TWI701336B

TWI701336B - 類固醇之２１－羥基化

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Publication number: TWI701336B
Application number: TW104135343A
Authority: TW
Inventors: 克勞斯拉特曼; 湯瑪斯施蒂爾格; 貝恩德亞諾哈; 漢斯福爾克羅斯爾; 賽巴斯蒂安里斯曼; 可西蒙娜安德爾; 瑞塔伯恩哈特; 弗蘭克漢那曼
Original assignee: 法商賽諾菲公司
Priority date: 2014-10-30
Filing date: 2015-10-28
Publication date: 2020-08-11
Also published as: US11608514B2; IL251978A0; US10385376B2; IL285700A; JP7364611B2; SG11201703444SA; ES2898465T3; CY1125282T1; JP2021097709A; IL275237B; CN114540453A; US20220228189A1; TWI816043B; JP2017532057A; CN108138215A; DK3212800T3; TW202300653A; IL275237A; WO2016066738A1; EP3957739A1

Abstract

大體而言，本發明涉及類固醇羥化領域。更具體而言，本發明涉及用於在細胞中對類固醇進行21-羥化的方法。還涉及表現類固醇21-羥基化酶(steroid 21-hydroxylating enzyme)或類固醇21-羥化酶(steroid 21-hydroxylase)的細胞、包含編碼類固醇21-羥化酶的核酸的表現載體和用於實施在細胞中對類固醇進行21-羥化的方法的套組。

Description

類固醇之21-羥基化

合成糖皮質激素是衍生自天然存在的應激激素皮質醇，並且因為它們的抗炎和免疫抑制作用而在製藥工業中扮演至關重要的角色。另外，合成分子經常發揮比皮質醇更有效的作用。

目前，一些藥學活性類固醇的合成牽涉它們的前體的21-羥化(例如參見圖1)，其由長時間化學多步合成組成。藉由合成化學，這種羥化仍然困難，因為化學氧化劑對位置21不具選擇性。出於這一理由，必須要保護其他官能團以避免它們的氧化，並使羥化反應針對位置21進行。另外，因為使用了如碘等試劑，合成對環境不友善。因此，對於廉價的藥學活性類固醇且可持續的生產是高度期望的，以滿足對這些重要藥物的高需求。

這個問題已經由本發明的發明人通過開發在一步合成中通過酶CYP21A2進行類固醇的完整細胞生物轉化而得到瞭解決，CYP21A2 是細胞色素P450單加氧酶蛋白(monooxygenases)家族成員，且能夠在類固醇骨架的21-位進行高度選擇性的類固醇羥化(所述方法的方案參見圖2)。CYP21A2是哺乳動物膜錨定酶，其位於內質網中並且在類固醇激素生物合成中發揮關鍵作用。發明人已經證明本發明的生物催化系統是充滿前景的候選者，可取代已經確立的化學合成。具體來說，他們證明瞭類固醇能夠在一個單一的羥化步驟中得到修飾，產生一個理想的產物，這是省時、對環境友好(未觀察到副產物)並且便於下游加工。此外，有利的是，就本發明在完整細胞中類固醇的生產而言，酶不必經過純化，在宿主中保持穩定，也不必要添加昂貴的氧化還原當量(redox equivalent)如NADPH，因為細胞自身即充當供體。

在下文詳細描述本發明之前，應理解的是本發明不限於此處記載的特定的方法學、方案和試劑，因為這些可以變化。還應理解，此處使用的術語學僅出於描述特定實施例的目的，而非意圖限制本發明的範圍，本發明的範圍將由所附申請專利範圍進行限定。除非另行定義，此處使用的全部技術和科學術語與本領域普通技術人員所通常理解的含義相同。

優選地，此處使用的術語如「A multilingual glossary of biotechnological terms：(IUPAC Recommendations)」,Leuenberger,H.G.W,Nagel,B.和Kölbl,H.編(1995),Helvetica Chimica Acta,CH-4010 Basel,Switzerland)中所述進行定義。

本說明書本文引用了數篇文件。本文引用的每一篇文件(包括全部專利、專利申請、科學出版物、製造商的說明書、指導等)，無論是在前文還是在後文中，均以其整體併入作為參考。不應將本文的任何內容理解成承認本發明無權因為在先發明而先於這些公開內容。

在下文中，將描述本發明的元素。這些元素隨著具體實施例列出，然而，應該理解的是它們可以以任意方式和任意數量組合以創造出其他具體實施例。以多種方式描述的實例和優選具體實施例不應理解成將本發明僅限定為明確記載的具體實施例。應將此說明書理解為支持並囊括將明確記載的具體實施例與任意數量的公開的和/或優選的元素組合得到的具體實施例。另外，在本申請中所有描述的元素的排列組合應被認為由本申請的說明書揭示，除非上下文另有說明。

在本說明書和隨後的申請專利範圍的全文中，除非上下文另有要求，詞語「包含」和其變化，如「包括」和「含有」應理解為暗示包括所述整數或步驟或整數或步驟的集合，但不排除任何其它整數或步驟或整數或步驟的集合。如本說明書和所附請求項中所使用的，單數形式的「一」、「一種」和「所述」包括複數的指稱，除非上下文另有明確指示。

在第一方面，本發明涉及用於羥化類固醇的碳原子21的方法，包括以下步驟：a)提供細胞，所述細胞表現(i)異源CYP21A2蛋白或其功能性變體，(ii)至少一種能夠將電子轉移至CYP21A2的異源電子轉移系統，和(iii)一種或多種促進CYP21A2折疊的分子伴侶(chaperone)；和b)將類固醇添加至所述細胞。

類固醇是一類有機化合物，其含有特徵性排列的彼此結合的四個環烷烴環(下文所示)。類固醇的核心由鍵合在一起的十七個碳原子構成，採取四個稠合環的形式：三個環己烷環(稱為環A、B和C)和一個環戊烷環(D環)。類固醇的變化在於與這四個環核心附接的官能團和環的氧化狀態。

類固醇的碳原子21的羥化是在如上文顯示的ABCD類固醇環體系中所示的位置21添加-OH基團。碳原子的編號是根據IUPAC(國際純粹與應用化學聯合會)認可的環編碼和原子編號方式。類固醇的21-羥化如圖1中所示。

在本發明第一方面的方法的特定實施例中，類固醇是3-酮類固醇。更具體而言，類固醇是非天然類固醇，即不在未經遺傳改變的細胞，尤其是人或牛細胞中產生和/或21-羥化的類固醇。

在一個具體實施例中，類固醇選自下組：medrane(美得能)、deltamedrane、孕酮、17OH-孕酮、甲羥孕酮(medroxyprogesterone)和5-α-二氫-孕酮。21-羥化將這些特定的類固醇分別轉化成premedrol、medrol、11-脫氧皮質酮、11-脫氧皮質醇、21OH-甲羥孕酮和21OH-(5α-二氫孕酮)。在一個特定的具體實施例中，其中類固醇是非天然類固醇，所述類固醇選自下組：medrane、deltamedrane、甲羥孕酮和5-α-二氫-孕酮。

具體而言，所述細胞是培養的細胞，培養在任何培養基中，例如生長培養基中，並且在特定的具體實施例中，處於休眠狀態(resting state)。根據這個具體實施例，所述細胞包含在能夠維持所述細胞的緩衝液或培養基中而非生長培養基中。緩衝液的組成依據特定的細胞，而合適的緩衝液是本領域公知的。依據細胞類型，所述細胞是懸浮細胞或貼壁細胞。懸浮細胞是可天然生活在懸浮液中(即不與表面附著)的細胞，或是經過修飾從而能夠在懸浮培養物中生存的細胞，例如生長至比貼壁狀態下所能允許的更高的密度。貼壁細胞是需要表面如組織培養塑膠或微載體的細胞，所述表面可塗覆有胞外基質(如膠原蛋白和層粘連蛋白)組分以增加貼附性質並提供生長和分化所需的其他信號。在一個具體實施例中，貼壁細胞是單層細胞。

通常而言，細胞可為原核細胞或真核細胞。在第一方面的方法中使用的原核細胞的特定實例是大腸桿菌細胞，例如實施例的大腸桿菌菌株C43(DE3)的大腸桿菌細胞。真核細胞的特定實例是酵母細胞，例如，釀酒酵母(S.cerevisae)細胞或粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)細胞。然而，第一方面的方法不限於任何特定細胞類型並且可使用任何細胞類型，特別是能夠在培養中生長並維持以及能夠用作重組表現系統的任何細胞類型，如除了上述細胞之外的昆蟲細胞或哺乳動物細胞。

術語「異源」意指在正常情況下(即沒有人為干預下)於不表現某種蛋白質的細胞中表現所述蛋白質。例如，CYP21A2是一種也稱作21-羥化酶的酶，其為細胞色素P450酶家族的一部分。細胞色素P450酶參與了機體內的許多過程，如輔助分解藥物的反應和幫助產生膽固醇、某些激素和脂肪(脂質)。21-羥化酶發現於腎上腺中，腎上腺位於腎的頂部並且產生調節機體內許多基本功能的多種激素。因此，關於異源表現，對於不是腎上腺細胞的任何細胞而言CYP21A2蛋白均可被認為是異源的。

具體而言，術語「異源」也可指相較於在其中進行表現特別是重組表現的細胞而言某個蛋白質或基因所來源的物種。異源蛋白則是源自與在其中進行表現的細胞(即本發明第一方面的方法的細胞)不同的物種的蛋白質。例如，本發明人在大腸桿菌細胞中表現了哺乳動物具體而言人或牛的蛋白質，使得這些蛋白質相對於所述細胞是異源的。

在本發明第一方面的方法的特定具體實施例中，CYP21A2蛋白是人或牛來源的。人CYP21A2(UniProt登錄號P08686)具有根據序列表的SEQ ID NO：1的序列。牛CYP21A2(UniProt登錄號P00191)具有根據序列表的SEQ ID NO：2的序列。還參見圖8。然而，同源基因也存在於其他哺乳動物物種中，如Canis lupus(狗)、Macaca mulata(恒河猴)、Rattus norvegicus(大鼠)、Gallus gallus(雞)、Danio rerio(斑馬魚)、Mus musculus(小鼠)或Pan troglodytes(黑猩猩)。因此，需強調可使用任何CYP21A2蛋白，特別是任何哺乳動物CYP21A2蛋白。也可使用分別根據SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的修飾的人或牛CYP21A2。同樣參見圖8。

術語「功能性變體」是具有未改變的或CYP21A2蛋白對類固醇進行21-羥化的能力的至少20%(例如，至少：20%；30%；40%；50%；60%；70%；80%；90%；95%；98%；99%；99.5%；或100%或者甚至更多)的蛋白質變體。這種能力能夠由技術人員在無需過度實驗的情況下使用例如本文實施例1和2中所示的方法來確定。

「蛋白變體」是具有與其所來源的CYP21A2的胺基酸序列至少70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列的蛋白質，其所來源的CYP21A2的胺基酸序列例如是SEQ ID NO：1或3(在人CYP21A2的情況下)或SEQ ID NO：2或4(在牛CYP21A2的情況下)。兩條序列之間百分比同一性的確定使用Karlin和Altschul,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90,5873-5877,1993的數學演算法來完成。將這樣的演算法併入Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215,403-410的BLASTN和BLASTP程式。為了獲得用於比較目的的空位比對(gapped alignment)，如Altschul等(1997)Nucleic Acids Res.25,3389-3402中所述利用Gapped BLAST。當利用BLAST和Gapped BLAST程式時，使用各個程式的缺省參數。

或者，蛋白變體也可限定為具有多至100、90、80、70、60、50、40、30、20、10、5、4、3、2或1個胺基酸取代，特別是保守胺基酸取代。保守取代表是本領域熟知的(參見例如Creighton(1984)Proteins.W.H.Freeman and Company)。胺基酸的物理和化學性質的概覽提供在下表1中。在特定的具體實施例中，保守取代是用根據表1具有相同性質的胺基酸進行的取代。

術語「變體」也包括蛋白質片段。CYP21A2的片段具有多至總共100、90、80、70、60、50、40、30、20、10、5、4、3、2或1個胺基酸的N-末端和/或C-末端缺失。在特定的實施例中，所述功能性變體是缺乏疏水錨定區域(即29個N-末端胺基酸殘基截短)的CYP21A2片段(圖8)。

此外，可修飾CYP21A2蛋白，例如通過N-末端或C-末端胺基酸添加，如標簽或N-末端修飾，以提供改進的細菌表現。例如，標簽可為C-末端His標簽，例如6 x His標簽和N-末端修飾，從CYP2C3的N-末端添加10個胺基酸(參見圖8和SEQ ID Nos 3和4)。

電子轉移系統是藉由氧化還原反應將電子從電子供體轉移至電子受體的一系列化合物。術語「能夠將電子轉移至CYP21A2」因此意指CYP21A2是這個系列的電子受體。本文的術語「系列(series)」可包括CYP21A2，並且因此所述電子轉移系統在CYP21A2之外可以僅由一個蛋白質組成。就本發明第一方面的方法而言，只要所述系統能夠將電子轉移至CYP21A2，所述電子轉移系統由哪些成員組成並非關鍵。合適的系統是本領域熟知的。在本發明第一方面的方法的特定實施例中，所述至少一個電子轉移系統包含(i)CYP21A2還原酶，或(ii)鐵氧還蛋白還原酶，優選NADPH依賴性鐵氧還蛋白還原酶(皮質鐵氧還蛋白還原酶(adrenodoxin reductase))和鐵氧還蛋白。例如，所述至少一個電子轉移蛋白可選自下組：NADPH依賴性細胞色素P450還原酶(CPR，例如人或牛的)，皮質鐵氧還蛋白還原酶(AdR，例如人或牛的)和皮質鐵氧還蛋白(Adx4-108，例如人或牛的)的組合，黃素氧還蛋白還原酶(Fpr，例如來自大腸桿菌)和皮質鐵氧還蛋白(Adx4-108，例如人或牛的)的組合，皮質鐵氧還蛋白還原酶同源物(homolog)(Arh)例如粟酒裂殖酵母(S.pombe)皮質鐵氧還蛋白還原酶同源物(Arh1)和皮質鐵氧還蛋白(Adx4-108，例如人或牛)的組合，皮質鐵氧還蛋白還原酶同源物(Arh)例如粟酒裂殖酵母皮質鐵氧還蛋白還原酶同源物(Arh1)和電子轉移結構域的鐵氧還蛋白結構域(etp^fd)例如粟酒裂殖酵母電子轉移結構域的鐵氧還蛋白結構域(etp1^fd)的組合，以及黃素氧還蛋白還原酶(Fpr，例如來自大腸桿菌)和電子轉移結構域的鐵氧還蛋白結構域(etp^fd)例如粟酒裂殖酵母電子轉移結構域的鐵氧還蛋白結構域(etp1^fd)的組合。

在特定的具體實施例中，不向細胞添加外源NADPH。在此具體實施例中，NADPH由細胞產生。在具體的實施例中，細胞中的NADPH產生可通過重組手段提高，例如異源表現NADPH產生中牽涉的酶(例如葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PD)、磷酸葡糖酸脫氫酶(PGD)、蘋果酸脫氫酶(MDH)和/或異檸檬酸脫氫酶(ICDH)中的一種或多種)，和/或其可通過提供激素信號來提高，即添加提高內源NADPH產生水平的激素如雌二醇。

類似地，分子伴侶可為任何分子伴侶，只要其能夠促進CYP21A2的折疊。本發明人發現本發明第一方面的方法能夠僅依賴於內源分子伴侶，即不必要額外表現合適的分子伴侶。然而，額外表現改善細胞中功能性CYP21A2的產生，並且因此可以是有益的。因此，在本發明第一方面的方法的一個實施例中，所述一種或多種分子伴侶是重組表現的分子伴侶。具體而言，一種或多種分子伴侶可以是異源分子伴侶。例示性分子伴侶是大腸桿菌分子伴侶GroEL和GroES或其他分子伴侶如DnaK、DnaJ、GrpE和ClpB以及小熱激蛋白(sHSP)如IbpA和IbpB(IbpAB)。

任選地，要在細胞中表現的相同的分子伴侶或一種或多種額外分子伴侶能夠折疊上述電子轉移蛋白中的一種或多種。

重組表現指重組基因的表現。這樣的基因可以是任何通過遺傳工程方法引入細胞的基因，並且通常是異源基因和/或在表現方面與可能的內源對應物基因以不同方式調節的基因。在一個實施例中，重組表現是可誘導的。

在本發明第一方面的方法的一個實施例中，所述方法進一步包括向細胞的懸浮物添加一種或多種細胞透化劑，例如在步驟b)之後。細胞透化劑是增加膜滲透性的試劑。實例是有機溶劑，如甲醇、丙酮或DMSO，洗滌劑如皂角苷、Triton X-100或Tween-20和EDTA。具體而言，多粘菌素B(polymyxin B)可用作細胞透化劑。這種試劑被證明在本發明的方法中運作得特別良好。

在本發明第一方面的方法中的另一個實施例中，所述方法進一步包括從細胞和/或細胞的上清液(即細胞包含於其中的緩衝液或培養基)，例如從完整細胞懸浮物，提取21-羥化類固醇的步驟c)。提取可使用本領域已知用於提取未溶解化合物的任何溶劑或提取方法進行。例如，可使用溶劑如1-丁醇、2-丁酮或氯仿。

在本發明第一方面的方法的具體實施例中，至少一種色胺酸酶基因的表現在細胞中是降低的或廢除的。色胺酸酶或L-色胺酸吲哚裂合酶(EC號4.1.99.1.)是催化L-色胺酸+H₂O=吲哚+丙酮酸+NH₃反應的酶。因此，降低或廢除會導致細胞的吲哚產生減少，其能夠促進所述方法，因為吲哚是CYP酶如CYP21A2的抑制劑。由於色胺酸酶基因通常(但並非僅僅)存在於原核生物中，例如，大腸桿菌中，這種具體實施例特別應用於其中細胞是原核細胞的本發明第一方面的方法的實施例中。在一個實施例中，表現色胺酸酶基因的細胞的物種選自下組：嗜水氣單孢菌(Aeromonas hydrophila)、芽孢桿菌屬菌種(Bacillus sp.)、擬桿菌屬菌種(Bacteroides sp.)、棒狀桿菌屬菌種(Corynebacterium sp.)、產氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes)、產氣腸桿菌SM-18、腸細菌屬菌種(Enterobacter sp.)、歐文氏菌屬菌種(Erwinia sp.)、金色埃希氏菌(Escherichia aurescens)、大腸桿菌(Escherichia coli)、壞死梭桿菌Funduliforme亞種(Fusobacterium necrophorum subsp.Funduliforme)、克魯維酵母屬菌種(Kluyvera sp.)、產氣微球菌(Micrococcus aerogenes)、摩氏摩根菌(Morganella morganii)、蜂房類芽孢桿菌(Paenibacillus alvei)、Paracolobactrum coliforme、副大腸菌屬菌種(Paracolobactrum sp.)、巴斯德菌屬菌種(Pasteurella sp.)、深海發光桿菌(Photobacterium profundum)、牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonas gingivalis)、中間普氏菌(Prevotella intermedia)、普通變形桿菌(Proteus vulgaris)、雷氏普羅威登斯菌(Providencia rettgeri)、鹼性志賀氏菌(Shigella alkalescens)、球狀菌屬菌種(Sphaerophorus sp.)、嗜熱共生小桿菌(Symbiobacterium thermophilum)、弧菌屬菌種(Vibrio sp.)和哺乳動物物種如人(Homo sapiens)和褐家鼠(Rattus norvegicus)。

在本發明第一方面的方法的進一步實施例中，細胞進一步表現編碼催化血紅素生物合成途徑中的步驟的酶的異源或重組基因，特別是異源hemA(穀胺醯tRNA還原酶)基因。這樣的細胞的一個實例是大腸桿菌。這會有利地降低補入CYP血紅素合成的前體如血紅素前體δ-胺基乙醯丙酸(δ-aminolevulinic acid)的需要，並降低這些細胞中類固醇的生物轉化的成本。

在本發明第一方面的方法的特定實施例中，將編碼(i)異源CYP21A2蛋白或其功能性變體、(ii)至少一種能夠將電子轉移至CYP21A2的異源電子轉移系統，和任選的(iii)一種或多種促進CYP21A2折疊的分子伴侶的核酸包含在一個或多個表現盒(expression cassette)中，所述一個或多個表現盒整合至細胞中，特別是整合至其基因組中。術語「表現盒」指包含與基因表現所必需的調節序列如啟動子可操作地連接的基因的DNA片段。「可操作地連接」指編碼特定遺傳資訊的核苷酸區的連接，從而使這些核苷酸區是連續的，區的功能性得到保留並且將相對於其他區作為功能單元的一部分表現功能。核酸(i)、(ii)和任選的(iii)可各自包含在單獨的表現盒中或包含在一個或多個多順反子表現盒中。如本文所述，術語「多順反子(multicistronic)」意指多個順反子，亦即，多個核酸或基因，其可操作地連接於同一調節序列，例如啟動子。

在一個具體實施例中，將編碼(i)異源CYP21A2蛋白或其功能性變體、(ii)至少一種能夠將電子轉移至CYP21A2的異源電子轉移系統，和任選的(iii)一種或多種促進CYP21A2折疊的分子伴侶的核酸包含在細胞中所包含的表現載體中。「表現載體」是一種運載體，借助它能夠將含有編碼蛋白質的核酸的DNA片段引入宿主細胞，在該宿主細胞中所述核酸能夠通過該宿主細胞表現。核酸(i)、(ii)和任選的(iii)可各自包含在單獨的表現載體中或包含在一個或多個多順反子表現載體中。

另外，核酸(i)、(ii)和任選的(iii)中的一種或多種可包含在整合入細胞基因組中的表現盒中，而其餘的核酸(i)、(ii)和任選的(iii)包含在表現載體中，二者均如上文所示。

在第二方面，本發明涉及細胞，其表現(i)異源CYP21A2蛋白或其功能性變體，(ii)至少一種能夠將電子轉移至CYP21A2的異源電子轉移系統，和(iii)一種或多種促進CYP21A2折疊的分子伴侶。

這種細胞以及本發明第一方面的方法中的細胞也可被描述成包含一種或多種核酸的細胞，所述一種或多種核酸編碼(i)異源CYP21A2蛋白或其功能性變體，(ii)至少一種能夠將電子轉移至CYP21A2的異源電子轉移系統，和(iii)一種或多種促進CYP21A2折疊的分子伴侶。

在特定的具體實施例中，這些核酸包含在一個或多個表現盒中。

第二方面的細胞本質上是本發明第一方面的方法中使用的細胞，並且因此，本發明第二方面的細胞的進一步的具體實施例如上文關於第一方面的方法所述。

在協力廠商面，本發明涉及多順反子表現載體，其包含(i)編碼CYP21A2蛋白或其功能性變體的核酸，(ii)編碼至少一種能夠將電子轉移至CYP21A2的異源電子轉移系統的一種或多種核酸，和任選的(iii)編碼促進CYP21A2折疊的分子伴侶的一種或多種核酸。

在第四方面，本發明涉及套組，其包含- 第二方面的細胞，- 協力廠商面的多順反子表現載體，或- (i)包含編碼CYP21A2蛋白或其功能性變體的核酸的表現載體，(ii)包含編碼至少一種能夠將電子轉移至CYP21A2的異源電子轉移系統的一種或多種核酸的一種或多種表現載體，和任選的(iii)包含編碼促進CYP21A2折疊的分子伴侶的一種或多種核酸的一種或多種表現載體。

術語「套組」用於本文意指實施第一方面的方法所必需的試劑、材料和說明中的全部或一些的集合。這包括細胞培養基或緩衝液(均為乾燥或液體形式)、一種或多種細胞透化劑、用於提取類固醇的溶劑和特別是有待羥化的類固醇，特別是3-酮類固醇，例如，medrane、deltamedrane、孕酮、17OH-孕酮、甲羥孕酮或5-α-二氫-孕酮中的一種或多種。另外，設想本文描述的與第一方面的方法有關的全部試劑或材料可以是第四方面的套組的一部分。

在一個特定的具體實施例中，第一方面的方法、第二方面的細胞、協力廠商面的表現載體和第四方面的套組不包含可應用於與類固醇的21-羥化(特別是如本文所述的)無關的類固醇轉化或產生的其他步驟或組分，尤其是異源基因或蛋白質。任選地，這一點的例外可為與21-羥化類固醇的進一步加工(如從premedrol轉化成medrol)相關的下游步驟或組分，或與有待21-羥化的類固醇的產生(如medrane的產生)相關的上游步驟或組分。

在以下的附圖和實施例中更詳細地描述本發明的一些特定具體實施例。然而，絕不意圖通過該等特定具體實施例的細節來限制本發明。相反，本發明涉及包含雖然沒有在本文的實施例中明確提及、但是技術人員無需過度努力便可發現的細節的任何具體實施例。

圖1：在碳原子21處羥化類固醇(此處為孕酮)。

圖2：通過CYP21A2進行的類固醇的完整細胞生物轉化方案以及大腸桿菌中需要的電子轉移蛋白。

圖3：左圖：純化牛CYP21的CO示差譜；右圖：在所示純化步驟(IMAC/DEAE/SP)之後取得的bCYP21樣品的SDS-PAGE。

圖4：通過人CYP21和描述的電子轉移蛋白(此處為AdR和Adx)(系統2)將medrane體外21-羥化為premedrol的HPLC色譜。

圖5：為使用人或牛CYP21以不同電子轉移蛋白進行完整細胞生物轉化所構建的載體。

圖6：通過牛CYP21和描述的電子轉移蛋白(此處為Fpr和Adx)進行的完整細胞21-羥化medrane成為premedrol(A)、δ-medrane成為medrol(B)、甲羥孕酮成為21OH-甲羥孕酮(C)和17OH-孕酮成為11-脫氧皮質醇(D)的HPLC色譜。

圖7：通過牛CYP21和描述的電子轉移蛋白(此處為Fpr和Adx)進行的medrane成為premedrol的時間依賴性完整細胞轉化。

圖8：野生型和修飾的人(A)和牛(B)CYP21A2的胺基酸序列。

實施例的描述：實施例1：體外羥化 1.1 hCYP21/bCYP21的表現/純化

為了顯示人和牛CYP21均能在21位羥化類固醇，用兩種酶進行了體外研究。作為例示性21-羥化方法，將medrane轉化為premedrol：

Premedrol(甲基氫化可的松(methylhydrocortisone))是高度有效的藥用類固醇medrol(甲潑尼龍(methylprednisolone))的前體。Medrol是一種在自身免疫病、多發性硬化和概括而言用於局部和系統性治療炎症的治療中的重要藥物。

兩種酶均在大腸桿菌菌株C43(DE3)中通過共表現載體pGro12中編碼的大腸桿菌分子伴侶GroEL/GroES進行表現。這些分子伴侶確保了正確的蛋白質折疊，這對於併入血紅素修補基團(prosthetic group)而言是重要的。在圖3中，顯示了純化的牛CYP21的SDS-PAGE和CO示差譜。如CO示差譜顯示，酶以活性形式純化。為了測定medrane與兩種同工酶的結合，測定了結合常數(K_D值)。

1.2 電子遞送氧化還原配偶體(redox partners)的表現

為了有效的基質轉化，兩個同種型(isoform)都需要電子轉移系統，所述電子轉移系統由兩個部分組成，細胞色素P450酶本身和一種或兩種對於羥化反應而言關鍵的電子轉移蛋白。沒有這些轉移蛋白，不會發生反應。例如，電子能夠通過表2中所列的六種電子轉移系統轉移至CYP21：表2：CYP-21依賴性基質轉化中應用的電子遞送蛋白和用於完整細胞系統的對應表現質粒。將hCYP21或bCYP21與指明的氧化還原配偶體bCPR(牛NADPH依賴性細胞色素P450還原酶)、bAdR(牛皮質鐵氧還蛋白還原酶)、bAdx_4-108(牛皮質鐵氧還蛋白)、Fpr(大腸桿菌黃素氧還蛋白還原酶)、Arh1(粟酒裂殖酵母皮質鐵氧還蛋白還原酶同源物)、etp1^fd(粟酒裂殖酵母電子轉移蛋白，鐵氧還蛋白結構域)組合在重構系統(reconstituted system)或完整細胞系統中。

對於體外研究和基質轉化的驗證，全部氧化還原配偶體均為純化的。

1.3 細胞色素P450系統的體外重構

使用純化的酶在限定的緩衝液中並且使用NADPH再生系統進行的體外基質轉化揭示了兩個同種型連同本文列出的電子轉移蛋白能夠非常有效地將medrane轉化為premedrol。圖4顯示通過人CYP21連同電子轉移系統2進行的medrane的體外轉化。這個結果指示由premedrol所例示的類固醇能夠通過CYP21連同合適的氧化還原體系(例如如表2中所示的)酶促產生。

實施例2：完整細胞系統

鑒於類固醇的成功體外轉化，開發了在完整細胞中的生物轉化。

大體而言，為了在完整細胞中進行羥化，在大腸桿菌菌株C43(DE3)中異源表現了CYP21以及必要的電子轉移蛋白。對於表現和接下來的轉化，構建了基於質粒pET17b的雙或三順反子載體，其攜帶特定CYP21和特定氧化還原系統的基因。圖5顯示了所有構建的載體。為了促進正確的蛋白質折疊，將大腸桿菌分子伴侶GroEL和GroES在第二載體上共表現。經轉化的大腸桿菌細胞能夠產生CYP21酶以及所需的氧化還原配偶體。在蛋白質表現之後，發生基質轉化，其通過添加要羥化的類固醇(以medrane作為示例)作為基質來起始。

具體而言，將大腸桿菌菌株C43(DE3)以用於完整細胞生物催化的載體(例如p21b_ArET)和編碼分子伴侶GroEL/ES的pGro12轉化。培養物包含2L錐形瓶(Erlenmeyer flask)中的200mL TB培養基(+抗生素胺苄青黴素和卡那黴素)，以2mL種子培養物接種，並且在37℃生長。通過添加1mM IPTG、1mM δ-胺基乙醯丙酸、4mg/mL阿拉伯糖(arabinose)在OD 0.5誘導表現，並在27℃保持28小時。對於完整細胞生物轉化，通過離心並用50mM磷酸鉀緩衝液(pH 7.4)洗滌來收穫細胞。基質轉化以添加400μM基質開始，使細胞在300mL帶擋板的燒瓶中的25mL磷酸鉀緩衝液(50mM)中以約24g/L(濕重)的細胞密度靜止24小時，所述緩衝液包括2%甘油、1mM IPTG、1mM δ-胺基乙醯丙酸、4mg/mL阿拉伯糖。取得樣品，例如，在24小時之後，並在使用氯仿提取類固醇之後通過RP-HPLC進行測量。

圖6顯示所述類固醇轉化成了它的21-羥化衍生物，並且沒有觀察到副產物的出現，這與化學合成形成對比。在完整細胞中針對每個CYP21同種型使用六種氧化還原體系研究了時間依賴性的產物形成，從而不僅確定了終點產率，還確定了就生物技術工藝而言高度感興趣的反應速度(圖7)。

緊接著medrane成為premedrol的轉化之後，人和牛CYP21兩者能夠羥化所有測試的尚未在21位羥化的3-酮類固醇。具體而言，能顯示以下類固醇的轉化：

- Medrane成為premedrol(非天然基質)

- Deltamedrane成為medrol(非天然基質)

- 孕酮成為11-脫氧皮質酮(天然基質)

- 17OH-孕酮成為11-脫氧皮質醇(天然基質)

- 甲羥孕酮成為21OH-甲羥孕酮(非天然基質)

- 5α-二氫孕酮成為21OH-(5α-二氫孕酮)。

<110> 法商賽諾菲公司 Sanofi

<120> 類固醇的21-羥基化 21-HYDROXYLATION OF STEROIDS

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 495

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 1

<210> 2

<211> 496

<212> PRT

<213> 牛(Bos Taurus)

<400> 2

<210> 3

<211> 481

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 3

<210> 4

<211> 482

<212> PRT

<213> 牛(bos Taurus)

<400> 4

Claims

一種用於羥化類固醇的碳原子21的方法，包括以下步驟：a)提供細胞，所述細胞表現(i)異源哺乳動物CYP21A2蛋白或其功能性變體，該功能性變體具有SEQ ID NO：1至4中任一個胺基酸序列之至少80%序列同一性，且具有未改變的CYP21A2蛋白對類固醇進行21-羥化之能力的至少20%；(ii)至少一種能夠將電子轉移至CYP21A2的異源電子轉移系統，和(iii)一種或多種促進CYP21A2折疊的分子伴侶；和b)將類固醇添加至所述細胞其中該類固醇為medrane或deltamedrane。
如請求項1的方法，進一步包括步驟c)從所述細胞的上清液萃取21-羥化類固醇。
如請求項1或2的方法，進一步包括在步驟b)之後向所述細胞添加一種或多種細胞透化劑。
如請求項1或2的方法，其中所述細胞是休眠細胞。
如請求項1或2的方法，其中所述細胞是原核細胞或真核細胞。
如請求項5的方法，其中所述原核細胞為大腸桿菌細胞或所述真核細胞為酵母細胞。
如請求項1或2的方法，其中所述至少一種電子轉移系統包括(i)CYP21A2還原酶，和/或(ii)鐵氧還蛋白還原酶和鐵氧還蛋白。
如請求項1或2的方法，其中所述一種或多種分子伴侶是重組表現的分子伴侶。
如請求項1或2的方法，其中至少一種色胺酸酶基因的表現在所述細胞中是降低的或廢除的。
如請求項1或2的方法，其中所述細胞進一步表現異源基因，所述異源基因編碼催化血紅素生物合成途徑中的步驟的酶。
如請求項10的方法，其中異源基因為hemA基因。
如請求項1或2的方法，其中所述編碼(i)、(ii)和視情況存在之(iii)的基因包含在一個或多個表現盒(expression cassette)中，所述一或多個表現盒整合在所述細胞基因組中。
一種細胞之用途，該細胞表現(i)異源哺乳動物CYP21A2蛋白或其功能性變體，該功能性變體具有SEQ ID NO：1至4中任一個胺基酸序列之至少80%序列同一性，且具有未改變的CYP21A2蛋白對類固醇進行21-羥化之能力的至少20%；(ii)至少一種能夠將電子轉移至CYP21A2的異源電子轉移系統，和(iii)一種或多種促進CYP21A2折疊的分子伴侶該用途為用於羥化類固醇的碳原子21，其中該類固醇為medrane或deltamedrane。
一種多順反子(multicistronic)表現載體之用途，該多順反子表現載體包含(i)編碼哺乳動物CYP21A2蛋白或其功能性變體的核酸，該功能性變體具有SEQ ID NO：1至4中任一個胺基酸序列之至少80%序列同一性，且具有未改變的CYP21A2蛋白對類固醇進行21-羥化之能力的至少20%；(ii)編碼至少一種能夠將電子轉移至CYP21A2的異源電子轉移系統的一種或多種核酸，和視情況存在之(iii)編碼促進CYP21A2折疊的分子伴侶的一種或多種核酸，該用途為用於羥化類固醇的碳原子21，其中該類固醇為medrane或deltamedrane。
一種套組的用途，該套組包含- 如請求項13中所定義的細胞，- 如請求項14中所定義的多順反子表現載體，或- (i)包含編碼哺乳動物CYP21A2蛋白或其功能性變體的核酸的表現載體，該功能性變體具有SEQ ID NO：1至4中任一個胺基酸序列之至少80%序列同一性，且具有未改變的CYP21A2蛋白對類固醇進行21-羥化之能力的至少20%；(ii)包含編碼至少一種能夠將電子轉移至CYP21A2的異源電子轉移系統的一種或多種核酸的一或多個表現載體，和視情況存在之(iii)包含編碼促進CYP21A2折疊的分子伴侶的一種或多種核酸的一個或多個表現載體，該用途為用於羥化類固醇的碳原子21，其中該類固醇為medrane或deltamedrane。