PT1051502E - Expressão de genes exógenos com e. coli de uma forma controlada e altamente eficiente - Google Patents

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Description

DESCRIÇÃO
EXPRESSÃO DE GENES EXÓGENOS EM E. COLI NUMA FORMA
CONTROLADA E EFICIENTE
ÂMBITO DA INVENÇÃO A presente invenção tem por objecto novos sistemas de vectores de expressão e sistemas melhorados, capazes de expressarem genes exógenos, incluindo genes tóxicos, em E. coli e em outras células hospedeiras. Mais especificamente, a presente invenção tem por objecto sistemas de vectores de expressão, fortemente regulados, altamente eficientes, que utilizam a proteína de revestimento do bacteriófago MS2 (PRMS2) e o sítio de reconhecimento de MS2 para a tradução de controlo do ARNm para qualquer gene clonado numa célula hospedeira. Além disso, a presente invenção tem por objecto sistemas de vectores de expressão que utilizam proteínas de controlo transcricional, por exemplo, motA e asiA do bacteriófago T4, para regular a transcrição e providenciar um sistema promotor induzível, faseado, que é muito menos complicado e muito mais versátil do que os sistemas não faseados previamente descritos.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
As células procarióticas têm-se tornado no sistema de escolha para a expressão de genes clonados, que codificam polipéptidos eucarióticos e procarióticos e existem numerosos sistemas de expressão para a expressão de produtos de genes em bactérias. A expressão de genes em E. coli, ficou estabelecida como uma técnica chave na compreensão dos processos moleculares e os sistemas de expressão de E. coli tornaram-se um padrão e um processo popular para a produção e a purificação em larga escala de proteínas exógenas. O que é 1 importante é que a tecnologia tem providenciado uma fonte de proteínas numa quantidade e qualidade que foi previamente difícil ou mesmo impossível de alcançar através do isolamento a partir de fontes naturais. Já está descrito um certo número de sistemas de expressão patenteados para serem utilizados em hospedeiros bacterianos. Nalguns exemplos, os sistemas de expressão descritos referem-se a sistemas de expressão generalistas, enquanto noutros exemplos, o sistema de expressão patenteado destina-se a permitir uma regulação relativamente apertada ou está formatado individualmente para expressão de uma proteína em particular. Exemplos dessas patentes incluem a patente de invenção norte-americana U.S. N°. 4.767.708 (construção do vector recombinante contendo uma polimerase I do ADN bacteriano clonado, sob controlo de um promotor estranho positivamente regulado); patente de invenção norte-americana U.S. N°. 4.503.142 (construção de uma classe de clonagem e de vectores de expressão com base na utilização do promotor/operador lac de E. coli); e patente de invenção norte-americana U.S. N°. 4.578.355 (utilização do promotor PL do bacteriófago lambda, para construir vectores com elevado nível de expressão).
Outro sistema de expressão largamente utilizado, refere-se ao sistema de expressão do vector pET, que faz uso da poderosa polimerase de ARN T7 para transcrever os genes que interessa; Studier et al., J. Mol. Biol., 189:113-130 (1986). A polimerase de ARN T7 é altamente selectiva para os seus próprios promotores e até hoje não se conhecem promotores de T7 no ADN de E. coli. T7 utiliza a sua polimerase altamente selectiva para dirigir a transcrição para o seu próprio ADN em vez do ADN do hospedeiro durante a infecção e uma quantidade relativamente pequena de polimerase de ARN de T7 2 para dirigir uma transcrição de alto nível de um promotor de T7 num plasmido em múltiplas cópias. Além disso, a polimerase de ARN de T7 é pelo menos 5 vezes mais activa do que as polimerases de E. coli; Id. Muitas proteínas heterólogas já foram expressas com sucesso com rendimentos elevados utilizando o sistema pET; ver, por exemplo, Dietrich et al., Eur. J. Biochem, 203.:399-407 (1991); Lathrop et al. , Protein Expr. Purif., 3:512-517 (1992); Aukhil et al., J. Biol. Chem., 268:2542-2553 (1993).
Infelizmente, este e outros sistemas jã referenciados ainda sofrem em menor ou maior grau dos mesmos problemas, tais como: 1) expressão não induzida resultante do escape do promotor; 2) incapacidade para controlar a expressão na dimensão necessária quando o produto do gene vai matar ou, de alguma forma, danificar seriamente a célula hospedeira se for expresso (mais normalmente associada com a expressão de genes eucarióticos em bactérias); 3) a necessidade de apelar à indução da expressão quer nas respostas bioquímicas dos hospedeiros ou o problema de se tratar de mecanismos de indução de alguma forma inadequados ou caros; 4) incapacidade para expressar um gene de interesse em níveis suficientes; e 5) instabilidade do plasmido. Até que esses problemas sejam adequadamente entendidos e ultrapassados com sucesso, o potencial total desses sistemas de expressão não será completamente apreciado nem utilizado.
Todos os sistemas de promotores indutíveis conhecidos têm um nível residual de actividade ou de "perda", que leva a uma transcrição inapropriada e a uma expressão do gene a ser clonado sob o controlo do promotor. Na maioria dos casos, isto não é um problema porque o produto do gene a ser produzido é bem tolerado pela célula, isto é, o produto do gene não é tóxico. Contudo, nos casos em que o produto do 3 gene a ser produzido é tóxico ou mesmo letal para a célula, mesmo estas pequenas quantidades de expressão podem ser prejudiciais. De facto, há certos genes tóxicos que têm sido caracterizados como "não clonáveis" porque eles são instáveis em qualquer vector de clonagem.
Studier, F.W., J. Mol. Biol., 219:37-44 (1991) levantou o problema da expressão com perdas nos vectores pET desenvolvendo as séries Lis de vectores. Estes vectores abriga o gene para a lisozima T7, que liga a polimerase de ARN de T7 presente nas células não induzidas e previne a transcrição dos genes alvo. Dubendorff e Studier, J. Mol, Biol., 219:45-59 (1991) levantou o problema providenciando cópias adicionais dos elementos de controlo do operão lac nos plasmidos de pET. Brown et al. , Gene, 127:99-103 (1993) utilizou a indução por infecção com o mutante do fago de T7 para clonar com sucesso o gene tóxico POL3. Infelizmente, este e outros sistemas referenciados falham no alívio completo do problema de perda ou sofrem dos problemas da instabilidade dos plasmidos e da lise das células associadas com elevados níveis de lisozima e/ou de infecção de fagos. A presente invenção, conforme é reivindicada, levanta e ultrapassa o problema da perda de promotor, utilizando as capacidades de repressão translacional da proteína de revestimento MS2 de bacteriófago. MS2 de bacteriófago é um fago contendo ARN com um ciclo de vida relativamente simples; Van Duin, J. , Single-Stranded RNA Bacteriophages in The Bacteriophages, Capítulo 4, págs. 117-167, Plenum Press, New York (1988) . O ARN codifica quatro genes, um dos quais é um gene de replicase que copia o genoma, outro dos quais é o gene da proteína de revestimento multifuncional. Como a concentração da proteína de revestimento aumenta na célula, forma um dímero e liga-se a uma estrutura em forma de 4 alfinete, que consiste no sítio de ligação do ribossoma e ATG do gene de replicase. Esta ligação inibe então qualquer outra tradução a partir do gene de replicase e muda efectivamente o ciclo de vida para a envolvente do genoma. A sequência da proteína de revestimento MS2 já foi publicada; Fiers et al. , Nature, 260:500-507 (1976), os mutantes da proteína de revestimento, já foram isolados e caracterizados; Peabody & Ely, Nucleic Acids Research, ,20(7):1649-1655 (1992) e a construção dum sistema com dois plasmidos para análise genética da actividade do repressor translacional da proteína de revestimento, já foi descrita; Peabody, D., Journ. ofBiol. Chem., 265(10):5684-5689 (1990). O bacteriófago MS2 não é o único fago conhecido por ter proteínas que se ligam ao ARN mensageiro e inibem a tradução. Por exemplo, a proteína regA do bacteriófago T4 e a proteína do gene V de M13, são duas outras dessas proteínas. Contudo, uma diferença chave entre a proteína regA, a proteína do gene V e a proteína de revestimento MS2, diz respeito à colocação dos seus sítios de reconhecimento relativamente ao sítio inicial do gene. Por exemplo, o sítio de reconhecimento das proteínas regA está constituído por sequências na região de codificação do gene, limitando assim os genes que podem ser controlados por ele. A proteína do gene V reconhece uma sequência a montante da sequência de ligação do ribossoma e assim pode ainda permitir um nível baixo da iniciação translacional. Para MS2, o sítio de ligação não cobre as regiões de codificação do gene mas inclui a sequência de ligação do ribossoma e o codão de iniciação. O sistema MS2 permite assim uma repressão a mais rígida possível enquanto permite ainda que o sítio seja utilizado universalmente. 5 A utilização específica dos sítios de reconhecimento de PRMS2 e MS2 será descrita com mais detalhe nos exemplos dados aqui. Como será demonstrado por esses exemplos, esta utilização única do sistema MS2 permite a um especialista na matéria resolver com eficácia o problema da perda do promotor normalmente associada com a expressão de genes heterólogos em bactérias. De um ponto de vista da produção comercial, isto é particularmente útil porque não é geralmente favorável à perda de produto antes do ponto de indução. E, como está relacionado com a capacidade para o genes tóxicos se expressarem efectivamente, isto pode ser de um tremendo valor para os que trabalham neste domínio, porque algum destes genes se expressos em quantidades limitadas, podem ter utilizações benéficas.
Outro aspecto importante do desenho do sistema de expressão bacteriana, é a regulação da transcrição. Sabe-se que para muitos organismos, o tempo de expressão do gene é regulado pela produção de proteínas de controlo da transcrição específicas. Isto é particularmente verdade para um certo número de bacteriófagos diferentes, dado que a progressão ao longo do seu ciclo de vida é regulada pelo aparecimento de diferentes proteínas de transcrição, que levam à expressão de todas as classes de genes que correspondem ao estado do seu desenvolvimento. Por exemplo, sabe-se à muito tempo que o bacteriófago T4 se move através do seu ciclo de vida desta forma e que os mecanismos actuais já foram suficientemente esclarecidos; Brody et al., FEMS Micro. Letters, 128:1-8 (1995). Este fago lítico tem três classes de genes: precoce; médio; e tardio. Os promotores de genes precoces são muito semelhantes aos promotores fortes de E. coli e são reconhecidos imediatamente após a infecção pela polimerase do ARN do hospedeiro. A acumulação de dois produtos de genes precoces, motA e asiA, muda a transcrição 6 para um modo suave. A proteína motA é uma proteína de 23,5 kDa, que guia a polimerase de ARN para os promotores médios de T4, por meio do reconhecimento de uma sequência na região -30 dos promotores. A proteína asiA é uma proteína de 10,5 kDa, originalmente conhecida por ser uma proteína de factor anti-sigma, isto é, que liga o sigma 70 de E. coli e torna-o não funcional. Sabe-se hoje em dia, contudo, que a ligação de asiA a sigma 70 actualmente causa uma alteração conformacional que vai abolir o reconhecimento da região -35 dos promotores de E. coli e a proteína asiA pode actuar como uma ponte entre a proteína motA e a subunidade de sigma 70. Além disso, a proteína asiA também inibe o reconhecimento dos promotores precoces de T4. MotA e asiA são necessárias e suficientes para a transcrição específica dos promotores médios de T4. Estes detalhes foram determinados por ensaios de transcrição in vitro, utilizando motA e asiA purificados e polimerase de ARN de E. coli não modificada; Ouhammouch et al., Proc. Natl. Acad. Sei. EUA, 92:1451-1455 (1995). A presente invenção tem por objecto novos promotores e uma nova utilização dos promotores médios de T4, para regular a transcrição de qualquer gene clonado numa célula hospedeira procariótica. As vantagens principais deste sistema promotor, residem no facto de que ele dirige a transcrição de promotores específicos, ao mesmo tempo que inibe a transcrição de promotores de E. coli, o que minimiza assim a concorrência de aparelhos translacionais e inibe a célula de responder à produção da proteína alvo por meio da indução da transcrição dos genes de protease. Utilizando o sistema promotor médio de T4 aqui descrito, é também possível expressar certas proteínas acessórias antes da indução da proteína alvo num ciclo de expressão "por etapas", que pode ser induzido por um único sinal, reduzindo assim a natureza complicada dos actuais protocolos de expressão, que 7 geralmente requerem múltiplos eventos de indução para conseguirem realizar essa expressão. As especificidades do sistema promotor médio de T4, estão descritos nos exemplos dados aqui. A presente invenção, através da utilização do sistema de MS2 para regular de forma apertada a tradução e a sua utilização de promotores médios de T4 para regular a transcrição, providencia sistemas de vectores de expressão fortemente regulados, altamente eficientes, capazes de expressar genes exógenos, incluindo genes tóxicos em E. coli e noutras células hospedeiras. Os sistemas aqui descritos, para além de resolverem os problemas associados a outros sistemas conhecidos, providenciam, pela primeira vez, sistemas de promotores por fases que são muito mais versáteis do que os sistemas descritos previamente. Estes sistemas serão de um valor tremendo para aqueles que trabalham na área do desenho de sistemas de expressão bacteriana.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção, conforme reivindicado, providencia um sistema de expressão translacional para ser utilizado na clonagem ou na expressão de um gene heterólogo em células hospedeiras, compreendendo o referido sistema um repressor translacional ligado operacionalmente a um promotor constitutivo. Num enquadramento preferido, o repressor translacional é a proteína de revestimento de MS2. A presente invenção tem ainda por objecto, conforme reivindicado, um processo de melhoria para a clonagem ou expressão de um gene heterólogo, compreendo o referido processo a cultura, em condições apropriadas, de células 8 hospedeiras transformadas com um vector de plasmido, compreendendo o referido vector uma sequência de ADN que codifica o referido gene heterólogo ligado a um sítio de reconhecimento do repressor translacional e uma sequência de ADN que codifica um repressor translacional ligado operacionalmente a um promotor constitutivo; em que o referido repressor translacional controla a expressão do referido gene heterólogo. Num enquadramento preferido, o repressor translacional é a proteína de revestimento MS2. Num enquadramento, o vector ainda compreende uma sequência de ADN, que codifica 0,3 - 0,7 genes precoces do bacteriófago T7 (SEQ ID N°. 2). A presente invenção tem ainda por objecto um processo, um processo melhorado, conforme reivindicado, para a clonagem ou a expressão de um gene heterólogo, compreendendo o referido processo a cultura, em condições apropriadas, de células hospedeiras que tenham sido co-transformadas com um primeiro vector de plasmido, que compreende uma sequência de ADN, que codifica um promotor indutível e o referido gene heterólogo ligado a um sítio de reconhecimento do repressor translacional e um segundo vector de plasmido que compreende uma sequência de ADN que codifica um repressor translacional ligado operacionalmente a um promotor constitutivo; em que o referido repressor translacional controla a expressão do referido gene heterólogo. Num enquadramento preferido, o repressor translacional é a proteína de revestimento MS2. A presente invenção ainda tem por objecto um processo melhorado, tal como reivindicado, para a clonagem ou a expressão de um gene heterólogo, compreendendo o referido processo a cultura, em condições apropriadas, de células hospedeiras que comportam uma sequência de ADN, que codifica um repressor translacional ligado operacionalmente a um 9 promotor constitutivo, transformado com um vector de plasmido, compreendo o referido vector uma sequência de ADN que codifica um promotor indutível e uma sequência de ADN que codifica o referido gene heterólogo ligado a um sítio de reconhecimento do repressor translacional; em que o referido repressor translacional controla a expressão do referido gene heterólogo. Num enquadramento preferido, o repressor translacional é a proteína de revestimento MS2. A presente invenção ainda tem por objecto um processo melhorado, tal como reivindicado, para a clonagem ou a expressão de um gene heterólogo, compreendendo o referido processo a cultura, em condições apropriadas, de células hospedeiras que comportam uma sequência de ADN codificando um promotor indutível, uma sequência de ADN que codifica o referido gene heterólogo ligado ao sítio de reconhecimento do repressor translacional e uma sequência de ADN que codifica um repressor translacional ligado operacionalmente a um promotor constitutivo; em que o referido repressor translacional controla a expressão do referido gene heterólogo. Num enquadramento preferido, o repressor translacional é a proteína de revestimento MS2. A presente invenção ainda tem por objecto uma "cassete do gene 1 de T7 controlado por MS2", tal como reivindicado, em que a referida cassete compreende uma sequência de ADN que codifica um promotor indutível, o sítio de reconhecimento de MS2 ligado ao gene 1 de T7 e o gene da proteína de revestimento MS2 sob o controlo de um promotor constitutivo fraco. A presente invenção ainda tem por objecto células hospedeiras capazes de expressar um gene heterólogo e comportando uma "cassete do gene 1 de T7 controlada por MS2". 10 A presente invenção tem ainda por objecto, um processo melhorado, conforme reivindicado, para a expressão de um gene heterólogo, compreendendo o referido processo a cultura, em condições apropriadas, de células hospedeiras que comportam uma "cassete do gene 1 de T7 controlada por MS2" e transformada por um vector de expressão contendo uma sequência de ADN que codifica o referido gene heterólogo sob o controlo de um promotor de T7. A presente invenção ainda tem por objecto uma série de células hospedeiras capazes de clonar ou expressar um gene heterólogo, sendo as referidas células hospedeiras tratadas por engenharia genética para produzir concentrações diferentes de PRMS2. A presente invenção tem ainda por objecto um sistema promotor indutível em etapas para a clonagem ou a expressão de um gene heterólogo, compreendendo o referido sistema proteínas de controlo transcricional reguladas, que dirigem a transcrição de promotores específicos, ao mesmo tempo que inibem a transcrição geral de promotores de hospedeiros bacterianos. Num enquadramento preferido, as proteínas de controlo transcricional são motA e asiA e as referidas proteínas são reguladas por PRMS2. A presente invenção tem ainda por objecto um processo melhorado, tal como reivindicado, para a clonagem ou a expressão de um gene heterólogo, compreendo o referido processo a cultura, em condições apropriadas, de células hospedeiras que tenham sido co-transformadas com um primeiro vector de plasmido, compreendendo uma sequência de ADN que codifica o referido gene heterólogo sob o controlo do promotor médio de T4 e um segundo vector de plasmido que 11 compreende uma sequência de ADN, que codifica um promotor indutível, motA e as sequências do gene asiA cada uma delas ligadas a um sítio de reconhecimento do repressor translacional e um repressor translacional ligado operacionalmente a um promotor constitutivo; em que o referido repressor translacional controla a expressão dos referidos genes motA e asiA e em que os referidos genes motA e asiA dirigem a transcrição do promotor médio de T4 ao mesmo tempo que inibem a transcrição do referido promotor indutível. Num enquadramento preferido, o repressor translacional é a proteína de revestimento MS2. Num enquadramento, o segundo vector do plasmido ainda compreende uma sequência de ADN, que codifica uma proteína acessória. A presente invenção tem ainda por objecto um processo melhorado, conforme reivindicado, para a clonagem ou a expressão de um gene heterólogo, compreendendo o referido processo a cultura, em condições apropriadas, de células hospedeiras que comportam uma sequência de ADN que codifica um promotor indutível, sequências dos genes motA e asiA ligados, cada um deles, a um sítio de reconhecimento do repressor translacional e um repressor translacional ligado operacionalmente a um promotor constitutivo, transformado com um vector de plasmido que compreende uma sequência de ADN, que codifica o referido gene heterólogo ligado sob o controlo do promotor médio de T4 ,* em que o referido repressor translacional controla a expressão dos referidos genes motA e asiA e em que os referidos genes motA e asiA dirigem a transcrição do promotor médio de T4 ao mesmo tempo que inibem a transmissão do referido promotor indutível. Num enquadramento preferido, o repressor translacional é a proteína de revestimento MS2. 12 A presente invenção tem ainda por objecto uma "cassete de T4 à base de MS2", compreendo a referida cassete uma sequência de ADN que codifica um promotor indutível, sequências dos genes motA e asiA, cada um deles, ligado a uma sequência de reconhecimento de MS2 e um gene da proteína de revestimento MS2 sob o controlo de um promotor constitutivo. A presente invenção tem ainda por objecto uma célula hospedeira procariótica, capaz de expressar um gene heterólogo e comportando uma "cassete de T4 à base de MS2". A presente invenção tem ainda por objecto um processo melhorado, conforme reivindicado, para a clonagem ou a expressão de um gene heterólogo, compreendendo o referido processo a cultura, em condições apropriadas, de células hospedeiras que comportam uma "cassete à base de MS 2" e transformadas com um vector de expressão que contém uma sequência de ADN que codifica o referido gene heterólogo sob o controlo de um promotor de T4. A presente invenção ainda tem por objecto a sequência de ADN da SEQ ID N°. 1 e a sequência de ADN da SEQ ID N°. 2.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A figura 1 é a sequência completa do gene (SEQ ID N°. 1) da proteína de revestimento MS2 de tipo selvagem, utilizada nos sistemas da presente invenção. O gene tem um sítio Ndel na extremidade 5' e um sítio BamHI na extremidade 3'. A figura 2 é uma fotografia de um gel de SDS, que mostra os resultados das experiências de expressão de PRMS2ts. A coluna 1 é um putativo clone positivo não induzido das 13 células hospedeiras BL21(DE3) (contendo o gene PRMS2ts em pT7-7) crescendo até uma D.O. (densidade óptica) de 0,6; as colunas 2-14 são vários putativos clones positivos das células hospedeiras BL21(DE3) (contendo o gene PRMS2ts em pT7-7) , após 4 horas de indução a 3 7 °C. A coluna 15 representa os marcadores do arco de Amersham do intervalo pequeno. A figura 3 é um diagrama esquemático dos vectores do plasmido pRIN desenvolvidos na presente invenção. A figura 4 é uma fotografia de uma análise de mancha de
Western, que mostra os resultados de uma experiência de expressão e perda, realizada com vários vectores de plasmido pRIN em que o gene 1 de T7 foi clonado. Esta análise de mancha, em particular, é de uma cultura estacionária feita durante a noite e em que cada conjunto de colunas representa o gene 1 de T7, mais ou menos (m) uma caixa a jusante no mesmo vector. Os primeiros três conjuntos de colunas utilizam pRINll (promotor de PS4) com vários PRMS2s. Os últimos três conjuntos de colunas utilizam pRIN20 (promotor UV5 lac) cora vários PRMS2s. A coluna 4 é o intervalo menor dos marcadores de peso molecular da Bicrad. A figura 5 é uma fotografia de uma análise de mancha de Western, que mostra os resultados de uma experiência de expressão e perda, realizada com vários vectores do plasmido pRIN em que o gene 1 de T7 foi clonado. Esta análise de mancha em particular é de uma cultura de pré-indução com crescimento exponencial (prel) e cada conjunto de colunas é o gene 1 de T7, mais ou menos (m) uma caixa a montante, no mesmo vector. Os primeiros três conjuntos de colunas utilizam pRINll (promotor de PS4) com vários PRMS2s. Os últimos três conjuntos de colunas utilizam pRIN20 (promotor de UV5 lac) 14 com vários PRMS2s. A coluna 1 é o intervalo menor dos marcadores de peso molecular da Biorad. A figura 6 é uma fotografia de uma análise de mancha de
Western, que mostra os resultados de uma experiência de expressão e perda realizada com vários vectores do plasmido pRIN em que o gene 1 de T7 foi clonado. Esta análise de mancha, em particular, é de uma cultura induzida por IPTG que cresceu a 28 °C e cada conjunto de colunas é uma caixa a jusante, mais ou menos (m) gene 1 no mesmo vector. Os primeiros três conjuntos de colunas utilizam pRINll (promotor de PS4) com vários PRMS2s, Os últimos três conjuntos de colunas utilizam pRIN20 (promotor de UV5 lac) com vários PRMS2s. A coluna 2 é o intervalo menor dos marcadores de peso molecular da Biorad. A figura 7 é um diagrama esquemático de uma "cassete do gene 1 de T7 controlada por MS2". A figura 8 representa uma figura do gel de SDS que compara as características de expressão e perda da estirpe BL21(DE3) disponível comercialmente (colunas 3-5), da estirpe BL21(DE3) contendo pLisS como um vector secundário (colunas 1-2) , da estirpe EE11-20 (colunas 6-8) e da estirpe EE11-20 contendo pLisS como um vector secundário (colunas 9-10). As comparações basearam-se na expressão de NT-3 como o gene do produto alvo. As colunas 1, 5, 6 e 10 representam culturas durante a noite (NO), as colunas 4 e 7 representam culturas de pré-indução (prel) e as colunas 2, 3, 8 e 9 representam as culturas de indução (utilizando IPTG a 28 °C) (1-28). A figura 9 representa uma figura de um gel de SDS que compara as características de perda e de expressão das estirpes comercialmente disponíveis BL21(DE3) (colunas 3-5), 15 da estirpe BL21(DE3) contendo pLisS como um vector secundário (colunas 1-2), da estirpe EE11-20 (colunas 6-8) e da estirpe EE11-20 contendo pLisS como vector secundário (colunas 9-10). As comparações basearam-se na expressão de FNDC como o gene do produto alvo. As colunas 1, 5, 6 e 10 representam culturas durante a noite (NO), as colunas 4 e 7 representam culturas de pré-indução (prel) e as colunas 2, 3, 8 e 9 representam as culturas de indução (utilizando IPTG a 28 °C) (1-28). A figura 10 representa uma figura de um gel de SDS que compara as caracteristicas de perda e de expressão das estirpes comercialmente disponíveis BL21(DE3) (colunas 3-5), da estirpe BL21(DE3) contendo pLisS como um vector secundário (colunas 1-2), da estirpe EE11-20 (colunas 6-8) e da estirpe EE11-20 contendo pLisS como um vector secundário (colunas 9-10) . As comparações basearam-se na expressão de FNDC como o gene do produto alvo. As colunas 1, 5, 6 e 10 representam culturas durante a noite (NO), as colunas 4 e 7 representam culturas de pré-indução (prel) e as colunas 2, 3, 8 e 9 representam as culturas de indução (utilizando IPTG a 28 °C) (1-28) . A figura 11 representa uma figura de um gel de SDS que compara as caracteristicas de perda e de expressão das estirpes comercialmente disponíveis BL21(DE3) (colunas 5-7) e da estirpe EE11-11M (colunas 2-4). As comparações basearam-se na expressão de FNDC como o gene do produto alvo. As colunas 4 e 5 representam culturas durante a noite (NO), as colunas 3 e 7 representam culturas de pré-indução (prel) e as colunas 2 e 6 representam as culturas de indução (utilizando IPTG a 28 °C) (1-28). A coluna 1 é o intervalo menor dos marcadores de peso molecular da Biorad. 16 A figura 12 representa uma figura de um gel de SDS que mostra as características de expressão e perda das estirpes EE11-11M, utilizando a expressão de NT-3 como o gene do produto alvo. A coluna 5 representa a cultura durante a noite (NO), a coluna 4 representa as culturas de pré-indução (prel) e as colunas 2 e 3 representam as culturas de indução (utilizando IPTG a 28 °C) (1-28) ou culturas de IPTG a 37 °C (1-37) . A coluna 1 é o intervalo menor dos marcadores de peso molecular da Biorad. A figura 13 representa uma figura de um gel de SDS que mostra o decurso de uma indução de fermentação de 10 litros de GCFS em pAMG25 na estirpe EE11-11M. A coluna 1 é a cultura no momento da indução. A coluna 2 é a cultura no momento da indução. As colunas 3 a 9 representam a cultura várias horas após o crescimento na presença do indutor (IPTG), por exemplo, a coluna 3 representa passada 1 hora, a coluna 4 representa passadas 2 horas, etc. A coluna 10 representa os marcadores de ponte de peso molecular baixo de Amersham. A última coluna representa um marcador de GCSF. A figura 14 representa uma figura de um gel de SDS que mostra o decurso ao longo do tempo da indução da fermentação de 10 litros de leptina em pAMG25 na estirpe EE11-11M. A coluna 1 representa os marcadores de ponte de peso molecular baixo de Amersham. A coluna 2 representa a cultura no momento da indução. As colunas 3-8 representam a cultura depois de várias horas de crescimento na presença do indutor (IPTG), por exemplo, a coluna 3 representa passada 1 hora, a coluna 4 representa passadas 2 horas, etc. A coluna 9 representa um marcador de leptina. A figura 15 representa uma fotografia de uma análise de mancha de Western, que mostra os resultados de uma 17 experiência de expressão, realizada utilizando um sistema à base de MS2 em que 0,4 do gene precoce de T7 foi clonado. As colunas 2, 4, 6 e 8 representam quarto culturas diferentes contendo 0,4 após 4 horas de indução a 4 2 °C; as colunas 3, 5, 7 e 9 representam as amostras não induzidas das mesmas culturas. A coluna 1 é o intervalo menor dos marcadores de peso molecular da Biorad. A figura 16 representa uma fotografia de um gel de SDS, que mostra os resultados de uma experiência de expressão realizada utilizando um sistema à base de MS2, em que 0,6 do gene precoce de T7 foi clonado. As colunas 2 e 4 representam duas culturas não induzidas contendo 0,6; as colunas 3 e 5 representam as mesmas amostras passadas 4 horas de indução a 42 °C. A coluna 1 é o intervalo menor dos marcadores de peso molecular da Biorad. A figura 17 representa sequência completa do gene (SEQ ID N° . 2) do operão 3-7t, construído para conter os genes precoces (0,3-0,7) de T7. A figura 18 representa a figura de um gel de SDS que compara a expressão de NDF alfa/beta na ausência ou na presença das proteínas precoces de T7. O operão de 3-7t era um pRINIO e foi induzido por um aumento de temperatura de 28 °C para 37 °C. O NDF alfa/beta estava no plasmido pAMG33 e foi induzido pela adição de IPTG quando a temperatura voltou para 28 °C. A metade esquerda do gel representa o decurso de NDF alfa/beta na ausência dos genes precoces de T7. A coluna 1 representa após a indução das proteínas precoces mas antes da indução de NDF alfa/beta. As colunas 2-4 representam a cultura após algumas horas de crescimento na presença do indutor (IPTG), por exemplo, a coluna 2 representa passada 1 hora, a coluna 3 representa passadas 2 horas, etc. A coluna 5 18 representa os marcadores de ponte de peso molecular baixo de Amersham. A metade direita do gel representa o decurso ao longo do tempo da expressão de NDF alfa/beta, na presença das proteínas precoces de T7. A coluna 6 representa após a indução das proteínas precoces mas antes da indução de NDF alfa/beta. As colunas 7-9 representam a cultura após mais 1 hora de crescimento na presença de indutor (IPTG). A figura 19 representa uma análise de mancha de Western de um gel comparando a expressão de uma versão truncada da subunidade TP2 de telomerase humana (TP2 de 301-941) na presença e na ausência das proteínas precoces de T7. 0 operão de 3-7t foi o pRINIO e foi induzido por um aumento na temperatura de 28 °C para 37 °C. A TP2 de 301-941 estava num plasmido pAMG22 e foi induzida pela adição de IPTG quando a temperatura se deslocou novamente para 28 °C. A coluna 1 representa uma amostra de pré-indução de TP2 de 301-941, na presença das proteínas precoces de T7. A coluna 2 representa a expressão de TP2 de 301-941 após 2 horas de indução na presença de proteínas precoces de T7 a 28 °C. A coluna 3 representa expressão de TP2 de 301-941 após 2 horas de indução na presença de proteínas precoces de T7 a 3 7 °C. A coluna 4 representa uma amostra de pré-indução de TP2 de 301-941 na ausência das proteínas precoces de T7. A coluna 5 representa a expressão de TP2 a 301-941 após 2 horas de indução na ausência de proteínas precoces de T7 a 37 °C. A figura 20 representa uma análise de mancha de Western de um gel que mostra a produção passiva de vários níveis da proteína de revestimento MS 2 pelas estirpes GM315, GM320, GM340 e GM350. Compararam-se as estirpes em função da estirpe parental, a partir da qual elas tinham sido construídas. A coluna 1 representa uma cultura em fase logarítmica de GM315. As colunas 2, 4, 6, 8 e 10 são estirpes parentais 393. As 19 colunas 3 e 5 são GM32 0, a coluna 7 é GM34 0 e a coluna 9 é GM350. A figura 21 representa uma fotografia de um gel que mostra a expressão da hepatite C polimerase (HepCpol) em estirpes que têm vários níveis de proteína de revestimento MS2 (as fracções solúveis e insolúveis de cada experiência de expressão, também são comparáveis). A coluna 1 representa marcadores de peso molecular. A coluna 2 representa todo o extracto da célula de uma cultura induzida de HepCpol em pAMG21 expressa na estirpe GM221, que não contém proteína de revestimento MS2. A coluna 3 representa a fracção insolúvel desta experiência e a coluna 4 representa a fracção solúvel. A coluna 5 representa todo o extracto da célula de uma cultura de HepCpol induzida em pAMG21 expressa na estirpe GM315, que contém proteína de revestimento MS2. A coluna 6 representa a fracção insolúvel desta experiência e a coluna 7 representa a fracção solúvel. A coluna 8 representa todo o extracto da célula de uma cultura induzida de HepC e em pAMG21 expressa na estirpe GM320, que contêm mais proteína de revestimento MS2 do que na GM315. A coluna 9 representa a fracção insolúvel desta experiência e a coluna 10 representa a fracção solúvel. A figura 22 representa toda a sequência de ADN (SEQ ID N°. 3) do promotor médio PuvsX de T4, utilizado nos sistemas da presente invenção. 0 gene tem um sítio de Aatll na extremidade 5' e um sítio de Ciai na extremidade 3'. A figura 23 representa a sequência completa de ADN (SEQ ID N°. 4) do promotor médio PX de T4, utilizado nos sistemas da presente invenção. 0 gene tem um sítio de Aatll na extremidade 5' e um sítio de Ciai na extremidade 3'. 20 A figura 24 é uma fotografia de um gel de SDS, que mostra as características de expressão e perda de pAMG13 utilizando a expressão do gene 1 de T7 (sob o controlo de um promotor lambda) como o gene do produto alvo. A coluna 5 representa uma amostra estacionária que cresceu durante a noite a 2 8 °C, a coluna 4 representa uma amostra que foi induzida durante 4 horas, a 42 °C, a coluna 3 representa uma amostra que foi induzida durante 4 horas, a 37 °C, a coluna 2 representa uma amostra não induzida, que cresceu a 28 °C até a uma D.O. de 0,6 e a coluna 1 representa um marcador de peso molecular baixo da Biorad. A figura 25 representa uma fotografia de um gel de SDS, que mostra as características de expressão e perda de pAMG13, em que o gene 1 de T7 foi co-expresso com o operão pRINIO de T4. A coluna 4 representa uma amostra estacionária que cresceu durante a noite a 28 °C, a coluna 3 representa uma amostra que foi induzida durante 4 horas, a 42 °C, a coluna 2 representa uma amostra que foi induzida durante 4 horas, a 37 °C e a coluna 1 representa uma amostra não induzida, que cresceu a 28 °C até a uma D.O. de 0,6. A figura 26 representa uma fotografia de um gel de SDS, que mostra as características de expressão e perda de pAMGuvsX em que o gene 1 de T7 (sob o controlo do promotor médio uvsX de T4) foi co-expresso com o operão pRINIO de T4. A coluna 4 representa uma amostra estacionária que cresceu durante a noite a 28 °C, a coluna 3 representa uma amostra que foi induzida durante 4 horas, a 42 °C, a coluna 2 representa uma amostra que foi induzida durante 4 horas, a 37 °C e a coluna 1 representa uma amostra não induzida, que cresceu a 28 °C até a uma D.O. de 0,6. 21 A figura 27 representa uma fotografia de um gel de SDS, que mostra as características de expressão e perda de pAMGuvsX em que o gene 1 de T7 foi co-expresso com o operão pRINll de T4. A coluna 5 representa uma amostra estacionária que cresceu durante a noite a 2 8 °C, a coluna 4 representa uma amostra que foi induzida durante 4 horas, a 3 7 °C, a coluna 3 representa uma amostra que foi induzida durante 4 horas, a 2 8 °C, a coluna 2 representa uma amostra não induzida, que cresceu a 28 °C até a uma D.O. de 0,6 e a coluna 1 representa um marcador de peso molecular baixo da Biorad. A figura 28 representa uma fotografia de um gel de SDS, que mostra as características de expressão e perda de
pAMGuvsX em que NT-3 (sob o controlo de um promotor médio uvsX de T4) foi co-expresso com o operão pRINIO de T4. A coluna 4 representa uma amostra que foi induzida durante 4 horas, a 4 2 °C, a coluna 3 representa uma amostra que foi induzida durante 4 horas, a 37 °C, a coluna 2 representa uma amostra não induzida, que cresceu a 28 °C até a uma D.O. de 0,6 e a coluna 1 representa um marcador de peso molecular baixo da Biorad. A figura 29 representa uma fotografia de um gel de SDS, que mostra as características de expressão e perda de
pAMGuvsX em que FNDC (sob o controlo de um promotor médio uvsX de T4) foi co-expresso com o operão pRINIO de T4. A coluna 5 representa uma amostra que foi induzida durante 4 horas, a 4 2 °C, a coluna 4 representa uma amostra que foi induzida durante 4 horas, a 37 °C, a coluna 3 representa uma amostra que foi induzida durante 4 horas, a 28 °C, a coluna 2 representa uma amostra não induzida, que cresceu a 28 °C até a uma D.O. de 0,6 e a coluna 1 representa um marcador de peso molecular baixo da Biorad. 22 A figura 30 representa um diagrama esquemático dos vectores do plasmido pCB desenvolvidos na presente invenção. A figura 31 representa um diagrama esquemático dos vectores do plasmido pAW desenvolvidos na presente invenção.
A figura 32 representa uma fotografia de um gel de SDS, que mostra as características de expressão e perda de pAMGX em que o gene 1 de T7 (sob o controlo de um promotor médio X de T4) foi co-expresso com pAW20. A coluna 4 representa uma amostra estacionária que cresceu durante a noite, a 28 °C, a coluna 3 representa uma amostra que foi induzida durante 4 horas, a 28 °C, a coluna 2 representa uma amostra não induzida, que cresceu a 2 8 °C até a uma D.O. de 0,6 e a coluna 1 representa um marcador de peso molecular baixo da Biorad. A figura 33 representa uma fotografia de um gel de SDS, que mostra as características de expressão e perda de pAMGX em que SPI (sob o controlo de um promotor médio X de T4) foi co-expresso com pAW20. A coluna 3 representa uma amostra que foi induzida durante 4 horas, a 28 °C, a coluna 2 representa uma amostra não induzida, que cresceu a 28 °C até a uma D.O. de 0,6 e a coluna 1 representa um marcador de peso molecular baixo da Biorad. A figura 34 representa uma fotografia de um gel de SDS, que mostra as características de expressão e perda de pAMGuvsX em que OPG (sob o controlo de um promotor médio uvsX de T4) foi co-expresso com pAW20. A coluna 4 representa uma amostra que foi induzida durante 4 horas, a 28 °C, a coluna 2 representa uma amostra não induzida, que cresceu a 28 °C até 23 a uma D.O. de 0,6 e a coluna 1 representa um marcador de peso molecular baixo da Biorad. A figura 35 representa uma fotografia de um gel de SDS, que mostra as características de expressão e perda de pAMGuvsX em que FNDC (sob o controlo de um promotor médio uvsX de T4) foi co-expresso com pAWll. A coluna 3 representa uma amostra induzida durante 4 horas, a 37 °C, a coluna 2 representa uma amostra induzida durante 4 horas, a 28 °C e a coluna 1 representa uma amostra não induzida. A figura 36 representa uma fotografia de um gel de SDS, que mostra as características de expressão e perda de pAMGuvsX em que OPG (sob o controlo de um promotor médio uvsX de T4) foi co-expresso com pAWll. A coluna 4 representa uma amostra induzida durante 4 horas, a 37 °C, a coluna 3 representa uma amostra induzida durante 4 horas, a 28 °C, a coluna 2 representa uma amostra não induzida e a coluna 1 representa os marcadores de ponte de peso molecular baixo de Amersham. A figura 37 representa uma fotografia de um gel de SDS, que mostra as características de expressão e perda de pAMGuvsX em que NT3 (sob o controlo de um promotor médio uvsX de T4) foi co-expresso com pAWll. A coluna 3 representa uma amostra induzida durante 4 horas, a 37 °C, a coluna 2 representa uma amostra induzida durante 4 horas, a 28 °C e a coluna 1 representa uma amostra não induzida. A figura 38 representa uma fotografia de um gel de SDS, que mostra as características de expressão e perda de pAMGX em que 3MNDF (sob o controlo de um promotor médio X de T4) foi co-expresso com pAWll. A coluna 3 representa uma amostra induzida durante 4 horas, a 37 °C, a coluna 2 representa uma 24 amostra induzida durante 4 horas, a 28 °C e a coluna 1 representa uma amostra não induzida. A figura 39 representa uma fotografia de um gel de SDS que mostra as características de expressão e perda de pAMGuvsX em que FNDC (sob o controlo de um promotor médio uvsX de T4) foi co-expresso com o operão pRINIO de T4, que também continha 0,6 do gene como uma proteína acessória. A coluna 5 representa uma amostra que foi induzida durante 4 horas, a 42 °C, a coluna 4 representa uma amostra que foi induzida durante 4 horas, a 37 °C, a coluna 3 representa uma amostra que foi induzida durante 4 horas, a 28 °C, a coluna 2 representa uma amostra não induzida, que cresceu a 28 °C até a uma D.O. de 0,6 e a coluna 1 representa um marcador de peso molecular baixo da Biorad.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
Para os fins da presente invenção, um "repressor translacional" define-se como uma proteína capaz de se ligar especificamente a um sítio de reconhecimento numa parte de ARN e inibir a tradução. Na presente invenção, a proteína de revestimento MS2 e o sítio de reconhecimento MS2, são utilizados para providenciar um sistema repressor translacional. Em resumo, a sequência de PRMS2 publicada, foi utilizada para gerar oligonucleótidos a partir dos quais se construiu o gene intacto. Depois, depois de se determinar que PRMS2 era tolerado a níveis muito elevados na E. coli sem qualquer efeito aparente no crescimento das células, PRMS2 foi colocado sob o controlo de um promotor constitutivo fraco em plasmidos com um número de cópias variável. A ideia foi produzir continuamente níveis baixos de PRMS2, de tal maneira que quaisquer genes clonados que tenham um sítio de 25 reconhecimento de MS2, podem ser conservados completamente silenciosos até ser útil expressá-los.
Utilizando esta abordagem, demonstrou-se que este sistema à base de MS2 podia ser utilizado para providenciar um sistema fortemente controlado, melhorado, envolvendo, por exemplo, o gene de polimerase de ARN de T7. O gene 1 de T7 clonado providencia uma fonte de polimerase de ARN de T7 para dirigir de forma selectiva a expressão a alto nível de genes alvo sob o controlo de um promotor de T7. Contudo, dado que a polimerase de ARN de T7 é tão activa e selectiva, é importante controlar os níveis básicos da polimerase de ARN de T7 activa, isto é, cortar o gene 1 de T7 no estado não induzido, de modo a prevenir a expressão prematura do gene alvo. A estratégia utilizada na presente invenção envolve assim a clonagem de um gene 1 de T7 com um sítio de reconhecimento MS2 ligado à sua sequência de codificação e a inserção desta estrutura no cromossoma em conjunto com uma cópia da proteína de revestimento MS2 sob o controlo de um promotor constitutivo fraco. Os dois genes foram clonados cauda a cauda, de tal modo que os promotores para cada um deles foram orientados em direcções opostas. Demonstrou-se assim que as células hospedeiras contendo uma cópia cromossómica deste "gene 1 de T7 controlado por MS2" permitiu uma produção efectiva de polimerase de ARN de T7, que podia então ser utilizada para conduzir a expressão de um gene alvo.
Os genes alvo ensaiados sucessivamente no sistema da presente invenção incluíram o gene 1 de T7, o factor 3 neurotrófico (NT-3), o factor neurotrófico derivado do cérebro (FNDC), o inibidor da serina protease (SPI) e 26 osteoprotegrina (OPG), factor de diferenciação de neu (NDF) alfa/beta, hepatite C polimerase, teloraerase humana e análogos, derivados e as suas variantes. Considera-se que os vários sistemas controlados por MS2 podem providenciar um controlo melhor de qualquer gene clonado, tóxico ou não tóxico, numa célula hospedeira procariótica.
Demonstrou-se ainda que o sistema à base de MS2 podia ser utilizado para estabilizar os clones e estabilizar certos clones tóxicos. Tal como se utiliza aqui, o gene tóxico é qualquer gene cuja expressão na célula hospedeira vai evitar que a célula hospedeira na cultura atinja o crescimento logarítmico normal, que atingiria mas para a expressão do gene tóxico. Como exemplos na presente invenção, os genes precoces de bacteriófago T7 foram clonados e expressos, assim como o foram motA e asiA. Vários dos genes precoces de bacteriófago T7 são conhecidos por serem tóxicos; Studier e Rosenberg, J. Mol. Bíol., 153:503-525 (1981). O gene de 0,7, em particular, é letal, dado que codifica uma função que inibe o ARN polimerase de E. coli. MotA e asiA são também agora conhecidas por serem tóxicas; Hinton et al., Methods in Enzymol., 274:43-57 (1996). A capacidade para expressar esses genes tem um valor significativo por alguns destes genes também têm mostrado ter um efeito positivo na expressão de genes heterõlogos em E. coli por infecção de fagos. Noutras palavras, há algumas vezes que é útil ter uma cópia clonada destes genes presentes na célula para expressão imediatamente antes da expressão do gene alvo.
Nos exemplos dados aqui, o gene 1 de T7 esteve sob o controlo do promotor lac de UV5; Fuller, F. , Gene, 19:43-54 (1982), o promotor PS4; a patente de invenção WO 95/267246 (Bartley et al. ) , publicada em 12 de Outubro de 1995 e o promotor lux; a patente de invenção norte-americana U.S. N°. 27 5.196.318 (Baldwin et al.), publicada em 23 de Março de 1993. É importante notar que, contudo, o gene 1 de T7 podia estar sob o controlo de qualquer promotor indutível, incluindo promotores bacterianos, tais como, trp- ou lpp-; promotores de fagos, tais como, lambda PL ou Pr; ou promotores sintéticos, tais como, tac ou trc.
Também se desenvolveu e descreveu aqui como um sistema eficaz da presente invenção, as formas de mutante de PRMS2. Por exemplo, uma versão de mutante de PRMS2 em que o codão para o resíduo de valina na posição 29 foi alterado para um codão para isoleucina, foi construída. Esta mutação afecta a capacidade dos dímeros de proteína de revestimento para se associar em agregados com a dimensão da capacidade; Peabody, D.S. e Ely, R. , Nuc. Acid Res., 20(7):1649-1655 (1992). Dado que a proteína de revestimento se liga ao seu alvo de ARNm como um dimero e pensa-se que a multimerização de dímeros inibe a associação com o ARNm, esta mutação seria assim espectãvel que aumentasse a concentração efectiva dos repressores translacionais presentes sem aumento da concentração da proteína actual, conservando mais proteína de revestimento em dímeros em vez de ser em multímeros. Deve ser entendido por um especialista na matéria que outras formas de mutante de PRMS2 serão eficazes nos sistemas da presente invenção.
Embora os exemplos aqui dados utilizem especificamente o sistema de bacteriófago MS2, não seria espectãvel que outros sistemas semelhantes, por exemplo, ζ)β, GA, SP, R17, f2 e fr, possam ser utilizados como sistemas repressores translacionais de uma forma semelhante.
As células hospedeiras utilizadas e avaliadas na presente invenção, incluíram a estirpe BL21(DE3) de E. coli B 28 + pLisS e a estirpe de EE1120 de E. colí K + pLisS. Será claramente entendido por um especialista na matéria que outras estirpes B de E. coli utilizadas vulgarmente e estirpes K seriam eficazes na prática da presente invenção. Deve também entender-se que várias células hospedeiras eucarióticas podiam ser utilizadas na prática da presente invenção.
Os terminadores transcricionais fortes são também utilizados nos sistemas da presente invenção. Inserindo esses terminadores a montante do promotor de interesse (por exemplo, o promotor que dirige a expressão do gene 1 de T7), a transcrição lida através das sequências crípticas do promotor é eliminada, providenciando assim um sistema mais fortemente regulado. Os terminadores T1T2; Amman et al. , Gene, 2_5:167-178 (1983) foram utilizados nos exemplos da presente invenção, contudo, há outros terminadores fortes, por exemplo, tHP; Nohno et al. , Mol. Gen. Genet. , 205:260-259 (1986), que seria claramente espectável que trabalhassem efectivamente no sistema da presente invenção.
Embora a polimerase de ARN de T7 fosse utilizada nos exemplos da presente invenção, o equivalente à ARN polimerases dos fagos semelhantes a T7 também funcionará. Esses fagos estão descritos com detalhe na técnica; ver, por exemplo, Hausmann, R., The T7 Group in The Bacteriophages, Capítulo 8, págs. 259-283, Plenum Press, New York (1988).
Também se descreve na presente invenção a criação de um sistema para a activação de um promotor médio de T4 clonado in vivo, utilizando um operão especialmente construído que consiste em genes de modA e asíA sob o controlo de um promotor indutível. A principal vantagem deste sistema promotor é que ele dirige a transcrição dos promotores 29 específicos ao mesmo tempo que inibe a transcrição de promotores de E. coli, que minimiza a concorrência para o aparelho translacional e inibe a célula de responder à produção da proteína alvo por meio da indução da transcrição de genes protease. Também se demonstrou que o sistema providenciaria um ciclo de expressão "faseado" que podia ser útil para inter alia, expressar certas proteínas acessórias, que podem ser úteis à produção da proteína alvo.
Mais especificamente, a ideia foi de que as proteínas acessórias podiam ser clonadas sob um promotor que podia ser induzido da mesma forma que o promotor de modA e asiA ou podiam todas estar sob o controlo do mesmo promotor numa única conformação operacional. Quando o sinal de indução é dado, estas proteínas acessórias e modA e asiA serão produzidas simultaneamente. Quando modA e asiA atingem níveis de saturação (igual ou de alguma forma superior ao do número de moléculas de polimerase de ARN presentes) , então a transcrição dos promotores de E. coli seria inibida, terminando essa etapa do ciclo de expressão. A polimerase de ARN seria dirigida apenas para os promotores médios T4, o que varia à expressão da proteína alvo. Não há correntemente nenhum sistema disponível que possa fazer isto nas E. coli. A capacidade para expressar essas proteínas acessórias desta forma, pode ser de grande benefício na melhoria da expressão de proteínas em sistemas procarióticos. Por exemplo, Yasukawa et al., The Journ. Of Biol. Chem., 270(432):25328-25331 (1995) relatou que a co-produção da tioredoxina (Trx) de E. coli ou chaperonas GroESL de E. coli, aumentam as solubilidades de várias proteínas vertebradas que estão a ser produzidas em E. coli (Trx foi o mais eficaz) . Isto é uma verificação importante e útil porque as proteínas eucarióticas estão frequentemente produzidas na E. coli como 30 agregados insolúveis e isto é uma das barreiras aos estudos da estrutura macromolecular.
Na presente invenção, os genes modA e asiA foram clonados sob o promotor de lambda PL e também clonados sob um promotor derivado de lac. É importante, contudo, que qualquer promotor indutível trabalhará, incluindo os promotores bacterianos, tais como, trp- ou lpp-; promotores de fagos, tais como, lambda PL ou PR; ou promotores sintéticos, tais como, tac ou trc.
Dado que os promotores médios de T4 eram "leaky" e, ainda mais importante, porque os genes tóxicos motA e asiA necessitam de ser fortemente controlados, as características do sistema MS2 e o sistema promotor médio de T4, foram combinadas. Os operões de motA/asiA foram encontrados como sendo não clonáveis a menos que ambos os genes fossem ligados ao sítio de reconhecimento de MS2. As "cassetes de T4 à base de MS2 óptimas", a serem inseridas no cromossoma da célula hospedeira, contém assim um promotor indutível de motA e asiA com as sequências dos genes de motA e asiA (+ sequências de proteínas acessórias) ligadas a uma sequência de reconhecimento da proteína de revestimento MS2 e a um gene da proteína de revestimento MS2, ligada operacionalmente a um promotor constitutivo fraco.
Utilizando este sistema, o baixo nível de promoção de PRMS2 evita a perda do promotor médio de T4 e a promoção de motA/asiA até que ocorra um evento de indução, que leva assim à produção de motA/asiA (e à produção de proteínas acessórias, se pretendido) e fecha a transcrição de E. coli, seguida da produção do gene alvo conduzida pelos promotores médios de T4. 31
Também se desenvolveu e se descreve aqui uma série de estirpes de E. coli, que foram tratadas por engenharia genética para produzir diferentes concentrações de PRMS2. Estas estirpes tinham tido uma proteína de revestimento de MS2 sob o controlo das sequências do promotor TET modificado integradas no seu ADN cromossómico em sítios específicos. As sequências do promotor de TET foram modificadas por meio da alteração das bases nas regiões -10 e -35 para as tornar homólogas da sequência de consenso para estas regiões em promotores fortes de E. coli. Também têm sido alteradas utilizando oligonucleótidos para tornar a sequência do sítio de ligação do ribossoma aleatória. Estas alterações permitiram a alteração de um certo número de formas que produzem níveis superiores de proteína de revestimento MS2, tal como foi determinado por análise de mancha de Western.
As várias estirpes contendo MS2 da presente invenção, podem ser utilizadas para clonar genes tóxicos e outros, que não podem ser clonados utilizando uma tecnologia convencional. Por exemplo, determinou-se que, quando se trabalha com genes tóxicos, o estabelecimento da ligação inicial é a etapa mais sensível à toxicidade, e por isso, a etapa mais difícil no processo de clonagem. Uma vez isolado um clone estável, contudo, ele pode então ser transformado noutras linhas de células sem incidentes. Utilizando GM350, pode-se acoplar o gene tóxico ou gene "não clonável" a um sítio de reconhecimento de MS2 e assim utilizar a ligação para transformar GM350. Como GM350 tem a mais alta produção da proteína de revestimento MS2; de facto, é produzido tanto mais PRMS2 quanta a expressão após indução é efectivamente eliminada, podendo-se utilizar GM350 para identificar e obter um clone estável. Uma vez obtido um clone estável e confirmada a sequência, pode-se utilizar o plasmido recombinante para transformar a outras estirpes de MS2, que 32 decrescentes produzem quantidades decrescentes da proteína de revestimento. A estabilidade do clone em cada estirpe pode ser determinada e a proteína, em última análise, expressa numa dessas estirpes. Nos casos em que a toxicidade persiste no seguimento da obtenção do clone inicial, os produtores de níveis baixos de PRMS2, por exemplo, GM315 e GM320, serão úteis para estabilizar essas estruturas.
Os exemplos que se seguem são dados para ilustrar mais completamente a presente invenção, mas não foram construídos para limitar o seu âmbito. O exemplo 1 descreve a construção da proteína de revestimento de MS2 de tipo selvagem (PRMS2ts) e providencia assim os resultados do ensaio da PRMS2ts quanto à sua capacidade de ser expressa em E. coli e quaisquer efeitos de que essa expressão tenha no crescimento da célula. 0 exemplo 2 descreve a construção de duas versões mutantes do gene da proteína de revestimento MS2. 0 exemplo 3 descreve a construção dos vectores de plasmido pRIN contendo mutantes de PRMS2 ou PRMS2ts, para serem utilizados no desenvolvimento do sistema de repressão translacional. O exemplo 4 descreve a clonagem do gene 1 de T7 nos vectores do plasmido pRIN e o subsequente ensaio dos vectores quanto à expressão e ao sistema de perda. O exemplo 5 descreve a inserção cromossómica de "cassetes do gene 1 de T7 controlada por MS2" no cromossoma de uma célula hospedeira e demonstra depois a utilização dessas estirpes hospedeiras para expressar vários genes alvo, assim como, para providenciar os resultados dos ensaios em que as características de perda e de expressão das novas estirpes desenvolvidas, são comparadas com as estirpes contendo polimerase de ARN de T7 disponíveis comercialmente. O exemplo 6 descreve a fermentação em larga escala das novas estirpes desenvolvidas com elevada densidade. 0 exemplo 7 descreve a utilização do sistema de MS2 para clonar vários genes precoces de T7. 0 exemplo 8 descreve o ensaio dos genes 33 precoces de T7 no aumento da produção de proteínas heterólogas. O exemplo 9 descreve a inserção cromossómica do gene da proteína de revestimento de MS2 sob o controlo de vários promotores de TET alterados, para produzir estirpes tratadas por engenharia genética, para produzir diferentes concentrações de PRMS2 e os resultados do ensaio destas
estirpes quanto à sua capacidade para clonar genes tóxicos. O exemplo 10 descreve a construção do plasmido de pAMGuvxs, do plasmido pAMGX e dos sistemas de pRIN do operão de T4 utilizados para desenvolver o sistema à base do promotor médio de T4 utilizando multicópias de plasmidos. O exemplo 11 descreve o ensaio de pAMGuvxs, pAMGX e dos sistemas de pRIN do operão de T4, preparados e descritos no exemplo 10. O exemplo 12 descreve a clonagem de motA/asiA em plasmidos de cópias únicas contendo o sistema de MS2. O exemplo 13 descreve o ensaio de plasmidos de cópias únicas, preparados e descritos no 12. O exemplo 14 descreve a utilização do sistema à base de MS2/T4 para expressar com eficácia uma proteína acessória e assim melhorar a expressão de uma proteína alvo.
Materais e Processos
Nos exemplos que se seguem, utilizam-se os seguintes plasmidos bacterianos/vectores de expressão: pAMG13, pAMG21, pAMG22, pAMG25, pAMG33 e 3002 nahG (cada um dos quais tinha sido previamente depositado ou está a ser depositado em ligação com o registo deste pedido de patente de invenção; pT7-7; Tabor e Richardson, Proc. Natl. Acad. Sei. EUA, 82:1074-1078 (1985); pACYC184; Chang et al. , J. Bacteriol. , 134:1141-1156 (1978); Rose, Nucleic Acid Res., 16:355 (1988a); pKK2 23-3; Amman et al., Gene, 25:167-178 (1983); pGPl-2; Tabor e Richardson, Proc. Natl. Acad. Sei. EUA, 34 8^2:1074-1078 (1985); e pSClOl; Bernardi e Bernardi, Nuc.
Acids Res. , 132:9415-9426.
Nos exemplos que se seguem, os processos dados a seguir foram utilizados a menos que se faça notar de alguma forma. 1. Ligações
Todas as ligações foram realizadas num volume final de 40 pL. Utilizou-se, aproximadamente, 50 ng até 500 ng de cada vector e de 500 ng até 2 pg de cada inserção. Adicionou-se ligase de ADN de T4 a 1 unidade de actividade e incubaram-se as misturas reaccionais a 16 °C, durante a noite. As misturas reaccionais precipitaram então por meio da adição de acetato de amónio até 2,5 M e adicionou-se 2,5 volumes de etanol. Incubou-se então a mistura reaccional a -80 °C, durante pelo menos 1 hora e depois centrifugou-se a 15.000 rpm (a 4 °C) , durante 30 minutos. Fez-se uma nova suspensão da massa nos 40 pL originais e utilizou-se uma aliquota de 4 pL para electroporação. 2. Tratamento com cinases e enrolamento dos oligonucleõtidos
Fez-se uma nova suspensão de oligonucleõtidos em água, a uma concentração de 20 pmole/pL. Utilizou-se uma aliquota de 12,5 pL de cada oligonucleótido para a reacção com cinases. A esta mistura reaccional adicionou-se 2 pL de ATP, 2 pL de tampão de ligação e 2,5 pL de água. A reacção iniciou-se pela adição de 1 pL de PNK e fez-se a sua incubação a 3 7 °C, durante 1 hora. Aqueceram-se então as amostras até 65 °C, durante 15 minutos. Misturaram-se depois pares complementares e aqueceu-se até 100 °C, durante 1 minuto e deixou-se arrefecer lentamente até à temperatura ambiente e depois 35 colocou-se em gelo. Nesse momento, os oligonucleótidos enrolados estavam prontos para serem ligados. Para sequências particularmente longas, à que ordenar dois nucleótidos que depois são medidos em toda a sua região e têm 6-12 bases de complementaridade nas extremidades 3'. Estes oligonucleótidos serão utilizados tanto como matrizes, assim como, iniciadores (a 1 pmole/pL de concentração final) em 50 pL de reacções de RCP (reacção em cadeia de polimerase) e depois da purificação do gel serão digeridos de forma restrita antes da ligação.
3. Reacções de RCP
Utilizaram-se vários programas padrão por rotina, para os processos de RCP. Quando se amplificam os genes ou os fragmentos de operões, o volume da reacção foi de 100 pL. Adiciona-se uma aliquota de 10 pL de cada iniciador a 10 pmole/pL a cada mistura reaccional e a matriz é adicionada entre 50 ng até 250 ng. As reacções prosseguem durante 25 ciclos. A primeira etapa faz-se a 94 °C, durante 30 segundos, depois a 50 °C durante 2 minutos, seguida de 72 °C, durante três minutos. Os fragmentos amplificados foram purificados em gel, em geles de agarose da SeaKem GTG (FMC) . Recuperou-se o ADN da agarose utilizando Qiaex II (Qioagen Inc.).
As reacções de rastreio das colónias para identificar clones positivos, foram realizadas em volumes de 20 pL. Os oligonucleótidos estão presentes numa concentração final de 0,25 pmole/pL. Recolheram-se as colónias utilizando a ponta de uma pipeta e dissolveram-se na mistura reaccional. Retirou-se uma aliquota de 1 pL e utilizou-se para inocular um tubo de 5 mL do antibiótico apropriado contendo LB. As reacções de RCP foram realizadas durante 30 ciclos. A primeira etapa é feita a 94 °C, durante 30 segundos, seguido de um anelamento a 37 °C, de 30 segundos e uma elongação a 72 36 °C, durante 30 segundos. Para inserções maiores (> 1.000 bases) o tempo de elongação é aumentado até 1 minuto. Carregam-se então as misturas reaccionais em geles de agarose (0,8-1,0 %) e identificam-se os clones positivos por migração em função de padrões e de reacções de simulação de vectores.
Exemplo 1
Este exemplo descreve a construção do gene da proteína de revestimento de MS2 de tipo selvagem (PRMS2ts) e depois dá os resultados da análise de PRMS2ts quanto à sua capacidade para ser expressa em E. coli e quaisquer efeitos que essa expressão tenha no crescimento das células hospedeiras. A sequência da proteína publicada da proteína de revestimento MS2; Peabody, D., EMBO J., 12(2):595-600 (1993), foi utilizada para desenhar um gene utilizando os codões de utilização preferida de E. coli. Desenharam-se os oligonucleótidos 909-34 até 909-53 (ver quadro 1) e utilizaram-se para construir o gene e a sequência completa do gene está descrita na figura 1. Os oligonucleótidos foram preparados de modo a incluir um sítio de Ndel na extremidade 5' do gene e um sítio de BamHI na extremidade 3' . Este gene foi então digerido sob restrição com BamHI e Ndel e clonado no plasmido pT7-7; Tabor e Richardson, Proc. Natl. Acad. Sei. EUA, 821:1074-1078 (1985). Uma vez identificado um clone positivo e confirmada a sequência, este gene foi sub-clonado no plasmido 3002 nahG utilizando os mesmos sítios de restrição. A estirpe BL21(DE3), disponível comercialmente (Novagen, Madison, WI) foi utilizada para ensaiar a capacidade de PRMS2ts para ser expressa em E. coli. BL21(DE3) é uma estirpe 37 B de Ε. coli, que contém uma cópia cromossómica do gene de ARN de T7 polimerase sob o controlo do promotor lac de UV5. As colónias de BL21(DE3) contendo o gene PRMS2ts em pT7-7, foram recolhidas das placas e utilizadas para inocular uma aliquota de 5 pL de LB-amp num tubo de Falcon de 50 mL. Esta preparação cresceu durante a noite a 28 °C, com agitação. A cultura nocturna foi utilizada para inocular meio fresco, numa diluição de 1:100 (50 pL até 5 mL) num tubo de 15 mL. As culturas cresceram a 28 °C, com agitação, até a uma D. O. aproximada de 0,6. A expressão do gene PRMS2ts foi induzida pela adição de IPTG até 0,4 mM. A incubação continuou a 37 °C com agitação, durante 4 horas. Retirou-se uma amostra de 1 mL e aglomeraram-se as células por centrifugação. Os aglomerados foram novamente suspensos em tampão de craqueamento a 0,01 unidades de D.O./pL e as amostras foram fervidas durante 5 minutos. Carregou-se uma aliquota de 6 pL de cada amostra num gel de SDS-poliacrilamida a 4-20 % (Novex) . Corou-se o gel com azul de Coomassie para visualizar as proteínas. Tal como ficou descrito pela gravura do gel (figura 2), as colunas 8, 10, 11 e 12 mostram a produção de PRMS2ts. Estas culturas de produção atingiram uma densidade óptica mais elevada do que as que não continham versões funcionais do gene PRMS2 em pT7-7, demonstrando assim que PRMS2 pode ser efectivamente expressa sem afectar aparentemente o crescimento das células hospedeiras.
Exemplo 2
Este exemplo descreve a produção de duas versões mutantes do gene da proteína de revestimento MS2. 38
Uma versão mutante do gene da proteína de revestimento MS2 em que o codão para o resíduo de valina na posição 2 9 tinha sido alterado para um codão para isoleucina, foi construída por RCP de sobreposição, utilizando os oligonucleótidos 1456-55 e 1456-56 (ver quadro 1). Este mutante particular será referido daqui para a frente como um PRMS2-11.
Uma versão mutante do gene da proteína de revestimento de MS2, em que o codão para o resíduo de cisteína na posição 101 foi alterado para um codão para arginina, foi construída por meio de RCP de sobreposição utilizando os oligonucleótidos 1456-61 e 1456-62 (ver quadro 1). Este mutante particular será referido daqui para a frente como PRMS2-14.
Exemplo 3
Este exemplo descreve a construção de vectores do plasmido pRIN contendo os mutantes PRMS2ts ou PRMS2 para se utilizarem no desenvolvimento do sistema de repressão translacional. Os vectores de pRIN são vectores de cópias múltiplas (15 cópias) à base do plasmido pACYC184; Chang et al., J. Bacteriol., 134:1141-1156 (1978); Rose, Nucleic Acid
Res. , 16:355 (1988a) . 0 plasmido pACYC184 foi digerido com as enzimas de restrição Xbal e HindIII. Prepararam-se os oligonucleótidos 940-29 e 940-30 (ver quadro 1) para ligá-los nestes sítios ao mesmo tempo que se introduzia novos sítios únicos para utilização posterior, Especificamente, os oligonucleótidos em espiral foram clonados no vector de corte de pACYC184, matando assim os sítios Xbal e HindIII e introduzindo os 39 sítios únicos PstI e Saci, assim como, um segundo sítio Sphl. Este plasmido foi então digerido com a enzima de restrição EagI e os oligonucleótidos 941-43 e 941-44 (ver quadro 1) , foram clonados no vector que destruiu o sítio de EagI e introduziu um único sítio de restrição de AatlI. O fragmento 1036-99 (ver quadro 1) contendo o gene da proteína de revestimento MS2 de tipo selvagem ligado ao promotor nahG, foi construído por RCP a partir de 3.002 clones de nahG, descritos no exemplo 1, tal como, um sítio de Saci estava a montante da sequência do promotor e um sítio de BamHI estava na terminação do gene. Este fragmento foi então clonado no vector derivado de pACYC184 (descrito no parágrafo anterior) a partir de Saci até BamHI. A sequência do promotor nahG foi então substituída por uma sequência do promotor de TET como se segue: construiu-se um promotor de TET sintético utilizando os oligonucleótidos 1016-20 e 1016-21 (ver quadro 1) . O promotor foi preparado utilizando a sequência promotora de TET original com pACYC184 com a alteração da introdução de um sítio de Ndel no início natural do gene de TET. O promotor foi colocado na estrutura a partir de Saci até Ndel de tal modo que o gene de PRMS2ts ficou operacionalmente ligado ao promotor de TET.
Preparou-se um fragmento de ADN contendo as sequências do terminador T1T2 de rrnB por RCP, utilizando o plasmido pKK223-3; Amman et al. , Gene, 25:167-178 (1983) como uma matriz e utilizando os oligonucleótidos 1036-6 e 1053-71 (ver quadro 1) . Este fragmento foi construído de modo a ter sítios para as enzimas de restrição AatlI e Aval nas extremidades. O vector derivado de pACYC184 descrito antes, foi cortado com estas enzimas e este fragmento foi ligado a ele. 40
Uma versão sintética de um promotor lambda e o sítio múltiplo de clonagem a partir do vector pAMG13, foram cortadas a partir de Aatll até BamHI. O vector derivado de pACYC184 descrito, foi então cortado com estas enzimas e o fragmento pAMG13 ligado a elas. O plasmido resultante foi designado por pRINIO (p) (figura 3) . Também se construíram três plasmidos semelhantes derivados de pACYC184, um contendo o promotor de PS4 em vez do promotor de lambda (designado por pRINll (p)), outro que continha o promotor lac de UV5 em vez do promotor lambda (designado por pRIN20 (p) ) e outro que continha o promotor de lux (designado por pRIN22 (p)) (figura 3) .
As construções de pRIN continham os mutantes de PRMS2-11 e PRMS2-14. Os fragmentos das formas mutantes, ainda ligados ao promotor de TET, foram gerados de modo a ter um sítio de Sphl na extremidade do promotor e um sítio de BamHI na extremidade do gene mutante de PRMS2. Os plasmidos pRIN descrito antes, foram cortados com BamHI e Sphl e a porção de plasmido foi retirada em gel purificado a partir do fragmento de PRMS2ts. Os fragmentos do mutante foram então ligados utilizando os sítios de Sphl e BamHI. As construções contendo o mutante PRMS2-11 foram designadas por pRINIO(11), pRINll(11), pRIN20(ll) e pRIN22(ll) e as construções contendo o mutante de PRMS2-14 foram designados por pRINIO(14), pRINll(14), pRIN20(14) epRIN22(14).
Exemplo 4
Este exemplo descreve a clonagem do gene 1 de T7 em vários vectores do plasmido pRIN e o subsequente ensaio dos vectores de plasmido quanto à expressão e a sistema de perdas. 41 O gene 1 de T7 foi clonado em vários plasmidos pRIN descritos antes. 0 gene 1 de T7 foi construído por RCP utilizando os oligonucleótidos 949-1 e 949-2 (ver quadro 1) para ter uma sequência de reconhecimento da proteína de revestimento MS2 ligada à sua sequência de codificação. A matriz utilizada foi o plasmido pGPl-2; Tabor e Richardson, Proc. Natl. Acad. Sei. EUA, £2:1074-1078 (1985). O gene foi clonado nos vários plasmidos de pRIN a partir de Xbal até BamHI. Os mutantes de PRMS2 foram ensaiados quanto à sua capacidade para inibir a multimerização e assim levou a um aumento da concentração efectiva do repressor translacional. Outro parâmetro que foi examinado, foi a presença ou a ausência de uma sequência de caixa a jusante no gene 1 (oligonucleótido 1477-84) (ver quadro 1) (esta sequência tinha sido mostrada como um melhorador da translação por meio do aumento da ligação ao ribossoma; Sprengart et al. , Nuc. Acids Res., 18(7):1719-1723 (1990)).
As culturas durante a noite de várias estruturas cresceram em 5 mL de LB-cam em tubos de 50 mL, a 28 °C. Estes foram utilizados para inocular porções frescas de 5 mL de LB-cam em tubos de 15 mL a 1:100 de diluição. Todos estes ingredientes voltaram para 28 °C, com agitação. Retiraram-se as amostras das culturas imediatamente antes da indução e o passo da indução neste caso envolveu a adição de IPTG a uma concentração final de 0,4 mM. A incubação das culturas induzidas continuou durante 3 horas e retiraram-se amostras de 1 mL. Todas as amostras foram aglomeradas por centrifugação e os grânulos foram novamente suspensos em tampão de cracking. Depois de levar à ebulição durante 5 minutos, fez-se passar uma aliquota de 6 pL num gel de SDS-poliacrilamida a 4-20 % (Novex). 42 A proteína foi então transferida electroforeticamente para nitrocelulose. As manchas foram bloqueadas durante a noite no par do blotto com leite em pó sem gordura a 2 %; Harlow & Lane, Immunoblotting ín Antibodies, A Laboratory Manual, Capítulo 12, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1988) . As manchas foram sondadas durante 1 hora com um coelho derivado de anticorpo policlonal para a polimerase de ARN de T7. Depois de se lavarem as manchas, fez-se a sua sondagem com peroxidase de rábano, anti-coelho, de burro, conjugada com um anticorpo (Amersham), durante 1 hora. Lavou-se e tratou-se com reagentes de ECL (Amersham) e exposição a filme de raio X. A exposição foi feita durante 15 minutos para maximizar a sensibilidade. Desenvolveu-se o filme utilizando um processador de filmes da Kodak.
As figuras 4-6 são fotografias de manchas de Western, que mostram os resultados das experiências de expressão e perda realizadas com várias construções. A figura 4 é uma mancha de uma cultura estacionária feita durante a noite. A figura 5 é uma mancha de uma cultura de pré-indução que cresce exponencialmente (prel) e a figura 6 é uma mancha de um IPTG induzido por cultura, que cresceu a 28 °C. Tal como foi evidenciado pelas fotografias destas manchas, é evidente que a presença da proteína de revestimento tem um efeito dramático na perda nocturna (comparar a figura 4 e 5) e há alguma redução do nível de acumulação de proteína nas células que mostre o maior controlo de perda. Mais especificamente, o sinal é forte do lado esquerdo das manchas e diminui nas colunas do rato do lado direito em função da tensão e grau de controlo exercido pelos sistemas correspondentes; o promotor PS4 perde menos do que o promotor lac de UV5; a mutação da caixa a jusante diminui a perda, mas tem pouco impacto ao nível individual para o promotor de PS4; os mutantes de PRMS2 exibem um controlo mais forte da perda de gene 1 de T7 43 durante a noite e nas culturas exponenciais excepto as de tipo selvagem; os mutantes têm impacto ao nível da acumulação após indução, com as mais cuidadas controladas durante a noite (lac de UV5) exibindo níveis inferiores de polimerase do ARN após a indução; e o mutante PRMS214 parece ter um maior efeito do que o mutante PRMS211, que é um produto intermédio entre PRMS2ts e PRMS214.
Exemplo 5
Este exemplo descreve a inserção cromossómica de "cassetes do gene 1 de T7 controlada por MS2" no cromossoma de uma célula hospedeira e depois demonstra a utilização dessa célula hospedeira para expressar vários genes alvo, assim como, para providenciar os resultados dos ensaios em que a perda e as características de expressão das estirpes recentemente desenvolvidas são comparadas às disponíveis comercialmente, polimerase de ARN de T7 contendo estirpes.
Uma "cassete do gene 1 de T7 controlada por MS2" (contendo as sequências do terminador a jusante, uma sequência do promotor indutível, o sítio de reconhecimento de MS2, o gene 1 de T7, o gene da proteína de revestimento de MS 2 (PRMS2ts ou PRMS2-11 ou PRMS2-14) e um promotor constitutivo fraco, por exemplo, TET (ver figura 7) , foi cortado nos vários plasmidos de pRIN utilizando enzimas de restrição Sphl e PpuMI e depois foram clonados num vector M13 especialmente construído, MMEbg; Blum et al. , J.
Bacteriology, 171 (1) :538-546 (1889); Micheals, M.L., Gene, 93:1-7 (1990), para a integração específica do sítio no cromossoma hospedeiro. Obtiveram-se várias cassetes contendo quer PRMS2ts, PRMS2-11 ou PRMS2-14. 44 A integração procede através de um mecanismo de recombinação forçada. Primeiro, ligaram-se os oligonucleótidos 1553-73 e 1553-74 (ver quadro 1) nos sítios BamHl e Notl e de MMebg. Estes oligonucleótidos introduzem sítios únicos de Sphl e PpuMI no vector. A "cassete do gene 1 de T7 controlada por MS2", foi então ligada nos sítios Sphl e PpuMI. As ligação foram então transformadas em células XL1 azul pondo as células em 1 mL de SOC e colocando em placa 150 pL da ligação de MOCK 150 pL e 30 pL de ligações inseridas com 300 pL de uma cultura de XL1 azul durante a noite + 3,5 mL de LB + Top Agar a 0,8 %. Verteu-se a mistura sobre placas LB e incubou-se a 3 7 °C, durante a noite. Colocaram-se as placas em 100 pL de IX TE.
As culturas nocturnas iniciaram-se antes do rastreio por RCP com 70 pL de fagos novamente suspensos a partir das placas e 200 pL de XL1 azul ON em 5 mL de LB. Agitaram-se estas culturas a 37 °C, durante a noite. Rastreou-se cada placa por meio de RCP. Utilizou-se 2 pL da placa novamente em suspensão em 20 pL de uma mistura reaccional de RCP. Utilizam-se os oligonucleótidos 305-3 e 305-14 (interna para o gene 1 de T7) (ver quadro 1) para este rastreio. Identificaram-se os clones positivos fazendo passar as misturas reaccionais em gem de agarose a 1,0 %. Retirou-se aliquotas de 1 mL de cada cultura nocturna e guardou-se 800 pL do sobrenadante com fagos num tubo de Eppendorf. Incubou-se então a 70 °C, durante 20 minutos, uma aliquota de 200 pL de cada sobrenadante. Adicionou-se então 100 pL do fago tratado, aquecido, a 500 pL de uma estirpe K autotrófica de E. coli com um genótipo de lac iQ (designadas por células F'tet/GM120) a partir de uma cultura nocturna. (GM120 tem o número de acesso na ATCC N° . 55764). Incubaram-se estas amostras a 37 °C, durante cerca de 1 hora. Colocou-se então em placas 25 pL de F'tet/GM120 de controlo, 25 pL de fago, 45 sozinho, tratado com o calor e 25 pL de uma diluição a 1:10 de cada cruzamento em placas LB+Kn40. Fez-se a incubação destas placas a 37 °C, durante a noite. As colónias purificadas que resultaram do cruzamento (ou lisogenização) foram colocadas em linhas duas vezes em placas LB + Kn40 e incubadas a 3 7 °C, durante a noite. Fez-se então uma sub-cultura das colónias duas vezes em bílis de boi a 0,3 % e LB e depois agitou-se a 37 °C, durante a noite. As células foram então colocadas em linha em placas LB, em conjunto com uma réplica da colocação em placa de LB a LB + Kn para identificar as colónias sensíveis a canamicina (o fago já não deve estar presente nas colónias que são sensíveis a canamicina).
Realizou-se o rastreio de RCP para verificar a inserção nos cromossomas como se segue: recolheu-se uma colónia de uma placa e utilizou-se para inocular 20 pL de uma mistura de RCP (5 mL de LB também inoculado, utilizando a mesma ponta de pipeta, para ser utilizado para uma cultura durante a noite, se fosse identificada uma colónia positiva). Fez-se passar 15 pL de cada amostra de RCP em gel de agarose a 1,0 %, para encontrar elementos positivos. Quando se identificaram os elementos positivos pela sua dimensão no gel, as culturas correspondentes feitas durante a noite, foram agitadas a 37 °C. Foram então colocadas em placas de LB e incubadas a 37 °C, durante a noite. A cura das células do factor F', as culturas de colónias simples da placa em 5 mL de LB, foram agitadas a 3 7 °C, durante 4 horas. Seguiu-se então um protocolo publicado para a cura utilizando laranja de acridina como se segue; Miller, Experiments in molecular genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, págs. 104-106 (1972). Basicamente, colocam-se as células em placa com LB e uma placa de réplica com LB + tetraciclina. As células sensíveis a tetraciclina serão isoladas como menos F' . Iniciam-se as culturas das colónias destas placas durante a noite e depois re-infecta-se com M13 mpl8 para assegurar que o factor F' já não está presente nas células. Mistura-se então 300 pL das culturas nocturnas com um revestimento de agar e junta-se 2 pL do concentrado de fagos M13 mpl8. Já não deve haver placas presentes. Duas estirpes produzidas utilizando este protocolo, foram designadas por EE11-11M (promotor PS4) e EE11-20 (promotor lac de UV5) .
As perdas e as características de expressão de EE11-11M e EE11-20, foram comparadas com as das estirpes comercialmente disponíveis BL21(DE3) (descritas previamente), utilizando a expressão do gene do produto NT-3 ou o gene do produto FNDC como um marcador. NT-3 (ou FNDC) está presente no vector pET22b disponível comercialmente (Novagen, Madison, WI), que também tem um sítio de lac i entre o promotor T7 e o gene que interessa e comporta um gene lac iQ para reduzir a perda. Também se comparou BL21(DE3) contendo pLisS como um vector secundário versus EE11-11M contendo pLisS como um vector secundário versus EE11-20 contendo pLisS como um vector secundário (como se estabeleceu previamente, pLysS comporta o gene de lisozima de T7 que inibe a polimerase de ARN T7 e é a via recomendada para reduzir a perda). Finalmente, o plasmido pAMG25 que continha o gene FNDC foi também utilizado para comparar BL21(DE3) versus EE11-20.
Especificamente, as culturas nocturnas (5 mL) de LB + antibiótico (Kn40 ou Cm30) em tubos de Falcon de 50 mL e iniciou-se e estas culturas foram agitadas a 28 °C. Inocularam-se tubos frescos de 5 mL de LB + antibiótico em tubos de vidro de 14 mL com uma diluição de 1:100 da cultura da noite. Agitaram-se os tubos a 28 °C até que eles atingissem uma DO600 = ~0,8. As culturas da noite continuaram a ser agitadas a 28 °C, até à conclusão da experiência. As aliquotas de cada amostra foram retiradas antes da indução. As culturas foram induzidas pela a adição de 20 pL de IPTG 100 mM (deu uma concentração final para o IPTG de 0,4 mM). As culturas induzidas foram incubadas a 28 °C com agitação, durante 24 horas. Retirou-se uma amostra de 1 mL da cultura e agitou-se num tubo de Eppendorf de 1,5 mL, a 15.000 rpm (a 4 ° C) (Tomy MTX-160), durante 5 minutos. Decantou-se o sobrenadante e reteve-se a massa. As massas foram novamente suspensas num tampão de craqueamento a 0,01 unidades de DO/pL. Aqueceram-se então as amostras até 100 °C num bloco de aquecimento grande, durante 5 minutos, depois arrefeceram-se durante 2-3 minutos e depois carregou-se 6 pL de cada amostra num gel de tris-glicina-SDS-poliacrilamida a 4-20 %, no seio de um tampão de passagem de IX tris-glicina com a adição de SDS a 2 %. 0 gel passou a 150 V durante 1,3 horas. Corou-se o gel com azul de Coomassie para visualizar a proteína.
Tal como se mostra na figura 8, que utiliza NT-3 como o gene alvo, a estirpe EE11-20 não tem qualquer perda detectável em nenhuma das culturas nocturnas (CN) ou antes da indução (prel), enquanto que BL21(DE3) claramente apresenta. Os níveis de indução para NT-3 são comparáveis entre as estirpes. Olhando para a figura 9, que utiliza FNDC como um gene alvo, EE11-20 novamente não exibe nenhuma perda de produto antes da indução, embora BL21(DE3) claramente isso acontece. EE11-20 reduziu os níveis de FNDC em pET22b o que não aconteceu para BL21(DE3). Olhando para a figura 10, os níveis de FNDC expressos utilizando o vector pAMG25 foram semelhantes para EE11-20 e BL21(DE3). Para cada uma das experiências descritas nas figuras 8-10, a presença de pLisS reduziu a perda, mas também inibiu a expressão do produto (como tinha sido previamente relatado na literatura). 48
Finalmente, olhando para as figures 11 e 12, vê-se que EE11-11M não mostra nenhuma perda nocturna ou de pré-indução mas produz níveis comparáveis de proteína quando comparada com BL21(DE3). Além disso, a estirpe EE11-11M é superior à estirpe EE11-20 pelo facto da presença de lac i no vector não ter efeito na acumulação de proteínas e no facto de puder originar níveis superiores dos mesmos produtos (por exemplo, comparar as figuras 8 e 12). É claro a partir destes resultados que elementos adicionais que tenham sido introduzidos para controlar a perda nas estirpes disponíveis comercialmente, não são necessários nas estirpes desenvolvidas na presente invenção e a estirpe da presente invenção exibe tanto um maior controlo em relação à perda como níveis comparáveis de expressão do produto após indução.
Exemplo 6
Para determinar o impacto que a presença da proteína de revestimento MS2 pode ter a expressão de uma proteína heteróloga numa fermentação de alta densidade, ensaiaram-se vários produtos. Inicialmente, as condições reflectiram as condições que foram utilizadas para um frasco de agitação numa escala pequena, uma indução de baixa densidade õptica. Utilizou-se uma cultura exponencial (densidade óptica = 1,4) de EE11-11M contendo GCSF em pAMG25 para inocular um fermentador de 10 litros. A cultura cresceu a 28 °C até a uma densidade óptica de 0,8 e foi induzida com a adição de IPTG. Deixou-se a cultura crescer mais 10 horas após a indução atingindo uma densidade óptica final de 12 e retiraram-se amostras de hora em hora. Tal como se evidencia na figura 13, 49 não há uma perda detectãvel pré-indução da GCSF (coluna 1) e a proteína continua a ser produzida ao longo da indução.
Fez-se uma segunda fermentação (utilizando leptina em pAMG25) para ensaiar o desempenho da estirpe EE11-11M a elevada densidade. Utilizou-se um inoculo exponencial (densidade óptica = 1,32) para iniciar uma fermentação de 10 litros. A cultura cresceu até a uma densidade óptica de 10 a 28 °C. A cultura foi então induzida pela adição de IPTG. O crescimento continuou durante 6 horas e a cultura atingiu uma densidade óptica final de 41. Tal como se mostra na figura 14, não há uma perda aparente antes da indução e a leptina é produzida bem ao longo do tempo de indução.
Estas experiências mostram que a presença da proteína de revestimento MS2 não tem impacto negativo numa fermentação em larga escala ou de elevada densidade.
Exemplo 7
Este exemplo descreve a utilização do sistema MS2 para clonar vários genes precoces de T7. Os genes de T7 são colocados sozinhos ou como um operão. Os genes precoces dos bacteriófagos 0,4 e 0,6 foram amplificados por RCP, utilizando 356-ADN de T7; Studier et al. , J. Mol. Biol. , 235:917-937 (1979); Dunn & Studier, J. Mol. Biol., 166:477-535 (1983) como uma matriz. Cada gene foi produzido por RCP de modo a ter um sítio de EcoRI adjacente ao primeiro codão do gene (oligonucleótidos 1049-5 e 1049-7) (ver quadro 1) e foram clonados em pAMG13, que tinha sido modificado para conter um sítio de reconhecimento da proteína de revestimento MS2 e um marcador de poli-histidina em fragmentos com a região de clonagem múltipla (oligonucleótidos 1035-30 e 1035- 50 31)(ver quadro 1). Os oligonucleótidos 1482-18 e 1266-69 (ver quadro 1), foram utilizados para o gene 0,4 e os oligonucleótidos 1266-71 e 1443-41 (ver quadro 1) , para o gene 0,6. A proteína de revestimento MS 2 foi providenciada em trans a partir de pRINlO. As células electro-concorrentes contendo pRINIO, foram transformadas pelas ligações do gene precoce com pAMG13. Os clones positivos foram identificados por colónias transformantes de rastreio de RCP. As culturas positivas cresceram durante a noite como iniciadores para as experiências de expressão. Inocularam-se tubos frescos de LB Kan/Cam numa diluição de 1:100 (de 50 pL até 5 mL) e cresceram a 28 °C, com agitação, até uma D. O. de aproximadamente 0,7. Foram induzidas por passagem para um agitador a 42 °C e a incubação continuou durante 4 horas. Retiraram-se aliquotas de 1 mL e aglomeraram-se as células. Fez-se uma nova suspensão dos aglomerados em tampão de craqueamento a 0,01 unidades de D.O./pL e levou-se à ebulição durante 5 minutos. Arrefeceu-se em gelo e fez-se passar uma aliquota de 6 pL de cada um num gel de SDS-poliacrilamida a 10-27 %. A proteína foi então transferida electroforeticamente para nitrocelulose. Bloquearam-se as manchas durante a noite em mata borrão duplo com leite em pó sem gordura a 2 %. Fez-se uma sondagem das manchas durante 1 hora com um anticorpo policlonal derivado de coelho com péptido sintético à base da sequência de proteínas esperadas. Diluíram-se estes soros de 1 para 2000. Depois da lavagem, fez-se uma sondagem das manchas com peroxidase de rábano anti-coelho, de burro, conjugada com anticorpo (Amersham), durante 1 hora. Lavou-se e tratou-se com reagentes de ECL (Amersham) e expôs-se a um filme de raio X. A exposição durou 4 minutos. Revelou-se o 51 filme utilizando um processador de filmes da Kodak. Tal como se mostra na figura 15, a expressão do gene 0,4 foi obtida utilizando o sistema controlado por MS2. Do mesmo modo, obteve-se a expressão do gene 0,6 (figura 16).
Prepararam-se duas versões do gene 0,7: 1) oligonucleótidos 1053-66 e 1266-73 (ver quadro 1) , foram utilizados para preparar uma versão de comprimento completo do gene; e 2) os oligonucleótidos 1053-66 e 1266-72 (ver quadro 1), foram utilizados para preparar uma versão truncada do gene. A truncagem teve por base uma versão de mutante que tinha sido isolada, ao mesmo tempo que se tentava clonar a versão de comprimento completo sem um sítio de MS2 num vector de cópia única e se tinha uma mutação de ocre no codão 242. Esta paragem precoce é semelhante a uma mutação isolada do fago no codão 243; Studier, F.W., J. Mol. Biol., 79:227-236 (1973) e esse mutante mostrou ter perdido a actividade de fecho do hospedeiro mas retido a actividade da cinase; Michalewicz e Nicholson, Virology, 186:452-462 (1992).
Também se preparou um operão dos genes precoces por RCP sequencial. Os oligonucleótidos 1511-32, 1539-60, 1803-86, 1319-59, 1577-83, 1577-84, 1539-65, 1066-72 e 1435-93 (ver quadro 1) , foram preparados de modo a terem sobreposição da sequência dos genes adjacentes a cada gene individual precoce e também para introduzir um sítio de MS2 adjacente ao sítio inicial de cada região de codificação. Cada gene foi amplificado individualmente por RCP utilizando estes oligonucleótidos. Os genes precoces foram então adicionados em conjunto sequencialmente. Os genes 0,4 e 0,5 foram primeiros ligados por meio da utilização quer como matrizes e apenas utilizando os iniciadores externos. Isto produziu um fragmento de 0,4-0,5 que foi então utilizado como uma semi-matriz com o fragmento 0,3 e, assim sucessivamente, até a uma 52 estrutura completa de 0,3 a 0,7, designada por operão 3-7t, ser gerada (SEQ ID N° . 2) (figura 17). Para reduzir ainda mais a perda, os genes precoces no operão, as sequências da (caixa a jusante) foram mutadas nos genes 0,3, 0,6 e 0,7. A maior parte das alterações de base feitas para reduzir a homologia (da caixa a jusante), foram silenciosas embora uma substituição conservadora de aminoácidos ocorresse em cada um dos genes.
Exemplo 8
Este exemplo descreve os resultados das experiências em que operão 3-7t construído e descrito no exemplo 7, foi utilizado para aumentar a expressão de proteínas heterólogas em E. coli. As características de expressão dos sistemas que se seguem foram comparadas: 1) NDF alfa/beta clonado em pAMG33 e expresso em GM221 de E. coli ou com o operão 3-7t em pRINIO expresso em GM221 de E. coli; 2) 301-941 TP2 clonado em pAMG22 e expresso em GM221 de E. coli ou com o operão 3-7t em pRINIO e expresso em GM221 de E. coli.
Para cada experiência, retiraram-se colónias isoladas das placas e fez-se crescer em duas porções de 5 mL de LB com canamicinor LB, com canamicina e com cloranfenicol. Agitaram-se os tubos durante a noite a 28 °C. Preparam-se frascos de 4 litros contendo 1 L de 2XYT com canamicina ou 2XYT com canamicina e cloranfenicol. Inocularam-se com 10 mL de cultura do iniciador. As culturas cresceram, com agitação, a 28 °C, até a uma D.O. de 0,8. As culturas foram então levadas para 37 °C, com agitação, durante 1 hora. Voltou-se a levá-las para 2 8 °C e extraíram-se com IPTG 0,4 mM. Cresceram durante mais 3 horas com amostras retiradas hora a hora. As amostras de 1 mL foram centrifugadas durante 5 minutos a 15 53 K, a 4 ° C. Decantou-se o sobrenadante e congelou-se o aglomerado. Diluiu-se 500 pL de cada cultura em 500 pL de 2XYT e mediu-se a densidade óptica. Os aglomerados foram então descongelados e novamente suspensos em 0,01 unidades de DO/pL de tampão de craqueamento. Carregou-se então 6 pL destes aglomerados craqueados num gel de SDS-poliacrilamida (4-20 %) . Depois de se fazer passar a 150 V, durante 1,3 horas, os geles foram corados com azul de Coomassie para se visualizar as proteínas.
Como se mostra na figura 18, a presença de proteínas precoces de T7 protege NDF alfa/beta da proteólise. Quando não há proteínas precoces de T7 presentes, NDF alfa/beta é produzido durante 1 hora por indução (coluna 2) mas já não é detectável 2 horas após a indução (coluna 3) . Quando as proteínas precoces de T7 estão presentes, não há mais NDF alfa/beta detectável e continua a acumular-se ao longo de 3 horas de indução (colunas 7-9).
Tal como se mostra na figura 19, a célula hospedeira não produz 301-941 TP2 depois da indução na ausência das proteínas precoces de T7 (coluna 5) . Quando as proteínas precoces de T7 estão presentes, a produção da proteína após a indução aumenta drasticamente (colunas 2 e 3).
Exemplo 9
Este exemplo descreve a construção e análise de uma célula de uma série de estirpes hospedeiras procarióticas que foram tratadas por engenharia genética para produzir diferentes concentrações de PRMS2. As estirpes hospedeiras têm o PRMS2 ligado a um promotor TET modificado inserido no seu cromossoma. 54
Construção de estirpes Preparou-se uma cassete de uma variante de PRMS2-14 ligado ao promotor TET, utilizando os oligonucleótidos 1674-96 e 1674-97 (ver quadro 1). Esta cassete foi clonada nos sítios Notl e BamHI de MMebg para gerar MMebg-PRMS2-14. 0 promotor de TET foi então optimizado nas etapas: 1) a região -10 foi retirada para consenso por sobreposição de RCP. As metades de mutantes foram produzidas utilizando os oligonucleótidos 1011-96 com 1784-89 e 1758-66 com 1674-97. As metades foram então submetidas a RCP em conjunto utilizando os oligonucleótidos 1674-96 e 1674-97. Fez-se a reclonagem em MMebg a partir de Notl até BamHI, para se obter MMebg-PRMS214 (-10); 2) a região -35 foi levada a consenso para produzir um promotor TET completamente optimizado. Isto foi novamente feito utilizando metades na reacção de RCP, em que MMebg-PRMS214 (-10) serviu como matriz. As metades de mutantes foram construídas utilizando pares de oligonucleótidos 1011-96 com 1784-88 e 1803-15 com 1674-97 (ver quadro 1) . As duas metades foram então submetidas a RCP em conjunto, utilizando os oligonucleótidos 1674-96 e 1674-97. Fez-se a reclonagem em MMebg a partir de Notl até BamHI, para se obter MMebg-PRMS214 (completamente optimizado). MMebg-PRMS214 (-10) e MMebg-PRMS214 (completamente optimizado) exibiam ambos uma produção aumentada da proteína de revestimento MS2, quando comparada com a estrutura promotora de tipo selvagem (pequeno aumento para (-10) e um grande aumento para a completamente optimizada).
Para produzir versões do promotor mutante que originaria níveis de proteína de revestimento MS2 intermédios em relação aos mutantes descritos previamente, utilizou-se uma estratégia para tornar aleatória a sequência do sítio de ligação do ribossoma (SLR). A sequência da região promotora 55 contendo a região de consenso em -10 e o gene da proteína de revestimento MS2 até ao sítio Kpnl foram utilizados para preparar os oligonucleótidos 1822-01, 1822-02 e 1863-81. Estes oligonucleótidos foram fosforilados e anelados com os oligonucleótidos 1821-99, 1822-03, 1822-04 e 1822-05. o produto de ligação serviu então como uma matriz de RCP utilizando os oligonucleótidos 1822-06 e 1822-07. Este fragmento que está então de forma aleatória na sequência de ligação do ribossoma, foi capaz de ser ligado desde Notl até BamHI. Para determinar o efeito das alterações do sítio de ligação do ribossoma na proteína de produção, utilizou-se um ensaio de galactosidase beta. Especificamente, produziu-se uma fusão de PRMS2-14-LacZ produzindo um fragmento de LacZ com os oligonucleótidos 1803-52 e 1803-53 e a ligação deste num MMebg-PRMS2-14 desde Kpnl até BamHI. Esta estrutura contém o promotor TET de tipo selvagem ligado ao início do gene da proteína de revestimento MS2, que está fundido num fragmento com o gene LacZ de galactosidase beta. Os fragmentos de SLR aleatórios descritos no parágrafo anterior, foram então ligados nesta estrutura desde Notl até Kpnl. A fusão inicial e as ligações de fusão aleatórias, foram integradas no cromossoma seguindo o protocolo descrito no exemplo 5. A estirpe hospedeira utilizada foi F'tet/393iElacZ145N a que falta actividade de galactosidase beta. Analisaram-se os lisogenes novamente dissolvidos quanto à actividade de galatosidase beta, conforme descrito; Miller, Experimente in molecular genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, págs. 352-355 (1972). Identificou-se uma série de mutantes com vários níveis de actividade. Três destes mutantes, os números 1, 3 e 15 foram seleccionados para a produção de estirpes. A MMebg-PRMS2-14-LacZ que tinha dado origem a estas estirpes particulares, foi digerida desde Kpnl até BamHI para eliminar a fusão de LacZ. O gene PRMS2-14 foi então regenerado por ligação de Kpnl ao fragmento de 56
BamHI nestes vectores. Produziram-se as estirpes a partir destes três mutantes e MMebg-PRMS2-14 (completamente optimizado) por integração na estirpe hospedeira 393. As estirpes resultantes foram designadas por GM315 (mutante 1), GM320 (mutante 3), GM340 (mutante 15) e GM350 (completamente optimizada).
Ensaio das estirpes para produzir PRMS2 A capacidade destas estirpes para produzir a proteína de revestimento MS2, foi determinada por análise de mancha de Western de culturas exponenciais. As colónias de cada estirpe foram retiradas das placas e utilizadas para inocular 5 mL de LB. As colónias cresceram com agitação, a 30 °C, até a uma densidade óptica de 0,7. Retiraram-se amostras de 1 mL. Todas as amostras foram aglomeradas por centrifugação e este aglomerado foi novamente suspenso em tampão de craqueamento. Depois de se levar à ebulição durante 5 minutos, retirou-se uma aliquota de 6 pL de cada e fez-se passar em gel de SDS-poliacrilamida a 4-20 % (Novex). Transferiu-se então a proteína por electroforese para nitrocelulose. As manchas foram bloqueadas durante a noite em "blotto-tween" com leite em pó sem gordura a 2 %; Harlow & Lane, Immunoblotting ín Antibodies, A Laboratory Manual, Capítulo 12, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1988). Sondaram-se as manchas durante 1 hora com um anticorpo policlonal derivado de coelho, para avaliar a proteína de revestimento MS2. Depois da lavagem, sondaram-se as manchas com peroxidase de rábano, anti-coelho, de burro, conjugada com anticorpo (Amersham), durante 1 hora. Lavou-se e tratou-se com reagentes de ECL (Amersham) e expôs-se a um filme de raios X. O filme foi revelado utilizando um processador de filmes da Kodak. Tal como se mostra na figura 20, o nível de proteína de revestimento MS2 expressa passivamente durante a fase de crescimento logarítmico, é 57 detectável em relação à base em níveis baixos em GM315 e GM320 e aumenta consideravelmente em GM340 e GM350.
Clonagem de genes heterólogos utilizando as estirpes Utilizando técnicas convencionais, verificou-se que era muito difícil de clonar as funções do marcador de His do terminal N do gene ns5b da hepatite C (a Hep C polimerase) . Quando se isolaram versões de comprimento completo do gene, elas continham mutações que levaram às paragens precoces da tradução ou que estavam em ATG e evitavam o início da translação em conjunto. Para facilitar a clonagem deste gene, Ligou-se a ele uma sequência de reconhecimento de MS2 e as ligações foram usadas para transformar primeiro a estirpe GM350. Detectaram-se inserções de comprimento completo, sequenciaram-se e determinou-se que estavam correctas. O gene recombinante ns5b marcado com His, obtido de GM350 foi então colocado em pAMG21 e utilizado para transformar GM221, GM315 e GM320 (GM221 não contém a proteína de revestimento MS2 enquanto que GM315 e GM320 produzem níveis mais baixos do que GM350). Verificou-se que o gene era estável em todas as três linhas de células. A capacidade das várias estirpes para produzir esta hepC polimerase marcada com His, foi então determinada. Utilizaram-se culturas realizadas durante a noite para inocular 50 mL de 2XYT, em frascos de Erlenmeyer de 25 0 mL, numa diluição de 1 para 100. As estirpes cresceram com agitação a 30 °C, até a uma densidade óptica de 0,6. O vector pAMG21 contém um promotor lux e por isso a produção de hepC polimerase é conseguida pela adição do auto-indutor, numa concentração final de 30 ng/mL. A incubação continuou durante 4 horas e retiraram-se amostras. Voltou a fazer-se uma suspensão das células por centrifugação. Fez-se uma nova 58 suspensão dos aglomerados em 10 mL de SBF e fez-se uma mícrofluidização. Centrifugaram-se as amostras para separar as fracções solúveis e insolúveis. As fracções insolúveis foram misturadas com tampão de craqueamento e fez-se passar as amostras em geles de SDS a 4-20 %. Depois da passagem a 15 0 V, durante 1,3 horas, coraram-se os geles com azul de Coomassie para visualizar as proteínas.
Tal como se mostra na figura 21, a hepC polimerase é produzida nas três estirpes. A maioria da proteína produzida é insolúvel. Pode dalgum modo haver uma expressão mais elevada na proteína de revestimento MS2 contendo as estirpes. Este exemplo demonstra assim uma forma pela qual se pode utilizar as estirpes: o produtor mais elevado, GM350, é utilizado para clonar inicialmente o gene instável; e, uma vez obtido um clone estável e confirmado como correcto, ele pode ser transformado nas estirpes remanescentes e pode-se determinar a capacidade para produzir o produto de proteína, assim como, a estabilidade sustentável do gene.
Exemplo 10
Este exemplo descreve a construção do vector do plasmido pAMGuvxs, do vector do plasmido pAMGX e dos vectores do plasmido pRIN do operão de T4, utilizados para desenvolver o sistema à base do promotor médio de T4.
Os promotores médios de T4 bacteriófagos foram construídos de forma sintética utilizando as sequências de PuvsX e PX publicadas; Hinton, D.M., J. Biol. Chem., 266(27)18034-18044 (1991) (uvsX: oligonucleótidos 1084-66 e 1084-67 (ver quadro 1), X: oligonucleótidos 1084-68 e 1084-69) (ver quadro 1) . O promotor PuvsX foi reconstruído para 59 eliminar o sítio Ndel que ele contém (oligonucleótidos 1202-11 e 1550-85) (ver quadro 1). Cada estrutura foi produzida de modo a ter os sítios de restrição Aatll e Ciai. A sequência de base completa da estrutura do promotor PuvsX, está descrita na figura 22 e a sequência completa do gene da estrutura do promotor PX, está descrita na figura 23. O plasmido pAMG13 foi digerido com Aatll e Ciai para eliminar o promotor lambda sintético e o vector foi purificado em gel. Os promotores médios de T4 foram então ligados com este plasmido para criar os vectores de plasmido pAMGuvsX e pAMGX.
Produziu-se o operão motA/asiA de tal modo que cada gene fosse precedido por uma sequência de reconhecimento da proteína de revestimento MS2. A sequência publicada de motA; Uzan et al. , Mol. Microbiol., 4(9):1487-1496 (1990) e asiA; Orsini et al. , Jour. Bacteriology, 175 (1) :8593 (1993), foi utilizada para a produção. No início do fragmento, estava um sítio Xbal e no fim estava um sítio Xhol (oligonucleótidos 1084-63, 1528-19, 1528-20 e 1703-53) (ver quadro 1). Este fragmento foi digerido com Xbal e Xhol e depois ligado com vários vectores do plasmido pRIN para providenciar, por exemplo, o vector do plasmido pRINIO do operão de T4, o vector do plasmido pRINll do operão de T4, etc.
Exemplo 11
Este exemplo descreve o ensaio dos vectores de plasmido pAMGuvxs, pAMGX e dos vectores do plasmido pRIN do operão de T4, preparados e descritos no exemplo 10. Especificamente, realizaram-se as experiências de expressão para analisar a capacidade dos sistemas para evitar a perda e permitir a expressão do gene do produto. As características de expressão e de perda dos sistemas que se seguem, foram comparadas: 1) 60 gene 1 de T7 clonado e expresso no hospedeiro de E. coli, GM221 (N° . de acesso na ATCC 202077), contendo o vector de pAMGl3 (isto é, gene 1 de T7 sob o controlo do promotor lambda); 2) gene 1 de T7 clonado e co-expresso com pRINIO do operão de T4 no hospedeiro de E. coli, GM221, contendo pAMG13; 3) gene 1 de T7 clonado e co-expresso com pRINIO do operão de T4 no hospedeiro de E. coli, GM221. contendo pAMGuvsX (isto é, o gene 1 de T7 sob o controlo do promotor médio de T4 uvsX; 4) gene 1 de T7 clonado e co-expresso com pRINll do operão de T4 no hospedeiro de E. coli, GM221, contendo pAMGuvsX; 5) NT-3 clonado e co-expresso com pRINIO do operão de T4 no hospedeiro de E. coli, GM225, contendo pAMGuvsX; e 6) FNDC clonado e co-expresso com pRINIO do operão de T4 no hospedeiro de E. coli, GM225, contendo pAMGuvsX.
Para cada experiência, retiraram-se colónias únicas das placas e fez-se crescer em 5 mL de 2XYT com cloranfenicol e canamicina. Agitaram-se os tubos durante a noite, a 28 °C.
Carregaram-se tubos de 50 mL com 5 mL de 2XYT com cloranfenicol e canamicina. Os tubos frescos foram inoculados com 50 pL das culturas iniciais. Estes tubos promoveram o crescimento, com agitação, a 28 °C, até uma D.O. de 0,6-1,2. O promotor PS4 contendo as culturas (pRINll), que foram induzidas com 20 pL de IPTG, enquanto que o promotor lambda continha culturas (pAMG), que foram induzidas mudando a temperatura de 37 °C ou 42 °C. O tempo de indução para todas estas experiências de expressão foi de 4,0 horas. Centrifugou-se 1 mL de cada cultura, durante 10 minutos. Decantou-se o sobrenadante e congelou-se o aglomerado. Diluiu-se 500 pL de cada cultura em 500 pL de 2XYT e mediu-se a densidade óptica. Descongelaram-se os aglomerados e voltaram a suspender-se em tampão de craqueamento de 0,01 unidades de DO/pL. Carregou-se então 6 pL destes aglomerados 61 craqueados num gel de SDS-poliacrilamida (4-20 % ou 16 %) . Depois de se fazer uma passagem a 150 V durante 1,3 horas, coraram-se os geles com azul de Coomassie para visualizar as proteínas.
Os dados das figuras 24-29 podem ser resumidos como se segue: 1) o vector de pAMG13 é capaz, sob indução, de produzir níveis abundantes de polimerase de ARN de T7, quando o gene 1 de T7 está sob o controlo do promotor lambda (ver colunas 3 e 4, figura 24); 2) os produtos da proteína do operão T4 conseguem abolir suficientemente o reconhecimento do promotor lambda por meio da polimerase do ARN de E. coli (comparar as colunas 2 e 3 da figura 25 com as colunas 3 e 4 da figura 24); 3) podem obter-se níveis abundantes de polimerase de ARN de T7 em pAMGuvsX, em que o gene 1 de T7 é clonado e co-expresso com pRINIO do operão de T4 (comparar as colunas 3 e 4 da figura 24 com as colunas 2 e 3 da figura 26) ; 4) a co-expressão com pRINll do operão de T4 é tão efectiva na produção do gene 1 de T7 como é o pRINIO do operão de T4 (comparar as colunas 3 e 4 da figura 27 com as colunas 2 e 3 da figura 26) ; e 5) podem também obter-se níveis abundantes de NT-3 e FNDC a partir de pAMGuvsX, em que NT-3/FNDC é clonado e co-expresso com pRINIO do operão de T4 (comparar as figuras 28 e 29 com a figura 26).
Exemplo 12
Este exemplo descreve a clonagem do operão motA/asiA em plasmidos de cópias únicas contendo o sistema MS2. Os vectores de cópias únicas derivaram de pSClOl; Bernardi e Bernardi, Nuc. Acids Res., 12:9415-9426. Este vector foi digerido com Ndel e depois re-circularizado para se obter o plasmido pSClOldNde. Introduziu-se um ligante de ADN contendo 62 os sítios BglII e Nsil no sítio de EcoRI deste plasraido. Clonou-se então um fragmento de pAMG22 desde Nsil até BglII, que contém T1T2, o promotor de PS4 e o sítio de clonagem múltiplo para criar o plasmido pTS2. Cortou-se então pTS2 com MluI e Xmnl, tornaram-se as extremidades cegas utilizando um fragmento de Klenow; Sambrook et al. , Molecular cloning, a laboratory manual, segunda edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, págs. 5.40-5.41 (1989) e o plasmido foi re-circularizado para se obter pTS2d. Os fragmentos dos vectores do plasmido pRIN contendo o promotor alvo, o sítio de reconhecimento de MS2, o gene de PRMS2 e o promotor TET, foram gerados por RCP utilizando os oligonucleótidos 828-31 e 1553-72 (ver quadro 1). Estes fragmentos foram digeridos com Aatll e BglII e depois ligados em pTS2d para criar os vectores do plasmido pCB (ver figura 30). O operão motA/asiA descrito no exemplo 10, foi então clonado nestes vectores de plasmido pCB desde Xbal até Xhol, para criar os vectores do plasmido pAW (ver figura 31).
Produziu-se outro plasmido simples pCB utilizando o promotor TET mutado para o controlo da proteína de revestimento MS2. Produziu-se uma cassete do gene da proteína de revestimento MS2 ligado ao promotor TET por RCP, utilizando os oligonucleótidos 1870-97 e 1906-27 (ver quadro 1). Este fragmento foi digerido desde Xhol até BglII e ligado em pTS2d para criar pCBll. O operão motA/asiA descrito no exemplo 10, foi então clonado neste vector desde Xbal até Xhol para criar pAWll (promotor de Ps4).
Exemplo 13
Este exemplo descreve o ensaio dos vectores do plasmido pAW preparados e descritos no exemplo 12. As experiências de 63 expressão foram realizadas de tal maneira que os genes do produto foram clonados quer sob os promotores de uvsX de T4 ou X de T4. As caracterxsticas de expressão e de perda dos sistemas que se seguem foram comparadas: 1) gene 1 de T7 clonado e co-expresso com pAW20 em E. coli, GM221, contendo pAMGX (isto é, o gene 1 de T7 sob o controlo do promotor X de T4; 2) SPI clonado e co-expresso com pAW20 em E. coli, GM225, contendo pAMGX (isto é, o SPI sob o controlo do promotor X de T4; 3) OPG clonado e co-expresso com pAW20 em E. coli, GM225, contendo pAMGuvsX (isto é, OPG sob o controlo do promotor uvsX de T4) ; 4) FNDC clonado e co-expresso com pAWll em E. coli, GM225, contendo pAMGuvsX (isto é, FNDC sob o controlo do promotor uvsX de T4) ; 5) OPG clonado e co-expresso com pAWll em E. coli, GM225, contendo pAMGuvsX (isto é, OPG sob o controlo do promotor X de T4; 6) NT3 clonado e co-expresso com pAWll em E. coli, GM225, contendo pAMGuvsX (isto é, NT3 sob o controlo do promotor de uvsX de T4; e 7) 3MNDF clonado e co-expresso com pAWll em E. coli, GM225, contendo pAMGX (isto é, 3MNDF sob o controlo do promotor X de T4).
Para cada experiência, retiraram-se colónias simples de placas e fez-se crescer em 5 mL de 2XYT com tetraciclina e canamicina. Agitaram-se os tubos durante a noite, a 28 °C. Colocou-se 5 mL de 2XYT em tubos de 50 pL com tetraciclina e canamicina. Os tubos foram novamente inoculados com 50 pL das culturas iniciais. Fez-se crescer nestes tubos as culturas, com agitação, a 28 °C, até a uma O.D. de 0,6-1,2. O promotor PS4 contendo as culturas e o promotor lac de UV5 contendo as culturas, foram induzidas com 20 pL de IPTG, enquanto que as culturas contendo o promotor lambda foram induzidas por aumento da temperatura, quer para 3 7 °C ou para 42 °C. O tempo de indução para todas estas experiências de indução foi de 4,0 horas. Fez-se a centrifugação de 1 mL de cada cultura, durante 10 minutos. Decantou-se o sobrenadante e congelou-se 64 a massa. Diluiu-se 500 μΐι de cada cultura em 500 μΐι de LB e mediu-se a densidade óptica. Descongelaram-se então os aglomerados e voltaram então a suspender-se em 0,01 unidade de DO/pL de tampão de craqueamento. Carregaram-se então 6 pL destes aglomerados craqueados em gel de SDS-poliacrilamida (a 4-20 % ou 16 %) . Depois de se fazer passar a 150 V, durante 1,3 horas, coraram-se os geles com azul de Coomassie para visualizar as proteínas. Os dados das figuras 32-34 podem ser resumidos como se segue:: 1) podem obter-se níveis abundantes do gene 1 de T7 em pAMGX, em que o gene 1 de T7 é clonado e co-expresso com pAW20 (figura 32); 2) podem obter-se níveis abundantes de SPI em pAMGX, em que SPI é clonado e co-expresso com pAW20 (figura 33) ; e 3) podem obter-se níveis abundantes de OPG em pAMGuvsX, em que OPG é clonado e co-expresso com pAW20 (figura 34).
Os dados das figuras 35-38 podem ser resumidos como se segue: 1) podem obter-se níveis abundantes de FNDC em pAMGuvsX, em que FNDC é clonado e co-expresso com pAWll (figura 35); 2) podem obter-se níveis abundantes de OPG em pAMGuvsX, em que OPG é clonado e co-expresso com pAWll (figura 36); 3) podem obter-se níveis abundantes de NT3 em pAMGuvsX, em que NT3 é clonado e co-expresso com pAWll (figura 37); 4) podem obter-se níveis abundantes de 3MNDF em pAMGX, em que 3MNDF é clonado e co-expresso com pAWll (figura 38) .
Dado que o ensaio com cópias simples de plasmidos pAW origina um sistema semelhante aquele que ocorreria se a cassete de T4 à base de MS2 fosse colocada no cromossoma, constitui um objecto da presente invenção que cada um dos elementos do promotor médio de MS2-T4 requeridos, possa ser colocado no cromossoma da célula hospedeira, para providenciar um sistema eficaz e altamente controlado. 65
Exemplo 14
Este exemplo descreve a utilização de um sistema T4 à base de MS2, para expressar com eficácia uma proteína acessória e assim aumentar a expressão de uma proteína alvo.
Produziu-se por RCP um operão de T4 contendo motA e asiA tendo um sítio de Xhol no início, seguido de um sítio de reconhecimento de MS2 e um sítio BamHI na extremidade do gene asiA que está também precedido de um sítio de reconhecimento de MS2 (oligonucleótidos 1351-01 e 12686) (ver quadro 1) . Este fragmento foi então clonado nos sítios correspondentes de pRINIO (dando pRINIO do operão de T4). O gene 0,6 de T7 foi preparado de modo a ter um sítio Xbal seguido de um sítio de reconhecimento de MS2 e terminando com um sítio de Xhol (oligonucleótidos 1443-41 e 1465-31) (ver quadro 1). Este fragmento de 0,6 foi então colocado em pRINIO do operão de T4 utilizando os sítios correspondentes. Isto origina um plasmido (pRINIO do operão de T4 0,6) que pode expressar tanto o gene 0,6 como os factores de transcrição de T4. As experiências de expressão foram realizadas (seguindo o mesmo protocolo experimental que foi descrito no exemplo 11) , utilizando um sistema em que FNDC foi clonado e co-expresso com pRINIO do operão T4 0,6, em E. coli, no hospedeiro GM225 contendo pAMGuvsX (isto é, FNDC sob o controlo do promotor médio uvsX de T4).
Tal como descrito na figura 39, podem obter-se níveis abundantes de FNDC utilizando este sistema e os níveis obtidos eram superiores aos obtidos utilizando um sistema pRINIO do operão de T4, a que faltava o gene 0,6 (comparar as 66 colunas 4 e 5 da figura 2 9 com as colunas 4 e 5 da figura 39). Por isso, a proteína acessória (0,6) aumentou a expressão da proteína alvo num sistema de expressão de promotor por etapas.
No quadro 1 a seguir indicam-se os oligonucleótidos utilizados nos exemplos aqui descritos.
Quadro 1
909-34 (SEQ ID N° . 5) TATGGCTTCTAACTTCACTCAGTTCGTACTGGTTGAC 909-35 (SEQ ID N° . 6) GCCTTGTCAACCAGTACGAACTGAGTGAAGTTAGAAGCCA 909-36 (SEQ ID N° . 7) AACGGCGGTACCGGCGATGTAACTGTTGCACCGTCCAACTTC 909-37 (SEQ ID N° . 8) ATTTGCGAAGTTGGACGGTGCAACAGTTACATCGCCGGTACC 909-38 (SEQ ID N° . 9) GCAAATGGCGTTGCTGAATGGATTTCTTCCAACTCT 909-39 (SEQ ID N° . 10) GCTGCGAGAGTTGGAAGAAATCCATTCAGCAACGCC 909-40 (SEQ ID N" . 11) CGCAGCCAGGCTTACAAAGTAACTTGCAGCGTTCGCCAGTCC 909-41 (SEQ ID N° . 12) TGCAGAGGACTGGCGAACGCTGCAAGTTACTTTGTAAGCCTG 909-42 (SEQ ID N° . 13) TCTGCACAAAACCGAAAATACACCATCAAGGTAGAA 909-43 (SEQ ID N° . 14) CGGGACTTCTACCTTGATGGTGTATTTTCGGTTTTG 909-44 (SEQ ID N° . 15) GTCCCGAAAGTTGCGACCCAGACTGTAGGCGGTGTCGAACTG 909-45 (SEQ ID N° . 16) AACCGGCAGTTCGACACCGCCTACCGTCTGGGTCGCAACTTT 909-46 (SEQ ID N° . 17) CCGGTTGCTGCATGGCGCAGCTACCTGAACATGGAA 909-47 (SEQ ID N° . 18) CGTCAGTTCCATGTTCAGGTAGCTGCGCCATGCAGC 909-48 (SEQ ID N° . 19) CTGACTATCCCGATTTTCGCAACCAACTCTGACTGTGAACTG 909-49 (SEQ ID N° . 20) TACGATCAGTTCACAGTCAGAGTTGGTTGCGAAAATCGGGAT 909-50 (SEQ ID N° . 21) ATCGTAAAAGCTATGCAGGGTCTGCTAAAAGAT 909-51 (SEQ ID N° . 22) ATTGCCATCTTTTAGCAGACCCTGCATAGCTTT 909-52 (SEQ ID N° . 23) GGCAATCCAATTCCGTCCGCAATCGCTGCAAACTCTGGTATCTAC TAATAG 909-53 (SEQ ID N° . 24) GATCCTATTAGTAGATACCAGAGTTTGCAGCGATTGCGGACGGAA TTGG 1456-55 (SEQ ID N° . 25) CGCAAATGGCATTGCTGAATGG 1456-56 (SEQ ID N° . 26) CCATTCAGCAATGCCATTTGCG 1456-61 (SEQ ID N° . 27) CCAACTCTGACCGTGAACTGATCG 1456-62 (SEQ ID K° . 28) CGATCAGTTCACGGTCAGAGTTGG 940-29 (SEQ ID N° . 29) AGCTGGTGAGCTCGATCATTGGGCATACGCATGCTGCAGCGC 940-30 (SEQ ID N° . 30) TCTAGGCGCTGCAGCATGCGTATGCCCAATGATCGAGCTCACC 941-43 (SEQ ID N° . 31) GGCCAATCGCGAATTGACGTCACGTTCAGAATT 67
941-44 (SEQ ID N° 32) GGCCAATTCTGAACGTGACGTCAATTCGCGATT 1036-99 (SEQ ID N° 33) ATGCATCGAGCTCGATTAGGACATGGGGCCTCGCT 1016-20 (SEQ ID N° 34) GCCCGCGCGAGCTCGTTGTAATTCTCATGTTTGACAGCTTATCAT CGATAAGCTTTAATGCGGTAGTTT 1016-21 (SEQ ID N° . 35) GGGAATTCCATATGCGGTGCCTGACTGCGTTAGCAATTTAACTGT GATAAACTACCGCATTAAAGC 1036-6 (SEQ ID N° . 36) GATTCCCCCGGGCAAATAAAACGAAAGGCTCAGTCGAAAGAC 1053-71 (SEQ ID N° . 37) CTGATCGCGACGTCTTGTAGAAACGCAAAAAGGCCATCCGTCAG 949-1 (SEQ ID N° . 38) GCTCTAGAAACATGAGGATTACCCATGAACACGATTAACATCGCT AAGAACGACTTCTCTGAC 949-2 (SEQ ID N° . 39) CGGGATCCGTCATTACGCGAACGCGAAGTCCGACTC 1477-84 (SEQ ID N” . 40) GCGCGCTCTAGAAAACATGAGGATTACCCATGAATACCATCAATA TCGCTAAGAACGACTTCTCTGACATC 1553-73 (SEQ ID N° . 41) GGCCCAGTGCATGCCTACGTGGGTCCTAGTCGC 1553-74 (SEQ ID N° . 42) GATCGCGACTAGGACCCACGTAGGCATGCACTG 305-3 (SEQ ID N° . 43) CTGAATACGCTGAGGCTA 305-14 (SEQ ID N° . 44) TCAGCCAGTAGTAACCTT 1049-5 (SEQ ID N° . 45) GCGCGCGAATTCTTTCGATCTACTACCAACGTGCAATACGGTCTG ACC 1049-7 (SEQ ID N° . 46) GCGCGCGAATTCTTTCGAATGAAGCACTACGTTATGCCAATCCAC ACG 1035-30 (SEQ ID N° . 47) CTAGAGCAAACATGAGGATTACCCATGAAACATCACCATCACCAT CACCATACCGGTGGCG 1035-31 (SEQ ID N" . 48) AATTCGCCACCGGTATGGTGATGGTGATGGTGATGTTTCATGGGT AATCCTCATGTTTGCT 1482-18 (SEQ ID N° . 49) GCGCGCTCTAGAAAACATGAGGATTACCCATGTCTACTACCAACG TGCAATACGGTCTGACC 1266-69 (SEQ ID N° . 50) GCGCGCGGATCCGAGTCTATCACTCAGCAGATTCTA 1266-71 (SEQ ID N° . 51) GCGCGCGGATCCCTATTATGAGATAGCGTTCAGTGTGTTGGC 1053-66 (SEQ ID N° . 52) GCGCGCCTCAGAAAACATGAGGATTACCCATGAACATTACCGACA TCATGAACGCTATCGACGCAATCA 1266-73 (SEQ ID N° . 53) GCGCGCGGATCCCTATCAGCCCATTAACATTGCGTC 1266-72 (SEQ ID N° . 54) GCGCGCGGATCCCTATCATGCGACTTCCTCGACTTC 1511-32 (SEQ ID N° . 55) GCGCGCTCTAGAAAACATGAGGATTACCCATGGCTATGTCTAATC TCACATATAACAACGTTTTCGAC 1539-60 (SEQ ID N° . 56) CACGTTGGTAGTAGACATGGGTAATCCTCATGTTTTTACTCTTCA TCCTCCTCGTACTCC 1539-65 (SEQ ID N° . 57) GTCGGTAATGTTCATGGGTAATCCTCATGTTTTTATGAGATAGCG TTCAGTGTGTTGG 1803-86 (SEQ ID N° . 58) AGCATATACATGGGTAATCCTCATGTTTGAGTCTATCACTCAGCA 68
GATTCTAAAGC 1319-59 (SEQ ID N" 59) CTGCTGAGTGATAGACTCAAACATGAGGATTACCCATGTATATGC 1577-83 (SEQ ID N° 60) CATAACGTAATGCCGCATGGGTAATCCTCATGTTTTCATCATTTG CGTAGTGCCCCTTTGATG 1577-84 (SEQ ID N° . 61) CATCAAAGGGGCACTACGCAAATGATGAAAACATGAGGATTACCC ATGCGGCATTACGTTATG 1066-72 (SEQ ID N° . 62) GAACGCTATCTCATAACGAAACATGAGGATTACCCATGAACATTA CCG 1435-93 (SEQ ID N° . 63) GCGCGGATCCCTATCATGCGACTTC 1084-66 (SEQ ID N° . 64) GCGCGCGACGTCGGCAAAAAGCAGTCAGAAGAAACTAAAGCAGCA AAACGAAAAGAAGCTTTGCTT 1084-67 (SEQ ID N° . 65) GCGCGCATCGATTGATGGTTTATTTCTATTATAACCATATGGATT ATTAAGCAAAGCTTCTTT 1084-68 (SEQ ID N° . 66) GCGCGCGACGTCTGATAGAGTCAATGAGTTAAAACACAGTGATGT TTTGCGTAAAGAGAT 1084-69 (SEQ ID N° . 67) GCGCGCATCGATGCACGGGTTTTATTTAAAATATCATGTTGAATA GAAAGCATCTCTTTACGC 1202-11 (SEQ ID N° . 68) GCGCGCGACGTCGGCAAAAAGCAGTCAGAAGAAACTAAAGCAAAA CGAAAAGAAGCTTTGCTT 1550-85 (SEQ ID N° . 69) GCGCGCATCGATTGATGGTTTATTTCTATTATAACGATATAGATT ATTAAGCAAAGCTTCTTT 1084-63 (SEQ ID N° . 70) GCGCGCTCTAGAAAACATGAGGATTACCCATGTCTAAAGTAACTT ACATCATCAAAGCTTCTA 1528-19 (SEQ ID N° . 71) TGTATCAATGTTTTTATTCATGGGTGATCCTC 1528-20 (SEQ ID N° . 72) ATGAATAAAAACATTGATACAGTTCGTG 1703-53 (SEQ ID N° . 73) GCGCGCCTCGAGCTATTATTTGTTCGTATACATCTCCAGGTATCG ATA 828-31 (SEQ ID N° . 74) GGATGGCCTTTTTGCGTTTCT 1553-72 (SEQ ID N° . 75) GCGCGCAGATCTGAAGATCTTATTAATCAGATAAAATATTTCTAG GCG 1351-01 (SEQ ID N° . 76) GCGCGCCTCGAGAAACATGAGGATTACCCATGTCTAAAGTAACTT ACATCATCAAAGCTTCTA 1260-86 (SEQ ID N° . 77) GCGCGCGGATCCCTATTATTTGTTCGTATACATCTCCAGGTATCG ATA 1443-41 (SEQ ID N° . 78) GCGCGCTCTAGAAAACATGAGGATTACCCATGATGAAGCACTACG TTATGCCAATCCACACGTCC 1465-31 (SEQ ID N° . 79) GCGCGCCTCGAGCTATTATGAGATAGCGTTCAG 1870-97 (SEQ ID N° . 80) GCGCGCGCATGCAGATCTGTATGCCCAATGATCGAGCTGTTGTAA TTCTC 1906-27 (SEQ ID N° . 81) GCGCGCCTCGAGCCGCGGCTATTAGTAGATACCAGAGTTTGC 69
1674-96 (SEQ ID N° . 82) CAACACCCAGCGGCCGCTGCGTATCAATGATCGAGCTGT 1674-97 ÍSEQ ID N° . 83) AAGCTTACTCGAGGATCCCTATTAGTAGATACCACAGT 1011-96 (SEQ ID N° . 84) GCTGCCGCTGTTAGTCTTCGTTCC 1784-89 (SEQ ID N° . 85) CTACCGCATTATAGCTTATCGATGATAAGCT 1758-66 (SEQ ID N° . 86) CGATAAGCTATAATGCGGTAGTTTACAGTTAAA 1784-88 (SEQ ID N° . 87) TTATTCCTCCTTGCGTTAGCAATTTAACTGTGATAAACTACCGCA TTATAGCTTATCG 1803-15 (SEQ ID N° . 88) CGATAAGCTATAATGCGGTAGTTTATCACAGTTAAATTGCTAACG CAAGGAATAACATATGGCTTCTAACTTCACTCAG 1803-52 (SEQ ID N° . 89) CCACCACCGGGTACCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGG 1803-53 (SEQ ID N° . 90) CCACCACACGGATCCTTATTTTTGACACCAGACCAACT 1822-01 (SEQ ID N° . 91) AGTTAAATTGCTAACGCA(AG)(AG)(AG)(AG)GGCACCGCATA TGCTTCTAACTTCACTCA 1822-02 (SEQ ID N° . 92) GTTCGTACTGGTTGACAACGGCGGTACCCACAGTGACTATATGGG TGGCA 1822-03 (SEQ ID N° . 93) ATCGATGATAAGCTGTCAATAATGAGAATT 1822-04 (SEQ ID N° . 94) GTTAGCAATTTAACTGTGATAAACTACCGC 1822-05 (SEQ ID N" . 95) TCAACCAGTACGAACTGAGTGAAGTTAGAA 1863-81 (SEQ ID N° . 96) CAGCTTATCATCGATAAGCTATAATGCGGTAGTTAATCAC 1822-06 (SEQ ID N° . 97) TGACACACGGTCAATGGTTGG 1822-07 (SEQ ID N° . 98) TGCCACCCATATAGTCACTGTGG
Depósitos de AND/Células Hospedeiras
Depositaram-se as células hospedeiras K-12/GM350 de E. coli na ATCC (American Type Culture Collection, 12301
Parklawn Drive, Rockville, MD, EUA), em 20 de Janeiro de 1999 .
Depositaram-se as células hospedeiras K-12/GM225 de E. coli na ATCC (American Type Culture Collection, 12301
Parklawn Drive, Rockville, MD, EUA), em 27 de Janeiro de 1998 e foi-lhes atribuído o número de acesso 20281.
Depositaram-se as células hospedeiras K-12/GM225 de E. coli, contendo o vector de plasmido pAMG13 na ATCC (American 70
Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, EUA) , em 27 de Janeiro de 1998 e foi-lhes atribuído o número de acesso 98641.
Depositaram-se as células hospedeiras K-12/GM225 de E. coli, contendo o vector de plasmido pAMG25 na ATCC (American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, EUA) , em 27 de Janeiro de 1998 e foi-lhes atribuído o número de acesso 98642.
Depositaram-se as células hospedeiras K-12/GM225 de E. coli, contendo o vector de plasmido 3002 nahG na ATCC (American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, EUA) , em 27 de Janeiro de 1998 e foi-lhes atribuído o número de acesso 98645.
Depositaram-se as células hospedeiras K-12/GM225 de E. coli, contendo o vector de plasmido pRINIO (p) na ATCC (American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, EUA) , em 27 de Janeiro de 1998 e foi-lhes atribuído o número de acesso 98639.
Depositaram-se as células hospedeiras EE11-11M de E. coli na ATCC (American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, EUA), em 27 de Janeiro de 1998 e foi-lhes atribuído o número de acesso 202083.
Depositaram-se as células hospedeiras EE11-20 de E. coli na ATCC (American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, EUA) , em 27 de Janeiro de 1998 e foi-lhes atribuído o número de acesso 202082.
Depositaram-se as células hospedeiras K-12/GM225 de E. coli, contendo o vector de plasmido pAMGuvsX na ATCC 71 (American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, EUA) , em 27 de Janeiro de 1998 e foi-lhes atribuído o número de acesso 98644.
Depositaram-se as células hospedeiras K-12/GM225 de E. colí, contendo o vector de plasmido pAMGX na ATCC (American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, EUA) , em 27 de Janeiro de 1998 e foi-lhes atribuído o número de acesso 98643.
Depositaram-se as células hospedeiras K-12/GM225 de E. coli, contendo o vector de plasmido pRINIO do operão de T4 na ATCC (American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, EUA) , em 27 de Janeiro de 1998 e foi-lhes atribuído o número de acesso 98640.
Depositaram-se as células hospedeiras K-12/GM225 de E. colí, contendo o vector de plasmido pAW20 na ATCC (American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, EUA) , em 28 de Janeiro de 1998 e foi-lhes atribuído o número de acesso 98638.
Depositaram-se as células hospedeiras K-12/FM-15 de E. coli, contendo o vector de plasmido pAMG21 na ATCC (American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, EUA) e foi-lhes atribuído o número de acesso 98113.
Depositaram-se as células hospedeiras K-12/GM221 de E. colí, contendo o vector de plasmido pAMG33 na ATCC (American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, EUA), em 20 de Janeiro de 1999.
Depositou-se o vector de plasmido pAMG22 na ATCC (American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, 72
Rockville, MD, EUA) , em 28 de Janeiro de 1998 e foi-lhes atribuído o número de acesso 98646. A presente invenção foi descrita em termos dos enquadramentos particulares verificados ou propostos para incluir os modos preferidos da prática da presente invenção. Será evidente para os especialistas na matéria que, à luz da presente descrição, podem fazer-se numerosas modificações e alterações nos enquadramentos particulares exemplificados sem sair do âmbito das reivindicações. 73
LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> BROWN, WILLIAM C.
<120> EXPRESSÃO CONTROLADA ALTAMENTE EFICIENTE DE GENES EXÓGENOS EM E. COLI <13 0 > A- 518 <14 0 > AINDA NÃO ATRIBUÍDA <141 > 1999-01-26 < 15 0 > 60/072.794 <151> 1998-01-28 <160> 98 <17 0 > Patentln Ver, , 2.0 <210> 1 <211> 397 <212> ADN <213 > bacteriófago MS 2 <400> 1 atggcttcta accttcactc agttcgtact ggttgacaac ggcggtaccg gcgatgtaac 60 tgttgcaccg tccaacttcg caaatggcgt tgctgaatgg atttcttcca actctcgcag 120 ccaggcttac aaagtaactt gcagcgttcg ccagtcctct gcacaaaacc gaaaatacac 180 catcaaggta gaagtcccga aagttgcgac ccagactgta ggcggtgtcg aactgccggt 240 tgctgcatgg cgcagctacc tgaacatgga actgactatc ccgattttcg caaccaactc 300 tgactgtgaa ctgatcgtaa aagctatgca gggtctgcta aaagatggca atccaattcc 360 gtccgcaatc gctgcaaact ctggtatcta ctaatag 397
<210> 2 <211> 1851 <212> ADN <213> bacteriófago T7 <4 0 0 > 2 tctagaaaac atgaggatta cccatggcta tgtctaatct cacatataac aacgttttcg 60 accacgctta cgaaatgctg aaagaaaaca tccgttatga tgacatccgt gacactgatg 120 74 acctgcacga tgctattcac atggctgccg ataatgcagt tccgcactac tacgctgaca 180 tctttagcgt aatggcaagt gagggcattg accttgagtt cgaagactct ggtctgatgc 240 ctgacaccaa ggacgtaatc cgcatcctgc aagcgcgtat ctatgagcaa ttaacgattg 300 acctctggga agacgcagaa gacttgctca atgaatactt ggaggaagtc gaggagtacg 360 aggaggatga agagtaaaaa catgaggatt acccatgtct aataccaacg tgcaatacgg 420 tctgaccgct caaactgtac ttttctatag cgacatggtg cgctgtggct ttaactggtc 480 actcgcaatg gcacagctca aagaactgta cgaaaacaac aaggcaatag ctttagaacc 540 tgctgagtga tagactcaaa catgaggatt acccatgtat atgcttacta tcggtctact 600 caccgctcta ggtctggctg taggtgcatc ctttgggaag gctttaggtg tagctgtagg 660 ttcctacttt accgcttgca tcatcatagg aatcatcaaa ggggcactac gcaaatgatg 720 aaaacatgag gattacccat gcggcattac gttatgccaa tccacacgtc caacggggca 780 accgtatgta cacctgatgg gttcgcaatg aaacaacgaa tcgaacgcct tgagcgtgaa 840 ctccgcatta accgcaagat taacaagata ggttccggct atgacagaac gcactgatgg 900 cttaaagaaa ggttatatgc ccaatggcac actatacgct gcaaatcggc gaatagtgag 960 aacttggcga gagaacaacc tcgaacgccg caaggaacaa gagagggcgg tgtggcatag 1020 acgaaaggaa aaggttaaag ccaagaaact cgccgcactt gaacaggcac tagccaacac 1080 actgaacgct atctcataaa aacatgagga ttacccatga acattaccga catatcaaac 1140 gctatcgacg caatcaaagc actgccaatc tgtgaacttg acaagcgtca aggtatgctt 1200 atcgacttac tggtcgagat ggtcaacagc gagacgtgtg atggcgagct aaccgaacta 1260 aatcaggcac ttgagcatca agattggtgg actaccttga agtgtctcac ggctgacgca 1320 gggttcaaga tgctcggtga tggtcacttc tcggctgctt atagtcaccc gctgctacct 1380 aacagagtga ttaaggtggg ctttaagaaa gaggattcag gcgcagccta taccgcattc 1440 tgccgcatgt atcagggtcg tcctggtatc cctaacgtct acgatgtaca gcgccacgct 1500 ggatgctata cggtggtact tgacgcactt aaggattgcg agcgtttcaa caatgatgct 1560 cattataaat acgctgagat tgcaagcgac atcattgatt gcaattcgga tgagcatgat 1620 gagttaactg gatgggatgg tgagtttgtt gaaacttgta aactaatccg caagttcttt 1680 gagggcatcg cctcattcga catgcatagc gggaacatca tgttctcaaa tggagacgta 1740 ccatacatca ccgacccggt atcattctcg cagaagaaag acggtggcgc attcagcatc 1800 gaccctgagg aactcatcaa ggaagtcgag gaagtcgcat gatagctcga g 1851 <210> 3 <211> 87 <212> ADN <213> bacteriófago T4 <400> 3 ggcaaaaagc agtcagaaga aactaaagca aaacgaaaag aagctttgct taataatcca 60 tatggttata atagaaataa accatca 87 <210> 4 <211> 87 75 <212> ADN <213> bacteriófafo T4 <400> 4 tgatagagtc aatgagttaa aacacagtga tgttttgcgt aaagagatgc tttctattca 60 acatgatatt ttaaataaaa cccgtgc 87
<210> 5 <211> 37 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 5 tatggcttct aacttcactc agttcgtact ggttgac 37
<210> 6 <211> 40 <212 > ADN <213> oligonucleótido <400> 6 gccttgtcaa ccagtacgaa ctgagtgaag ttagaagcca 40
<210> 7 <211> 42 <212 > ADN <213> oligonucleótido <4 00 > 7 aacggcggta ccggcgatgt aactgttgca ccgtccaact tc 42
<210> 8 <211> 42 <212 > ADN <213> oligonucleótido <400> 8 42 atttgcgaag ttggacggtg caacagttac atcgccggta cc <210> 9 <211> 36 76 36 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 9 gcaaatggcg ttgctgaatg gatttcttcc aactct
<210> 10 <211> 36 <212 > ADN <213> oligonucleótido <400> 10 gctgcgagag ttggaagaaa tccattcagc aacgcc 36
<210 > 11 <211> 42 <212> ADN <213> oligonucleótido <4 0 0 > 11 42 cgcagccagg cttacaaagt aacttgcagc gttcgccagt cc
<210> 12 <211> 42 <212 > ADN <213> oligonucleótido <4 00 > 12 tgcagaggac tggcgaacgc tgcaagttac tttgtaagcc tg 42
<210> 13 <211> 36 < 212 > ADN <213> oligonucleótido <4 0 0 > 13 36 tctgcacaaa accgaaaata caccatcaag gtagaa
<210 > 14 <211> 36 <212 > ADN 77 36 <213> oligonucleótido <4 0 0 > 14 cgggacttct accttgatgg tgtattttcg gttttg <210> 15 <211> 42 <212> ADN <213> oligonucleótido <4 0 0 > 15 gtcccgaaag ttgcgaccca gactgtaggc ggtgtcgaac tg 42 <210> 16 <211> 42 <212 > ADN <213> oligonucleótido <4 0 0 > 16 aaccggcagt tcgacaccgc ctaccgtctg ggtcgcaact tt <210> 17 <211> 36 <212 > ADN <213> oligonucleótido <400> 17 ccggttgctg catggcgcag ctacctgaac atggaa <210 > 18 <211> 36 <212> ADN <213> oligonucleótido 42 36 <4 0 0 > 18 cgtcagttcc atgttcaggt agctgcgcca tgcagc 36 <210 > 19 <211> 42 <212 > ADN <213> oligonucleótido 78 <400> 19 42 ctgactatcc cgattttcgc aaccaactct gactgtgaac tg
<210> 20 <211> 42 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 20 tacgatcagt tcacagtcag agttggttgc gaaaatcggg at 42
<210 > 21 <211> 33 <212> ADN <213> oligonucleótido <4 0 0 > 21 33 atcgtaaaag ctatgcaggg tctgctaaaa gat
<210> 22 <211> 33 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 22 attgccatct tttagcagac cctgcatagc ttt 33
<210> 23 <211> 51 <212 > ADN <213> oligonucleótido <400> 23 51 ggcaatccaa ttccgtccgc aatcgctgca aactctggta tctactaata g <210> 24 <211> 49 <212 > ADN <213> oligonucleótido 79 <4 Ο Ο > 24 gatcctatta gtagatacca gagtttgcag cgattgcgga cggaattgg <210> 25 <211> 22 <212> ADN <213> oligonucleótído <400> 25 cgcaaatggc attgctgaat gg <210> 26 <211> 22 <212 > ADN <213> oligonucleótído 49 22 <400> 26 ccattcagca atgccatttg cg <210> 27 <211> 24 <212> ADN <213> oligonucleótído 22 <400> 27 ccaactctga ccgtgaactg atcg 24 <210> 28 <211> 24 <212> ADN <213> oligonucleótído <400> 28 cgatcagttc acggtcagag ttgg 24 <210> 29 <211> 42 <212> ADN <213> oligonucleótído <400> 29 80 agctggtgag ctcgatcatt gggcatacgc atgctgcagc gc 42 <210> 30 <211> 43 <212> ADN <213> oligcnucleótido <400> 30 tctaggcgct gcagcatgcg tatgcccaat gatcgagctc acc 43 <210> 31 <211> 33 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 31 ggccaatcgc gaattgacgt cacgttcaga att 33 <210> 32 <211> 33 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 32 ggccaattct gaacgtgacg tcaattcgcg att 33 <210> 33 <211> 35 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 33 atgcatcgag ctcgattagg acatggggcc tcgct 35 <210> 34 <211> 69 <212 > ADN <213> oligonucleótido <400> 34 gcccgcgcga gctcgttgta attctcatgt ttgacagctt atcatcgata agctttaatg 60 81 cggtagttt 69 <210> 35 <211> 66 <212> ADN <213 > oligonucleótido <400> 35 gggaattcca tatgcggtgc ctgactgcgt tagcaattta actgtgataa actaccgcat 60 taaagc 66 <210> 36 <211> 42 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 36 gattcccccg ggcaaataaa acgaaaggct cagtcgaaag ac 42 <210> 37 <211> 44 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 37 ctgatcgcga cgtcttgtag aaacgcaaaa aggccatccg tcag 44 <210> 38 <211> 63 <212 > ADN <213> oligonucleótido <400> 38 gctctagaaa catgaggatt acccatgaac acgattaaca tcgctaagaa cgacttctct 60 gac 63 <210> 39 <211> 36 <212> ADN <213> oligonucleótido 82 <400> 39 36 cgggatccgt cattacgcga acgcgaagtc cgactc
<210> 40 <211> 71 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 40 gcgcgctcta gaaaacatga ggattaccca tgaataccat caatatcgct aagaacgact 60 tctctgacat c 71
<210> 41 <211> 33 <212 > ADN <213> oligonucleótido <400> 41 33 ggcccagtgc atgcctacgt gggtcctagt cgc
<210> 42 <211> 33 <212 > ADN <213> oligonucleótido <400> 42 gatcgcgact aggacccacg taggcatgca ctg 33
<210> 43 <211> 18 <212 > ADN <213> oligonucleótido <400> 43 18 ctgaatacgc tgaggcta <210> 44 <211> 18 <212 > ADN <213> oligonucleótido 83 <400> 44 18 48 48 tcagccagta gtaacctt
<210> 45 <211> 48 <212> ADN <213? oligonucleótido <400> 45 gcgcgcgaat tctttcgatc tactaccaac gtgcaatacg gtctgacc
<210> 46 <211> 48 <212 > ADN <213> oligonucleótido <400> 46 gcgcgcgaat tctttcgaat gaagcactac gttatgccaa tccacacg
<210> 47 <211> 61 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 47 ctagagcaaa catgaggatt acccatgaaa catcaccatc accatcacca taccggtggc 60 9 61
<210> 48 <211> 61 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 48 aattcgccac cggtatggtg atggtgatgg tgatgtttca tgggtaatcc tcatgtttgc 60 t 61
<210> 49 <211> 62 <212 > ADN <213> oligonucleótido 84 <400> 49 gcgcgctcta gaaaacatga ggattaccca tgtctactac caacgtgcaa tacggtctga 60 cc 62 <210> 50 <211> 36 <212> ADN <213> oligonucleõtido <400> 50 gcgcgcggat ccgagtctat cactcagcag attcta 36 <210> 51 <211> 42 <212 > ADN <213> olígonucleótido <400> 51 gcgcgcggat ccctattatg agatagcgtt cagtgtgttg gc 42 <210> 52 <211> 69 <212 > ADN <213> olígonucleótido <400> 52 gcgcgcctca gaaaacatga ggattaccca tgaacattac cgacatcatg aacgctatcg 60 acgcaatca 69 <210> 53 <211> 36 <212 > ADN <213> olígonucleótido <400> 53 gcgcgcggat ccctatcagc ccattaacat tgcgtc 36
<210> 54 <211> 36 <212> ADN 85 213> oligonucleõtido <400> 54 gcgcgcggat ccctatcatg cgacttcctc gacttc 36
<210> 55 <211> 68 <212 > ADN <213> oligonucleótido <400> 55 gcgcgctcta gaaaacatga ggattaccca tggctatgtc taatctcaca tataacaacg 60 ttttcgac 68
<210> 56 <211> 60 <212 > ADN <213> oligonucleótido <400> 56 cacgttggta gtagacatgg gtaatcctca tgtttttact cttcatcctc ctcgtactcc 60
<210> 57 <211> 58 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 57 gtcggtaatg ttcatgggta atcctcatgt ttttatgaga tagcgttcag tgtgttgg sg
<210> 58 <211> 56 <212 > ADN <213> oligonucleótido <400> 58 agcatataca tgggtaatcc tcatgtttga gtctatcact cagcagattc taaagc 56
<210> 59 <211> 45 <212> ADN 86 45 <213> oligonucleótido <400> 59 ctgctgagtg atagactcaa acatgaggat tacccatgta tatgc
<210> 60 <211> 63 <212 > ADN <213> oligonucleótido <400> 60 cataacgtaa tgccgcatgg gtaatcctca tgttttcatc atttgcgtag tgcccctttg 60 atg 63
<210> 61 <211> 63 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 61 catcaaaggg gcactacgca aatgatgaaa acatgaggat tacccatgcg gcattacgtt 60 atg 63
<210> 62 <211> 48 <212 > ADN <213> oligonucleótido <4 00 > 62 gaacgctatc tcataacgaa acatgaggat tacccatgaa cattaccg 43
<210> 63 <211> 25 <212 > ADN <213> oligonucleótido <400> 63 25 gcgcggatcc ctatcatgcg acttc <210> 64 <211> 66 87
<212> ADN <213> oligonucleótido <400> 64 gcgcgcgacg tcggcaaaaa gcagtcagaa gaaactaaag cagcaaaacg aaaagaagct 60 ttgctt 66
<210> 65 <211> 63 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 65 gcgcgcatcg attgatggtt tatttctatt ataaccatat ggattattaa gcaaagcttc 60 ttt 63
<210> 66 <211> 60 <212 > ADN <213> oligonucleótido <400> 66 gcgcgcgacg tctgatagag tcaatgagtt aaaacacagt gatgttttgc gtaaagagat 60
<210> 67 <211> 63 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 67 gcgcgcatcg atgcacgggt tttatttaaa atatcatgtt gaatagaaag catctcttta 60 cgc 63
<210> 68 <211> 63 <212 > ADN <213> oligonucleótido <400> 68 gcgcgcgacg tcggcaaaaa gcagtcagaa gaaactaaag caaaacgaaa agaagctttg 60 ctt 63 88 <210> 69 <211> 63
<212> ADN <213> oligonucleôtido <400> 69 gcgcgcatcg attgatggtt tatttctatt ataacgatat agattattaa gcaaagcttc 60 ttt 63
<210> 70 <211> 63 <212> ADN <213> oligonucleôtido <400> 70 gcgcgctcta gaaaacatga ggattaccca tgtctaaagt aacttacatc atcaaagctt 60 cta 63
<210> 71 <211> 32 <212 > ADN <213> oligonucleôtido <400> 71 32 28 tgtatcaatg tttttattca tgggtgatcc tc
<210> 72 <211> 28 <212 > ADN <213> oligonucleôtido <400> 72 atgaataaaa acattgatac agttcgtg
<210> 73 <211> 48 <212 > ADN <213 > oligonucleôtido <400> 73 89 48 21 gcgcgcctcg agctattatt tgttcgtata catctccagg tatcgata
<210> 74 <211> 21 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 74 ggatggcctt tttgcgtttc t
<210> 75 <211> 48 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 75 gcgcgcagat ctgaagatct tattaatcag ataaaatatt tctaggcg 48
<210> 76 <211> 63 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 76 gcgcgcctcg agaaacatga ggattaccca tgtctaaagt aacttacatc atcaaagctt 60 cta 63
<210> 77 <211> 48 <212> ADN <213> oligonucleótido <4 00 > 77 48 gcgcgcggat ccctattatt tgttcgtata catctccagg tatcgata
<210> 78 <211> 65 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 78 90 gcgcgctcta gaaaacatga ggattaccca tgatgaagca ctacgttatg ccaatccaca 60 65 33 50 42 39 cgtcc
<210> 79 <211> 33 <212 > ADN <213> oligonucleótido <400> 79 gcgcgcctcg agctattatg agatagcgtt cag
<210> 80 <211> 50 <212 > ADN <213> oligcnucleótido <400> 80 gcgcgcgcat gcagatctgt atgcccaatg atcgagctgt tgtaattctc
<210> 81 <211> 42 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 81 gcgcgcctcg agccgcggct attagtagat accagagttt gc
<210> 82 <211> 39 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 82 caacacccag cggccgctgc gtatcaatga tcgagctgt
<210> 83 <221> 38 <212 > ADN <213> oligonucleótido <400> 83 91 38 24 aagcttactc gaggatccct attagtagat accagagt
<210> 84 <211> 24 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 84 gctgccgctg ttagtcttcg ttcc
<210> 85 <211> 31 <212 > ADN <213> oligonucleótido <400> 85 ctaccgcatt atagcttatc gatgataagc t 31
<210> 86 <211> 33 <212 > ADN <213> oligonucleótido <400> 86 cgataagcta taatgcggta gtttacagtt aaa 33
<210> 87 <211> 58 <212 > ADN <213> oligonucleótido <400> 87 ttattcctcc ttgcgttagc aatttaactg tgataaacta ccgcattata gcttatcg 58
<210> 88 <211> 79 <212 > ADN <213> oligonucleótido <400> 88 cgataagcta taatgcggta gtttatcaca gttaaattgc taacgcaagg aataacatat 60 92 79 ggcttctaac ttcactcag
<210> 89 <211> 39 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 89 ccaccaccgg gtaccgtcgt tttacaacgt cgtgactgg 39
<210> 90 <211> 38 <212 > ADN <213> oligonucleótido <400> 90 ccaccacacg gatccttatt tttgacacca gaccaact 38
<210> 91 <211> 88 <212 > ADN <213> oligonucleótido <400> 91 ccaccacacg gatccttatt tttgacacca gacagttaaa ttgctaacgc aagagagagg 60 gcaccgcata tgcttctaac ttcactca 88
<210> 92 <211> 50 <212 > ADN <213> oligonucleótido <400> 92 50 gttcgtactg gttgacaacg gcggtaccca cagtgactat atgggtggca
<210> 93 <211> 30 <212> ADN <213> oligonucleótido <400> 93 93 atcgatgata agctgtcaat aatgagaatt 30 <210> 94 <211> 30 <212> ADN <213> oligonucleótido <4 0 0 > 94 gttagcaatt taactgtgat aaactaccgc 30 <210 > 95 <211> 30 <212 > ADN <213> oligonucleótido <4 00 > 95 tcaaccagta cgaactgagt gaagttagaa 30 <210 > 96 <211> 40 <212 > ADN <213> oligonucleótido <400> 96 cagcttatca tcgataagct ataatgcggt agttaatcac 40 <210 > 97 <211> 21 <212 > ADN <213> oligonucleótido <400> 97 tgacacacgg tcaatggttg g <210 > 98 <211> 23 < 212 > ADN <213 > oligonucleótido 21 <4 0 0 > 98 tgccacccat atagtcactg tgg 23
Lisboa, 8 de Janeiro de 2007 94

Claims (16)

  1. REINVINDICAÇÕES 1. Sistema de repressão de tradução, caracterizado por ser utilizado na clonagem ou na expressão de um gene heterólogo específico, compreendendo o referido sistema uma proteína do repressora de tradução codificando uma região ligada funcionalmente a um promotor constitutivo e o referido gene heterólogo ligado funcionalmente a um promotor indutível e a um sítio de reconhecimento do repressor e em que o repressor de tradução controla a expressão do referido gene heterólogo e em que o sítio de ligação da proteína repressora inclui a sequência de ligação do ribossoma e o codão de iniciação mas não cobre outras regiões de codificação do gene heterólogo.
  2. 2. Sistema de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de que o referido repressor de tradução ser a proteína de revestimento MS2 do bacteriófago (PRMS2).
  3. 3. Processo para a clonagem ou a expressão de um gene heterólogo, caracterizado pelo facto de compreender: a cultura, em condições apropriadas, de células hospedeiras transformadas com um vector de plasmido, compreendendo um sistema de acordo com a reivindicação 1, compreendendo o referido vector uma sequência de ADN, que codifica um promotor indutível, uma sequência de ADN que codifica o referido gene heterólogo ligado a um sítio de reconhecimento do repressor de tradução e com o referido promotor indutível e uma sequência de ADN que codifica um repressor de tradução ligado operacionalmente a um promotor constitutivo, em que 1 o referido repressor de tradução controla a expressão do referido gene heterólogo, ou a cultura, em condições apropriadas, de células hospedeiras que tinham sido co-transformadas com um primeiro vector de plasmido, compreendendo um sistema de acordo com a reivindicação 1, compreendendo o referido vector uma sequência de ADN que codifica um promotor indutível e o referido gene heterólogo ligado a um sítio de reconhecimento do repressor de tradução e com o referido promotor indutível e um segundo vector de plasmido compreendendo uma sequência de ADN que codifica um repressor de tradução ligado operacionalmente a um promotor constitutivo; em que o referido repressor de tradução controla a expressão do referido gene heterólogo, ou a cultura, em condições apropriadas, de células hospedeiras compreendendo um sistema de acordo com a reivindicação 1, comportando as referidas células uma sequência de ADN que codifica um repressor de tradução ligado operacionalmente a um promotor constitutivo, transformado com um vector de plasmido, compreendendo o referido vector uma sequência de ADN que codifica um promotor indutível e uma sequência de ADN que codifica o referido gene heterólogo ligado a um sítio de reconhecimento do repressor de tradução e com o referido promotor indutível; em que o referido repressor de tradução controla a expressão do referido gene heterólogo, ou 2 a cultura, em condições apropriadas, de células hospedeiras compreendendo um sistema de acordo com a reivindicação 1, em que as referidas células comportam uma sequência de ADN que codifica um promotor indutível, uma sequência de ADN que codifica os referidos genes heterólogos ligados a um sítio de reconhecimento do repressor de tradução e com o referido promotor indutível e uma sequência de ADN codificando um repressor translacional ligado operacionalmente a um promotor constitutivo; em que o referido repressor translacional controla a expressão do referido gene heterólogo.
  4. 4. Processo, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo facto de o referido repressor de tradução ser a proteína de revestimento de bacteriófago MS2.
  5. 5. Processo, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo facto de o referido vector compreender ainda a SEQ ID N°. 2.
  6. 6. Sistema, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o referido sistema ser uma "cassete do gene 1 de T7 controlada por MS2", em que a referida cassete compreende uma sequência de ADN que codifica o gene 1 de T7, um promotor indutível, um sítio de reconhecimento de MS2 e o gene de proteína de revestimento MS2 sob o controlo de um promotor constitutivo, estando o referido gene 1 de T7 ligado ao referido promotor indutível e ao referido sítio de reconhecimento de MS2.
  7. 7. Célula hospedeira, caracterizada pelo facto de ser capaz de expressar um gene heterólogo e ter uma "cassete do 3 gene 1 de T7 controlada por MS2", de acordo com a reivindicação 6, inserida no seu cromossoma.
  8. 8. Processo, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo facto de se destinar a expressar um gene heterólogo, compreendendo o referido processo: a cultura, em condições apropriadas, de células hospedeiras comportando uma "cassete do gene 1 de T7 controlada por MS2", de acordo com a reivindicação 7, inserida no seu cromossoma e transformada com um vector de plasmido contendo uma sequência de ADN que codifica o referido gene heterólogo sob o controlo de um promotor de T7.
  9. 9. Processo, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo facto de o referido gene heterólogo ser um gene precoce de T7.
  10. 10. Processo de acordo com a reivindicação 3, para a clonagem ou a expressão de um gene heterólogo, caracterizado pelo facto de compreender: a cultura, sob condições apropriadas, de células hospedeiras que tinham sido co-transformadas com um primeiro vector de plasmido, compreendendo um sistema de acordo com a reivindicação 1, compreendendo o referido vector uma sequência de ADN, que codifica o referido gene heterólogo sob o controlo do promotor médio de T4 e um segundo vector de plasmido compreendendo uma sequência de ADN, que codifica um promotor indutível, sequências do gene de motA e asiA, cada uma delas ligadas a um sítio de reconhecimento do repressor de tradução e 4 ao referido promotor indutível e um repressor de tradução ligado operacionalmente a um promotor constitutivo; em que o referido repressor de tradução controla a expressão dos referidos genes de motA e asiA e em que os referidos genes motA e asiA dirigem a transcrição do promotor médio de T4 ao mesmo tempo que inibem a transcrição a partir do referido promotor indutível.
  11. 11. Processo, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo facto de o referido segundo vector de plasmido compreender ainda uma sequência de ADN que codifica uma proteína acessória.
  12. 12. Processo, de acordo com a reivindicação 3, para a clonagem ou a expressão de um gene heterólogo, caracterizado pelo facto do referido processo compreender: a cultura, em condições apropriadas, de células hospedeiras compreendendo um sistema de acordo com a reivindicação 1, em que as referidas células comportam uma sequência de ADN que codifica um promotor indutível, sequências dos genes motA e asiA cada uma delas ligada a um sítio de reconhecimento do repressor de tradução e ao referido promotor indutível e um repressor de tradução ligado operacionalmente a um promotor constitutivo, transformado com um vector de plasmido compreendendo uma sequência de ADN que codifica o referido gene heterólogo ligado sob o controlo do promotor médio de T4; em que o referido repressor de tradução controla a expressão dos referidos genes de motA e asiA e em que os 5 referidos genes motA e asiA dirigem a transcrição do promotor médio de T4 ao mesmo tempo que inibem a transcrição do referido promotor indutível.
  13. 13. Processo, de acordo com uma qualquer das reivindicações 10-12, caracterizado pelo facto de o referido repressor de tradução ser uma proteína do revestimento de MS2 de bacteriófago.
  14. 14. Sistema, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de ser uma "cassete de T4 à base de MS2", compreendendo a referida cassete uma sequência de ADN que codifica um promotor indutível, sequências dos genes de motA e asiA, cada uma elas ligada a uma sequência de reconhecimento de MS2 e ao referido promotor indutível e o gene da proteína de revestimento MS2 sob o controlo de um promotor constitutivo.
  15. 15. Célula hospedeira procariótica, caracterizada pelo facto de ser capaz de expressar um gene heterólogo e comportar uma "cassete de T4 à base de MS2", de acordo com a reivindicação 14, inserida no seu cromossoma.
  16. 16. Processo, de acordo com a reivindicação 3, para a clonagem ou a expressão de um gene heterólogo, caracterizado pelo facto de o processo compreender: a cultura, em condições apropriadas, de células hospedeiras comportando uma "cassete à base de MS2", de acordo com a reivindicação 6 ou 14, inserida no seu cromossoma e transformada com um vector de expressão contendo uma sequência de ADN, que codifica o referido gene heterólogo sob o controlo de um promotor de T4. Lisboa, 8 de Janeiro de 2007 6
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