JP2022518200A - 非抗生物質選択マーカーとしてのβ－ガラクトシダーゼαペプチド及びその使用 - Google Patents
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Abstract
核酸コンストラクトを選択可能マーカーとして使用する方法が本明細書に提供される。核酸コンストラクトは、プロモータに操作可能に連結されたβ－ガラクトシダーゼのアミノ末端フラグメントをコードする核酸配列を含む、単離されたβ－ガラクトシダーゼ発現カセットを含む。また、β－ガラクトシダーゼ発現カセットを含む単離されたベクター、単離されたベクターを生成する方法、及び単離されたベクターを含むキットも提供される。
Description
本発明は、非抗生物質選択マーカーを含む単離されたβ－ガラクトシダーゼ発現カセットに関する。具体的には、単離されたβ－ガラクトシダーゼ発現カセットは、プロモータに操作可能に連結されたβ－ガラクトシダーゼのアミノ末端フラグメントを含む。また、β－ガラクトシダーゼ発現カセットを含む単離されたベクター、単離されたベクターを産生する方法、及び単離されたベクターを含むキットも提供される。
（電子的に提出された配列表の参照）
本出願は、ファイル名「ＪＢＩ６０３１ＵＳＰＳＰ１Ｓｅｑｌｉｓｔ１」及び２０１９年１月１７日の作成日で、４８ｋｂのサイズを有するＡＳＣＩＩ形式の配列表としてＥＦＳ－Ｗｅｂを介して電子的に提出される、配列表を含有する。ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して提出された配列表は、本明細書の一部であり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、ファイル名「ＪＢＩ６０３１ＵＳＰＳＰ１Ｓｅｑｌｉｓｔ１」及び２０１９年１月１７日の作成日で、４８ｋｂのサイズを有するＡＳＣＩＩ形式の配列表としてＥＦＳ－Ｗｅｂを介して電子的に提出される、配列表を含有する。ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して提出された配列表は、本明細書の一部であり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
プラスミドベクターは、通常、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現される遺伝子を含有し、プラスミドが形質転換又はエレクトロポレーションによって細胞に導入されるとき、プラスミドを含有しないものからプラスミドを含有する細胞を同定又は選択する方法を提供する。最も一般的に使用される選択可能マーカーは、抗生物質に対する耐性を付与する遺伝子である。しかしながら、抗生物質耐性遺伝子が望ましくないいくつかの状況が存在する。プラスミドを使用して、抗体などの生物製剤の製造細胞株を作製する場合、抗生物質耐性遺伝子は、通常、除去又は破壊される。遺伝子療法では、抗生物質耐性遺伝子も望ましくない。カナマイシン／ネオマイシン耐性遺伝子は、しばしばＦＤＡにより容認されるが、ＥＵ規制機関ははるかに厳格である。欧州薬局方は、「別段正当化され、認可されない限り、特に臨床的に有用な抗生物質に関して選択可能遺伝子マーカーとして使用される抗生物質耐性遺伝子は、ベクターコンストラクトに含まれない。組み換えプラスミドの他の選択技術が好ましい」と述べている（「Ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｍｅｄｉｃａｌ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ ｕｓｅ．」Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉ ７．０（２０１１））。細胞株の開発に少量のプラスミドを必要とする場合、抗生物質選択マーカーの破壊が可能であり得るが、これらの技術は、より多くのプラスミドを製造する必要がある遺伝子療法用途には実用的ではない。
複製起点及び選択マーカーが合わせて１ｋｂ未満のサイズであるプラスミドベクターが、インビボでの遺伝子サイレンシングを回避するためのプラスミドに基づく遺伝子療法の開発に必要である。プラスミド骨格は、３ｋｂ又は４ｋｂ以上のプラスミド骨格を有する従来のプラスミドと比較して、１ｋｂ以下である場合、マウスにおいて、より長くかつより高いレベルで発現した（Ｌｕ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２０（１１）：２１１１－９（２０１２））。インビボで発現されなかったＤＮＡの大きなブロックがサイレンシングを誘導したと提案された。したがって、より小さいプラスミド骨格を有するプラスミドがはるかに有効であり得る。
より小さいプラスミドはまた、一過性トランスフェクションが治療薬を製造するために使用される用途にも必要とされる。一例は、プラスミドの大規模なトランスフェクションが臨床材料を生成するために使用される、アデノ随伴ウイルスベクターの産生である。より小さいプラスミドは、トランスフェクトされなければならないＤＮＡの量を低減し、コストを低減する。
したがって、遺伝子療法用途に使用することができる選択可能マーカーを含むより小さいプラスミドを生成する必要性が存在する。
一般的な一態様では、選択可能マーカーとして核酸コンストラクトを使用する方法が提供される。本方法は、（ａ）ｌａｃオペロンに欠失を含む宿主細胞を核酸コンストラクトと接触させることであって、核酸コンストラクトが、プロモータに操作可能に連結されたβ－ガラクトシダーゼのアミノ末端フラグメントをコードする核酸配列を含む、単離されたβ－ガラクトシダーゼ発現カセットを含む、接触させること、及び（ｂ）核酸コンストラクトが宿主細胞内に維持される条件下で、宿主細胞を成長させることを含む。
別の一般的な態様では、単離されたβ－ガラクトシダーゼ発現カセットが提供される。単離されたカセットは、プロモータに操作可能に連結されたβ－ガラクトシダーゼのアミノ末端フラグメントをコードする核酸配列を含む。
ある特定の実施形態では、β－ガラクトシダーゼのアミノ末端フラグメントは、配列番号１と少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、β－ガラクトシダーゼのアミノ末端フラグメントは、配列番号１のアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態では、核酸配列は、複製起点を更に含む。複製起点は、例えば、高コピー複製起点であり得る。ある特定の実施形態では、高コピー複製起点は、ｐＵＣ５７複製起点である。ある特定の実施形態では、ｐＵＣ５７複製起点は、配列番号１９の核酸配列を含む。
ある特定の実施形態では、単離されたβ－ガラクトシダーゼ発現カセットは、二量体分解エレメントを更に含む。二量体分解エレメントは、例えば、部位特異的リコンビナーゼ認識部位を含む核酸配列を含み得る。二量体分解エレメントは、部位特異的リコンビナーゼをコードする核酸配列を更に含み得る。ある特定の実施形態では、宿主細胞は、部位特異的リコンビナーゼをコードする核酸配列を含む。二量体分解エレメントは、例えば、ＣｏｌＥ１二量体分解エレメントであり得る。ある特定の実施形態では、ＣｏｌＥ１二量体分解エレメントは、配列番号２０の核酸配列を含む。
また、本発明の単離されたβ－ガラクトシダーゼ発現カセットを含む単離されたベクターも提供される。ある特定の実施形態では、単離されたベクターは、約１．５キロベース未満のサイズである。ある特定の実施形態では、単離されたベクターは、配列番号９～１３、１７、及び１８からなる群から選択される核酸配列を含む。
また、本発明の単離されたベクターを生成する方法も提供される。本方法は、（ａ）宿主細胞を単離されたベクターと接触させること、（ｂ）ベクターを産生する条件下で宿主細胞を成長させること、及び（ｃ）宿主細胞からベクターを単離することを含む。
ある特定の実施形態では、宿主細胞を最少培地で成長させる。最少培地は、唯一の炭素源としてラクトースを含み得る。ある特定の実施形態では、最少培地は、容積あたり約１重量％～約４重量％（ｗ／ｖ）のラクトースを含む。ある特定の実施形態では、最少培地は、約２％ｗ／ｖのラクトースを含む。
また、（ａ）本発明の単離されたβ－ガラクトシダーゼ発現カセット、及び（ｂ）ｌａｃオペロンに欠失を含む宿主細胞を含む、キットも提供される。ある特定の実施形態では、キットは、唯一の炭素源としてラクトースを含む最少培地を更に含む。ある特定の実施形態では、ベクターは、単離されたβ－ガラクトシダーゼ発現カセットを含む。ある特定の実施形態では、宿主細胞は、ＬａｃＺΔＭ１５欠失を含む。ある特定の実施形態では、宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞及び酵母宿主細胞からなる群から選択される。
上記の概要、及び本出願の好ましい実施形態の以下の詳細な説明は、添付の図面と併せて読むことでより良く理解されるであろう。しかしながら、本出願は、図面に示される実施形態そのものに限定されないことを理解するべきである。
Ｐ２１５プラスミドの概略図を示す。
Ｐ２１６プラスミドの概略図を示す。
Ｐ２１７プラスミドの概略図を示す。
Ｐ２１８プラスミドの概略図を示す。
Ｐ２１９プラスミドの概略図を示す。
Ｐ４６９－２プラスミドの概略図を示す。
様々な刊行物、論文、及び特許を、背景技術において、及び本明細書全体を通じて引用又は記載する。これら参照文献の各々はその全容が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に含まれる文書、操作、材料、デバイス、物品などの考察は、本発明のコンテキストを与えるためのものである。かかる考察は、これらの事物のいずれか又は全てが、開示又は特許請求されるいかなる発明に対しても先行技術の一部を構成することを認めるものではない。
特に規定のない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般的に理解されるのと同じ意味を有する。そうでない場合、本明細書で使用される特定の用語は、本明細書に記載される意味を有するものである。
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用するとき、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、特に文脈上明らかでない限り、複数の指示対象物を含むことに留意する必要がある。
特に明記しない限り、本明細書に記載される濃度又は濃度範囲などのあらゆる数値は、全ての場合において、「約」という用語によって修飾されているものとして理解されるべきである。したがって、数値は、典型的には、記載される値の±１０％を含む。例えば、１ｍｇ／ｍＬの濃度は０．９ｍｇ／ｍＬ～１．１ｍｇ／ｍＬを含む。同様に、１％～１０％（ｗ／ｖ）の濃度範囲は０．９％（ｗ／ｖ）～１１％（ｗ／ｖ）を含む。本明細書で使用するとき、数値範囲の使用は、文脈上そうでない旨が明確に示されない限り、その範囲内の整数及び値の分数を含む、全ての可能な部分範囲、その範囲内の全ての個々の数値を明示的に含む。
別途記載のない限り、一連の要素に先行する「少なくとも」という用語は、一連の全ての要素を指すと理解されるべきである。当業者であれば、単なる通常の実験手順を使用するだけで、本明細書に記載した本発明の特定の実施形態に対して多くの同等物を認識するか、又は確認することができよう。このような等価物は、本発明によって包含されることが意図される。
本明細書で使用するとき、用語「備える（comprises）、「備える（comprising）」、「含む（includes）」、「含む（including）」、「有する（has）」、「有する（having）」、「含有する（contains）」、又は「含有する（containing）」あるいはこれらの任意の他の変形形態は、述べられている整数又は整数群を含むことが意図されるが、これら以外の他の整数又は整数群を除外するものではなく、非排他的又は非制限的であることが意図されることが理解されよう。例えば、一連の要素を含む組成物、混合物、プロセス、方法、物品、又は装置は、必ずしもそれらの要素のみに限定されるものではなく、明示的に列挙されない、又はそのような組成物、混合物、プロセス、方法、物品、又は装置に本来存在しない他の要素を含んでもよい。更に、明示的に反対に明記されない限り、「又は」は包括的な「又は」を指すものであり、排他的な「又は」を指すものではない。例えば、条件Ａ又はＢは、Ａが真であり（又は存在する）かつＢが偽である（又は存在しない）場合、Ａが偽であり（又は存在しない）かつＢが真である（又は存在する）場合、並びにＡ及びＢの両方が真である（又は存在する）場合、のいずれか１つによって充足される。
本明細書で使用するとき、複数の列挙された要素間の接続的な用語「及び／又は」は、個々の及び組み合わされた選択肢の両方を包含するものとして理解される。例えば、２つの要素が「及び／又は」によって接続される場合、第１の選択肢は、第２の要素なしに第１の要素が適用可能であることを指す。第２の選択肢は、第１の要素なしに第２の要素が適用可能であることを指す。第３の選択肢は、第１及び第２の要素が一緒に適用可能であることを指す。これらの選択肢のうちのいずれか１つは、意味に含まれ、したがって、本明細書で使用するとき、用語「及び／又は」の要件を満たすことが理解される。選択肢のうちの２つ以上の同時適用性もまた、意味に含まれ、したがって、用語「及び／又は」の要件を満たすことが理解される。
本明細書で使用するとき、用語「からなる（consists of）」又は「からなる（consist of）」若しくは「からなる（consisting of）」などの変形は、明細書及び特許請求の範囲全体にわたって使用するとき、任意の列挙された整数又は整数群を包含するが、追加の整数又は整数群が、指定の方法、構造、又は組成物に追加されることはないことを示す。
本明細書で使用するとき、用語「から本質的になる（consists essentially of）」又は「から本質的になる（consist essentially of）」若しくは「から本質的になる（consisting essentially of）」などの変形は、明細書及び特許請求の範囲全体にわたって使用するとき、任意の列挙された整数又は整数群を包含し、任意選択で、指定の方法、構造、又は組成物の基本的又は新規の特性を実質的に変化させない任意の列挙された整数又は整数群も包含することを示す。Ｍ．Ｐ．Ｅ．Ｐ．§ ２１１１．０３を参照されたい。
好ましい発明の構成要素の寸法又は特徴を指すときに本明細書で使用される用語「約」、「およそ」、「概ね」、「実質的に」などの用語は、当業者には理解されるように、記載の寸法／特徴が厳密な境界又はパラメータではなく、機能的に同じ又は類似する、それらからのわずかな相違を除外するものではないことを示すことも理解すべきである。最小値では、数値パラメータを含むこのような参照は、当該技術分野において受け入れられている数学的及び工業的原理（例えば、四捨五入、測定、又は他の系統的誤差、製造公差など）を使用すると、最小有効数字は変化しない変形形態を含むであろう。
「同一」又は「同一性」パーセントという用語は、２つ又は３つ以上の核酸又はポリペプチド配列（例えば、アミノ末端β－ガラクトシダーゼペプチド及びそれらをコードするポリヌクレオチド、本明細書に記載の単離されたベクターの核酸）との関連において、以下の配列比較アルゴリズムのうちの１つを使用して、又は目視検査によって測定される最大一致について比較及びアライメントされたとき、同一であるか、又は同じアミノ酸残基若しくはヌクレオチドの特定の百分率を有する２つ又は３つ以上の配列又はサブ配列を指す。
配列比較のために、典型的には、１つの配列は、試験配列が比較される参照配列として作用する。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験及び参照配列がコンピュータに入力され、必要に応じて、サブシーケンス座標が指定され、配列アルゴリズムプログラムパラメータが指定される。次いで、配列比較アルゴリズムは、指定されたプログラムパラメータに基づいて、参照配列に対する試験配列の配列同一性パーセントを計算する。
比較のための配列の最適なアライメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ ＆ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ＆Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アライメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ＆Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４（１９８８）の類似性検索方法、これらのアルゴリズムのコンピュータ化された実装（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ）、又は目視検査（全般的には、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ａ ｊｏｉｎｔ ｖｅｎｔｕｒｅ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，（１９９５ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）（Ａｕｓｕｂｅｌ）を参照）によって行うことができる。
配列同一性及び配列類似性のパーセントを決定するのに好適なアルゴリズムの例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０及びＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２にそれぞれ記載されているＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ ２．０アルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ分析を行うソフトウェアは、国立生物工学情報センター（National Center for Biotechnology Information）を通じて公的に入手可能である。このアルゴリズムは、最初に、データベース配列における同じ長さのワードとアラインメントしたときに一致するか、又はいくつかの正の値の閾値スコアＴを満たすかのいずれかの、クエリー配列における長さＷの短いワードを同定することによって、高スコア配列対（ＨＳＰ）を同定することを含む。Ｔは、隣接ワードスコア閾値（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．、上記）と称される。これらの初期隣接ワードヒットは、それを含有するより長いＨＳＰを見つけるための検索を開始するためのシードとして機能する。次いで、累積アラインメントスコアを増加させることができる限り、各配列に沿ってワードヒットを両方向に延長する。
ヌクレオチド配列については、パラメータＭ（一致する残基の対についてのリワードスコア、常に＞０）及びＮ（不一致の残基についてのペナルティスコア、常に＜０）を使用して累積スコアを計算する。アミノ酸配列については、スコアリングマトリックスを使用して累積スコアを計算する。累積アラインメントスコアがその最大獲得値から量Ｘだけ低下したとき、１つ又は２つ以上の負のスコアリング残基のアラインメントの蓄積により、累積スコアがゼロ以下になったとき、又はいずれかの配列の末端に達したときに、各方向におけるワードヒットの延長を停止する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムのパラメータＷ、Ｔ、及びＸが、アライメントの感度及び速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列について）は、デフォルトとして、ワード長（Ｗ）１１、期待値１０、Ｍ＝５、Ｎ＝－４、及び両方の鎖の比較を使用する。アミノ酸配列については、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして、ワード長（Ｗ）３、期待値（Ｅ）１０、及びＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを使用する（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ＆Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５（１９８９）を参照）。
配列同一性パーセントを計算することに加えて、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２つの配列間の類似性の統計解析も行う（例えば、Ｋａｒｌｉｎ＆Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３－５７８７（１９９３）を参照）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１つの尺度は、最小合計確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは、２つのヌクレオチド又はアミノ酸配列間の一致が偶然に生じる確率の指標を提供する。例えば、核酸は、試験核酸と参照核酸との比較における最小合計確率が、約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満である場合、参照配列に類似しているとみなされる。
２つの核酸配列又はポリペプチドが実質的に同一であることの更なる指標は、以下に記載されるように、第１の核酸によりコードされるポリペプチドが、第２の核酸によりコードされるポリペプチドと免疫学的に交差反応性であることである。したがって、ポリペプチドは、典型的には、第２のポリペプチドと実質的に同一であり、例えば、２つのペプチドは保存的置換によってのみ異なる。２つの核酸配列が実質的に同一である別の指標は、２つの分子がストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズすることである。
本明細書で使用するとき、用語「単離された」は、生物学的構成成分（例えば、核酸、ペプチド、タンパク質、又は細胞）が、これらの構成成分が天然に生じる生物の他の生物学的構成成分（すなわち、他の染色体及び染色体外ＤＮＡ及びＲＮＡ、タンパク質、細胞、並びに組織）から実質的に分離されているか、これらの構成成分とは別に産生されているか、又はこれらの構成成分から精製されているものであることを意味する。したがって、「単離された」核酸、ペプチド、タンパク質、及び細胞は、標準的な精製方法及び本明細書に記載の精製方法によって精製された核酸、ペプチド、タンパク質、及び細胞が挙げられる。「単離された」核酸、ペプチド、タンパク質、及び細胞は、組成物の一部であることができ、組成物が核酸、ペプチド、タンパク質、又は細胞の本来の環境の一部ではない場合であっても依然として単離される。また、この用語は、宿主細胞中での組み換え発現により調製された核酸、ペプチド、及びタンパク質、並びに化学合成された核酸も包含する。
本明細書で使用するとき、「ポリヌクレオチド」なる用語は、同義的に、「核酸分子」、「ヌクレオチド」、又は「核酸」とも称され、非修飾ＲＮＡ若しくはＤＮＡ又は修飾ＲＮＡ若しくはＤＮＡであってよい、任意のポリリボヌクレオチド又はポリデオキシリボヌクレオチドを指す。「ポリヌクレオチド」としては、これらに限定されるものではないが、一本鎖及び二本鎖ＤＮＡ、一本鎖及び二本鎖の領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖及び二本鎖ＲＮＡ、並びに一本鎖及び二本鎖の領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖又はより典型的には二本鎖又は一本鎖及び二本鎖の領域の混合物であってよいＤＮＡ及びＲＮＡを含むハイブリッド分子が挙げられる。加えて、「ポリヌクレオチド」は、ＲＮＡ若しくはＤＮＡ又はＲＮＡ及びＤＮＡの両方を含む三本鎖領域を指す。用語、ポリヌクレオチドには、１つ又は２つ以上の修飾塩基を含有するＤＮＡ又はＲＮＡ、及び安定性若しくは他の理由により修飾された主鎖を有するＤＮＡ又はＲＮＡも含まれる。「修飾」塩基は、例えば、トリチル化塩基及び異常な塩基、例えば、イノシンを含む。様々な修飾をＤＮＡ及びＲＮＡに行うことができる。したがって、「ポリヌクレオチド」は、典型的に天然に認められるポリヌクレオチドの化学的、酵素的又は代謝的に修飾された形態、並びにウイルス及び細胞のＤＮＡ及びＲＮＡの特徴を有する化学的形態を包含する。「ポリヌクレオチド」はまた、比較的短い核酸鎖（多くの場合、オリゴヌクレオチドと呼ばれる）も包含する。
本明細書で使用するところの「ベクター」なる用語は、別の核酸セグメントを機能的に挿入することによってそのセグメントの複製又は発現を行うことができるレプリコンのことである。
本明細書で使用するとき、用語「発現」は、遺伝子産物の生合成を指す。かかる用語には、遺伝子のＲＮＡへの転写が含まれる。また、かかる用語には、ＲＮＡの１つ又は２つ以上のポリペプチドへの翻訳も含まれ、全ての天然に生じる転写後及び翻訳後修飾も更に含まれる。発現されるＣＡＲは、宿主細胞の細胞質内、細胞培養の成長培地などの細胞外環境中に存在し得るか、又は細胞膜に固定され得る。
本明細書で使用するとき、用語「操作可能に連結された」は、構造的又は機能的関係に配置されるとき、核酸（例えば、プロモータ及びポリペプチドをコードする核酸）間の連結を指す。例えば、核酸配列の１つのセグメントは、同じ連続する核酸配列上に互いに対して配置され、コード配列の転写を促進するようにコード配列に対して配置されるプロモータ又はエンハンサなどの構造的又は機能的関係を有する場合、核酸配列の別のセグメント、翻訳を促進するようにコード配列に対して配置されるリボソーム結合部位、又は前タンパク質（例えば、コードされたポリペプチドの分泌に関与する前タンパク質）の発現を促進するように、コード配列に対して配置されるプレ配列又は分泌リーダーに操作可能に連結され得る。他の実施例では、操作可能に連結された核酸配列は連続していないが、核酸として、又はそれらによって発現されるタンパク質として互いに機能的関係を有するように配置される。エンハンサは、例えば、連続している必要はない。連結は、簡便な制限部位でライゲーションすることによって、又は合成オリゴヌクレオチドアダプター若しくはリンカーを使用することによって達成することができる。
本明細書で使用するとき、用語「プロモータ」は、メッセンジャーＲＮＡにおける遺伝子配列の転写の開始を可能にする核酸配列を指し、このような転写は、プロモータ上又はプロモータ付近のＲＮＡポリメラーゼの結合により開始される。
本明細書で使用するとき、用語「複製起点」又は「複製の起点」は、プラスミドの複製に必要な核酸配列を指す。複製起点の例としては、ｐＢＲ３２２複製起点、ＣｏｌＥ１複製起点、ｐＵＣ５７複製起点、ｐＭＢ１複製起点、ｐＳＣ１０１複製起点、及びＲ６Ｋ γ複製起点が挙げられるが、これらに限定されない。複製起点は、高コピー又は低コピーであり得る。ベクター中に存在する場合、高コピー複製起点は、細胞あたりのベクターの高コピー数（例えば、１５０～２００）をもたらすことができる。ベクター中に存在する場合、中コピー複製起点は、細胞あたりのベクターの中コピー数（例えば、２５～５０）をもたらすことができる。ベクター中に存在する場合、低コピー複製起点は、細胞あたりのベクターの低コピー数（例えば、１～３）をもたらすことができる。
本明細書で使用するとき、用語「二量体分解エレメント」は、核酸配列（例えば、ベクター又はプラスミド）の多量体の、当該配列が存在するモノマーへのインビボ変換を促進する核酸配列を指す。二量体分解エレメントは、部位特異的リコンビナーゼ標的部位（例えば、ＬｏｘＰ標的部位、ｒｆｓ標的部位、ＦＲＴ標的部位、ＲＰ４ ｒｅｓ標的部位、ＲＫ２ ｒｅｓ標的部位、及びｒｅｓ標的部位）を含む核酸配列を含み得る。二量体分解エレメントは、部位特異的リコンビナーゼ（例えば、Ｃｒｅリコンビナーゼ、ＲｅｓＤリコンビナーゼ、Ｆｌｐリコンビナーゼ、ＰａｒＡリコンビナーゼ、Ｓｉｎリコンビナーゼ、βリコンビナーゼ、γδリコンビナーゼ、ｔｎｐＲリコンビナーゼ、及びｐＳＫ４１リゾルバーゼ）をコードする核酸配列を含み得る。単離されたベクター／核酸の二量体は、二量体分解エレメント内に含まれる標的ＤＮＡ配列に作用する酵素によって分解され得る。酵素は、標的ＤＮＡ配列を組み換える。非限定的な例として、宿主細胞又は二量体分解エレメントを含むベクターのいずれかによって発現される酵素ＸｅｒＣ及びＸｅｒＤは、ＣｏｌＥ１二量体分解エレメントの標的部位を認識し、ベクター／核酸のモノマーが産生されることを確実にするために、いくつかの追加の補因子と共に機能する。
本明細書で使用するとき、用語「ペプチド」、「ポリペプチド」、又は「タンパク質」は、アミノ酸から構成される分子を指すことができ、当業者によってタンパク質として認識され得る。本明細書では、アミノ酸残基の従来の１文字又は３文字コードが使用される。用語「ペプチド」、「ポリペプチド」、及び「タンパク質」は、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指すために、本明細書において互換的に使用することができる。ポリマーは、直鎖又は分枝鎖であり得、修飾されたアミノ酸を含むことができ、非アミノ酸により中断され得る。本用語はまた、自然に修飾されているか、又は介入によって修飾されているアミノ酸ポリマーを包含する。例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、又は任意の他の操作若しくは修飾、例えば、標識構成成分とのコンジュゲート。また、定義には、例えば、アミノ酸の１つ又は２つ以上のアナログ（例えば、非天然アミノ酸などを含む）を含有するポリペプチド、並びに当該技術分野において既知の他の修飾が含まれる。
本明細書に記載のペプチド配列は、通常の慣習に従って記載され、ペプチドのＮ末端領域は左側にあり、Ｃ末端領域は右側にある。アミノ酸の異性体形態は既知であるが、別途明示的に示されない限り、示されるのはアミノ酸のＬ型である。
ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、及び使用方法
一般的な一態様では、選択可能マーカーとして核酸コンストラクトを使用する方法が提供される。本方法は、（ａ）ｌａｃオペロンに欠失を含む宿主細胞を核酸コンストラクトと接触させることであって、核酸コンストラクトが、プロモータに操作可能に連結されたβ－ガラクトシダーゼのアミノ末端フラグメントをコードする核酸配列を含む、単離されたβ－ガラクトシダーゼ発現カセットを含む、接触させること、及び（ｂ）核酸コンストラクトが宿主細胞内に維持される条件下で、宿主細胞を成長させることを含む。
一般的な一態様では、選択可能マーカーとして核酸コンストラクトを使用する方法が提供される。本方法は、（ａ）ｌａｃオペロンに欠失を含む宿主細胞を核酸コンストラクトと接触させることであって、核酸コンストラクトが、プロモータに操作可能に連結されたβ－ガラクトシダーゼのアミノ末端フラグメントをコードする核酸配列を含む、単離されたβ－ガラクトシダーゼ発現カセットを含む、接触させること、及び（ｂ）核酸コンストラクトが宿主細胞内に維持される条件下で、宿主細胞を成長させることを含む。
別の一般的な態様では、本発明は、プロモータに操作可能に連結されたβ－ガラクトシダーゼのアミノ末端フラグメントをコードする核酸配列を含む、単離されたβ－ガラクトシダーゼ発現カセットに関する。
ある特定の実施形態では、β－ガラクトシダーゼのアミノ末端フラグメントは、配列番号１と少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、β－ガラクトシダーゼのアミノ末端フラグメントは、配列番号１と少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。β－ガラクトシダーゼのアミノ末端フラグメントは、配列番号１を含み得る。
ある特定の実施形態では、核酸配列は、複製起点を更に含む。複製起点は、例えば、高コピー複製起点であり得る。ある特定の実施形態では、高コピー複製起点は、ｐＵＣ５７複製起点である。ある特定の実施形態では、ｐＵＣ５７複製起点は、配列番号１９と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有する核酸配列を含む。ある特定の実施形態では、ｐＵＣ５７複製起点は、配列番号１９の核酸配列を含む。
ある特定の実施形態では、単離されたβ－ガラクトシダーゼ発現カセットは、二量体分解エレメントを更に含み得る。二量体分解エレメントは、例えば、部位特異的リコンビナーゼ認識部位を含む核酸配列を含み得る。部位特異的リコンビナーゼ認識部位は、例えば、ＬｏｘＰ部位、ｒｆｓ部位、ＦＲＴ部位、ＲＰ４ ｒｅｓ部位、ＲＫ２ ｒｅｓ部位、及びｒｅｓ部位からなる群から選択され得る。二量体分解エレメントは、部位特異的リコンビナーゼをコードする核酸配列を更に含み得る。ある特定の実施形態では、宿主細胞は、部位特異的リコンビナーゼをコードする核酸配列を含む。部位特異的リコンビナーゼは、例えば、Ｃｒｅリコンビナーゼ、ＲｅｓＤリコンビナーゼ、Ｆｌｐリコンビナーゼ、ＰａｒＡリコンビナーゼ、Ｓｉｎリコンビナーゼ、βリコンビナーゼ、γδリコンビナーゼ、ｔｎｐＲリコンビナーゼ、及びｐＳＫ４１リゾルバーゼからなる群から選択され得る。
二量体分解エレメントは、例えば、ＣｏｌＥ１二量体分解エレメントであり得る。ＣｏｌＥ１二量体分解エレメントは、配列番号２０と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有する核酸配列を含み得る。ある特定の実施形態では、ＣｏｌＥ１二量体分解エレメントは、配列番号２０の核酸配列を含む。
ある特定の実施形態では、単離されたベクターは、本発明の単離されたβ－ガラクトシダーゼ発現カセットを含む。本開示の観点から、当業者に既知の任意のベクター、例えば、プラスミド、コスミド、人工染色体（例えば、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、及び／又はＰ１由来人工染色体（ＰＡＣ））、トランスポゾン、ファージベクター、又はウイルスベクターなどを使用することができる。いくつかの実施形態では、ベクターは、プラスミドなどの組み換え発現ベクターである。ベクターは、例えば、プロモータ、リボソーム結合エレメント、ターミネータ、エンハンサ、選択マーカー、及び複製起点という、発現ベクターの従来の機能を確立するための任意のエレメントを含むことができる。プロモータは、常時発現型、誘導型、又は再形成可能なプロモータであり得る。細胞に核酸を送達することができるいくつかの発現ベクターが当該技術分野において知られており、β－ガラクトシダーゼペプチドのアミノ末端フラグメントを産生するために、本明細書で使用することができる。従来のクローニング技術、又は人工遺伝子合成を使用して、本発明の実施形態に従った組み換え発現ベクターを生成することができる。
ある特定の態様では、単離されたベクターは、約１．５キロベース未満のサイズである。単離されたベクターは、例えば、約７００塩基対、約８００塩基対、約９００塩基対、約１０００塩基対（約１キロベース）、約１１００塩基対（約１．１キロベース）、約１２００塩基対（約１．２キロベース）、約１３００塩基対（約１．３キロベース）、約１４００塩基対（約１．４キロ塩基）、又は約１５００塩基対（約１．５キロベース）の長さであり得る。ある特定の実施形態では、単離されたベクターは、約１キロベース未満のサイズである。ある特定の実施形態では、単離されたベクターは、約９００未満の塩基対のサイズである。ある特定の実施形態では、単離されたベクターは、約８００未満の塩基対のサイズである。
ある特定の実施形態では、単離されたベクターは、配列番号９～１３、１７、及び１８からなる群から選択される核酸と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有する核酸配列を含む。ある特定の実施形態では、単離されたベクターは、配列番号９～１３、１７、及び１８からなる群から選択される核酸配列を含む。
また、本発明の単離されたベクターを生成する方法も提供される。本方法は、（ａ）宿主細胞を単離されたベクターと接触させること、（ｂ）ベクターを産生する条件下で宿主細胞を成長させること、及び（ｃ）宿主細胞からベクターを単離することを含む。
ある特定の実施形態では、宿主細胞を最少培地で成長させる。最少培地は、唯一の炭素源としてラクトースを含み得る。ある特定の実施形態では、最少培地は、容積あたり約１重量％～約４重量％（ｗ／ｖ）のラクトースを含む。ある特定の実施形態では、最少培地は、約１％～約４％ｗ／ｖ、約１％～約３％ｗ／ｖ、約１％～約２％ｗ／ｖ、約１．５％～約４％ｗ／ｖ、約１．５％～約３％ｗ／ｖ、約１．５％～約２％ｗ／ｖ、約２％～約４％ｗ／ｖ、約２％～約３％ｗ／ｖ、約２．５％～約４％ｗ／ｖ、約２．５％～約３５％ｗ／ｖ、又は約３％～約４％ｗ／ｖのラクトースを含む。ある特定の実施形態では、最少培地は、約２％ｗ／ｖのラクトースを含む。
ある特定の実施形態では、本発明は、本発明の単離されたベクターを含む宿主細胞に関する。本開示の観点から、当業者に既知の任意の宿主細胞は、本発明の単離されたベクターを含めるために使用され得る。好適な宿主細胞としては、ＬａｃＺΔＭ１５欠失を有するが、残りのラクトース生合成経路は無傷である細胞が挙げられる。バクテリオファージΦ８０の組み込み（すなわち、Φ８０ｌａｃＺΔＭ１５マーカー）との関連においてこの変異を含有する株は、完全なｌａｃオペロンとの関連においてこの変異を含有し、したがって好適な宿主である。ＬａｃＺ－α相補性プラスミドで形質転換されたときに有意なレベルのβ－ガラクトシダーゼを産生するＬａｃＺ遺伝子のアミノ末端（Ｎ末端）領域において異なる欠失を有する他の宿主もまた、好適な宿主であり得る。本発明の好適な宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞又は酵母宿主細胞を含み得る。
また、（ａ）本発明の単離されたβ－ガラクトシダーゼ発現カセット、及び（ｂ）ｌａｃオペロンに欠失を含む宿主細胞とを含む、キットも提供される。ある特定の実施形態では、ベクターは、単離されたβ－ガラクトシダーゼ発現カセットを含む。ある特定の実施形態では、宿主細胞は、ＬａｃＺΔＭ１５欠失を含む。ある特定の実施形態では、宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞又は酵母宿主細胞から選択され得る。
ある特定の実施形態では、キットは、唯一の炭素源としてラクトースを含む最少培地を更に含む。ある特定の実施形態では、最少培地は、容積あたり約１重量％～約４重量％（ｗ／ｖ）のラクトースを含む。ある特定の実施形態では、最少培地は、約１％～約４％ｗ／ｖ、約１％～約３％ｗ／ｖ、約１％～約２％ｗ／ｖ、約１．５％～約４％ｗ／ｖ、約１．５％～約３％ｗ／ｖ、約１．５％～約２％ｗ／ｖ、約２％～約４％ｗ／ｖ、約２％～約３％ｗ／ｖ、約２．５％～約４％ｗ／ｖ、約２．５％～約３５％ｗ／ｖ、又は約３％～約４％ｗ／ｖのラクトースを含む。ある特定の実施形態では、最少培地は、約２％ｗ／ｖのラクトースを含む。
実施形態
本発明は、以下の非限定的な実施形態を提供する。
実施形態１は、核酸コンストラクトを選択可能マーカーとして使用する方法であり、本方法は、
ａ．ｌａｃオペロンに欠失を含む宿主細胞を核酸コンストラクトと接触させることであって、核酸コンストラクトが、プロモータに操作可能に連結されたβ－ガラクトシダーゼのアミノ末端フラグメントをコードする核酸配列を含む、単離されたβ－ガラクトシダーゼ発現カセットを含む、接触させること、及び
ｂ．核酸コンストラクトを含有する宿主細胞のみが宿主細胞内に維持される条件下で、宿主細胞を成長させることを含む。
本発明は、以下の非限定的な実施形態を提供する。
実施形態１は、核酸コンストラクトを選択可能マーカーとして使用する方法であり、本方法は、
ａ．ｌａｃオペロンに欠失を含む宿主細胞を核酸コンストラクトと接触させることであって、核酸コンストラクトが、プロモータに操作可能に連結されたβ－ガラクトシダーゼのアミノ末端フラグメントをコードする核酸配列を含む、単離されたβ－ガラクトシダーゼ発現カセットを含む、接触させること、及び
ｂ．核酸コンストラクトを含有する宿主細胞のみが宿主細胞内に維持される条件下で、宿主細胞を成長させることを含む。
実施形態２は、β－ガラクトシダーゼのアミノ末端フラグメントが、配列番号１と少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１に記載の方法である。
実施形態３は、β－ガラクトシダーゼのアミノ末端フラグメントが、配列番号１のアミノ酸配列を含む、実施形態１又は２に記載の方法である。
実施形態４は、核酸配列が、複製起点を更に含む、実施形態１～３のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態５は、複製起点が、高コピー複製起点である、実施形態４に記載の方法である。
実施形態６は、高コピー複製起点が、ｐＵＣ５７複製起点である、実施形態５に記載の方法である。
実施形態７は、ｐＵＣ５７複製起点が、配列番号１９の核酸配列を含む、実施形態６に記載の方法である。
実施形態８は、単離されたβ－ガラクトシダーゼ発現カセットが、二量体分解エレメントを更に含む、実施形態１～７のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態９は、二量体分解エレメントが、部位特異的リコンビナーゼ認識部位を含む核酸配列を含む、実施形態８に記載の方法である。
実施形態１０は、二量体分解エレメントが、部位特異的リコンビナーゼをコードする核酸配列を更に含む、実施形態８又は９に記載の方法である。
実施形態１１は、宿主細胞が、部位特異的リコンビナーゼをコードする核酸配列を含む、実施形態８又は９に記載の方法である。
実施形態１２は、二量体分解エレメントが、ＣｏｌＥ１二量体分解エレメントである、実施形態８～１１のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態１３は、ＣｏｌＥ１二量体分解エレメントが、配列番号２０の核酸配列を含む、実施形態１２に記載の方法である。
実施形態１４は、宿主細胞がＬａｃＺΔＭ１５欠失を含む、実施形態１～１３のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態１５は、単離されたベクターが、単離されたβ－ガラクトシダーゼ発現カセットを含む、実施形態１～１４のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態１６は、単離されたベクターが、約１．５キロベース未満のサイズである、実施形態１５に記載の方法である。
実施形態１７は、単離されたベクターが、配列番号９～１３、１７、及び１８からなる群から選択される核酸配列を含む、実施形態１５又は１６に記載の方法である。
実施形態１８は、実施形態１５～１７のいずれか１つに記載の単離されたベクターを生成する方法であり、本方法は、
ａ．宿主細胞を単離されたベクターと接触させること、
ｂ．ベクターを産生する条件下で宿主細胞を成長させること、及び
ｃ．ベクターを宿主細胞から単離することを含む。
ａ．宿主細胞を単離されたベクターと接触させること、
ｂ．ベクターを産生する条件下で宿主細胞を成長させること、及び
ｃ．ベクターを宿主細胞から単離することを含む。
実施形態１９は、宿主細胞が、最少培地で成長する、実施形態１８に記載の方法である。
実施形態２０は、最少培地が、唯一の炭素源としてラクトースを含む、実施形態１９に記載の方法である。
実施形態２１は、最少培地が、容積あたり約１重量％～約４重量％（ｗ／ｖ）のラクトースを含む、実施形態２０に記載の方法である。
実施形態２２は、最少培地が、約２％ｗ／ｖのラクトースを含む、実施形態２１に記載の方法である。
実施形態２３は、プロモータに操作可能に連結されたβ－ガラクトシダーゼのアミノ末端フラグメントをコードする核酸配列を含む、単離されたβ－ガラクトシダーゼ発現カセットである。
実施形態２４は、β－ガラクトシダーゼのアミノ末端フラグメントが、配列番号１と少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態２３に記載の単離されたβ－ガラクトシダーゼ発現カセットである。
実施形態２５は、β－ガラクトシダーゼのアミノ末端フラグメントが、配列番号１のアミノ酸配列を含む、実施形態２３又は２４に記載の単離されたβ－ガラクトシダーゼ発現カセットである。
実施形態２６は、核酸配列が複製起点を更に含む、実施形態２３～２５のいずれか１つに記載の単離されたβ－ガラクトシダーゼ発現カセットである。
実施形態２７は、複製起点が高コピー複製起点である、実施形態２６に記載の単離されたβ－ガラクトシダーゼ発現カセットである。
実施形態２８は、高コピー複製起点がｐＵＣ５７複製起点である、実施形態２７に記載の単離されたβ－ガラクトシダーゼ発現カセットである。
実施形態２９は、ｐＵＣ５７複製起点が配列番号１９の核酸配列を含む、実施形態２８に記載の単離されたβ－ガラクトシダーゼ発現カセットである。
実施形態３０は、単離されたβ－ガラクトシダーゼ発現カセットが、二量体分解エレメントを更に含む、実施形態２３～２９のいずれか１つに記載の単離されたβ－ガラクトシダーゼ発現カセットである。
実施形態３１は、二量体分解エレメントが、部位特異的リコンビナーゼ認識部位を含む核酸配列を含む、実施形態３０に記載の単離されたβ－ガラクトシダーゼ発現カセットである。
実施形態３２は、二量体分解エレメントが、部位特異的リコンビナーゼをコードする核酸配列を更に含む、実施形態３０又は３１に記載の単離されたβ－ガラクトシダーゼ発現カセットである。
実施形態３３は、二量体分解エレメントがＣｏｌＥ１二量体分解エレメントである、実施形態３０～３２のいずれか１つに記載の単離されたβ－ガラクトシダーゼ発現カセットである。
実施形態３４は、ＣｏｌＥ１二量体分解エレメントが、配列番号２０の核酸配列を含む、実施形態３３に記載の単離されたβ－ガラクトシダーゼ発現カセットである。
実施形態３５は、実施形態２３～３４のいずれか１つに記載の単離されたβ－ガラクトシダーゼ発現カセットを含む単離されたベクターである。
実施形態３６は、単離されたベクターが、約１．５キロベース未満のサイズである、実施形態３５に記載の単離されたベクターである。
実施形態３７は、単離されたベクターが、配列番号９～１３、１７、及び１８からなる群から選択される核酸配列を含む、実施形態３５又は３６に記載の単離されたベクターである。
実施形態３８は、
ａ．実施形態２３～３７のいずれか１つに記載の単離されたβ－ガラクトシダーゼ発現カセット、及び
ｂ．Ｌａｃオペロンに欠失を含む宿主細胞を含む、キットである。
ａ．実施形態２３～３７のいずれか１つに記載の単離されたβ－ガラクトシダーゼ発現カセット、及び
ｂ．Ｌａｃオペロンに欠失を含む宿主細胞を含む、キットである。
実施形態３９は、唯一の炭素源としてラクトースを含む最少培地を更に含む、実施形態３８に記載のキットである。
実施形態４０は、ベクターが単離されたβ－ガラクトシダーゼ発現カセットを含む、実施形態３８又は３９に記載のキットである。
実施形態４１は、宿主細胞がＬａｃＺΔＭ１５欠失を含む、実施形態３８～４０のいずれか１つに記載のキットである。
実施形態４２は、宿主細胞が、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞及び酵母宿主細胞からなる群から選択される、実施形態４１に記載のキットである。
実施例１：ＴＯＰ１０細胞において抗生物質選択の代わりにβ－ガラクトシダーゼのα相補性を介したプラスミド選択
材料
細胞：Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ Ｔｏｐ１０コンピテント細胞（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ；Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ、カタログ番号Ｃ４０４００３）。ＮＥＢ ５－α（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ、カタログ番号（Ｃ２９８７）。ＧＴ１１５（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ、カタログ番号ＧＴ１１５－２１）。ＮＥＢ Ｓｔａｂｌｅ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、カタログ番号Ｃ３０４０Ｈ）。Ｓｔｅｌｌａｒ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ ＵＳＡ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ、カタログ番号６３６７６６）。ＤＨ１０Ｂ（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ、カタログ番号１８２９７０１０）。Ｓｔｂｌ３（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ、カタログ番号Ｃ７３７３０３）。Ｘｌｉ－ｂｌｕｅ（Ａｇｉｌｅｎｔ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ、カタログ番号２００２３６）。
プラスミド：ｐＵＣ１９（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号ＳＤ００６１）；ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ．ＫＳ（－）（Ａｇｉｌｅｎｔ；Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ、カタログ番号２１２２０８）。クローンＰ２１５（配列番号９）及びＰ２１６（配列番号１０）。ＧＷＩＺ－ルシフェラーゼ（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ；Ｐ０３０２００）；Ｐ２１９（配列番号１３、図５）。Ｐ４６９－２（配列番号１７、図６）。
培地：Ｍ９＋ラクトース培地（Ｔｅｋｎｏｖａ，Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ ＣＡ、カタログ番号Ｍ１３４８－０４（プレート））：０．３％ ＫＨ２ＰＯ４、０．６％ Ｎａ２ＨＰＯ４、０．５％（８５ｍＭ）ＮａＣｌ、０．１％ ＮＨ４Ｃｌ、２ｍＭ ＭｇＳＯ４、５０ｍｇ／リットルのＬ－ロイシン、５０ｍｇ／Ｌのイソロイシン；１ｍＭチアミン、２％ラクトース、及び１．５％寒天。
Ｍ９＋グルコース培地（Ｔｅｋｎｏｖａ Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ ＣＡ、カタログ番号Ｍ１３４６－０４（プレート））：０．３％ ＫＨ２ＰＯ４、０．６％ Ｎａ２ＨＰＯ４、０．５％（８５ｍＭ）ＮａＣｌ、０．１％ ＮＨ４Ｃｌ、２ｍＭ ＭｇＳＯ４、５０ｍｇ／リットルのＬ－ロイシン、５０ｍｇ／リットルのイソロイシン、１ｍＭチアミン、１％グルコース、及び１．５％寒天。ＬＢ－カルベニシリン（１００）プレート（Ｔｅｋｎｏｖａ，Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ ＣＡ、カタログ番号Ｌ１０１０）。ＬＢプレート（Ｔｅｋｎｏｖａ Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ ＣＡ Ｌ１１００）。ＬＢ＋６０μｇ／ｍＬのＸ－Ｇａｌ、０．１ｍＭ ＩＰＴＧ（Ｔｅｋｎｏｖａ Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ ＣＡ Ｌ１９２０）。ＳＯＣ媒体（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ １５５４４０３４）。ＬＢブロス（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ １０８５５０２１）；
Ｄ－ＰＢＳ、ｐＨ７．１、Ｍｇ２＋なし、Ｃａ２＋なし（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ １４２００－０７５）
材料
細胞：Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ Ｔｏｐ１０コンピテント細胞（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ；Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ、カタログ番号Ｃ４０４００３）。ＮＥＢ ５－α（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ、カタログ番号（Ｃ２９８７）。ＧＴ１１５（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ、カタログ番号ＧＴ１１５－２１）。ＮＥＢ Ｓｔａｂｌｅ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、カタログ番号Ｃ３０４０Ｈ）。Ｓｔｅｌｌａｒ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ ＵＳＡ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ、カタログ番号６３６７６６）。ＤＨ１０Ｂ（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ、カタログ番号１８２９７０１０）。Ｓｔｂｌ３（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ、カタログ番号Ｃ７３７３０３）。Ｘｌｉ－ｂｌｕｅ（Ａｇｉｌｅｎｔ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ、カタログ番号２００２３６）。
プラスミド：ｐＵＣ１９（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号ＳＤ００６１）；ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ．ＫＳ（－）（Ａｇｉｌｅｎｔ；Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ、カタログ番号２１２２０８）。クローンＰ２１５（配列番号９）及びＰ２１６（配列番号１０）。ＧＷＩＺ－ルシフェラーゼ（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ；Ｐ０３０２００）；Ｐ２１９（配列番号１３、図５）。Ｐ４６９－２（配列番号１７、図６）。
培地：Ｍ９＋ラクトース培地（Ｔｅｋｎｏｖａ，Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ ＣＡ、カタログ番号Ｍ１３４８－０４（プレート））：０．３％ ＫＨ２ＰＯ４、０．６％ Ｎａ２ＨＰＯ４、０．５％（８５ｍＭ）ＮａＣｌ、０．１％ ＮＨ４Ｃｌ、２ｍＭ ＭｇＳＯ４、５０ｍｇ／リットルのＬ－ロイシン、５０ｍｇ／Ｌのイソロイシン；１ｍＭチアミン、２％ラクトース、及び１．５％寒天。
Ｍ９＋グルコース培地（Ｔｅｋｎｏｖａ Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ ＣＡ、カタログ番号Ｍ１３４６－０４（プレート））：０．３％ ＫＨ２ＰＯ４、０．６％ Ｎａ２ＨＰＯ４、０．５％（８５ｍＭ）ＮａＣｌ、０．１％ ＮＨ４Ｃｌ、２ｍＭ ＭｇＳＯ４、５０ｍｇ／リットルのＬ－ロイシン、５０ｍｇ／リットルのイソロイシン、１ｍＭチアミン、１％グルコース、及び１．５％寒天。ＬＢ－カルベニシリン（１００）プレート（Ｔｅｋｎｏｖａ，Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ ＣＡ、カタログ番号Ｌ１０１０）。ＬＢプレート（Ｔｅｋｎｏｖａ Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ ＣＡ Ｌ１１００）。ＬＢ＋６０μｇ／ｍＬのＸ－Ｇａｌ、０．１ｍＭ ＩＰＴＧ（Ｔｅｋｎｏｖａ Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ ＣＡ Ｌ１９２０）。ＳＯＣ媒体（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ １５５４４０３４）。ＬＢブロス（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ １０８５５０２１）；
Ｄ－ＰＢＳ、ｐＨ７．１、Ｍｇ２＋なし、Ｃａ２＋なし（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ １４２００－０７５）
結果
抗生物質選択マーカーを含まないプラスミドは、遺伝子療法用途及び治療用製品の細胞株の開発に望ましい。１ｋｂ以下のプラスミド骨格は、インビボで動物に送達されたときに遺伝子サイレンシングを回避するのに有用であったことも報告されている。これらの実験の目的は、Ｅ．ｃｏｌｉ中のプラスミド含有細胞を選択するための、小さい代謝選択マーカーを開発するための新しい戦略を探索することであった。
抗生物質選択マーカーを含まないプラスミドは、遺伝子療法用途及び治療用製品の細胞株の開発に望ましい。１ｋｂ以下のプラスミド骨格は、インビボで動物に送達されたときに遺伝子サイレンシングを回避するのに有用であったことも報告されている。これらの実験の目的は、Ｅ．ｃｏｌｉ中のプラスミド含有細胞を選択するための、小さい代謝選択マーカーを開発するための新しい戦略を探索することであった。
β－ガラクトシダーゼのαペプチドを発現するプラスミドは、ＴＯＰ１０細胞におけるＬａｃＺΔ１５対立遺伝子を補完し、ラクトースオペロンを完成させ、ラクトースを唯一の炭素源として最少培地で細胞を成長させることができると仮定された。
プラスミドｐＵＣ１９及びｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩは両方ともβ－ガラクトシダーゼαペプチド融合タンパク質を発現する。これらのプラスミドは、Ｔｏｐ１０宿主株におけるｌａｃ変異を補完することができ、最少培地での成長を可能にしたかどうかを試験した。
ｐＵＣ１９及び／又はｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩが、ＴＯＰ１０細胞におけるＬａｃＺΔ１５変異を補完することが可能であったかどうかを試験するために、これらのプラスミドを、以下の手順を使用して細胞に形質転換した。
２つの形質転換混合物を次のように減菌微小遠心管中で調製した。１）１μＬ（１００ｐｇ）のｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩプラスミド＋５０μＬのＯｎｅ Ｓｈｏｔ ＴＯＰ１０細胞。２）１μＬ（１０ｐｇ）のｐＵＣ１９プラスミド＋５０μＬのＯｎｅ Ｓｈｏｔ ＴＯＰ１０細胞。形質転換混合物を氷上で３０分間インキュベートした後、４２℃で３０秒間熱ショックを与えた。熱ショック後、形質転換混合物を氷上で１分間インキュベートした。形質転換混合物に、４５０μＬのＳＯＣ培地を加え、細胞を３７℃で１時間振盪させながらインキュベートした。細胞を含有する形質転換混合物を遠心分離し、細胞を５００μＬの減菌Ｄ－ＰＢＳ緩衝液中に再懸濁した。細胞を遠心分離し、更に２回再懸濁した。各試料について、細胞の２つの１：１０連続希釈物をＤ－ＰＢＳで作製した。２００μＬの各希釈液を、Ｍ９＋ラクトースプレート上に広げた。２００μＬの第１の２つの希釈液も、ＬＢ－カルベニシリン（１００）プレート上に広げた。プレートを３７℃で一晩インキュベートした。
一晩インキュベートした後、ＬＢ－カルベニシリン（１００）プレート上にプレーティングされた両方の形質転換物からのコロニーが多く存在し、これらのプレートを４℃で保管した。Ｍ９＋ラクトースプレート上にプレーティングされた形質転換物のいずれかからの目に見えるコロニーは存在せず、これらのプレートを３７℃で更に２４時間インキュベートした。Ｍ９－ラクトースプレート上にコロニーは見えなかった。細胞を３０℃で更に４８時間培養した。これらのプレート上には、長時間インキュベートした後でもコロニーは見えなかった。
ＬａｃＺ－α融合ペプチドを発現するクローニングベクターのいずれも、ＴＯＰ１０宿主株におけるＬａｃ変異を補完せず、唯一の炭素源としてラクトースを含有する最少培地での成長は可能ではなかった。
ｐＵＣ１９及びｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩクローニングベクターによるＬａｃＺ－αペプチド融合タンパク質の発現は、試験した宿主株におけるｌａｃ変異を適切に補完するのに十分な高さではなかった可能性があった。両方のベクターは、マルチクローニング領域を通して転写される融合タンパク質を産生し、このような融合タンパク質は、ＬａｃＺΔ１５変異を補完するために準最適であり得る。
実施例２：Ｅ．ｃｏｌｉにおいて代謝選択マーカーとして使用されるＬａｃＺ発現プラスミド。
培地及び強力なプロモータ（それぞれＬａｃＺＹＡ及びＯｍｐＦ）を有する２つのＬａｃＺ－α発現カセットを設計した。ＯｍｐＦプロモータ配列は、Ｓｔａｖｒｏｐｏｕｌｏｓら（Ｓｔａｖｒｏｐｏｕｌｏｓ ａｎｄ Ｓｔｒａｔｈｄｅｅ，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ７２（１）：９９－１０４（２００１））によって使用されたＯｍｐＦプロモータに基づくものであった。ＬａｃＺＹＡプロモータは、ｌａｃリプレッサーによって結合されたｌａｃオペレータ配列と共に、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔの配列に由来した。
培地及び強力なプロモータ（それぞれＬａｃＺＹＡ及びＯｍｐＦ）を有する２つのＬａｃＺ－α発現カセットを設計した。ＯｍｐＦプロモータ配列は、Ｓｔａｖｒｏｐｏｕｌｏｓら（Ｓｔａｖｒｏｐｏｕｌｏｓ ａｎｄ Ｓｔｒａｔｈｄｅｅ，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ７２（１）：９９－１０４（２００１））によって使用されたＯｍｐＦプロモータに基づくものであった。ＬａｃＺＹＡプロモータは、ｌａｃリプレッサーによって結合されたｌａｃオペレータ配列と共に、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔの配列に由来した。
ＬａｃＺαペプチドのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に関して、Ｒｅｄｄｙ（Ｒｅｄｄｙ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ３７（６）：９４８－５２（２００４）は、プラスミドｐＵＣ１９が、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔよりも約１０倍多いβ－ガラクトシダーゼ活性をもたらしたことを報告した。これらのプラスミドは、ｌａｃＺαペプチドを駆動する同じプロモータエレメントを有する。しかしながら、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔはｐＵＣ１９よりもはるかに長いポリリンカーを有し、ｐＵＣ１９は非ｌａｃＺ Ｃ末端残基をコードする。これらの違いの中で、高いｐＵＣ１９β－ガラクトシダーゼ活性をもたらすことは不明である。Ｎｉｓｈｉｙａｍａらは、６０アミノ酸のＮ末端αペプチドが、それらのアッセイにおいて最大β－ガラクトシダーゼ活性を有したことを見出した（Ｎｉｓｈｉｙａｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．２４（５）：５９９－６０３（２０１５））。残基６０で切断短縮されたＭＧ１６５５株からの次の野生型ＬａｃＺα領域を使用した。ＭＴＭＩＴＤＳＬＡＶＶＬＱＲＲＤＷＥＮＰＧＶＴＱＬＮＲＬＡＡＨＰＰＦＡＳＷＲＮＳＥＥＡＲＴＤ
ＲＰＳＱＱＬＲＳＬＮＧＥＷＲ（配列番号１）。
ＲＰＳＱＱＬＲＳＬＮＧＥＷＲ（配列番号１）。
ターミネータ配列は、Ｏｒｏｓｚら（Ｏｒｏｓｚ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０１（３）：６５３－９（１９９１））によって記載されるｒｒｎＢＴ２ターミネータに由来した。
Ｐ２１５（配列番号９）（図１）及びＰ２１６（配列番号１０）（図２）プラスミドを、ＧｅｎｅＷｉｚ（Ｓｏｕｔｈ Ｐｌａｉｎｆｉｅｌｄ，ＮＪ）での遺伝子合成により構築した。プラスミドは、アンピシリン耐性カセット及び４．９ｋｂの導入遺伝子を含有する。
結果
抗生物質選択マーカーを含まないプラスミドは、遺伝子療法用途及び治療用製品の細胞株の開発に望ましい。１ｋｂ以下のプラスミド骨格は、インビボで動物に送達されたときに遺伝子サイレンシングを回避するのに有用であったことも報告されている。これらの実験の目的は、Ｅ．ｃｏｌｉ中のプラスミド含有細胞を選択するための、小さい代謝選択マーカーを開発するための新しい戦略を探索することであった。
抗生物質選択マーカーを含まないプラスミドは、遺伝子療法用途及び治療用製品の細胞株の開発に望ましい。１ｋｂ以下のプラスミド骨格は、インビボで動物に送達されたときに遺伝子サイレンシングを回避するのに有用であったことも報告されている。これらの実験の目的は、Ｅ．ｃｏｌｉ中のプラスミド含有細胞を選択するための、小さい代謝選択マーカーを開発するための新しい戦略を探索することであった。
β－ガラクトシダーゼのαペプチドを発現するプラスミドは、Ｔｏｐ１０細胞におけるＬａｃＺΔ１５対立遺伝子を補完し、ラクトースオペロンを完成させ、ラクトースを唯一の炭素源として最少培地で細胞を成長させることができると仮定された。
実施例１では、ｌａｃＺα融合ペプチドを発現するｐＵＣ１９及びｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクターが、ＴＯＰ１０細胞を補完し、ラクトースを有する最少培地でそれらを成長させることが可能であるかどうかを試験した。これらの実験は成功しなかった。
これらのベクターによりコードされたｌａｃＺα融合タンパク質は、ＬａｃＺΔ１５変異を補完する際に準最適であり、ラクトース含有最少培地での成長を可能にするのに十分な高レベルで発現されなかったという仮説に基づいて、ベクターを新しいｌａｃＺα発現カセットで合成した。ＬａｃＺΔ１５変異を補完するこれらのベクターの能力を試験した。１０ナノグラム（ｎｇ）のプラスミドＰ２１５及びＰ２１６、並びにｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩを５０μＬのＯｎｅＳｈｏｔ Ｔｏｐ１０細胞に形質転換した。細胞を氷上で２０分間ＤＮＡと共にインキュベートし、４２℃で３０秒間熱ショックを与え、氷上での１分間のインキュベートに戻した。４５０μＬのＳＯＣを細胞に加え、細胞を振盪しながら３７℃で１時間インキュベートした。２５０μＬの細胞を除去し、残りの細胞をインキュベータに戻した。抽出した細胞を５００μＬのＤ－ＰＢＳで２回洗浄し、最後の洗浄後に２００μＬのＤ－ＰＢＳ中に再懸濁した。５０μＬの細胞を、ＬＢ－カルベニシリン（１００）、Ｍ９＋グルコース、及びＭ９＋ラクトースプレート上にプレーティングし、プレートを３７℃でインキュベートした。熱ショックの４．５時間後、インキュベータからの残りの細胞を上述のように洗浄し、Ｍ９＋グルコース及びＭ９＋ラクトースプレート上にプレーティングした。プレートを一晩３７℃でインキュベートした。
Ｍ９＋グルコース上にプレーティングされた形質転換物は、細胞の菌叢を作り、Ｔｏｐ１０宿主細胞がこれらのプレート上で成長することができることを示す。ＬＢ－カルベニシリン（１００）上にプレーティングされた形質転換物も、多くのコロニーを同様に産生した。ＬＢ－カルベニシリンプレートを４℃で保管した。Ｍ９＋ラクトースプレートを３７℃で維持し、更に２４時間インキュベートした。
形質転換物は、１時間又は４時間のいずれかで回復させることができ、両方とも、Ｍ９＋ラクトースプレート上にプレーティングしたときに多数のコロニーを産生した。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ形質転換物上にコロニーは存在せず、実施例１の結果を確認し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩが、ラクトース最少培地での成長を可能にするために、ＬａｃＺΔ１５変異の補完を通して十分なβ－ガラクトシダーゼを産生することができなかったことを示す。プレートを４℃で保管した。
ＣｏｌＥ１などの天然プラスミドは、抗生物質選択の不在下でＥ．ｃｏｌｉ宿主内で効率的に維持される一方で、ｐＵＣシリーズのベクターは、選択の不在下で高い率で細胞から失われ得る（Ｓｕｍｍｅｒｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ２９：１１３７－１１４５（１９９８））。しかしながら、最少培地対リッチＬＢ培地でのＰ２１５及びＰ２１６形質転換細胞の成長速度が非常にゆっくりであることを考慮すると、プラスミドの損失頻度があまり高くない場合には、選別の不在下で、ＬＢ中で細胞培養物を成長させることがプラスミドＤＮＡ精製のためにははるかに速く、より安価であろう。β－ガラクトシダーゼα相補性プラスミド含有細胞は、β－ガラクトシダーゼが細胞を青色に変えるＸＧＡＬ（５－ブロモ－４－クロロ－３－インドリル－β－Ｄ－ガラクトピラノシド）インジケータを加水分解するため、ＬＢ－ＩＰＴＧ－ＸＧＡＬプレート上で成長させたプラスミド不含細胞とは容易に区別される。このアッセイを使用して、ＬＢ培地で抗生物質を含まずにこれらの細胞を成長させたときのプラスミド損失の頻度を調査した。
細胞の純粋な集団を、ＬＢ－ＩＰＴＧ－ＸＧＡＬプレート上に細胞を画線することによって得、プラスミドを含有するコロニーは青色になった。プレートに画線されたコロニーのほとんどは、予想どおり青色であった。
細胞の純粋な集団を得た後、連続細胞培養物を成長させた。単一の青色コロニーを採取し、１５ｍＬのチューブ内で２ｍＬのＬＢ培地で成長させた。振盪しながら、培養物を３７℃で一晩インキュベートした。
培養物からの細胞をＬＢ－ＩＰＴＧ－ＸＧＡＬプレート上に画線し、プレートを３７℃で一晩インキュベートした。再画線されたプレート上のコロニーは青色であった。単一のコロニーを、２５０ｍＬフラスコ中の５０ｍＬのＬＢに播種し、振盪しながら３７℃で一晩インキュベートした。
一晩培養物の１０－４希釈物５０μＬを、ＬＢ－ＩＰＴＧ－ＸＧＡＬプレート上にプレーティングした。プレートを、３７℃で一晩インキュベートした。５０ｍＬ培養物１μＬを、５０ｍＬのＬＢ（５０，０００倍希釈）の新たな培養物に希釈した。培養物を３７℃で一晩成長させた。
一晩インキュベートした後、プレート上の全てのコロニーは青色であることが観察された。前の晩からの５０ｍＬ培養物の１０－４希釈物５０μＬを、ＬＢ－ＩＰＴＧ－ＸＧＡＬプレート上にプレーティングした。前の晩の５０ｍＬ培養物１μＬを、５０ｍＬのＬＢ（５０，０００倍希釈）の新たな培養物に希釈した。培養物を３７℃で一晩成長させた。
一晩インキュベートした後、５０μＬの１０－４希釈物を含むプレート上に約１０００のコロニーが観察された。Ｐ２１５形質転換物の全てのコロニーは青色であり、Ｐ２１６形質転換プレート上に観察された白色のコロニーは３つしか存在しなかった。
結果は、プラスミドＰ２１５及びＰ２１６が、選択の不在下でも安定であったことを示した。これらのプラスミドは、Ｐ２１５及びＰ２１６についてそれぞれ７．２及び７．３ｋｂである。単一のコロニーから５０ｍＬに希釈し、次いで１：５０，０００に希釈し、コンフルエンスまで２回成長させると、細胞は、細胞のほとんどに依然としてプラスミドを保持しながら、選択なしに１．２５×１０８リットルの体積まで成長させることができることを示唆する。形質転換効率は、細胞を、熱ショック後のＳＯＣ培地中で１時間対４時間回復させたときに同様であった。
構築されたα相補性プラスミドは、Ｔｏｐ１０細胞におけるＬａｃＺΔ１５変異を補完し、唯一の炭素源としてラクトースを有する最少培地での成長を可能にする。これらのプラスミドもまた、選択的圧力の不在下でＬＢ液体培養物中で安定であることが見出された。
実施例３：β－ガラクトシダーゼ－α相補性プラスミドのサイズの低減
以前の実験では、Ｐ２１５及びＰ２１６プラスミドからのβ－ガラクトシダーゼαペプチドの発現は、プラスミド上の選択マーカーとして有用であり、抗生物質耐性遺伝子を置換することが示された。次に、最小の可能なレプリコンを定義する目的で、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてプラスミド選択及び複製にプラスミドのどの領域が必須であるかを定義することが求められた。
以前の実験では、Ｐ２１５及びＰ２１６プラスミドからのβ－ガラクトシダーゼαペプチドの発現は、プラスミド上の選択マーカーとして有用であり、抗生物質耐性遺伝子を置換することが示された。次に、最小の可能なレプリコンを定義する目的で、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてプラスミド選択及び複製にプラスミドのどの領域が必須であるかを定義することが求められた。
結果
標準的なクローニング技術を使用して、ｍＣｈｅｒｒｙ及びピューロマイシン耐性遺伝子をプラスミドＰ２１５から除去してプラスミドＰ２１７（配列番号１１）を作製した（図３）。
標準的なクローニング技術を使用して、ｍＣｈｅｒｒｙ及びピューロマイシン耐性遺伝子をプラスミドＰ２１５から除去してプラスミドＰ２１７（配列番号１１）を作製した（図３）。
プラスミドＰ２１７から、標準的なクローニング技術を使用して、アンピシリン耐性遺伝子を除去した。ライゲーションしたＤＮＡを５０μＬのＴＯＰ１０細胞に形質転換し、氷上で２０分間インキュベートし、３０秒間熱ショックを与え、更に３分間氷上でインキュベートした。インキュベーション後、４５０μＬのＳＯＣを細胞に加え、細胞を振盪しながら３７℃で１時間インキュベートした。細胞をペレット化し、１ｍＬのｄ－ＰＢＳで３回洗浄した。細胞をＭ９－ラクトースプレート上にプレーティングし、３７℃で２日間インキュベートした。形質転換物からコロニーを採取し、ＬＢ－ＩＰＴＧ－ＸＧＡＬプレート上に画線した。得られたコロニーは、各クローンに関して青色であった。単一のクローンを採取し（クローンＰ２１８（配列番号１２、図４））、ＤＮＡ配列決定は、所望の欠失が作製されたことを確認した。
β－ガラクトシダーゼ選択カセットのサイズを更に減少させるために、ｒｒｎＢＴ２転写ターミネータ（配列番号７）を欠失させた。転写物の安定性を維持するためにこの配列が必要ではなかった可能性に加えて、ｐＵＣ５７／ｐＭＢ１起源の上流のプロモータからのリードスルー転写は、起源の複製プライマー領域を通して転写を増加させることによってコピー数を増加させることができることが報告された（Ｐａｎａｙｏｔａｔｏｓ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１２（６）：２６４１－８（１９８４）、Ｏｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ．１７２（２）：１５１－９（１９７９））。
標準的なクローニング技術を使用して、欠失コンストラクトＰ２１９（配列番号１３、図５）のコロニーを得た。ＤＮＡ配列決定により欠失が確認された。
この作業により解明された最小β－ガラクトシダーゼ発現カセット／複製起点カセット（配列番号１８）は、９３８ｂｐである。それは、より大きなプラスミド骨格に関連する哺乳類細胞におけるＤＮＡサイレンシングを回避するために、１ｋｂよりも小さいことの目的が満たされる（Ｌｕ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２０（１１）：２１１１－９（２０１２））。
実施例４：ホタルルシフェラーゼ発現カセットを有するβ－ガラクトシダーゼ－α相補性ベクターの作製
上に提供される実施例では、抗生物質耐性遺伝子の代わりに選択マーカーとしてβ－ガラクトシダーゼ変異のα相補性を使用するプラスミドを構築した。プラスミドサイズが増加する場合でもＤＮＡ複製が依然として効率的であったかを決定するために、上記に定義した最小β－ガラクトシダーゼ発現カセット／複製起点配列（配列番号１８）を使用して、標準的なクローニング技術を使用して、既存のプラスミドの抗生物質選択マーカー及び複製起点を置換した。
上に提供される実施例では、抗生物質耐性遺伝子の代わりに選択マーカーとしてβ－ガラクトシダーゼ変異のα相補性を使用するプラスミドを構築した。プラスミドサイズが増加する場合でもＤＮＡ複製が依然として効率的であったかを決定するために、上記に定義した最小β－ガラクトシダーゼ発現カセット／複製起点配列（配列番号１８）を使用して、標準的なクローニング技術を使用して、既存のプラスミドの抗生物質選択マーカー及び複製起点を置換した。
標準的なクローニング技術を使用して、ＧＷＩＺ－ルシフェラーゼプラスミド（配列番号１６）からＣＭＶプロモータ－ルシフェラーゼ－ポリＡ発現カセットをＰ２１９にクローニングした。Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ ＴＯＰ１０細胞への形質転換、Ｍ９＋ラクトースプレートへのプレーティング、及び３７℃で２日間のインキュベーションにより、大きなコロニーが産生された。コロニーをＬＢ－ＩＰＴＧ－ＸＧＡＬプレート上に再画線し、３７℃で一晩インキュベートした。
形質転換反応の青色コロニーを、プライマーＣＮＦＯＲ（配列番号１４）、及びＰ４５５Ｒ２（配列番号１５）を使用してインサートについてスクリーニングした。２つのＰＣＲ陽性コロニーを採取し、３７℃で成長させた６ｍＬのＬＢ培養物に播種した。ＤＮＡを培養物から単離し、ＤＮＡ収率を、分光光度計を用いてそれらのＯＤ２６０を測定することによって推定した（表１）。
５００ｍＬのフラスコ中の２００ｍＬのＬＢに、クローンＰ４６９－２の単一の青色コロニーを播種し、シェーカーインキュベータ内で３７℃で１８時間成長させた。Ｑｉａｇｅｎ ＨｉＳｐｅｅｄ ＭａｘｉＰｒｅｐキットを使用して、この培養物からＤＮＡを精製し、４４０μｇのＤＮＡを回収した。
プラスミドＰ４６９－２（配列番号１７）を配列決定し、ＧｅｎｅＷｉｚで確認した。
この実施例では、カナマイシン耐性遺伝子及びＧＷＩＺ－ルシフェラーゼの複製起点は、上記に定義した最小β－ガラクトシダーゼ／複製起点に正常に置き換えられた。このクローンをＬＢ培地で選択的圧力を加えずに成長させたとき、許容可能なプラスミド収率が達成された。
実施例５：様々なＥ．ｃｏｌｉ株におけるβ－ガラクトシダーゼ－α相補性ベクター機能の試験
抗生物質耐性遺伝子の代わりに、β－ガラクトシダーゼαペプチドを選択可能マーカーとして使用することができる追加のＥ．ｃｏｌｉ株を同定するために、上記で構築されたプラスミドのうちの１つを、８つの異なる株へのＤＮＡトランスフェクションによって試験した。
抗生物質耐性遺伝子の代わりに、β－ガラクトシダーゼαペプチドを選択可能マーカーとして使用することができる追加のＥ．ｃｏｌｉ株を同定するために、上記で構築されたプラスミドのうちの１つを、８つの異なる株へのＤＮＡトランスフェクションによって試験した。
結果
表２の５０μＬのＥ．ｃｏｌｉ株を、減菌微小遠心管内で、氷上で１ｎｇのプラスミドＰ４６９－２と共に３０分間インキュベートした。４２℃で３０秒間細胞に熱ショックを与え、氷上で１分間インキュベートした。ＮＥＢ－Ｓｔａｂｌｅ細胞を除く全ての細胞に４５０μＬのＳＯＣ培地を加えた。形質転換したＮＥＢ－Ｓｔａｂｌｅ細胞に、４５０μＬのＮＥＢ－Ｓｔａｂｌｅ増生（outgrowth）培地（製造業者により供給された）を加えた。細胞を、振盪しながら３７℃で１時間インキュベートした。細胞をペレット化し、１ｍＬのＤ－ＰＢＳで３回洗浄した。細胞をＭ９－ラクトースプレート上にプレーティングし、３７℃で３日間インキュベートした。
表２の５０μＬのＥ．ｃｏｌｉ株を、減菌微小遠心管内で、氷上で１ｎｇのプラスミドＰ４６９－２と共に３０分間インキュベートした。４２℃で３０秒間細胞に熱ショックを与え、氷上で１分間インキュベートした。ＮＥＢ－Ｓｔａｂｌｅ細胞を除く全ての細胞に４５０μＬのＳＯＣ培地を加えた。形質転換したＮＥＢ－Ｓｔａｂｌｅ細胞に、４５０μＬのＮＥＢ－Ｓｔａｂｌｅ増生（outgrowth）培地（製造業者により供給された）を加えた。細胞を、振盪しながら３７℃で１時間インキュベートした。細胞をペレット化し、１ｍＬのＤ－ＰＢＳで３回洗浄した。細胞をＭ９－ラクトースプレート上にプレーティングし、３７℃で３日間インキュベートした。
予想どおり、陰性対照として含まれたＳｔｂｌ３形質転換細胞からのプレート上にコロニーは検出されなかった。株のうちの５つ（Ｔｏｐ１０、ＧＴ１１５、ＮＥＢ－Ｓｔａｂｌｅ、Ｓｔｅｌｌａｒ、及びＤＨ１０Ｂ）は、正常なサイズのコロニーを有した。２つの株（ＮＥＢ－Ａｌｐｈａ及びＸＬ１－Ｂｌｕｅ）は、小さなコロニーを有した。これは、ＮＥＢ－ａｌｐｈａ（ＤＨ５ａｌｐｈａ）及びＸＬ１－Ｂｌｕｅと同様の株が、最少培地での成長を遅らせるｐｕｒＢ遺伝子に変異を含有するため予想された（Ｊｕｎｇ ｅｔ ａｌ．Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏ．７６：６３０７－６３０９（２０１０））。
ＸＬ１－ｂｌｕｅ及びＮＥＢ－Ａｌｐｈａプレートを３７℃で更に１日インキュベートした。
Ｍ９－ラクトースプレートからＬＢ－ＩＰＴＧ－ＸＧＡＬプレート上にコロニーを画線し、３７℃でインキュベートすることによって、純粋なコロニーを得た。ＬＢ－ＩＰＴＧ－ＸＧＡＬプレート上に青色コロニー（プラスミド含有細胞）を画線し（２回目）、３７℃でインキュベートし、これはほとんど青色細胞を産生した。
Φ８０ｄｌａｃＺΔＭ１５マーカーを含有した試験株の全ては、β－ガラクトシダーゼαペプチド発現プラスミドＰ４６９－２により形質転換され、唯一の炭素源としてラクトースを有するＭ９最少培地で選択され得る。Ｆエピソーム上にマーカーｌａｃＩｑＺΔＭ１５を含有する株ＸＬ１－ｂｌｕｅのプラスミドＰ４６９－２トランスフェクタントもまた、Ｍ９－ラクトースプレート上で選択可能であった。したがって、７つの市販のＥ．ｃｏｌｉ株は、β－ガラクトシダーゼ選択可能マーカーと適合性があることが示された。
当業者は、広い発明概念から逸脱することなく前述の実施形態に変更を行うことができることを理解するであろう。したがって、本発明は、開示された特定の実施形態に制限されず、本説明によって定義されるように本発明の趣旨及び範囲内の修正を包含することを意図するものと理解される。
Claims (27)
- 核酸コンストラクトを選択可能マーカーとして使用する方法であって、前記方法が、
ａ．ｌａｃオペロンに欠失を含む宿主細胞を前記核酸コンストラクトと接触させることであって、前記核酸コンストラクトが、プロモータに操作可能に連結されたβ－ガラクトシダーゼのアミノ末端フラグメントをコードする核酸配列を含む、単離されたβ－ガラクトシダーゼ発現カセットを含む、接触させること、及び
ｂ．前記核酸コンストラクトが前記宿主細胞内に維持される条件下で、前記宿主細胞を成長させること
を含む、前記方法。 - 前記β－ガラクトシダーゼのアミノ末端フラグメントが、配列番号１と少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
- 前記β－ガラクトシダーゼのアミノ末端フラグメントが、配列番号１のアミノ酸配列を含む、請求項１又は２に記載の方法。
- 前記核酸配列が、複製起点を更に含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複製起点が、高コピー複製起点である、請求項４に記載の方法。
- 前記高コピー複製起点が、ｐＵＣ５７複製起点である、請求項５に記載の方法。
- 前記ｐＵＣ５７複製起点が、配列番号１９の核酸配列を含む、請求項６に記載の方法。
- 前記単離されたβ－ガラクトシダーゼ発現カセットが、二量体分解エレメントを更に含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
- 前記二量体分解エレメントが、部位特異的リコンビナーゼ認識部位を含む核酸配列を含む、請求項８に記載の方法。
- 前記二量体分解エレメントが、部位特異的リコンビナーゼをコードする核酸配列を更に含む、請求項８又は９に記載の方法。
- 前記宿主細胞が、部位特異的リコンビナーゼをコードする核酸配列を含む、請求項８又は９に記載の方法。
- 前記二量体分解エレメントが、ＣｏｌＥ１二量体分解エレメントである、請求項８～１１のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ＣｏｌＥ１二量体分解エレメントが、配列番号２０の核酸配列を含む、請求項１２に記載の方法。
- 前記宿主細胞が、ＬａｃＺΔ１５欠失を含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
- 単離されたベクターが、前記単離されたβ－ガラクトシダーゼ発現カセットを含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
- 前記単離されたベクターが、約１．５キロベース未満のサイズである、請求項１５に記載の方法。
- 前記単離されたベクターが、配列番号９～１３、１７、及び１８からなる群から選択される核酸配列を含む、請求項１５又は１６に記載の方法。
- 請求項１５～１７のいずれか一項に記載の単離されたベクターを生成する方法であって、前記方法が、
ａ．宿主細胞を前記単離されたベクターと接触させること、
ｂ．前記ベクターを産生する条件下で前記宿主細胞を成長させること、及び
ｃ．前記ベクターを前記宿主細胞から単離すること
を含む、前記方法。 - 前記宿主細胞が、最少培地で成長する、請求項１８に記載の方法。
- 前記最少培地が、唯一の炭素源としてラクトースを含む、請求項１９に記載の方法。
- 前記最少培地が、容積あたり約１重量％～約４重量％（ｗ／ｖ）のラクトースを含む、請求項２０に記載の方法。
- 前記最少培地が、約２％ｗ／ｖのラクトースを含む、請求項２１に記載の方法。
- キットであって、
ａ．請求項１～１３のいずれか一項に記載の単離されたβ－ガラクトシダーゼ発現カセット、及び
ｂ．ｌａｃオペロンに欠失を含む宿主細胞
を含む、前記キット。 - 前記唯一の炭素源としてラクトースを含む最少培地を更に含む、請求項２３に記載のキット。
- ベクターが、前記単離されたβ－ガラクトシダーゼ発現カセットを含む、請求項２３又は２４に記載のキット。
- 前記宿主細胞が、前記ＬａｃＺΔ１５欠失を含む、請求項２３～２５のいずれか一項に記載のキット。
- 前記宿主細胞が、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞及び酵母宿主細胞からなる群から選択される、請求項２６に記載のキット。
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