JP7364611B2 - ステロイドの２１－ヒドロキシル化 - Google Patents
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Description
本発明は概してステロイドヒドロキシル化の分野に関する。より詳細には、本発明は細胞におけるステロイドの２１－ヒドロキシル化の方法に関する。本発明はまた、ステロイド２１－ヒドロキシル化を行う酵素、すなわちステロイド２１－ヒドロキシラーゼを発現する細胞、ステロイド２１－ヒドロキシラーゼをコードする核酸を含む発現ベクター、および細胞におけるステロイドの２１－ヒドロキシル化の方法を実行するためのキットに関する。
合成グルココルチコイドは、天然存在のストレスホルモンコルチゾールからの派生であり、その抗炎症効果および免疫抑制効果から、医薬品産業において重要な役割を果たす。さらに合成分子は多くの場合、コルチゾールよりも有効に作用する。
現在、一部の薬学的に活性なステロイドの合成は、その前駆体の２１－ヒドロキシル化（一例として図１を参照のこと）を含み、長時間続く多段階化学合成からなる。また、化学的な酸化剤は２１位に対して選択的ではないので、合成化学によってはこのヒドロキシル化は困難である。この理由から、他の官能基を保護してその酸化を回避し、またヒドロキシル化反応を２１位に導く必要がある。さらに、ヨウ素などの試薬を使用するため、この合成は環境に優しくない。したがって、薬学的に活性なステロイドを安価かつ持続可能に生成することは、これらの重要な薬物に対する高い需要を満たすために極めて望ましい。
本発明者らは、酵素ＣＹＰ２１Ａ２による１段階合成でのステロイドの全細胞生体内変換の開発によってこの問題に取り組んでいる。酵素ＣＹＰ２１Ａ２は、チトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼのタンパク質ファミリーのメンバーであり、ステロイド骨格の２１位において高選択的なステロイドのヒドロキシル化を行うことができる（この方法のスキームについては図２を参照のこと）。ＣＹＰ２１Ａ２は、小胞体に位置し、ステロイドホルモン生合成において重要な役割を果たす、哺乳類の膜アンカー酵素である。本発明者らは、本発明の生体触媒系が、確立された化学合成に取って代わる有望な候補であることを示している。本発明者らは特に、所望の１生成物に至る単一のヒドロキシル化工程でステロイドを修飾することができることを示している。これは時間を節約し、環境に優しく（副生成物は観測されなかった）、下流のプロセシングを容易にする。それに加え、かつ有利に、本発明による全細胞でのステロイド生成では、酵素を精製する必要がなく、酵素は宿主において安定なままであり、かつ細胞自体が供与体としての役割を果たすので、ＮＡＤＰＨのような高価な酸化還元等価物を添加する必要がない。
本発明を以下で詳細に説明する前に、方法、プロトコルおよび試薬は様々でありうるので、本発明は、本明細書に記載する特定の方法、プロトコルおよび試薬に限定されないことを理解するべきである。また本明細書において使用する用語は、単に特定の実施形態を説明することを目的とするものであり、本発明の範囲を限定するよう意図するものではなく、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されることを理解するべきである。別段の定めがない限り、本明細書中において使用する全ての技術用語および科学用語は、当業者によって一般的に理解される意味と同じ意味を有する。
本明細書において使用する用語は、「Ａ ｍｕｌｔｉｌｉｎｇｕａｌ ｇｌｏｓｓａｒｙ ｏｆ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｔｅｒｍｓ：（ＩＵＰＡＣ Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ）」、Ｌｅｕｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｈ．Ｇ．Ｗ、Ｎａｇｅｌ，Ｂ．およびＫｏｌｂｌ，Ｈ．編（１９９５）、Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ、ＣＨ－４０１０ Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄに記載されるように規定されることが好ましい。
本明細書の本文では、いくつかの文書を引用している。本明細書において引用する文書（全ての特許、特許出願、科学刊行物、製造業者の仕様書、説明書などを含める）の各々は、上記または下記のいずれでも、参照によってその全体を組み入れる。本明細書においては、先行発明に基づき、かかる開示に先行する権限が本発明にないことの承認として解釈するべきものはない。
以下に、本発明の構成要素を説明する。これらの構成要素は特定の実施形態と共に列挙するが、これらの構成要素は任意の様式および任意の数で組み合わせて、さらなる実施形態を作成してもよいことを理解するべきである。様々に説明している例、および好ましい実施形態は、明示的に説明している実施形態のみに本発明を限定するものとして解釈するべきではない。この記載は、明示的に説明している実施形態を任意の数の開示した構成要素および／または好ましい構成要素と組み合わせる実施形態を支持し、包含するものとして理解するべきである。さらに、文脈により別のことが示されない限り、本出願において説明している全ての構成要素の任意の順列および組合せが、本出願の説明によって開示されると見なされるべきである。
本明細書とこれに続く特許請求の範囲とにわたり、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という語と、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変化形は、述べられている整数もしくは工程、または整数もしくは工程の群を含むことを意味しているが、他のいかなる整数もしくは工程、または整数もしくは工程の群を排除することを意味するものではないことを理解するべきである。本明細書および添付の特許請求の範囲において使用する場合、内容から明らかに他の意味で示されている場合を除き、単数形「ａ」「ａｎ」および「ｔｈｅ」は複数指示物を含む。
第１の態様においては、本発明は、ステロイドの炭素原子２１をヒドロキシル化する方法であって、
ａ）（ｉ）異種ＣＹＰ２１Ａ２タンパク質またはその機能的バリアント、
（ｉｉ）電子をＣＹＰ２１Ａ２に伝達することができる少なくとも１つの異種電子伝達系、および
（ｉｉｉ）ＣＹＰ２１Ａ２の折りたたみを促進する１種またはそれ以上のシャペロン
を発現する細胞を用意する工程；ならびに
ｂ）細胞にステロイドを添加する工程
を含む方法に関する。
ａ）（ｉ）異種ＣＹＰ２１Ａ２タンパク質またはその機能的バリアント、
（ｉｉ）電子をＣＹＰ２１Ａ２に伝達することができる少なくとも１つの異種電子伝達系、および
（ｉｉｉ）ＣＹＰ２１Ａ２の折りたたみを促進する１種またはそれ以上のシャペロン
を発現する細胞を用意する工程；ならびに
ｂ）細胞にステロイドを添加する工程
を含む方法に関する。
ステロイドは、互いにつながった特徴的な配置の４つのシクロアルカン環を含有する有機化合物の１種である（以下に示す）。ステロイド核は、互いに結合した１７個の炭素原子から構成されており、この１７個の炭素原子は４つの縮合環：３つのシクロヘキサン環（環Ａ、ＢおよびＣと呼ぶ）ならびに１つのシクロペンタン環（環Ｄ）の形態をしている。ステロイドは、この４環核に付いた官能基と、環の酸化状態とによって異なる。
ステロイドの炭素原子２１のヒドロキシル化は、上記のＡＢＣＤステロイド環系において示される２１位での－ＯＨ基の付加である。炭素原子の番号付けは、ＩＵＰＡＣ（国際
純正および応用化学連合）承認の環の標記および原子の番号付けに従う。ステロイドの２１－ヒドロキシル化を図１に示す。
純正および応用化学連合）承認の環の標記および原子の番号付けに従う。ステロイドの２１－ヒドロキシル化を図１に示す。
本発明の第１の態様の方法の特定の実施形態においては、ステロイドは３－ケトステロイドである。より詳細には、ステロイドは非天然ステロイド、すなわち、遺伝子改変されていない細胞、特にヒトまたはウシ細胞において生成および／または２１－ヒドロキシル化されていないステロイドである。
一実施形態においては、ステロイドは、メドラン（ｍｅｄｒａｎｅ）、デルタメドラン（ｄｅｌｔａｍｅｄｒａｎｅ）、プロゲステロン、１７ＯＨ－プロゲステロン、メドロキシプロゲステロン、および５－α－ジヒドロプロゲステロンからなる群から選択される。２１－ヒドロキシル化は、これらの特定のステロイドをそれぞれプレメドロール（ｐｒｅｍｅｄｒｏｌ）、メドロール、１１－デオキシコルチコステロン、１１－デオキシコルチゾール、２１ＯＨ－メドロキシプロゲステロン、および２１ＯＨ－（５α－ジヒドロプロゲステロン）に変換する。ステロイドが非天然ステロイドである特定の一実施形態においては、ステロイドは、メドラン、デルタメドラン、メドロキシプロゲステロン、および５－α－ジヒドロプロゲステロンからなる群から選択される。
細胞は特に、任意の細胞培地、例えば増殖培地において培養される培養細胞であり、特定の実施形態においては、静止状態である。この実施形態によれば、細胞は、増殖培地ではなく、細胞を維持することができるバッファーまたは培地中に含まれる。バッファーの組成は特定の細胞に応じ、好適なバッファーは当技術分野において周知である。細胞の種類に応じて、細胞は懸濁細胞または接着細胞である。懸濁細胞は、懸濁液中で（すなわち表面に付着せずに）自然に存在することができる細胞、または、懸濁培養物中で生存することができるように、例えば接着状態によって可能となる密度よりも高い密度に増殖するように改変された細胞である。接着細胞は、組織培養プラスチックまたはマイクロキャリアなどの表面を必要とする細胞であり、その表面は、細胞外マトリックス（コラーゲンおよびラミニンなど）成分でコーティングして接着特性を向上させ、増殖および分化に必要な他のシグナルを与えてもよい。一実施形態においては、接着細胞は単層細胞である。
細胞は概して原核細胞でも真核細胞でもよい。第１の態様の方法において使用する原核細胞の特定の例は、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）細胞であり、例えば実施例の大腸菌株Ｃ４３（ＤＥ３）細胞である。真核細胞の特定の例は酵母細胞であり、例えばＳ．セレビシエ（Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓａｅ）細胞またはシゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）細胞である。しかしながら第１の態様の方法は、いずれの特定の細胞タイプにも限定されず、任意の細胞タイプを使用してもよい。特に、上述の細胞のほかに昆虫細胞または哺乳類細胞のような、培養で増殖させて維持することができ、かつ組換え発現系として使用することができる任意の細胞タイプを使用してもよい。
「異種」という用語は、タンパク質を、通常は（すなわち、ヒトの介入なしでは）そのタンパク質を発現しない細胞において発現させることを意味する。例えばＣＹＰ２１Ａ２は２１－ヒドロキシラーゼとも呼ばれる酵素であり、チトクロムＰ４５０ファミリーの酵素の一部である。チトクロムＰ４５０酵素は、薬物を分解する反応を補助すること、ならびにコレステロール、特定のホルモン、および脂肪（脂質）の生成を助けることなど、体内の多くのプロセスに関与する。２１－ヒドロキシラーゼ酵素は副腎において見出され、副腎は腎臓の頂部に位置して、体内での多くの必須機能を調節する様々なホルモンを生成する。したがって異種発現に関しＣＹＰ２１Ａ２タンパク質は、副腎細胞ではない任意の細胞については異種であると見なすことができる。
特に「異種」という用語は、タンパク質または遺伝子が発現される細胞、特に組換えで発現される細胞と比べた、タンパク質または遺伝子が由来する種を指すこともある。その場合、異種タンパク質は、タンパク質が発現される細胞、すなわち本発明の第１の態様の方法の細胞とは異なる種に由来するタンパク質である。例えば本発明者らは哺乳類、特にヒトまたはウシのタンパク質を大腸菌細胞において発現させた。これにより、これらのタンパク質は細胞に対して異種となる。
本発明の第１の態様の方法の特定の実施形態においては、ＣＹＰ２１Ａ２タンパク質は、ヒトまたはウシ起源のタンパク質である。ヒトＣＹＰ２１Ａ２（ＵｎｉＰｒｏｔ受入番号Ｐ０８６８６）は、配列表の配列番号１に従った配列を有する。ウシＣＹＰ２１Ａ２（ＵｎｉＰｒｏｔ受入番号Ｐ００１９１）は、配列表の配列番号２に従った配列を有する。図８も参照のこと。しかしながら相同遺伝子は、Ｃａｎｉｓ ｌｕｐｕｓ（イヌ）、Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔａ（アカゲザル）、Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ（ラット）、Ｇａｌｌｕｓ ｇａｌｌｕｓ（ニワトリ）、Ｄａｎｉｏ ｒｅｒｉｏ（ゼブラフィッシュ）、Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ（マウス）、またはＰａｎ ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ（チンパンジー）などの他の哺乳類種にも存在する。したがって任意のＣＹＰ２１Ａ２タンパク質、特に任意の哺乳類ＣＹＰ２１Ａ２タンパク質を使用することができることを強調する。それぞれ配列番号３および配列番号４に従った、改変されたヒトＣＹＰ２１Ａ２またはウシＣＹＰ２１Ａ２も使用することができる。図８も参照のこと。
「機能的バリアント」という用語は、無改変のタンパク質またはＣＹＰ２１Ａ２タンパク質の、ステロイドを２１－ヒドロキシル化する能力の少なくとも２０％（例えば、少なくとも：２０％；３０％；４０％；５０％；６０％；７０％；８０％；９０％；９５％；９８％；９９％；９９．５％；もしくは１００％；またはさらにそれ以上）を有するタンパク質バリアントである。この能力は、例えば本明細書における実施例１および実施例２に示す方法を用いて、当業者によって過度の負担なく決定することができる。
「タンパク質バリアント」は、それが由来するＣＹＰ２１Ａ２のアミノ酸配列、例えばヒトＣＹＰ２１Ａ２の場合には配列番号１もしくは３、またはウシＣＹＰ２１Ａ２の場合には配列番号２もしくは４と、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一なアミノ酸配列を有するタンパク質である。２つの配列のパーセント同一性（ｐｅｒｃｅｎｔ ｉｄｅｎｔｉｔｙ）の決定は、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ
９０、５８７３－５８７７、１９９３の数学アルゴリズムを用いて行う。このようなアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、（１９９０） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．２１５、４０３－４１０のＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰプログラムに組み込まれている。比較の目的で、ギャップが挿入されたアライメントを得るには、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５、３３８９－３４０２において記載されるようにＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴを利用する。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、各プログラムのデフォルトパラメータを使用する。
９０、５８７３－５８７７、１９９３の数学アルゴリズムを用いて行う。このようなアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、（１９９０） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．２１５、４０３－４１０のＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰプログラムに組み込まれている。比較の目的で、ギャップが挿入されたアライメントを得るには、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５、３３８９－３４０２において記載されるようにＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴを利用する。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、各プログラムのデフォルトパラメータを使用する。
あるいはタンパク質バリアントは、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０、５、４、３、２、または１個以下のアミノ酸置換、特に保存的アミノ酸置換を有するものとして規定することもできる。保存的置換表は当技術分野において周知である（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ（１９８４）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ． Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙを参照のこと）。アミノ酸の物理特性および化学特性の概観を以下の表１に示す。特定の実施形態においては、保存的置換は、表１に従って同じ特性を有するアミノ酸を用いて行われる置換である。
「バリアント」という用語は、タンパク質断片も含む。ＣＹＰ２１Ａ２の断片は、合計で１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０、５、４、３、２、または１個以下のアミノ酸のＮ末端欠失および／またはＣ末端欠失を有する。特定の実施形態においては、機能的バリアントは、疎水性アンカー領域を欠損している、すなわち２９個のＮ末端アミノ酸残基がトランケーションされているＣＹＰ２１Ａ２の断片である（図８）。
さらにＣＹＰ２１Ａ２タンパク質は、例えばタグなどのＮ末端またはＣ末端アミノ酸付加、または細菌発現を改良するためのＮ末端修飾などによって修飾してもよい。例えば、タグは６×ＨｉｓタグなどのＣ末端Ｈｉｓタグとしてもよく、Ｎ末端修飾は、ＣＹＰ２Ｃ３のＮ末端に１０個のアミノ酸を付加することとしてもよい（図８ならびに配列番号３および４を参照のこと）。
電子伝達系は、酸化還元反応によって電子供与体から電子受容体へと電子を伝達する一連の化合物である。「ＣＹＰ２１Ａ２に電子を伝達することができる」という用語は、これによりＣＹＰ２１Ａ２がこの一連の電子受容体であることを意味する。本明細書において「一連」という用語はＣＹＰ２１Ａ２を含んでもよく、よって電子伝達系は、ＣＹＰ２１Ａ２のほかには単一のタンパク質からなっていてもよい。本発明の第１の態様の方法では、電子伝達系がＣＹＰ２１Ａ２に電子を伝達することができる限り、電子伝達系がどのメンバーからなっているかは重要ではない。好適な系は当技術分野において周知である。本発明の第１の態様の方法の特定の実施形態においては、少なくとも１つの電子伝達系は、（ｉ）ＣＹＰ２１Ａ２レダクターゼ、または（ｉｉ）フェレドキシンレダクターゼ、好ましくはＮＡＤＰＨ依存性フェレドキシンレダクターゼ（アドレノドキシンレダクターゼ）およびフェレドキシン、を含む。例えば少なくとも１つの電子伝達系は、ＮＡＤＰＨ依存性チトクロムＰ４５０レダクターゼ（ＣＰＲ、例えばヒトまたはウシ）、アドレノドキシンレダクターゼ（ＡｄＲ、例えばヒトまたはウシ）とアドレノドキシン（Ａｄｘ４－１０８、例えばヒトまたはウシ）との組合せ、フラボドキシンレダクターゼ（Ｆｐｒ、例えば大腸菌由来）とアドレノドキシン（Ａｄｘ４－１０８、例えばヒトまたはウシ）との組
合せ、アドレノドキシンレダクターゼ相同体（Ａｒｈ）、例えばＳ．ポンベ（Ｓ． ｐｏｍｂｅ）アドレノドキシンレダクターゼ相同体（Ａｒｈ１）とアドレノドキシン（Ａｄｘ４－１０８、例えばヒトまたはウシ）との組合せ、アドレノドキシンレダクターゼ相同体（Ａｒｈ）、例えばＳ．ポンベアドレノドキシンレダクターゼ相同体（Ａｒｈ１）と電子伝達ドメインのフェレドキシンドメイン（ｅｔｐｆｄ）、例えばＳ．ポンベ電子伝達ドメインのフェレドキシンドメイン（ｅｔｐ１ｆｄ）との組合せ、およびフラボドキシンレダクターゼ（Ｆｐｒ、例えば大腸菌由来）と電子伝達ドメインのフェレドキシンドメイン（ｅｔｐｆｄ）、例えばＳ．ポンベ電子伝達ドメインのフェレドキシンドメイン（ｅｔｐ１ｆｄ）との組合せからなる群から選択することができる。
合せ、アドレノドキシンレダクターゼ相同体（Ａｒｈ）、例えばＳ．ポンベ（Ｓ． ｐｏｍｂｅ）アドレノドキシンレダクターゼ相同体（Ａｒｈ１）とアドレノドキシン（Ａｄｘ４－１０８、例えばヒトまたはウシ）との組合せ、アドレノドキシンレダクターゼ相同体（Ａｒｈ）、例えばＳ．ポンベアドレノドキシンレダクターゼ相同体（Ａｒｈ１）と電子伝達ドメインのフェレドキシンドメイン（ｅｔｐｆｄ）、例えばＳ．ポンベ電子伝達ドメインのフェレドキシンドメイン（ｅｔｐ１ｆｄ）との組合せ、およびフラボドキシンレダクターゼ（Ｆｐｒ、例えば大腸菌由来）と電子伝達ドメインのフェレドキシンドメイン（ｅｔｐｆｄ）、例えばＳ．ポンベ電子伝達ドメインのフェレドキシンドメイン（ｅｔｐ１ｆｄ）との組合せからなる群から選択することができる。
特定の実施形態においては、外因性ＮＡＤＰＨを細胞に添加しない。この実施形態においては、ＮＡＤＰＨは細胞によって生成される。特定の実施形態においては、細胞におけるＮＡＤＰＨ生成は、組換え手段、例えばＮＡＤＰＨ生成に関する酵素（例えば、グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤ）、ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ（ＰＧＤ）、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ＭＤＨ）、および／もしくはイソクエン酸デヒドロゲナーゼ（ＩＣＤＨ）のうちの１つもしくはそれ以上）の異種発現によって増加させてもよく、かつ／またはホルモンシグナルを与えること、すなわち内因性ＮＡＤＰＨ生成のレベルを向上させるエストラジオールなどのホルモンを添加することによって増加させてもよい。
同様にシャペロンは、ＣＹＰ２１Ａ２の折りたたみを促進することができる限りは任意のシャペロンとすることができる。本発明者らは、本発明の第１の態様の方法が内因性シャペロンのみに依拠することができること、すなわち好適なシャペロンのさらなる発現は必須ではないことを見出した。しかしながらさらなる発現により、細胞における機能的ＣＹＰ２１Ａ２の生成は改良され、したがって有益となりうる。したがって本発明の第１の態様の方法の一実施形態においては、１種またはそれ以上のシャペロンは、組換えで発現されるシャペロンである。特に、１種またはそれ以上のシャペロンは異種シャペロンとしてもよい。例示的なシャペロンは、大腸菌シャペロンＧｒｏＥＬおよびＧｒｏＥＳ、またはＤｎａＫ、ＤｎａＪ、ＧｒｐＥ、およびＣｌｐＢのような他のシャペロン、ならびにＩｂｐＡおよびＩｂｐＢ（ＩｂｐＡＢ）などの低分子量熱ショックタンパク質（ｓＨＳＰ）である。
場合により、同じシャペロン、または細胞において発現される１つもしくはそれ以上のさらなるシャペロンが、上記の電子伝達タンパク質のうち１つまたはそれ以上を折りたたむことができる。
組換え発現は、組換え遺伝子の発現を指す。このような遺伝子は、遺伝子工学の方法によって細胞に導入された任意の遺伝子とすることができ、通常は異種遺伝子であり、かつ／または存在しうる対応する内在性遺伝子とは発現に関して異なって制御されている遺伝子である。一実施形態においては、組換え発現は誘導可能である。
本発明の第１の態様の方法の一実施形態においては、この方法は、例えば工程ｂ）の後に、細胞懸濁液に１種またはそれ以上の細胞透過剤を添加することをさらに含む。細胞透過剤は、膜の透過性を増加させる試薬である。例としては、メタノール、アセトン、またはＤＭＳＯなどの有機溶媒、サポニン、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、またはＴｗｅｅｎ－２０などの界面活性剤、およびＥＤＴＡである。特に、ポリミキシンＢを細胞透過剤として使用することができる。この薬剤は、本発明の方法において特に良好に作用することがわかった。
本発明の第１の態様の方法の別の実施形態においては、この方法は、細胞および／また
は細胞の上清（すなわち、細胞が含まれているバッファーもしくは培地）、例えば全細胞懸濁液から、２１－ヒドロキシル化ステロイドを抽出するする工程ｃ）をさらに含む。この抽出は、溶解していない化合物を抽出するための当技術分野で公知の任意の溶媒または抽出方法を用いて行うことができる。例えば１－ブタノール、２－ブタノン、またはクロロホルムなどの溶媒を使用してもよい。
は細胞の上清（すなわち、細胞が含まれているバッファーもしくは培地）、例えば全細胞懸濁液から、２１－ヒドロキシル化ステロイドを抽出するする工程ｃ）をさらに含む。この抽出は、溶解していない化合物を抽出するための当技術分野で公知の任意の溶媒または抽出方法を用いて行うことができる。例えば１－ブタノール、２－ブタノン、またはクロロホルムなどの溶媒を使用してもよい。
本発明の第１の態様の方法の特定の実施形態においては、少なくとも１つのトリプトファナーゼ遺伝子の発現が細胞において低減または消失している。トリプトファナーゼ、すなわちＬ－トリプトファンインドール－リアーゼ（ＥＣ番号４．１．９９．１．）は、Ｌ－トリプトファン＋Ｈ２Ｏ＝インドール＋ピルビン酸＋ＮＨ３の反応を触媒する酵素である。したがって、発現を低減または消失させることにより、細胞によるインドールの生成が減少する。インドールは、ＣＹＰ２１Ａ２などのＣＹＰ酵素の阻害剤であるので、これにより当該方法を改良することができる。トリプトファナーゼ遺伝子は概して（しかし限定するわけではなく）原核生物、例えば大腸菌において見出されるので、この特定の実施形態は、細胞が原核生物細胞である本発明の第１の態様の方法の実施形態に特に適合する。一実施形態においては、トリプトファナーゼ遺伝子を発現する細胞の種は、エロモナス・ハイドロフィラ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ）、バチルス属種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）、バクテロイデス属種（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｓｐ．）、コリネバクテリウム属種（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）、エンテロバクター・エロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）、エンテロバクター・エロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）ＳＭ－１８、エンテロバクター属種（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）、エルウィニア属種（Ｅｒｗｉｎｉａ
ｓｐ．）、エシェリキア・アウレッセンス（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ａｕｒｅｓｃｅｎｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、フソバクテリウム・ネクロホラム亜種ファンデュリフォルメ（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｅｃｒｏｐｈｏｒｕｍ ｓｕｂｓｐ． Ｆｕｎｄｕｌｉｆｏｒｍｅ）、クライベラ属種（Ｋｌｕｙｖｅｒａ ｓｐ．）、ミクロコッカス・エロゲネス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）、モルガネラ・モルガニー（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ ｍｏｒｇａｎｉｉ）、パエニバチルス・アルベイ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ａｌｖｅｉ）、パラコロバクトラム・コリフォルメ（Ｐａｒａｃｏｌｏｂａｃｔｒｕｍ ｃｏｌｉｆｏｒｍｅ）、パラコロバクトラム属種（Ｐａｒａｃｏｌｏｂａｃｔｒｕｍ ｓｐ．）、パスツレラ属種（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｓｐ．）、フォトバクテリウム・プロファンダム（Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒｏｆｕｎｄｕｍ）、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）、プレボテラ・インターメディア（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ
ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）、プロテウス・ブルガリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ）、プロビデンシア・レットゲリ（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ ｒｅｔｔｇｅｒｉ）、シゲラ・アルカレッセンス（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ａｌｋａｌｅｓｃｅｎｓ）、スフェロフォルス属種（Ｓｐｈａｅｒｏｐｈｏｒｕｓ ｓｐ．）、シムビオバクテリウム・サーモフィラム（Ｓｙｍｂｉｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ）、ビブリオ属種（Ｖｉｂｒｉｏ ｓｐ．）、ならびにヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）およびラット（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）などの哺乳類種からなる群から選択される。
ｓｐ．）、エシェリキア・アウレッセンス（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ａｕｒｅｓｃｅｎｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、フソバクテリウム・ネクロホラム亜種ファンデュリフォルメ（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｅｃｒｏｐｈｏｒｕｍ ｓｕｂｓｐ． Ｆｕｎｄｕｌｉｆｏｒｍｅ）、クライベラ属種（Ｋｌｕｙｖｅｒａ ｓｐ．）、ミクロコッカス・エロゲネス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）、モルガネラ・モルガニー（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ ｍｏｒｇａｎｉｉ）、パエニバチルス・アルベイ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ａｌｖｅｉ）、パラコロバクトラム・コリフォルメ（Ｐａｒａｃｏｌｏｂａｃｔｒｕｍ ｃｏｌｉｆｏｒｍｅ）、パラコロバクトラム属種（Ｐａｒａｃｏｌｏｂａｃｔｒｕｍ ｓｐ．）、パスツレラ属種（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｓｐ．）、フォトバクテリウム・プロファンダム（Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒｏｆｕｎｄｕｍ）、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）、プレボテラ・インターメディア（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ
ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）、プロテウス・ブルガリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ）、プロビデンシア・レットゲリ（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ ｒｅｔｔｇｅｒｉ）、シゲラ・アルカレッセンス（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ａｌｋａｌｅｓｃｅｎｓ）、スフェロフォルス属種（Ｓｐｈａｅｒｏｐｈｏｒｕｓ ｓｐ．）、シムビオバクテリウム・サーモフィラム（Ｓｙｍｂｉｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ）、ビブリオ属種（Ｖｉｂｒｉｏ ｓｐ．）、ならびにヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）およびラット（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）などの哺乳類種からなる群から選択される。
本発明の第１の態様の方法のさらなる実施形態においては、細胞は、ヘムの生合成経路における工程を触媒する酵素をコードする異種または組換え遺伝子、特に異種ｈｅｍＡ（グルタミルｔＲＮＡレダクターゼ）遺伝子をさらに発現する。このような細胞の例は大腸菌である。これにより、ヘム前駆体δ－アミノレブリン酸などの、ＣＹＰヘム合成用の前駆体を供給する必要性が有利に減り、このような細胞におけるステロイドの生体内変換のコストが減る。
本発明の第１の態様の方法の特定の実施形態においては、（ｉ）異種ＣＹＰ２１Ａ２タ
ンパク質またはその機能的バリアント、（ｉｉ）電子をＣＹＰ２１Ａ２に伝達することができる少なくとも１つの異種電子伝達系、および場合により（ｉｉｉ）ＣＹＰ２１Ａ２の折りたたみを促進する１種またはそれ以上のシャペロンをコードする核酸は、細胞、特に細胞のゲノムに組み込まれる１つまたはそれ以上の発現カセットに含まれる。「発現カセット」という用語は、遺伝子発現に必要なプロモーターなどの調節配列に、作動可能に連結した遺伝子を含むＤＮＡ断片を指す。「作動可能に連結した」は、ヌクレオチド領域が近接し、その領域の機能性が保存され、かつ機能単位の一部として他の領域と関連して働くような、特定の遺伝情報をコードするヌクレオチド領域の連結を指す。核酸（ｉ）、（ｉｉ）、および場合により（ｉｉｉ）を、それぞれ個々の発現カセットが含んでもよく、または１つもしくはそれ以上の多シストロン性発現カセットが含んでもよい。本明細書で使用する場合、「多シストロン性」という用語は、複数のシストロン、すなわち複数の核酸または遺伝子が、例えばプロモーターなどの同じ調節配列に、作動可能に連結していることを意味する。
ンパク質またはその機能的バリアント、（ｉｉ）電子をＣＹＰ２１Ａ２に伝達することができる少なくとも１つの異種電子伝達系、および場合により（ｉｉｉ）ＣＹＰ２１Ａ２の折りたたみを促進する１種またはそれ以上のシャペロンをコードする核酸は、細胞、特に細胞のゲノムに組み込まれる１つまたはそれ以上の発現カセットに含まれる。「発現カセット」という用語は、遺伝子発現に必要なプロモーターなどの調節配列に、作動可能に連結した遺伝子を含むＤＮＡ断片を指す。「作動可能に連結した」は、ヌクレオチド領域が近接し、その領域の機能性が保存され、かつ機能単位の一部として他の領域と関連して働くような、特定の遺伝情報をコードするヌクレオチド領域の連結を指す。核酸（ｉ）、（ｉｉ）、および場合により（ｉｉｉ）を、それぞれ個々の発現カセットが含んでもよく、または１つもしくはそれ以上の多シストロン性発現カセットが含んでもよい。本明細書で使用する場合、「多シストロン性」という用語は、複数のシストロン、すなわち複数の核酸または遺伝子が、例えばプロモーターなどの同じ調節配列に、作動可能に連結していることを意味する。
一実施形態においては、（ｉ）異種ＣＹＰ２１Ａ２タンパク質またはその機能的バリアント、（ｉｉ）電子をＣＹＰ２１Ａ２に伝達することができる少なくとも１つの異種電子伝達系、および場合により（ｉｉｉ）ＣＹＰ２１Ａ２の折りたたみを促進する１種またはそれ以上のシャペロンをコードする核酸は、細胞に含まれた発現ベクターに含まれる。「発現ベクター」は媒体であり、この媒体により、タンパク質をコードする核酸を含有するＤＮＡ断片を宿主細胞に導入することができ、宿主細胞では、宿主細胞が核酸を発現することができる。核酸（ｉ）、（ｉｉ）、および場合により（ｉｉｉ）を、それぞれ個々の発現ベクターが含んでもよく、または１つもしくはそれ以上の多シストロン性発現ベクターが含んでもよい。
また、核酸（ｉ）、（ｉｉ）、および場合により（ｉｉｉ）のうちの１つまたはそれ以上を、細胞のゲノムに組み込まれる発現カセットが含んでもよく、残りの核酸（ｉ）、（ｉｉ）、または場合により（ｉｉｉ）を発現ベクターが含み、両方とも上記で述べたとおりである。
第２の態様においては、本発明は、細胞であって、
（ｉ）異種ＣＹＰ２１Ａ２タンパク質またはその機能的バリアント、
（ｉｉ）電子をＣＹＰ２１Ａ２に伝達することができる少なくとも１つの異種電子伝達系、および
（ｉｉｉ）ＣＹＰ２１Ａ２の折りたたみを促進する１種またはそれ以上のシャペロン
を発現する細胞に関する。
（ｉ）異種ＣＹＰ２１Ａ２タンパク質またはその機能的バリアント、
（ｉｉ）電子をＣＹＰ２１Ａ２に伝達することができる少なくとも１つの異種電子伝達系、および
（ｉｉｉ）ＣＹＰ２１Ａ２の折りたたみを促進する１種またはそれ以上のシャペロン
を発現する細胞に関する。
本発明の第１の態様の方法の細胞と同様に、この細胞もまた、
（ｉ）異種ＣＹＰ２１Ａ２タンパク質またはその機能的バリアント、
（ｉｉ）電子をＣＹＰ２１Ａ２に伝達することができる少なくとも１つの異種電子伝達系、および
（ｉｉｉ）ＣＹＰ２１Ａ２の折りたたみを促進する１種またはそれ以上のシャペロン
をコードする１種またはそれ以上の核酸
を含む細胞として記載することができる。
（ｉ）異種ＣＹＰ２１Ａ２タンパク質またはその機能的バリアント、
（ｉｉ）電子をＣＹＰ２１Ａ２に伝達することができる少なくとも１つの異種電子伝達系、および
（ｉｉｉ）ＣＹＰ２１Ａ２の折りたたみを促進する１種またはそれ以上のシャペロン
をコードする１種またはそれ以上の核酸
を含む細胞として記載することができる。
特定の実施形態においては、これらの核酸を、１つまたはそれ以上の発現カセットが含む。
第２の態様の細胞は本質的に、本発明の第１の態様の方法で使用する細胞であり、したがって本発明の第２の態様の細胞のさらなる実施形態は、第１の態様の方法に関して上で説明したとおりである。
第３の態様においては、本発明は、多シストロン性の発現ベクターであって、
（ｉ）ＣＹＰ２１Ａ２タンパク質またはその機能的バリアントをコードする核酸、
（ｉｉ）電子をＣＹＰ２１Ａ２に伝達することができる少なくとも１つの異種電子伝達系をコードする１種またはそれ以上の核酸、および場合により
（ｉｉｉ）ＣＹＰ２１Ａ２の折りたたみを促進するシャペロンをコードする１種またはそれ以上の核酸
を含む、多シストロン性発現ベクターに関する。
（ｉ）ＣＹＰ２１Ａ２タンパク質またはその機能的バリアントをコードする核酸、
（ｉｉ）電子をＣＹＰ２１Ａ２に伝達することができる少なくとも１つの異種電子伝達系をコードする１種またはそれ以上の核酸、および場合により
（ｉｉｉ）ＣＹＰ２１Ａ２の折りたたみを促進するシャペロンをコードする１種またはそれ以上の核酸
を含む、多シストロン性発現ベクターに関する。
第４の態様においては、本発明は、キットであって、
・第２の態様の細胞、
・第３の態様の多シストロン性発現ベクター、または
・（ｉ）ＣＹＰ２１Ａ２タンパク質またはその機能的バリアントをコードする核酸を含む発現ベクター、（ｉｉ）電子をＣＹＰ２１Ａ２に伝達することができる少なくとも１つの異種電子伝達系をコードする１種またはそれ以上の核酸を含む１つまたはそれ以上の発現ベクター、および場合により（ｉｉｉ）ＣＹＰ２１Ａ２の折りたたみを促進するシャペロンをコードする１種またはそれ以上の核酸を含む１つまたはそれ以上の発現ベクター
を含む、キットに関する。
・第２の態様の細胞、
・第３の態様の多シストロン性発現ベクター、または
・（ｉ）ＣＹＰ２１Ａ２タンパク質またはその機能的バリアントをコードする核酸を含む発現ベクター、（ｉｉ）電子をＣＹＰ２１Ａ２に伝達することができる少なくとも１つの異種電子伝達系をコードする１種またはそれ以上の核酸を含む１つまたはそれ以上の発現ベクター、および場合により（ｉｉｉ）ＣＹＰ２１Ａ２の折りたたみを促進するシャペロンをコードする１種またはそれ以上の核酸を含む１つまたはそれ以上の発現ベクター
を含む、キットに関する。
「キット」という用語は、本明細書においては、第１の態様の方法を実施するのに必要な試薬、材料、および説明書のうちの全てまたは一部の集合体を意味する。このキットは、細胞培養培地またはバッファー（乾燥もしくは液体形態の両方）、１種またはそれ以上の細胞透過剤、ステロイド抽出用の溶媒、ならびに、特に、ヒドロキシル化するステロイド、特に３－ケトステロイド、例えばメドラン、デルタメドラン、プロゲステロン、１７ＯＨ－プロゲステロン、メドロキシプロゲステロン、または５α－ジヒドロプロゲステロンのうちの１つまたはそれ以上を含む。さらに、第１の態様の方法に関連して本明細書で説明した全ての試薬または材料は、第４の態様のキットの一部分とすることができることが意図される。
特定の実施形態においては、第１の態様の方法、第２の態様の細胞、第３の態様の発現ベクター、および第４の態様のキットは、適用できる場合は、さらなる工程または成分を含まず、特に異種遺伝子またはタンパク質、特に本明細書で説明したステロイドの２１－ヒドロキシル化に関連しないステロイド変換またはステロイド生成のための異種遺伝子またはタンパク質を含まない。場合により、これの例外は、２１－ヒドロキシル化ステロイドのさらなるプロセシングに関連する下流の工程もしくは成分（プレメドロールからメドロールへの変換など）、または２１－ヒドロキシル化するステロイドの生成に関連する上流の工程または成分（メドランの生成など）としてもよい。
以下の図面および実施例においては、本発明の一部の特定の実施形態をより詳細に説明する。しかし特定の実施形態の詳細によって、本発明を限定することは意図しない。対照的に、本発明は、本明細書の実施形態で明示的に述べられていないが、当業者によって過度の労力なく見出される詳細を含む任意の実施形態に関する。
〔実施例１〕
インビトロヒドロキシル化
１．１ ｈＣＹＰ２１／ｂＣＹＰ２１の発現／精製
ヒトおよびウシＣＹＰ２１の両方が、ステロイドを２１位でヒドロキシル化できることを示すため、両方の酵素を用いたインビトロ研究を行った。例示的な２１－ヒドロキシル化方法として、メドランをプレメドロールに変換した。
インビトロヒドロキシル化
１．１ ｈＣＹＰ２１／ｂＣＹＰ２１の発現／精製
ヒトおよびウシＣＹＰ２１の両方が、ステロイドを２１位でヒドロキシル化できることを示すため、両方の酵素を用いたインビトロ研究を行った。例示的な２１－ヒドロキシル化方法として、メドランをプレメドロールに変換した。
プレメドロール（メチルヒドロコルチゾン）は、有効性の高い医薬品ステロイドのメドロール（メチルプレドニゾロン）の前駆体である。メドロールは、自己免疫疾患、多発性硬化症の療法における重要な薬物であり、一般に炎症の局所治療用および全身治療用である。
両方の酵素を、ベクターｐＧｒｏ１２にコードされた大腸菌シャペロンＧｒｏＥＬ／ＧｒｏＥＳの同時発現により、大腸菌株Ｃ４３（ＤＥ３）において発現させた。これらのシャペロンにより、正確なタンパク質折りたたみが確実に行われ、これはヘム補欠分子族の取込みに重要である。図３において、精製したウシＣＹＰ２１のＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびＣＯ差スペクトルを示している。ＣＯ差スペクトルが示すように、酵素は活性型で精製された。両方のアイソザイムへのメドランの結合を決定するため、結合定数（ＫＤ値）を決定した。
１．２ 電子送達（ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｄｅｌｉｖｅｒｉｎｇ）酸化還元パートナーの発現
効率的な基質変換のため、両方のアイソフォームは、２つの部分からなる電子伝達系を必要とする。その２つの部分は、ヒドロキシル化反応に不可欠な、チトクロムＰ４５０酵素自体と、１種または２種の電子伝達タンパク質とである。これらの伝達タンパク質なしでは反応は起こらない。例えば表２に列挙した６つの電子伝達系が、電子をＣＹＰ２１に伝達することができる。
効率的な基質変換のため、両方のアイソフォームは、２つの部分からなる電子伝達系を必要とする。その２つの部分は、ヒドロキシル化反応に不可欠な、チトクロムＰ４５０酵素自体と、１種または２種の電子伝達タンパク質とである。これらの伝達タンパク質なしでは反応は起こらない。例えば表２に列挙した６つの電子伝達系が、電子をＣＹＰ２１に伝達することができる。
インビトロ研究および基質変換の検証のため、全ての酸化還元パートナーを精製した。
１．３ インビトロでのチトクロムＰ４５０系の再構成
規定したバッファー中で、精製した酵素を用い、かつＮＡＤＰＨ再生系を用いてインビトロ基質変換をすることにより、両方のアイソフォームは、本明細書に列挙した電子伝達タンパク質と共に、非常に効率的にメドランをプレメドロールに変換することができることが明らかとなった。図４には、ヒトＣＹＰ２１と電子伝達系２とによるメドランインビトロ変換を示している。この結果は、ＣＹＰ２１が、例えば表２に示した好適な酸化還元系と共に、プレメドロールによって例示されるステロイドを酵素的に生成することができることを示している。
規定したバッファー中で、精製した酵素を用い、かつＮＡＤＰＨ再生系を用いてインビトロ基質変換をすることにより、両方のアイソフォームは、本明細書に列挙した電子伝達タンパク質と共に、非常に効率的にメドランをプレメドロールに変換することができることが明らかとなった。図４には、ヒトＣＹＰ２１と電子伝達系２とによるメドランインビトロ変換を示している。この結果は、ＣＹＰ２１が、例えば表２に示した好適な酸化還元系と共に、プレメドロールによって例示されるステロイドを酵素的に生成することができることを示している。
〔実施例２〕
全細胞系
ステロイドのインビトロ変換の成功を考慮し、全細胞における生体内変換を開発した。
全細胞系
ステロイドのインビトロ変換の成功を考慮し、全細胞における生体内変換を開発した。
概して、全細胞におけるヒドロキシル化を行うために、大腸菌株Ｃ４３（ＤＥ３）において、ＣＹＰ２１および必要な電子伝達タンパク質を異種発現させた。発現およびその後
の変換のため、プラスミドｐＥＴ１７ｂをベースとする２シストロン性または３シストロン性のベクターを構築した。このベクターが特定のＣＹＰ２１および特定の酸化還元系の遺伝子を運ぶ。図５には、全ての構築したベクターを示している。正確なタンパク質折りたたみを促進するため、大腸菌シャペロンＧｒｏＥＬおよびＧｒｏＥＳを第２のベクターで同時発現させた。形質転換した大腸菌細胞は、ＣＹＰ２１酵素および必要とされる酸化還元パートナーを生成することができた。タンパク質の発現後、ヒドロキシル化するステロイド（メドランによって例示される）を基質として添加することによって開始した基質変換が起こった。
の変換のため、プラスミドｐＥＴ１７ｂをベースとする２シストロン性または３シストロン性のベクターを構築した。このベクターが特定のＣＹＰ２１および特定の酸化還元系の遺伝子を運ぶ。図５には、全ての構築したベクターを示している。正確なタンパク質折りたたみを促進するため、大腸菌シャペロンＧｒｏＥＬおよびＧｒｏＥＳを第２のベクターで同時発現させた。形質転換した大腸菌細胞は、ＣＹＰ２１酵素および必要とされる酸化還元パートナーを生成することができた。タンパク質の発現後、ヒドロキシル化するステロイド（メドランによって例示される）を基質として添加することによって開始した基質変換が起こった。
特に、全細胞生体触媒作用のためのベクター（例えば、ｐ２１ｂ＿ＡｒＥＴ）、およびシャペロンＧｒｏＥＬ／ＧｒｏＥＳをコードするｐＧｒｏ１２で、大腸菌株Ｃ４３（ＤＥ３）を形質転換した。培養物は、２Ｌ三角フラスコ中で、種培養２ｍＬを播種したＴＢ培地２００ｍＬ（＋抗生物質アンピシリンおよびカナマイシン）を含んだ。この培養物を３７℃で増殖させた。ＯＤ０．５にて、１ｍＭ ＩＰＴＧ、１ｍＭ δ－アミノレブリン酸、４ｍｇ／ｍＬアラビノースを添加することにより発現を誘導し、２７℃で２８時間維持した。全細胞生体内変換のため、遠心分離によって細胞を収集し、５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．４）で洗浄した。基質変換は、３００ｍＬのバッフル付きフラスコ中の２％グリセリン、１ｍＭ ＩＰＴＧ、１ｍＭ δ－アミノレブリン酸、４ｍｇ／ｍＬアラビノースを含むリン酸カリウムバッファー（５０ｍＭ）２５ｍＬに、静止細胞と共に４００μＭの基質を添加して開始し、細胞密度約２４ｇ／Ｌ（湿重量）で２４時間行った。例えば２４時間後に試料を取り、クロロホルムを用いてステロイドを抽出後、ＲＰ－ＨＰＬＣによって測定を行った。
図６では、ステロイドがその２１－ヒドロキシル化誘導体に変換されたこと、また化学合成とは対照的に、副生成物の出現は観測されなかったことが示されている。６つの酸化還元系を有する全細胞において、各ＣＹＰ２１アイソフォームに対し生成物形成の時間依存性を検討して、終点収率だけでなく、バイオテクノロジー方法に関して非常に興味深い反応速度も決定した（図７）。
メドランからプレメドロールへの変換に次いで、ヒトおよびウシＣＹＰ２１の両方は、試験した全ての、２１位がまだヒドロキシル化されていない３－ケトステロイドをヒドロキシル化することができた。特に、以下のステロイド変換を示すことができた。
・メドランからプレメドロール（非天然基質）
・デルタメドランからメドロール（非天然基質）
・プロゲステロンから１１－デオキシコルチコステロン（天然基質）
・１７ＯＨ－プロゲステロンから１１－デオキシコルチゾール（天然基質）
・メドロキシプロゲステロンから２１ＯＨ－メドロキシプロゲステロン（非天然基質）
・５α－ジヒドロプロゲステロンから２１ＯＨ－（５α－ジヒドロプロゲステロン）
・メドランからプレメドロール（非天然基質）
・デルタメドランからメドロール（非天然基質）
・プロゲステロンから１１－デオキシコルチコステロン（天然基質）
・１７ＯＨ－プロゲステロンから１１－デオキシコルチゾール（天然基質）
・メドロキシプロゲステロンから２１ＯＨ－メドロキシプロゲステロン（非天然基質）
・５α－ジヒドロプロゲステロンから２１ＯＨ－（５α－ジヒドロプロゲステロン）
Claims (20)
- ステロイドの炭素原子２１をヒドロキシル化する方法であって、
ａ）（ｉ）異種哺乳類ＣＹＰ２１Ａ２タンパク質、または、無改変の異種哺乳類ＣＹＰ２１Ａ２タンパク質のステロイドを２１－ヒドロキシル化する能力の少なくとも２０％を有するその機能的バリアント、
（ｉｉ）電子をＣＹＰ２１Ａ２に伝達することができる少なくとも１つの異種電子伝達系、および
（ｉｉｉ）ＣＹＰ２１Ａ２の折りたたみを促進する１種またはそれ以上のシャペロン
を発現する原核細胞を用意する工程；ならびに
ｂ）該細胞にステロイドを添加する工程
を含む、前記方法。 - 細胞の上清から２１－ヒドロキシル化ステロイドを抽出する工程ｃ）をさらに含む、請求項１に記載の方法。
- 工程ｂ）の後に、細胞に１種またはそれ以上の細胞透過剤を添加することをさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
- ステロイドは３－ケトステロイドである、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
- ３－ケトステロイドは、メドラン、デルタメドラン、プロゲステロン、１７ＯＨ－プロゲステロン、メドロキシプロゲステロン、および５－α－ジヒドロプロゲステロンからなる群から選択される、請求項４に記載の方法。
- 細胞は静止細胞である、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
- 細胞は大腸菌細胞である、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
- 少なくとも１つの電子伝達系は、
（ｉ）ＣＹＰ２１Ａ２レダクターゼ、ならびに／または
（ｉｉ）フェレドキシンレダクターゼおよびフェレドキシン
を含む、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。 - フェレドキシンレダクターゼが、ＮＡＤＰＨ依存性フェレドキシンレダクターゼである、請求項８に記載の方法。
- １種またはそれ以上のシャペロンは組換えで発現されたシャペロンである、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。
- 少なくとも１つのトリプトファナーゼ遺伝子の発現は細胞において低減または消失している、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。
- 細胞は、ヘムの生合成経路における工程を触媒する酵素をコードする異種遺伝子をさらに発現する、請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法。
- 異種遺伝子がｈｅｍＡ遺伝子である、請求項１２に記載の方法。
- （ｉ）、（ｉｉ）をコードする遺伝子または（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）をコードする遺伝子は、細胞のゲノムに組み込まれる１つまたはそれ以上の発現カセットに含まれる、請求項１～１３のいずれか１項に記載の方法。
- 原核細胞であって、
（ｉ）異種哺乳類ＣＹＰ２１Ａ２タンパク質、または、無改変の異種哺乳類ＣＹＰ２１Ａ２タンパク質のステロイドを２１－ヒドロキシル化する能力の少なくとも２０％を有するその機能的バリアント、
（ｉｉ）電子をＣＹＰ２１Ａ２に伝達することができる少なくとも１つの異種電子伝達系、および
（ｉｉｉ）ＣＹＰ２１Ａ２の折りたたみを促進する１種またはそれ以上のシャペロン
を発現する前記細胞。 - 大腸菌細胞である、請求項１５に記載の原核細胞。
- 請求項１５または１６に記載の原核細胞を含むキット。
- 原核細胞内でのステロイドの炭素原子２１のヒドロキシル化のための、
（ｉ）哺乳類ＣＹＰ２１Ａ２タンパク質、または、無改変の異種哺乳類ＣＹＰ２１Ａ２タンパク質のステロイドを２１－ヒドロキシル化する能力の少なくとも２０％を有するその機能的バリアントをコードする核酸、および（ｉｉ）電子をＣＹＰ２１Ａ２に伝達することができる少なくとも１つの異種電子伝達系をコードする１種またはそれ以上の核酸、を含む多シストロン性発現ベクターの使用。 - 多シストロン性発現ベクターが、（ｉｉｉ）ＣＹＰ２１Ａ２の折りたたみを促進するシャペロンをコードする１種またはそれ以上の核酸、をさらに含む、請求項１８に記載の使用。
- 原核細胞が大腸菌細胞である、請求項１８または１９に記載の使用。
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