487-1496 (1990), y asiA; Orsini et
al., Jour. Bacteriology, 175(1):85-93
(1993) se usaron para la construcción. En el comienza del fragmento
estaba un sitio XbaI y en el extremo estaba un sitio XhoI
(oligonucleótidos 1084-63, 1528-19,
1528-20, y 1733-53)(ver Tabla 1).
Este fragmento se digirió con XbaI y XhoI y luego se ligó con
varios vectores de plásmidos pRIN para proporcionar, por ejemplo, el
vector del plásmido pRIN10 del operón T4, vector del plásmido
pRIN11 del operón T4, etc.
Este Ejemplo describe el examen de los vectores
del plásmido pAMGuvxs, pAMGX y pRIN del operón T4 y se describen en
el Ejemplo 10. Más específicamente, los experimentos de expresión se
realizaron para examinar la capacidad de los sistemas para evitar
la pérdida y permitir la expresión del producto génico. Se
compararon las características de expresión y pérdida de los
siguientes sistemas: 1) gen 1 de T7 clonado y expresado en E.
coli huésped GM221 (ATCC No de acceso. 202077) que contiene el
vector pAMG13 vector (es decir, gen 1 de T7 bajo el control del
promotor lambda); 2) gen 1 de T7 clonado y expresado con pRIN del
operón T4 en E. coli huésped GM221 que contiene pAMG13; 3)
gen 1 de T7 clonado y coexpresado con el pRIN10 del operón T4 en
E. coli huésped GM221 que contiene pAMGuvsX (es decir, gen 1
de T7 bajo el control del promotor medio de uvsX T4; 4) gen 1 de T7
clonado y coexpresado con el pRIN11 del operón T4 en E. coli
huésped GM221 que contiene pAMGuvsX; 5) NT-3
clonado y coexpresado con el pRIN10 del operón T4 en E. coli
huésped GM225 que contiene pAMGuvsX; y 6) BDNF clonado y
coexpresado con el pRIN10 del operón T4 en E. coli huésped
GM225 que contiene pAMGuvsX.
Para cada experimento, se escogieron colonias
únicas de las placas y se cultivaron en 5 ml de 2XYT con
cloranfenicol y kanamicina. Los tubos se agitaron durante toda la
noche a 28ºC. Se ajustaron tubos de 50 ml con 5 ml de 2XYT con
cloranfenicol y kanamicina. Los tubos frescos se inocularon con 50
\mul de los cultivos iniciadores. Estos tubos se cultivaron con
agitación a 28ºC a una DO de 0,6-1,2. Los cultivos
que contienen el promotor PS4 (pRlN11) se indujeron con 20 \mul
de IPTG, mientras que los cultivos que contienen el promotor lambda
(pAMG) se indujeron por el cambio a 37ºC o 42ºC. El tiempo de
inducción para todos los experimentos de expresión fue de 4,0
horas. Se centrifugó 1 ml de cada cultivo durante 10 minutos. El
sobrenadante se decantó y el sedimento se congeló. Se diluyeron 500
\mul de cada cultivo en 500 \mul de 2XYT y se tomó la densidad
óptica. Los sedimentos luego se descongelaron y resuspendieron en
buffer de craqueo a 0,01 unidades de DO/\mul. Luego se cargaron 6
\mul de estos sedimentos craqueados en gel de poliacrilamida SDS
(4-20% o 16%). Después de la corrida a 150V durante
1,3 horas los geles se tiñeron con azul coomassie para visualizar
las proteínas.
Los datos de las Figuras 24-29
se pueden sintetizar de la siguiente manera: 1) el vector pAMG13 es
capaz, después de la inducción, de producir niveles abundantes de
ARN polimerasa de T7 cuando el gen 1 de T7 está bajo el control del
promotor lambda (ver calles 3 y 4, Figura 24); 2) los productos
proteicos del operón T4 anulan en forma suficiente el
reconocimiento del promotor lambda por la ARN polimerasa de E.
coli (comparar calles 2 y 3 de la Figura 25 con las calles 3 y
4 de la Figura 24); 3) se pueden obtener abundantes niveles de ARN
polimerasa de T7 en pAMGuvsX donde el gen 1 de T7 esta clonado y
coexpresado con el pRIN10 del operón de T4 (comparar calles 3 y 4
de la Figura 24 con las calles 2 y 3 de la Figura 25); 4)
coexpresión con el pRIN11 del operón T4 es tan efectivo para
producir el gen 1 de T7 como es el con el pRIN10 del operón T4
(comparar calles 3 y 4 de la Figura 27 con las calles 2 y 3 de la
Figura 26); y 5) también se pueden obtener abundantes niveles de
NT-3 y BDNF de pAMGuvsX donde el
NT-3/BINF esta clonado y coexpresado con el pRIN10
del operón T4 (comparar Figuras 28 y 29 con la Figura 26).
Este Ejemplo describe la clonación del operón de
motA/asiA en plásmidos de copia única que contienen el sistema
MS2.
Los vectores de copia única se derivaron del
pSC101; Bernardi and Bernardi, Nuc. Acids Res.,
12:9415-9426. Este vector se digirió con
NdeI y luego se recirculariza para producir el plásmido pSC101dNde.
Un ligador de ADN que contiene los sitios Bg1II y NsiI se introdujo
en el sitio EcoRI de este plásmido. Un fragmento del pAMG22 de NsiI
a Bg1II que contiene T1T2, promotor PS4 y el sitio de clonación
múltiple se clonó luego para crear el plásmido pT52. Luego el pTS2
se cortó con M1uI y Xmnl, los extremos se quitaron las puntas
mediante un fragmento Klenow; Sambrook et al., Molecular
cloning, a laboratory manual, Segunda edición, Cold Spring
Harbor Laboratory Press, páginas 5.40-5.41 (1989), y
el plásmido se recircularizó para producir pTS2d. Los fragmentos de
los vectores de plásmidos pRIN que contienen el promotor blanco, el
sitio de reconocimiento MS2, gen MS2CP y el promotor TET se
generaron por PCR mediante los oligonucleótidos
828-31 y 1553-72 (ver Tabla 1).
Estos fragmentos se digirieron con AatIl y Bg1II y luego se ligaron
en pTS2d para crear los vectores de plásmidos pCB (ver la Figura
30). El operón motA/asiA descrito en el Ejemplo 10 luego se clonó en
estos vectores plásmidos pCB desde XbaI a XhoI para crear los
vectores plásmidos pAw11 (ver la Figura 31).
Otro plásmido de pCB único se construyó mediante
el promotor TET mutado para el control de la proteína de cubierta
de MS2. Se construyó un casete del gen de la proteína de cubierta de
MS2 unida al promotor TET por PCR mediante los oligonucleótidos
1870-97 y 1906-27(ver Tabla
1). Este fragmento se digirió XhoI a Bg1II y se ligó en pTS2d para
crear pCB11. El operón motA/asiA descrito en el Ejemplo 10 luego se
clonó en este vector desde XbaI a XhoI para crear pAW11 (promotor
PS4).
Este Ejemplo describe el examen de los vectores
plásmidos pAW preparados y descritos en el Ejemplo 12. Los
experimentos de expresión se realizaron en los genes del producto
que se clonaron bajo los promotores del T4 uvsX o X. Se compararon
las características de expresión y pérdida de los siguientes
sistemas: 1) gen 1 de T7 clonado y coexpresado con pAW20 en E.
coli GM221 que contiene pAMGX (es decir, el gen 1 de T7 bajo
control del promotor T4 X; 2) SPI clonado y coexpresado con pAW20
E. coli GM225 que contiene pAMGX (es decir, SPI bajo control
del promotor T4 X; 3) OPG clonado y coexpresado con pAW20 en E.
coli GM225 que contiene pAMGuvsX (es decir, OPG bajo el control
del promotor T4 uvsX); 4)BDNF clonado y coexpresado con pAW11
en E. coli GM225 que contiene pAMGuvsX (es decir, BDNF bajo
el control del promotor T4 uvsX ); 5) OPG clonado y coexpresado con
pAW11 en E. coli GM225 que contiene pAMGuvsX (es decir, OPG
bajo el control del promotor de T4 X; 6) NT3 clonado y coexpresado
con pAW11 en E. coli GM225 que contiene pAMGuvsX (es decir,
NT3 bajo el control del promotor T4 uvsX; y 7) 3MNDF clonado y
coexpresado con pAW11 en E. coli GM225 que contiene pAMGX
(es decir, 3MNDF bajo el control del promotor X de T4).
Para cada experimento se escogieron colonias
únicas de las placas y se cultivaron en 5 ml de 2XYT con
tetraciclina y kanamicina. Los tubos se agitaron toda la noche a
28ºC. Se ajustaron tubos de 50 ml con 5 ml de 2XYT con tetraciclina
y kanamicina. Los tubos frescos se inocularon con 50 \mul de los
cultivos iniciadores. Estos tubos se cultivaron con agitación a
28ºC a una DO de 0,6-1,2. Los cultivos que contienen
el promotor PS4 y los cultivos que contienen el promotor lac UV5 se
indujeron con 20 \mul de IPTG, mientras que los cultivos que
contienen el promotor lambda (pAMG) se indujeron por el cambio a
37ºC o 42ºC. El tiempo de inducción para todos los experimentos de
expresión fue de 4,0 horas. Se centrifugó 1 ml de cada cultivo
durante 10 minutos. El sobrenadante se decantó y el sedimento se
congeló. Se diluyeron 500 \mul de cada cultivo en 500 \mul de
LB y se tomó la densidad óptica. Los sedimentos luego se
descongelaron y resuspendieron en buffer de craqueo 0,01 unidades
de DO/\mul. Luego se cargaron 6 \mul de estos sedimentos
craqueados en gel de poliacrilamida SDS (4-20% o
16%). Después de la corrida a 150V durante 1,3 horas los geles se
tiñeron con azul coomassie para visualizar las proteínas.
Los datos de las Figuras 32-34
se pueden sintetizar de la siguiente manera: 1) se pueden obtener
abundantes niveles del gen 1 de T7 en el pAMGX donde el n gen 1 de
T7 está clonado y coexpresado con pAW20 (Figura 32); 2) se pueden
obtener abundantes niveles de SPI en el pAMGX donde SPI está clonado
y coexpresado con pAW20 (Figura 33); y 3) se pueden obtener
abundantes niveles de OPG en pAMGuvsX donde OPG está clonado y
coexpresado con pAW20 (Figura 34).
Los datos de las Figuras 35-38
se pueden sintetizar de la siguiente manera: 1) se pueden obtener
abundantes niveles de BDNF en pAMGuvsX donde BDNF está clonado y
coexpresado con pAW11 (Figura 35); 2) se pueden obtener abundantes
niveles de OPG en el pAMGuvsX donde OPG está clonado y coexpresado
con pAW11 (Figura 36); 3) se pueden obtener abundantes niveles de
NT3 en pAMGuvsx donde NT3 está clonado y coexpresado con pAW11
(Figura 37); 4) se pueden obtener abundantes niveles de 3MNDF en
pAMGX donde 3MNDF está clonado y coexpresado con pAW11 (Figura
38).
Debido a que el examen con los plásmidos pAW de
copia única proporciona un sistema similar al que se produciría si
el casete de T4 basado en MS2 se colocara en el cromosoma, está
contemplado por la presente invención que cada uno de los elementos
promotores medios de MS2-T4 requeridos se podrían
colocar en el cromosoma de la célula hospedante para proporcionar un
sistema efectivo de control ajustado.
Este Ejemplo describe el uso de un sistema de T4
basado en MS2 para expresar en forma efectiva una proteína accesoria
y por lo tanto mejora la expresión de una proteína blanco.
Un operón de T4 que contenía motA y asiA se
construyó por PCR para tener un sitio XhoI en el comienzo, seguido
por un sitio de reconocimiento de MS2 y un sitio BamHI en el extremo
del gen asiA que está también precedido por un sitio de
reconocimiento de MS2 (oligonucleótidos 1351-01 y
1260-86) (ver Tabla 1) Este fragmento luego se
clonó en los sitios correspondientes de pRIN10 (que da el pRIN10 del
operón de T4).
Se construyó el gen 0.6 de T7 para tener un
sitio XbaI seguido por un sitio de reconocimiento de MS2 y finaliza
con un sitio XhoI (oligonucleótidos 1443-41 y
1465-31) (ver Tabla 1). Este fragmento 0.6 luego se
colocó en el pRIN10 del operón de T4 empelando los sitios
correspondientes. Esto produce un plásmido (pRIN10 del operón de T4
0,6) que puede expresar al gen 0.6 y los factores de transcripción
de T4. Luego se realizaron los experimentos de expresión (siguiendo
el mismo protocolo experimental que se describe en el Ejemplo 11)
empleando un sistema donde el BDNF estaba clonado y coexpresado con
el pRIN10 del operón de T4 0,6 en E. coli huésped de GM225
que contiene pAMGuvsX (es decir, BDNF bajo el control del promotor
medio de T4 uvsX).
Como se ilustra en la Figura 39, se podrían
obtener abundantes niveles de BDNF mediante este sistema y los
niveles obtenidos fueron superiores a los que se obtuvieron mediante
un sistema del pRIN10 del operón de T4 carente del gen 0.6
(comparar las calles 4 y 5, Figura 29 a las calles 4 y 5, Figura
39). En consecuencia, la proteína accesoria (0.6) aumentó la
expresión de la proteína blanco en un sistema de expresión promotor
escalonado.
En la siguiente Tabla 1 se proporcionan los
oligonucleótidos usados en los Ejemplos descritos en la presente
memoria.
Las células hospedantes de E. coli
K-12/GM350 se depositaron con el ATCC (American Type
Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, USA) el 20
de enero de 1999.
Las células hospedantes de E. coli
K-12/GM225 han sido depositadas con el ATCC
(American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville,
MD, USA) el 27 de enero de 1998, y se asignó el No. de acceso
20281.
Las células hospedantes de E. coli
K-12/GM225 que contienen el vector del plásmido
pAMG13 han sido depositadas con el ATCC (American Type Culture
Collection,120301 Parklawn Drive, Rockville, MD, USA) el 27 de enero
de 1998 y se asignó el acceso No. 98641.
Las células hospedantes de E. coli
K-12/GM225 que contienen el vector del plásmido
pAMG25 han sido depositadas con el ATCC (American Type Culture
Collection, 12301 ParklawnDrive, Rockville, MD, USA) el 27 de enero
de 1998, y se asignó el acceso No. 98642.
Las células hospedantes de E. coli
K-12/GM225 que contienen el vector del plásmido 3002
nahG han sido depositadas con el ATCC (American Type Culture
Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, USA) el 27 de enero
de 1998, y se asignó el acceso No. 98645.
Las células hospedantes de E. coli
K-12/GM225 que contienen el vector del plásmido
pRIN10 (wt) ATCC han sido depositadas con el (American Type Culture
Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, USA) el 27 de enero
de 1998, y se asignó el acceso No. 98639.
Las células hospedantes de E. coli
EM11-11M ATCC han sido depositadas con el ATCC
(American Type CultureCollection, 12301 Parklawn Drive, Rockville,
MD, USA) el 27 de enero de 1998, y se asignó el acceso No.
202083.
Las células hospedantes de E. coli
EE11-20 han sido depositadas con el ATCC (American
Type CultureCollection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, USA) el
27 de enero de 1998, y se asignó el acceso No. 202082.
Las células hospedantes de E. coli
K-12/GM225 que contienen el vector del plásmido
pAMGuvsX han sido depositadas con el ATCC (American Type Culture
Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, USA) el 27 de enero
de 1998 y se asignó el acceso No. 98644.
Las células hospedantes de E. coli
K-12/GM225 que contienen el vector del plásmido
pAMGX han sido depositadas con el ATCC (American Type Culture
Collection, 12301 ParklawnDrive, Rockville, MD; USA) el 27 de enero
de 1998, y se asignó el acceso No. 98643.
Las células hospedantes de E. coli
K-12/GM225 que contienen el vector del plásmido
pRIN10 del operón T4 han sido depositadas con el ATCC (American Type
Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, USA) el 27
de enero de 1998, y se asignó el acceso No. 98640.
Las células hospedantes de E. coli
K-12/GM225 que contienen el vector del plásmido
pAW20 han sido depositadas con el ATCC (American Type Culture
Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, USA) el 27 de enero
de 1998, y se asignó el acceso No. 98638.
Las células hospedantes de E. coli
K-12/FM-15 que contienen el vector
del plásmido pAMG21 se depositaron con el ATCC (American Type
Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, USA) y se
asignó el acceso No. 98113.
Las células hospedantes de
K-12/GM221 que contienen el vector del plásmido
pAMG33 se depositaron con el ATCC (American Type Culture Collection,
12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, USA) el 20 de enero de
1999.
El vector plásmido pAMG22 ha sido depositado con
el ATCC (American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive,
Rockville, MD, USA) el 28 de enero de 1998, y se asignó el acceso
No. 98646.
La presente invención ha sido descrita en
términos de realizaciones particulares halladas o propuestas para
comprender modos preferidos para la práctica de la invención. Será
apreciado por los expertos en la técnica, que a la luz de la
presente revelación se pueden realizar numerosas modificaciones y
cambios en las realizaciones particulares ejemplificadas sin
apartarse del alcance de las reivindicaciones.
<110> BROWN, WILLIAM C.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> EXPRESIÓN CONTROLADA ALTAMENTE
EFICIENTE DE GENES EXÓGENOS EN E. COLI
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> A-518
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> NO ASIGNADO TODAVÍA
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
1999-01-26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/072, 794
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1998-01-28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 98
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 397
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> bacteri6fago MS2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1851
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> bacteriófago de T7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 87
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> bacteriófago de T4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 87
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> bacteriófago de T4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> oligonucléotido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptatggcttct aacttcactc agttcgtact ggttcac
\hfill37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> oligonucléotido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgccttgtcaa ccagtacgaa ctgagtgaag ttagaagcca
\hfill40
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> oligonucléotido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaacggcggta ccggcgatgt aactgttgca ccgtccaact tc
\hfill42
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatttgcgaag ttggacggtg caacagttac atcgccggta cc
\hfill42
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcaaatggcg ttgctgaatg gatttcttcc aactct
\hfill36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> oligonucléotido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgctgcgagag ttggaagaaa tccattcagc aacgcc
\hfill6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> oligonucléotido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgcagccagg cttacaaagt aacttgcagc gttcgccagt cc
\hfill42
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> oligonucléotido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgcagaggac tggcgaacgc tgcaagttac tttgtaagcc tg
\hfill42
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> oligonucléotido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptctgcacaaa accgaaaata caccatcaag gtagaa
\hfill36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> oligonucléotido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgggacttct accttgatgg tctattttcg gttttg
\hfill36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 42
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtcccgaaag ttgcgaccca gactgtaggc ggtgtcgaac tg
\hfill42
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 42
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> oligonucléotido
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaaccggcagt tcgacaccgc ctaccgtctg ggtcgcaact tt
\hfill42
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> oligonucléotido
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccggttgctg catggcgcag ctacctgaac atggaa
\hfill36
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\vskip0.400000\baselineskip
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<211> 36
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<212> ADN
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<213> oligonucléotido
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgtcagttcc atgttcaggt agctgcgcca tgcagc
\hfill36
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<212> ADN
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<213> oligonucléotido
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<400> 19
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctgactatcc cgattttcgc aaccaactct gactgtgaac tg
\hfill42
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
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<211> 42
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<212> ADN
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<213> oligonucléotido
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<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptacgatcagt tcacagtcag agttggttgc gaaaatcggg at
\hfill42
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
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<211> 33
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> oligonucléotido
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<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatcgtaaaag ctatgcaggg tctgctaaaa gat
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
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<212> ADN
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<213> oligonucléotido
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<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipattgccatct tttagcagac cctgcatagc ttt
\hfill33
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<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 51
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> oligonucléotido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggcaatccaa ttccgtccgc aatcgctgca aactctggta tctactaata g
\hfill51
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 49
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> oligonucléotido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgatcctatta gtagatacca gagtttgcac cgattgcgga cggaattgg
\hfill49
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> oligonucléotido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgcaaatggc attgctgaat gg
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> oligonucléotido
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<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccattcagca atgccatttg cg
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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<211> 24
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<212> ADN
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<213> oligonucleótido
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<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccaactctga ccgtgaact atcg
\hfill24
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<210> 28
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<212> ADN
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<213> oligonucleótido
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgatcagttc acggtcagag ttgg
\hfill24
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<210> 29
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<211> 42
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> oligonucléotido
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagctggtgag ctcgatcatt gggcatacgc atgctgcagc gc
\hfill42
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 43
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> oligonucléotido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptctaggcgct gcagcatgcg tatgcccaat gatcgagctc acc
\hfill43
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<313> oligonucléotido
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggccaatcgc gaattgacgt cacgttcaga att
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> oligonucléotido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggccaattct gaacgtgacg tcaattcgcg att
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 35
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> oligonucléotido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatgcatcgag ctcgattagg acatggggcc tcgct
\hfill35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 69
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> oligonucléotido
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 66
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<212> ADN
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<213> oligonucléotido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 42
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> oligonucléotido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgattcccccg ggcaaataaa acgaaaggct cagtcgaaag ac
\hfill42
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 44
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> oligonucléotido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctgatcgcga cgtcttgtag aaacgcaaaa aggccatccg tcag
\hfill44
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 63
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<212> ADN
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<213> oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
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<212> ADN
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<213> oligonucléotido
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 39
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgggatccgt cattacgcga acgcgaagtc cgactc
\hfill36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 71
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 41
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggcccagtgc atgcctacgt gggtcctagt cgc
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 42
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgatcgcgact aggacccacg taggcatgca ctg
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> oligonucléotido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 43
\vskip1.000000\baselineskip
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\hskip-.1em\dddseqskipctgaatacgc tgaggcta
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> oligonucléotido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 44
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcagccagta gtaacctt
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 49
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> oligonucléotido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 45
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcgcgcgaat tctttcgatc tactaccaac gtgcaatacg gtctgacc
\hfill48
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> oligonucléotido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 46
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcgcgcgaat tctttcgaat gaagcactac gttatgccaa tccacacg
\hfill48
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 61
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> oligonucléotido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 61
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 49
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 62
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 49
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 50
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcgcgcggat ccgagtctat cactcagcag attcta
\hfill36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 51
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcgcgcggat ccctattatg agatagcgtt cagtgtgttg gc
\hfill42
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 52
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 69
<212 ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 52
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 53
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> oligonucléotido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 53
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcgcgccggat ccctatcagc ccattaacat tgcgtc
\hfill36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 54
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> oligonucléotido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 54
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\vskip0.400000\baselineskip
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\hfill36
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<211> 60
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<212> ADN
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<213> oligonucléotido
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 56
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\vskip0.400000\baselineskip
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\hfill60
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<212> ADN
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\vskip0.400000\baselineskip
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\hfill58
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<210> 58
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 56
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<212> ADN
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<213> oligonucléotido
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\vskip0.400000\baselineskip
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\hfill56
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\vskip0.400000\baselineskip
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\hfill45
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<213> oligonucleótido
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\vskip0.400000\baselineskip
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\newpage
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\vskip0.400000\baselineskip
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> oligonucleótido
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<210> 66
\vskip0.400000\baselineskip
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> oligonucleótido
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<213> oligonucleótido
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<211> 63
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<212> ADN
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> oligonucléotido
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> oligonucléotido
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
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\hfill32
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<212> ADN
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<213> oligonucléotido
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<400> 72
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatgaataaaa acattgatac agttcgtg
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\vskip0.400000\baselineskip
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<212> ADN
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<213> oligonucléotido
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 73
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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<400> 74
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\vskip0.400000\baselineskip
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\hfill21
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<211> 48
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<212> ADN
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<213> oligonucléotido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 75
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcgcgcagat ctgaagatct tattaatcag ataaaatatt tctaggcg
\hfill48
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 63
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> oligonucleotiflo
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,6cm
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 48
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> oligonucléotido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcgcgcggat ccctattatt tgttcgtata catctccagg tatcgata
\hfill48
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 78
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 65
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<212> ADN
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<213> oligonucléotido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 78
\hskip0,6cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 79
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
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<212> ADN
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<213> oligonucléotido
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 79
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcgcgcctcg agctattatg agatagcgtt cag
\hfill33
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 50
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<212> ADN
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<213> oligonucléotido
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<400> 80
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcgcgcgcat gcagatctgt atgcccaatg atcgagctgt tgtaattctc
\hfill50
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 81
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 42
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<212> ADN
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<213> oligonucléotido
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 81
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcgcgcctcg agccgcggct attagtagat accagagttt gc
\hfill42
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\vskip0.400000\baselineskip
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<212> ADN
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<213> oligonucléotido
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaacacccag cggcgctgc gtatcaatga tcgagctgt
\hfill39
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 83
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 38
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<212> ADN
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<213> oligonucléotido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaagcttactc gaggatccct attagtagat accagagt
\hfill38
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 84
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> oligonucléotido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 84
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgctgccgctg ttagtcttcg ttcc
\hfill24
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 85
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> oligonucléotido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 85
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctaccgcatt atagcttatc gatgataagc t
\hfill31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 86
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> oligonucléotido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 86
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgataagcta taatgcggta gtttacagtt aaa
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 87
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\hskip-.1em\dddseqskipttattcctcc ttgcgttagc aatttaactg tgataaacta ccgcattata gcttatcg
\hfill58
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 88
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 79
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> oligonucléotido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 88
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 89
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> oligonucléotido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 89
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccaccaccgg gtaccgtcgt tttacaacgt cgtgactgg
\hfill39
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 90
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 90
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccaccacacg gatccttatt tttgacacca gaccaact
\hfill38
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 91
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 88
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 92
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 92
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgttcgtactg gttgacaacg gcggtaccca cagtgactat atgggtggca
\hfill50
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 93
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatcgatgata agctgtcaat aatgagaatt
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 94
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgttagcaatt taactgtgat aaactaccgc
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 95
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\vskip0.400000\baselineskip
<213> oligonucleótido
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\hskip-.1em\dddseqskiptcaaccagta cgaactgagt gaagttagaa
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 96
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<211> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 96
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcagcttatca tcgataagct ataatgcggt agttaatcac
\hfill40
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 97
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 97
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgacacacgg tcaatggttg g
\hfill21
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 98
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> oligonncleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 98
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgccacccat atagtcactg tgg
\hfill23
Claims (16)
1. Un sistema de represión de la traducción para
usar en la clonación o expresión de un gen heterólogo específico,
dicho sistema que comprende una proteína del represor de la
traducción que codifica una región operativamente unida a un
promotor constitutivo, y dicho gen heterólogo operativamente unido a
un promotor inducible y un sitio de reconocimiento del represor, y
donde el represor de la traducción controla la expresión de dicho
gen heterólogo y donde el sitio de unión de la proteína represora
incluye la secuencia de unión al ribosoma y el codón de iniciación,
pero no cubre regiones codificadoras adicionales del gen
heterólogo.
2. El sistema de la reivindicación 1, done dicho
represor de la traducción es la proteína de cubierta del
bacteriófago MS2 (MS2CP).
3. Un proceso para la clonación o expresión de
un gen heterólogo, dicho proceso que comprende:
cultivar en condiciones adecuadas, células
hospedantes transformadas con un vector plásmido que comprende un
sistema de acuerdo con la reivindicación 1, dicho vector que
comprende una secuencia de ADN que codifica un promotor inducible,
una secuencia de ADN que codifica dicho gen heterólogo unido a un
sitio de reconocimiento del represor de la traducción y a dicho
promotor inducible, y una secuencia de ADN que codifica un represor
de la traducción operativamente unido a un promotor constitutivo,
donde dicho represor de la traducción controla la expresión de dicho
gen heterólogo, o
cultivar en condiciones adecuadas, células
hospedantes que han sido co-transformadas con un
primer vector plásmido que comprende un sistema de acuerdo con la
reivindicación 1, dicho vector que comprende una secuencia de ADN
que codifica un promotor inducible y dicho gen heterólogo unido a un
sitio de reconocimiento del represor de la traducción y a dicho
promotor inducible y un segundo vector plásmido que comprende una
secuencia de ADN que codifica un represor de la traducción
operativamente unido a un promotor constitutivo donde dicho represor
de la traducción controla la expresión de dicho gen heterólogo;
o
cultivar en condiciones adecuadas, células
hospedantes que comprenden un sistema de acuerdo con la
reivindicación 1, dichas células que albergan a una secuencia de ADN
que codifica un represor de la traducción operativamente unido a un
promotor constitutivo, transformado con un vector plásmido, dicho
vector que comprende una secuencia de ADN que codifica un promotor
inducible, y una secuencia de ADN que codifica dicho gen heterólogo
unido a un sitio de reconocimiento del represor de la traducción y a
dicho promotor inducible; donde dicho represor de la traducción
controla la expresión de dicho gen heterólogo; o
cultivar en condiciones adecuadas, células
hospedantes que comprenden un sistema de acuerdo con la
reivindicación 1, dichas células que albergan a una secuencia de ADN
que codifica un promotor inducible, una secuencia de ADN que
codifica dicho gen heterólogo unido a un sitio de reconocimiento del
represor de la traducción y a dicho promotor inducible, y a una
secuencia de ADN que codifica un represor de la traducción
operativamente unido a un promotor constitutivo; donde dicho
represor de la traducción controla la expresión de dicho gen
heterólogo.
4. Un proceso de la reivindicación 3, donde
dicho represor de la traducción es una proteína de cubierta del
bacteriófago MS2.
5. Un proceso de la reivindicación 3, donde
dicho vector además comprende la SEC ID NO:2.
6. Un sistema de acuerdo con la reivindicación
1, dicho sistema es un "casete del gen 1 de T7 controlado por
MS2", dicho casete que comprende una secuencia de ADN que
codifica el gen 1 de T7, un promotor inducible, el sitio de
reconocimiento de MS2 y el gen de la proteína de cubierta de MS2
bajo el control de un promotor constitutivo, dicho gen 1 de T7 unido
a dicho promotor inducible y a dicho sitio de reconocimiento de
MS2.
7. Una célula hospedante capaz de expresar el
gen heterólogo y tener un "casete del gen 1 de T7 controlado por
MS2", de acuerdo con la reivindicación 6, insertado en su
cromosoma.
8. Un proceso de acuerdo con la reivindicación
3, para expresar un gen heterólogo, dicho proceso que comprende:
cultivar en condiciones adecuadas, células
hospedantes que tengan un "casete del gen 1 de T7 controlado por
MS2", de acuerdo con la reivindicación 6, insertado en su
cromosoma y transformado con un vector del plásmido que contiene una
secuencia de ADN que codifica el gen heterólogo bajo el control de
un promotor de T7.
9. Un proceso de la reivindicación 8, donde
dicho gen heterólogo es un gen temprano de T7.
10. Un proceso de acuerdo con la reivindicación
3 para la clonación o expresión de un gen heterólogo, dicho proceso
que comprende:
cultivar en condiciones adecuadas, células
hospedantes que han sido co-transformadas con un
primer vector plásmido, que comprende un sistema de acuerdo con la
reivindicación 1, dicho vector que comprende una secuencia de ADN
que codifica dicho gen heterólogo bajo el control del promotor medio
de T4, y un segundo vector plásmido que comprende una secuencia de
ADN que codifica un promotor inducible, las secuencias génicas motA
y asiA, cada una ligada a un sitio de reconocimiento del represor de
la traducción y a dicho promotor inducible, y un represor de la
traducción operativamente unido a un promotor constitutivo; donde
dicho represor de la traducción controla la expresión de dichos
genes motA y asiA, y donde dichos genes motA y asiA dirigen la
transcripción del promotor medio de T4 mientras inhiben la
transcripción de dicho promotor inducible.
11. Un proceso de la reivindicación 10, donde
dicho segundo vector plásmido además comprende una secuencia de ADN
que codifica una proteína accesoria.
12. Un proceso de acuerdo con la reivindicación
3 para la clonación o expresión de un gen heterólogo, dicho proceso
que comprende:
cultivar en condiciones adecuadas, células
hospedantes que comprenden un sistema de acuerdo con la
reivindicación 1, dichas células que albergan a una secuencia de ADN
que codifica un promotor inducible, las secuencia génicas motA y
asiaA cada una ligada a un sitio de reconocimiento del represor de
la traducción y a dicho promotor inducible, y un represor de la
traducción operativamente unido a un promotor constitutivo,
transformado con un vector plásmido que comprende una secuencia de
ADN que codifica dicho gen heterólogo unido al promotor medio de T4;
donde dicho represor de la traducción controla la expresión de
dichos genes motA y asiaA, y donde dichos genes motA y asiaA dirigen
la transcripción desde el promotor medio de T4 mientras inhiben la
transcripción de dicho promotor inducible.
13. Un proceso de cualquiera de las
reivindicaciones 10-12, donde dicho represor de la
traducción es una proteína de cubierta del bacteriófago MS2.
14. Un sistema de acuerdo con la reivindicación
1, dicho sistema es un "casete de T4 basado en MS2", dicho
casete que comprende una secuencia de ADN que codifica un promotor
inducible, las secuencia génicas motA y asiaA cada una ligada al
sitio de reconocimiento de MS2 y a dicho promotor inducible, y el
gen de la proteína de cubierta de MS2 bajo el control de un promotor
constitutivo.
15. Una célula hospedante procariota capaz de
expresar un gen heterólogo y que tiene un "casete de T4 basado en
MS2", de acuerdo con la reivindicación 14, insertado en su
cromosoma.
16. Un proceso de acuerdo con la reivindicación
3 para la clonación o expresión de un gen heterólogo, dicho proceso
que comprende:
cultivar en condiciones adecuadas, células
hospedantes que tienen un "casete basado en MS2", de acuerdo
con la reivindicación 6 o 14, insertado en su cromosoma y
transformadas con un vector de expresión que contiene una secuencia
de ADN que codifica dicho gen heterólogo bajo el control de un
promotor de T4.
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