JP2000189163A - トリガ―ファクタ―発現プラスミド - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】
【課題】外来タンパク質を可溶化した状態で、かつ正常
な立体構造を保持した状態で発現させうる人工オペロ
ン、該オペロンを有する発現プラスミド、該プラスミド
と外来タンパク質発現ベクターとを含有した共形質転換
体及び該共形質転換体を用いることを特徴とする外来タ
ンパク質の製造方法を提供すること。 【解決手段】トリガーファクター、ＧｒｏＥＬ及びＧｒ
ｏＥＳをコードする遺伝子を含有した人工オペロン；前
記人工オペロンを保持するプラスミド；トリガーファク
ターをコードする遺伝子を保持するプラスミド；前記い
ずれかのプラスミドと外来タンパク質用発現プラスミド
とを保持する共形質転換体；並びに前記共形質転換体を
用いることを特徴とする外来タンパク質の製造方法。
な立体構造を保持した状態で発現させうる人工オペロ
ン、該オペロンを有する発現プラスミド、該プラスミド
と外来タンパク質発現ベクターとを含有した共形質転換
体及び該共形質転換体を用いることを特徴とする外来タ
ンパク質の製造方法を提供すること。 【解決手段】トリガーファクター、ＧｒｏＥＬ及びＧｒ
ｏＥＳをコードする遺伝子を含有した人工オペロン；前
記人工オペロンを保持するプラスミド；トリガーファク
ターをコードする遺伝子を保持するプラスミド；前記い
ずれかのプラスミドと外来タンパク質用発現プラスミド
とを保持する共形質転換体；並びに前記共形質転換体を
用いることを特徴とする外来タンパク質の製造方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、外来タンパク質を
可溶化した状態で、かつ正常な立体構造を保持した状態
で発現させうる、人工オペロン、該オペロンを有する発
現プラスミド、該プラスミドと外来タンパク質発現ベク
ターとを含有した共形質転換体および該共形質転換体を
用いることを特徴とする外来タンパク質の製造方法に関
する。
可溶化した状態で、かつ正常な立体構造を保持した状態
で発現させうる、人工オペロン、該オペロンを有する発
現プラスミド、該プラスミドと外来タンパク質発現ベク
ターとを含有した共形質転換体および該共形質転換体を
用いることを特徴とする外来タンパク質の製造方法に関
する。
【０００２】
【従来の技術】トリガーファクターは、イン・ビトロで
の大腸菌外膜タンパク質のＯｍｐＡの前駆体であるｐｒ
ｏＯｍｐＡの膜への輸送に必要な細胞質因子として発見
された因子である〔Crooke, E. and Wickner, W., Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA, 84,5216-5220 (1987)〕。ま
た、分子量４８ｋＤａのトリガーファクターをコードす
る遺伝子としてｔｉｇ遺伝子がクローニングされている
〔Guthrie, B. and Wickner, W., J. Bacteriol., 172,
5555-5562 (1990) 〕。アミノ酸配列の解析により、ト
リガーファクターはＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢ
Ｐ）ドメインを有し、ＦＫ５０６との結合活性とペプチ
ジル−プロリルイソメラーゼ（ＰＰＩａｓｅ）活性の発
現に必要なすべてのアミノ酸が保存されていることが明
らかにされている〔Callebaut, I. and Mornon, J. -
P., FEBS Lett., 374, 211-21 (1995)〕。
の大腸菌外膜タンパク質のＯｍｐＡの前駆体であるｐｒ
ｏＯｍｐＡの膜への輸送に必要な細胞質因子として発見
された因子である〔Crooke, E. and Wickner, W., Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA, 84,5216-5220 (1987)〕。ま
た、分子量４８ｋＤａのトリガーファクターをコードす
る遺伝子としてｔｉｇ遺伝子がクローニングされている
〔Guthrie, B. and Wickner, W., J. Bacteriol., 172,
5555-5562 (1990) 〕。アミノ酸配列の解析により、ト
リガーファクターはＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢ
Ｐ）ドメインを有し、ＦＫ５０６との結合活性とペプチ
ジル−プロリルイソメラーゼ（ＰＰＩａｓｅ）活性の発
現に必要なすべてのアミノ酸が保存されていることが明
らかにされている〔Callebaut, I. and Mornon, J. -
P., FEBS Lett., 374, 211-21 (1995)〕。
【０００３】トリガーファクターは、大腸菌リボソーム
の５０Ｓサブユニットに結合したＰＰＩａｓｅとしても
同定され、該トリガーファクターは、変異型ＲＮａｓｅ
Ｔ１のイン・ビトロでのリフォールディングにおけるプ
ロリル異性化反応を著しく促進することが報告されてい
る〔Stoller, G. et al. (1995) EMBO J. 14, 4939-494
8 〕。さらに、クロスリンク試薬を用いた実験により、
トリガーファクターは大腸菌リボソーム上の新生ポリペ
プチド鎖と結合することが見出されている〔Valent, Q.
A. et al., EMBO J., 14, 5494-5505 (1995); Hesterk
amp, T. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 443
7-4441(1996)〕。また、トリガーファクターはＧｒｏＥ
Ｌのアンフォールドタンパク質への結合を促進すること
も知られている〔Kandror, O. et al., EMBO J., 14, 6
021-6027 (1995) ;Kandror, O. et al., J. Biol. Che
m., 272, 1730-1734 (1997)〕。
の５０Ｓサブユニットに結合したＰＰＩａｓｅとしても
同定され、該トリガーファクターは、変異型ＲＮａｓｅ
Ｔ１のイン・ビトロでのリフォールディングにおけるプ
ロリル異性化反応を著しく促進することが報告されてい
る〔Stoller, G. et al. (1995) EMBO J. 14, 4939-494
8 〕。さらに、クロスリンク試薬を用いた実験により、
トリガーファクターは大腸菌リボソーム上の新生ポリペ
プチド鎖と結合することが見出されている〔Valent, Q.
A. et al., EMBO J., 14, 5494-5505 (1995); Hesterk
amp, T. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 443
7-4441(1996)〕。また、トリガーファクターはＧｒｏＥ
Ｌのアンフォールドタンパク質への結合を促進すること
も知られている〔Kandror, O. et al., EMBO J., 14, 6
021-6027 (1995) ;Kandror, O. et al., J. Biol. Che
m., 272, 1730-1734 (1997)〕。
【０００４】ＰＰＩａｓｅはペプチド鎖中のプロリン残
基に作用し、ペプチド結合に関する配置のシス−トラン
ス異性化を触媒する。この反応はタンパク質の折畳み過
程の律速段階とされており、ＰＰＩａｓｅファミリータ
ンパク質の役割として、細胞内でのタンパク質折畳み、
リフォールディング、会合と解離、輸送などへの関与が
考えられている。
基に作用し、ペプチド結合に関する配置のシス−トラン
ス異性化を触媒する。この反応はタンパク質の折畳み過
程の律速段階とされており、ＰＰＩａｓｅファミリータ
ンパク質の役割として、細胞内でのタンパク質折畳み、
リフォールディング、会合と解離、輸送などへの関与が
考えられている。
【０００５】また、イン・ビトロにおいては、トリガー
ファクターがいくつかのタンパク質の折り畳みを助ける
ことが示されている〔Scholz, C. et al., EMBO J. 16,
54-58, (1997)〕。しかしながら、トリガーファクター
の機能の実態は不明であった。
ファクターがいくつかのタンパク質の折り畳みを助ける
ことが示されている〔Scholz, C. et al., EMBO J. 16,
54-58, (1997)〕。しかしながら、トリガーファクター
の機能の実態は不明であった。
【０００６】大腸菌による外来タンパク質の発現におい
て、シャペロンを共発現させて目的の外来タンパク質の
不溶化抑制および安定化の試みは、これまで種々行なわ
れている。しかしながら、どのタンパク質にどのシャペ
ロンの共発現が有効かを予測することは困難であり、試
行錯誤が繰り返されている。また、既知のシャペロンの
共発現では十分な効果が得られない場合もある。
て、シャペロンを共発現させて目的の外来タンパク質の
不溶化抑制および安定化の試みは、これまで種々行なわ
れている。しかしながら、どのタンパク質にどのシャペ
ロンの共発現が有効かを予測することは困難であり、試
行錯誤が繰り返されている。また、既知のシャペロンの
共発現では十分な効果が得られない場合もある。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、前記従来技
術に鑑みてなされたものであり、外来タンパク質を可溶
化した状態で、かつ正常な立体構造を保持した状態で発
現させうる、トリガーファクター、ＧｒｏＥＬおよびＧ
ｒｏＥＳのそれぞれをコードする遺伝子を含有した人工
オペロンを提供することを目的とする。また、本発明
は、該オペロンを含有したプラスミドおよびトリガーフ
ァクター発現プラスミドを提供することを目的とする。
さらに、本発明は、前記プラスミドと外来タンパク質発
現ベクターとを含有した共形質転換体を提供することに
ある。さらに、本発明は、前記共形質転換体を用いるこ
とを特徴とする外来タンパク質の製造方法を提供するこ
とを目的とする。
術に鑑みてなされたものであり、外来タンパク質を可溶
化した状態で、かつ正常な立体構造を保持した状態で発
現させうる、トリガーファクター、ＧｒｏＥＬおよびＧ
ｒｏＥＳのそれぞれをコードする遺伝子を含有した人工
オペロンを提供することを目的とする。また、本発明
は、該オペロンを含有したプラスミドおよびトリガーフ
ァクター発現プラスミドを提供することを目的とする。
さらに、本発明は、前記プラスミドと外来タンパク質発
現ベクターとを含有した共形質転換体を提供することに
ある。さらに、本発明は、前記共形質転換体を用いるこ
とを特徴とする外来タンパク質の製造方法を提供するこ
とを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】即ち、本発明の要旨は、
〔１〕 トリガーファクター、ＧｒｏＥＬおよびＧｒｏ
ＥＳのそれぞれをコードする遺伝子を含有してなる人工
オペロン、〔２〕 前記〔１〕記載の人工オペロンを保
持する、トリガーファクター、ＧｒｏＥＬおよびＧｒｏ
ＥＳのそれぞれを発現しうるプラスミド、〔３〕 誘導
可能なプロモーター制御下にトリガーファクターをコー
ドする遺伝子を保持する、トリガーファクターを発現し
うるプラスミド、〔４〕 前記〔２〕または〔３〕記載
のプラスミドと外来タンパク質用の発現プラスミドとを
保持する共形質転換体、ならびに〔５〕 前記〔４〕記
載の共形質転換体を用いることを特徴とする、外来タン
パク質の製造方法、に関する。
〔１〕 トリガーファクター、ＧｒｏＥＬおよびＧｒｏ
ＥＳのそれぞれをコードする遺伝子を含有してなる人工
オペロン、〔２〕 前記〔１〕記載の人工オペロンを保
持する、トリガーファクター、ＧｒｏＥＬおよびＧｒｏ
ＥＳのそれぞれを発現しうるプラスミド、〔３〕 誘導
可能なプロモーター制御下にトリガーファクターをコー
ドする遺伝子を保持する、トリガーファクターを発現し
うるプラスミド、〔４〕 前記〔２〕または〔３〕記載
のプラスミドと外来タンパク質用の発現プラスミドとを
保持する共形質転換体、ならびに〔５〕 前記〔４〕記
載の共形質転換体を用いることを特徴とする、外来タン
パク質の製造方法、に関する。
【０００９】
【発明の実施の形態】本発明の人工オペロンは、トリガ
ーファクター、ＧｒｏＥＬおよびＧｒｏＥＳのそれぞれ
をコードする遺伝子（それぞれｔｉｇ遺伝子、ｇｒｏＥ
Ｌ遺伝子、ｇｒｏＥＳ遺伝子という）を含有することを
１つの大きな特徴とする。本発明の人工オペロンは前記
ｔｉｇ、ｇｒｏＥＬ、ｇｒｏＥＳの各遺伝子を含有する
ため、該人工オペロンを外来タンパク質をコードする遺
伝子と共発現させた場合に、可溶性の発現産物を効率よ
く得ることができるという優れた効果を発揮する。
ーファクター、ＧｒｏＥＬおよびＧｒｏＥＳのそれぞれ
をコードする遺伝子（それぞれｔｉｇ遺伝子、ｇｒｏＥ
Ｌ遺伝子、ｇｒｏＥＳ遺伝子という）を含有することを
１つの大きな特徴とする。本発明の人工オペロンは前記
ｔｉｇ、ｇｒｏＥＬ、ｇｒｏＥＳの各遺伝子を含有する
ため、該人工オペロンを外来タンパク質をコードする遺
伝子と共発現させた場合に、可溶性の発現産物を効率よ
く得ることができるという優れた効果を発揮する。
【００１０】本発明において、「トリガーファクター」
とは、イン・ビトロでの大腸菌外膜タンパク質のＯｍｐ
Ａの前駆体であるｐｒｏＯｍｐＡの膜への輸送に必要な
細胞質因子として発見された因子をいう。
とは、イン・ビトロでの大腸菌外膜タンパク質のＯｍｐ
Ａの前駆体であるｐｒｏＯｍｐＡの膜への輸送に必要な
細胞質因子として発見された因子をいう。
【００１１】前記トリガーファクターは、配列番号：１
に示されるアミノ酸配列を有する因子である〔Guthrie,
B. and Wickner, W., J. Bacteriol., 172, 5555-5562
(1990) 〕。本発明において、トリガーファクターは、
外来遺伝子との共発現により、外来タンパク質を可溶化
した状態で、かつ正常な立体構造を保持した状態で発現
させうる因子であれば、前記配列番号：１に示されるア
ミノ酸配列において、１個以上のアミノ酸残基に、置
換、欠失、付加または挿入の変異が導入された配列を有
する因子をも包含する。
に示されるアミノ酸配列を有する因子である〔Guthrie,
B. and Wickner, W., J. Bacteriol., 172, 5555-5562
(1990) 〕。本発明において、トリガーファクターは、
外来遺伝子との共発現により、外来タンパク質を可溶化
した状態で、かつ正常な立体構造を保持した状態で発現
させうる因子であれば、前記配列番号：１に示されるア
ミノ酸配列において、１個以上のアミノ酸残基に、置
換、欠失、付加または挿入の変異が導入された配列を有
する因子をも包含する。
【００１２】本発明の人工オペロンには、前記トリガー
ファクターのアミノ酸配列に対応するｔｉｇ遺伝子が用
いられる。かかるｔｉｇ遺伝子としては、配列番号：２
に示される塩基配列からなる遺伝子が挙げられる〔Guth
rie, B. and Wickner, W., J. Bacteriol., 172, 5555-
5562 (1990) 〕。前記配列番号：２に示される塩基配列
からなる遺伝子は、例えば、小原クローンＮｏ．１４８
〔Kohara, Y et al.,Cell, 50, 495-508 (1987)〕から
得ることができる。
ファクターのアミノ酸配列に対応するｔｉｇ遺伝子が用
いられる。かかるｔｉｇ遺伝子としては、配列番号：２
に示される塩基配列からなる遺伝子が挙げられる〔Guth
rie, B. and Wickner, W., J. Bacteriol., 172, 5555-
5562 (1990) 〕。前記配列番号：２に示される塩基配列
からなる遺伝子は、例えば、小原クローンＮｏ．１４８
〔Kohara, Y et al.,Cell, 50, 495-508 (1987)〕から
得ることができる。
【００１３】また、本発明において、ｔｉｇ遺伝子は、
外来遺伝子との共発現により、外来タンパク質を可溶化
した状態で、かつ正常な立体構造を保持した状態で発現
させうる因子をコードする遺伝子であれば、前記配列番
号：２に示される塩基配列において、１個以上の塩基に
置換、欠失、付加もしくは挿入などの変異が導入された
配列からなる遺伝子をも包含する。
外来遺伝子との共発現により、外来タンパク質を可溶化
した状態で、かつ正常な立体構造を保持した状態で発現
させうる因子をコードする遺伝子であれば、前記配列番
号：２に示される塩基配列において、１個以上の塩基に
置換、欠失、付加もしくは挿入などの変異が導入された
配列からなる遺伝子をも包含する。
【００１４】さらに、本発明において、ｔｉｇ遺伝子
は、外来遺伝子との共発現により、外来タンパク質を可
溶化した状態で、かつ正常な立体構造を保持した状態で
発現させうる因子をコードする遺伝子であれば、前記配
列番号：２に示される塩基配列からなるＤＮＡまたは前
記配列番号：２に示される塩基配列において、１個以上
の塩基に置換、欠失、付加もしくは挿入などの変異が導
入された配列を有するＤＮＡのいずれかのＤＮＡにスト
リンジェントな条件下にハイブリダイズするＤＮＡから
なる遺伝子をも包含する。
は、外来遺伝子との共発現により、外来タンパク質を可
溶化した状態で、かつ正常な立体構造を保持した状態で
発現させうる因子をコードする遺伝子であれば、前記配
列番号：２に示される塩基配列からなるＤＮＡまたは前
記配列番号：２に示される塩基配列において、１個以上
の塩基に置換、欠失、付加もしくは挿入などの変異が導
入された配列を有するＤＮＡのいずれかのＤＮＡにスト
リンジェントな条件下にハイブリダイズするＤＮＡから
なる遺伝子をも包含する。
【００１５】なお、ハイブリダイゼーションの条件は、
例えば、モレキュラークローニング：ア ラボラトリー
マニュアル第２版〔Sambrook, J. et al., Cold Spring
Harbour Laboratory Press, New York, (1989) 〕に記
載の条件などが挙げられる。
例えば、モレキュラークローニング：ア ラボラトリー
マニュアル第２版〔Sambrook, J. et al., Cold Spring
Harbour Laboratory Press, New York, (1989) 〕に記
載の条件などが挙げられる。
【００１６】本発明に用いられるＧｒｏＥＬおよびＧｒ
ｏＥＳのアミノ酸配列をそれぞれ配列番号：３および４
に示す〔Hemmingsen, S. M. et al., Nature, 333, 330
-334(1988) 〕。本発明において、ＧｒｏＥＬおよびＧ
ｒｏＥＳは、前記配列番号：３および４のそれぞれに示
される配列を有する野性型のＧｒｏＥＬおよびＧｒｏＥ
Ｓと同等の機能を有する因子であれば、前記配列番号：
３および４のそれぞれに示されるアミノ酸配列におい
て、１個以上のアミノ酸残基に、置換、欠失、付加また
は挿入の変異が導入された配列を有する因子をも包含す
る。
ｏＥＳのアミノ酸配列をそれぞれ配列番号：３および４
に示す〔Hemmingsen, S. M. et al., Nature, 333, 330
-334(1988) 〕。本発明において、ＧｒｏＥＬおよびＧ
ｒｏＥＳは、前記配列番号：３および４のそれぞれに示
される配列を有する野性型のＧｒｏＥＬおよびＧｒｏＥ
Ｓと同等の機能を有する因子であれば、前記配列番号：
３および４のそれぞれに示されるアミノ酸配列におい
て、１個以上のアミノ酸残基に、置換、欠失、付加また
は挿入の変異が導入された配列を有する因子をも包含す
る。
【００１７】本発明に用いられるｇｒｏＥＬ遺伝子およ
びｇｒｏＥＳ遺伝子は、それぞれ配列番号：５および６
に示される塩基配列〔Hemmingsen, S. M. et al., Natu
re,333, 330-334 (1988) 〕からなる遺伝子が挙げられ
る。前記ｇｒｏＥＬ遺伝子およびｇｒｏＥＳ遺伝子は、
例えば、ｐＧｒｏ１１プラスミド〔Nishihara, K. eta
l., Appl. Environ. Microbiol., 64, 1694-1699 (199
8) 〕から得ることができる。
びｇｒｏＥＳ遺伝子は、それぞれ配列番号：５および６
に示される塩基配列〔Hemmingsen, S. M. et al., Natu
re,333, 330-334 (1988) 〕からなる遺伝子が挙げられ
る。前記ｇｒｏＥＬ遺伝子およびｇｒｏＥＳ遺伝子は、
例えば、ｐＧｒｏ１１プラスミド〔Nishihara, K. eta
l., Appl. Environ. Microbiol., 64, 1694-1699 (199
8) 〕から得ることができる。
【００１８】本発明においては、ｇｒｏＥＬ遺伝子およ
びｇｒｏＥＳ遺伝子は、前記野生型のＧｒｏＥＬおよび
ＧｒｏＥＳと同等の機能を有する因子をコードする遺伝
子であれば、前記配列番号：５および６に示されるそれ
ぞれの塩基配列において、１個以上の塩基に、置換、欠
失、付加または挿入の変異が導入された配列を有する遺
伝子をも包含する。
びｇｒｏＥＳ遺伝子は、前記野生型のＧｒｏＥＬおよび
ＧｒｏＥＳと同等の機能を有する因子をコードする遺伝
子であれば、前記配列番号：５および６に示されるそれ
ぞれの塩基配列において、１個以上の塩基に、置換、欠
失、付加または挿入の変異が導入された配列を有する遺
伝子をも包含する。
【００１９】さらに、ｇｒｏＥＬ遺伝子およびｇｒｏＥ
Ｓ遺伝子は、前記野生型のＧｒｏＥＬおよびＧｒｏＥＳ
と同等の機能を有する因子をコードする遺伝子であれ
ば、前記配列番号：５および６に示されるそれぞれの配
列または前記配列番号：５および６に示されるそれぞれ
の塩基配列において、１個以上の塩基に、置換、欠失、
付加もしくは挿入などの変異が導入された配列を有する
ＤＮＡにストリンジェントな条件下にハイブリダイズす
るＤＮＡからなる遺伝子をも包含する。
Ｓ遺伝子は、前記野生型のＧｒｏＥＬおよびＧｒｏＥＳ
と同等の機能を有する因子をコードする遺伝子であれ
ば、前記配列番号：５および６に示されるそれぞれの配
列または前記配列番号：５および６に示されるそれぞれ
の塩基配列において、１個以上の塩基に、置換、欠失、
付加もしくは挿入などの変異が導入された配列を有する
ＤＮＡにストリンジェントな条件下にハイブリダイズす
るＤＮＡからなる遺伝子をも包含する。
【００２０】本発明の人工オペロンにおいて、前記ｔｉ
ｇ遺伝子、ｇｒｏＥＬ遺伝子およびｇｒｏＥＳ遺伝子の
配置は、特に限定されるものではないが、例えば、ｇｒ
ｏＥＳ−ｇｒｏＥＬ−ｔｉｇの順番で配置されたオペロ
ンなどが挙げられる。
ｇ遺伝子、ｇｒｏＥＬ遺伝子およびｇｒｏＥＳ遺伝子の
配置は、特に限定されるものではないが、例えば、ｇｒ
ｏＥＳ−ｇｒｏＥＬ−ｔｉｇの順番で配置されたオペロ
ンなどが挙げられる。
【００２１】本発明の人工オペロンにおいては、前記ｔ
ｉｇ遺伝子、ｇｒｏＥＬ遺伝子およびｇｒｏＥＳ遺伝子
は、プロモーターの制御下に配置することができる。
ｉｇ遺伝子、ｇｒｏＥＬ遺伝子およびｇｒｏＥＳ遺伝子
は、プロモーターの制御下に配置することができる。
【００２２】プロモーターの制御下に存在する前記オペ
ロンの転写を制御するプロモーターは、トリガーファク
ター、ＧｒｏＥＬおよびＧｒｏＥＳのそれぞれの発現量
を調節する観点から、誘導可能なプロモーターであるこ
とが好ましい。誘導可能なプロモーターとしては、例え
ば、ｌａｃ、ｔａｃ、ｔｒｃ、ｔｒｐ、ａｒａ、Ｐｚｔ
−１、ＰL およびＴ７が挙げられる。前記ｌａｃ、ｔａ
ｃおよびｔｒｃは、いずれもイソプロピル−β−Ｄ−チ
オガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を用いて誘導するこ
とができ、前記ｔｒｐ、ａｒａおよびＰｚｔ−１は、そ
れぞれ、３−インドールアクリル酸（ＩＡＡ）、Ｌ−ア
ラビノース、テトラサイクリンを用いて誘導することが
できる。また前記ＰL は高温（４２℃）で誘導すること
ができる。また、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼによって特異
的にかつ強力に転写されるＴ７プロモーターも使用でき
る。この場合、ｌａｃプロモーター下流に連結したＴ７
ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子をもつλファージを溶原化し
た大腸菌を用いることにより、ＩＰＴＧで誘導が可能で
ある。前記プロモーターの中では、誘導操作性の容易さ
の観点から、ｌａｃ、ｔｒｐ、ａｒａおよびＰｚｔ−１
が好ましい。前記プロモーターは、公知のベクターなど
に含まれており、制限酵素等を用いてベクターから適宜
切り出して用いることができる。
ロンの転写を制御するプロモーターは、トリガーファク
ター、ＧｒｏＥＬおよびＧｒｏＥＳのそれぞれの発現量
を調節する観点から、誘導可能なプロモーターであるこ
とが好ましい。誘導可能なプロモーターとしては、例え
ば、ｌａｃ、ｔａｃ、ｔｒｃ、ｔｒｐ、ａｒａ、Ｐｚｔ
−１、ＰL およびＴ７が挙げられる。前記ｌａｃ、ｔａ
ｃおよびｔｒｃは、いずれもイソプロピル−β−Ｄ−チ
オガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を用いて誘導するこ
とができ、前記ｔｒｐ、ａｒａおよびＰｚｔ−１は、そ
れぞれ、３−インドールアクリル酸（ＩＡＡ）、Ｌ−ア
ラビノース、テトラサイクリンを用いて誘導することが
できる。また前記ＰL は高温（４２℃）で誘導すること
ができる。また、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼによって特異
的にかつ強力に転写されるＴ７プロモーターも使用でき
る。この場合、ｌａｃプロモーター下流に連結したＴ７
ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子をもつλファージを溶原化し
た大腸菌を用いることにより、ＩＰＴＧで誘導が可能で
ある。前記プロモーターの中では、誘導操作性の容易さ
の観点から、ｌａｃ、ｔｒｐ、ａｒａおよびＰｚｔ−１
が好ましい。前記プロモーターは、公知のベクターなど
に含まれており、制限酵素等を用いてベクターから適宜
切り出して用いることができる。
【００２３】また、本発明の人工オペロンにおいては、
ｒｒｎＢＴ１Ｔ２などに代表されるターミネーターを有
することにより、より安定に人工オペロン上の因子を発
現させることが可能になる。これらのターミネーター
は、公知のベクターなどに含まれており、制限酵素等を
用いてベクターから適宜切り出して用いることができ
る。
ｒｒｎＢＴ１Ｔ２などに代表されるターミネーターを有
することにより、より安定に人工オペロン上の因子を発
現させることが可能になる。これらのターミネーター
は、公知のベクターなどに含まれており、制限酵素等を
用いてベクターから適宜切り出して用いることができ
る。
【００２４】本発明の人工オペロンの具体例としては、
例えば、配列番号：７に示される塩基配列を有するオペ
ロンなどが挙げられる。
例えば、配列番号：７に示される塩基配列を有するオペ
ロンなどが挙げられる。
【００２５】本発明のプラスミドは、トリガーファクタ
ーをコードする遺伝子または前記人工オペロンを保持す
ることを１つの大きな特徴とする。
ーをコードする遺伝子または前記人工オペロンを保持す
ることを１つの大きな特徴とする。
【００２６】本発明のプラスミドにおいては、誘導可能
なプロモーターにより、トリガーファクターをコードす
る遺伝子または人工オペロン上にコードされる因子（ト
リガーファクター、ＧｒｏＥＬおよびＧｒｏＥＳ）を発
現できることが好ましい。
なプロモーターにより、トリガーファクターをコードす
る遺伝子または人工オペロン上にコードされる因子（ト
リガーファクター、ＧｒｏＥＬおよびＧｒｏＥＳ）を発
現できることが好ましい。
【００２７】また、本発明のプラスミドを宿主に導入す
るに際して、同一のプラスミド上に、トリガーファクタ
ーをコードする遺伝子または前記オペロンと目的とする
外来タンパク質とをコードする遺伝子を有しているプラ
スミドを用いてもよく、トリガーファクターをコードす
る遺伝子またはオペロンを保持するプラスミドと外来タ
ンパク質をコードする遺伝子を保持するプラスミド（以
下、共発現型プラスミドという）とを同時に用いてもよ
い。なかでも、外来タンパク質ごとにトリガーファクタ
ーをコードする遺伝子または前記オペロンと目的とする
外来タンパク質とをコードする遺伝子を含有するプラス
ミドを作製する必要性がないこと、宿主内でのプラスミ
ドの安定性などの観点から、共発現型プラスミドが好ま
しい。
るに際して、同一のプラスミド上に、トリガーファクタ
ーをコードする遺伝子または前記オペロンと目的とする
外来タンパク質とをコードする遺伝子を有しているプラ
スミドを用いてもよく、トリガーファクターをコードす
る遺伝子またはオペロンを保持するプラスミドと外来タ
ンパク質をコードする遺伝子を保持するプラスミド（以
下、共発現型プラスミドという）とを同時に用いてもよ
い。なかでも、外来タンパク質ごとにトリガーファクタ
ーをコードする遺伝子または前記オペロンと目的とする
外来タンパク質とをコードする遺伝子を含有するプラス
ミドを作製する必要性がないこと、宿主内でのプラスミ
ドの安定性などの観点から、共発現型プラスミドが好ま
しい。
【００２８】外来蛋白質の発現レベルを低下させず、ト
リガーファクターまたは前記人工オペロン上にコードさ
れる因子の発現量や発現時期を最適化するために、トリ
ガーファクターまたは人工オペロン上にコードされる因
子の発現と目的蛋白質の発現は独立して制御できる方が
有利である。前記したような観点から、トリガーファク
ターまたは人工オペロン上にコードされる因子の発現に
用いる誘導可能なプロモーターとしては、目的蛋白質の
発現に用いられるプロモーターと異なるものが好まし
い。
リガーファクターまたは前記人工オペロン上にコードさ
れる因子の発現量や発現時期を最適化するために、トリ
ガーファクターまたは人工オペロン上にコードされる因
子の発現と目的蛋白質の発現は独立して制御できる方が
有利である。前記したような観点から、トリガーファク
ターまたは人工オペロン上にコードされる因子の発現に
用いる誘導可能なプロモーターとしては、目的蛋白質の
発現に用いられるプロモーターと異なるものが好まし
い。
【００２９】前記プラスミドとして共発現型プラスミド
を用いる場合、使用する宿主内、例えば、大腸菌内で目
的蛋白質の発現ベクターと不和合性を示さないレプリコ
ンを有するものであれば使用可能である。例えば、目的
蛋白質の発現ベクターとしてｐＢＲ３２２等ＣｏｌＥ１
レプリコンをもつベクターを用いる場合、トリガーファ
クターまたは前記人工オペロン上にコードされる因子の
発現に用いるプラスミドには、ｐＡＣＹＣ系プラスミド
に存在するｐ１５Ａレプリコンを使用することができ
る。
を用いる場合、使用する宿主内、例えば、大腸菌内で目
的蛋白質の発現ベクターと不和合性を示さないレプリコ
ンを有するものであれば使用可能である。例えば、目的
蛋白質の発現ベクターとしてｐＢＲ３２２等ＣｏｌＥ１
レプリコンをもつベクターを用いる場合、トリガーファ
クターまたは前記人工オペロン上にコードされる因子の
発現に用いるプラスミドには、ｐＡＣＹＣ系プラスミド
に存在するｐ１５Ａレプリコンを使用することができ
る。
【００３０】本発明の発現プラスミドの具体例として
は、共発現型プラスミドである、ｐＴｆ１３およびｐＧ
−Ｔｆ１が挙げられる。それぞれの概略構成図を図１お
よび図２に示す。
は、共発現型プラスミドである、ｐＴｆ１３およびｐＧ
−Ｔｆ１が挙げられる。それぞれの概略構成図を図１お
よび図２に示す。
【００３１】前記ｐＴｆ１３およびｐＧ−Ｔｆ１は、そ
れぞれ、例えば、下記実施例１および下記実施例２のよ
うにして得ることができる。
れぞれ、例えば、下記実施例１および下記実施例２のよ
うにして得ることができる。
【００３２】本発明の共形質転換体は、本発明のプラス
ミド（共発現型プラスミド）と外来タンパク質発現ベク
ターとを導入することによって得ることができる。
ミド（共発現型プラスミド）と外来タンパク質発現ベク
ターとを導入することによって得ることができる。
【００３３】前記共形質転換体に用いる外来タンパク質
発現ベクターとしては、特に限定されないが、所望の外
来タンパク質を菌体の細胞質内で発現または菌体のペリ
プラズムに分泌させうるベクターであり、かつ前記発現
プラスミドと和合性を示すベクターなどが挙げられ、特
に誘導可能なプロモーターにより、目的の外来タンパク
質の発現が誘導されるベクターが好ましい。誘導可能な
プロモーターとしては、前記と同様のプロモーターが挙
げられるが、トリガーファクターまたは人工オペロン上
にコードされる因子の誘導発現に用いるプロモーター以
外のプロモーターを選ぶことにより、トリガーファクタ
ーまたは人工オペロン上にコードされる因子と目的外来
タンパク質とを別々に発現誘導することができる。
発現ベクターとしては、特に限定されないが、所望の外
来タンパク質を菌体の細胞質内で発現または菌体のペリ
プラズムに分泌させうるベクターであり、かつ前記発現
プラスミドと和合性を示すベクターなどが挙げられ、特
に誘導可能なプロモーターにより、目的の外来タンパク
質の発現が誘導されるベクターが好ましい。誘導可能な
プロモーターとしては、前記と同様のプロモーターが挙
げられるが、トリガーファクターまたは人工オペロン上
にコードされる因子の誘導発現に用いるプロモーター以
外のプロモーターを選ぶことにより、トリガーファクタ
ーまたは人工オペロン上にコードされる因子と目的外来
タンパク質とを別々に発現誘導することができる。
【００３４】また、外来タンパク質発現ベクターは、必
要に応じて選択マーカー遺伝子を含んでもよい。かかる
選択マーカー遺伝子としては、前記と同様のものが挙げ
られるが、本発明のプラスミド（共発現型プラスミド）
に含まれる選択マーカー遺伝子以外のものを用いること
により、共形質転換体の二重選別が可能となる。
要に応じて選択マーカー遺伝子を含んでもよい。かかる
選択マーカー遺伝子としては、前記と同様のものが挙げ
られるが、本発明のプラスミド（共発現型プラスミド）
に含まれる選択マーカー遺伝子以外のものを用いること
により、共形質転換体の二重選別が可能となる。
【００３５】前記外来タンパク質発現ベクターとして
は、得られた外来タンパク質のジスルフィド結合の正し
い形成を行なう観点から、菌体のペリプラズムに分泌さ
せるベクターであることが好ましく、かかるベクターと
しては、例えば、目的とする外来タンパク質にＯｍｐ
Ａ、ＯｍｐＴ、ＭａｌＥ、β−ラクタマーゼなどのシグ
ナルペプチドが付加されたポリペプチドをコードする遺
伝子を有するベクターなどが挙げられる。前記ベクター
は、例えば、前記シグナルペプチドをコードする遺伝子
を遺伝子工学的に目的外来タンパク質をコードする遺伝
子上のＮ末端に対応する箇所に付加し、得られた遺伝子
を公知のベクターに組み込むことにより得ることができ
る。
は、得られた外来タンパク質のジスルフィド結合の正し
い形成を行なう観点から、菌体のペリプラズムに分泌さ
せるベクターであることが好ましく、かかるベクターと
しては、例えば、目的とする外来タンパク質にＯｍｐ
Ａ、ＯｍｐＴ、ＭａｌＥ、β−ラクタマーゼなどのシグ
ナルペプチドが付加されたポリペプチドをコードする遺
伝子を有するベクターなどが挙げられる。前記ベクター
は、例えば、前記シグナルペプチドをコードする遺伝子
を遺伝子工学的に目的外来タンパク質をコードする遺伝
子上のＮ末端に対応する箇所に付加し、得られた遺伝子
を公知のベクターに組み込むことにより得ることができ
る。
【００３６】また、本発明の外来タンパク質発現ベクタ
ーにおいては、本発明の目的を妨げないものであれば、
例えば、β−ガラクトシダーゼ、グルタチオン−Ｓ−ト
ランスフェラーゼ、マルトース結合タンパク質などのタ
ンパク質との融合タンパク質としての発現；ヒスチジン
タグなどを付加したタンパク質としての発現などに代表
される目的外来タンパク質の精製を容易に行なうための
手法を可能にする配列を含んでもよい。
ーにおいては、本発明の目的を妨げないものであれば、
例えば、β−ガラクトシダーゼ、グルタチオン−Ｓ−ト
ランスフェラーゼ、マルトース結合タンパク質などのタ
ンパク質との融合タンパク質としての発現；ヒスチジン
タグなどを付加したタンパク質としての発現などに代表
される目的外来タンパク質の精製を容易に行なうための
手法を可能にする配列を含んでもよい。
【００３７】本発明に用いられる宿主としては、例え
ば、大腸菌が挙げられ、具体的には、ＨＢ１０１、ＪＭ
１０９、ＭＣ４１００、ＭＧ１６５５、Ｗ３１１０等の
一般的に用いられる株、ならびにｄｅｇＰ変異株、ｏｍ
ｐＴ変異株、ｔｓｐ変異株、ｌｏｎ変異株、ｃｌｐＰＸ
変異株、ｈｓｌＶ／Ｕ変異株、ｌｏｎおよびｃｌｐＰＸ
二重変異株、ｌｏｎ、ｃｌｐＰＸおよびｈｓｌＶ／Ｕ三
重変異株等のプロテアーゼ変異株、ｐｌｓＸ変異株、ｒ
ｐｏＨ変異株（例えば、ｒｐｏＨ欠失変異株、ｒｐｏＨ
ミスセンス変異株など）等の変異株が挙げられる。
ば、大腸菌が挙げられ、具体的には、ＨＢ１０１、ＪＭ
１０９、ＭＣ４１００、ＭＧ１６５５、Ｗ３１１０等の
一般的に用いられる株、ならびにｄｅｇＰ変異株、ｏｍ
ｐＴ変異株、ｔｓｐ変異株、ｌｏｎ変異株、ｃｌｐＰＸ
変異株、ｈｓｌＶ／Ｕ変異株、ｌｏｎおよびｃｌｐＰＸ
二重変異株、ｌｏｎ、ｃｌｐＰＸおよびｈｓｌＶ／Ｕ三
重変異株等のプロテアーゼ変異株、ｐｌｓＸ変異株、ｒ
ｐｏＨ変異株（例えば、ｒｐｏＨ欠失変異株、ｒｐｏＨ
ミスセンス変異株など）等の変異株が挙げられる。
【００３８】本発明においては、外来タンパク質をより
安定に発現させる観点から、ｌｏｎおよびｃｌｐＰＸ二
重変異株またはｌｏｎ、ｃｌｐＰＸおよびｈｓｌＶ／Ｕ
三重変異株のプロテアーゼ変異株、ｐｌｓＸ変異株、ｒ
ｐｏＨ変異株が好ましい。前記ｒｐｏＨ変異株のなかで
は、外来タンパク質をより安定に発現させる観点から、
ｒｐｏＨ欠失変異株が好ましい。
安定に発現させる観点から、ｌｏｎおよびｃｌｐＰＸ二
重変異株またはｌｏｎ、ｃｌｐＰＸおよびｈｓｌＶ／Ｕ
三重変異株のプロテアーゼ変異株、ｐｌｓＸ変異株、ｒ
ｐｏＨ変異株が好ましい。前記ｒｐｏＨ変異株のなかで
は、外来タンパク質をより安定に発現させる観点から、
ｒｐｏＨ欠失変異株が好ましい。
【００３９】ここで、ｌｏｎおよびｃｌｐＰＸ二重変異
株としては、ｌｏｎ遺伝子およびｃｌｐＰＸ遺伝子に二
重欠失変異を導入したＷ３１１０株由来のＫＹ２７８３
株が好ましい。なお、前記ＫＹ２７８３株は、Ｅ．ｃｏ
ｌｉ ＫＹ２７８３と命名・表示され、平成１０年２月
３日（原寄託日）より通商産業省工業技術院生命工学工
業技術研究所（あて名：日本国茨城県つくば市東１丁目
１番３号（郵便番号：３０５−８５６６））に受託番
号：ＦＥＲＭ ＢＰ−６２４４として寄託されている。
株としては、ｌｏｎ遺伝子およびｃｌｐＰＸ遺伝子に二
重欠失変異を導入したＷ３１１０株由来のＫＹ２７８３
株が好ましい。なお、前記ＫＹ２７８３株は、Ｅ．ｃｏ
ｌｉ ＫＹ２７８３と命名・表示され、平成１０年２月
３日（原寄託日）より通商産業省工業技術院生命工学工
業技術研究所（あて名：日本国茨城県つくば市東１丁目
１番３号（郵便番号：３０５−８５６６））に受託番
号：ＦＥＲＭ ＢＰ−６２４４として寄託されている。
【００４０】また、ｌｏｎ、ｃｌｐＰＸおよびｈｓｌＶ
／Ｕ三重変異株とは、前記ｌｏｎおよびｃｌｐＰＸ二重
変異株において、さらにＨｓｌＶ／Ｕプロテアーゼをコ
ードするｈｓｌＶ／Ｕ遺伝子に変異を導入した変異株で
あり、ｌｏｎ遺伝子、ｃｌｐＰＸ遺伝子およびｈｓｌＶ
／Ｕ遺伝子に三重欠失変異を導入したＷ３１１０株由来
のＫＹ２８９３株が好ましい。なお、前記ＫＹ２８９３
は、Ｅ．ｃｏｌｉ ＫＹ２８９３と命名・表示され、平
成１０年２月３日（原寄託日）より通商産業省工業技術
院生命工学工業技術研究所（あて名：日本国茨城県つく
ば市東１丁目１番３号（郵便番号：３０５−８５６
６））に受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−６２４３として寄
託されている。
／Ｕ三重変異株とは、前記ｌｏｎおよびｃｌｐＰＸ二重
変異株において、さらにＨｓｌＶ／Ｕプロテアーゼをコ
ードするｈｓｌＶ／Ｕ遺伝子に変異を導入した変異株で
あり、ｌｏｎ遺伝子、ｃｌｐＰＸ遺伝子およびｈｓｌＶ
／Ｕ遺伝子に三重欠失変異を導入したＷ３１１０株由来
のＫＹ２８９３株が好ましい。なお、前記ＫＹ２８９３
は、Ｅ．ｃｏｌｉ ＫＹ２８９３と命名・表示され、平
成１０年２月３日（原寄託日）より通商産業省工業技術
院生命工学工業技術研究所（あて名：日本国茨城県つく
ば市東１丁目１番３号（郵便番号：３０５−８５６
６））に受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−６２４３として寄
託されている。
【００４１】本発明により、発現させる外来タンパク質
としては、宿主内、特に大腸菌内で不安定化および／ま
たは不溶化する外来タンパク質であれば、いかなるタン
パク質でもよい。かかる外来タンパク質の具体例として
は、インターフェロン、インターロイキン、インターロ
イキン受容体、インターロイキン受容体拮抗物質、顆粒
球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺
激因子、マクロファージコロニー刺激因子、エリスロポ
エチン、トロンボポエチン、白血病抑制因子、幹細胞成
長因子、腫瘍壊死因子、成長ホルモン、プロインスリ
ン、インスリン様成長因子、繊維芽細胞成長因子、血小
板由来成長因子、トランスフォーミング成長因子、肝細
胞成長因子、骨形成因子、神経成長因子、毛様体神経栄
養因子、脳由来神経栄養因子、グリア細胞由来神経栄養
因子、ニューロトロフィン、血管新生阻害因子、プロウ
ロキナーゼ、組織プラスミノーゲンアクチベーター、血
液凝固因子、プロテインＣ、グルコセレブロシダーゼ、
スーパーオキシドディスムターゼ、レニン、リゾチー
ム、Ｐ４５０、プロキモシン、トリプシンインヒビタ
ー、エラスターゼインヒビター、リポコルチン、レプチ
ン、免疫グロブリン、単鎖抗体、補体成分、血清アルブ
ミン、スギ花粉抗原、低酸素誘導性ストレスタンパク
質、プロテインキナーゼ、プロトオンコジーン産物、転
写調節因子およびウイルス構成タンパク質が挙げられ
る。
としては、宿主内、特に大腸菌内で不安定化および／ま
たは不溶化する外来タンパク質であれば、いかなるタン
パク質でもよい。かかる外来タンパク質の具体例として
は、インターフェロン、インターロイキン、インターロ
イキン受容体、インターロイキン受容体拮抗物質、顆粒
球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺
激因子、マクロファージコロニー刺激因子、エリスロポ
エチン、トロンボポエチン、白血病抑制因子、幹細胞成
長因子、腫瘍壊死因子、成長ホルモン、プロインスリ
ン、インスリン様成長因子、繊維芽細胞成長因子、血小
板由来成長因子、トランスフォーミング成長因子、肝細
胞成長因子、骨形成因子、神経成長因子、毛様体神経栄
養因子、脳由来神経栄養因子、グリア細胞由来神経栄養
因子、ニューロトロフィン、血管新生阻害因子、プロウ
ロキナーゼ、組織プラスミノーゲンアクチベーター、血
液凝固因子、プロテインＣ、グルコセレブロシダーゼ、
スーパーオキシドディスムターゼ、レニン、リゾチー
ム、Ｐ４５０、プロキモシン、トリプシンインヒビタ
ー、エラスターゼインヒビター、リポコルチン、レプチ
ン、免疫グロブリン、単鎖抗体、補体成分、血清アルブ
ミン、スギ花粉抗原、低酸素誘導性ストレスタンパク
質、プロテインキナーゼ、プロトオンコジーン産物、転
写調節因子およびウイルス構成タンパク質が挙げられ
る。
【００４２】本発明のプラスミドを外来タンパク質発現
ベクターと共に大腸菌に導入する方法としては、塩化カ
ルシウム法、塩化ルビジウム法、エレクトロポレーショ
ン法等の通常の方法が用いられる。共形質転換体のスク
リーニング法としては、選択マーカー遺伝子に応じた薬
剤により行なうことができる。外来タンパク質の発現
は、例えば、ウエスタンブロット解析等により確認する
ことができる。
ベクターと共に大腸菌に導入する方法としては、塩化カ
ルシウム法、塩化ルビジウム法、エレクトロポレーショ
ン法等の通常の方法が用いられる。共形質転換体のスク
リーニング法としては、選択マーカー遺伝子に応じた薬
剤により行なうことができる。外来タンパク質の発現
は、例えば、ウエスタンブロット解析等により確認する
ことができる。
【００４３】本発明の外来タンパク質の製造方法は、前
記共形質転換体を用いることを１つの大きな特徴とす
る。前記製造方法は、例えば、トリガーファクターの発
現量、またはトリガーファクター、ＧｒｏＥＬおよびＧ
ｒｏＥＳのそれぞれの発現量が、発現対象の外来タンパ
ク質の安定化および／または可溶化に適した量となる誘
導条件下に共形質転換体を培養し、菌体を集め、集めた
菌体を破砕し、外来タンパク質に応じた精製方法に従っ
て、該外来タンパク質を単離・精製することにより行な
うことができる。
記共形質転換体を用いることを１つの大きな特徴とす
る。前記製造方法は、例えば、トリガーファクターの発
現量、またはトリガーファクター、ＧｒｏＥＬおよびＧ
ｒｏＥＳのそれぞれの発現量が、発現対象の外来タンパ
ク質の安定化および／または可溶化に適した量となる誘
導条件下に共形質転換体を培養し、菌体を集め、集めた
菌体を破砕し、外来タンパク質に応じた精製方法に従っ
て、該外来タンパク質を単離・精製することにより行な
うことができる。
【００４４】前記誘導条件は、本発明のプラスミドおよ
び外来タンパク質発現ベクターに用いられた誘導可能な
プロモーターにより異なるが、トリガーファクターの発
現量、またはトリガーファクター、ＧｒｏＥＬおよびＧ
ｒｏＥＳのそれぞれの発現量が外来タンパク質の可溶化
に適した量となる条件であればよい。例えば、前記誘導
条件は、以下のようにして決定することができる。
び外来タンパク質発現ベクターに用いられた誘導可能な
プロモーターにより異なるが、トリガーファクターの発
現量、またはトリガーファクター、ＧｒｏＥＬおよびＧ
ｒｏＥＳのそれぞれの発現量が外来タンパク質の可溶化
に適した量となる条件であればよい。例えば、前記誘導
条件は、以下のようにして決定することができる。
【００４５】まず、前記プロモーターの誘導物質を、種
々の添加濃度、添加時期を変化させて添加する。外来タ
ンパク質を発現させた菌体を集め、集めたそれぞれの菌
体を破砕し抽出物を得る。得られたそれぞれの抽出物
を、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ついで、クマシ
ーブリリアントブルー染色や銀染色などによりゲル中の
タンパク質に由来するバンドを可視化する。可視化され
たバンドのなかで、外来タンパク質に由来するバンドに
ついて、デンシトメトリーなどでその濃度を測定するこ
とにより適切な誘導条件を調べることができる。
々の添加濃度、添加時期を変化させて添加する。外来タ
ンパク質を発現させた菌体を集め、集めたそれぞれの菌
体を破砕し抽出物を得る。得られたそれぞれの抽出物
を、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ついで、クマシ
ーブリリアントブルー染色や銀染色などによりゲル中の
タンパク質に由来するバンドを可視化する。可視化され
たバンドのなかで、外来タンパク質に由来するバンドに
ついて、デンシトメトリーなどでその濃度を測定するこ
とにより適切な誘導条件を調べることができる。
【００４６】共形質転換体の培養は、宿主として用いた
細胞により異なるため、特に限定されないが、種々の培
養時間、培養温度などを設定し、それぞれの培養条件下
に発現した外来タンパク質の量を前記誘導条件の決定と
同様に調べることにより決定することができる。
細胞により異なるため、特に限定されないが、種々の培
養時間、培養温度などを設定し、それぞれの培養条件下
に発現した外来タンパク質の量を前記誘導条件の決定と
同様に調べることにより決定することができる。
【００４７】外来タンパク質の分離精製方法は、例え
ば、塩析、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマ
トグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲ
ル濾過クロマトグラフィーに代表されるタンパク質の精
製方法により行なうことができる。
ば、塩析、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマ
トグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲ
ル濾過クロマトグラフィーに代表されるタンパク質の精
製方法により行なうことができる。
【００４８】
【実施例】実施例１ ｐＴｆ１３の構築 トリガーファクターを含む小原クローンＮｏ．１４８
〔Kohara, Y. et al. (1987) Cell 50, 495-50〕から、
ｔｉｇ遺伝子を含む約２．６ｋｂの断片をＸｍｎＩおよ
びＮｒｕＩを用いて切り出し、ついで得られたＸｍｎＩ
−ＮｒｕＩ断片を平滑末端化し、ｔｉｇ遺伝子断片を得
る。ｐＡＲ３プラスミド〔Perez-Perez, J. & Guitierr
ez, J.，Gene 158, 141-142 (1995)〕をＰｓｔＩで切断
し、ついで得られた直鎖状のプラスミド断片を平滑末端
化して、ｐＡＲ３断片を得る。前記のようにして得られ
たｔｉｇ遺伝子断片をｐＡＲ３断片に連結し、ｐＴｆ１
３を構築した。
〔Kohara, Y. et al. (1987) Cell 50, 495-50〕から、
ｔｉｇ遺伝子を含む約２．６ｋｂの断片をＸｍｎＩおよ
びＮｒｕＩを用いて切り出し、ついで得られたＸｍｎＩ
−ＮｒｕＩ断片を平滑末端化し、ｔｉｇ遺伝子断片を得
る。ｐＡＲ３プラスミド〔Perez-Perez, J. & Guitierr
ez, J.，Gene 158, 141-142 (1995)〕をＰｓｔＩで切断
し、ついで得られた直鎖状のプラスミド断片を平滑末端
化して、ｐＡＲ３断片を得る。前記のようにして得られ
たｔｉｇ遺伝子断片をｐＡＲ３断片に連結し、ｐＴｆ１
３を構築した。
【００４９】実施例２ ｐＧ−Ｔｆ１の構築 前記小原クローンＮｏ．１４８から、ｔｉｇ遺伝子を含
む約２．５ｋｂの断片をＢｓｐ１２８６１ＩおよびＮｒ
ｕＩを用いて切り出し、ついで得られたＢｓｐ１２８６
１Ｉ−ＮｒｕＩ断片を平滑末端化して、ｔｉｇ遺伝子断
片を得る。ｐＧｒｏ１１プラスミド〔Nishihara, K. et
al., Appl. Environ. Microbiol., 64,1694-1699 (199
8) 〕のｇｒｏＥＬ遺伝子の下流をＳｍａＩで切断した
のち、前記平滑末端化されたｔｉｇ遺伝子断片を連結
し、ｐＧ−Ｔｆ１を得た。
む約２．５ｋｂの断片をＢｓｐ１２８６１ＩおよびＮｒ
ｕＩを用いて切り出し、ついで得られたＢｓｐ１２８６
１Ｉ−ＮｒｕＩ断片を平滑末端化して、ｔｉｇ遺伝子断
片を得る。ｐＧｒｏ１１プラスミド〔Nishihara, K. et
al., Appl. Environ. Microbiol., 64,1694-1699 (199
8) 〕のｇｒｏＥＬ遺伝子の下流をＳｍａＩで切断した
のち、前記平滑末端化されたｔｉｇ遺伝子断片を連結
し、ｐＧ−Ｔｆ１を得た。
【００５０】調製例１マウスエンドスタチン発現のための共形質転換体の調製 ｐＴｆ１３またはｐＧ−Ｔｆ１のそれぞれ（各５０ｎ
ｇ）とマウスエンドスタチンをコードするｐＴＢ０１＃
８〔O'Reilly, M. S. et al., Cell, 88, 277-285 (199
7); ハーバード大学子供病院Thomas Boehm博士、Judah
Folkman 博士より入手〕（５０ｎｇ）とを用いて、大腸
菌ＢＬ２１を形質転換した。なお、形質転換は塩化カル
シウム法により行なった。
ｇ）とマウスエンドスタチンをコードするｐＴＢ０１＃
８〔O'Reilly, M. S. et al., Cell, 88, 277-285 (199
7); ハーバード大学子供病院Thomas Boehm博士、Judah
Folkman 博士より入手〕（５０ｎｇ）とを用いて、大腸
菌ＢＬ２１を形質転換した。なお、形質転換は塩化カル
シウム法により行なった。
【００５１】ｐＴｆ１３とｐＴＢ０１＃８を保持する共
形質転換体は、クロラムフェニコールおよびアンピシリ
ンをそれぞれ２０μｇ／ｍｌおよび５０μｇ／ｍｌの濃
度で含むプレートを用いてスクリーニングすることによ
り得た。得られたトリガーファクターとマウスエンドス
タチンとを共発現するクローンをＮＫ３６５と命名し
た。
形質転換体は、クロラムフェニコールおよびアンピシリ
ンをそれぞれ２０μｇ／ｍｌおよび５０μｇ／ｍｌの濃
度で含むプレートを用いてスクリーニングすることによ
り得た。得られたトリガーファクターとマウスエンドス
タチンとを共発現するクローンをＮＫ３６５と命名し
た。
【００５２】ｐＧ−Ｔｆ１とｐＴＢ０１＃８を保持する
共形質転換体は、クロラムフェニコールおよびアンピシ
リンをそれぞれ２０μｇ／ｍｌおよび５０μｇ／ｍｌの
濃度で含むプレートを用いてスクリーニングすることに
より得た。得られた得られたトリガーファクター、Ｇｒ
ｏＥＬおよびＧｒｏＥＳとマウスエンドスタチンとを共
発現するクローンをＮＫ３６４と命名した。
共形質転換体は、クロラムフェニコールおよびアンピシ
リンをそれぞれ２０μｇ／ｍｌおよび５０μｇ／ｍｌの
濃度で含むプレートを用いてスクリーニングすることに
より得た。得られた得られたトリガーファクター、Ｇｒ
ｏＥＬおよびＧｒｏＥＳとマウスエンドスタチンとを共
発現するクローンをＮＫ３６４と命名した。
【００５３】比較例として、ＧｒｏＥＬおよびＧｒｏＥ
Ｓとマウスエンドスタチン、ＤｎａＫ、ＤｎａＪおよび
ＧｒｐＥとマウスエンドスタチン、ならびにＤｎａＫ、
ＤｎａＪ、ＧｒｐＥ、ＧｒｏＥＬおよびＧｒｏＥＳとマ
ウスエンドスタチンとを共発現する共形質転換体をそれ
ぞれ調製した。
Ｓとマウスエンドスタチン、ＤｎａＫ、ＤｎａＪおよび
ＧｒｐＥとマウスエンドスタチン、ならびにＤｎａＫ、
ＤｎａＪ、ＧｒｐＥ、ＧｒｏＥＬおよびＧｒｏＥＳとマ
ウスエンドスタチンとを共発現する共形質転換体をそれ
ぞれ調製した。
【００５４】ＤｎａＫ、ＤｎａＪ、ＧｒｐＥ、ＧｒｏＥ
ＬおよびＧｒｏＥＳとマウスエンドスタチンとを共発現
するクローンは、ｐＧ−ＫＪＥ８とｐＴＢ０１＃８とを
共形質転換し、クロラムフェニコールおよびアンピシリ
ンをそれぞれ２０μｇ／ｍｌおよび５０μｇ／ｍｌの濃
度で含むプレートを用いて、スクリーニングすることに
より得た。得られたクローンをＮＫ３６３と命名した。
ＬおよびＧｒｏＥＳとマウスエンドスタチンとを共発現
するクローンは、ｐＧ−ＫＪＥ８とｐＴＢ０１＃８とを
共形質転換し、クロラムフェニコールおよびアンピシリ
ンをそれぞれ２０μｇ／ｍｌおよび５０μｇ／ｍｌの濃
度で含むプレートを用いて、スクリーニングすることに
より得た。得られたクローンをＮＫ３６３と命名した。
【００５５】前記ｐＧ−ＫＪＥ８はｐＧ−ＫＪＥ６〔Ni
shihara, K. et al., Appl. Environ. Microbiol. 64,
1694-1699 (1998)〕のｄｎａＫ−ｄｎａＪ−ｇｒｐＥ遺
伝子の下流にｒｒｎＢＴ１Ｔ２ターミネーター配列を入
れることにより、シャペロン発現調節をより厳密に行え
るようにしたプラスミドで、下記のように調製した。ま
ず、ｐＫＪＥ７のｄｎａＫ−ｄｎａＪ−ｇｒｐＥ遺伝子
の下流にあるＫｐｎＩ部位を平滑末端化した後、ｐＴｒ
ｃ９９Ａ（ファルマシア社）からＸｍｎＩ部位で切り出
したｒｒｎＢＴ１Ｔ２配列を挿入し、プラスミドｐＫＪ
Ｅ９を得た。次いで、ｐＫＪＥ９をＸｍｎＩ部位で切断
して、ｐＧ−ＫＪＥ６を調製した場合と同様にＴｅｔＲ
−Ｐｚｔ１ｐ−ｇｒｏＥＳ−ｇｒｏＥＬ断片を平滑末端
で挿入した。ＴｅｔＲ−Ｐｚｔ１ｐ−ｇｒｏＥＳ−ｇｒ
ｏＥＬ断片がｐＧ−ＫＪＥ６と同じ向きに入っているプ
ラスミドを選択し、該プラスミドをｐＧ−ＫＪＥ８とし
た。
shihara, K. et al., Appl. Environ. Microbiol. 64,
1694-1699 (1998)〕のｄｎａＫ−ｄｎａＪ−ｇｒｐＥ遺
伝子の下流にｒｒｎＢＴ１Ｔ２ターミネーター配列を入
れることにより、シャペロン発現調節をより厳密に行え
るようにしたプラスミドで、下記のように調製した。ま
ず、ｐＫＪＥ７のｄｎａＫ−ｄｎａＪ−ｇｒｐＥ遺伝子
の下流にあるＫｐｎＩ部位を平滑末端化した後、ｐＴｒ
ｃ９９Ａ（ファルマシア社）からＸｍｎＩ部位で切り出
したｒｒｎＢＴ１Ｔ２配列を挿入し、プラスミドｐＫＪ
Ｅ９を得た。次いで、ｐＫＪＥ９をＸｍｎＩ部位で切断
して、ｐＧ−ＫＪＥ６を調製した場合と同様にＴｅｔＲ
−Ｐｚｔ１ｐ−ｇｒｏＥＳ−ｇｒｏＥＬ断片を平滑末端
で挿入した。ＴｅｔＲ−Ｐｚｔ１ｐ−ｇｒｏＥＳ−ｇｒ
ｏＥＬ断片がｐＧ−ＫＪＥ６と同じ向きに入っているプ
ラスミドを選択し、該プラスミドをｐＧ−ＫＪＥ８とし
た。
【００５６】試験例１ マウスエンドスタチンの発現 調製例１で得られた各共形質転換体を用いて、マウスエ
ンドスタチンの発現を調べた。培養には、Ｌ培地（組
成：１％バクトトリプトン、０．５％酵母エキス、０．
５％ＮａＣｌ、２０μｇ／ｍｌクロラムフェニコール、
５０μｇ／ｍｌアンピシリン）を用いた。
ンドスタチンの発現を調べた。培養には、Ｌ培地（組
成：１％バクトトリプトン、０．５％酵母エキス、０．
５％ＮａＣｌ、２０μｇ／ｍｌクロラムフェニコール、
５０μｇ／ｍｌアンピシリン）を用いた。
【００５７】各共形質転換体は３７℃で培養した。培養
開始する際に、ＮＫ３６５の培地にはＬ−アラビノース
（終濃度１０ｍｇ／ｍｌ）を添加し、またＮＫ３６４の
培地にはテトラサイクリン（終濃度１０ｎｇ／ｍｌ）を
添加してシャペロンを発現誘導した。Ｋｌｅｔｔ Ｕｎ
ｉｔ約６０の時に培養液に１０ｍＭ ＭｇＳＯ4 とλフ
ァージＣＥ６（Ｎｏｖａｇｅｎ社）３×１０9 ｐｆｕ／
ｍｌを加えてエンドスタチンの発現を誘導した。
開始する際に、ＮＫ３６５の培地にはＬ−アラビノース
（終濃度１０ｍｇ／ｍｌ）を添加し、またＮＫ３６４の
培地にはテトラサイクリン（終濃度１０ｎｇ／ｍｌ）を
添加してシャペロンを発現誘導した。Ｋｌｅｔｔ Ｕｎ
ｉｔ約６０の時に培養液に１０ｍＭ ＭｇＳＯ4 とλフ
ァージＣＥ６（Ｎｏｖａｇｅｎ社）３×１０9 ｐｆｕ／
ｍｌを加えてエンドスタチンの発現を誘導した。
【００５８】ＮＫ３６３の培養開始時に培地にテトラサ
イクリン（５０ｎｇ／ｍｌ）を添加し、Ｋｌｅｔｔ Ｕ
ｎｉｔ約６０の時に前記と同様に１０ｍＭ ＭｇＳＯ4
とλファージＣＥ６を加えて、ＧｒｏＥＬおよびＧｒｏ
ＥＳとマウスエンドスタチンの発現を誘導した。
イクリン（５０ｎｇ／ｍｌ）を添加し、Ｋｌｅｔｔ Ｕ
ｎｉｔ約６０の時に前記と同様に１０ｍＭ ＭｇＳＯ4
とλファージＣＥ６を加えて、ＧｒｏＥＬおよびＧｒｏ
ＥＳとマウスエンドスタチンの発現を誘導した。
【００５９】また、培養開始時にＬ−アラビノース（１
０ｍｇ／ｍｌ）を、Ｋｌｅｔｔ Ｕｎｉｔ約６０の時に
ＭｇＣｌ2 とλファージＣＥ６をそれぞれ添加し、Ｄｎ
ａＫ、ＤｎａＪ、ＧｒｐＥとマウスエンドスタチンの発
現を誘導した。
０ｍｇ／ｍｌ）を、Ｋｌｅｔｔ Ｕｎｉｔ約６０の時に
ＭｇＣｌ2 とλファージＣＥ６をそれぞれ添加し、Ｄｎ
ａＫ、ＤｎａＪ、ＧｒｐＥとマウスエンドスタチンの発
現を誘導した。
【００６０】さらに、培養開始時にＬ−アラビノース
（１０ｍｇ／ｍｌ）とテトラサイクリン（２０ｎｇ／ｍ
ｌ）を、Ｋｌｅｔｔ Ｕｎｉｔ約６０の時にＭｇＣｌ2
とλファージＣＥ６をそれぞれ添加し、ＤｎａＫ、Ｄｎ
ａＪ、ＧｒｐＥ、ＧｒｏＥＬおよびＧｒｏＥＳとマウス
エンドスタチンの発現を誘導した。
（１０ｍｇ／ｍｌ）とテトラサイクリン（２０ｎｇ／ｍ
ｌ）を、Ｋｌｅｔｔ Ｕｎｉｔ約６０の時にＭｇＣｌ2
とλファージＣＥ６をそれぞれ添加し、ＤｎａＫ、Ｄｎ
ａＪ、ＧｒｐＥ、ＧｒｏＥＬおよびＧｒｏＥＳとマウス
エンドスタチンの発現を誘導した。
【００６１】エンドスタチンの発現誘導を２時間行なっ
たのち、菌体を回収した。得られた菌体を超音波破砕
し、ついで８２００×ｇの遠心分離により可溶性画分と
不溶性画分に分けた。それぞれの画分について、菌体タ
ンパク質８μｇに由来する量をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し
た。なお、対照として、トリガーファクターを発現誘導
しないＮＫ３６５から得られた画分を用いた。結果を図
３に示す。
たのち、菌体を回収した。得られた菌体を超音波破砕
し、ついで８２００×ｇの遠心分離により可溶性画分と
不溶性画分に分けた。それぞれの画分について、菌体タ
ンパク質８μｇに由来する量をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し
た。なお、対照として、トリガーファクターを発現誘導
しないＮＫ３６５から得られた画分を用いた。結果を図
３に示す。
【００６２】図３の左パネルに示すように、通常大腸菌
内では不溶化しインクルージョンボディーとして発現す
るマウスエンドスタチンとＧｒｏＥＬおよびＧｒｏＥＳ
のみとの共発現した場合には、エンドスタチンは大部分
が可溶性画分に検出されたが、不溶性画分にもマウスエ
ンドスタチンが検出された。さらに、マウスエンドスタ
チンとＤｎａＫ、ＤｎａＪおよびＧｒｐＥまたはＤｎａ
Ｋ、ＤｎａＪ、ＧｒｐＥ、ＧｒｏＥＬおよびＧｒｏＥＳ
とを共発現した場合にも、不溶性画分にマウスエンドス
タチンが検出された。
内では不溶化しインクルージョンボディーとして発現す
るマウスエンドスタチンとＧｒｏＥＬおよびＧｒｏＥＳ
のみとの共発現した場合には、エンドスタチンは大部分
が可溶性画分に検出されたが、不溶性画分にもマウスエ
ンドスタチンが検出された。さらに、マウスエンドスタ
チンとＤｎａＫ、ＤｎａＪおよびＧｒｐＥまたはＤｎａ
Ｋ、ＤｎａＪ、ＧｒｐＥ、ＧｒｏＥＬおよびＧｒｏＥＳ
とを共発現した場合にも、不溶性画分にマウスエンドス
タチンが検出された。
【００６３】一方、図３の右パネルの結果より、マウス
エンドスタチンとトリガーファクターまたはトリガーフ
ァクター、ＧｒｏＥＬおよびＧｒｏＥＳとを共発現した
どちらの場合も、発現したエンドスタチンは可溶性画分
においてのみ検出され、不溶性画分には検出されなかっ
た。また、トリガーファクターまたはトリガーファクタ
ー、ＧｒｏＥＬおよびＧｒｏＥＳを共発現していない対
照に比べ、可溶性画分が増加していることが観察され
た。
エンドスタチンとトリガーファクターまたはトリガーフ
ァクター、ＧｒｏＥＬおよびＧｒｏＥＳとを共発現した
どちらの場合も、発現したエンドスタチンは可溶性画分
においてのみ検出され、不溶性画分には検出されなかっ
た。また、トリガーファクターまたはトリガーファクタ
ー、ＧｒｏＥＬおよびＧｒｏＥＳを共発現していない対
照に比べ、可溶性画分が増加していることが観察され
た。
【００６４】以上のように、ＧｒｏＥＬおよびＧｒｏＥ
Ｓ、ＤｎａＫ、ＤｎａＪおよびＧｒｐＥ、ならびにＤｎ
ａＫ、ＤｎａＪ、ＧｒｐＥ、ＧｒｏＥＬおよびＧｒｏＥ
Ｓのそれぞれのシャペロンの共発現に比べ、トリガーフ
ァクターまたはトリガーファクター、ＧｒｏＥＬおよび
ＧｒｏＥＳの共発現により、一層外来タンパク質の可溶
化の効果が得られることが示された。
Ｓ、ＤｎａＫ、ＤｎａＪおよびＧｒｐＥ、ならびにＤｎ
ａＫ、ＤｎａＪ、ＧｒｐＥ、ＧｒｏＥＬおよびＧｒｏＥ
Ｓのそれぞれのシャペロンの共発現に比べ、トリガーフ
ァクターまたはトリガーファクター、ＧｒｏＥＬおよび
ＧｒｏＥＳの共発現により、一層外来タンパク質の可溶
化の効果が得られることが示された。
【００６５】調製例２ヒトＯＲＰ１５０発現のための共形質転換体の調製 実施例１もしくは２で得られたｐＴｆ１３もしくはｐＧ
−Ｔｆ１、またはｇｒｏＥＬおよびｇｒｏＥＳを保持す
るプラスミドであるｐＧｒｏ１１〔Nishihara,K. et a
l., Appl. Environ. Microbiol., 64, 1694-1699 (199
8) 〕のそれぞれ（各５０ｎｇ）とヒトＯＲＰ１５０を
コードするプラスミドｐＯＲＰ４（５０ｎｇ）とを用い
て、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換した。なお、形質転換
は塩化カルシウム法により行なった。
−Ｔｆ１、またはｇｒｏＥＬおよびｇｒｏＥＳを保持す
るプラスミドであるｐＧｒｏ１１〔Nishihara,K. et a
l., Appl. Environ. Microbiol., 64, 1694-1699 (199
8) 〕のそれぞれ（各５０ｎｇ）とヒトＯＲＰ１５０を
コードするプラスミドｐＯＲＰ４（５０ｎｇ）とを用い
て、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換した。なお、形質転換
は塩化カルシウム法により行なった。
【００６６】ｐＴｆ１３とｐＯＲＰ４の共形質転換体
は、クロラムフェニコールおよびアンピシリンをそれぞ
れ２０μｇ／ｍｌおよび５０μｇ／ｍｌの濃度で含むプ
レートを用いてスクリーニングすることにより得た。得
られたクローンをＮＫ３６０と命名した。
は、クロラムフェニコールおよびアンピシリンをそれぞ
れ２０μｇ／ｍｌおよび５０μｇ／ｍｌの濃度で含むプ
レートを用いてスクリーニングすることにより得た。得
られたクローンをＮＫ３６０と命名した。
【００６７】ｐＧ−Ｔｆ１とｐＯＲＰ４の共形質転換体
は、クロラムフェニコールおよびアンピシリンをそれぞ
れ２０μｇ／ｍｌおよび５０μｇ／ｍｌの濃度で含むプ
レートを用いてスクリーニングすることにより得た。得
られたクローンをＮＫ３４０と命名した。
は、クロラムフェニコールおよびアンピシリンをそれぞ
れ２０μｇ／ｍｌおよび５０μｇ／ｍｌの濃度で含むプ
レートを用いてスクリーニングすることにより得た。得
られたクローンをＮＫ３４０と命名した。
【００６８】ｐＧｒｏ１１とｐＯＲＰ４の共形質転換体
は、クロラムフェニコールおよびアンピシリンをそれぞ
れ２０μｇ／ｍｌおよび５０μｇ／ｍｌの濃度で含むプ
レートを用いてスクリーニングすることにより得た。得
られたクローンをＮＫ３４１と命名した。
は、クロラムフェニコールおよびアンピシリンをそれぞ
れ２０μｇ／ｍｌおよび５０μｇ／ｍｌの濃度で含むプ
レートを用いてスクリーニングすることにより得た。得
られたクローンをＮＫ３４１と命名した。
【００６９】試験例２ ヒトＯＲＰ１５０発現 調製例２で得られたＮＫ３６０、ＮＫ３４０およびＮＫ
３４１を用いて、ヒトＯＲＰ１５０の発現を調べた。培
養には、Ｌ培地（組成：１％バクトトリプトン、０．５
％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ、２０μｇ／ｍｌクロ
ラムフェニコール、５０μｇ／ｍｌアンピシリン）を用
いた。
３４１を用いて、ヒトＯＲＰ１５０の発現を調べた。培
養には、Ｌ培地（組成：１％バクトトリプトン、０．５
％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ、２０μｇ／ｍｌクロ
ラムフェニコール、５０μｇ／ｍｌアンピシリン）を用
いた。
【００７０】各共形質転換体は３７℃で培養した。ＮＫ
３４０およびＮＫ３４１は、Ｋｌｅｔｔ Ｕｎｉｔが約
４０に達した時に、それぞれの培養液にテトラサイクリ
ン（終濃度１０ｎｇ／ｍｌ）とＩＰＴＧ（終濃度１ｍ
Ｍ）を添加してシャペロンおよびＯＲＰ１５０の発現を
誘導した。ＮＫ３６０は、Ｋｌｅｔｔ Ｕｎｉｔが約２
０に達した時にＬ−アラビノース（終濃度１０ｍｇ／ｍ
ｌ）を添加してトリガーファクターを発現誘導し、続い
てＫｌｅｔｔ Ｕｎｉｔが約４０に達した時にＩＰＴＧ
（終濃度１ｍＭ）を添加してＯＲＰ１５０の発現を誘導
した。
３４０およびＮＫ３４１は、Ｋｌｅｔｔ Ｕｎｉｔが約
４０に達した時に、それぞれの培養液にテトラサイクリ
ン（終濃度１０ｎｇ／ｍｌ）とＩＰＴＧ（終濃度１ｍ
Ｍ）を添加してシャペロンおよびＯＲＰ１５０の発現を
誘導した。ＮＫ３６０は、Ｋｌｅｔｔ Ｕｎｉｔが約２
０に達した時にＬ−アラビノース（終濃度１０ｍｇ／ｍ
ｌ）を添加してトリガーファクターを発現誘導し、続い
てＫｌｅｔｔ Ｕｎｉｔが約４０に達した時にＩＰＴＧ
（終濃度１ｍＭ）を添加してＯＲＰ１５０の発現を誘導
した。
【００７１】ＩＰＴＧ添加２時間後にそれぞれの菌体を
回収した。得られた菌体を超音波破砕し、ついで８２０
０×ｇの遠心分離により可溶性画分と不溶性画分に分け
た。それぞれの画分について、菌体タンパク質８μｇに
由来する量をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。なお、対照と
して、シャペロン（ＧｒｏＥＬ、ＧｒｏＥＳ）を発現誘
導しないＮＫ３４１から得られた画分を用いた。結果を
図４に示す。
回収した。得られた菌体を超音波破砕し、ついで８２０
０×ｇの遠心分離により可溶性画分と不溶性画分に分け
た。それぞれの画分について、菌体タンパク質８μｇに
由来する量をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。なお、対照と
して、シャペロン（ＧｒｏＥＬ、ＧｒｏＥＳ）を発現誘
導しないＮＫ３４１から得られた画分を用いた。結果を
図４に示す。
【００７２】図４の結果より、通常大腸菌内では不溶化
しインクルージョンボディーとして発現するＯＲＰ１５
０は、ＧｒｏＥＬおよびＧｒｏＥＳとの共発現あるいは
トリガーファクターとの共発現により、発現したＯＲＰ
１５０の半分程度が可溶性タンパク質となり、ＧｒｏＥ
Ｌ、ＧｒｏＥＳおよびトリガーファクターとの共発現に
よりほぼすべてのＯＲＰ１５０が可溶性タンパク質とな
ることが示された。
しインクルージョンボディーとして発現するＯＲＰ１５
０は、ＧｒｏＥＬおよびＧｒｏＥＳとの共発現あるいは
トリガーファクターとの共発現により、発現したＯＲＰ
１５０の半分程度が可溶性タンパク質となり、ＧｒｏＥ
Ｌ、ＧｒｏＥＳおよびトリガーファクターとの共発現に
よりほぼすべてのＯＲＰ１５０が可溶性タンパク質とな
ることが示された。
【００７３】
【発明の効果】本発明の人工オペロンおよびプラスミド
は、目的の外来遺伝子との共発現により、外来蛋白質を
安定化した状態で、かつ可溶化した状態で発現すること
ができるという優れた性質を発揮する。また、本発明の
共形質転換体は、外来蛋白質を安定化した状態で、かつ
可溶化した状態で発現することができるという優れた効
果を奏する。さらに、本発明の外来蛋白質の製造方法に
よれば、外来蛋白質を安定化した状態で、かつ可溶化し
た状態で発現することができるという優れた効果を奏す
る。本発明によれば、大腸菌における外来蛋白質の効率
的な遺伝子工学的生産が可能となる。
は、目的の外来遺伝子との共発現により、外来蛋白質を
安定化した状態で、かつ可溶化した状態で発現すること
ができるという優れた性質を発揮する。また、本発明の
共形質転換体は、外来蛋白質を安定化した状態で、かつ
可溶化した状態で発現することができるという優れた効
果を奏する。さらに、本発明の外来蛋白質の製造方法に
よれば、外来蛋白質を安定化した状態で、かつ可溶化し
た状態で発現することができるという優れた効果を奏す
る。本発明によれば、大腸菌における外来蛋白質の効率
的な遺伝子工学的生産が可能となる。
【００７４】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> HSP Reseach Institute, Inc. <120> Trigger factor expression plasmids <130> HSP-10-008 <160> 7
【００７５】 <210> 1 <211> 432 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 1 Met Gln Val Ser Val Glu Thr Thr Gln Gly Leu Gly Arg Arg Val 1 5 10 15 Thr Ile Thr Ile Ala Ala Asp Ser Ile Glu Thr Ala Val Lys Ser 20 25 30 Glu Leu Val Asn Val Ala Lys Lys Val Arg Ile Asp Gly Phe Arg 35 40 45 Lys Gly Lys Val Pro Met Asn Ile Val Ala Gln Arg Tyr Gly Ala 50 55 60 Ser Val Arg Gln Asp Val Leu Gly Asp Leu Met Ser Arg Asn Phe 65 70 75 Ile Asp Ala Ile Ile Lys Glu Lys Ile Asn Pro Ala Gly Ala Pro 80 85 90 Thr Tyr Val Pro Gly Glu Tyr Lys Leu Gly Glu Asp Phe Thr Tyr 95 100 105 Ser Val Glu Phe Glu Val Tyr Pro Glu Val Glu Leu Glu Gly Leu 110 115 120 Glu Ala Ile Glu Val Glu Lys Pro Ile Val Glu Val Thr Asp Ala 125 130 135 Asp Val Asp Gly Met Leu Asp Thr Leu Arg Lys Gln Gln Ala Thr 140 145 150 Trp Lys Glu Lys Asp Gly Ala Val Glu Ala Glu Asp Arg Val Thr 155 160 165 Ile Asp Phe Thr Gly Ser Val Asp Gly Glu Glu Phe Glu Gly Gly 170 175 180 Lys Ala Ser Asp Phe Val Leu Ala Met Gly Gln Gly Arg Met Ile 185 190 195 Pro Gly Phe Glu Asp Gly Ile Lys Gly His Lys Ala Gly Glu Glu 200 205 210 Phe Thr Ile Asp Val Thr Phe Pro Glu Glu Tyr His Ala Glu Asn 215 220 225 Leu Lys Gly Lys Ala Ala Lys Phe Ala Ile Asn Leu Lys Lys Val 230 235 240 Glu Glu Arg Glu Leu Pro Glu Leu Thr Ala Glu Phe Ile Lys Arg 245 250 255 Phe Gly Val Glu Asp Gly Ser Val Glu Gly Leu Arg Ala Glu Val 260 265 270 Arg Lys Asn Met Glu Arg Glu Leu Arg Ala Pro Ser Val Thr Ala 275 280 285 Leu Ser Ser Gln Ala Ile Glu Gly Leu Val Lys Ala Asn Asp Ile 290 295 300 Asp Val Pro Ala Ala Leu Ile Asp Ser Glu Ile Asp Val Leu Arg 305 310 315 Arg Gln Ala Ala Gln Arg Phe Gly Gly Asn Glu Lys Gln Ala Leu 320 325 330 Glu Leu Pro Arg Glu Leu Phe Glu Glu Gln Ala Lys Arg Arg Val 335 340 345 Val Val Gly Leu Leu Leu Gly Glu Val Ile Arg Thr Asn Glu Leu 350 355 360 Lys Ala Asp Glu Glu Arg Val Lys Gly Leu Ile Glu Glu Met Ala 365 370 375 Ser Ala Tyr Glu Asp Pro Lys Glu Val Ile Glu Phe Tyr Ser Lys 380 385 390 Asn Lys Glu Leu Met Asp Asn Met Arg Asn Val Ala Leu Glu Glu 395 400 405 Gln Ala Val Glu Ala Val Leu Ala Lys Ala Lys Val Thr Glu Lys 410 415 420 Glu Thr Thr Phe Asn Glu Leu Met Asn Gln Gln Ala 425 430
【００７６】 <210> 2 <211> 1299 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 2 atgcaagttt cagttgaaac cactcaaggc cttggccgcc gtgtaacgat tactatcgct 60 gctgacagca tcgagaccgc tgttaaaagc gagctggtca acgttgcgaa aaaagtacgt 120 attgacggct tccgcaaagg caaagtgcca atgaatatcg ttgctcagcg ttatggcgcg 180 tctgtacgcc aggacgttct gggtgacctg atgagccgta acttcattga cgccatcatt 240 aaagaaaaaa tcaatccggc tggcgcaccg acttatgttc cgggcgaata caagctgggt 300 gaagacttca cttactctgt agagtttgaa gtttatccgg aagttgaact cgagggtctg 360 gaagcgatcg aagttgaaaa accgatcgtt gaagtgaccg acgctgacgt tgacggcatg 420 ctggatactc tgcgtaaaca gcaggcgacc tggaaagaaa aagacggcgc tgttgaagca 480 gaagaccgcg taaccatcga cttcaccggt tctgtagacg gcgaagagtt cgaaggcggt 540 aaagcgtctg atttcgtact ggcgatgggc cagggtcgta tgatcccggg ctttgaagac 600 ggtatcaaag gccacaaagc tggcgaagag ttcaccatcg acgtgacctt cccggaagaa 660 taccacgcag aaaacctgaa aggtaaagca gcgaaattcg ctatcaacct gaagaaagtt 720 gaagagcgtg aactgccgga actgactgca gaattcatca aacgtttcgg cgttgaagat 780 ggttccgtag aaggtctgcg cgctgaagtg cgtaaaaaca tggagcgcga gctgaagagc 840 gccatccgta accgcgttaa gtctcaggcg atcgaaggtc tggtaaaagc taacgacatc 900 gacgtaccgg ctgcgctgat cgacagcgaa atcgacgttc tgcgtcgcca ggctgcacag 960 cgtttcggtg gcaacgaaaa acaagctctg gaactgccgc gcgaactgtt cgaagaacag 1020 gctaaacgcc gcgtagttgt tggcctgctg ctgggcgaag ttatccgcac caacgagctg 1080 aaagctgacg aagagcgcgt gaaaggcctg atcgaagaga tggcttctgc gtacgaagat 1140 ccgaaagaag ttatcgagtt ctacagcaaa aacaaagaac tgatggacaa catgcgcaat 1200 gttgctctgg aagaacaggc tgttgaagct gtactggcga aagcgaaagt gactgaaaaa 1260 gaaaccactt tcaacgagct gatgaaccag caggcgtaa 1299
【００７７】 <210> 3 <211> 548 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 3 Met Ala Ala Lys Asp Val Lys Phe Gly Asn Asp Ala Arg Val Lys 1 5 10 15 Met Leu Arg Gly Val Asn Val Leu Ala Asp Ala Val Lys Val Thr 20 25 30 Leu Gly Pro Lys Gly Arg Asn Val Val Leu Asp Lys Ser Phe Gly 35 40 45 Ala Pro Thr Ile Thr Lys Asp Gly Val Ser Val Ala Arg Glu Ile 50 55 60 Glu Leu Glu Asp Lys Phe Glu Asn Met Gly Ala Gln Met Val Lys 65 70 75 Glu Val Ala Ser Lys Ala Asn Asp Ala Ala Gly Asp Gly Thr Thr 80 85 90 Thr Ala Thr Val Leu Ala Gln Ala Ile Ile Thr Glu Gly Leu Lys 95 100 105 Ala Val Ala Ala Gly Met Asn Pro Met Asp Leu Lys Arg Gly Ile 110 115 120 Asp Lys Ala Val Thr Ala Ala Val Glu Glu Leu Lys Ala Leu Ser 125 130 135 Val Pro Cys Ser Asp Ser Lys Ala Ile Ala Gln Val Gly Thr Ile 140 145 150 Ser Ala Asn Ser Asp Glu Thr Val Gly Lys Leu Ile Ala Glu Ala 155 160 165 Met Asp Lys Val Gly Lys Glu Gly Val Ile Thr Val Glu Asp Gly 170 175 180 Thr Gly Leu Gln Asp Glu Leu Asp Val Val Glu Gly Met Gln Phe 185 190 195 Asp Arg Gly Tyr Leu Ser Pro Tyr Phe Ile Asn Lys Pro Glu Thr 200 205 210 Gly Ala Val Glu Leu Glu Ser Pro Phe Ile Leu Leu Ala Asp Lys 215 220 225 Lys Ile Ser Asn Ile Arg Glu Met Leu Pro Val Leu Glu Ala Val 230 235 240 Ala Lys Ala Gly Lys Pro Leu Leu Ile Ile Ala Glu Asp Val Glu 245 250 255 Gly Glu Ala Leu Ala Thr Ala Val Val Asn Thr Ile Arg Gly Ile 260 265 270 Val Lys Val Ala Ala Val Lys Ala Pro Gly Phe Gly Asp Arg Arg 275 280 285 Lys Ala Met Leu Gln Asp Ile Ala Thr Leu Thr Gly Gly Thr Val 290 295 300 Ile Ser Glu Glu Ile Gly Met Glu Leu Glu Lys Ala Thr Leu Glu 305 310 315 Asp Leu Gly Gln Ala Lys Arg Val Val Ile Asn Lys Asp Thr Thr 320 325 330 Thr Ile Ile Asp Gly Val Gly Glu Glu Ala Ala Ile Gln Gly Arg 335 340 345 Val Ala Gln Ile Arg Gln Gln Ile Glu Glu Ala Thr Ser Asp Tyr 350 355 360 Asp Arg Glu Lys Leu Gln Glu Arg Val Ala Lys Leu Ala Gly Gly 365 370 375 Val Ala Val Ile Lys Val Gly Ala Ala Thr Glu Val Glu Met Lys 380 385 390 Glu Lys Lys Ala Arg Val Glu Asp Ala Leu His Ala Thr Arg Ala 395 400 405 Ala Val Glu Glu Gly Val Val Ala Gly Gly Gly Val Ala Leu Ile 410 415 420 Arg Val Ala Ser Lys Leu Ala Asp Leu Arg Gly Gln Asn Glu Asp 425 430 435 Gln Asn Val Gly Ile Lys Val Ala Leu Arg Ala Met Glu Ala Pro 440 445 450 Leu Arg Gln Ile Val Leu Asn Cys Gly Glu Glu Pro Ser Val Val 455 460 465 Ala Asn Thr Val Lys Gly Gly Asp Gly Asn Tyr Gly Tyr Asn Ala 470 475 480 Ala Thr Glu Glu Tyr Gly Asn Met Ile Asp Met Gly Ile Leu Asp 485 490 495 Pro Thr Lys Val Thr Arg Ser Ala Leu Gln Tyr Ala Ala Ser Val 500 505 510 Ala Gly Leu Met Ile Thr Thr Glu Cys Met Val Thr Asp Leu Pro 515 520 525 Lys Asn Asp Ala Ala Asp Leu Gly Ala Ala Gly Gly Met Gly Gly 530 535 540 Met Gly Gly Met Gly Gly Met Met 545
【００７８】 <210> 4 <211> 97 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 4 Met Asn Ile Arg Pro Leu His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys 1 5 10 15 Glu Val Glu Thr Lys Ser Ala Gly Gly Ile Val Leu Thr Gly Ser 20 25 30 Ala Ala Ala Lys Ser Thr Arg Gly Glu Val Leu Ala Val Gly Asn 35 40 45 Gly Arg Ile Leu Glu Asn Gly Glu Val Lys Pro Leu Asp Val Lys 50 55 60 Val Gly Asp Ile Val Ile Phe Asn Asp Gly Tyr Gly Val Lys Ser 65 70 75 Glu Lys Ile Asp Asn Glu Glu Val Leu Ile Met Ser Glu Ser Asp 80 85 90 Ile Leu Ala Ile Val Glu Ala 95
【００７９】 <210> 5 <211> 1647 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 5 atggcagcta aagacgtaaa attcggtaac gacgctcgtg tgaaaatgct gcgcggcgta 60 aacgtactgg cagatgcagt gaaagttacc ctcggtccaa aaggccgtaa cgtagttctg 120 gataaatctt tcggtgcacc gaccatcacc aaagatggtg tttccgttgc tcgtgaaatc 180 gaactggaag acaagttcga aaatatgggt gcgcagatgg tgaaagaagt tgcctctaaa 240 gcaaacgacg ctgcaggcga cggtaccacc actgcaaccg tactggctca ggctatcatc 300 actgaaggtc tgaaagctgt tgctgcgggc atgaacccga tggacctgaa acgtggtatc 360 gacaaagcgg ttaccgctgc agttgaagaa ctgaaagcgc tgtccgtacc atgctctgac 420 tctaaagcga ttgctcaggt tggtaccatc tccgctaact ccgacgaaac cgtaggtaaa 480 ctgatcgctg aagcgatgga caaagtcggt aaagaaggcg ttatcaccgt tgaagacggt 540 accggtctgc aggacgaact ggacgtggtt gaaggtatgc agttcgaccg tggctacctg 600 tctccttact tcatcaacaa gccggaaact ggcgcagtag aactggaaag cccgttcatc 660 ctgctggctg acaagaaaat ctccaacatc cgcgaaatgc tgccggttct ggaagctgtt 720 gccaaagcag gcaaaccgct gctgatcatc gctgaagatg tagaaggcga agcgctggca 780 actgctgttg ttaacaccat tcgtggcatc gtgaaagtcg ctgcggttaa agcaccgggc 840 ttcggcgatc gtcgtaaagc tatgctgcag gatatcgcaa ccctgactgg cggtaccgtg 900 atctctgaag agatcggtat ggagctggaa aaagcaaccc tggaagacct gggtcaggct 960 aaacgtgttg tgatcaacaa agacaccacc actatcatcg atggcgtggg tgaagaagct 1020 gcaatccagg gccgtgttgc tcagatccgt cagcagattg aagaagcaac ttctgactac 1080 gaccgtgaaa aactgcagga acgcgtagcg aaactggcag gcggcgttgc agttatcaaa 1140 gtgggtgctg ctaccgaagt tgaaatgaaa gagaaaaaag cacgcgttga agatgccctg 1200 cacgcgaccc gtgctgcggt agaagaaggc gtggttgctg gtggtggtgt tgcgctgatc 1260 cgcgtagcgt ctaaactggc tgacctgcgt ggtcagaacg aagaccagaa cgtgggtatc 1320 aaagttgcac tgcgtgcaat ggaagctccg ctgcgtcaga tcgtattgaa ctgcggcgaa 1380 gaaccgtctg ttgttgctaa caccgttaaa ggcggcgacg gcaactacgg ttacaacgca 1440 gcaaccgaag aatacggcaa catgatcgac atgggtatcc tggatccaac caaagtaact 1500 cgttctgctc tgcagtacgc agcttctgtg gctggcctga tgatcaccac cgaatgcatg 1560 gttaccgacc tgccgaaaaa cgatgcagct gacttaggcg ctgctggcgg tatgggcggc 1620 atgggtggca tgggcggcat gatgtaa 1647
【００８０】 <210> 6 <211> 294 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 6 atgaatattc gtccattgca tgatcgcgtg atcgtcaagc gtaaagaagt tgaaactaaa 60 tctgctggcg gcatcgttct gaccggctct gcagcggcta aatccacccg cggcgaagtg 120 ctggctgtcg gcaatggccg tatccttgaa aatggcgaag tgaagccgct ggatgtgaaa 180 gttggcgaca tcgttatttt caacgatggc tacggtgtga aatctgagaa gatcgacaat 240 gaagaagtgt tgatcatgtc cgaaagcgac attctggcaa ttgttgaagc gtaa 294
【００８１】 <210> 7 <211> 4525 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 7 ggcgtcaccc ataacagata cggactttct caaaggagag ttatcaatga atattcgtcc 60 attgcatgat cgcgtgatcg tcaagcgtaa agaagttgaa actaaatctg ctggcggcat 120 cgttctgacc ggctctgcag cggctaaatc cacccgcggc gaagtgctgg ctgtcggcaa 180 tggccgtatc cttgaaaatg gcgaagtgaa gccgctggat gtgaaagttg gcgacatcgt 240 tattttcaac gatggctacg gtgtgaaatc tgagaagatc gacaatgaag aagtgttgat 300 catgtccgaa agcgacattc tggcaattgt tgaagcgtaa tccgcgcacg acactgaaca 360 tacgaattta aggaataaag ataatggcag ctaaagacgt aaaattcggt aacgacgctc 420 gtgtgaaaat gctgcgcggc gtaaacgtac tggcagatgc agtgaaagtt accctcggtc 480 caaaaggccg taacgtagtt ctggataaat ctttcggtgc accgaccatc accaaagatg 540 gtgtttccgt tgctcgtgaa atcgaactgg aagacaagtt cgaaaatatg ggtgcgcaga 600 tggtgaaaga agttgcctct aaagcaaacg acgctgcagg cgacggtacc accactgcaa 660 ccgtactggc tcaggctatc atcactgaag gtctgaaagc tgttgctgcg ggcatgaacc 720 cgatggacct gaaacgtggt atcgacaaag cggttaccgc tgcagttgaa gaactgaaag 780 cgctgtccgt accatgctct gactctaaag cgattgctca ggttggtacc atctccgcta 840 actccgacga aaccgtaggt aaactgatcg ctgaagcgat ggacaaagtc ggtaaagaag 900 gcgttatcac cgttgaagac ggtaccggtc tgcaggacga actggacgtg gttgaaggta 960 tgcagttcga ccgtggctac ctgtctcctt acttcatcaa caagccggaa actggcgcag 1020 tagaactgga aagcccgttc atcctgctgg ctgacaagaa aatctccaac atccgcgaaa 1080 tgctgccggt tctggaagct gttgccaaag caggcaaacc gctgctgatc atcgctgaag 1140 atgtagaagg cgaagcgctg gcaactgctg ttgttaacac cattcgtggc atcgtgaaag 1200 tcgctgcggt taaagcaccg ggcttcggcg atcgtcgtaa agctatgctg caggatatcg 1260 caaccctgac tggcggtacc gtgatctctg aagagatcgg tatggagctg gaaaaagcaa 1320 ccctggaaga cctgggtcag gctaaacgtg ttgtgatcaa caaagacacc accactatca 1380 tcgatggcgt gggtgaagaa gctgcaatcc agggccgtgt tgctcagatc cgtcagcaga 1440 ttgaagaagc aacttctgac tacgaccgtg aaaaactgca ggaacgcgta gcgaaactgg 1500 caggcggcgt tgcagttatc aaagtgggtg ctgctaccga agttgaaatg aaagagaaaa 1560 aagcacgcgt tgaagatgcc ctgcacgcga cccgtgctgc ggtagaagaa ggcgtggttg 1620 ctggtggtgg tgttgcgctg atccgcgtag cgtctaaact ggctgacctg cgtggtcaga 1680 acgaagacca gaacgtgggt atcaaagttg cactgcgtgc aatggaagct ccgctgcgtc 1740 agatcgtatt gaactgcggc gaagaaccgt ctgttgttgc taacaccgtt aaaggcggcg 1800 acggcaacta cggttacaac gcagcaaccg aagaatacgg caacatgatc gacatgggta 1860 tcctggatcc aaccaaagta actcgttctg ctctgcagta cgcagcttct gtggctggcc 1920 tgatgatcac caccgaatgc atggttaccg acctgccgaa aaacgatgca gctgacttag 1980 gcgctgctgg cggtatgggc ggcatgggtg gcatgggcgg catgatgtaa ttgccctgca 2040 cctcgcagaa ataaacaaac ccccctgtga ttttttgagg taacaagatg caagtttcag 2100 ttgaaaccac tcaaggcctt ggccgccgtg taacgattac tatcgctgct gacagcatcg 2160 agaccgctgt taaaagcgag ctggtcaacg ttgcgaaaaa agtacgtatt gacggcttcc 2220 gcaaaggcaa agtgccaatg aatatcgttg ctcagcgtta tggcgcgtct gtacgccagg 2280 acgttctggg tgacctgatg agccgtaact tcattgacgc catcattaaa gaaaaaatca 2340 atccggctgg cgcaccgact tatgttccgg gcgaatacaa gctgggtgaa gacttcactt 2400 actctgtaga gtttgaagtt tatccggaag ttgaactcga gggtctggaa gcgatcgaag 2460 ttgaaaaacc gatcgttgaa gtgaccgacg ctgacgttga cggcatgctg gatactctgc 2520 gtaaacagca ggcgacctgg aaagaaaaag acggcgctgt tgaagcagaa gaccgcgtaa 2580 ccatcgactt caccggttct gtagacggcg aagagttcga aggcggtaaa gcgtctgatt 2640 tcgtactggc gatgggccag ggtcgtatga tcccgggctt tgaagacggt atcaaaggcc 2700 acaaagctgg cgaagagttc accatcgacg tgaccttccc ggaagaatac cacgcagaaa 2760 acctgaaagg taaagcagcg aaattcgcta tcaacctgaa gaaagttgaa gagcgtgaac 2820 tgccggaact gactgcagaa ttcatcaaac gtttcggcgt tgaagatggt tccgtagaag 2880 gtctgcgcgc tgaagtgcgt aaaaacatgg agcgcgagct gaagagcgcc atccgtaacc 2940 gcgttaagtc tcaggcgatc gaaggtctgg taaaagctaa cgacatcgac gtaccggctg 3000 cgctgatcga cagcgaaatc gacgttctgc gtcgccaggc tgcacagcgt ttcggtggca 3060 acgaaaaaca agctctggaa ctgccgcgcg aactgttcga agaacaggct aaacgccgcg 3120 tagttgttgg cctgctgctg ggcgaagtta tccgcaccaa cgagctgaaa gctgacgaag 3180 agcgcgtgaa aggcctgatc gaagagatgg cttctgcgta cgaagatccg aaagaagtta 3240 tcgagttcta cagcaaaaac aaagaactga tggacaacat gcgcaatgtt gctctggaag 3300 aacaggctgt tgaagctgta ctggcgaaag cgaaagtgac tgaaaaagaa accactttca 3360 acgagctgat gaaccagcag gcgtaattta cgcagcataa cgcgctaaat tcgcacaaag 3420 gcccgtcacc gccaggtggt gggctttttt ttgtcatgaa ttttgcatgg aaccgtgcga 3480 aaagcctctt tcggtgttag cgtaacaaca aaagattgtt atgcttgaaa tatggtgatg 3540 ccgtacccat aacacaggga ctagctgata atccgtccat aaggttacaa tcggtacagc 3600 aggttttttc aattttatcc aggagacgga aatgtcatac agcggcgaac gagataactt 3660 tgcaccccat atggcgctgg tgccgatggt cattgaacag acctcacgcg gtgagcgctc 3720 ttttgatatc tattctcgtc tacttaagga acgcgtcatt tttctgactg gccaggttga 3780 agaccacatg gctaacctga ttgtggcgca gatgctgttc ctggaagcag aaaacccaga 3840 aaaagatatc tatctgtaca ttaactcccc aggcggggtg atcactgccg ggatgtctat 3900 ctatgacacc atgcagttta tcaagcctga tgtcagcacc atctgtatgg gccaggcggc 3960 ctcgatgggc gctttcttgc tgaccgcagg ggcaaaaggt aaacgttttt gcctgccgaa 4020 ttcgcgcgtg atgattcacc aaccgttggg cggctaccag ggccaggcga ccgatatcga 4080 aattcatgcc cgtgaaattc tgaaagttaa agggcgcatg aatgaactta tggcgcttca 4140 tacgggtcaa tcattagaac agattgaacg tgataccgag cgcgatcgct tcctttccgc 4200 ccctgaagcg gtggaatacg gtctggtcga ttcgattctg acccatcgta attgatgcca 4260 gaggcgcaac tgtgccgcta tacttatcca gggcggcaca acgctgtaag cgcttgcgcc 4320 tgagaatggc atttgcgtcg tcgtgtgcgg cacaaagaac aaagaagagg ttttgaccca 4380 tgacagataa acgcaaagat ggctcaggca aattgctgta ttgctctttt tgcggcaaaa 4440 gccagcatga agtgcgcaag ctgattgccg gtccatccgt gtatatctgc gacgaatgtg 4500 ttgatttatg taacgacatc attcg 4525
【図１】図１は、ｐＴｆ１３（約５．９ｋｂ）の概略構
成図を示す。図中、ａｒａＢｐ／ｏはａｒａＢプロモー
ター／オペレーター、ｔｉｇはトリガーファクターの構
造遺伝子、ｐＡＣＹＣ ｏｒｉはｐＡＣＹＣ系プラスミ
ドの複製開始起点、Ｃｍｒはクロラムフェニコール耐性
遺伝子、ａｒａＣはａｒａＣアクチベーター／リプレッ
サーをそれぞれ示す。
成図を示す。図中、ａｒａＢｐ／ｏはａｒａＢプロモー
ター／オペレーター、ｔｉｇはトリガーファクターの構
造遺伝子、ｐＡＣＹＣ ｏｒｉはｐＡＣＹＣ系プラスミ
ドの複製開始起点、Ｃｍｒはクロラムフェニコール耐性
遺伝子、ａｒａＣはａｒａＣアクチベーター／リプレッ
サーをそれぞれ示す。
【図２】図２は、ｐＧ−Ｔｆ１（約８．４ｋｂ）の概略
構成図を示す。図中、Ｐｚｔ−１ｐはＰｚｔ−１プロモ
ーター、ｇｒｏＥＳおよびｇｒｏＥＬはＧｒｏＥＳおよ
びＧｒｏＥＬをコードする遺伝子、ｔｉｇはトリガーフ
ァクターの構造遺伝子、ｔｅｔＲはｔｅｔＲリプレッサ
ー、Ｃｍｒはクロラムフェニコール耐性遺伝子、ｐＡＣ
ＹＣ ｏｒｉはｐＡＣＹＣ系プラスミドの複製開始起点
をそれぞれ示す。
構成図を示す。図中、Ｐｚｔ−１ｐはＰｚｔ−１プロモ
ーター、ｇｒｏＥＳおよびｇｒｏＥＬはＧｒｏＥＳおよ
びＧｒｏＥＬをコードする遺伝子、ｔｉｇはトリガーフ
ァクターの構造遺伝子、ｔｅｔＲはｔｅｔＲリプレッサ
ー、Ｃｍｒはクロラムフェニコール耐性遺伝子、ｐＡＣ
ＹＣ ｏｒｉはｐＡＣＹＣ系プラスミドの複製開始起点
をそれぞれ示す。
【図３】図３は、共発現によるマウスエンドスタチンの
可溶化の結果を示す図である。図中、Ｓは可溶性画分、
Ｉは不溶性画分を示す。
可溶化の結果を示す図である。図中、Ｓは可溶性画分、
Ｉは不溶性画分を示す。
【図４】図４は、共発現によるヒトＯＲＰ１５０の可溶
化の結果を示す図である。図中、Ｓは可溶性画分、Ｉは
不溶性画分を示す。
化の結果を示す図である。図中、Ｓは可溶性画分、Ｉは
不溶性画分を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） (Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 CA04 DA06 EA04 HA06 4B064 AG01 CA02 CA19 CC24 DA03 DA13 4B065 AA26X AA91Y AA93Y AB01 AC14 BA02 CA24 CA44 CA46
Claims (15)
- 【請求項１】 トリガーファクター、ＧｒｏＥＬおよび
ＧｒｏＥＳのそれぞれをコードする遺伝子を含有してな
る人工オペロン。 - 【請求項２】 さらに誘導可能なプロモーターを含有し
てなる請求項１記載の人工オペロン。 - 【請求項３】 誘導可能なプロモーターがｌａｃ、ｔｒ
ｐ、ａｒａおよびＰｚｔ−１からなる群より選ばれた請
求項２記載の人工オペロン。 - 【請求項４】 請求項１〜３いずれか記載の人工オペロ
ンを保持する、トリガーファクター、ＧｒｏＥＬおよび
ＧｒｏＥＳのそれぞれを発現しうるプラスミド。 - 【請求項５】 誘導可能なプロモーター制御下にトリガ
ーファクターをコードする遺伝子を保持する、トリガー
ファクターを発現しうるプラスミド。 - 【請求項６】 誘導可能なプロモーターがｌａｃ、ｔｒ
ｐ、ａｒａおよびＰｚｔ−１からなる群より選ばれた請
求項５記載のプラスミド。 - 【請求項７】 請求項４〜６いずれか記載のプラスミド
と外来タンパク質用の発現プラスミドとを保持する共形
質転換体。 - 【請求項８】 大腸菌のプロテアーゼ変異株を用いて得
られる請求項７記載の共形質転換体。 - 【請求項９】 プロテアーゼ変異株がｌｏｎおよびｃｌ
ｐＰＸ二重変異株、またはｌｏｎ、ｃｌｐＰＸおよびｈ
ｓｌＶ／Ｕ三重変異株である、請求項８記載の共形質転
換体。 - 【請求項１０】 大腸菌のｐｌｓＸ変異株を用いて得ら
れる、請求項７記載の共形質転換体。 - 【請求項１１】 大腸菌のｒｐｏＨ変異株を用いて得ら
れる、請求項７記載の共形質転換体。 - 【請求項１２】 ｒｐｏＨ変異株がｒｐｏＨ欠失変異株
である、請求項１１記載の共形質転換体。 - 【請求項１３】 外来タンパク質が、インターフェロ
ン、インターロイキン、インターロイキン受容体、イン
ターロイキン受容体拮抗物質、顆粒球コロニー刺激因
子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、マクロフ
ァージコロニー刺激因子、エリスロポエチン、トロンボ
ポエチン、白血病抑制因子、幹細胞成長因子、腫瘍壊死
因子、成長ホルモン、プロインスリン、インスリン様成
長因子、繊維芽細胞成長因子、血小板由来成長因子、ト
ランスフォーミング成長因子、肝細胞成長因子、骨形成
因子、神経成長因子、毛様体神経栄養因子、脳由来神経
栄養因子、グリア細胞由来神経栄養因子、ニューロトロ
フィン、血管新生阻害因子、プロウロキナーゼ、組織プ
ラスミノーゲンアクチベーター、血液凝固因子、プロテ
インＣ、グルコセレブロシダーゼ、スーパーオキシドデ
ィスムターゼ、レニン、リゾチーム、Ｐ４５０、プロキ
モシン、トリプシンインヒビター、エラスターゼインヒ
ビター、リポコルチン、レプチン、免疫グロブリン、単
鎖抗体、補体成分、血清アルブミン、スギ花粉抗原、低
酸素誘導性ストレスタンパク質、プロテインキナーゼ、
プロトオンコジーン産物、転写調節因子およびウイルス
構成タンパク質からなる群より選択された、請求項７〜
１２いずれか記載の共形質転換体。 - 【請求項１４】 請求項７〜１３いずれか記載の共形質
転換体を用いることを特徴とする、外来タンパク質の製
造方法。 - 【請求項１５】 トリガーファクターの発現量、または
トリガーファクター、ＧｒｏＥＬおよびＧｒｏＥＳのそ
れぞれの発現量が外来タンパク質の可溶化に適した量と
なる誘導条件下に共形質転換体の培養を行なう、請求項
１４記載の製造方法。
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|---|---|---|---|
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| DE69932697T DE69932697T2 (de) | 1998-12-28 | 1999-12-28 | Plasmide, welche die Trigger-Faktoren Gene GroEL oder GroES exprimieren |
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| JP2002335959A (ja) * | 2001-04-30 | 2002-11-26 | F Hoffmann La Roche Ag | フォールディング補助タンパク質の共発現を伴うｉｎｖｉｔｒｏ翻訳系でのタンパク質の発現方法 |
| JP2003500056A (ja) * | 1999-05-21 | 2003-01-07 | ロシュ ダイアグノスティックス ゲーエムベーハー | 分子シャペロンを用いるタンパク質コンホメーションの調節方法 |
| JP2005278637A (ja) * | 2004-03-04 | 2005-10-13 | Marine Biotechnol Inst Co Ltd | シトクロムｐ４５０モノオキシゲナーゼの生産方法 |
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|---|---|---|---|---|
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