DE69932697T2

DE69932697T2 - Plasmide, welche die Trigger-Faktoren Gene GroEL oder GroES exprimieren

Info

Publication number: DE69932697T2
Application number: DE69932697T
Authority: DE
Inventors: Kazuyo Kyoto-shi Sogo; Hideki Takarazuka-shi Yanagi; Takashi Kyoto-shi Yura
Original assignee: Takara Bio Inc
Current assignee: Takara Bio Inc
Priority date: 1998-12-28
Filing date: 1999-12-28
Publication date: 2007-08-16
Anticipated expiration: 2019-12-29
Also published as: EP1016724B1; EP1016724A2; CA2291883C; JP4249832B2; CA2291883A1; EP1016724A3; JP2000189163A; DE69932697D1; US6197547B1; ATE335828T1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Operon, ein das Operon tragendes Expressionsplasmid, eine Cotransformante, die einen Expressionsvektor für ein fremdes Protein und ein beliebiges Expressionsplasmid umfasst, und ein Verfahren zum Produzieren eines fremden Proteins, welches das Exprimieren eines fremden Proteins durch die Verwendung der Cotransformante umfasst, welche in der Lage ist, ein fremdes Protein in einer solubilisierten Form und in einem Status, der eine korrekte Konformation aufweist, zu exprimieren.
Ein Triggerfaktor ist ein Protein, über das herausgefunden wurde, dass es ein cytoplasmatischer Faktor ist, der für den in vitro Transport zu einer Membran mit proOmpA, einem Vorläufer des äußeren Membranproteins OmpA von E. coli, notwendig ist [Crooke, E. und Wickner, W., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 84, 5216–5220 (1987)]. Zusätzlich wurde ein tig-Gen als ein Gen cloniert, das einen Triggerfaktor mit einem Molekulargewicht von 48 kDa codiert [Guthrie, B. und Wickner, W., J. Bacteriol. 172, 5555–5562 (1990)]. Auf der Basis der Analyse der Aminosäuresequenz ist herausgefunden worden, dass der Triggerfaktor eine FK506-gebundenes Protein (FKBP)-Domäne besitzt und dass alle Aminosäurereste, die für jede Expression der Bindungsaktivität mit FK506 und für eine Aktivität der Peptidylprolyl-Isomerase (PPlase) erforderlich sind, in dem Triggerfaktor konserviert sind [Callebaut, I. und Mornon, J. -P., FEBS Lett. 374, 211–215 (1995)].
Dort ist berichtet worden, dass der Triggerfaktor auch als PPlase identifiziert worden ist, welche an die 50S-Untereinheit eines Ribosoms von E. coli gebunden ist, und dass der Triggerfaktor die Prolyl-Isomerisierung bei der in vitro-Neufaltung der mutierten RNase T₁ wesentlich verstärkt [Stoller, G. et al., EMBO J. 14, 4939–4948 (1995)]. Darüber hinaus ist durch ein Experiment unter Verwendung eines quervernetzenden Reagenzen herausgefunden worden, dass der Triggerfaktor an eine im Entstehen begriffene Polypeptidkette an einem Ribosom von E. coli gebunden ist [Valent, Q. A. et al., EMBO J. 14, 5494–5505 (1995); Hesterkamp, T. et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 93, 4437–4441 (1996)]. Zusätzlich ist bekannt gewesen, dass der Triggerfaktor die Bindung eines nicht gefalteten Proteins von GroEL verstärkt [Kandror, O. et al., EMBO J. 14, 6021–6027 (1995); Kandror, O. et al., J. Biol. Chem. 272,1730–1734 (1997)].
PPlase wirkt auf den Prolin-Rest in einer Peptidkette und katalysiert cis-trans-Isomerisierung von Konformationen, die eine Peptidbindung betreffen. Diese Reaktion wird als ein die geschwindigkeitsbestimmender Schritt eines Faltungsprozesses des Proteins angesehen. Zusätzlich wird angenommen, dass das Protein aus der Familie der PPlasen an Faltung, Neufaltung, Zusammenlagerung und Dissoziation, Transport der Proteine und dergleichen innerhalb der Zellen beteiligt ist.
Zusätzlich hat sich gezeigt, dass der Triggerfaktor die Faltung mehrerer Proteine in vitro unterstützt [Scholz, C. et al., EMBO J. 16, 54–58 (1997)]. Die aktuelle Funktion des Triggerfaktors war jedoch bisher nicht bekannt.
Nishihara et al. (Appl. Environ. Microbiol. 64: 1694–1699, 1998) beschreiben Plasmide, die zur kontrollierten Expression des DnaK-DnaJ-GrpE und/oder GroEL-GroES-Chaperon-Teams verwendet werden können, um die Untersuchung der Wirkungen dieses Chaperon-Teams auf Faltung oder Zusammenbau von rekombinanten Proteinen in Escherichia coli zu ermöglichen. Ein typisches, auf pACYC184 basierendes Plasmid, das erhalten worden war, konnte die Dnak-DnaJ-GrpE und GroEL-GroES-Chaperon-Hauptteamgruppen von separaten Promotoren exprimieren, wenn L-Arabinose beziehungsweise Tetracyclin in einer von der Dosis abhängigen Weise zugegeben wurden. Coexpression der DnaK-DnaJ-GrPE und/oder GroEL-GroES-Chaperon-Teamgruppen in geeigneten Spiegeln führte zu einer deutlichen Stabilisierung und Akkumulation von Cryj2 ohne ausgedehnte Aggregation. Experimente, die mit Mutanten durchgeführt wurden, denen jedes der Chaperon-Proteine (DnaK, DnaJ, GrpE, GroEL und GroES) oder der Hitzeschock-Transkriptionsfaktor σ³² fehlte, ergaben, dass beide Chaperon-Teamgruppen entscheidend an der Faltung von Cryj2 beteiligt sind, dass sie aber auf unterschiedliche Weisen beteiligt sind.
Die Europäische Patentanmeldung EP 0885 967-A2 beschreibt ein künstliches Operon, das Polynucleotide, welche jedes der Chaperone DnaK, DnaJ und GrpE codieren, umfasst, ein Expressionsplasmid, welches das Operon trägt, eine Cotransformante, die durch das Einführen des Expressionsplasmids zusammen mit einem Expressionsvektor für ein fremdes Protein in E. coli hergestellt wurde, und ein Verfahren zum Produzieren eines fremden Proteins unter Verwendung der Cotransformante.
Guthrie und Wickner (J. Bacteriol. 1990, 172(10): 5555–5562) offenbaren, dass der Triggerfaktor ein häufig vorkommendes Protein im Cytosol von E. coli ist, das proOmpA für die in vitro-Translokation über innere Membranvesikel stabilisieren kann. Das Gen, das den Triggerfaktor von E. coli codiert, wurde isoliert und sequenziert, was die Konstruktion von Stämmen erlaubte, bei denen die Expression des Triggerfaktors leicht reguliert wird. Sie fanden keinen Defekt in der in vivo-Rate von Synthese oder Sekretion von proOmpA in Zellen, die vom Triggerfaktor befreit worden waren. Es wird angenommen, dass der primäre physiologische Defekt in vom Triggerfaktor befreiten oder ihn überproduzierenden Zellen in der Anreicherung von filamentösen Zellen besteht; die Filamentbildung des Stammes, der den Triggerfaktor überproduziert, wird durch ein Vielfachkopien-Plasmid unterdrückt, welches das essentielle Teilungsgen ftsZ exprimiert, was nahelegt, dass dem Triggerfaktor eine wichtige Rolle bei der Zellteilung zukommt.
Bei der Expression eines fremden Proteins durch E. coli sind zahlreiche Anstrengungen zur Unterdrückung der Aggregation und zur Stabilisierung eines gewünschten fremden Proteins durch die Coexpression von Chaperonen gemacht worden. Es ist jedoch schwierig gewesen, vorauszusagen, welches der Chaperone coexprimiert werden muss, um für ein bestimmtes Protein wirksam zu sein, so dass zur Zeit ein übermäßiges Austesten durchgeführt wird, um die wirksamen Chaperone zu bestimmen. Zusätzlich gibt es einige Fälle, in denen ausreichende Wirkungen durch Coexpression bekannter Chaperone nicht erreicht werden können.
Demzufolge besteht das technische Problem der vorliegenden Erfindung darin, Mittel und Verfahren bereitzustellen, die in E. coli exprimierten Proteine zu stabilisieren und ihre Aggregation zu unterdrücken.
Die Lösung des Problems wird durch die Ausführungsformen erreicht, die durch die Patentansprüche bereitgestellt werden.
Im Hinblick auf die vorstehend genannten Probleme ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Operon bereitzustellen, das Gene umfasst, die jeden der Triggerfaktoren GroEL und GroES codieren, wobei das Operon in der Lage ist, ein fremdes Protein in einer solubilisierten Form und in einem Status, der eine korrekte Konformation aufweist, zu exprimieren.
In einer Ausführungsform liefert die vorliegende Erfindung ein Expressionsplasmid, das das Operon trägt, und ein Expressionsplasmid für einen Triggerfaktor.
In einer anderen Ausführungsform liefert die vorliegende Erfindung eine Cotransformante, welche beide der vorstehend genannten Expressionsplasmide und einen Expressionsvektor für ein fremdes Protein beherbergt.
In noch einer anderen Ausführungsform liefert die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Produzieren eines fremden Proteins, welches das Exprimieren eines fremden Proteins durch die Verwendung der Cotransformante umfasst.
Diese und andere Aufgaben der vorliegenden Erfindung werden aus der nachstehenden Beschreibung deutlich werden.
Zusammengefasst betrifft die vorliegende Erfindung folgendes:

[1] ein Operon, welches ein Gen, das einen Triggerfaktor codiert, ein Gen, das GroEL codiert, und ein Gen, das GroES codiert, umfasst;
[2] ein Plasmid, das in der Lage ist, jeweils einen Triggerfaktor, GroEL und GroES zu exprimieren, wobei das Plasmid das Operon nach Punkt [1] trägt;
[3] ein Plasmid, das in der Lage ist, einen Triggerfaktor zu exprimieren, wobei das Plasmid ein Gen trägt, welches den Triggerfaktor unter der Kontrolle eines induzierbaren Promotors codiert;
[4] eine Cotransformante, die das Plasmid nach dem Punkt [2] oder [3] und ein Expressionsplasmid für ein fremdes Protein beherbergt; und
[5] ein Verfahren zum Produzieren eines fremden Proteins, welches das Exprimieren dieses fremden Proteins durch die Cotransformante nach Punkt [4] umfasst.

Die vorliegende Erfindung wird durch die hierin nachstehend gegebene genaue Beschreibung und die begleitenden Abbildungen, die nur zur Erläuterung dienen und daher die vorliegende Erfindung nicht begrenzen, besser verstanden werden und worin:
1 eine schematische Darstellung ist, die pTf13 (etwa 5,9 kB) zeigt, worin araB p/o der araB-Promotor/Operator ist, tig ein Strukturgen für einen Triggerfaktor ist, pACYC-Ori ein Replikationsursprung ist, der vom Plasmid pACYC stammt, Cmr das Gen für Chloramphenicol-Resistenz und araC der araC-Aktivator/Repressor ist;
2 eine schematische Darstellung ist, die pG-Tf1 (etwa 8,4 kB) zeigt, worin Pzt-1p der Pzt-1-Promotor ist, groES und groEL Gene sind, die GroES bzw. GroEL codieren, tig ein Strukturgen für einen Triggerfaktor ist, tetR der tetR-Repressor ist, Cmr das Gen für Chloramphenicol-Resistenz ist und pACYC-Ori ein Replikationsursprung ist, der vom Plasmid pACYC stammt.
3 die analytischen Ergebnisse der Solubilisierung von murinem Endostatin durch Coexpression mit einem Triggerfaktor einer SDS-PAGE zeigt, worin S eine lösliche Fraktion und I eine unlösliche Fraktion ist; und
4 die analytischen Ergebnisse der Solubilisierung von menschlichem ORP150 durch Coexpression mit einem Triggerfaktor einer SDS-PAGE zeigt, worin S eine lösliche Fraktion und I eine unlösliche Fraktion ist.
Eine der großartigen Eigenschaften des künstlichen Operons der vorliegenden Erfindung beruht darauf, dass das Operon Gene umfasst, die jeweils einen Triggerfaktor, GroEL und GroES codieren (die Gene werden entsprechend als tig-Gen, groEL-Gen und groES-Gen bezeichnet). Da das Operon der vorliegenden Erfindung jedes des vorstehend genannten tig-Gens, groEL-Gens und groES-Gens umfasst, kann eine ausgezeichnete Wirkung erzielt werden, insofern dass ein lösliches Expressionsprodukt effizient erhalten werden kann, wenn das Operon mit einem Gen, welches ein fremdes Protein codiert, coexprimiert wird.
In der vorliegenden Erfindung betrifft der Ausdruck „Triggerfaktor" einen Faktor, der als ein cytoplasmatischer Faktor entdeckt wurde, der für den in vitro Transport zu einer Membran mit proOmpA, einem Vorläufer des externen Membranproteins OmpA von E. coli, erforderlich ist.
Der Triggerfaktor ist ein Faktor, der die in SEQ ID NO:1 dargestellte Aminosäuresequenz besitzt [Guthrie, B. und Wickner, W., J. Bacteriol. 172, 5555–5562 (1990)]. In der vorliegenden Erfindung umfasst der Triggerfaktor auch einen Faktor mit einer Sequenz, in der eine Mutation als Substitution, Deletion, Addition oder Insertion einer oder mehrerer Aminosäurereste in die Aminosäuresequenz, die in der vorstehend genannten SEQ ID NO:1 dargestellt ist, eingeführt ist, solange der Faktor in der Lage ist, ein fremdes Protein in einer solubilisierten Form und in einem Status einer korrekten Konformation durch Coexpression mit einem fremden Gen, welches ein fremdes Protein codiert, zu exprimieren.
In dem Operon der vorliegenden Erfindung kann das tig-Gen, dass einer Aminosäuresequenz des Triggerfaktors entspricht, verwendet werden. Das tig-Gen schließt ein Gen, das die in SEQ ID NO:2 dargestellte Nucleotidsequenz umfasst, ein [Guthrie, B. und Wickner, W., J. Bacteriol. 172, 5555–5562 (1990)]. Das Gen, das die in SEQ ID NO:2 dargestellte Nucleotidsequenz umfasst, kann zum Beispiel aus dem Kohara-Clon Nr. 148 [Kohara, Y. et al., Cell 50, 495–508 (1987)] erhalten werden.
Zusätzlich beschreibt die vorliegende Erfindung das tig-Gen als ein Gen mit einer Sequenz, in der eine Substitutions-, Deletions-, Additions- oder Insertionsmutation einer oder mehrerer Basen in die vorstehend genannte, in SEQ ID NO:2 dargestellte Nucleotidsequenz eingefügt ist, solange es sich um ein Gen handelt, welches einen Faktor codiert, der in der Lage ist, ein fremdes Protein in einer solubilisierten Form und in einem Status einer korrekten Konformation durch Coexpression mit einem fremden Gen zu exprimieren.
In der vorliegenden Erfindung umfasst das tig-Gen auch ein Gen, das eine DNA umfasst, die in der Lage ist, unter stringenten Bedingungen an eine beliebige DNA zu hybridisieren, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einer die in SEQ ID NO:2 dargestellte Nucleotidsequenz umfassenden DNA. Ferner wird eine DNA mit einer Sequenz beschrieben, in der eine Substitutions-, Deletions-, Additions- oder Insertionsmutation einer oder mehrerer Basen in die vorstehend genannte, in SEQ ID NO:2 dargestellte Nucleotidsequenz eingefügt ist, solange es sich um ein Gen handelt, welches einen Faktor codiert, der in der Lage ist, ein fremdes Protein in einer solubilisierten Form und in einem Status einer korrekten Konformation durch Coexpression mit einem fremden Gen zu exprimieren.
Die Bedingungen für die Hybridisierung umschließen Bedingungen, die zum Beispiel in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Aufl. [Sambrook J. et al., Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York (1989)] und dergleichen beschrieben worden sind.
Die Aminosäuresequenzen für GroEL und GroES, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, werden in SEQ ID No:3 beziehungsweise 4 dargestellt [Hemmingsen, S.M. et al., Nature 333, 330–334 (1988)]. Die vorliegende Erfindung beschreibt auch GroEL und GroES als Faktoren, die jeweils eine Sequenz aufweisen, in der eine Substitutions-, Deletions-, Additions- oder Insertionsmutation eines oder mehrerer Aminosäurereste in jede der Aminosäuresequenzen, die in den vorstehend genannten SEQ ID NO:3 und 4 dargestellt sind, eingeführt ist, solange die Faktoren äquivalente Funktionen zu Wildtyp-GroEL und -GroES mit den vorstehend genannten, in den SEQ ID NO:3 beziehungsweise 4 dargestellten Sequenz aufweisen.
Die Gene groEL und groES, die in dem Gen der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, umschließen Gene, die jeweils die in den SEQ ID NO:5 beziehungsweise 6 dargestellten Nucleotidsequenzen umfassen [Hemmingsen, S.M. et al., Nature 333, 330–334 (1988)]. Sowohl das groEL-Gen als auch das groES-Gen können zum Beispiel aus dem Plasmid pGroll [Nishihara, K. et al., Appl. Environ. Microbiol. 64, 1694–1699 (1988)] erhalten werden.
Die vorliegende Erfindung beschreibt das Gen groEL und das Gen groES auch als Gene, die jeweils eine Sequenz aufweisen, in der eine Substitutions-, Deletions-, Additions- oder Insertionsmutation einer oder mehrerer Basen in jede der Nucleotidsequenzen, die in den vorstehend genannten SEQ ID NO:5 und 6 dargestellt sind, eingeführt ist, solange jedes der Gene einen Faktor codiert, welcher eine äquivalente Funktion zu den vorstehend genannten Wildtyp-GroEL und -GroES aufweist.
Darüber hinaus umschließen das Gen groEL und das Gen groES auch Gene, die jeweils eine DNA umfassen, welche in der Lage ist, unter stringenten Bedingungen an eine beliebige DNA zu hybridisieren, welche aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einer DNA, die die in SEQ ID NO:5 oder 6 dargestellte Nucleotidsequenz besitzt, und aus einer DNA mit einer Sequenz besteht, in der eine Substitutions-, Deletions-, Additions- oder Insertionsmutation einer oder mehrerer Basen in die vorstehend genannte, in SEQ ID NO:5 und 6 dargestellte Nucleotidsequenz eingeführt ist, so lange jedes der Gene einen Faktor codiert, welcher eine äquivalente Funktion zu den vorstehend genannten Wildtyp-GroEL und -GroES aufweist.
In dem Operon der vorliegenden Erfindung ist die Anordnung des tig-Gens, des groEL-Gens und des groES-Gens nicht speziell begrenzt. Beispiele umschließen ein Operon, das aufeinanderfolgend als groES-groEL-tig und dergleichen angeordnet ist.
In dem Operon der vorliegenden Erfindung können das tig-Gen, das groEL-Gen und das groES-Gen unter der Kontrolle eines Promotors liegen.
Der Promotor zur Kontrolle der Transkription des Operons, das unter der Kontrolle des Promotors liegt, ist aus dem Gesichtspunkt der Regulierung von jedem Expressionsspiegel eines Triggerfaktors, von GroEL und GroES bevorzugt ein induzierbarer Promotor. Beispiele für den induzierbaren Promotor umschließen zum Beispiel lac, tac, trc, trp, ara, Pzt-1, P_L und T7. Jeder der Promotoren lac, tac und trc kann durch Verwendung von Isopropyl-β-D-thiogalctopyranosid (IPTG) induziert werden; jeder der Promotoren trp, ara, Pzt-1 kann mit 3-Indolacrylsäure (IAA), L-Arabinose beziehungsweise Tetracyclin induziert werden; und der P_L-Promotor kann durch eine hohe Temperatur (42°C) induziert werden. Auch der T7-Promotor, der spezifisch und stark durch T7-RNA-Polymerase transkribiert wird, kann verwendet werden. In diesem Fall kann der T7-Promotor mit IPTG induziert werden, indem ein E. coli Stamm verwendet wird, der einen lysogenisierten λ-Phagen beherbergt, welcher das Gen für die T7-RNA-Polymerase stromabwärts des lac-Promotors ligiert trägt. Unter den Promotoren sind aus dem Gesichtspunkt der leichten Durchführbarkeit von Manipulationen zur Induktion lac, trp, ara und Pzt-1 vorzuziehen. Der Promotor ist in einem bekannten Vektor enthalten, und er kann verwendet werden, indem er unter Verwendung eines Restriktionsenzyms und dergleichen in geeigneter Weise ausgeschnitten wird.
Zusätzlich kann in dem Operon der vorliegenden Erfindung ein Faktor, der von einem Operon codiert wird, durch den Besitz eines Terminators, zum Beispiel durch rrnBT1T2 repräsentiert, stabiler exprimiert werden. Der Terminator ist in einem bekannten Vektor enthalten, und er kann verwendet werden, indem er unter Verwendung eines Restriktionsenzyms und dergleichen in geeigneter Weise ausgeschnitten wird.
Konkrete Beispiele des Operons der vorliegenden Erfindung umschließen zum Beispiel ein Operon, welches die in SEQ ID NO:7 dargestellte Nucleotidsequenz umfasst.
Eine der großartigen Eigenschaften des Plasmids der vorliegenden Erfindung beruht darauf, dass das Plasmid ein Gen trägt, welches einen Triggerfaktor codiert, oder es trägt das Operon.
Es ist bevorzugt, dass in dem Plasmid der vorliegenden Erfindung ein Faktor, der durch ein Gen codiert wird, welches einen Triggerfaktor codiert, oder Faktoren (Triggerfaktor, GroEL und GroES), die durch ein Operon codiert werden, exprimiert werden können, indem ein induzierbarer Promotor verwendet wird.
Wenn das Plasmid der vorliegenden Erfindung in eine Wirtszelle eingeführt wird, können zusätzlich ein gewünschtes fremdes Protein und ein Plasmid, welches ein Gen trägt, das einen Triggerfaktor codiert, oder ein Gen, das das Operon auf dem selben Plasmid codiert, verwendet werden. Zusätzlich können ein Plasmid, welches ein Gen, das einen Triggerfaktor codiert, oder ein Gen trägt, das das Operon codiert, und gleichzeitig ein Plasmid, welches ein Gen trägt, das ein fremdes Protein codiert (nachstehend hierin als „Coexpressionsplasmid" bezeichnet), verwendet werden. Unter diesen Plasmiden ist das Coexpressionsplasmid unter dem Gesichtspunkt, dass es nicht notwendig ist, für jedes fremde Protein ein Plasmid herzustellen, welches ein gewünschtes fremdes Protein und ein Gen, das einen Triggerfaktor codiert, oder ein Gen, das das Operon codiert, trägt, und unter dem Gesichtspunkt der Stabilität des Plasmids in einer Wirtszelle bevorzugt.
Um den Expressionsspiegel und den Expressionszeitpunkt des Triggerfaktors oder der Faktoren, die durch das Operon codiert werden, zu optimieren, ohne den Expressionsspiegel des fremden Proteins zu senken, ist es vorteilhaft, dass die Expression des Triggerfaktors oder der Faktoren, die durch das Operon codiert werden, unabhängig von der Expression eines gewünschten Proteins reguliert werden können. Auf Grund der vorstehend genannten Aspekte ist es vorzuziehen, dass die induzierbaren Promotoren, die für die Expression des Triggerfaktors oder der Faktoren, die durch das Operon codiert werden, sich von den Promotoren, die für die Expression eines gewünschten Proteins verwendet werden können, unterscheiden.
Wenn ein Coexpressionsplasmid als das Plasmid verwendet wird, kann jeder beliebige Expressionsvektor verwendet werden, solange er ein Replikon trägt, welches keine Unverträglichkeit mit einem Expressionsvektor des gewünschten Proteins in einer verwendeten Wirtszelle, einschließlich zum Beispiel E. coli, zeigt. Wenn zum Beispiel ein Vektor, der ein ColE1-Replikon trägt, wobei der Vektor zum Beispiel pBR322 einschließt, als ein Expressionsvektor für ein gewünschtes Protein verwendet wird, umschließt das Plasmid, das zur Expression des Triggerfaktors oder der Faktoren, die durch das Operon codiert werden, verwendet wird, das p15A-Replikon, welches in pACYC-Plasmidderivaten vorkommt.
Konkrete Beispiele für das Expressionsplasmid der vorliegenden Erfindung umschließen die Coexpressionsplasmide pTf13 und pG-Tf1. Schematische Darstellungen von jedem dieser Coexpressionsplasmide werden in den 1 beziehungsweise 2 gezeigt.
pTf13 und pG-Tf1 können jeweils zum Beispiel durch die in den nachstehenden Beispielen 1 und 2 beschriebenen Verfahren erhalten werden.
Die Cotransformante der vorliegenden Erfindung kann erhalten werden, indem das Plasmid der vorliegenden Erfindung (Coexpressionsplasmid) und ein Expressionsvektor für ein fremdes Protein in eine geeignete Wirtszelle eingeführt werden.
Der Expressionsvektor für ein fremdes Protein, der in der vorstehend beschriebenen Cotransformante verwendet wird, ist nicht speziell begrenzt. Der Vektor umschließt einen Vektor, der in der Lage ist, ein gewünschtes, fremdes Protein in dem Cytosol von Zellen zu exprimieren oder in das Periplasma von Zellen zu sekretieren und Verträglichkeit mit dem Coexpressionsplasmid zu zeigen. Im Einzelnen sind jene Vektoren, in denen die Expression eines gewünschten, fremden Proteins durch einen induzierbaren Promotor induziert wird, zu bevorzugen. Der induzierbare Promotor umschließt die gleichen Promotoren wie jene, die vorstehend aufgelistet wurden. Der Triggerfaktor oder die Faktoren, die von einem künstlich geschaffenen Operon codiert werden, können unabhängig von einem gewünschten, fremden Protein zur Expression induziert werden, indem ein Promotor ausgewählt wird, der sich von dem Promotor, der für die Induktion der Expression des Triggerfaktors oder der Faktoren, die von einem Operon codiert werden, unterscheidet.
Zusätzlich kann der Expressionsvektor für ein fremdes Protein ein Gen für einen Selektionsmarker tragen, falls der Fall es erfordert. Beispiele für solche Gene für einen Selektionsmarker umschließen Gene für Ampicillinresistenz (Amp^r), Gene für Kanamycinresistenz (Km^r) und Gene für Chloramphenicolresistenz (Cm^r). Eine Doppelselektion der Cotransformante kann ermöglicht werden, indem ein Gen für einen Selektionsmarker verwendet wird, das sich von jenem, das in dem Plasmid der vorliegenden Erfindung (Coexpressionsplasmid) enthalten ist, unterscheidet.
Der Expressionsvektor für ein fremdes Protein ist bevorzugt ein Vektor, der unter dem Gesichtspunkt der korrekten Bildung von Disulfidbindungen in dem entstandenen fremden Protein in der Lage ist, in das Periplasma von Zellen zu sekretieren. Beispiele für den Expressionsvektor umschließen zum Beispiel einen Vektor mit einem Gen, das ein Polypeptid codiert, das sich aus der Addition eines Signalpeptids wie etwa OmpA, OmpT, MalE oder β-Lactamase an ein gewünschtes fremdes Protein ergibt. Der Expressionsvektor kann zum Beispiel erhalten werden, indem ein Gen, das das Signalpeptid codiert, durch gentechnische Verfahren an eine Stelle angefügt wird, die dem N-Terminus eines gewünschten fremden Proteins entspricht, und das entstandene Gen in einen bekannten Vektor inkorporiert wird.
Zusätzlich kann in dem Expressionsvektor für ein fremdes Protein der vorliegenden Erfindung eine Sequenz enthalten sein, die die Reinigung eines gewünschten Proteins erleichtern kann, dargestellt zum Beispiel durch die Expression als ein Fusionsprotein mit einem Protein wie etwa β-Galactosidase, Glutathion-S-Transferase oder einem Maltose-gebundenen Protein; Expression als Histidinmarkierte Proteine oder dergleichen.
Der Wirtsorganismus, der in der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, umschließt zum Beispiel E. coli-Stämme. Konkrete Beispiele für die Stämme umschließen allgemein verwendete Stämme wie etwa HB101, JM109, MC4100, MG1655 und W3110; und zahlreiche Mutanten, einschließlich Protease-Mutanten wie etwa degP-Mutanten, ompT-Mutanten, tsp-Mutanten, Ion-Mutanten, clpPX-Mutanten, hslV/U-Mutanten, Ion-clpPX-Doppelmutanten und Ion-clpPX-hslV/U-Dreifachmutanten; plsX-Mutanten; rpoH-Mutanten wie etwa rpoH-Deletionsmutanten und rpoH-Missense-Mutanten und dergleichen.
In der vorliegenden Erfindung können Protease-Mutanten wie Ion-clpPX-Doppelmutanten und Ion-clpPX-hslV/U-Dreifachmutanten, plsX-Mutanten und rpoH-Mutanten unter dem Gesichtspunkt der stabileren Expression des fremden Proteins vorteilhaft verwendet werden. Unter den rpoH-Mutanten sind die rpoH-Deletionsmutanten unter dem Gesichtspunkt der stabileren Expression des fremden Proteins bevorzugt.
Hier ist eine bevorzugte Ion-clpPX-Doppelmutante der Stamm KY2783, der von dem E. coli-Stamm W3110 abstammt, wobei der Stamm KY2783 durch Einführen von Doppel-Deletionsmutationen in die Ion- und clPX-Gene entstanden ist. Der Stamm KY2783 wurde als E. coli-Stamm KY2783 bezeichnet und gekennzeichnet und ist unter der Zugangsnummer FERM BP-6244 im National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry hinterlegt, dessen Adresse 1–3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japan ist; Datum der ersten Hinterlegung: 3. Februar 1998.
Auch der Ausdruck "Ion-clpPX-hslV/U-Dreifachmutante" betrifft eine Mutante, die durch weiteres Mutieren des hslV/U-Gens, welches HslV/U-Protease codiert, in die vorstehend beschriebene Ion-clpPX-Doppelmutante hergestellt wird. Ein Vorzug wird dem Stamm KY2893 gegeben, der vom E. coli-Stamm W3110 abstammt, der Stamm KY2893 ist durch Einführen der Dreifachmutationen in die Gene Ion, clpPX und hslV/U entstanden. Der Stamm KY2893 wurde als E. coli-Stamm KY2893 bezeichnet und hinterlegt und ist unter der Zugangsnummer FERM BP-6243 im National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry hinterlegt, dessen Adresse 1–3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japan ist; Datum der ersten Hinterlegung: 3. Februar 1998.
Das fremde Protein, das in der vorliegenden Erfindung exprimiert werden soll, kann jedes beliebige Protein sein, solange es ein fremdes Protein ist, das in E. coli destabilisiert und/oder desolubilisiert werden kann. Konkrete Beispiele für die fremden Proteine umschließen Interferone, Interleukine, Interleukin-Rezeptoren, Interleukin-Rezeptor-Antagonisten, Granulocytenkolonie stimulierende Faktoren, Granulocyten-Makrophagenkolonie stimulierende Faktoren, Makrophagenkolonie stimulierende Faktoren, Erythropoietin, Thrombopoietin, Leukämie hemmende Faktoren, Stammzellen-Wachstumsfaktoren, Tumornekrose-Faktoren, Wachstumshormone, Proinsulin, Insulin-ähnliche Wachstumsfaktoren, Fibroblasten-Wachstumsfaktoren, von Blutplättchen stammende Wachstumsfaktoren, transformierende Wachstumsfaktoren, Hepatocyten-Wachstumsfaktoren, Knochen bildende Faktoren, Nerven-Wachstumsfaktoren, ciliare neurotrophe Faktoren, Gehirn-stämmige neurotrophe Faktoren, Glia-stämmige neurotrophe Faktoren, Neurotrophine, Angiogenese-Hemmer, Prourokinase, Gewebe-Plasminogen-Aktivatoren, Blutgerinnungsfaktoren, Protein C, Glucocerebrosidase, Superoxid-Dismutase, Renin, Lysozym, P450, Prochymosin, Trypsin-Hemmer, Elastase-Hemmer, Lipocortin, Reptin, Immunoglobuline, Einzelketten-Antikörper, Komplement-Komponenten, Serumalbumin, Zedernpollen-Allergene, Hypoxie-induzierte Stressproteine, Proteinkinasen, Proto-Onkogen-Produkte, Transkription-Regulierungsfaktoren und Virus-konstituierende Proteine.
Das Verfahren zur Einführung des Plasmids der vorliegenden Erfindung in E. coli zusammen mit einem Expressionsvektor für ein fremdes Protein umschließt ein gebräuchliches Verfahren wie etwa das Calciumchlorid-Verfahren, das Rubidiumchlorid-Verfahren oder das Elektroporationsverfahren. Die Cotransformante kann unter Verwendung eines Reagenzes in Abhängigkeit vom Gen für den Selektionsmarker durchmustert werden. Die Expression des fremden Proteins kann zum Beispiel durch Western-Blotanalyse bestätigt werden.
Eine der großartigen Eigenschaften des Verfahrens zum Produzieren eines fremden Proteins beruht darauf, dass das Verfahren das Exprimieren des fremden Proteins durch die Verwendung der vorstehend beschriebenen Cotransformante umfasst. Das fremde Protein kann zum Beispiel durch einen Prozess produziert werden, welcher umfasst: Kultivierung einer Transformante unter Induktionsbedingungen, bei denen der Expressionsspiegel des Triggerfaktors oder der Expressionsspiegel von sowohl Triggerfaktor, GroEL als auch GroES in einer Höhe liegt, die für Stabilisierung und/oder Solubilisierung eines zu exprimierenden fremden Proteins geeignet ist; Ernten der Zellen; Aufbrechen der geernteten Zellen; Isolieren und Reinigen des fremden Proteins aus der Lösung der aufgebrochenen Zellen im Einklang mit dem von dem gewünschten fremden Protein abhängigen Reinigungsverfahren.
Die Induktionsbedingungen unterscheiden sich in Abhängigkeit der induzierbaren Promotoren, die für das Plasmid der vorliegenden Erfindung verwendet werden, und dem Expressionsvektor für ein fremdes Protein, solange die Bedingungen in der Weise sind, dass der Expressionsspiegel des Triggerfaktors oder der Expressionsspiegel von sowohl Triggerfaktor, GroEL als auch GroES jeweils in einer Höhe liegt, die für Stabilisierung und/oder Solubilisierung des fremden Proteins geeignet ist. Zum Beispiel können die Induktionsbedingungen wie folgt bestimmt werden.
Zuerst wird die induktive Substanz für den Promotor unter Variierung verschiedener Zugabekonzentrationen und des Zeitpunktes der Zugabe zugegeben. Die Zellen, in denen das fremde Protein exprimiert wird, werden geerntet und jede der geernteten Zellen wird aufgebrochen, um einen zellfreien Extrakt zu erhalten. Jeder der erhaltenen Extrakte wird zum Beispiel der SDS-PAGE unterworfen, und anschließend werden die Proteinen zugeschriebenen Banden in dem Gel durch Anfärbung mit Coomassie-Brilliant-blau oder durch Silberfärbung sichtbar gemacht. Unter den sichtbar gemachten Banden können geeignete Induktionsbedingungen für die Bande, die einem fremden Protein zugeschrieben wird, untersucht werden, indem die Konzentration der Bande durch Densitometrie oder andere Verfahren bestimmt werden.
Die Kulturbedingungen für die Cotransformante unterscheiden sich in Abhängigkeit von den Zellen, die als Wirtszellen verwendet werden, und sind nicht speziell begrenzt. Der Spiegel an exprimiertem, fremdem Protein kann in der gleichen Weise bestimmt werden wie die Bestimmung der Induktionsbedingungen, indem verschiedene Kulturzeiträume und Kulturtemperaturen festgesetzt werden, um das fremde Protein unter den jeweiligen Kulturbedingungen zu exprimieren.
Das Verfahren zur Isolierung und Reinigung eines fremden Proteins umschließt zum Beispiel Reinigungsverfahren für Protein wie etwa Aussalzen, Ionenaustausch-Chromatographie, hydrophobe Chromatographie, Affinitätschromatographie, Gelfiltrationschromatographie und dergleichen.
Darüber hinaus betrifft eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung einen Kit, welcher das Operon oder das Plasmid oder die Cotransformante der Erfindung umfasst.
Vorteilhafterweise umfasst der Kit der vorliegenden Erfindung darüber hinaus optional (a) Reaktionspufferlösung(en) und/oder Lösung(en) zur Lagerung. Teile des Kits der Erfindung können individuell in Ampullen oder in Kombination in Behältern oder in Multi-Behälter-Einheiten verpackt werden. Der Kit der vorliegenden Erfindung kann vorteilhaft verwendet werden, um das Verfahren der Erfindung durchzuführen, und könnte unter anderen für eine Vielzahl von Anwendungen, die vorstehend genannt werden, eingesetzt werden, z.B. in diagnostischen Kits oder als Forschungsmittel. Zusätzlich kann der Kit der Erfindung Nachweismittel enthalten, die für wissenschaftliche und/oder diagnostische Zwecke geeignet sind. Die Herstellung der Kits folgt bevorzugt Standardverfahren, die Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sind.
Demzufolge kann der Kit verwendet werden, um das Verfahren der vorliegenden Erfindung durchzuführen.
Im Text der Beschreibung werden mehrere Dokumente zitiert. Es besteht jedoch kein Zugeständnis, dass jedes zitierte Dokument tatsächlich Stand des Wissens für die vorliegende Erfindung ist.
Die vorliegende Erfindung wird hierin nachstehend mit Hilfe der nachstehenden Beispiele genauer beschrieben, wodurch der Rahmen oder der Geist der vorliegenden Erfindung aber nicht eingeschränkt werden soll.
Beispiel 1: Konstruktion von pTf113
Ein Fragment mit etwa 2,6 kB, das das tig-Gen trug, wurde mit XmnI und NruI aus dem Kohara-Clon Nr. 148 [Kohara, Y. et al., Cell 50, 495–508 (1987)] ausgeschnitten und umfasste einen Triggerfaktor, und anschließend wurden an dem entstandenen XmnI-NruI-Fragment die Enden in glatte Enden überführt, um ein tig-Gen-Fragment zu ergeben. Das pAR3-Plasmid [Perez-Perez, J. und Guitierrez, J., Gene 958, 141–142 (1995)] wurde mit PstI gespalten, und anschließend wurden die Enden des entstandenen linearisierten Plasmidfragmentes in glatte Enden überführt, um ein pAR3-Fragment zu erhalten. Das, wie vorstehend beschrieben, erhaltene tig-Gen-Fragment wurde in das pAR3-Fragment ligiert, wodurch pTf13 konstruiert wurde.
Beispiel 2: Konstruktion von gG-Tf1
Ein Fragment mit etwa 2,5 kB, welches das tig-Gen trug, wurde mit Bsp12861I und NruI aus dem vorstehend genannten Kohara-Clon Nr. 148 ausgeschnitten, und anschließend wurden an dem entstandenen Bsp12861I-NruI-Fragment die Enden in glatte Enden überführt, um ein tig-Gen-Fragment zu ergeben. Das pGrol1-Plasmid (Nishihara, K. et al., Appl. Environ. Microbiol. 64, 1694–1699 (1998)] wurde mit SmaI stromabwärts vom groEL-Gen gespalten, und anschließend wurde das entstandene, glattendige tig-Gen-Fragment in das linearisierte Plasmidfragment ligiert, um pG-Tf1 zu erhalten.
Beispiel 3: Herstellung der Cotransformante zur Expression von murinenm Endostatin
E. coli-Stamm BL21 wurde mit pTB01#8 [O'Reilly, M.S. et al., Cell 88, 277–285 (1997); verfügbar gemacht von Dr. Thomas Boehm und Dr. Judah Folkman aus dem Children's Hospital, Harvard Medical School] (50 ng), welches murines Endostatin codierte, und entweder pTf13 oder pG-Tf1 (jeweils 50 ng) transformiert, um eine Cotransformante zu erhalten. Hier wurde die Transformation durch das Calciumchlorid-Verfahren durchgeführt.
Die Cotransformante, die pTf13 und pTB01#8 beherbergte, wurde durch Durchmusterung mit einer Platte, die Chloramphenicol und Ampicillin in Konzentrationen von 20 μg/ml beziehungsweise 50 μg/ml enthielt, erhalten. Der entstandene Clon, in dem der Triggerfaktor zusammen mit dem murinen Endostation coexprimiert wurde, wurde NK365 genannt.
Die Cotransformante, die pG-Tf1 und pTB01#8 beherbergte, wurde durch Durchmusterung mit einer Platte, die Chloramphenicol und Ampicillin in Konzentrationen von 20 μg/ml beziehungsweise 50 μg/ml enthielt, erhalten. Der entstandene Clon, in dem der Triggerfaktor, GroEL und GroES zusammen mit dem murinen Endostation coexprimiert wurden, wurde NK364 genannt.
Als ein vergleichendes Beispiel wurden jede der Cotransformanten hergestellt, eine, in der GroEL und GroES mit murinem Endostatin coexprimiert wurden; eine, in der DnaK, DnaJ und GrpE mit murinem Endostatin coexprimiert wurden; beziehungsweise eine, in der DnaK, DnaJ, GrpE, GroEL und GroES mit murinem Endostatin coexprimiert wurden.
Der Clon, in dem DnaK, DnaJ, GrpE, GroEL und GroES mit murinem Endostatin coexprimiert wurden, wurde durch Cotransformation mit pG-KJE8 und pTB01#8 und Durchmusterung mit einer Platte, die Chloramphenicol und Ampicillin in Konzentrationen von 20 μg/ml beziehungsweise 50 μg/ml enthielt, erhalten. Der entstandene Clon wurde NK363 genannt.
PG-KJE8 wurde in der nachstehend beschriebenen Weise mit einem Plasmid hergestellt, das in der Lage war, die Chaperon-Expression genauer zu regulieren, indem eine rrnBT1T2-Terminatorsequenz stromabwärts des dnaK-dnaJ-grpE-Gens in pG-KJE6 inseriert wurde [Nishihara, K. et al., Appl. Environ. Microbiol. 64, 1694–1699 (1988)]. Zuerst wurde pKJE7 mit KpnI an der KpnI-Stelle, die stromabwärts des dnaK-dnaJ-grpE-Gens liegt, gespalten, um ein linearisiertes KpnI-Fragment zu erhalten, und anschließend wurden am entstandenen KpnI-Fragment die Enden in glatte Enden überführt. Als nächstes wurde die rrnBT1T2-Sequenz, die aus pTrc99A (hergestellt von Pharmacia) an der XmnI-Stelle ausgeschnitten worden war, an das glattendige Fragment ligiert, wodurch Plasmid pKJE9 entstand. Anschließend wurde pKJE9 an der XmnI-Stelle gespalten, und ein glattendiges tetR-Pzt1p-groES-groEL-Fragment wurde in der gleichen Weise wie im Falle der Herstellung von pG-KJE6 inseriert. Ein Plasmid, in dem das tetR-Pzt1p-groES-groEL-Fragment in der gleichen Ausrichtung wie pG-KJE6 inseriert war, wurde selektiert, und das Plasmid wurde pG-KJE8 genannt.
Beispiel 4: Expression von murinem Endostatin
Die Expression von murinem Endostatin wurde unter Verwendung von jeder der in Beispiel 3 erhaltenen Cotransformanten untersucht. Die Kultivierung wurde unter Verwendung von L-Medium durchgeführt (Zusammensetzung: 1% Bactotrypton, 0,5% Hefeextrakt, 0,5% NaCl, 20 μg/ml Chloramphenicol und 50 μg/ml Ampicillin).
Jede der Cotransformanten wurde bei 37°C kultiviert. Die Expression des Chaperons wurde durch Zugabe von L-Arabinose (Endkonzentration: 10 mg/ml) zu einem Medium für NK365 zu Beginn der Kultivierung induziert. Alternativ wurde die Expression des Chaperons durch Zugabe von Tetracyclin (Endkonzentration 10 ng/ml) zu einem Medium für NK364 induziert. Anschließend, sobald die Klett-Einheit etwa 60 betrug, wurde die Expression von Endostatin durch Zugabe von 10 mM MgSO₄ und 3 × 10⁹ PbE/ml λ-Phage CE6 (hergestellt von Novagen) zu einem Kulturmedium induziert.
Die Expression von GroEL und GroES zusammen mit murinem Endostatin wurde durch Zugabe von Tetracyclin (50 ng/ml) zu Beginn der Kultivierung von NK363 und Zugabe von 10 mM MgSO₄ und λ-Phage CE6 in gleicher Weise, wie vorstehend beschrieben, zu einem Kulturmedium, wenn die Klett-Einheit etwa 60 betrug, induziert.
Zusätzlich wurde die Expression von DnaK, DnaJ, GrpE zusammen mit murinem Endostatin induziert, indem L-Arabinose (10 mg/ml) zu Beginn der Kultivierung zugegeben wurde, und, wenn die Klett-Einheit etwa 60 betrug, sowohl MgCl₂ als auch λ-Phage CEG zu einem Kulturmedium zugegeben wurden.
Darüber hinaus wurde die Expression von DnaK, DnaJ, GrpE, GroEL und GroES zusammen mit murinem Endostatin induziert, indem L-Arabinose (10 mg/ml) und Tetracyclin (20 ng/ml) zu Beginn der Kultivierung zugegeben und, wenn die Klett-Einheit etwa 60 betrug, MgCl₂ und λ-Phage CEG zu einem Kulturmedium zugegeben wurden.
Nachdem die Induktion die Expression von Endostatin über 2 Stunden durchgeführt worden war, wurden die Zellen geerntet. Die erhaltenen Zellen wurden mittels Ultraschall aufgebrochen, und anschließend wurden die aufgebrochenen Zellen bei 8200 × g zentrifugiert, wodurch eine lösliche Fraktion von einer unlöslichen Fraktion getrennt wurde. Jede der Fraktionen wurde der SDS-PAGE in einer Menge eines 8-μg Äquivalents an zellulärem Protein unterzogen. Hier wurde eine von NK365 erhaltene Fraktion, die die Expression des Triggerfaktors nicht induziert, als eine Kontrolle verwendet. Die Ergebnisse werden in 3 dargestellt.
Wie auf der linken Tafel von 3 dargestellt, wurde in dem Fall der Coexpression von murinem Endostatin, das normalerweise nicht solubilisiert ist und als Einschlusskörperchen in E. coli exprimiert wird, mit GroEL und GroES der größte Teil an Endostatin in der löslichen Fraktion nachgewiesen, jedoch wurde eine geringe Menge murines Endostatin auch in der unlöslichen Fraktion nachgewiesen. Darüber hinaus wurde auch im Falle der Coexpression von murinem Endostatin mit DnaK, DnaJ, GrpE oder der Coexpression von murinem Endostatin mit DnaK, DnaJ, GrpE, GroEL und GroES murines Endostatin in der unlöslichen Fraktion nachgewiesen.
Auf der anderen Seite wurde, nach den Ergebnissen der rechten Tafel aus 3, in beiden Fällen der Coexpression von murinem Endostatin mit dem Triggerfaktor und der Coexpression von murinem Endostatin mit dem Triggerfaktor, GroEL und GroES das exprimierte Endostatin nur in der löslichen Fraktion nachgewiesen, in der unlöslichen Fraktion jedoch nicht nachgewiesen. Zusätzlich wurde beim Vergleich mit der Kontrolle, bei der es keine Coexpression eines fremden Proteins zusammen mit einem Triggerfaktor oder mit dem Triggerfaktor, GroEL und GroES gab, beobachtet, dass die lösliche Fraktion erhöht war.
Wie vorstehend beschrieben, kann im Vergleich mit der Coexpression mit jedem der Chaperone GroEL und GroES; DnaK, DnaJ, GrpE; und DnaK, DnaJ, GrpE, GroEL und GroES eine unerwartete, ausgezeichnete Solubilisierungswirkung für ein fremdes Protein durch Coexpression mit dem Triggerfaktor oder mit dem Triggerfaktor, GroEL und GroES erhalten werden.
Beispiel 5: Herstellung einer Cotransformante für die Expression von menschlichem ORP150
E. coli-Stamm JM109 wurde mit Plasmid pORP4 (50 ng), welches menschliches ORP150 und jeweils (jeweils 50 ng) pTf13 oder pG-Tf1 codiert, erhalten aus Beispiel 1 oder 2, und pGro1 transformiert, das ein Plasmid ist, welches GroEL und GroES beherbergt, [Nishihara, K. et al., Appl. Environ. Microbiol. 64,: 1694–1699 (1988)]. Hier wurde die Transformation mit dem Calciumchlorid-Verfahren durchgeführt.
Die Cotransformante von pTf13 und pORP4 wurde durch Durchmusterung mit einer Platte, die Chloramphenicol und Ampicillin in Konzentrationen von 20 μg/ml beziehungsweise 50 μg/ml enthielt, erhalten. Der entstandene Clon wurde NK360 genannt.
Die Cotransformante von pG-Tf1 und pORP4 wurde durch Durchmusterung mit einer Platte, die Chloramphenicol und Ampicillin in Konzentrationen von 20 μg/ml beziehungsweise 50 μg/ml enthielt, erhalten. Der entstandene Clon wurde NK340 genannt.
Die Cotransformante von pGro11 und pORP4 wurde durch Durchmusterung mit einer Platte, die Chloramphenicol und Ampicillin in Konzentrationen von 20 μg/ml beziehungsweise 50 μg/ml enthielt, erhalten. Der entstandene Clon wurde NK341 genannt.
Beispiel 6: Expression von menschlichem ORP150
Die Expression von menschlichem ORP150 wurde für jeden Clon NK360, NK340 und NK341, die in Beispiel 5 erhalten worden waren, untersucht. Die Kultivierung wurde unter Verwendung von L-Medium durchgeführt (Zusammensetzung: 1% Bactotrypton, 0,5% Hefeextrakt, 0,5% NaCl, 20 μg/ml Chloramphenicol und 50 μg/ml Ampicillin).
Jede der Cotransformanten wurde bei 37°C kultiviert. Die Expression von Chaperon und ORP150 wurde durch Zugabe von Tetracyclin (Endkonzentration 10 ng/ml) und IPTG (Endkonzentration 1 mM) zu jedem der Kulturmedien von NK340 und NK341 induziert, wenn die Klett-Einheit etwa den Wert 40 erreicht hatte. Die Expression des Triggerfaktors wurde durch Zugabe von L-Arabinose (Endkonzentration: 10 mg/ml) zu einem Kulturmedium von NK360 induziert, wenn die Klett-Einheit etwa den Wert 20 erreicht hatte. Anschließend wurde die Expression von ORP150 durch Zugabe von IPTG (Endkonzentration: 1 mM) induziert, wenn die Klett-Einheit etwa den Wert 40 erreicht hatte.
Zwei Stunden nach Zugabe von IPTG wurden alle Zellen geerntet. Die erhaltenen Zellen wurden mittels Ultraschall aufgebrochen, und anschließend wurden die aufgebrochenen Zellen bei 8200 × g zentrifugiert, wodurch eine lösliche Fraktion von einer unlöslichen Fraktion getrennt wurde. Jede der Fraktionen wurde der SDS-PAGE in einer Menge eines 8 μg-Äquivalents an zellulärem Protein unterzogen. Hier wurde eine von NK341 erhaltene Fraktion, die die Expression der Chaperone (GroEL, GroES) nicht induziert, als eine Kontrolle verwendet. Die Ergebnisse werden in 4 dargestellt.
Aus den Ergebnissen in 4 wird deutlich, dass die Hälfte des exprimierten ORP150 durch Coexprimieren von ORP150, das normalerweise nicht solubilisiert ist und als Einschlusskörperchen in E. coli exprimiert wird, mit GroEL, GroES oder mit dem Triggerfaktor löslich wird und dass durch Coexpression mit GroEL und GroES und dem Triggerfaktor nahezu das gesamte ORP150 löslich wird.
Das Operon und das Plasmid der vorliegenden Erfindung zeigen hervorragende Eigenschaften im Hinblick darauf, dass das fremde Protein in einem stabilisierten Status und in einem solubilisierten Status durch Coexpression eines gewünschten fremden Gens exprimiert werden kann. Zusätzlich zeigt die Cotransformante der vorliegenden Erfindung eine hervorragende Wirkung darin, dass das fremden Protein in einem stabilisierten Status und in einem solubilisierten Status exprimiert werden kann. Darüber hinaus kann im Einklang mit einem Verfahren zum Produzieren eines fremden Proteins der vorliegenden Erfindung eine hervorragende Wirkung im Hinblick auf die Expression des fremden Proteins in einem stabilisierten Status und in einem solubilisierten Status gezeigt werden. Im Einklang mit der vorliegenden Erfindung ist es ermöglicht worden, ein fremdes Protein in E. coli durch gentechnische Verfahren effizient zu produzieren.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Operon, umfassend ein Gen, welches einen Triggerfaktor, ein Gen, welches GroEL, und ein Gen, welches GroES codiert, wobei das Gen, welches den Triggerfaktor codiert, ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: (a) einem Gen, welches einen Faktor codiert, der die Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID NO:1 gezeigt, besitzt; (b) einem Gen, welches die Nucleotidsequenz, wie in SEQ ID NO:2 gezeigt, umfasst; (c) einem Gen, welches eine DNA umfasst, die in der Lage ist, unter stringenten Bedingungen mit dem komplementären Strang der Polynucleotide aus (a) oder (b) zu hybridisieren, wobei das Gen einen Faktor codiert, der PPlase-Aktivität hat; wobei das Gen, welches GroEL codiert, ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: (d) einem Gen, welches einen Faktor codiert, der eine Sequenz, wie in SEQ ID NO:3 gezeigt, besitzt; (e) einem Gen, welches die Nucleotidsequenz, wie in SEQ ID NO:5 gezeigt, umfasst; (f) einem Gen, welches eine DNA umfasst, die in der Lage ist, unter stringenten Bedingungen mit dem komplementären Strang der Polynucleotide aus (d) oder (e) zu hybridisieren, wobei das Gen einen Faktor codiert, welcher eine Funktion des Wild-Typs GroEL hat, der die Sequenz, wie in SEQ ID NO:3 gezeigt, besitzt; und wobei das Gen, welches GroES codiert, ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus (g) einem Gen, welches einen Faktor codiert, der eine Sequenz, wie in SEQ ID NO:4 gezeigt, besitzt; (h) einem Gen, welches die Nucleotidsequenz, wie in SEQ ID NO:6 gezeigt, umfasst; (i) einem Gen, welches eine DNA umfasst, die in der Lage ist, unter stringenten Bedingungen mit dem komplementären Strang der Polynucleotide nach (g) oder (h) zu hybridisieren, wobei das Gen einen Faktor codiert, der eine Funktion des Wild-Typs GroES hat, der die Sequenz, wie in SEQ ID NO:4 gezeigt, besitzt.
Operon nach Anspruch 1, zusätzlich umfassend einen induzierbaren Promotor.
Operon nach Anspruch 2, wobei der induzierbare Promotor ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus lac, trp, ara und Pzt-1.
Plasmid, welches in der Lage ist, jeden der folgenden, Triggerfaktor, GroEL und GroES, zu exprimieren, wobei das Plasmid das Operon nach einem der Ansprüche 1 bis 3 enthält.
Cotransformante, welche das Plasmid nach Anspruch 4 sowie ein Expressionsplasmid für ein Fremdprotein enthält.
Cotransformante nach Anspruch 5, erhältlich durch die Verwendung einer plsX- Mutante, einer rpoH-Mutante oder einer Protease-Mutante aus E. coli als Wirt.
Cotransformante nach Anspruch 6, wobei die Protease-Mutante eine Ion-clpPX-Doppelmutante oder eine Ion-clpPX-hslV/U-Dreifachmutante ist.
Cotransformante nach Anspruch 6, wobei die rpoH-Mutante eine rpoH-Deletions-Mutante ist.
Cotransformante nach einem der Ansprüche 5 bis 8, wobei das Fremdprotein ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Interferonen, Interleukinen, Interleukin-Rezeptoren, Interleukin-Rezeptor-Antagonisten, Granulocyten-Kolonie-stimulierenden Faktoren, Granulocyten-Makrophagen-Koloniestimulierenden Faktoren, Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktoren, Erythropoietin, Thrombopoietin, Leukämie-inhibierenden Faktoren, Stammzell-Wachstumsfaktoren, Tumor-Nekrose-Faktoren, Wachstumshormonen, Proinsulin, Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktoren, Fibroblasten-Wachstumsfaktoren, aus Blutplättchen abgeleiteten Wachstumsfaktoren, transformierenden Wachstumsfaktoren, Hepatocyten-Wachstumsfaktoren, Osteogenese-Faktoren, Nervenwachstumsfaktoren, ziliaren neurotrophischen Faktoren, aus dem Gehirn stammenden neurotrophischen Faktoren, aus Glia stammenden neurotrophischen Faktoren, Neurotrophin, Angiogeneseinhibitoren, Prourokinase, Gewebeplasminogenaktivatoren, Blutgerinnungsfaktoren, Protein C, Glucocerebrosidase, Superoxiddismutase, Renin, Lysozym, P450, Prochymosin, Trypsininhibitoren, Elastaseinhibitoren, Lipocortin, Reptin, Immunglobulinen, Einzelkettenantikörpern, Komplement-Komponenten, Serumalbumin, Zederpollenallergenen, Hypoxie-induzierten Stressproteinen, Proteinkinasen, protoonkogenen Produkten, Transkriptionsregulationsfaktoren und Virus-konstituierenden Proteinen.
Verfahren zur Herstellung eines Fremdproteins, umfassend die Expression des Fremdproteins durch die Verwendung der Cotransformanten nach einem der Ansprüche 5 bis 9.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei die Cotransformante so unter Induktionsbedingungen gezüchtet wird, dass eine Expressionshöhe des Triggerfaktors, oder eine Expressionshöhe von jedem der folgenden, Triggerfaktor, GroEL und GroES, eine Höhe erreicht, die geeignet ist, um die Fremdproteine zu solubilisieren.
Kit, umfassend das Operon nach einem der Ansprüche 1 bis 3, das Plasmid nach Anspruch 4 oder die Cotransformante nach einem der Ansprüche 5 bis 9.
Verwendung des Kits nach Anspruch 12, zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 10 oder 11.