DE69933990T2

DE69933990T2 - Hocheffiziente und kontrollierte expression von exogenen genen in e. coli

Info

Publication number: DE69933990T2
Application number: DE69933990T
Authority: DE
Inventors: C. William Woodland Hills BROWN
Original assignee: Amgen Inc
Current assignee: Amgen Inc
Priority date: 1998-01-28
Filing date: 1999-01-27
Publication date: 2007-09-20
Anticipated expiration: 2019-01-28
Also published as: PT1051502E; AU2564299A; HK1030965A1; WO1999038985A3; AU731049B2; EP1051502B1; CA2318813A1; WO1999038985A2; US6180391B1; EP1051502A2; CA2318813C; DE69933990D1; ATE345391T1; JP4346819B2; JP2002501752A; DK1051502T3; ES2275335T3

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft neue und verbesserte Expressionsvektorsysteme, die in der Lage sind, exogene Gene, einschließlich toxischer Gene, in E.coli und anderen Wirtszellen zu exprimieren. Genauer betrifft die Erfindung hocheffiziente, stark regulierte Expressionsvektorsysteme, die das Bakteriophagen MS2-Hüllprotein (MS2CP) und die MS2-Erkennungsstelle verwenden, um die Translation der mRNA für jegliches klonierte Gen in einer Wirtszelle zu kontrollieren. Zusätzlich betrifft die Erfindung Expressionsvektorsysteme, die Transkriptionskontrollproteine, z.B. motA und asiA von dem Bakteriophagen T4 verwenden, um die Transkription zu regulieren und ein abgestuftes induzierbares Promotersystem bereitzustellen, das viel weniger kompliziert und viel vielseitiger als die zuvor beschriebenen nicht-abgestuften Systeme ist.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Prokaryotische Zellen sind das System der Wahl zur Expression von klonierten Genen geworden, die für eukaryotische und prokaryotische Polypeptide kodieren, und es existieren zahlreiche Expressionssysteme zur Expression von Genprodukten in Bakterien. Die Expression von Genen in E.coli ist als eine Schlüsseltechnik beim Verständnis von molekularen Prozessen etabliert worden, und E.coli-Expressionssysteme sind ein Standard und ein populäres Verfahren zur Herstellung und Aufreinigung auf großem Maßstab von exogenen Proteinen geworden. Wichtigerweise hat die Technologie eine Quelle von Proteinen in einer Menge und Qualität zur Verfügung gestellt, die zuvor durch Isolierung aus natürlichen Quellen schwierig oder unmöglich zu erreichen war.
Eine Anzahl von patentierten Expressionssystemen zur Verwendung in bakteriellen Wirten ist beschrieben worden. In einigen Fällen beziehen sich die beschriebenen Expressionssystem auf verallgemeinerte Expressionssysteme, während in anderen Fällen das patentierte Expressionssystem so angelegt ist, daß es eine relativ starke Regulierung ermöglicht, oder es ist für die Expression eines bestimmten Proteins individuell maßgeschneidert. Beispiele für solche Patente schließen US-Patent Nr. 4,767,708 (Konstruktion eines rekombinanten Vektors, enthaltend eine klonierte bakterielle DNA-Polymerase I unter der Kontrolle eines positiv regulierten Fremdpromoters), US-Patent Nr. 4,503,142 (Konstruktion einer Klasse von Klonier- und Expressionsvektoren, basierend auf der Verwendung des Lackpromoter/Operator von E. coli), und US-Patent Nr. 4,578,355 (Verwendung des P_L-Promoter des Bakteriophagen Lambda für die Konstruktion von Hochniveau-Expressionsvektoren) ein.
Ein anderes weithin verwendetes Expressionssystem, das als das pET-Vektorexpressionssystem bezeichnet wird, verwendet die starke T7-RNA-Polymerase, um Gene von Interesse zu transkribieren; Studier et al., J. Mol. Biol., 189:113-130 (1986). T7-RNA-Polymerase ist für seine eigenen Promotern stark selektiv, und es sind bekanntermaßen keine T7-Promoteren in der DNA von E.coli vorhanden. T7 verwendet seine hochselektive Polymerase, um die Transkription auf seine eigene DNA statt auf die Wirts-DNA während einer Infektion zu steuern, und eine relativ kleine Menge an T7-RNA-Polymerase, die aus einer klonierten Kopie eines T7-Gens 1 bereitgestellt wird, ist ausreichend, um eine Transkription auf hohem Niveau von einem T7-Promoter in einem Multikopie-Plasmid zu steuern. Darüber hinaus ist die T7-RNA-Polymerase wenigsten 5-mal aktiver als E.coli-Polymerasen; ebenda. Viele heterologe Proteine sind in hohen Ausbeuten unter Verwendung des pET-Systems erfolgreich exprimiert worden; siehe z.B. Dietrich et al., Eur. J. Biochem., 201:399-407 (1991); Lathrop et al., Protein Expr. Purif., 3:512-517 (1992); Aukhil et al., J. Biol. Chem., 268: 2542-2553 (1993).
Leider leiden diese und andere Expressionssysteme, über die berichtet worden ist, zu einem größeren oder geringeren Ausmaß immer noch an solchen Dingen wie: 1) nicht-induzierte Expression, die aus einer Undichtigkeit („leakiness") des Promoters resultiert; 2) die Unfähigkeit, die Expression in dem notwendigen Ausmaß zu kontrollieren, wenn das Genprodukt, sofern exprimiert, die Wirtszelle töten oder anderweitig ernsthaft schädigen wird (typischerweise assoziiert mit der Expression von eukaryotischen Genen bei Bakterien); 3) die Notwendigkeit, für die Induktion der Expression von entweder den biochemischen Antworten des Wirts oder teuren oder anderweitig inadäquaten Induktionsmechanismen abhängig zu sein; 4) die Unfähigkeit, das Gen von Interesse in ausreichenden Niveaus zu exprimieren; und 5) Plasmid-Instabilität. Bis solche Probleme adäquat adressiert und erfolgreich überwunden worden sind, wird das volle Potential von solchen Expressionssystemen nicht in vollem Umfang geschätzt oder verwendet werden.
Alle bekannten induzierbaren Promotersysteme haben ein Restniveau an Aktivität oder "Undichtigkeit" („leakiness"), die zu der unangemessenen Transkription und Expression des Gens führt, das unter der Kontrolle des Promoters kloniert wird. In den meisten Fällen ist dies kein Problem, da das Genprodukt, das produziert wird, durch die Zelle gut toleriert wird, d.h. das Genprodukt ist nicht-toxisch. Jedoch können in Fällen, wo das Genprodukt, das produziert wird, toxisch oder sogar für die Zelle lethal ist, sogar diese geringen Mengen an Expression nachteilig sein. In der Tat gibt es bestimmte toxische Gene, die als „nicht-klonierbar" charakterisiert worden sind, da sie in jedem Klonierungsvektor instabil sind.
Studier, F.W., J. Mol. Biol., 219:37-44 (1991) behandelte das Problem einer undichten Expression („leaky expression") in den pET-Vektoren durch Entwicklung der Lys-Vektorreihe. Diese Vektoren beinhalten das Gen für T7-Lysozym, das die T7-RNA-Polymerase bindet, die in der nicht-induzierten Zelle vorhanden ist, und verhindert, daß sie die Zielgene transkribiert. Dubendorff und Studier, J. Mol. Biol., 219:45-59 (1991) behandelten das Problem, indem sie zusätzliche Kopien an lac-Operon-Kontrollelementen in den pET-Plasmiden bereitstellten. Brown et al., Gene, 127:99-103 (1993) verwendeten eine Induktion mittels Infektion mit einem mutanten T7-Phagen, um das toxische POL3-Gen erfolgreich zu klonieren. Leider vermögen es diese und andere Systeme, über die berichtet worden ist, nicht, das Undichtigkeitsproblem vollständig zu beheben, oder leiden an den Problemen der Plasmid-Instabilität und Zelllyse, die mit hohen Niveaus an Lysozym und/oder Phageninfektion assoziiert ist. Peabody D.S. J. Biol. Chemistry, Band 265, Nr. 10, 1990, S. 5684-9 offenbart CSH7-Bakterienzellen, die mit 2 konstitutiven Promotern transformiert worden sind.
Die vorliegende Erfindung, wie beansprucht, behandelt und überwindet das Problem der Promoter-Undichtigkeit, indem sie von den Translationsrepressionsfähigkeiten des Bakteriophagen-MS2-Hüllproteins Gebrauch macht. Bakteriophage MS2 ist ein RNA-enthaltender Phage mit einem ziemlich einfachen Lebenszyklus; Van Duin, J., Single-Stranded RNA Bacteriophages in The Bacteriophages, Kapitel 4, S. 117-167, Plenum Press, New York (1988). Die RNA kodiert für vier Gene, von denen eins ein Replikasegen ist, das das Genom kopiert, von denen ein anderes das multifunktionale Hüllproteingen ist. Wenn die Konzentration des Hüllproteins in der Zelle wächst, bildet es ein Dimer und bindet an eine Haarnadelstruktur, bestehend aus der Ribosomenbindungsstelle und ATG des Replikasegens. Diese Bindung inhibiert dann eine weitere Translation von dem Replikasegen und verschiebt effektiv den Lebenszyklus zu der Verpackung des Genoms.
Die Sequenz des MS2-Hüllproteins ist veröffentlicht worden; Fiers et al., Nature, 260:500-507 (1976), Mutanten des Hüllproteins sind isoliert und charakterisiert worden; Peabody & Ely, Nucleic Acids Research, 20 (7):1649-1655 (1992), und die Konstruktion eines 2-Plasmidsystems zur genetischen Analyse der Translationsrepressoraktivität des Hüllproteins ist beschrieben worden; Peabody, D., Journ. of Biol. Chem., 265 (10):5684-5689 (1990).
Der Bakteriophage MS2 ist nicht der einzige Phage, von dem bekannt ist, daß er Proteine hat, die Messenger-RNA binden und die Translation inhibieren. Zum Beispiel sind das RegA-Protein des Bakteriophagen T4 und das Gen-V-Protein von M13 zwei andere solche Proteine. Jedoch bezieht sich ein wesentlicher Unterschied zwischen dem RegA-Protein, dem Gen-V-Protein und dem MS2-Hüllprotein auf die Position ihrer Erkennungsstellen relativ zu der Anfangsstelle des Gens. Zum Beispiel umfaßt die Erkennungsstelle des RegA-Proteins Sequenzen in der kodierenden Region des Gens, wodurch die Gene, die dadurch kontrolliert werden können, beschränkt sind. Das Gen-V-Protein erkennt eine Sequenz stromauf von der Ribosomenbindungssequenz und kann daher immer noch ein niedriges Niveau an Translationsinitiation ermöglichen. Für MS2 deckt die Bindungsstelle keine kodierenden Regionen des Gens ab, sondern schließt die Ribosomenbindungssequenz und das Initionskodon ein. Das MS2-System ermöglicht daher die stärkste mögliche Repression, während es gleichzeitig ermöglicht, daß die Stelle universal genützt wird.
Die spezifische Verwendung der MS2CP- und MS2-Erkennungsstelle wird in größeren Einzelheiten in den hierin bereitgestellten Beispielen beschrieben werden. Wie anhand dieser Beispiele gezeigt, ermöglicht es diese einzigartige Verwendung des MS2-Systems dem Fachmann, das Problem der Promoter-Undichtigkeit, die normalerweise mit der Expression von heterologen Genen in Bakterien assoziiert ist, effektiv zu lösen. Von einem kommerziellen Herstellungsstandpunkt ist dies besonders nützlich, da es im allgemeinen nicht vorteilhaft ist, wenn Produkt vor dem Induktionspunkt austritt. Und was die Fähigkeit angeht, toxische Gene effektiv zu exprimieren, kann dies von großem Wert für diejenigen sein, die in dem Gebiet arbeiten, da einige dieser Gene, sofern in beschränkten Mengen exprimiert, vorteilhafte Verwendungen haben können.
Ein weiterer wichtiger Aspekt des Designs eines bakteriellen Expressionssystems ist die Regulierung der Transkription. Es ist bekannt, daß für viele Organismen der zeitliche Ablauf der Genexpression durch die Produktion von spezifischen Transkriptionskontrollproteinen reguliert ist. Dies ist insbesondere zutreffend für eine Anzahl von verschiedenen Bakteriophagen, da der Fortschritt durch ihren Lebenszyklus durch das Auftreten von verschiedenen Transkriptionsproteinen reguliert ist, die zu der Expression von gesamten Klassen von Genen führen, die dem Stadion ihrer Entwicklung entsprechen. Zum Beispiel ist es für eine lange Zeit bekannt gewesen, daß Bakteriophage T4 durch seinen Lebenszyklus auf diese Weise fortschreitet, und die tatsächlichen Mechanismen sind vor kurzem aufgeklärt worden; Brody et al., FEMS Micro. Letters, 128:1-8 (1995). Dieser lytische Phage hat drei Genklassen: early; middle; und late. Die early-Gen-Promoter sind den starken E.coli-Promotern sehr ähnlich und werden unmittelbar nach Infektion durch die RNA-Polymerase des Wirts erkannt. Die Akkumulation von zwei early-Genprodukten, motA und asiA, verschiebt die Transkription auf den middle-Modus.
Das motA-Protein ist ein 23,5 kDa-Protein, das die RNA-Polymerase auf die T4-middle-Promoter führt, indem es eine Sequenz an der -30-Region der Promoter erkennt. Das asiA-Protein ist ein 10,5 kDa-Protein, von dem ursprünglich gedacht wurde, daß es ein anti-sigma-Faktor-Protein ist, d.h., daß es an sigma-70 von E.coli bindet und es nicht-funktionierend macht. Es wird nunmehr jedoch gedacht, daß die Bindung von asiA an sigma 70 tatsächlich eine Konformationsveränderung bewirkt, die die Erkennung der -35-Region der E.coli-Promoter zunichte macht, und das asiA-Protein kann als eine Brücke zwischen dem motA-Protein und der sigma-70-Untereinheit fungieren. Darüberhinaus inhibiert asiA-Protein ebenfalls die Erkennung der T4-early-Promoter. motA und asiA sind notwendig und ausreichend, um die Transkription von T4-middle-Promoter zu spezifizieren.
Diese Details sind mittels in-vitro-Transkriptionsassays unter Verwendung von aufgereinigtem motA und asiA und nicht-modifizierter E.coli RNA-Polymerase bestimmt worden; Ouhammouch et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:1451-1455 (1995).
Die vorliegende Erfindung stellt eine neuartige und neue Verwendung der T4-middle-Promoter bereit, um die Transkription von einem beliebigen Gen in einer prokaryotischen Wirtszelle zu regulieren. Die Hauptvorteile dieses Promoter-Systems sind, daß es die Transkription von spezifischen Promotern steuert, während es die Transkription von E.coli- Promotern inhibiert, was daher den Wettbewerb um den Translationsapparat minimiert und die Zelle daran hindert, auf die Produktion des Zielproteins zu antworten, indem sie die Transkription von Protease-Genen induziert. Unter Verwendung des T4-middle-Promoter-Systems, das hierin beschrieben ist, ist es auch möglich, bestimmte akzessorische Proteine vor der Zielproteininduktion in einem "abgestuften" Expressionszyklus zu exprimieren, der durch ein einzelnes Signal induziert werden kann, wodurch die komplizierte Natur der gegenwärtigen Expressionsprotokolle verringert wird, die im allgemeinen vielfache Induktionsereignisse benötigen, um eine solche Expression zu erzielen. Die spezifischen Eigenschaften des T4-middle-Promoter-Systems werden in den hierin dargebotenen Beispielen beschrieben.
Durch die Verwendung des MS2-Systems, die Translation in starker Weise zu regulieren und durch die Verwendung von T4-middle-Promoter, um die Transkription zu regulieren, liefert die vorliegende Erfindung hocheffiziente, stark regulierte Expressionsvektorsystems, die in der Lage sind, exogene Gene, einschließlich toxischer Gene, in E.coli und anderen Wirtszellen zu exprimieren. Die hierin beschriebenen Systeme bieten zusätzlich zur Behandlung der mit anderen bekannten Systemen assoziierten Probleme zum ersten Mal abgestufte Promotersysteme, die viel vielseitiger sind, als die zuvor beschriebenen Systeme. Diese System werden von hohem Wert für diejenigen sein, die auf dem Gebiet der Konstruktion von bakteriellen Expressionssystemen arbeiten.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegenden Erfindung, wie beansprucht, bietet ein Translationsrepressionssystem zur Verwendung beim Klonieren oder Exprimieren eines heterologen Gens in Wirtszellen, wobei das System einen Translationsrepressor umfaßt, der operabel mit einem konstitutiven Promoter verknüpft ist. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Translationsrepressor MS2 Hüllprotein.
Die Erfindung bietet darüber hinaus ein verbessertes Verfahren, wie beansprucht, zum Klonieren oder Exprimieren eines heterologen Gens, wobei das Verfahren umfaßt: Kultivieren unter geeigneten Bedingungen von Wirtszellen, die mit einem Plasmidvektor transformiert worden sind, wobei der Vektor eine DNA-Sequenz umfaßt, die für einen induzierbaren Promoter kodiert, eine DNA-Sequenz, die für das heterologe Gen kodiert, das mit einer Translationsrepressorerkennungsstelle verknüpft ist, und eine DNA-Sequenz, die für einen Translati onsrepressor kodiert, der mit einem konstitutiven Promoter operabel verknüpft ist, wobei der Translationsrepressor die Expression des heterologen Gens kontrolliert. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Translationsrepressor MS2-Hüllprotein. In einer Ausführungsform umfaßt der Vektor weiterhin eine DNA-Sequenz, die für 0,3-0,7 early-Gene des Bakteriophagen T7 kodiert (SEQ ID NO:2).
Die Erfindung stellt weiterhin ein verbessertes Verfahren, wie beansprucht, zum Klonieren oder Exprimieren eines heterologen Gens bereit, wobei das Verfahren umfaßt: Kultivieren unter geeigneten Bedingungen von Wirtszellen, die mit einem ersten Plasmidvektor, umfassend eine DNA-Sequenz, die für einen induzierbaren Promoter und das heterologe Gen, das mit einer Transkriptionsrepressorerkennungsstelle verknüpft ist, kodiert, und einem zweiten Plasmidvektor cotransformiert worden sind, umfassend eine DNA-Sequenz, die für einen Translationsrepressor kodiert, der operabel mit einem konstitutiven Promoter verknüpft ist, wobei der Translationsrepressor die Expression des heterologen Gens kontrolliert. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Translationsrepressor MS2-Hüllprotein.
Die Erfindung bietet darüber hinaus ein verbessertes Verfahren, wie beansprucht, zum Klonieren oder Exprimieren eines heterologen Gens, wobei das Verfahren umfaßt: Kultivieren unter geeigneten Bedingungen von Wirtszellen, die eine DNA-Sequenz beinhalten, die für einen Translationsrepressor kodiert, der operabel mit einem konstruktiven Promoter verknüpft ist, transformiert mit einem Plasmidvektor, wobei der Vektor eine DNA-Sequenz umfaßt, die für einen induzierbaren Promoter kodiert, und eine DNA-Sequenz, die für das heterologe Gen kodiert, das mit einer Translationsrepressorerkennungsstelle verknüpft ist, wobei der Translationsrepressor die Expression des heterologen Gens steuert. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Translationsrepressor MS2-Hüllprotein.
Die Erfindung bietet darüber hinaus ein verbessertes Verfahren, wie beansprucht, zum Klonieren oder Exprimieren eines heterologen Gens, wobei das Verfahren umfaßt: Kultivieren unter geeigneten Bedingungen von Wirtszellen, die eine DNA-Sequenz beinhalten, die für einen induzierbaren Promoter kodiert, eine DNA-Sequenz, die für das heterologe Gen kodiert, das mit einer Translationsrepressorerkennungsstelle verknüpft ist, und eine DNA-Sequenz, die für einen Translationsrepressor kodiert, der mit einem konstitutiven Promoter operabel verknüpft ist, wobei der Translationsrepressor die Expression des heterologen Gens steuert. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Translationsrepressor MS2-Hüllprotein.
Die Erfindung bietet darüber hinaus eine "MS2-gesteuerte T7-Gen-1-Kassette", wie beansprucht, wobei die Kassette eine DNA-Sequenz, die für einen induzierbaren Promoter kodiert, die MS2-Erkennungsstelle, verknüpft mit dem T7-Gen-1, und das MS2-Hüllproteingen unter der Kontrolle eines schwachen konstitutiven Promoters umfaßt.
Die Erfindung stellt darüber hinaus Wirtszellen bereit, die in der Lage sind, ein heterologes Gen zu exprimieren und die eine „MS2-gesteuerte T7-Gen-1-Kassette" beinhalten.
Die Erfindung stellt darüber hinaus ein verbessertes Verfahren, wie beansprucht, zum Exprimieren eines heterologen Gens bereit, wobei das Verfahren umfaßt: Kultivieren unter geeigneten Bedingungen von Wirtszellen, die eine "MS2-gesteuerte T7-Gen-1-Kassette" beinhalten und mit einem Expressionsvektor transformiert worden sind, enthaltend eine DNA-Sequenz, die für das heterologe Gen unter der Kontrolle eine T7-Promoters kodiert.
Die Erfindung stellt darüber hinaus eine Reihe von Wirtszellen bereit, die in der Lage sind, ein heterologes Gen zu klonieren oder zu exprimieren, wobei die Wirtszellen so konstruiert sind, daß sie verschiedene Konzentrationen an MS2CP erzeugen.
Die Erfindung stellt darüber hinaus ein abgestuftes induzierbares Promotersystem zum Klonieren oder Exprimieren eine heterologen Gens bereit, wobei das System regulierte Transkriptionskontrollproteine umfaßt, die die Transkription von spezifischen Promotern steuern, während gleichzeitig die allgemeine Transkription von bakteriellen Wirtspromotern inhibiert wird. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Transkriptionskontrollproteine motA und asiA, und die Proteine werden durch MS2CP reguliert.
Die Erfindung stellt darüber hinaus ein verbessertes Verfahren, wie beansprucht, zum Klonieren oder Exprimieren eines heterologen Gens bereit, wobei das Verfahren umfaßt: Kultivieren unter geeigneten Bedingungen von Wirtszellen, die mit einem ersten Plasmidvektor, umfassend eine DNA-Sequenz, die für das heterologe Gen unter Kontrolle des T4-middle-Promoters kodiert, und einem zweiten Plasmidvektor co-transformiert worden sind, umfassend eine DNA-Sequenz, die für einen induzierbaren Promoter, motA- und asiA-Gensequenzen kodiert, von denen jede mit einer Translationsrepressorerkennungsstelle verknüpft ist, und einen Translationsrepressor, der operabel mit einem konstitutiven Promoter verknüpft ist, wobei der Translationsrepressor die Expression der motA- und asiA-Gene steuert, und wobei die motA- und asiA-Gene die Transkription von dem T4-middle-Promoter steuern, während gleichzeitig die Transkription von dem induzierbaren Promoter inhibiert wird. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Translationsrepressor MS2-Hüllprotein. In einer Ausführungsform umfaßt der zweite Plasmidvektor weiterhin eine DNA-Sequenz, die für ein akzessorisches Protein kodiert.
Die Erfindung stellt darüber hinaus eine verbessertes Verfahren, wie beansprucht, zum Klonieren oder Exprimieren eines heterologen Gens bereit, wobei das Verfahren umfaßt: Kultivieren unter geeigneten Bedingungen von Wirtszellen, umfassend eine DNA-Sequenz, die für einen induzierbaren Promoter, motA- und asiA-Gensequenzen kodiert, von denen jede mit einer Translationsrepressorerkennungsstelle verknüpft ist, und einen Translationsrepressor, der mit einem konstitutiven Promoter verknüpft ist, transformiert mit einem Plasmidvektor, umfassend eine DNA-Sequenz, die für das heterologe Gen kodiert, das unter der Kontrolle von T4-middle-Promoter verknüpft ist, wobei der Translationsrepressor die Expression der motA- und asiA-Gene steuert und wobei die motA- und asiA-Gene die Transkription von dem T4-middle-Promoter steuern, während gleichzeitig die Transkription von dem induzierbaren Promoter inhibiert wird. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Translationsrepressor MS2-Hüllprotein.
Die Erfindung stellt weiterhin eine „MS2-basierende T4-Kassette" bereit, wobei die Kassette eine DNA-Sequenz umfaßt, die für einen induzierbaren Promoter, motA- und asiA-Gensequenzen kodiert, von denen jede mit einer MS2-Erkennungssequenz verknüpft ist, und das MS2-Hüllproteingen unter der Kontrolle eines konstitutiven Promoters ist.
Die Erfindung stellt weiterhin eine prokaryotische Wirtszelle bereits, die in der Lage ist, ein heterologes Gen zu exprimieren, und die eine „MS2-basierende T4-Kassette" beinhaltet.
Die Erfindung stellt darüber hinaus ein verbessertes Verfahren, wie beansprucht, zum Klonieren oder Exprimieren eines heterologen Gens bereit, wobei das Verfahren umfaßt: Kultivieren unter geeigneten Bedingungen von Wirtszellen, die eine „MS2-basierende Kassette" beinhalten und mit einem Expressionsvektor transformiert worden sind, der eine DNA-Sequenz enthält, die für das heterologe Gen unter der Kontrolle eines T4-Promoters kodiert.
Die Offenbarung stellt darüber hinaus die DNA-Sequenz von SEQ ID NO:1 und die DNA-Sequenz von SEQ ID NO:2 bereit.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist die vollständige Gensequenz (SEQ ID NO:1) des Wildtyp MS2-Hüllproteins, die in den Systemen der vorliegenden Erfindung verwendet wird. Das Gen hat eine NdeI-Stelle an dem 5'-Ende und eine BamHI-Stelle an dem 3'-Ende.
2 ist ein Foto eines SDS-Gels, das die Ergebnisse der wtMS2CP-Expressionsexperimente zeigt. Spur 1 ist ein nicht-induzierter vermeintlicher positiver Klon aus BL21 (DE3)-Wirtszellen (enthaltend das wtMS2CP-Gen in pT7-7), die bis zu einer O.D. von 0,6 wachsen gelassen wurden. Spuren 2-14 sind verschiedene vermeintliche positive Klone aus BL21 (DE3)-Wirtzellen (enthaltend das wtMS2CP-Gen in pT7-7) nach 4 Stunden Induktion bei 37°C. Spur 15 sind die Amersham Rainbow-Marker im niedrigen Bereich.
3 ist ein schematisches Diagramm der pRIN-Plasmidvektoren, die in der vorliegenden Erfindung entwickelt worden sind.
4 ist ein Foto eines Western-Blot, der die Ergebnisse eines Expressions- und Undichtigkeits-Experiments zeigt, das mit verschiedenen pRIN-Plasmidvektoren durchgeführt worden ist, in die das T7-Gen 1 kloniert worden war. Dieser bestimmte Blot ist von einer stationären Übernacht-Kultur, und jeder Satz Spuren ist T7-Gen-1, plus oder minus (m) eine downstream-Box, in dem selben Vektor. Die ersten drei Sätze an Spuren verwenden pRIN11 (PS4-Promoter) mit verschiedenen MS2CPs. Die letzten drei Sätze an Spuren verwenden pRIN20 (UVS-Iac-Promoter) mit verschiedenenMS2CPs. Spur 4 ist der Biorad-Molekulargewichtsmarker im niedrigen Bereich.
5 ist ein Foto eines Western-Blot, der die Ergebnisse eines Expressions- und Undichtigkeits-Experiments („leakage experiment") zeigt, das mit verschiedenen pRIN-Plasmidvektoren durchgeführt worden ist, in die das T7-Gen-1 kloniert worden war. Dieser bestimmte Blot ist von einer exponentiell wachsenden Präinduktionskultur (preI), und jeder Satz an Spuren ist T7-1, plus oder minus (m) eine downstream-Box, in dem selbem Vektor. Die ersten drei Sätze von Spuren verwenden pRIN11 (PS4-Promoter) mit verschiedenen MS2CPs. Die letzten drei Sätze an Spuren verwenden pRIN20 (UVS-Iac-Promoter) mit verschiedenen MS2CPs. Spur 1 ist der Biorad-Molekulargewichtsmarker im niedrigen Bereich.
6 ist ein Foto eines Western-Blot, der die Ergebnisse eines Expressions- und Undichtigkeits-Experiments zeigt, das mit verschiedenen pRIN-Plasmidvektoren durchgeführt wurde, in die das T7-Gen-1 kloniert worden war. Dieser bestimmte Blot ist von einer IPTG-induzierten Kultur, die bei 28°C wachsen gelassen worden war, und jeder Satz Spuren ist eine downstream-Box plus oder minus (m) Gen-1 in dem selben Vektor. Die ersten drei Sätze an Spuren verwenden pRIN11 (PS4-Promoter) mit verschiedenen MS2CPs. Die letzten drei Sätze an Spuren verwenden pRIN20 (UVS-Iac-Promoter) mit verschiedenen MS2CPs. Spur 2 ist der Biorad-Molekulargewichtsmarker im niedrigen Bereich.
7 ist ein schematisches Diagramm einer "MS2-gesteuerten T7-Gen-1-Kassette".
8 ist ein Bild eines SDS-Gels, das die Undichtigkeits- und Expressionseigenschaften des kommerziell erhältlichen BL21 (DE3)-Stamms (Spuren 3-5), des BL2l (DE3)-Stamms, enthaltend pLysS als einen sekundären Vektor (Spuren 1-2), des EE11-20-Stamms (Spuren 6-8) und des EE11-20-Stamms, der pLysS als einen Sekundärvektor enthält (Spuren 9-10), vergleicht. Die Vergleiche basierten auf der Expression von NT-3 als das Ziel-Produktgen. Spuren 1, 5, 6 und 10 stellen Übernacht-Kulturen (ON) dar, Spuren 4 und 7 stellen Präinduktionskulturen (prel) dar und Spuren 2, 3, 8 und 9 stellen Induktionskulturen dar (unter Verwendung von IPTG bei 28°C) (I-28).
9 ist ein Bild eines SDS-Gels, das die Undichtigkeits- und Expressionseigenschaften des kommerziell erhältlichen BL21 (DE3)-Stamms (Spuren 3-5), des BL21 (DE3)-Stamms, enthaltend pLysS als einen sekundären Vektor (Spuren 1-2), des EE11-20-Stamms (Spuren 6-8), und des EE11-20-Stamms, enthaltend pLysS als einen sekundären Vektor enthält (Spuren 9-10), vergleicht. Die Vergleiche basierten auf der Expression von BDNF als das Ziel-Produktgen. Spuren 1, 5, 6 und 10 stellen Übernacht-Kulturen (ON) dar, Spuren 4 und 7 stellen Präinduktionskulturen (preI) dar, und Spuren 2, 3, 8 und 9 stellen Induktionskulturen dar (unter Verwendung von IPTG bei 28°C) (I-28).
10 ist ein Bild eines SDS-Gels, das die Undichtigkeits- und Expressionseigenschaften des kommerziell erhältlichen BL21 (DE3)-Stamms (Spuren 3-5), des BL21 (DE3)-Stamms, enthaltend pLysS als einen sekundären Vektor (Spuren 1-12), des EE11-20-Stamms (Spuren 6-8) und des EE11-20-Stamms, enthaltend pLysS als einen sekundären Vektor (Spuren 9-10), vergleicht. Die Vergleiche basierten auf der Expression von BDNF als das Ziel-Produktgen. Spuren 1, 5, 6 und 10 stellen Übernacht-Kulturen (ON) dar, Spuren 4 und 7 stellen Präinduktionskulturen (preI) dar, und Spuren 2, 3, 8 und 9 stellen Induktionskulturen (unter Verwendung von IPTG bei 28°C) (I-28) dar.
11 ist ein Bild eines SDS-Gels, das die Undichtigkeits- und Expressionseigenschaften des kommerziell erhältlichen BL21 (DE3)-Stamms (Spuren 5-7) und des EE11-11M-Stamms (Spuren 2-4) vergleicht. Die Vergleiche basierten auf der Expression von BDNF als das Ziel-Produktgen. Spuren 4 und 5 stellen Ubernacht-Kulturen (ON) dar, Spuren 3 und 7 stellen Präinduktionskulturen (preI) dar, und Spuren 2 und 6 stellen Induktionskulturen dar (unter Verwendung von IPTG bei 28°C) (I-28). Spur 1 ist der Biorad-Molekulargewichtsmarker im niedrigen Bereich.
12 ist ein Bild eines SDS-Gels, das die Undichtigkeits- und Expressionseigenschaften des EE11-11M-Stamms unter Verwendung der Expression von NT-3 als das Ziel-Produktgen zeigt. Spur 5 stellt eine Übernachtkultur (ON) dar, Spur 4 stellt Präinduktionskulturen (preI) dar, und Spuren 2 und 3 stellen Induktionskulturen unter Verwendung von IPTG bei 28°C (I-28) oder IPTG bei 37°C (I-37) dar. Spur 1 ist der Biorad-Molekulargewichtsmarker im niedrigen Bereich.
13 ist ein Bild eines SDS-Gels, das einen 10-Liter-Fermentations-Induktionszeitverlauf von GCSF in pAMG25 in dem Stamm EE11-11M zeigt. Spur 1 ist die Kultur zum Zeitpunkt der Induktion, Spur 2 ist die Kultur zum Zeitpunkt der Induktion, Spuren 3-9 sind die Kultur nach zusätzlichen Stunden des Wachstums in der Anwesenheit eines Inducer (IPTG), z.B. Spur 3 ist nach einer Stunde, Spur 4 ist nach 2 Stunden etc. Spur 10 ist Amersham-Rainbow-Marker mit niedrigem Molekulargewicht. Die letzte Spur ist ein GCSF-Marker.
14 ist ein Bild eines SDS-Gels, das einen 10-Liter-Fermentations-Induktionszeitverlauf von Leptin in pAMG25 in einem Stamm EE11-11M zeigt. Spur 1 ist Amersham-Rainbow-Marker mit niedrigem Molekulargewicht. Spur 2 ist die Kultur zur Zeit der Induktion. Spuren 3-8 sind die Kulturen nach zusätzlichen Stunden des Wachstums in der Anwesenheit eines Inducer (IPTG), z.B. Spur 3 ist nach 1 Stunde, Spur 4 ist nach 2 Stunden etc. Spur 9 ist ein Leptinmarker.
15 ist ein Foto eines Western-Blot, der die Ergebnisse eines Expressionsexperiments zeigt, das unter Verwendung eine MS2-basierenden Systems durchgeführt wurde, in das das 0.4-early-Gen von T7 kloniert worden war. Spuren 2, 4, 6 und 8 stellen vier verschiedene 0.4-enthaltende Kulturen nach 4 Stunden der Induktion bei 42°C dar; Spuren 3, 5, 7 und 9 sind die nicht-induzierten Proben der selben Kulturen. Spur 1 ist der Biorad-Molekulargewichtsmarker im niedrigen Bereich.
16 ist ein Foto eines SDS-Gels, das die Ergebnisse eines Expressionsexperiments zeigt, das unter Verwendung eines MS2-basierenden Systems durchgeführt worden war, in das das 0.6-early-Gen von T7 kloniert wurde. Spuren 2 und 4 stellen zwei verschiedene 0.6-enthaltende Kulturen dar, die nicht-induziert wurden; Spuren 3 und 5 sind dieselben Proben nach 4 Stunden der Induktion bei 42°C. Spur 1 ist der Biorad-Molekulargewichtsmarker im niedrigen Bereich.
17 ist die vollständige Gensequenz (SEQ ID NO:2) des 3-7t-Operons, das konstruiert worden ist, um die early-Gene (0.3-0.7) von T7 zu enthalten.
18 ist ein Bild eines SDS-Gels, das die Expression von NDF-alpha/beta in der Abwesenheit und Anwesenheit der T7-early-Proteine vergleicht. Das 3-7t-Operon war in pRIN-10 und wurde durch eine Verschiebung der Temperatur von 28°C auf 37°C induziert. NDF-alphalbeta war in Plasmid pAMG33 und wird durch die Zugabe von IPTG induziert, wenn die Temperatur zurück auf 28°C verschoben wird. Die linke Hälfte des Gels ist ein Zeitverlauf von NDF-alpha/beta in der Abwesenheit der T7-early-Gene. Spur 1 ist nach der Induktion der early-Proteine, aber vor der Induktion von NDF-alpha/beta. Spuren 2-4 sind die Kultur nach zusätzlichen Stunden des Wachstums in der Anwesenheit von Inducer (IPDG) z.B. ist Spur 2 nach 1 Stunde, Spur 3 ist nach 2 Stunden etc. Spur 5 ist Amersham-Rainbow-Marker mit niedrigem Molekulargewicht. Die rechte Hälfte des Gels ist ein Zeitverlauf von NDF-alpha/beta-Expression in der Anwesenheit der T7-early-Proteine. Spur 6 ist nach der Induktion der early-Proteine, aber vor der Induktion von NDF-alpha/beta. Spuren 7-9 sind die Kultur nach einer zusätzlichen Stunde des Wachstums in der Anwesenheit von Inducer (IPTG).
19 ist ein Bild eines Western-Blot eines Gels, das die Expression einer trunkierten Version von humaner Telomerase-Untereinheit-TP2 (301-941 TP2) in der Anwesenheit und Abwesenheit von 77-early-Proteinen vergleicht. Das 3-7t-Operon befand sich in pRIN10 und wurde durch eine Verschiebung in der Temperatur von 28°C auf 37°C induziert. 301-941-TP2 befand sich in Plasmid pAMG22 und wird durch die Zugabe von IPTG induziert, wenn die Temperatur zurück auf 28°C verschoben wird. Spur 1 ist eine Präinduktionsprobe von 301-941-TP2 in der Anwesenheit der T7-early-Proteine. Spur 2 ist die Expression von 301-941-TP2 nach 2 Stunden der Induktion in der Abwesenheit von T7-early-Proteinen bei 28°C. Spur 3 ist die Expression von 301-941-TP2 nach 2 Stunden der Induktion in der Anwesenheit von T7-early-Proteinen bei 37°C. Spur 4 ist eine Präinduktionsprobe von 301-941-TP2 in der Abwesenheit der T7-early-Proteine. Spur 5 ist die Expression von 301-941-TP2 nach 2 Stunden der Induktion in der Abwesenheit von T7-early-Proteinen bei 37°C.
20 ist ein Bild eines Western-Blot eines Gels, das die passive Produktion von verschiedenen Niveaus des MS2-Hüllproteins durch die Stämme GM315, GM320, GM340 und GM350 zeigt. Die Stämme werden gegen den Elternstamm verglichen, aus dem sie konstruiert worden waren. Spur 1 stellt eine Log-Phasen-Kultur von GM315 dar. Spuren 2, 4, 6, 8 und 10 sind der Elternstamm 393. Spuren 3 und 5 sind GM320, Spur 7 ist GM340 und Spur 9 ist GM350.
21 ist ein Bild eines Gels, das die Expression der Hepatitis-C-Polymerase (HepCpol) in Stämmen mit verschiedenen Niveaus an MS2-Hüllproteinen zeigt (die löslichen und unlöslichen Fraktionen von jedem Expressionsexperiment werden ebenfalls verglichen). Spur 1 sind Molekulargewichtsmarker. Spur 2 ist ein Ganzzellextrakt einer induzierten Kultur von HepC-pol in pAMG21, der in Stamm GM221 exprimiert worden war, der kein MS2-Hüllprotein enthält. Spur 3 ist die unlösliche Fraktion von diesem Experiment, und Spur 4 ist die lösliche Fraktion. Spur 5 ist der Ganzzellextrakt einer induzierten Kultur von HepCpol in pAMG21, der im Stamm GM315 exprimiert wird, welcher MS2-Protein enthält. Spur 6 ist die unlösliche Fraktion aus dem Experiment, und Spur 7 ist die lösliche Fraktion. Spur 8 ist der Ganzzellextrakt einer induzierten Kultur von HepC in pAMG21, der in Stamm GM320 exprimiert wird, der mehr MS2-Hüllprotein als der in GM315 enthält. Spur 9 ist die unlösliche Fraktion aus diesem Experiment, und Spur 10 ist die lösliche Fraktion.
22 ist die vollständige DNA-Sequenz (SEQ ID NO:3) des T4-PuvsX-middle-Promoter, der in den Systemen der vorliegenden Erfindung verwendet wird. Das Gen hat eine AatII-Stelle am 5'-Ende und eine ClaI-Stelle am 3'-Ende.
23 ist die vollständige DNA-Sequenz (SEQ ID NO:4) des T4-PX-middle-Promoter, der in den Systemen der vorliegenden Erfindung verwendet wird. Das Gen hat eine AatII-Stelle am 5'Ende und eine ClaI-Stelle am 3'-Ende.
24 ist ein Bild eine SDS-Gels, das die Undichtigkeits- und Expressionseigenschaften von pAMG13 unter Verwendung der Expression von T7-Gen-1 (unter der Kontrolle eines lambda-Promoter) als das Ziel-Produktgen zeigt. Spur 5 stellt eine stationäre Probe dar, die über Nacht bei 28°C wuchs, Spur 4 stellt eine Probe dar, die für 4 Stunden bei 42°C induziert war, Spur 3 stellt eine Probe dar, die für 4 Stunden bei 37°C induziert war, Spur 2 stellt eine nicht-induzierte Probe dar, die bei 28°C auf eine O.D. von 0,6 wuchs, und Spur 1 ist der Biorad-Molekulargewichtsmarker im niedrigen Bereich.
25 ist ein Bild eine SDS-Gels, das die Undichtigkeits- und Expressionseigenschaften von pAMG13 zeigt, in dem das T7-Gen-1 mit T4-Operon-pRIN10 co-exprimiert war. Spur 4 stellt eine stationäre Probe dar, die über Nacht bei 28°C wuchs, Spur 3 stellt eine Probe dar, die für 4 Stunden bei 42°C induziert wurde, Spur 2 stellt eine Probe dar, die für 4 Stunden bei 37°C induziert wurde, und Spur 1 stelle eine nicht-induzierte Probe dar, die bei 28°C auf eine O.D. von 0,6 wuchs.
26 ist ein Bild eines SDS-Gels, das die Undichtigkeits- und Expressionseigenschaften von pAMGuvsX zeigt, in dem T7-Gen-1 (unter der Kontrolle des uvxX-T4-middle-Promoter) mit dem T4-Operon pRIN10 co-exprimiert wurde. Spur 4 stellt eine stationäre Probe dar, die über Nacht bei 28°C wuchs, Spur 3 stellt eine Probe dar, die für 4 Stunden bei 42°C induziert wurde, Spur 2 stellt eine Probe dar, die für 4 Stunden bei 37°C induziert wurde, und Spur 1 stellt eine nicht-induzierte Probe dar, die bei 28°C auf eine O.D. von 0,6 wuchs.
27 ist ein Bild eines SDS-Gels, das die Undichtigkeits- und Expressionseigenschaften von pAMGuvsX zeigt, in dem das T7-Gen-1 mit T4-Operon-pRIN11 co-exprimiert wurde. Spur 5 stellt eine stationäre Probe dar, die über Nacht bei 28°C wuchs, Spur 4 stellt eine Probe dar, die für 4 Stunden bei 37°C induziert wurde, Spur 3 stellt eine Probe dar, die für 4 Stunden bei 28°C induziert wurde, Spur 2 stellt eine nicht-induzierte Probe dar, die bei 28°C auf eine O. D. von 0,6 wuchs, und Spur 1 ist der Bio-Rad-Molekulargewichtsmarker im niedrigen Bereich.
28 ist ein Bild eines SDS-Gels, das die Undichtigkeits- und Expressionseigenschaften von pAMGuvsX zeigt, in dem NT-3 (unter der Kontrolle des uvsX-T4-Middle-Promoter) mit T4-Operon pRIN10 co-exprimiert wurde. Spur 4 stellt eine Probe dar, die für 4 Stunden bei 42°C induziert wurde, Spur 3 stellt eine Probe dar, die für 4 Stunden bei 37°C induziert wurde, Spur 2 stellt eine nicht-induzierte Probe dar, die bei 28°C auf eine O.D. von 0,6 wuchs, und Spur 1 ist der Bio-Rad Molekulargewichtsmarker im niedrigen Bereich.
29 ist ein Bild eines SDS-Gels, das die Undichtigkeits- und Expressionseigenschaften von pAMGuvsX zeigt, in dem BDNF (unter der Kontrolle des uvsX-T4-Middle-Promoter) mit T4-Operon pRIN10 co-exprimiert wurde. Spur 5 stellt eine Probe dar, die für 4 Stunden bei 42°C induziert wurde, Spur 4 stellt eine Probe dar, die für 4 Stunden 37°C induziert wurde, Spur 3 stellt eine Probe dar, die für 4 Stunden bei 28°C induziert wurde, Spur 2 stellt eine nicht-induzierte Probe dar, die bei 28°C auf eine O.D. von 0,6 wuchs, und Spur 1 ist der Biorad-Molekulargewichtsmarker im niedrigen Bereich.
30 ist ein schematisches Diagramm der pCB-Plasmidvektoren, die in der vorliegenden Erfindung entwickelt wurden.
31 ist ein schematischen Diagramm der pAW-Plasmidvektoren, die in der vorliegenden Erfindung entwickelt wurden.
32 ist ein Bild eines SDS-Gels, das die Undichtigkeits- und Expressionseigenschaften von pAMGX zeigt, in dem das T7-Gen-1 (unter der Kontrolle des T4-X-middle-Promoter) mit pAW20 co-exprimiert wurde. Spur 4 stellt eine stationäre Probe dar, die über Nacht bei 28°C wuchs, Spur 3 stellt eine Probe dar, die für 4 Stunden bei 28°C induziert wurde. Spur 2 stellt eine nicht-induzierte Probe dar, die bei 28°C auf eine O.D. von 0,6 wuchs und Spur 1 ist der Biorad-Molekulargewichtsmarker im niedrigen Bereich.
33 ist ein Bild eines SDS-Gels, das die Undichtigkeits- und Expressionseigenschaften von pAMGX zeigt, in dem SPI (unter der Kontrolle des T4-X-middle-Promoter) mit pAW20 co-exprimiert wurde. Spur 3 stellt eine Probe dar, die für 4 Stunden bei 28°C induziert wurde, Spur 2 stellt eine nicht-induzierte Probe dar, die bei 28°C auf eine O.D. von 0,6 wuchs, und Spur 1 ist der Biorad-Molekulargewichtsmarker im niedrigen Bereich.
34 ist ein Bild eines SDS-Gels, das die Undichtigkeits- und Expressionseigenschaften von pAMGuvsX zeigt, in dem OPG (unter der Kontrolle des T4-uvsX-middle-Promoter) mit pAW20 co-exprimiert wurde. Spur 4 stellt eine Probe dar, die für 4 Stunden bei 28°C induziert wurde, Spur 2 stellt eine nicht-induzierte Probe dar, die bei 28°C auf eine O.D. von 0,6 wuchs, und Spur 1 ist der Biorad-Molekulargewichtsmarker im niedrigen Bereich.
35 ist ein Bild eines SDS-Gels, das die Undichtigkeits- und Expressionseigenschaften von pAMGuvsX zeigt, in dem BDNF (unter der Kontrolle des T4-uvsX-middle-Promoter) mit pAW11 co-exprimiert wurde. Spur 1 stellt eine nicht-induzierte Probe dar, Spur 2 stellt eine Probe dar, die bei 28°C für 4Stunden induziert wurde, und Spur 3 stellt eine Probe dar, die bei 37°C für 4 Stunden induziert wurde.
36 ist ein Bild eines SDS-Gels, das Undichtigkeits- und Expressionseigenschaften von pAMGuvsX zeigt, in dem OPG (unter der Kontrolle des T4-uvsX-middle-Promoter) mit pAW11 co-exprimiert wurde. Spur 1 ist Amersham-Rainbow-Marker mit niedrigem Molekulargewicht, Spur 2 stellt eine nicht-induzierte Probe dar, Spur 3 stellt eine Probe dar, die bei 28°C für 4 Stunden induziert wurde, und Spur 4 stellt eine Probe dar, die bei 37°C für 4 Stunden induzierte wurde.
37 ist ein Bild eines SDS-Gels, das Undichtigkeits- und Expressionseigenschaften von pAMGuvsX zeigt, in dem NT3 (unter der Kontrolle des T4-uvsX-middle-Promoter) mit pAW11 co-exprimiert wurde. Spur 1 stellt eine nicht-induzierte Probe dar, Spur 2 stellt eine Probe dar, die bei 28°C für 4 Stunden induziert wurde, und Spur 3 stellt eine Probe dar, die bei 37°C für 4 Stunden induziert wurde.
38 ist ein Bild eines SDS-Gels, das Undichtigkeits- und Expressionseigenschaften von pAMGX zeigt, in dem 3MNDF (unter der Kontrolle des T4-X-middle-Promoter) mit pAW11 co-exprimiert wurde. Spur 1 stellt eine nicht-induzierte Probe dar, Spur 2 stellt eine Probe dar, die bei 28°C für 4 Stunden induziert wurde, und Spur 3 stellte eine Probe dar, die bei 37°C für 4 Stunden induziert wurde.
39 ist ein Bild eines SDS-Gels, das die Undichtigkeits- und Expressionseigenschaften von pAMGuvsX zeigt, in dem BDNF (unter der Kontrolle des T4-uvsX-middle-Promoter) mit einem T4-Operon-pRIN10 co-exprimiert wurde, das ebenfalls das 0.6-Gen als ein akzessorisches Protein enthielt. Spur 5 stellt eine Probe dar, die für 4 Stunden bei 42°C induziert wurde, Spur 4 stellt eine Probe dar, die für 4 Stunden bei 37°C induziert wurde, Spur 3 stellt eine Probe dar, die für 4 Stunden bei 28°C induziert wurde, Spur 2 stellt eine nicht-induzierte Probe dar, die bei 28°C auf eine O.D. von 0.6 wuchs, und Spur 1 ist der Biorad-Molekulargewichtsmarker im niedrigen Bereich.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung wird ein „Translationsrepressor" als ein Protein definiert, das in der Lage ist, spezifisch an eine Erkennungsstelle auf einem Stück RNA zu binden und die Translation zu inhibieren. In der vorliegenden Erfindung werden das MS2-Hüllprotein und die MS2-Erkennungsstelle verwendet, um ein Translationsrepressorsystem bereits zu stellen. Kurz gesagt wurde die veröffentlichte Sequenz des MS2CP dazu verwendet, Oligonukleotide zu erzeugen, aus denen das intakte Gen konstruiert wurde. Dann wurde, nachdem festgestellt wurde, das MS2CP in sehr hohen Niveaus in E.coli ohne irgendeinen offensichtlichen Effekt auf das Zellwachstum toleriert wurde, MS2CP unter die Kontrolle eines schwachen konstitutiven Promoters in Plasmiden mit verschiedenen Kopienzahl gebracht. Die Idee war, kontinuierlich niedrige Niveaus an MS2CP zu produzieren, so daß jegliche klonierten Gene, die eine MS2-Erkennungsstelle haben, vollständig ruhig gehalten würden, bis es nützlich ist, sie zu exprimieren.
Unter Verwendung dieses Ansatzes, wurde gezeigt, daß dieses MS2-basierende System dazu verwendet werden konnte, ein verbessertes stark kontrolliertes System bereitzustellen, das z.B. das T7-RNA-Polymerase-Gen beinhaltet. Das klonierte T7-Gen-1 stellt eine Quelle für T7-RNA-Polymerase zum Steuern einer selektiven Hochniveau-Expression von Zielgenen unter der Kontrolle eines T7-Promoter bereit. Da jedoch die T7-RNA-Polymerase so aktiv und selektiv ist, ist es jedoch wichtig, die Grundniveaus von aktiver T7-RNA-Polymerase zu kontrollieren, d.h. das T7-Gen-1 in dem nicht-induzierten Zustand abzuschalten, um eine verfrühte Expression des Zielgens zu verhindern.
Die bei der vorliegenden Erfindung verwendete Strategie beinhaltete daher die Klonierung des T7-Gens-1 mit einer MS2-Erkennungsstelle, die an seine Kodierungssequenz verknüpft ist, und den Einbau dieses Konstrukts in das Chromosom zusammen mit einer Kopie des MS2-Hüllproteins unter der Kontrolle eines schwachen konstitutiven Promoters. Die beiden Gene wurden Ende an Ende kloniert, so daß die Promoter für jedes Gen in entgegengesetzte Richtungen orientiert waren. Es wurde dann gezeigt, daß die Wirtszellen, die eine chromosomale Kopie dieses „MS2-kontrollierten T7-Gen-1"-Konstrukts enthielten, eine effektive Erzeugung von T7-RNA-Polymerase ermöglichten, die dann verwendet werden konnte, um die Expression eines Zielgens anzutreiben.
Zielgene, die in dem System der vorliegenden Erfindung erfolgreich getestet wurden, schlossen das T7-Gen-1, neurotropher Faktor-3 (NT-3), aus Hirn stammender neurotropher Faktor (BDNF), Serinproteaseinhibitor (SPI) und Osteoprotegrin (OPG), neu-Differenzierungsfaktor (NDF)-alpha/beta, Hepatitis-C-Polymerase, humane Telomerase und Analoge, Derivate und Varianten davon ein. Es wird in Erwägung gezogen, daß die verschiedenen MS2-kontrollierten Systeme eine verbesserte Kontrolle für jegliches klonierte Gen, toxisch oder nicht toxisch, in einer prokaryotischen Wirtszelle bereitstellen können.
Es wurde weiterhin gezeigt, daß das MS2-basierende System dazu verwendet werden konnte, um bestimmte toxische Gene stabil zu klonieren und zu exprimieren. Wie hierin verwendet, ist ein toxisches Gen jegliches Gen, dessen Expression in der Wirtszelle die Wirtszelle in Kultur daran hindern wird, das normale logarithmische Wachstum zu erzielen, das es erzielt hätte, wenn nicht die Expression des toxischen Gens stattgefunden hätte. Als Beispiele in der vorliegenden Erfindung wurden die early-Gene von Bakteriophage T7 kloniert und exprimiert, ebenso wie motA und asiA. Mehrere der early-Gene von Bakteriophage T7 sind bekanntermaßen toxisch; Studier und Rosenberg, J. Mol. Biol., 153:503-525 (1981). Das 0.7-Gen ist insbesondere tödlich, da es für eine Funktion kodiert, die die E.coli-RNA-Polymerase inhibiert. Es ist ebenfalls jetzt bekannt, daß auch motA und asiA toxisch sind; Hinton et al., Methods in Enzymol., 274:43-57 (1996). Die Fähigkeit, solche Gene zu exprimieren, ist von signifikantem Wert, da gezeigt worden ist, daß einige diese Gene einen positiven Effekt auf die heterologe Genexpression in E.coli durch Phageninfektion haben. In anderen Worten, es gibt Zeiten, wenn es nützlich ist, eine klonierte Kopie dieser Gene in der Zelle zur Expression genau vor der Expression des Zielgens zu haben.
In den hierin dargebotenen Beispielen war das T7-Gen-1 unter der Kontrolle des UV5-lac-Promoters; Fuller, F., Gene, 19:43-54 (1982); des PS4-Promoter, WO 95/267246 (Bartley et al.,), veröffentlicht am 12. Oktober 1995, und des lux-Promoter, US-Patent Nr. 5,196,318 (Baldwin et al.), erteilt am 23. März, 1993). Wichtigerweise könnte das T7-Gen-1 jedoch auch unter der Kontrolle eines beliebigen induzierbaren Promoter gewesen sein, einschließlich bakterieller Promotoren, wie etwa trp- oder lpp-, Phagenpromoter, wie lambda-P_L oder P_R oder synthetischen Promoter wie etwa tac oder trc.
Ebenso entwickelt und hierin als effektiv beim System der vorliegenden Erfindung beschrieben sind mutante Formen des MS2CP. Zum Beispiel wurde eine mutante Version des MS2CP konstruiert, in der das Kodon für den Valinrest an Position 29 in ein Kodon für Isoleucin verändert wurde. Diese Mutation bewirkt die Fähigkeit von Hüllproteindimeren, sich zu Aggregaten mit Capsid-Größe zu assoziieren; Peabody, D.S. und Ely, R., Nuc. Acid Res., 20 (7):1649-1655 (1992). Da das Hüllprotein an sein mRNA-Ziel als ein Dimer bindet, und davon ausgegangen wird, daß die Multimerisierung von Dimeren die Assoziation mit der mRNA inhibiert, würde daher erwartet werden, daß diese Mutation die wirksame Konzentration von vorhandenen Translationsrepressoren erhöhen würde, ohne die tatsächliche Proteinkonzentration zu erhöhen, indem mehr Hüllprotein in Dimere statt in Multimeren gehalten wird. Es würde von Fachleuten auf dem Gebiet verstanden werden, daß andere mutante Formen des MS2CP in den Systemen der vorliegenden Erfindung wirksam sind.
Obwohl die hierin dargebotenen Beispiele insbesondere das Bakteriophagen-MS2-System verwenden, wäre es nicht unerwartet, daß andere ähnliche Systeme, Qβ, GA, SP, R17, f2 und fr, als Translationsrepressorsysteme auf eine ähnliche Weise verwendet werden könnten.
Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten und bewerteten Wirtszellen schlossen den E. coli-B-Stamm (BL21 (DE3) ± pLysS und den E.coli-K-Stamm EE1120 ± pLysS ein. Es würde von Fachleuten verstanden werde, daß andere häufig verwendeten E.coli-B-Stämme und K-Stämme bei der Ausübung der vorliegenden Erfindung wirksam sein werden. Es würde ebenfalls verstanden werden, daß verschiedene eukaryotische Wirtszellen bei der Ausübung der vorliegenden Erfindung verwendet werden könnten.
Starke Transkriptionsterminatoren werden ebenfalls in den Systemen der vorliegenden Erfindung verwendet. Durch Einbau von solchen Terminatoren, stromauf von dem Promoter von Interesse (z.B. dem Promoter, der die Expression des T7-Gen-1 steuert), wird eine Durchlese-Transkription aus kryptischen Promotersequenzen eliminiert, was damit ein stärker reguliertes System bereitstellt. T1T2-Terminatoren, Amman et al., Gene, 25:167-178 (1983) wurden in den Beispielen der vorliegenden Erfindung verwendet; jedoch gibt es andere starke Terminatoren, z.B. t_HP; Nohno et al., Mol. Gen. Genet., 205:260-269 (1986), von denen klarerweise erwartet werden würde, daß sie in dem System der vorliegenden Erfindung wirksam arbeiten.
Obwohl die T7-RNA-Polymerase in den Beispielen der vorliegenden Erfindung verwendet wurde, würden äquivalenten RNA-Polymerasen aus T7-artigen Phagen ebenfalls funktionieren. Solche Phagen werden im einzelnen auf dem Gebiet beschrieben. Siehe z.B. Hausmann, R., The T7 Group in The Bacteriophages, Kapitel 8, S. 259-283, Plenum Press, New York (1988).
Ebenfalls wird in der vorliegenden Erfindung die Konstruktion eines Systems zur Aktivierung eines klonierten T4-middle-Promoter in vivo unter Verwendung eines speziell konstruierten Operons beschrieben, bestehend aus motA- und asiA-Genen unter der Kontrolle eine induzierbaren Promoters. Der Hauptvorteil dieses Promoterssystems ist es, daß es die Transkription von spezifischen Promotern steuert, während es die Transkription aus E.coli-Promotern inhibiert, was den Wettbewerb um den Translationsapparat minimiert und die Zelle daran hindert, auf eine Zielproteinproduktion durch Induzieren der Transkription von Proteasegenen zu antworten. Es wurde ebenfalls gezeigt, daß das System einen „abgestuften" Expressionszyklus bieten würde, der unter anderem zum Exprimieren von bestimmten akzessorischen Proteinen nützlich sein könnte, die für die Produktion des Zielproteins hilfreich sein können.
Genauer war die Idee die, daß die akzessorischen Proteine unter einem Promoter kloniert werden könnten, der auf dieselbe Weise wie der motA- und asiA-Promoter induziert wird, oder sie könnten alle unter der Kontrolle desselben Promoters in einer einzelnen Operon-Konfimation sein. Wenn das Induktionssignal gegeben wird, würden diese akzesssorischen Proteine und motA und asiA zeitgleich produziert werden.
Wenn motA und asiA Sättigungsniveaus erreichen würden (gleich oder ein wenig höher als die Anzahl an vorhandenen RNA-Polymerase-Molekülen), dann würde die Transkription von E.coli-Promotern inhibiert, was diese Stufe des Expressionszyklus enden würde. Die RNA-Polymerase würde dann nur auf T4-middle-Promoter gerichtet, was zur Expression des Zielproteins führen würden. Es steht gegenwärtig kein System zur Verfügung, das dies in E.coli machen kann.
Die Fähigkeit, solche akzessorischen Proteine auf diese Weise zu exprimieren kann von großem Vorteil beim Verbessern der Expression von Proteinen in prokaryotischen Systemen sein. Zum Beispiel berichteten Yasukawa et al., The Journ. of Biol. Chem., 270 (432):25328-25331 (1995), daß die Co-Produktion des E.coli-Thioredoxin (Trx) oder der E.coli-Chaperone GroESL die Löslichkeiten von verschiedenen Vertebratenproteinen erhöhte, die in E.coli produziert wurden (Trx war am effektivsten). Dies ist ein wichtiges und nützliches Ergebnis, da eukaryotische Proteine häufig in E.coli als unlösliche Aggregate erzeugt werden, und dies ist eine der Barrieren im Hinblick auf Studien über die makromolekulare Struktur.
In der vorliegenden Erfindung sind die motA- und asiA-Gene unter den lambda P_L-Promoter kloniert und ebenfalls unter einem aus lac-stammenden Promoter kloniert worden. Wichtiger, es würde jedoch jeglicher induzierbare Promoter funktionieren, einschließlich bakterieller Promoter, wie etwa trp- oder lpp-, Phagenpromoter, wie etwa lambda-P_L oder P_R, oder synthetische Promoter, wie etwa tac oder trc.
Da gefunden wurde, daß die T4-middle-Promoter „undicht" („leaky") waren, und da, noch wichtiger, die toxischen Gene motA und asiA sorgfältig kontrolliert werden müssen, wurden die Eigenschaften des MS2-Systems und des T4-middle-Promoter-Systems kombiniert. Es wurde gefunden, daß motA-/asiA-Operons nicht-klonierbar waren, sofern nicht beide Gene mit einer MS2-Erkennungsstelle verknüpft waren. Optimale „MS2-basierende T4-Kasetten", die in das Wirtszellchromosom eingefügt werden sollen, enthalten somit einen motA-/asiA-induzierbaren Promoter mit motA- und asiA-Gensequenzen (± akzessorischer Proteinsequenz), verknüpft mit einer MS2-Hüllproteinerkennungssequenz und einem MS2-Hüllproteingen, das mit einem schwachen konstitutiven Promoter operabel verknüpft ist.
Unter Verwendung dieses Systems verhindert die Erzeugung von MS2CP auf niedrigem Niveau eine Undichtigkeit („leakage") des T4-middle-Promoter und der motA/asiA-Produktion, bis ein Induktionsereignis stattfindet, das dann die motA/asiA-Produktion (und, sofern beabsichtigt, die Produktion von akzessorischem Protein) antreibt und die E.coli-Transkription abschaltet, gefolgt von einer Produktion des Ziel-Gens, angetrieben vom dem T4-middle-Promotern.
Ebenso entwickelt und hierin beschrieben werden eine Reihe von E.coli-Stämmen, die konstruiert worden sind, um verschiedene Konzentrationen an MS2CP zu erzeugen. Diese Stämme hatten das MS2-Hüllprotein unter der Kontrolle von modifizierten TET-Promoter-Sequenzen, integriert in ihre chromosomale DNA an bestimmten Stellen. Die TET-Promoter-Sequenzen wurden modifiziert, indem Basen in der -10- und -35-Region verändert wurden, um sie mit der Konsensussequenz für diese Regionen in starken E.coli-Promotern homolog zu machen. Sie sind ebenfalls verändert worden durch Verwendung von Oligonukleotiden, um die Sequenz der Ribosomenbindungsstelle zufallsmäßig zu verändern. Diese Veränderungen ermöglichten die Identifizierung einer Anzahl von Formen, die höhere Niveaus an MS2-Hüllprotein erzeugen, bestimmt anhand einer Western-Analyse.
Die verschiedenen MS2-enthaltenden Stämme der vorliegenden Erfindung können verwendet werden, um toxische und andere Gene zu klonieren, die nicht unter Verwendung von herkömmlicher Technologie kloniert werden können. Zum Beispiel ist bestimmt worden, daß bei Arbeiten mit toxischen Genen die Etablierung der anfänglichen Ligation der empfindlichste Schritt gegenüber der Toxizität ist und daher der schwierigste Schritt bei dem Klonierungsprozeß ist. Wenn jedoch erst einmal ein stabiler Klon isoliert worden ist, kann er dann in andere Zelllinien ohne Zwischenfälle transformiert werden. Unter Verwendung von GM350 konnte man das toxische oder „nicht-klonierbare" Gen an eine MS2-Erkennungsstelle koppeln und dann die Ligation verwenden, um GM350 zu transformieren. Da GM350 die höchste Produktion an MS2-Hüllproteinen hat, in der Tat wird so viel MS2CP produziert, daß eine Expression bei Induktion effektiv eliminiert wird, kann GM350 dazu verwendet werden, einen stabilen Klon zu identifizieren und zu erhalten. Wenn der stabile Klon erhalten worden ist und die Sequenz bestätigt worden ist, kann das rekombinante Plasmid verwendet werden, um die anderen MS2-Stämme zu transformieren, die eine abnehmende Menge an Hüllprotein erzeugen. Die Stabilität des Klons in jedem Stamm konnte bestimmt werden, und das Protein letztendlich in einem solchen Stamm exprimiert werden. In Fällen, bei denen die Toxizität im Anschluß an den Erhalt des anfänglichen Klons andauert, wären die MS2CP-Erzeuger auf niedrigem Niveau, z.B. GM315 und GM320, beim Stabilisieren dieser Konstrukte nützlich.
Die folgenden Beispiele werden dargeboten, um die Erfindung vollständiger zu veranschaulichen, sie sollen aber nicht dahingehend ausgelegt werden, daß sie den Umfang davon beschränken. Beispiel 1 beschreibt die Konstruktion des Wildtyp-MS2-Hüllproteingens (wtMS2CP) und stellt dann die Ergebnisse eines Tests des wtMS2CP im Hinblick auf seine Fähigkeit dar, in E.coli exprimiert zu werden, und jegliche Effekte, die eine solche Expression auf das Zellwachstum hatte. Beispiel 2 beschreibt die Konstruktion von zwei Mutantenversionen des MS2-Hüllproteingens. Beispiel 3 beschreibt die Konstruktion der pRIN-Plasmidvektoren, enthaltend wtMS2CP oder MS2CP-Mutanten zur Verwendung bei der Entwicklung des Translationsrepressionssystems. Beispiel 4 beschreibt die Klonierung des T7-Gens-1 in pRIN-Plasmidvektoren, und das sich anschließende Testen der Vektoren auf Expressions- und Systemundichtigkeit. Beispiel 5 beschreibt den chromosomalen Einbau von „MS2-kontrollierten T7-Gen-1-Kassetten" in das Chromosom einer Wirtszelle und demonstriert dann die Verwendung von solchen Wirtsstämmen, um verschiedene Zielgene zu exprimieren, und stellt Ergebnisse von Tests dar, bei denen die Undichtigkeits- und Expressionseigenschaften der neuentwickelten Stämme mit kommerziell erhältlichen T7-RNA-Polymerase enthaltenden Stämmen verglichen werden. Beispiel 6 beschreibt die Fermentation auf großem Maßstab der neu entwickelten Stämme auf eine hohe Dichte. Beispiel 7 beschreibt die Verwendung des MS2-Systems, um verschiedene T7-early-Gene zu klonieren. Beispiel 8 beschreibt das Testen der T7-early-Gene beim Verstärken einer heterologen Proteinproduktion. Beispiel 9 beschreibt den chromosomalen Einbau des MS2-Hüllproteingens unter der Kontrolle von verschiedenen veränderten TET-Promotern, um Stämme zu erzeugen, die konstruiert worden sind, um verschiedene Konzentrationen an MS2CP zu erzeugen, und die Ergebnisse des Testens dieser Stämme auf ihre Fähigkeit, toxische Gene zu klonieren. Beispiel 10 beschreibt die Konstruktion des pAMGuvxs-Plasmid, des pAMGX-Plasmids und der T4-Operon-pRIN-Systeme, die verwendet wurden, um die T4-middle-Promoter-basierenden Systeme unter Verwendung von Multicopy-Plasmiden zu entwickeln. Beispiel 11 beschreibt das Testen der pAMGuvxs-, pAMGX- und T4-Operon-pRIN-Systeme, die in Beispiel 10 hergestellt und beschrieben worden sind. Beispiel 12 beschreibt die Klonierung des motA/asia-Operons in Einzelkopieplasmide, enthaltend das MS2-System. Beispiel 13 beschreibt das Testen der Einzelkopie-Plasmide, die in Beispiel 12 hergestellt und beschrieben worden sind. Beispiel 14 beschreibt die Verwendung des MS2/T4-basierenden Systems, um ein akzessorischen Protein wirksam zu exprimieren und dadurch die Expression eines Zielproteins zu verstärken.
MATERIALIEN UND METHODEN
In den folgenden Beispielen werden die folgenden bakteriellen Plasmide/Expressionsvektoren verwendet: pAMG13, pAMG21, pAMG22, pAMG25, pAMG33 und 3002 nahG (die alle zuvor hinterlegt worden sind oder im Zusammenhang mit dem Einreichen dieser Anmeldung hinterlegt werden); pT7-7; Tabor und Richardson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:1074-1078 (1985); pACYC184; Chang et al., J. Bacteriol., 134:1141-1156 (1978), Rose, Nucleic Acid Res., 16:355 (1988a); pKK223-3; Amman et al., Gene, 25:167-178 (1983); pGP1-2; Tabor und Richardson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:1074.1078 (1985); und pSC101; Bernardi und Bernardi, Nuc. Acids Res., 12:9415-9426.
In den folgenden Beispielen wurden die unten dargebotenen Verfahren verwendet, sofern nicht anderweitig festgestellt.
1. Ligationen
Alle Ligationen wurden in einem Endvolumen von 40 μl durchgeführt. Näherungsweise 50 ng bis 500 ng von jedem Vektor wurden verwendet, und von 500 ng bis 2 μg von jedem Insert wurden verwendet. T4-DNA-Ligase wurde mit 1 Aktivitätseinheit zugegeben, und die Reaktionen werden bei 16°C über Nacht inkubiert. Die Reaktionen wurden dann durch die Zugabe von Ammoniumacetat auf 2,5 M ausgefällt, und 2,5 Volumina Ethanol wurden zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde dann bei –80°C für wenigstens 1 Stunde inkubiert und dann bei 15000 rpm (bei 4°C) für 30 Minuten zentrifugiert. Das Pellet wurde in den ursprünglichen 40 μl resuspendiert, und ein 4 μl-Aliqot wurde zur Elektroporation verwendet.
2. Kinasieren und Annealing von Oligonukleotiden
Die Oligonukleotide wurden in Wasser bei einer Konzentration von 20 pmol/μl resuspendiert. Ein 12,5 μl Aliquot von jedem Oligonukleotid wird für die Kinasierungsreaktion verwendet. Hierzu werden 2 μl ATP, 2 μl Ligationspuffer und 2,5 μl Wasser zugegeben. Die Reaktion wird durch die Zugabe von 1 μl PNK gestartet und wird bei 37°C für 1 Stunde inkubiert. Die Proben werden dann auf 65°C für 15 Minuten erhitzt. Komplementäre Paare werden dann gemischt und auf 100°C für 1 Minute erhitzt und auf Zimmertemperatur langsam abkühlen gelassen und dann auf Eis gestellt. An diesem Punkt sind die angelagerten Oligonukleotide fertig zum Ligieren. Für besonders lange Sequenzen wurden gewöhnlich zwei Oligonukleotide bestellt, die die gesamte Region überspannten und 6-12 Komplementaritätsbasen an den 3'-Enden hatten. Diese wurden gewöhnliche sowohl als Template als auch als Primer (bei 1 pmol/μl Endkonzentration) in 100 μl PCR-Reaktionen verwendet und nach einer Gelaufreinigung restriktionsverdaut vor einer Ligation.
3. PCR-Reaktionen
Mehrere Standardprogramme wurden routinemäßig für die PCR-Prozeduren verwendet. Beim Amplifizieren von Genen oder Operon-Fragmenten war das Reaktionsvolumen 100 μl. Ein 10 μl-Aliquot eines jeden Primers bei 10 pmol/μl wird zu jeder Reaktion zugegeben, und die Matrize wird zwischen 50 ng bis 250 ng zugegeben. Die Reaktionen werden für 25 Zyklen laufen gelassen. Der erste Schritt ist 94°C für 30 Sekunden, dann 50°C für 2 Minuten, gefolgt von 72°C für 3 Minuten. Die amplifizierten Fragmente wurden gelaufgereinigt in SeaKem GTG (FMC) Agarosegelen. Die DNA wurde aus der Agarose unter Verwendung von Qiaex-II (Qiagen Inc.) wiedergewonnen.
Kolonie-Screeningreaktionen zum Identifizieren von positiven Klonen werden in 20 μl Volumina laufen gelassen. Die Oligonukleotide liegen in einer Endkonzentration von 0,25 pmol/μl vor. Die Kolonien werden mit einer Pipettenspitze aufgenommen und in die Reaktionsmischung aufgelöst. Ein 1 μl-Aliquot wird entnommen und verwendet, um ein 5 ml-Röhrchen LB, enthaltend das geeignete Antibiotikum, zu beimpfen. Die PCR-Reaktionen werden für 30 Zyklen laufen gelassen. Der erste Schritt ist 94°C für 30 Sekunden, gefolgt von einem 30-Sekunden-Annealing bei 37°C und einer 30-Sekunden-Elongation bei 72°C. Für große Inserts (>1000 Basen), wird die Elongationszeit auf eine Minute ausgedehnt. Die Reaktionen werden dann auf Agarosegele geladen (0,8-1,0%), und Positive werden anhand der Migration gegen Standards und Vektor-Scheinreaktionen identifiziert.
BEISPIEL 1
Dieses Beispiel beschreibt die Konstruktion des Wildtyp-MS2-Hüllproteingens (wtMS2CP) und stellt dann die Ergebnisse des Testens des wtMS2CP auf seine Fähigkeit dar, in E.coli exprimiert zu werden, und jegliche Effekte, die eine solche Expression auf das Wirtszellwachstum hatte.
Die veröffentlichte Proteinsequenz des MS2-Hüllproteins, Peabody, D., EMBO J., 12 (2):595-600 (1993) wurde verwendet, um ein Gen zu konstruieren, unter Verwendung von E.coli-Kodons mit bevorzugter Verwendung. Oligonukleotide 909-34 bis 909-53 (siehe Tabelle 1) wurden konstruiert und verwendet, um das Gen zu konstruieren, und die vollständige Gensequenz wird in 1 dargestellt. Die Oligonukleotide wurden so konstruiert, daß sie eine NdeI-Stelle am 5'-Ende des Gens und eine BamHI-Stelle am 3'-Ende des Gens enthielten. Dieses Gen wurde dann restriktionsverdaut mit BamHI und NdeI und in Plasmid pT7-7 kloniert, Tabor und Richardson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:1074-1078 (1985). Wenn ein positiver Klon identifiziert und die Sequenz bestätigt worden war, wurde dieses Gen in Plasmid 3002 nahG unter Verwendung derselben Restriktionsstellen subkloniert.
Der kommerziell erhältliche BL21 (DE3)-Stamm (Novagen, Madison, WI) wurde verwendet, um die Fähigkeit des wtMS2CP zu testen, in E.coli exprimiert zu werden. BL21 (DE3) ist ein E.coli-B-Stamm, der eine chromosomale Kopie des T7-RNA-Polymerase-Gens unter der Kontrolle des UVS-Lac-Promoter enthält. Kolonien von BL21(DE3), enthaltend das wtMS2CP-Gen in pT7-7, wurden von Platten aufgenommen und dazu verwendet, ein 5 ml-Aliquot von LB-amp in ein 50-ml-Falcon-Röhrchen zu beimpfen. Diese Zubereitung wurde über Nacht bei 28°C unter Schütteln wachsengelassen. Die Übernachkultur wurde verwendet, um frisches Medium mit einer 1:100-Verdünnung zu beimpfen (50 μl auf 5 ml) in einem 15 ml-Röhrchen. Diese wurden bei 28°C unter Schütteln auf eine näherungsweise O.D. von 0,6 wachsengelassen.
Die Expression des wtMS2CP-Gens wurde durch Zugabe von IPTG auf 0,4 mM induziert. Die Inkubation wurde bei 37°C unter Schütteln für 4 Stunden fortgesetzt. Eine 1-ml-Probe wurde entnommen, und die Zellen wurden durch Zentrifugation pelletiert. Die Pellets wurden in Cracking-Puffer bei 0,01 OD Einheit/μl resuspendiert, und die Proben wurden für 5 Minuten gekocht. Ein 6-μl-Aliquot einer jeden Probe wurde auf ein 4-20 % SDS-Polyacrylamidgel (Novex) geladen. Das Gel wurde mit Coomassie-Blau gefärbt, um die Proteine sichtbar zu machen. Wie anhand des Gelbilds (2) gezeigt, zeigen Spuren 8, 10, 11 und 12 die Herstellung des wtMS2CP. Diese herstellenden Kulturen erreichten eine höhere optische Dichte als diejenigen, die keine funktionellen Versionen des MS2CP-Gens in pT7-7 enthielten, was zeigt, daß MS2CP effektiv ohne einen sichtbaren Effekt auf das Wirtszellwachstum exprimiert werden kann.
Beispiel 2
Dieses Beispiel beschreibt die Konstruktion von zwei Mutanten-Versionen des MS2-Hüllproteingens.
Eine mutante Version des MS2-Hüllproteingens, in dem das Codon für den Valinrest an Position 29 zu einem Codon für Isoleucin verändert wurde, wurde mittels überlappender PCR unter Verwendung von Oligonucleotiden 1456-55 und 1456-56 (siehe Tabelle 1) konstruiert. Diese besondere Mutante wird hiernach als MS2CP-11 bezeichnet.
Eine mutante Version des MS2-Proteingens, in dem das Codon für den Cysteinrest an Position 101 in ein Codon für Arginin verändert worden war, wurde mittels überlappender PCR unter Verwendung von Oligonucleotiden 1456-61 und 1456-62 (siehe Tabelle 1) konstruiert. Diese besondere Mutante wird hiernach als MS2CP-14 bezeichnet.
Beispiel 3
Dieses Beispiel beschreibt die Konstruktion der pRIN-Plasmidvektoren, enthaltend wtMS2CP oder MS2CP-Mutanten zur Verwendung bei der Entwicklung des Translationsrepressionssystems. Die pRIN-Vektoren sind Multicopy-Vektoren (15 Kopien), basierend auf dem Plasmid pACYC184, Chang et al., J. Bacteriol., 134:1141-1156 (1978); Rose, Nucleic Acid Res., 16:355 (1988a).
Das pACYC184-Plasmid wurde mit Restriktionsenzymen XbaI und HindIII verdaut. Die Oligonukleotide 940-29 und 940-30 (siehe Tabelle 1) wurden konstruiert, um in diese Stellen zu ligieren, während neue einzigartige Stellen für eine spätere Verwendung eingeführt wurden. Insbesondere wurden die angelagerten Oligonukleotide in den geschnittenen pACYC184-Vektor kloniert, wodurch die XbaI- und HindIII-Stelle zerstört und einzigartige PstI- und SacI-Stellen ebenso wie eine zweite SphI-Stelle eingeführt wurden. Dieses Plasmid wurde dann mit Restriktionsenzym EagI verdaut, und die Oligonukleotide 941-43 und 941-44 (siehe Tabelle 1) wurden in den Vektor kloniert, was die EagI-Stelle zerstörte und eine einzigartige AatII-Restriktionsstelle einführte.
Das 1036-99-Fragment (siehe Tabelle 1), enthaltend das Wildtyp-MS2-Hüllproteingen, verknüpft mit dem nahG-Promoter, wurde PCR-konstruiert aus dem 3002-nahG-Klon, beschrieben in Beispiel 1, so daß eine SacI-Stelle stromauf von der Promotersequenz vorlag, und eine BamHI-Stelle am Terminus des Gens vorlag. Dieses Fragment wurde dann in den pA-CYC184-abgeleiteten Vektor (beschrieben im vorherigen Absatz) von SacI bis BamHI kloniert.
Die nahG-Promotersequenz wurde dann durch eine TET-Promotersequenz wie folgt ersetzt: ein synthetischer TET-Promoter wurde unter Verwendung von Oligonukleotiden 1016-20 und 1016-21 (siehe Tabelle 1) konstruiert. Der Promoter wurde unter Verwendung der TET-Promotersequenz konstruiert, die für pACYC 184 nativ war, mit der Veränderung des Einbaus einer NdeI-Stelle am natürlichen Start des TET-Gens. Der Promoter wurde in das Konstrukt von SacI bis NdeI eingebracht, so daß das wtMS2CP-Gens operabel mit dem TET-Promoter verknüpft war.
Ein DNA-Fragment, enthaltend die rrnB T1T2-Terminatorsequenzen enthielt, wurde mittels PCR unter Verwendung von Plasmid pKK223-3 konstruiert, Amman et al., Gene, 25:167-178 (1983) als eine Matrize und unter Verwendung von Oligonukleotiden 1036-6 und 1053-71 (siehe Tabelle 1). Dieses Fragment wurde so konstruiert, daß es Stellen für die Restriktionsenzyme AatII und AvaI an den Enden hatte. Der pACYC184-abgeleitete Vektor, der oben beschrieben ist, wurde mit diesen Enzymen geschnitten, und dieses Fragment wurde einligiert.
Eine synthetische Version eines Lambda-Promoter und die multiple Klonierstelle aus Vektor pAMG13 wurden von AatII bis BamHI ausgeschnitten. Der pACYC184-abgeleitete Vektor, der beschrieben ist, wurde dann mit diesen Enzymen geschnitten, und das Fragment von pAMG13 einligiert. Das resultierende Plasmid wurde als pRIN10 (wt) bezeichnet (3). Drei ähnliche pACYC184-abgeleitete Plasmide, einer, enthaltend den PS4-Promoter anstelle des Lambda-Promoter (bezeichnet als pRIN11 (wt)), einer, der den UVS-Lac-Promoter anstelle des Lambda-Promoter enthielt (bezeichnet als pRIN20 (wt)), und einer, der den Lux-Promoter enthielt (bezeichnet als pRIN22 (wt)), wurden ebenfalls konstruiert (3).
pRIN-Konstruktionen, enthaltend die MS2CP-11- und MS2CP-14-Mutanten wurden ebenfalls konstruiert. Fragmente der mutanten Formen, immer noch mit dem TET-Promoter verknüpft wurden erzeugt, um eine SphI-Stelle an dem Promoter-Ende und eine BamHI am Ende des MS2CP-Mutantengens zu haben. Die oben beschriebenen pRIN-Plasmide wurden mit BamHI und SphI geschnitten, und der Plasmidteil wurde von dem wtMS2CP-Fragment gelaufgereinigt. Die Mutantenfragmente wurden dann ligiert, indem die SphI- und BamHI-Stellen verwendet wurden. Die Konstruktionen, enthaltend die MS2CP-11-Mutante, wurden als pRIN10(11), pRIN11(11), pRIN20(11) und pRIN22(11) bezeichnet, und die Konstruktionen, enthaltend die MS2CP-14-Mutante, wurden pRIN10(14), pRIN11(14), pRIN20(14) und pRIN22(14) benannt.
Beispiel 4
Dieses Beispiel beschreibt die Klonierung des T7-Gen-1 in verschiedene pRIN-Plasmidvektoren und das darauffolgende Testen der Plasmidvektoren auf Expression und System-Undichtigkeit.
Das T7-Gen-1 wurde in die verschiedenen oben beschriebenen pRIN-Plasmide kloniert. Das T7-Gen-1-Gen wurde PCR-konstruiert unter Verwendung von Oligonukleotiden 949-1 und 949-2 (siehe Tabelle 1), dergestalt, daß es eine MS2-Hüllprotein-Erkennungssequenz hatte, die mit seiner Kodierungssequenz verknüpft war. Die verwendete Matrize war das Plasmid pGP1-2, Tabor and Richardson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 1074-1078 (1985). Das Gen wurde in die verschiedenen pRIN-Plasmide von XbaI bis BamHI kloniert. Die MS2CP-Mutanten wurden auf ihre Fähigkeit getestet, eine Multimerisierung zu inhibieren und damit zu einem Anwachsen hinsichtlich der effektiven Konzentration an Translationsrepressor zu führen. Ein weiterer Parameter, der untersucht wurde, war die Anwesenheit oder Abwesenheit einer Downstream-Box-Sequenz in Gen-1 (Oligonukleotid 1477-84) (siehe Tabelle 1) (es ist gezeigt worden, daß diese Sequenz die Translation durch Verstärkung der Bindung an das Ribosom erhöht; Sprengart et al., Nuc. Acids Res., 18(7):1719-1723 (1990).
Übernachtkulturen der verschiedenen Konstrukte wurden in 5 ml LB-Cam in 50 ml-Röhrchen bei 28°C wachsengelassen. Diese wurden verwendet, um frische 5 ml-Portionen an LB-cam in 15 ml-Röhrchen bei einer 1:100-Verdünnung zu beimpfen. Diese wurden alle in einen 28°C-Schüttler zurückgeführt. Die Proben wurden von den Kulturen genau vor der Induktion genommen, und der Induktionsschritt in diesem Fall beinhaltete die Zugabe von IPTG auf eine Endkonzentration von 0,4 mM. Die Inkubation von induzierten Kulturen wurde für 3 Stunden fortgesetzt, und 1 ml-Proben wurden entnommen. Alle Proben wurden durch Zentrifugation pelletiert, und die Pellets wurden in einem Cracking-Puffer resuspendiert. Nach Kochen für 5 Minuten wurde ein 6 μl-Aliquot von jedem Lauf auf einem 4-20%-SDS-Polyacrylamidgel (Novex) laufengelassen.
Das Protein wurde dann elektrophoretisch auf Nitrocellulose übertragen. Die Blots wurden über Nacht in Blotto Tween mit 2% fettfreier Trockenmilch blockiert, Harlow & Lane, Immunoblotting in Antibodies, A Laboratory Manual, Kapitel 12, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1988). Die Blots wurden für 1 Stunde mit einem aus Kaninchen stammendem polyklonalen Antikörper gegen T7-RNA-Polymerase sondiert. Nach Waschen wurden die Blots mit Esel-Anti-Kaninchen-Meerrettichperoxidase-konjugiertem Antikörper (Amersham) für 1 Stunde sondiert. Dies wurde gewaschen und mit ECL-Reagenzien (Amersham) behandelt und gegenüber einem Röntgenfilm exponiert. Das Exponieren fand für 15 Minuten statt, um die Empfindlichkeit zu maximieren. Der Film wurde unter Verwendung eines Kodak-Film-Entwicklers entwickelt.
4-6 sind Photographien von Western Blots, die die Ergebnisse der Undichtigkeits- und Expressions-Experimente zeigen, die mit verschiedenen Konstrukten durchgeführt wurden. 4 ist ein Blot einer stationären Übernachtkultur, 5 ist ein Blot einer exponentiell wachsenden Präinduktionskultur (preI), und 6 ist ein Blot einer IPTG-induzierten Kultur, die bei 28°C wachsengelassen wurde. Wie anhand der Bilder der Blots belegt, ist es klar, daß die Anwesenheit des Hüllproteins einen dramatischen Effekt auf die Undichtigkeit über Nacht hat (vgl. 4 und 5), und es gibt eine gewisse Verringerung hinsichtlich des Niveaus der Proteinakkumulation in den Zellen, die die größte Undichtigkeitskontrolle zeigen. Genauer ist das Signal stärker auf den linken Spuren der Blots und nimmt in den rechten Spuren als eine Funktion der Stärke und des Ausmaßes der Kontrolle ab, die durch die entsprechenden Systeme ausgeübt wird; der PS4-Promoter ist undichter als der UVS-Lac-Promoter; die Mutation der Downstream-Box verringert die Undichtigkeit, hat aber geringen Einfluß auf das Induktionsniveau für den PS4-Promoter; die MS2CP-Mutanten zeigen eine stärkere Kontrolle der T7-Gen-1-Undichtigkeit in Übernacht- und exponentiellen Kulturen als dies der Wildtyp tut; die Mutanten beeinflussen das Niveau der Akkumulation bei Induktion, wobei die stärker kontrollierten Übernacht-Kulturen (UV5 Lac) niedrigere Niveaus der RNA-Polymerase nach der Induktion aufweisen; und die MS2CP14-Mutante scheint einen größeren Effekt als die MS2CP11-Mutante zu haben, die zwischen wtMS2CP und MS2CP14 liegt.
Beispiel 5
Dieses Beispiel beschreibt den chromosomalen Einbau von "MS2-kontrollierten T7-Gen-1-Cassetten" in das Chromosom einer Wirtszelle und demonstriert dann die Verwendung von solchen Wirtsstämmen, um verschiedene Zielgene zu exprimieren, und zeigt die Ergebnisse von Tests, bei denen die Undichtigkeits- und Expressionseigenschaften der neu entwickelten Stämme mit kommerziell erhältlichen T7-RNA-Polymerase-enthaltenden Stämmen verglichen wird.
Eine „MS2-kontrollierte T7-Gen-1-Cassette" (enthält die Upstream-Terminator-Sequenzen, eine induzierbare Promoter-Sequenz, die MS2-Erkennungsstelle, das T7-Gen-1, das MS2-Hüllprotein-Gen (wtMS2CP oder MS2CP-11 oder MS2CP-14), und einen schwachen konstitutiven Promoter, z.B. TET) (siehe 7) wurde aus den verschiedenen pRIN-Plasmiden unter Verwendung der Restriktionsenzyme SphI und PpuMI ausgeschnitten und dann in einen speziell konstruierten M13-Vektor MMEbg kloniert, Blum et al., J. Bacteriology, 171(1):538-546 (1889); Micheals, M.L., Gene, 93:1-7 (1990) für eine ortsspezifische Integration in das Wirtschromosom. Verschiedene Cassetten, enthaltend entweder wtMS2CP-11, MS2CP11 oder MS2CP-14 wurden erhalten.
Der Einbau findet durch einen erzwungenen Rekombinationsmechanismus statt. Als erstes wurden die Oligonukleotide 1553-73 und 1553-74 (siehe Tabelle 1) in die BamHI- und NotI-Stellen von MMebg ligiert. Diese Oligonukleotide führen einzigartige SphI- und PpuMI-Stellen in den Vektor ein. Die „MS2-kontrollierte T7-Gen-1-Cassette" wurde dann in die SphI- und PpuMI-Stellen ligiert. Die Ligationen wurden dann in XL1-Blue-Zellen transformiert, indem man die Zellen in 1 ml SOC brachte und 150 μl einer SCHEIN-Ligation („MOCK ligation") und 150 μl und 30 μl von Insert-Ligationen mit 300 μl XL1-Blue Übernacht-Kultur + 3,5 ml LB + 0,8% Top Agar ausplattierte. Die Mischung wurde über LB-Platten gegossen und bei 37°C über Nacht inkubiert. Die Plaques wurden in 100 μl 1 X TE aufgenommen.
Die Übernacht-Kulturen wurden begonnen, bevor ein PCR-Screening mit 70 μl resuspendiertem Phagen von Plaques und 200 μl XL1-Blue-ON in 5 ml LB stattfand. Diese Kulturen wurden bei 37°C über Nacht geschüttelt. Jeder Plaque wurde mittels PCR gescreent. 2 μl des resuspendierten Plaques in einer 20 μl PCR-Reaktion wurde verwendet. Oligonukleotide 305-3 und 305-14 (intern für das T7-Gen-1) (siehe Tabelle 1) wurden für dieses Screening verwendet. Die positiven Klone wurden durch Laufenlassen von Reaktionen auf einem 1,0% Agarosegel identifiziert. Ein 1 ml-Aliquot von jeder Übernacht-Kultur wurde herunterzentrifugiert, und 800 μl Überstand mit Phage in einem Eppendorfröhrchen aufbewahrt. Ein 200 μl-Aliquot von jedem Überstand wurde dann bei 70°C für 20 min inkubiert. 100 μl des wärmebehandelten Phagen wird dann zu 500 μl eines autotrophen K-Stammes von E.coli mit einem Genotyp von Lac i^Q (bezeichnet als F'tet/GM120-Zellen) von einer Übernacht-Kultur zugegeben. (GM120 hat die ATCC-Hinterlegungs-Nr. 55764). Diese Proben wurden bei 37°C für ungefähr 1 Stunde inkubiert. 25 μl Kontroll-F'tet/GM120, 25 μl Wärme behandelter Phagen allein und 25 μl einer 1:10-Verdünnung von jeder Kreuzung wurden dann auf LB+Kn⁴⁰-Platten ausplattiert. Die Platten wurden dann bei 37°C über Nacht inkubiert. Die aufgereinigten Kolonien, die aus der Kreuzung (oder Lysogenisierung) resultierten, wurden zweimal auf LB+Kn⁴⁰ Platten ausgestrichen und bei 37°C über Nacht inkubiert. Die Kolonien wurden dann zweimal in 0,3% Ochsengalle und LB subkultiviert und dann bei 37°C über Nacht geschüttelt. Die Zellen wurden dann auf LB-Platten ausgestrichen, zusammen mit einer Replica-Plattierung von LB zu LB+Kn, um die Kanamycin-empfindlichen Kolonien zu identifizieren (der Phage sollte nicht länger in den Kolonien vorhanden sein, die Kanamycin-empfindlich sind).
Ein PCR-Screening wurde dann durchgeführt, um auf eine Insertion in das Chromosom zu prüfen, wie folgt: eine Kolonie wurde von einer Platte genommen und dazu verwendet, um 20 μl einer PCR-Mischung zu beimpfen (5 ml LB werden ebenfalls beimpft, unter Verwendung derselben Spitze, um für eine Übernacht-Kultur verwendet zu werden, wenn ein Positiver identifiziert wurde). 15 μl einer jeden PCR-Probe wurde auf einem 1,0% Agarosegel laufen gelassen, um auf Positive zu überprüfen. Wenn die Positiven anhand der Größe auf dem Gel identifiziert wurden, wurden die entsprechenden Übernacht-Kulturen begonnen, indem bei 37°C geschüttelt wurde. Diese wurden dann auf LB-Platten ausplattiert und bei 37°C über Nacht inkubiert.
Um die Zellen von dem F'-Faktor zu heilen, wurden Kulturen aus einzelnen Kolonien von der Platte in 5 ml LB begonnen, wobei bei 37°C für 4 Stunden geschüttelt wurde. Ein veröffentlichtes Protokoll zum Heilen unter Verwendung von Acridin-Orange wurde dann befolgt, Miller, Experiments in molecular genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, S. 104-106 (1972). Im wesentlichen plattiert man Zellen auf LB und macht eine Replica-Plattierung auf LB+Tetracyclin. Die Tetracyclin-empfindlichen Zellen werden als F'-minus isoliert. Ubernacht-Kulturen der Kolonien von diesen Platten werden begonnen und dann mit M13 mp18 reinfiziert, um sicherzustellen, daß der F'-Faktor nicht länger in den Zellen vorhanden ist. 300 μl an Ubernacht-Kulturen wird dann mit Top-Agar gemischt und mit 2μl von M13 mp18-Phagenstamm betupft. Es sollten keine Plaques vorhanden sein. Zwei Stämme, die unter Verwendung dieses Protokolls konstruiert wurden, wurden als EE11-11M (PS4-Promoter) und als EE11-20 (UVS-Lac-Promoter) bezeichnet.
Die Undichtigkeits- und Expressionseigenschaften von EE11-11M und EE11-20 wurden mit dem kommerziell erhältlichen BL21 (DE3)-Stamm (zuvor beschrieben) unter Verwendung der Produktexpression von Gen NT-3 oder von Gen BDNF als einen Marker. NT-3 (oder BDNF) ist in dem kommerziell erhältlichen pET22b-Vektor vorhanden (Novagen, Madison, WI), der ebenfalls eine Lac-i-Stelle zwischen dem T7-Promoter und dem Gen von Interesse hat und ein Lac i^Q-Gen trägt, um eine Undichtigkeit zu verringern. Ebenso verglichen wurden BL21 (DE3),
enthaltend pLysS als einen sekundären Vektor gg. EE11-11M,
enthaltend pLysS als einen sekundären Vektor gg. EE11-20,
enthaltend pLysS als einen sekundären Vektor (wie zuvor festgestellt, trägt pLysS das T7-Lysozym-Gen, das die T7-RNA-Polymerase inhibiert und eine empfohlene Weise darstellt, um die Undichtigkeit zu verringern). Schließlich wurde ein pAMG25-Plasmid, das das BDNF-Gen enthielt, ebenfalls verwendet, um BL21 (DE3) gg. EE11-20 zu vergleichen.
Insbesondere wurden Übernacht-Kulturen (5 ml) von LB + Antibiotikum (Kn⁴⁰ oder Cm³⁰) in 50 ml-Falcon-Röhrchen begonnen, und diese Kulturen wurden bei 28°C geschüttelt. Frische Röhrchen von 5 ml LB + Antibiotikum in 14 ml Glasröhrchen wurden mit 1:100-Verdünnung der Übernacht-Kultur beimpft. Die Röhrchen wurden bei 28°C geschüttelt, bis sie eine OD₆₀₀ = ~0,8 erreichten. Die Übernacht-Kulturen wurden weiter bei 28°C geschüttelt, bis zum Abschluß des Experiments.
Aliquots von jeder Probe wurden vor einer Induktion genommen. Die Kulturen wurden durch die Zugabe von 20 μl 100 mM IPTG induziert (was eine 0,4 mM Endkonzentration für IPTG ergab). Die induzierten Kulturen wurden bei 28°C unter Schütteln für 4 Stunden inkubiert. Eine 1 ml-Probe der Kultur wurde entnommen und in einem 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen bei 15000 rpm (bei 4°C) (Tomy MTX-160) für 5 Minuten herunterzentrifugiert. Der Überstand wurde dekantiert und das Pellet behalten. Die Pellets wurden dann in Cracking-Puffer bei 0,01 OD Einheit/μl resuspendiert. Die Proben wurden dann auf 100°C in einem Wärmeblock für 5 Minuten erhitzt, dann für 2-3 Minuten abgekühlt und dann wurden 6 μl einer jeden Probe auf ein 4-20% Tris-Glycin-SDS-Polyacrylamidgel in 1X Tris-Glycin-Laufpuffer mit Zugabe von 2% SDS geladen. Das Gel wurde bei 150 V für 1,3 Stunden laufengelassen. Das Gel wurde mit Coomassie-Blau gefärbt, um das Protein sichtbar zu machen.
Wie in 8 dargestellt, die NT-3 als Zielgen verwendet, hat der EE11-20-Stamm keine nachweisbare Undichtigkeit in weder der Übernachtkultur (ON) noch vor der Induktion (preI), während BL21 (DE3) dies deutlich hat. Die Induktionsniveaus für NT-3 sind vergleichbar zwischen den Stämmen. Bei Betrachtung von 9, die BDNF als ein Zielgen verwendet, zeigt EE11-20 wiederum keine Produkt-Undichtigkeit vor der Induktion, während BL21 (DE3) dies deutlich tut. EE11-20 hat verringerte Niveaus an BDNF in pET22b im Vergleich mit BL21 (DE3). Bei Betrachtung von 10 sind die Niveaus von BDNF, das unter Verwendung des pAMG25-Vektors emprimiert wird, ähnlich für EE11-20 und BL21 (DE3). Für jedes der Experimente, die in den 8-10 dargestellt sind, verringerte die Anwesenheit von pLysS die Undichtigkeit, inhibierte aber auch die Produktexpression (wie zuvor in der Literatur berichtet worden war). Schließlich wird bei Betrachtung von 11 und 12 gezeigt, daß EE11-11M keine Übernacht- oder Präinduktions-Undichtigkeit aufweist, aber vergleichbare Niveaus an Protein erzeugt im Vergleich mit BL21 (DE3). Darüberhinaus ist der EE11-11M-Stamm dem EE11-20-Stamm dahingehend überlegen, daß die Anwesenheit von lac i auf dem Vektor keinen Effekt auf die Proteinakkumulation hat und in der Tat höhere Niveaus von eigenen Produkten ergeben kann (z.B. 8 und 12).
Es ist anhand dieser Resultate klar, daß zusätzliche Elemente, die eingeführt worden sind, um die Undichtigkeit in den kommerziell erhältlichen Stämmen zu kontrollieren, nicht notwendig sind in den Stämmen, die bei der vorliegenden Erfindung entwickelt worden sind, und die Stämme der vorliegenden Erfindung zeigen sowohl eine größere Kontrolle der Undichtigkeit als auch vergleichbare Niveaus der Produktexpression nach Induktion.
BEISPIEL 6
Um die Wirkung zu bestimmen, die die Anwesenheit von MS2-Hüllprotein auf die Expression eines heterologen Proteins bei einer Fermentation hoher Dichte haben kann, wurden mehrere Produkte getestet. Anfänglich gaben die Bedingungen diejenigen Bedingungen wieder, die für einen Schüttelkolben auf kleinem Maßstab verwendet wurden, eine Induktion bei niedriger optischer Dichte. Eine exponentielle Kultur (optische Dichte = 1,4) von EE11-11M, enthaltend GCSF in pAMG25, wurde verwendet, um einen 10-Liter-Fermenter zu beimpfen. Dies wurde bei 28°C auf eine optische Dichte von 0,8 wachsen gelassen und durch die Zugabe von IPTG induziert. Die Kultur ließ man für zusätzliche 10 Stunden wachsen, nachdem die Induktion eine finale optische Dichte von 12 erreicht hatte und Proben jede Stunde entnommen wurden. Wie in 13 gezeigt, gibt es keine nachweisbare Präinduktions-Undichtigkeit des GCSF (Spur 1), und das Protein wird fortwährend durch die ganze Induktion produziert.
Eine zweite Fermentation wurde durchgeführt (unter Verwendung von Leptin in pAMG25), um die Leistung des EE11-11M-Stammes bei hoher Dichte zu testen. Eine exponentielle Impfkultur (optische Dichte = 1,32) wurde verwendet, um eine 10-Liter-Fermenatation zu beginnen. Dies wurde auf eine optische Dichte von 10 bei 28°C wachsen gelassen. Die Kultur wurde dann durch Zugabe von IPTG induziert. Das Wachsen wurde für 6 Stunden fortgesetzt, und die Kultur erreichte eine finale optische Dichte von 41. Wie in 14 dargestellt, gibt es keine offensichtliche Undichtigkeit vor der Induktion, und Leptin wird durchgehend während der gesamten Induktionszeit produziert.
Diese Experimente zeigen, daß die Anwesenheit des MS2-Hüllproteins keine negative Auswirkung auf eine Fermentation auf großem Maßstab oder mit hoher Dichte hat.
BEISPIEL 7
Dieses Beispiel beschreibt die Verwendung des MS2-Systems, um verschiedene T7-early-Gene zu klonieren. Die T7-Gene werden alleine kloniert und als ein Operon.
Die 0.4- und 0.6-early-Gene vom Bakteriophagen T7 wurden PCR-amplifiziert unter Verwendung von T7-356-DNA, (Studier et al., J. Mol. Biol., 135 : 917-937 (1979); Dunn & Studier, J. Mol. Biol., 166 : 477-535 (1983) als ein Templat. Jedes Gen wurde PCR-konstruiert, so daß es eine EcoRI-Stelle angrenzend an das erste Kodon des Gens hat (Oligonukleotide 1049-5 und 1049-7) (siehe Tabelle 1) und wurde in pAMG13 kloniert, das modifiziert wurde, so daß es eine MS2-Hüllproteinerkennungsstelle und einen Polyhistidin-Tag im Leserahmen mit der multiplen Klonierungsregion enthielt (Oligonukleotide 1035-30 und 1035-31) (siehe Tabelle 1). Die Oligonukleotide 1482-18 und 1266-69 (siehe Tabelle 1) wurden für das 0.4-Gen verwendet, und die Oligonukleotide 1266-71 und 1443-41 (siehe Tabelle 1) für das 0.6-Gen.
Das MS2-Hüllprotein wurde in trans von pRIN10 bereitgestellt. Elektrokompetente Zellen, enthaltend pRIN10, wurden durch die Early-Gen-Ligationen mit pAMG13 transformiert. Positive Klone wurden anhand von PCR-Screening-transformanten Kolonien identifiziert. Positive Kulturen wurden über Nacht als Starterkulturen für Expressionsexperimente wachsen gelassen. Frische Röhrchen von LB Kan/Cam wurden mit einer 1:100-Verdünnung beimpft (50 μl auf 5 ml) und bei 28°C unter Schütteln auf eine O.D. von näherungsweise 0.7 wachsengelassen. Diese wurden durch Verschiebung in einen 42°C-Schüttler induziert, und die Inkubation wurde bis zu 4 Stunden fortgesetzt. Aliquots von 1 ml wurden entnommen, und die Zellen wurden pelletiert. Die Pellets wurden in Cracking-Puffer bei 0,01 OD Einheit/μl resuspendiert und für 5 Minuten gekocht. Diese wurden auf Eis gekühlt, und ein 6-μl-Aliquot von jedem wurde auf einem 10-27% SDS-Polyacrylamidgel laufen gelassen.
Das Protein wurde dann elektrophoretisch auf Nitrocellulose übertragen. Die Blots wurden über Nacht in Blotto-Tween mit 2% fettfreier Trockenmilch blockiert. Die Blots wurden für eine Stunde mit einem aus Kaninchen stammendem polyklonalen Antikörper auf ein synthetisches Peptid, basierend auf der erwarteten Proteinsequenz, sondiert. Dieses Serum wurde 1 zu 2000 verdünnt. Nach Waschen wurden die Blots mit Esel-anti-Kaninchen-Meerrettichperoxidase-konjugiertem Antikörper (Amersham) für eine Stunde sondiert. Dies wurde gewaschen und mit ECL-Reagenzien (Amersham) behandelt und einem Röntgenfilm ausgesetzt. Das Aussetzen erfolgte für 4 Minuten. Der Film wurde entwickelt unter Verwendung eines Kodak-Film-Prozessors. Wie in 15 gezeigt, wurde eine Expression des 0.4-Gens unter Verwendung des MS2-kontrollierten Systems erhalten. In ähnlicher Weise wurde die Expression des 0.6-Gens erhalten (16).
Zwei Versionen des 0.7-Gens wurden konstruiert: 1) Oligonukleotide 1053-66 und 1266-73 (siehe Tabelle 1) wurden verwendet, um die Volllängenversion des Gens zu konstruieren; und 2) Oligonukleotide 1053-66 und 1266-72 (siehe Tabelle 1) wurden verwendet, um eine trunkierte Version des Gens zu konstruieren. Die Trunkierung beruhte auf einer mutanten Version, die beim Versuch, die Volllängenversion ohne eine MS2-Stelle in einem Einzelkopie-Sektor zu klonieren, isoliert worden war, und hat eine ochre-Mutation bei Codon 242. Dieser frühe Stopp ist ähnlich einer Mutation, die aus dem Phagen in Codon 243 isoliert worden ist; Studier, F.W., J. Mol. Biol., 79: 227-236 (1973), und es wurde gezeigt, daß diese Mutante ihre Wirts-Abschaltaktivität verloren hatte, aber die Kinase-Aktivität beibehielt, Michalewicz and Nicholson, Virology, 186: 452-462 (1992).
Ein Operon der Early-Gene wurde ebenfalls mittels sequentieller PCR konstruiert. Oligonukleotide 1511-32, 1539-60, 1803-86, 1319-59, 1577-83, 1577-84, 1539-65, 1066-72 und 1435-93 (siehe Tabelle 1) wurden so konstruiert, daß sie eine Sequenz hatten, die mit den angrenzenden Genen zu jedem einzelnen Early-Gen überlappte, und um eine MS2-Stelle angrenzend an die Startstelle von jeder kodierenden Region einzuführen. Jedes Gen wurde einzeln PCR-amplifiziert und unter Verwendung dieser Oligonukleotide. Die Early-Gene wurden dann sequentiell zusammengefügt. Die 0.4- und 0.5-Gene wurden zuerst durch Verwendung von beiden als Templat und nur unter Verwendung der äußeren Primer verknüpft. Dies ergab ein 0.4-0.5-Fragment, das dann als ein Halb-Templat mit dem 0.3-Fragment verwendet wurde usw., bis ein vollständiges 0.3-0.7-Konstrukt, bezeichnet als 3-7t-Operon, erzeugt wurde (SEQ ID NO: 2) (17). Um weiter die Undichtigkeit der Early-Gene in dem Operon zu reduzieren, wurden die „Downstram-box"-Sequenzen in den 0.3-, 0.6- und 0.7-Genen mutiert. Die meisten der Basenveränderungen, die gemacht wurden, um die „Downstream-box"-Homologie zu verringern, waren stille Mutationen, obwohl eine konservative Aminosäuresubstitution in jedem der Gene stattfand.
BEISPIEL 8
Dieses Beispiel beschreibt die Ergebnisse von Experimenten, bei denen das 3-7t-Operon, das in Beispiel 7 konstruiert und beschrieben worden war, verwendet wurde, um die Expression von heterologen Proteinen in E.coli zu verbessern. Die Expressionseigenschaften der folgenden System wurden verglichen: 1) NDF-alpha/beta, kloniert in pAMG33 und exprimiert in E.coli GM221, oder mit 3-7t-Operon in pRIN10, exprimiert in E.coli GM221, 2) 301-941 TP2 kloniert in pAMG22 und in E.coli GM221 exprimiert oder mit 3-7t-Operon in pRIN10 und in E.coli GM221 exprimiert.
Für jedes Experiment wurden einzelne Kolonien von Platten genommen und in zwei 5 ml-Portionen von LB mit Kanamycin oder LB mit Kanamycin und Chloramphenicol aufgezogen. Die Röhrchen schüttelten über Nacht bei 28°C. Vier-Liter-Kolben enthaltend 1 l 2XYT mit Kanamycin oder 2XYT mit Kanamycin und Chloramphenicol wurden angesetzt. Diese wurden mit den 10 ml der Starterkultur beimpft. Diese wurden unter Schütteln bei 28°C auf eine O.D. von 0,8 wachsen gelassen. Die Kulturen wurden dann auf 37°C unter Schütteln für eine Stunde gebracht. Sie wurden dann zurück auf 28°C gebracht und auf 0,4 mM mit IPTG gebracht. Diese wurden für zusätzliche 3 Stunden wachsen gelassen, wobei Proben jede Stunde entnommen wurden. Die 1 ml-Proben wurden für 5 Minuten bei 15K und 4°C zentrifugiert. Der Überstand wurde dekantiert, und das Pellet wurde eingefroren. 500 μl einer jeden Kultur wurden in 500 μl 2XYT verdünnt, und die optische Dichte wurde gemessen. Die Pellets wurden dann aufgetaut und in 0,01 OD Einheit/μl-Crackingpuffer resuspendiert. 6 μl dieser aufgebrochenen Pellets wurden dann auf ein SDS-Polyacrylamid-Gel (4-20%) geladen. Nach Laufenlassen bei 150V für 1,3 Stunden wurden die Gele mit Coomassie-Blau gefärbt, um die Proteine sichtbar zu machen.
Wie in 18 gezeigt, schützt die Anwesenheit der T7-Early-Proteine NDF-alpha/beta vor Proteolyse. Wenn keine T7-Early-Proteine vorhanden sind, wird NDF-alpha/beta durch eine Stunde Induktion erzeugt (Spur 2), ist aber nicht länger nachweisbar mit 2 Stunden Induktion (Spur 3). Wenn die T7-Early-Proteine vorhanden sind, ist mehr NDF-alpah/beta nachweisbar, und es akkumuliert fortwährend während der gesamten drei Stunden Induktion (Spuren 7-9).
Wie in 19 gezeigt, erzeugt die Wirtszelle keine 301-941 TP2 nach der Induktion in der Abwesenheit der T7-Early-Proteine (Spur 5). Wenn die T7-Early-Proteine vorhanden sind, wächst die Produktion des Proteins nach Induktion dramatisch an (Spuren 2 und 3).
BEISPIEL 9
Dieses Beispiel beschreibt die Konstruktion und das Testen einer Reihe von prokaryotischen -Wirtsstämmen, die konstruiert worden sind, um verschiedene Konzentrationen an MS2CP zu erzeugen. Die Wirtsstämme haben das MS2CP mit einem modifizierten TET-Promoter verknüpft, der in ihr Chromosom eingeführt ist.
Konstruktion der Stämme: Eine Kassette der MS2CP-14-Variante, verknüpft mit dem TET-Promoter, wurde unter Verwendung von Oligonukleotiden 1674-96 und 1674-97 konstruiert (Siehe Tabelle 1). Diese Kassette wurde in die NotI- und BamHI-Stellen von MMebg einkloniert, um MMebg-MS2CP-14 zu erzeugen. Der TET-Promoter wurde dann in Stufen optimiert: 1) die -10-Region wurde auf Konsensus gebracht durch überlappende PCR. Die mutanten Hälfen wurden unter Verwendung von Oligonukleotiden 1011-96 mit 1784-89 und 1758-66 mit 1674-97 konstruiert. Die Hälften wurden dann unter Verwendung von Oligonukleotiden 1674-96 und 1674-97 mittels PCR zusammengebracht. Dies wurde dann in MMebg aus NotI bis BamHI umkloniert, um MMebg-MS2CP14 (-10) zu ergeben; 2) Die -35-Region wurde auf Konsensus gebracht, um einen vollständig optimierten TET-Promoter zu erzeugen. Dies wurde wiederum durchgeführt unter Verwendung einer Halbreaktion-PCR, bei der MMebg-MS2CP14 (-10) als Templat diente. Die mutanten Hälften wurden unter Verwendung von Oligonukleotidpaaren 1011-96 mit 1784-88 und 1803-15 mit 1674-97 konstruiert (siehe Tabelle 1). Die beiden Hälften wurden dann unter Verwendung von Oligonukleotiden 1674-96 und 1674-97 mittels PCR zusammengebracht. Dies wurde in MMebg aus NotI bis BamHI umkloniert, um MMebg-MS2CP14 zu ergeben (vollständig optimiert). MMebg-MS2CP14 (-10) und MMebg-MS2CP14 (vollständig optimiert) zeigten beide eine erhöhte Produktion von MS2-Hüllprotein gegenüber dem Wildtyp-Promoterkonstrukt (geringe Zunahme für den (-10) und eine sehr große Zunahme für den vollständig optimierten Typ).
Um mutante Promoterversionen zu konstruieren, die Konzentrationen an MS2-Hüllproteinintermediat an die zuvor beschriebenen Mutanten liefern würden, wurde eine Strategie zum Randomisieren der Sequenz der Ribosomenbindungsstelle (RBS) verwendet. Die Sequenz der Promoterregion, enthaltend die -10-Konsensusveränderung und das MS2-Hüllproteingen bis zu der KpnI-Stelle, wurden verwendet, um Oligonukleotide 1822-01, 1822-02 und 1863-81 zu konstruieren. Diese Oligonukleotide wurden phosphoryliert und mit Oligonukleotiden 1821-99, 1822-03, 1822-04 und 1822-05 angelagert. Das Ligationsprodukt diente dann als ein PCR-Templat unter Verwendung von Oligonukleotiden 1822-06 und 1822-07. Dieses Fragment, das jetzt hinsichtlich der Ribosomenbindungssequenz randomisiert war, war in der Lage, von NotI bis BamHI ligiert zu werden.
Um den Effekt der Ribosomenbindungsstellenveränderungen auf die Proteinproduktion zu bestimmen, wurde ein beta-Galaktosidase-Assay verwendet. Insbesondere wurde eine MS2CP-14-LacZ-Fusion konstruiert, indem ein LacZ-Fragment mit Oligonukleotiden 1803-52 und 1803-53 erzeugt und dies in MMebg-MS2CP-14 von KpnI bis BamHI ligiert wurde. Dieses Konstrukt enthält den Wildtyp-TET-Promoter, verknüpft mit dem Anfang des MS2-Hüllproteingens, das im Leserahmen mit dem Beta-Galactosidase-Gen LacZ fusioniert ist. Die randomisierten RBS-Fragmente, die in dem vorherigen Absatz beschrieben worden sind, wurden dann in dieses Konstrukt von NotI bis KpnI ligiert. Die anfängliche Fusion und die randomisierten Fusionsligationen wurden in das Chromosom gemäß dem in Beispiel 5 beschriebnen Protokoll integriert. Der Wirtsstamm, der verwendet wurde, war F'tet/393/ElacZ145N, der in der Beta-Galactosidase-Aktivität defizient ist. Aufgelöste Lysogene wurden auf Beta-Galactosidase-Aktivität getestet, wie beschrieben, Miller, Experiments in molecular genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, S. 352-355 (1972).
Eine Reihe von Mutanten mit verschiedenen Aktivitätsniveaus wurden identifiziert. Drei dieser Mutanten, Zahlen 1, 3 und 15, wurden für die Produktion von Stämmen ausgewählt. Die MMebg-MS2CP-14-LacZ, die für diese bestimmten Stämme der Ausgangspunkt waren, wurden von KpnI bis BamHI verdaut, um die LacZ-Fusion zu entfernen. Das MS2CP-14-Gen wurde dann durch Ligation des KpnI- bis BamHI-Fragments in diese Vektoren regeneriert. Die Stämme wurden von diesen drei Mutanten und dem MMebg-MS2CP-14 (vollständig optimiert) durch Integration in Wirtsstamm 393 konstruiert. Die resultierenden Stämme wurden GM315 (Mutante 1), GM320 (Mutante 3), GM340 (Mutante 15) und GM350 (vollständig optimiert) genannt.
Testen der Stämme, um MS2CP zu erzeugen. Die Fähigkeit dieser Stämme, MS2-Hüllprotein zu erzeugen, wurde mittels Western-Analyse von exponentiellen Kulturen bestimmt. Kolonien von jedem Stamm wurden von Platten genommen und dazu verwendet, um 5 ml LB zu beimpfen. Diese wurden unter Schütteln bei 30°C auf eine optische Dichte von 0,7 wachsen gelassen. Ein-ml-Proben wurden genommen. Alle Proben wurden mittels Zentrifugation pelletiert und die Pellets wurden in Cracking-Puffer resuspendiert. Nach Kochen für 5 Minuten wurde ein 6 μl-Aliquot von jedem auf einem 4-20% SDS-Polyacrylamidgel (Novex) laufen gelassen. Das Protein wurde dann elektrophoretisch auf Nitrocellulose übertragen. Die Blots wurden über Nacht in Blotto-Tween mit 2% fettfreier Trockenmilch blockiert; Harlow & Lane, Immunoblotting in Antibodies, A Laboratory Manual, Kapitel 12, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1988). Die Blots wurden für eine Stunde mit einem aus Kaninchen stam menden polyklonalen Antikörper auf MS2-Hüllprotein sondiert. Nach Waschen wurden die Blots mit Esel-anti-Kaninchen-Meerrettichperoxidase-konjugierten Antikörper (Amersham) für 1 Stunde sondiert. Dies wurde gewaschen und mit ECL-Reagenzien (Amersham) behandelt und einem Röntgenfilm ausgesetzt. Der Film wurde unter Verwendung eines Kodak-Film-Entwicklers entwickelt. Wie in 20 gezeigt, ist das Niveau von MS2-Hüllprotein, das passiv während des Log-Phasenwachstums exprimiert wird, gegenüber dem Hintergrund in niedrigen Niveaus in GM315 und GM320 nachweisbar und wächst beträchtlich in GM340 und GM350.
Klonierung von heterologen Genen unter Verwendung der Stämme. Bei Verwendung von herkömmlichen Techniken zeigten sich N-terminale His-Tag-Fusionen des ns5b-Gens von Hepatitis C (die Hep C-Polymerase) als sehr schwierig zu klonieren. Wenn Vollängenversionen des Gens isoliert wurden, enthielten sie Mutationen, die zu frühen Translationsstopps führten oder die in dem ATG waren und eine Translationsinitiation insgesamt verhinderten. Um die Klonierung dieses Gens zu erleichtern, wurde eine MS2-Erkennungsseqeunez damit verknüpft, und die Ligationen wurden verwendet, um zuerst den Stamm GM350 zu transformieren. Volllängen-Inserts wurden nachgewiesen, sequenziert und als korrekt bestimmt.
Das rekombinante mit einem His-Tag versehene ns5b-Gen, das aus GM350 erhalten wurde, wurde dann in pAMG21 gebracht und dazu verwendet, um GM221, GM315 und GM320 zu transformieren (GM221 enthält kein MS2-Hüllprotein, während GM315 und GM320 niedrigere Niveaus als GM350 erzeugen). Es wurde gefunden, daß das Gen in allen drei Zelllinien stabil war.
Die Fähigkeit der verschiedenen Stämme, die mit einem His-Tag versehene hepC-Polymerase zu erzeugen, wurde dann bestimmt. Übernachtkulturen wurden verwendet, um 50 ml 2XYT in 250 ml-Erlenmeyerkolben bei einer 1-100-Verdünnung zu beimpfen. Diese wurden unter Schütteln bei 30°C auf eine optische Dichte von 0,6 wachsen gelassen. Der pAMG21-Vektor enthält einen Lux-Promoter, und so wird die Produktion der hepC-Polymerase durch die Zugabe eines Autoinducers bei einer Endkonzentration von 30 ng/ml erzielt. Die Inkubation wird für 4 Stunden fortgesetzt, und es werden Proben entnommen. Die Zellen werden mittels Zentrifugation pelletiert. Die Pellets wurden in 10 ml PBS resuspendiert, und dies wurde microverflüssigt („microfluidized"). Die Proben wurden zentrifugiert, um die löslichen und unlöslichen Fraktionen zu trennen. Diese wurden mit Cracking-Puffer gemischt, und Proben wurden auf 4-20% SDS-Gelen laufen gelassen. Nach Laufenlassen bei 150V für 1,3 Stunden, wurden die Gele mittels Coomassie-Blau gefärbt, um die Proteine sichtbar zu machen.
Wie in 21 gezeigt, wird die hepC-Polymerase in allen drei Stämmen produziert. Der Hauptteil des produzierten Proteins ist unlöslich. Es kann eine gewisse höhere Expression in den MS2-Hüllprotein-enthaltenden Stämmen geben. Dieses Beispiel zeigt daher eine Weise, in der diese Stämme verwendet werden können: Der stärkste Produzent, GM350, wird verwendet, um das instabile Gen anfänglich zu klonieren; und, wenn eine stabiler Klon erhalten und als korrekt bestätigt worden ist, kann er in die verbleibenden Stämme transformiert werden, und die Fähigkeit, das Proteinprodukt zu erzeugen, und die anhaltende Stabilität des Gens kann bestimmt werden.
Beispiel 10
Dieses Beispiel beschreibt die Konstruktion des pAMGuvxs-Plasmidvektors, des pAMGX-Plasmidvektors und der T4-Operon-pRIN-Plasmidvektoren, die verwendet werden, um das T4-middle-Promoter-basierende System zu entwickeln.
Bakteriophagen-T4-middle-Promoter wurden synthetisch unter Verwendung der veröffentlichten Sequenzen von PuvsX und PX konstruiert, Hinton, D.M., J. Biol. Chem., 266 (27): 18034-18044 (1991) (uvsX: Oligonukleotide 1084-66 und 1084-67 (siehe Tabelle 1), X: Oligonukleotide 1084-68 und 1084-69) (siehe Tabelle 1). Der PuvsX-Promoter wurde rekonstruiert, um die NdeI-Stelle zu entfernen, die er enthält (Oligonukleotide 1202-11 und 1550-85) (siehe Tabelle 1). Jedes Konstrukt wurde so konstruiert, daß es AatII- und ClaI-Restriktionsstellen hatte. Die vollständige Basensequenz des PuvsX-Promoterkonstrukts wird in 22 dargestellt, und die vollständige Gensequenz des PX-Promoterkonstrukts wird in 23 dargestellt. Das Plasmid pAMG13 wurde mit AatII und ClaI verdaut, um den synthetischen Lambda-Promoter zu entfernen, und der Vektor wurde Gel-aufgereinigt. Die T4-middle-Promoter wurden dann jeder mit diesem Plasmid ligiert, um Plasmidvektoren pAM-GuvsX und pAMGX zu erzeugen.
Das motA/asiA-Operon wurde so konstruiert, daß jedem Gen eine MS2-Hüllprotein-Erkennungssequenz voranging. Die publizierte Sequenz von motA, Uzan et al., Mol. Microbiol., 4(9): 1487-1496 (1990), und asiA, Orsini et al., Jour. Bacteriology, 175(1): 85-93 (1993) wurden zur Konstruktion verwendet. Am Beginn des Fragments war eine XbaI-Stelle, 2XYT verdünnt, und die optische Dichte wurde aufgezeichnet. Die Pellets wurden dann aufgetaut und in 0,01 OD Einheit/μl Cracking-Puffer resuspendiert. 6 μl dieser aufgebrochenen und am Ende war eine XhoI-Stelle (Oligonukleotide 1084-63, 1528-19, 1528-20 und 1703-53) (siehe Tabelle 1). Dieses Fragment wurde mit XbaI und XhoI verdaut und dann mit mehreren pRIN-Plasmidvektoren ligiert, um zum Beispiel den T4-Operon-pRIN10-Plasmidvektor, den T4-Operon-pRIN11-Plasmidvektor etc. bereitzustellen.
Beispiel 11
Dieses Beispiel beschreibt das Testen der pAMGuvxs, pAMGX und T4-Operon-pRIN-Plasmidvektoren, die in Beispiel 10 hergestellt und beschrieben sind. Insbesondere wurden Expressionsexperimente durchgeführt, um die Fähigkeit der Systeme zu testen, eine Undichtigkeit zu verhindern und eine Expression des Produktgens zu ermöglichen. Die Expressions- und Undichtigkeitseigenschaften der folgenden Systeme wurden verglichen: 1) T7-Gen-1, kloniert und in E.coli-Wirt GM221 exprimiert (ATCC-Hinterlegungsnr. 202077), enthaltend den pAMG13-Vektor (d.h. T7-Gen-1 unter der Kontrolle des Lambda-Promoter); 2) T7-Gen-1, kloniert und mit T4-Operon-pRIN10 in E.coli-Wirt GM221 co-exprimiert, enthaltend pAMG13; 3) T7-Gen-1, kloniert und mit T4-Operon-pRIN10 in E.coli-Wirt GM221 coexprimiert, enthaltend pAMGuvsX (d.h. T7-Gen-1 unter Kontrolle von uvsX-T4-middle-Promoter); 4) T7-Gen-1, kloniert und mit T4-Operon-pRIN11 in E.coli-Wirt GM221 coexprimiert, enthaltend pAMGuvsX; 5) NT-3, kloniert und mit T4-Operon-pRIN10 in E.coli-Wirt GM225 co-exprimiert, enthaltend pAMGuvsX; und 6) BDNF, kloniert und mit T4-Operon-pRIN10 in E.coli-Wirt GM225 co-exprimiert, enthaltend pAMGuvsX.
Für jedes Experiment wurden einzelne Kolonien von Platten genommen und in 5 ml 2XYT mit Chloramphenicol und Kanamycin wachsen gelassen. Die Röhrchen schüttelten über Nacht bei 28°C. 50 ml-Röhrchen wurden mit 5 ml 2XYT mit Chloramphenicol und Kanamycin angesetzt. Die frischen Röhrchen wurden mit 50 μl der Starter-Kulturen beimpft. Diese Röhrchen wurden unter Schütteln bei 28°C auf eine O.D. von 0,6-1,2 wachsen gelassen. Der PS4-Promoter, enthaltend Kulturen (pRIN11), wurden mit 20 μl IPTG induziert, während die Lambda-Promoter-enthaltenden Kulturen (pAMG) durch Bringen auf entweder 37°C oder 42°C induziert wurden. Eine Induktionszeit für alle diese Expressionsexperimente war 4,0 Stunden. 1 ml einer jeden Kultur wurde für 10 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde dekantiert, und das Pellet wurde eingefroren. 500 μl einer jeden Kultur wurde in 500 μl von 2XYT verdünnt, und die optische Dichte wurde aufgezeichnet. Die Pellets wurden dann aufgetaut und in 0,01 OD Einheit/μl Cracking-Puffer resuspendiert. 6 μl dieser aufgebrochenen Pellets wurden dann auf ein SDS-Polyacrylamidgel (4-20 % oder 16 %) geladen. Nach Laufenlassen bei 150 V für 1,3 Stunden wurden die Gele mit Coomassie-Blau eingefärbt, um die Proteine sichtbar zu machen.
Die Daten aus 24-29 können wie folgt zusammengefaßt werden: 1) der pAMG13-Vektor ist in der Lage, nach Induktion große Mengen an T7-RNA-Polymerase zu erzeugen, wenn das T7-Gen-1 unter der Kontrolle des Lambda-Promoter ist (siehe Spuren 3 und 4, 24); 2) T4-Operon-Protein-Produkte verlieren die Erkennung des Lambda-Promoter durch die E.coli-RNA-Polymerase in hinreichender Weise (vergleiche Spuren 2 und 3 von 25 mit Spuren 3 und 4 von 24); 3) große Mengen an T7-RNA-Polymerase können in pAMGuvsX erhalten werden, wobei T7-Gen-1 kloniert und mit T4-Operon-pRIN10 coexprimiert wird (vergleiche Spuren 3 und 4 von 24 mit Spuren 2 und 3 von 26); 4) Co-Expression mit T4-Operon-pRIN11 ist so effektiv beim Produzieren von T7-Gen-1 wie es T4-Operon-pRIN10 ist (vergleiche Spuren 3 und 4 von 27 mit Spuren 2 und 3 von 26); und 5) große Mengen an NT-3 und BDNF können ebenfalls aus pAMGuvsX erhalten werden, wobei der NT-3/BDNF kloniert und mit T4- Operon-pRIN10 co-exprimiert wird (vergleiche 28 und 29 mit 26).
Beispiel 12
Dieses Beispiel beschreibt die Klonierung des motA/asiA-Operons in Einzel-Kopie-Plasmide, enthaltend das MS2-System.
Einzel-Kopie-Vektoren stammten aus pSC101, Bernardi and Bernardi, Nuc. Acids Res., 12: 9415-9426. Dieser Vektor wurde mit NdeI verdaut und dann rezirkularisiert, um Plasmid pSC101Nde zu ergeben. Ein DNA-Linker, enthaltend BglII- und NsiI-Stellen wurde in die EcoRI-Stelle dieses Plasmids eingeführt. Ein Fragment von pAMG22 aus NsiI bis BglII, das den T1T2, PS4-Promoter und die multiple Klonierstelle enthält, wurde dann einkloniert, um Plasmid pTS2 zu erzeugen. pTS2 wurde dann mit MluI und XmnI geschnitten, die Enden wurden unter Verwendung von Klenow-Fragment abgestumpft, Sambrook et al., Molecular cloning, a laboratory manual, Second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, S. 5.40-5.41 (1989), und das Plasmid wurde rezirkularisiert, um pTS2d zu ergeben. Die Fragmente der pRIN-Plasmidvektoren, enthaltend den Target-Promoter, MS2-Erkennungsstelle, MS2CP-Gen und TET-Promoter, wurden mittels PCR unter Verwendung von Oligonukleotiden 828-31 und 1553-72 (siehe Tabelle 1) erzeugt. Diese Fragmente wurden mit AatII und BglII ver daut und dann in pTS2d ligiert, um pCB-Plasmid-Vektoren zu erzeugen (siehe 30). Das in Beispiel 10 beschriebene motA/asiA-Operon wurde dann in diese pCB-Plasmidvektoren von XbaI bis XhoI kloniert, um pAW-Plasmid-Vektoren zu erzeugen (siehe 31).
Ein anderes einzeln pCB-Plasmid wurde unter Verwendung des mutierten TET-Promoter zur Kontrolle des MS2-Hüllproteins konstruiert. Eine Kassette des MS2-Hüllproteingens, verknüpft mit dem TET-Promoter wurde mittels PCR konstruiert unter Verwendung von Oligonukleotiden 1870-97 und 1906-27 (siehe Tabelle 1). Dieses Fragment wurde XhoI- bis BglII-verdaut und in pTS2d ligiert, um pCB11 zu erzeugen. Das in Beispiel 10 beschriebene motA/asiA-Operon wurde dann in diesen Vektor von XbaI bis XhoI kloniert, um pAW11 zu erzeugen (pS4-Promoter)
Beispiel 13
Dieses Beispiel beschreibt das Testen der pAW-Plasmidvektoren, die in Beispiel 12 hergestellt und beschrieben worden sind. Expressionsexperimente wurden durchgeführt, bei denen Produktgene unter entweder die T4- uvsX- oder X-Promoter kloniert wurden. Die Expressions- und Undichtigkeitseigenschaften der folgenden Systeme wurden verglichen: 1) T7-Gen-1, kloniert und mit pAW20 in E.coli GM221, enthaltend pAMGX, co-exprimiert (d.h. T7-Gen-1 unter Kontrolle von T4 X-Promoter; 2) SPI, kloniert und mit pAW20 in E.coli GM225, enthaltend pAMGX, co-exprimiert (d.h. SPI unter Kontrolle von T4 X Promoter; 3) OPG, kloniert und mit pAW20 in E.coli GM225, enthaltend pAMGuvsX, co-exprimiert (d.h. OPG unter Kontrolle von T4 uvsX-Promoter); 4) BDNF, kloniert und mit pAW11 in E.coli GM225, enthaltend pAMGuvsX, co-exprimiert (d.h. BDNF unter Kontrolle von T4 uvsX-Promoter); 5) OPG, kloniert und mit pAW11 in E.coli GM225, enthaltend pAMGuvsX, coexprimiert (d.h. OPG unter Kontrolle von T4 X-Promoter;) 6) NT3, kloniert und mit pAW11 in E.coli GM225, enthaltend pAMGuvsX, co-exprimiert (d.h. NT3 unter Kontrolle des T4-uvsX-Promoter;) und 7) 3MNDF, kloniert und mit pAW11 in E.coli GM225, enthaltend pAMGX, co-exprimiert (d.h. 3MNDF unter Kontrolle des T4-X-Promoter).
Für jedes Experiment wurden einzelne Kolonien von Platten genommen und in 5 ml 2XYT mit Tetracyclin und Kanamycin aufgezogen. Die Röhrchen schüttelten über Nacht bei 28°C. 50 ml-Röhrchen wurden mit 5 ml 2XYT mit Tet und Kan angesetzt. Die frischen Röhrchen wurden mit 50 μl der Starter-Kulturen beimpft. Diese Röhrchen wurden unter Schütteln bei 28°C auf eine O.D. von 0,6-1,2 wachsen gelassen. Die PS4-Promoter-enthaltenden Kulturen und UV5-lac-Promotor-enthaltenden Kulturen wurden mit 20 μl IPTG induziert, während die Lambda-Promoter-enthaltenden Kulturen induziert wurden durch Bringen auf entweder 37°C oder 42°C. Die Induktionszeit für alle diese Expressionsexperimente betrug 4,0 Stunden. 1 ml einer jeden Kultur wurde für 10 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde dekantiert und das Pellet wurde eingefroren. 500 μl einer jeden Kultur wurde in 500 μl LB verdünnt, und die optische Dichte wurde gemessen. Die Pellets wurden dann aufgetaut und in 0,01 OD Einheit/μl Cracking-Puffer resuspendiert. 6 μl dieser aufgebrochenen Pellets wurden dann auf ein SDS-Polyacrylamidgel (4-20 % oder 16 %) geladen. Nach Laufenlassen bei 150 V für 1,3 Stunden wurden die Gele mit Coomassie-Blau eingefärbt, um die Proteine sichtbar zu machen.
Die Daten aus 32-34 können wie folgt zusammengefaßt werden: 1) hohe Mengen an T7-Gen-1 können in pAMGX erhalten werden, wobei T7-Gen-1 kloniert und mit pAW20 coexprimiert wird (32); 2) große Mengen an SPI können in pAMGX erhalten werden, wobei SPI kloniert und mit pAW20 co-exprimiert wird (33); und 3) große Mengen an OPG können in pAMGuvsX erhalten werden, wobei OPG kloniert und mit pAW20 coexprimiert wird (34).
Die Daten aus 35-38 können wie folgt zusammengefaßt werden: 1) große Mengen an BDNF können in pAMGuvsX erhalten werden, wobei BDNF kloniert und mit pAW11 coexprimiert wird (35); 2) große Mengen an OPG können in pAMGuvsX erhalten werden, wobei OPG kloniert und mit pAW11 co-exprimiert wird (36); 3) große Mengen an NT3 können in pAMGuvsX erhalten werden, wobei NT3 kloniert und mit pAW11 co-exprimiert wird (37); 4) große Mengen an 3MNDF können in pAMGX erhalten werden, wobei 3MNDF kloniert und mit pAW11 co-exprimiert wird (38).
Da das Testen mit den Einzelkopie-pAW-Plasmiden ein System bietet, das ähnlich demjenigen ist, das auftreten würde, wenn die MS2-basierende T4-Kassette auf das Chromosom gebracht würde, wird von der vorliegenden Erfindung in Erwägung gezogen, daß jedes der erforderlichen MS2-T4-middle-promoter-Elemente auf das Chromosom der Wirtszelle gebracht werden könnte, um ein effektives, stark kontrolliertes System bereitzustellen.
Beispiel 14
Dieses Beispiel beschreibt die Verwendung des MS2-basierenden T4-Systems, um ein akzessorisches Protein effektiv zu exprimieren und dadurch die Expression eines Zielproteins zu verbessern.
Ein T4-Operon, enthaltend motA und asiA wurde PCR-konstruiert dahingehend, daß es eine XhoI-Stelle am Start, gefolgt von einer MS2-Erkennungsstelle, und eine BamHI-Stelle am Ende des asiA-Gens hat, dem auch eine MS2-Erkennungsstelle vorangeht (Oligonukleotide 1351-01 und 1260-86) (siehe Tabelle 1). Dieses Fragment wurde dann in die entsprechenden Stellen von pRIN10 kloniert (was das T4-Operon-pRIN10 ergibt).
Das 0.6-Gen von T7 wurde so konstruiert, daß es eine XbaI-Stelle hatte, gefolgt von einer MS2-Erkennungsstelle und einer Endung mit einer XhoI-Stelle (Oligonukleotide 1443-41 und 1465-31) (siehe Tabelle 1). Dieses 0.6-Fragment wurde dann in das T4-Operon-pRIN10 unter Verwendung der entsprechenden Stellen gebracht. Dies ergibt ein Plasmid (0.6-T4-Operon-pRIN10), das sowohl das 0.6-Gen als auch die T4-Transkriptionsfaktoren exprimieren kann. Expressionexperimente wurden dann durchgeführt (nach demselben experimentellen Protokoll, das in Beispiel 11 beschrieben ist), unter Verwendung eines Systems, bei dem BDNF kloniert und mit 0.6-T4-Operon-pRIN10 in E.coli-Wirt GM225 co-exprimiert wurde, enthaltend pAMGuvsX (d. h. BDNF unter der Kontrolle des T4-uvsX-middle-Promoter).
Wie in 39 gezeigt, konnten große Mengen an BDNF unter Verwendung dieses Systems erhalten werden, und die erhaltenen Mengen übertrafen diejenigen, die unter Verwendung eines T4-Operon-pRIN10-Systems erhalten wurden, dem das 0.6-Gen fehlte (vergleiche Spuren 4 und 5, 29 bis Spuren 4 und 5, 39). Deshalb verbesserte das akzessorische Protein (0.6) die Expression eines Zielproteins in einem abgestuften Promoter-Expressionssystem.
In Tabelle 1 unten werden die Oligonukleotide dargestellt, die bei den hierin beschriebenen Beispielen verwendet werden.
Tabelle 1
Hinterlegungen von DNA/Wirtszellen

E.coli K-12/GM350-Wirtszellen wurden bei der ATCC (American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, USA) am 20. Januar 1999 hinterlegt.
E.coli K-12/GM225-Wirtszellen sind bei der ATCC (American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, USA) am 27. Januar 1998 hinterlegt worden und bekamen Hinterlegungsnummer 20281.
E.coli K-12/GM225-Wirtszellen, enthaltend Plasmidvektor pAMG13, wurden bei der ATCC (American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, USA) am 27. Januar 1998 hinterlegt und erhielten die Hinterlegungsnummer 98641.
E.coli K-12/GM225-Wirtszellen, enthaltend Plasmidvektor pAMG25, wurden bei der ATCC (American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, USA) am 27. Januar 1998 hinterlegt und erhielten die Hinterlegungsnummer 98642.
E.coli K-12/GM225-Wirtszellen, enthaltend Plasmidvektor 3002 nahG, wurden bei der ATCC (American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, USA) am 27. Januar 1998 hinterlegt und erhielten die Hinterlegungsnummer 98645.
E.coli K-12/GM225-Wirtszellen, enthaltend Plasmidvektor pRIN10 (wt), wurden bei der ATCC (American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, USA) am 27. Januar 1998 hinterlegt und erhielten die Hinterlegungsnummer 98639.
E.coli EE11-11M-Wirtszellen wurden bei der ATCC (American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, USA) am 27. Januar 1998 hinterlegt und erhielten die Hinterlegungsnummer 202083.
E.coli EE11-20-Wirtszellen wurden bei der ATCC (American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, USA) am 27. Januar 1998 hinterlegt und erhielten die Hinterlegungsnummer 202082.
E.coli K-12/GM225-Wirtszellen, enthaltend Plasmidvektor pAMGuvsX, wurden bei der ATCC (American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, USA) am 27. Januar 1998 hinterlegt und erhielten die Hinterlegungsnummer 98644.
E.coli K-12/GM225-Wirtszellen, enthaltend Plasmidvektor pAMGX, wurden bei der ATCC (American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, USA) am 27. Januar 1998 hinterlegt und erhielten die Hinterlegungsnummer 98643.
E.coli K-12/GM225, enthaltend Plasmidvektor T4-Operon-pRIN10, wurden bei der ATCC (American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, USA) am 27. Januar 1998 hinterlegt und erhielten die Hinterlegungsnummer 98640.
E.coli K-12/GM225-Wirtszellen, enthaltend Plasmidvektor pAW20, wurden bei der ATCC (American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, USA) am 28. Januar 1998 hinterlegt und erhielten die Hinterlegungsnummer 98638.
E.coli K-12/FM-15-Wirtszellen, enthaltend Plasmidvektor pAMG21, wurden bei der ATCC (American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, USA) hinterlegt und erhielten die Hinterlegungsnummer 98113.
E.coli K-12/GM221-Wirtszellen, enthaltend Plasmidvektor pAMG33, wurden bei der ATCC (American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, USA) am 20. Januar 1999 hinterlegt.

Plasmidvektor pAMG22 wurde bei der ATCC (American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, USA) am 28. Januar 1998 hinterlegt und erhielt die Hinterlegungsnummer 98646.
Die vorliegende Erfindung ist im Hinblick auf einzelne Ausführungsformen beschrieben worden, von denen gefunden wurde oder bei denen vorgeschlagen wurde, daß sie bevorzugte Arten zur Ausübung der vorliegenden Erfindung umfassen. Es wird von Fachleuten verstanden werden, daß im Lichte der vorliegenden Offenbarung zahlreiche Modifizierungen und Veränderungen in den beispielhaft angegebenen einzelnen Ausführungsformen durchgeführt werden können, ohne vom Umfang der Ansprüche abzuweichen.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Translationsrepressionssystem zur Verwendung beim Klonieren oder Exprimieren eines spezifischen heterologen Gens, wobei das System eine Translationsrepressorprotein-kodierende Region umfasst, die operabel mit einem konstitutiven Promoter verknüpft ist, und wobei das heterologe Gen operabel mit einem induzierbaren Promoter und einer Repressorerkennungsstelle verknüpft ist, und wobei der Translationsrepressor die Expression des heterologen Gens steuert, und wobei die Bindungsstelle des Repressorproteins die Ribosomenbindungsequenz und Initiationscodon enthält, aber nicht weitere kodierende Regionen des heterologen Gens abdeckt.
System nach Anspruch 1, wobei der Translationsrepressor Bakteriophagen-MS2-Hüllprotein (MS2CP) ist.
Verfahren zum Klonieren oder Exprimieren eines heterologen Gens, wobei das Verfahren umfasst: Kultivieren unter geeigneten Bedingungen von Wirtszellen, die mit einem Plasmidvektor transformiert worden sind, der ein System nach Anspruch 1 umfasst, wobei der Vektor eine DNA-Sequenz, die für einen induzierbaren Promoter kodiert, eine DNA-Sequenz, die für das heterologe Gen kodiert, das mit einer Translationsrepressorerkennungsstelle und mit dem induzierbaren Promoter verknüpft ist, und eine DNA-Sequenz umfasst, die für einen Translationsrepressor kodiert, der mit einem konstitutiven Promoter operabel verknüpft ist, wobei der Translationsrepressor die Expression des heterologen Gens steuert, oder Kultivieren unter geeigneten Bedingungen von Wirtszellen, die mit einem ersten Plasmidvektor, umfassend ein System nach Anspruch 1, wobei der Vektor eine DNA-Sequenz umfasst, die für einen induzierbaren Promoter und das heterologe Gen kodiert, das mit einer Translationsrepressorerkennungsstelle und mit dem induzierbaren Promoter verknüpft ist, und mit einem zweiten Plasmidvektor co-transformiert worden sind, der eine DNA-Sequenz umfasst, die für einen Translationsrepressor kodiert, der operabel mit einem konstitutiven Promoter verknüpft ist, wobei der Translationsrepressor die Expression des heterologen Gens steuert, oder Kultivieren unter geeigneten Bedingungen von Wirtszellen, die ein System nach Anspruch 1 umfassen, wobei die Zellen eine DNA-Sequenz beinhalten, die für einen Translationsrepressor kodiert, der operabel mit einem konstitutiven Promoter verknüpft ist, transformiert mit einem Plasmidvektor, wobei der Vektor eine DNA-Sequenz umfasst, die für einen induzierbaren Promoter kodiert, und eine DNA-Sequenz, die für das heterologe Gen kodiert, das mit einer Translationsrepressorerkennungsstelle und mit dem induzierbaren Promoter verknüpft ist, wobei der Translationsrepressor die Expression des heterologen Gens steuert, oder Kultivieren unter geeigneten Bedingungen von Wirtszellen, die ein System nach Anspruch 1 umfassen, wobei die Zellen eine DNA-Sequenz beinhalten, die für einen induzierbaren Promoter kodiert, eine DNA-Sequenz, die für das heterologe Gen kodiert, das mit einer Translationsrepressorerkennungsstelle und mit dem induzierbaren Promoter verknüpft ist, und eine DNA-Sequenz, die für einen Translationsrepressor kodiert, der operabel mit einem konstitutiven Promoter verknüpft ist, wobei der Translationsrepressor die Expression des heterologen Gens steuert.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei der Translationsrepressor Bakteriophagen-MS2-Hüllprotein ist.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei der Vektor weiterhin SEQ ID NO:2 umfasst.
System nach Anspruch 1, wobei das System eine „MS2-gesteuerte T7-Gen-1-Kassette" ist, wobei die Kassette eine DNA-Sequenz, die für das T7-Gen-1 kodiert, einen induzierbaren Promoter, die MS2-Erkennungsstelle und das MS2-Hüllprotein-Gen unter der Kontrolle eines konstitutiven Promoters umfasst, wobei das T7-Gen-1 mit dem induzierbaren Promoter und mit der MS2-Erkennungsstelle verknüpft ist.
Wirtszelle, die in der Lage ist, ein heterologes Gen zu exprimieren und eine „MS2-gesteuerte T7-Gen-1-Kassette" nach Anspruch 6 hat, die in ihr Chromosom eingefügt ist.
Verfahren nach Anspruch 3 zum Exprimieren eines heterologen Gens, wobei das Verfahren umfasst: Kultivieren unter geeigneten Bedingungen von Wirtszellen, die eine „MS2-kontrollierte T7-Gen-1-Kassette" nach Anspruch 6 haben, eingefügt in ihr Chromosom und mit einem Plasmidvektor transformiert, enthaltend eine DNA-Sequenz, die für das heterologe Gen unter der Kontrolle eines T7-Promoters kodiert.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei das heterologe Gen ein T7-early-Gen ist.
Verfahren nach Anspruch 3 zum Klonieren eines heterologen Gens, wobei das Verfahren umfasst: Kultivieren unter geeigneten Bedingungen von Wirtszellen, die mit einem ersten Plasmidvektor, umfassend ein System nach Anspruch 1, wobei der Vektor eine DNA-Sequenz umfasst, die für das heterologe Gen unter der Kontrolle von T4-middle-Promoter kodiert, und einem zweiten Plasmidvektor co-transformiert worden sind, der eine DNA-Sequenz umfasst, die für einen induzierbaren Promoter, motA- und asiA-Gensequenz kodiert, von denen jede mit einer Translationsrepressorerkennungsstelle und mit dem induzierbaren Promoter verknüpft ist, und einen Translationsrepressor, der mit einem konstitutiven Promoter operabel verknüpft ist, wobei der Translationsrepressor die Expression der motA- und asiA-Gene steuert, und wobei die motA- und asiA-Gene die Transkription von dem T4-middle-Promoter steuern und gleichzeitig die Transkription von dem induzierbaren Promoter inhibieren.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei der zweite Plasmidvektor weiterhin eine DNA-Sequenz umfasst, die für ein akzessorisches Protein kodiert.
Verfahren nach Anspruch 3 zum Klonieren oder Exprimieren eines heterologen Gens, wobei das Verfahren umfasst: Kultivieren unter geeigneten Bedingungen von Wirtszellen, umfassend ein System nach Anspruch 1, wobei die Zellen eine DNA-Sequenz beinhalten, die für einen induzierbaren Promoter, motA- und asiA-Gensequenzen kodiert, von denen jede mit einer Translationsrepressorerkennungsstelle und mit dem induzierbaren Promoter verknüpft ist, und einen Translationsrepressor, der mit einem konstitutiven Promoter operabel verknüpft ist, transformiert mit einem Plasmidvektor, umfassend eine DNA-Sequenz, die für das heterologe Gen kodiert, das unter der Kontrolle von T4-middle-Promoter verknüpft ist, wobei der Translationsrepressor die Expression der motA- und asiA-Gene steuert, und wobei die motA- und asiA-Gene die Transkription von dem T4-middle-Promoter steuern und gleichzeitig die Transkription von dem induzierbaren Promoter inhibieren.
Verfahren nach einem der Ansprüche 10 – 12, wobei der Translationsrepressor Bakteriophagen-MS2-Hüllprotein ist.
System nach Anspruch 1, wobei das System eine „MS2-basierende T4-Kassette" ist, wobei die Kassette eine DNA-Sequenz umfasst, die für einen induzierbaren Promoter, motA- und asiA-Gensequenzen kodiert, von denen jede mit einer MS2-Erkennungssequenz und mit dem induzierbaren Promoter verknüpft ist, und das MS2-Hüllprotein-Gen unter der Kontrolle eines konstitutiven Promoters.
Prokaryotische Wirtszelle, die in der Lage ist, ein heterologes Gen zu exprimieren, und die eine „MS2-basierende T4-Kassette" nach Anspruch 14 hat, die in ihr Chromosom eingefügt ist.
Verfahren nach Anspruch 3 zum Klonieren oder Exprimieren eines heterologen Gens, wobei das Verfahren umfasst: Kultivieren unter geeigneten Bedingungen von Wirtszellen, die eine „MS2-basierenden Kassette" nach Anspruch 6 oder 14 haben, die in ihr Chromosom eingefügt ist, und die mit einem Expressionsvektor transformiert worden sind, der eine DNA-Sequenz enthält, die für das heterologe Gen unter der Kontrolle eines T4-Promoters kodiert.