CN108138215B

CN108138215B - 类固醇的21-羟基化

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Publication number: CN108138215B
Application number: CN201580071490.7A
Authority: CN
Inventors: C·拉特曼; T·施蒂尔格; B·雅诺哈; H-F·赖斯; S·里瑟姆; S·安德尔克; R·伯恩哈特; F·汉内曼
Original assignee: Sanofi SA
Current assignee: Sanofi SA
Priority date: 2014-10-30
Filing date: 2015-10-29
Publication date: 2022-01-25
Anticipated expiration: 2035-10-29
Also published as: IL275237A; IL251978B; US20190352690A1; SG10201906501YA; US20170321241A1; JP2024001138A; TW202300653A; US20220228189A1; CN114540453A; IL251978A0; CA2966067C; EP3015550A1; WO2016066738A1; JP6856528B2; HUE056495T2; CN108138215A; JP2021097709A; IL285700A; IL285700B1; TWI701336B

Abstract

概括而言，本发明涉及类固醇羟化领域。更具体而言，本发明涉及用于在细胞中对类固醇进行21‑羟化的方法。还涉及表达类固醇21‑羟基化酶(steroid 21‑hydroxylating enzyme)或类固醇21‑羟化酶(steroid 21‑hydroxylase)的细胞、包含编码类固醇21‑羟化酶的核酸的表达载体和用于实施在细胞中对类固醇进行21‑羟化的方法的试剂盒。

Description

类固醇的21-羟基化

说明书

概括而言，本发明涉及类固醇羟化领域。更具体而言，本发明涉及用于在细胞中对类固醇进行21-羟化的方法。还涉及表达类固醇21-羟基化酶(steroid 21-hydroxylatingenzyme)或类固醇21-羟化酶(steroid 21-hydroxylase)的细胞、包含编码类固醇21-羟化酶的核酸的表达载体和用于实施在细胞中对类固醇进行21-羟化的方法的试剂盒。

合成糖皮质激素衍生自天然存在的应激激素皮质醇，并且因为它们的抗炎和免疫抑制作用而在制药工业中扮演至关重要的角色。另外，合成分子经常发挥比皮质醇更有效的作用。

目前，一些药学活性类固醇的合成涉及它们的前体的21-羟化(例如参见图1)，其由长时间化学多步合成组成。通过合成化学的方式，这种羟化仍然困难，因为化学氧化剂对位置21不具选择性。出于这一理由，必须要保护其他官能团以避免它们的氧化，并使羟化反应针对位置21进行。另外，因为使用了如碘等试剂，合成对环境不友善。因此，对于药学活性类固醇廉价且可持续的生产以满足对这些重要药物的高需求是高度期望的。

这个问题已经由本发明的发明人通过开发在一步合成中由酶CYP21A2进行类固醇的完整细胞生物转化而得到了解决，CYP21A2是细胞色素P450单加氧酶(monooxygenases)蛋白家族成员，且能够在类固醇骨架的21-位进行高度选择性的类固醇羟化(所述方法的方案参见图2)。CYP21A2是哺乳动物膜锚定酶，其位于内质网中并且在类固醇激素生物合成中发挥关键作用。发明人已经证明本发明的生物催化系统是充满前景的候选者，可取代已经确立的化学合成。具体来说，他们证明了类固醇能够在一个单一的羟化步骤中得到修饰，产生一个理想的产物，其省时、对环境友好(未观察到副产物)并且便于下游加工。此外，有利的是，就本发明在完整细胞中类固醇的生产而言，酶不必经过纯化，在宿主中保持稳定，也不必要添加昂贵的氧化还原当量(redox equivalent)如NADPH，因为细胞自身即充当供体。

在下文详细描述本发明之前，应理解的是本发明不限于此处记载的特定的方法学、方案和试剂，因为这些可以变化。还应理解，此处使用的术语学仅出于描述特定实施方案的目的，而非意图限制本发明的范围，本发明的范围将由所附权利要求的范围进行限定。除非另行定义，此处使用的全部技术和科学术语与本领域普通技术人员所通常理解的含义相同。

优选地，此处使用的术语如“A multilingual glossary of biotechnologicalterms：(IUPAC Recommendations)”,Leuenberger,H.G.W,Nagel,B.和

H.编(1995),Helvetica Chimica Acta,CH-4010Basel,Switzerland)中所述进行定义。

本说明书引用了数篇文件。本文引用的每一篇文件(包括全部专利、专利申请、科学出版物、制造商的说明书、指导等)，无论是在前文还是在后文中，均以其整体并入作为参考。不应将本文的任何内容理解成是对本发明无权因为在先发明而先于这些公开内容的承认。

在下文中，将描述本发明的元素。这些元素随着具体实施方案列出，然而，应该理解的是它们可以以任意方式和任意数量组合以创造出其他具体实施方案。以多种方式描述的实例和优选的实施方案不应理解成将本发明仅限定为明确记载的具体实施方案。应将此说明书理解为支持并涵盖将明确记载的实施方案与任意数量的公开的和/或优选的元素组合得到的实施方案。另外，在本申请中所有描述的元素的排列组合应被认为由本申请的说明书公开，除非上下文另有说明。

在本说明书和随后的权利要求的范围的全文中，除非上下文另有要求，词语“包含”和其变化，如“包括”和“含有”应理解为暗示包括所述整数或步骤或整数或步骤的集合，但不排除任何其它整数或步骤或整数或步骤的集合。如本说明书和所附请求项中所使用的，单数形式的“一”、“一种”和“所述”包括复数的指称，除非上下文另有明确指示。

在第一方面，本发明涉及用于羟化类固醇的碳原子21的方法，包括以下步骤：

a)提供细胞，所述细胞表达

(i)异源CYP21A2蛋白或其功能性变体，

(ii)至少一种能够将电子转移至CYP21A2的异源电子转移系统，和

(iii)一种或多种促进CYP21A2折叠的分子伴侣(chaperone)；和

b)将类固醇添加至所述细胞。

类固醇是一类有机化合物，其含有特征性排列的彼此结合的四个环烷烃环(下文所示)。类固醇的核心由键合在一起的十七个碳原子构成，采取四个融合环的形式：三个环己烷环(称为环A、B和C)和一个环戊烷环(D环)。类固醇的变化在于与这四个环核心附接的官能团和环的氧化状态。

类固醇的碳原子21的羟化是在如上文显示的ABCD类固醇环体系中所示的位置21添加-OH基团。碳原子的编号是根据IUPAC(国际纯粹与应用化学联合会)认可的环编码和原子编号方式。类固醇的21-羟化如图1中所示。

在本发明第一方面的方法的特定实施方案中，类固醇是3-酮类固醇。更具体而言，类固醇是非天然类固醇，即不在未经遗传改变的细胞，尤其是人或牛细胞中产生和/或21-羟化的类固醇。

在一个实施方案中，类固醇选自下组：Medrane、Deltamedrane、孕酮、17OH-孕酮、甲羟孕酮(medroxyprogesterone)和5-α-二氢-孕酮。21-羟化将这些特定的类固醇分别转化成Premedrol、Medrol、11-脱氧皮质酮、11-脱氧皮质醇、21OH-甲羟孕酮和21OH-(5α-二氢孕酮)。在一个特定的实施方案中，其中类固醇是非天然类固醇，所述类固醇选自下组：Medrane、Deltamedrane、甲羟孕酮和5-α-二氢-孕酮。

具体而言，所述细胞是培养的细胞，培养在任何细胞培养基中，例如生长培养基中，并且在特定的实施方案中，处于休眠状态(resting state)。根据这个实施方案，所述细胞包含在能够维持所述细胞的缓冲液或培养基中而非生长培养基中。缓冲液的组成依赖于特定的细胞，而合适的缓冲液是本领域公知的。依据细胞类型，所述细胞是悬浮细胞或贴壁细胞。悬浮细胞是可天然生活在悬浮液中(即不与表面附着)的细胞，或是经过修饰从而能够在悬浮培养物中生存的细胞，例如生长至比贴壁状态下所能允许的更高的密度。贴壁细胞是需要表面如组织培养塑料或微载体的细胞，所述表面可涂覆有胞外基质(如胶原蛋白和层粘连蛋白)组分以增加贴附性质并提供生长和分化所需的其他信号。在一个实施方案中，贴壁细胞是单层细胞。

通常而言，细胞可为原核细胞或真核细胞。在第一方面的方法中使用的原核细胞的特定实例是大肠杆菌细胞，例如实施例的大肠杆菌菌株C43(DE3)的大肠杆菌细胞。真核细胞的特定实例是酵母细胞，例如，酿酒酵母(S.cerevisae)细胞或粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)细胞。然而，第一方面的方法不限于任何特定细胞类型并且可使用任何细胞类型，特别是能够在培养中生长并维持以及能够用作重组表达系统的任何细胞类型，如除了上述细胞之外的昆虫细胞或哺乳动物细胞。

术语“异源”意指在正常情况下(即没有人为干预下)不表达某种蛋白质的细胞中表达所述蛋白质。例如，CYP21A2是一种也称作21-羟化酶的酶，其为细胞色素P450酶家族的一部分。细胞色素P450酶参与了机体内的许多过程，如辅助分解药物的反应和帮助产生胆固醇、某些激素和脂肪(脂质)。21-羟化酶发现于肾上腺中，肾上腺位于肾的顶部并且产生调节机体内许多基本功能的多种激素。因此，关于异源表达，对于不是肾上腺细胞的任何细胞而言CYP21A2蛋白均可被认为是异源的。

具体而言，术语“异源”也可指相较于在其中进行表达特别是重组表达的细胞而言某个蛋白质或基因所来源的物种。异源蛋白则是源自与在其中进行表达的细胞(即本发明第一方面的方法的细胞)不同的物种的蛋白质。例如，本发明人在大肠杆菌细胞中表达了哺乳动物具体而言人或牛的蛋白质，使得这些蛋白质相对于所述细胞是异源的。

在本发明第一方面的方法的特定实施方案中，CYP21A2蛋白是人或牛来源的。人CYP21A2(UniProt登录号P08686)具有根据序列表的SEQ ID NO：1的序列。牛CYP21A2(UniProt登录号P00191)具有根据序列表的SEQ ID NO：2的序列。还参见图8。然而，同源基因也存在于其他哺乳动物物种中，如Canis lupus(狗)、Macaca mulata(恒河猴)、Rattusnorvegicus(大鼠)、Gallus gallus(鸡)、Danio rerio(斑马鱼)、Mus musculus(小鼠)或Pan troglodytes(黑猩猩)。因此，需强调可使用任何CYP21A2蛋白，特别是任何哺乳动物CYP21A2蛋白。也可使用分别根据SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的修饰的人或牛CYP21A2。同样参见图8。

术语“功能性变体”是具有未改变的或CYP21A2蛋白对类固醇进行21-羟化的能力的至少20％(例如，至少：20％；30％；40％；50％；60％；70％；80％；90％；95％；98％；99％；99.5％；或100％或者甚至更多)的蛋白质变体。这种能力能够由技术人员在无需过度实验的情况下使用例如本文实施例1和2中所示的方法来确定。

“蛋白变体”是具有与其所来源的CYP21A2的氨基酸序列至少70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列的蛋白质，其所来源的CYP21A2的氨基酸序列例如为SEQ ID NO：1或3(在人CYP21A2的情况下)或SEQ ID NO：2或4(在牛CYP21A2的情况下)。两条序列之间百分比同一性的确定使用Karlin和Altschul,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90,5873-5877,1993的数学算法来完成。这样的算法被并入Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215,403-410的BLASTN和BLASTP程序。为了获得用于比较目的的含缺口比对(gapped alignment)，如Altschul等(1997)Nucleic Acids Res.25,3389-3402中所述利用Gapped BLAST。当利用BLAST和Gapped BLAST程序时，使用各个程序的默认参数。

或者，蛋白变体也可限定为具有多至100、90、80、70、60、50、40、30、20、10、5、4、3、2或1个氨基酸取代，特别是保守氨基酸取代。保守取代表是本领域熟知的(参见例如Creighton(1984)Proteins.W.H.Freeman and Company)。氨基酸的物理和化学性质的概览提供在下表1中。在特定的实施方案中，保守取代是根据表1用具有相同性质的氨基酸进行的取代。

表1:天然存在的蛋白的性质

术语“变体”也包括蛋白质片段。CYP21A2的片段具有多至总共100、90、80、70、60、50、40、30、20、10、5、4、3、2或1个氨基酸的N-末端和/或C-末端缺失。在特定的实施方案中，所述功能性变体是缺乏疏水锚定区域(即29个N-末端氨基酸残基截短)的CYP21A2片段(图8)。

此外，可修饰CYP21A2蛋白，例如通过N-末端或C-末端氨基酸添加，如标签或N-末端修饰，用于改进细菌表达。例如，标签可为C-末端His标签，例如6x His标签和N-末端修饰，从CYP2C3的N-末端添加10个氨基酸(参见图8和SEQ ID Nos 3和4)。

电子转移系统是通过氧化还原反应将电子从电子供体转移至电子受体的一系列化合物。术语“能够将电子转移至CYP21A2”因此意指CYP21A2是这个系列的电子受体。本文的术语“系列(series)”可包括CYP21A2，并且因此所述电子转移系统在CYP21A2之外可以仅由一个蛋白质组成。就本发明第一方面的方法而言，只要所述系统能够将电子转移至CYP21A2，所述电子转移系统由哪些成员组成并非关键。合适的系统是本领域熟知的。在本发明第一方面的方法的特定实施方案中，所述至少一个电子转移系统包含(i)CYP21A2还原酶，或(ii)铁氧还蛋白还原酶，优选NADPH依赖性铁氧还蛋白还原酶(皮质铁氧还蛋白还原酶(adrenodoxin reductase))和铁氧还蛋白。例如，所述至少一个电子转移蛋白可选自下组：NADPH依赖性细胞色素P450还原酶(CPR，例如人或牛的)，皮质铁氧还蛋白还原酶(AdR，例如人或牛的)和皮质铁氧还蛋白(Adx4-108，例如人或牛的)的组合，黄素氧还蛋白还原酶(Fpr，例如来自大肠杆菌)和皮质铁氧还蛋白(Adx4-108，例如人或牛的)的组合，皮质铁氧还蛋白还原酶同源物(homolog)(Arh)例如粟酒裂殖酵母(S.pombe)皮质铁氧还蛋白还原酶同源物(Arh1)和皮质铁氧还蛋白(Adx4-108，例如人或牛)的组合，皮质铁氧还蛋白还原酶同源物(Arh)例如粟酒裂殖酵母皮质铁氧还蛋白还原酶同源物(Arh1)和电子转移结构域的铁氧还蛋白结构域(etp^fd)例如粟酒裂殖酵母电子转移结构域的铁氧还蛋白结构域(etp1^fd)的组合，以及黄素氧还蛋白还原酶(Fpr，例如来自大肠杆菌)和电子转移结构域的铁氧还蛋白结构域(etp^fd)例如粟酒裂殖酵母电子转移结构域的铁氧还蛋白结构域(etp1^fd)的组合。

在特定的实施方案中，不向细胞添加外源NADPH。在此实施方案中，NADPH由细胞产生。在具体的实施例中，细胞中的NADPH产生可通过重组方式提高，例如异源表达NADPH产生中涉及的酶(例如葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)、磷酸葡糖酸脱氢酶(PGD)、苹果酸脱氢酶(MDH)和/或异柠檬酸脱氢酶(ICDH)中的一种或多种)，和/或其可通过提供激素信号来提高，即添加提高内源NADPH产生水平的激素如雌二醇。

类似地，分子伴侣可为任何分子伴侣，只要其能够促进CYP21A2的折叠。本发明人发现本发明第一方面的方法能够仅依赖于内源分子伴侣，即不必要额外表达合适的分子伴侣。然而，额外表达改善细胞中功能性CYP21A2的产生，并且因此可以是有益的。因此，在本发明第一方面的方法的一个实施方案中，所述一种或多种分子伴侣是重组表达的分子伴侣。具体而言，一种或多种分子伴侣可以是异源分子伴侣。例示性分子伴侣是大肠杆菌分子伴侣GroEL和GroES或其他分子伴侣如DnaK、DnaJ、GrpE和ClpB以及小热激蛋白(sHSP)如IbpA和IbpB(IbpAB)。

任选地，要在细胞中表达的相同的分子伴侣或一种或多种额外分子伴侣能够折叠上述电子转移蛋白中的一种或多种。

重组表达指重组基因的表达。这样的基因可以是任何通过遗传工程方法引入细胞的基因，并且通常是异源基因和/或在表达方面与可能的内源对应物基因以不同方式调节的基因。在一个实施方案中，重组表达是可诱导的。

在本发明第一方面的方法的一个实施方案中，所述方法进一步包括向细胞的悬浮物添加一种或多种细胞透化剂，例如在步骤b)之后。细胞透化剂是增加膜渗透性的试剂。实例是有机溶剂，如甲醇、丙酮或DMSO，洗涤剂如皂角苷、Triton X-100或Tween-20和EDTA。具体而言，多粘菌素B(polymyxin B)可用作细胞透化剂。这种试剂被证明在本发明的方法中运作得特别良好。

在本发明第一方面的方法中的另一个实施例中，所述方法进一步包括从细胞和/或细胞的上清液(即细胞包含于其中的缓冲液或培养基)，例如从完整细胞悬浮物，提取21-羟化类固醇的步骤c)。提取可使用本领域已知用于提取未溶解化合物的任何溶剂或提取方法进行。例如，可使用溶剂如1-丁醇、2-丁酮或氯仿。

在本发明第一方面的方法的实施方案中，至少一种色氨酸酶基因的表达在细胞中是降低的或废除的。色氨酸酶或L-色氨酸吲哚裂合酶(EC号4.1.99.1.)是催化L-色氨酸+H2O＝吲哚+丙酮酸+NH3反应的酶。因此，降低或废除会导致细胞的吲哚产生减少，其能够促进所述方法，因为吲哚是CYP酶如CYP21A2的抑制剂。由于色氨酸酶基因通常(但并非仅仅)存在于原核生物中，例如，大肠杆菌中，这种特定实施方案特别应用于其中细胞是原核细胞的本发明第一方面的方法的实施方案中。在一个实施方案中，表达色氨酸酶基因的细胞的物种选自下组：嗜水气单孢菌(Aeromonas hydrophila)、芽孢杆菌属菌种(Bacillus sp.)、拟杆菌属菌种(Bacteroides sp.)、棒状杆菌属菌种(Corynebacterium sp.)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)、产气肠杆菌SM-18、肠细菌属菌种(Enterobacter sp.)、欧文氏菌属菌种(Erwinia sp.)、金色埃希氏菌(Escherichia aurescens)、大肠杆菌(Escherichia coli)、坏死梭杆菌Funduliforme亚种(Fusobacterium necrophorumsubsp.Funduliforme)、克鲁维酵母属菌种(Kluyvera sp.)、产气微球菌(Micrococcusaerogenes)、摩氏摩根菌(Morganella morganii)、蜂房类芽孢杆菌(Paenibacillusalvei)、Paracolobactrum coliforme、副大肠菌属菌种(Paracolobactrum sp.)、巴斯德菌属菌种(Pasteurella sp.)、深海发光杆菌(Photobacterium profundum)、牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)、中间普氏菌(Prevotella intermedia)、普通变形杆菌(Proteus vulgaris)、雷氏普罗威登斯菌(Providencia rettgeri)、碱性志贺氏菌(Shigella alkalescens)、球状菌属菌种(Sphaerophorus sp.)、嗜热共生小杆菌(Symbiobacterium thermophilum)、弧菌属菌种(Vibrio sp.)和哺乳动物物种如人(Homosapiens)和褐家鼠(Rattus norvegicus)。

在本发明第一方面的方法的进一步实施方案中，细胞进一步表达编码催化血红素生物合成途径中的步骤的酶的异源或重组基因，特别是异源hemA(谷胺酰tRNA还原酶)基因。这样的细胞的一个实例是大肠杆菌。这会有利地降低补入CYP血红素合成的前体如血红素前体δ-氨基乙酰丙酸(δ-aminolevulinic acid)的需要，并降低这些细胞中类固醇的生物转化的成本。

在本发明第一方面的方法的特定实施方案中，将编码(i)异源CYP21A2蛋白或其功能性变体、(ii)至少一种能够将电子转移至CYP21A2的异源电子转移系统，和任选的(iii)一种或多种促进CYP21A2折叠的分子伴侣的核酸包含在一个或多个表达盒(expressioncassette)中，所述一个或多个表达盒整合至细胞中，特别是整合至其基因组中。术语“表达盒”指包含与基因表达所必需的调节序列如启动子可操作地连接的基因的DNA片段。“可操作地连接”指编码特定遗传信息的核苷酸区的连接，从而使这些核苷酸区是连续的，区的功能性得到保留并且将相对于其他区作为功能单元的一部分表达功能。核酸(i)、(ii)和任选的(iii)可各自包含在单独的表达盒中或包含在一个或多个多顺反子表达盒中。如本文所述，术语“多顺反子(multicistronic)”意指多个顺反子，即多个核酸或基因，其可操作地连接于相同的调节序列，例如启动子。

在一个实施方案中，将编码(i)异源CYP21A2蛋白或其功能性变体、(ii)至少一种能够将电子转移至CYP21A2的异源电子转移系统，和任选的(iii)一种或多种促进CYP21A2折叠的分子伴侣的核酸包含在细胞中所包含的表达载体中。“表达载体”是一种媒介，借助它能够将含有编码蛋白质的核酸的DNA片段引入宿主细胞，在该宿主细胞中所述核酸能够通过该宿主细胞表达。核酸(i)、(ii)和任选的(iii)可各自包含在单独的表达载体中或包含在一个或多个多顺反子表达载体中。

另外，核酸(i)、(ii)和任选的(iii)中的一种或多种可包含在整合入细胞基因组中的表达盒中，而其余的核酸(i)、(ii)和任选的(iii)包含在表达载体中，二者均如上文所示。

在第二方面，本发明涉及细胞，其表达

(i)异源CYP21A2蛋白或其功能性变体，

(iii)一种或多种促进CYP21A2折叠的分子伴侣。

这种细胞以及本发明第一方面的方法中的细胞也可被描述成包含一种或多种核酸的细胞，所述一种或多种核酸编码

(i)异源CYP21A2蛋白或其功能性变体，

(iii)一种或多种促进CYP21A2折叠的分子伴侣。

在特定的实施方案中，这些核酸包含在一个或多个表达盒中。

第二方面的细胞本质上是本发明第一方面的方法中使用的细胞，并且因此，本发明第二方面的细胞的进一步的实施方案如上文关于第一方面的方法所述。

第三方面，本发明涉及多顺反子表达载体，其包含(i)编码CYP21A2蛋白或其功能性变体的核酸，(ii)编码至少一种能够将电子转移至CYP21A2的异源电子转移系统的一种或多种核酸，和任选的(iii)编码促进CYP21A2折叠的分子伴侣的一种或多种核酸。

在第四方面，本发明涉及试剂盒，其包含

-第二方面的细胞，

-第三方面的多顺反子表达载体，或

-(i)包含编码CYP21A2蛋白或其功能性变体的核酸的表达载体，(ii)包含编码至少一种能够将电子转移至CYP21A2的异源电子转移系统的一种或多种核酸的一种或多种表达载体，和任选的(iii)包含编码促进CYP21A2折叠的分子伴侣的一种或多种核酸的一种或多种表达载体。

术语“试剂盒”用于本文意指实施第一方面的方法所必需的试剂、材料和说明中的全部或一些的集合。这包括细胞培养基或缓冲液(均为干燥或液体形式)、一种或多种细胞透化剂、用于提取类固醇的溶剂和特别是有待羟化的类固醇，特别是3-酮类固醇，例如，Medrane、Deltamedrane、孕酮、17OH-孕酮、甲羟孕酮或5-α-二氢-孕酮中的一种或多种。另外，设想本文描述的与第一方面的方法有关的全部试剂或材料可以是第四方面的试剂盒的一部分。

在一个特定的实施方案中，第一方面的方法、第二方面的细胞、第三方面的表达载体和第四方面的试剂盒不包含可应用于与类固醇的21-羟化(特别是如本文所述的)无关的类固醇转化或产生的其他步骤或组分，尤其是异源基因或蛋白质。任选地，这一点的例外可为与21-羟化类固醇的进一步加工(如从Premedrol转化成Medrol)相关的下游步骤或组分，或与有待21-羟化的类固醇的产生(如Medrane的产生)相关的上游步骤或组分。

在以下的附图和实施例中更详细地描述本发明的一些特定实施方案。然而，并非意图通过这些特定实施方案的细节来限制本发明。相反，本发明涉及包含虽然没有在本文的实施例中明确提及、但是技术人员无需过度努力便可发现的细节的任何实施方案。

附图简述

图1：在碳原子21处羟化类固醇(此处为孕酮)。

图2：通过CYP21A2进行的类固醇的完整细胞生物转化方案以及大肠杆菌中需要的电子转移蛋白。

图3：左图：纯化牛CYP21的CO示差谱；右图：在所示纯化步骤(IMAC/DEAE/SP)之后取得的bCYP21样品的SDS-PAGE。

图4：通过人CYP21和描述的电子转移蛋白(此处为AdR和Adx)(系统2)将Medrane体外21-羟化为Premedrol的HPLC色谱图。

图5：为使用人或牛CYP21以不同电子转移蛋白进行完整细胞生物转化所构建的载体。

图6：通过牛CYP21和描述的电子转移蛋白(此处为Fpr和Adx)进行的完整细胞21-羟化Medrane成为Premedrol(A)、δ-medrane成为Medrol(B)、甲羟孕酮成为21OH-甲羟孕酮(C)和17OH-孕酮成为11-脱氧皮质醇(D)的HPLC色谱图。

图7：通过牛CYP21和描述的电子转移蛋白(此处为Fpr和Adx)进行的Medrane成为Premedrol的时间依赖性完整细胞转化。

图8：野生型和修饰的人(A)和牛(B)CYP21A2的氨基酸序列。

实施例的描述：

实施例1：体外羟化

1.1hCYP21/bCYP21的表达/纯化

为了显示人和牛CYP21均能在21位羟化类固醇，用两种酶进行了体外研究。作为例示性21-羟化方法，将Medrane转化为Premedrol：

Premedrol(甲基氢化可的松(methylhydrocortisone))是高度有效的药用类固醇Medrol(甲泼尼龙(methylprednisolone))的前体。美卓尔是一种在自身免疫病、多发性硬化和一般而言用于局部和系统性治疗炎症的疗法中的重要药物。

两种酶均在大肠杆菌菌株C43(DE3)中通过共表达载体pGro12中编码的大肠杆菌分子伴侣GroEL/GroES进行表达。这些分子伴侣确保了正确的蛋白质折叠，这对于并入血红素修补基团(prosthetic group)而言是重要的。在图3中，显示了纯化的牛CYP21的SDS-PAGE和CO示差谱。如CO示差谱显示，酶以活性形式纯化。为了测定Medrane与两种同工酶的结合，测定了结合常数(K_D值)。

1.2电子递送氧化还原配偶体(redox partners)的表达

为了有效的基质转化，两个同种型(isoform)都需要电子转移系统，所述电子转移系统由两个部分组成，细胞色素P450酶本身和一种或两种对于羟化反应而言关键的电子转移蛋白。没有这些转移蛋白，不会发生反应。例如，电子能够通过表2中所列的六种电子转移系统转移至CYP21：

表2：CYP-21依赖性基质转化中应用的电子递送蛋白和用于完整细胞系统的对应表达质粒。将hCYP21或bCYP21与表明的氧化还原配偶体bCPR(牛NADPH依赖性细胞色素P450还原酶)、bAdR(牛皮质铁氧还蛋白还原酶)、bAdx_4-108(牛皮质铁氧还蛋白)、Fpr(大肠杆菌黄素氧还蛋白还原酶)、Arh1(粟酒裂殖酵母皮质铁氧还蛋白还原酶同源物)、etp1^fd(粟酒裂殖酵母电子转移蛋白，铁氧还蛋白结构域)组合在重构系统(reconstituted system)或完整细胞系统中。

对于体外研究和基质转化的验证，全部氧化还原配偶体均为纯化的。

1.3细胞色素P450系统的体外重构

使用纯化的酶在限定的缓冲液中并且使用NADPH再生系统进行的体外基质转化揭示了两个同种型连同本文列出的电子转移蛋白能够非常有效地将Medrane转化为Premedrol。图4显示通过人CYP21连同电子转移系统2进行的Medrane的体外转化。这个结果指示由Premedrol所例示的类固醇能够通过CYP21连同合适的氧化还原体系(例如如表2中所示的)酶促产生。

实施例2：完整细胞系统

鉴于类固醇的成功体外转化，开发了在完整细胞中的生物转化。

概括而言，为了在完整细胞中进行羟化，在大肠杆菌菌株C43(DE3)中异源表达了CYP21以及必要的电子转移蛋白。对于表达和接下来的转化，构建了基于质粒pET17b的双或三顺反子载体，其携带特定CYP21和特定氧化还原系统的基因。图5显示了所有构建的载体。为了促进正确的蛋白质折叠，将大肠杆菌分子伴侣GroEL和GroES在第二载体上共表达。经转化的大肠杆菌细胞能够产生CYP21酶以及所需的氧化还原配偶体。在蛋白质表达之后，发生基质转化，其通过添加要羟化的类固醇(以Medrane作为示例)作为基质来起始。

具体而言，将大肠杆菌菌株C43(DE3)使用用于完整细胞生物催化的载体(例如p21b_ArET)和编码分子伴侣GroEL/ES的pGro12转化。培养物包含2L锥形瓶(Erlenmeyerflask)中的200mL TB培养基(+抗生素胺苄青霉素和卡那霉素)，以2mL种子培养物接种，并且在37℃生长。通过添加1mM IPTG、1mMδ-氨基乙酰丙酸、4mg/mL阿拉伯糖(arabinose)在OD0.5诱导表达，并在27℃保持28小时。对于完整细胞生物转化，通过离心并用50mM磷酸钾缓冲液(pH7.4)洗涤来收获细胞。基质转化以添加400μM基质开始，使细胞在300mL带挡板的烧瓶中的25mL磷酸钾缓冲液(50mM)中以约24g/L(湿重)的细胞密度静止24小时，所述缓冲液包括2％甘油、1mM IPTG、1mMδ-氨基乙酰丙酸、4mg/mL阿拉伯糖。取得样品，例如，在24小时之后，并在使用氯仿提取类固醇之后通过RP-HPLC进行测量。

图6显示所述类固醇转化成了它的21-羟化衍生物，并且没有观察到副产物的出现，这与化学合成形成对比。在完整细胞中针对每个CYP21同种型使用六种氧化还原体系研究了时间依赖性的产物形成，从而不仅确定了终点产率，还确定了就生物技术工艺而言高度感兴趣的反应速度(图7)。

紧接着Medrane成为Premedrol的转化之后，人和牛CYP21两者能够羟化所有测试的尚未在21位羟化的3-酮类固醇。具体而言，能显示以下类固醇的转化：

-Medrane成为Premedrol(非天然基质)

-Deltamedrane成为Medrol(非天然基质)

-孕酮成为11-脱氧皮质酮(天然基质)

-17OH-孕酮成为11-脱氧皮质醇(天然基质)

-甲羟孕酮成为21OH-甲羟孕酮(非天然基质)

-5α-二氢孕酮成为21OH-(5α-二氢孕酮)。

序列表

<110> 赛诺菲

<120> 类固醇的21-羟基化

<130> DE2014/089 WO

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 495

<212> PRT

<213> 人

<400> 1

Met Leu Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu Ala Gly Ala

1 5 10 15

Arg Leu Leu Trp Asn Trp Trp Lys Leu Arg Ser Leu His Leu Pro Pro

20 25 30

Leu Ala Pro Gly Phe Leu His Leu Leu Gln Pro Asp Leu Pro Ile Tyr

35 40 45

Leu Leu Gly Leu Thr Gln Lys Phe Gly Pro Ile Tyr Arg Leu His Leu

50 55 60

Gly Leu Gln Asp Val Val Val Leu Asn Ser Lys Arg Thr Ile Glu Glu

65 70 75 80

Ala Met Val Lys Lys Trp Ala Asp Phe Ala Gly Arg Pro Glu Pro Leu

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Tyr Ser Leu Leu Trp Lys Ala His Lys Lys Leu Thr Arg Ser Ala Leu

115 120 125

Leu Leu Gly Ile Arg Asp Ser Met Glu Pro Val Val Glu Gln Leu Thr

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Gln Glu Phe Cys Glu Arg Met Arg Ala Gln Pro Gly Thr Pro Val Ala

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Ile Glu Glu Glu Phe Ser Leu Leu Thr Cys Ser Ile Ile Cys Tyr Leu

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Thr Phe Gly Asp Lys Ile Lys Asp Asp Asn Leu Met Pro Ala Tyr Tyr

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225 230 235 240

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Gly Ser Gly Gln Leu Leu Glu Gly His Val His Met Ala Ala Val Asp

275 280 285

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Val Val Phe Leu Leu His His Pro Glu Ile Gln Gln Arg Leu Gln Glu

305 310 315 320

Glu Leu Asp His Glu Leu Gly Pro Gly Ala Ser Ser Ser Arg Val Pro

325 330 335

Tyr Lys Asp Arg Ala Arg Leu Pro Leu Leu Asn Ala Thr Ile Ala Glu

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355 360 365

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Ile Ile Pro Asn Leu Gln Gly Ala His Leu Asp Glu Thr Val Trp Glu

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465 470 475 480

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<210> 2

<211> 496

<212> PRT

<213> 牛

<400> 2

Met Val Leu Ala Gly Leu Leu Leu Leu Leu Thr Leu Leu Ala Gly Ala

1 5 10 15

His Leu Leu Trp Gly Arg Trp Lys Leu Arg Asn Leu His Leu Pro Pro

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Leu Val Pro Gly Phe Leu His Leu Leu Gln Pro Asn Leu Pro Ile His

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Leu Leu Ser Leu Thr Gln Lys Leu Gly Pro Val Tyr Arg Leu Arg Leu

50 55 60

Gly Leu Gln Glu Val Val Val Leu Asn Ser Lys Arg Thr Ile Glu Glu

65 70 75 80

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Tyr Ser Leu Leu Trp Lys Ala His Lys Lys Leu Thr Arg Ser Ala Leu

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145 150 155 160

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165 170 175

Thr Phe Gly Asn Lys Glu Asp Thr Leu Val His Ala Phe His Asp Cys

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Leu Lys Gln Ala Ile Glu Asn Arg Asp His Met Val Glu Lys Gln Leu

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Thr Arg His Lys Glu Ser Met Val Ala Gly Gln Trp Arg Asp Met Thr

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275 280 285

Ile Gly Gly Thr Glu Thr Thr Ala Ser Thr Leu Ser Trp Ala Val Ala

290 295 300

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305 310 315 320

Asp Arg Glu Leu Gly Pro Gly Ala Ser Cys Ser Arg Val Thr Tyr Lys

325 330 335

Asp Arg Ala Arg Leu Pro Leu Leu Asn Ala Thr Ile Ala Glu Val Leu

340 345 350

Arg Leu Arg Pro Val Val Pro Leu Ala Leu Pro His Arg Thr Thr Arg

355 360 365

Pro Ser Ser Ile Phe Gly Tyr Asp Ile Pro Glu Gly Met Val Val Ile

370 375 380

Pro Asn Leu Gln Gly Ala His Leu Asp Glu Thr Val Trp Glu Gln Pro

385 390 395 400

His Glu Phe Arg Pro Asp Arg Phe Leu Glu Pro Gly Ala Asn Pro Ser

405 410 415

Ala Leu Ala Phe Gly Cys Gly Ala Arg Val Cys Leu Gly Glu Ser Leu

420 425 430

Ala Arg Leu Glu Leu Phe Val Val Leu Leu Arg Leu Leu Gln Ala Phe

435 440 445

Thr Leu Leu Pro Pro Pro Val Gly Ala Leu Pro Ser Leu Gln Pro Asp

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Pro Tyr Cys Gly Val Asn Leu Lys Val Gln Pro Phe Gln Val Arg Leu

465 470 475 480

Gln Pro Arg Gly Val Glu Ala Gly Ala Trp Glu Ser Ala Ser Ala Gln

485 490 495

<210> 3

<211> 481

<212> PRT

<213> 人

<400> 3

Met Ala Lys Lys Thr Ser Ser Lys Gly Lys Pro Pro Leu Ala Pro Gly

1 5 10 15

Phe Leu His Leu Leu Gln Pro Asp Leu Pro Ile Tyr Leu Leu Gly Leu

20 25 30

Thr Gln Lys Phe Gly Pro Ile Tyr Arg Leu His Leu Gly Leu Gln Asp

35 40 45

Val Val Val Leu Asn Ser Lys Arg Thr Ile Glu Glu Ala Met Val Lys

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65 70 75 80

Val Ser Arg Asn Tyr Pro Asp Leu Ser Leu Gly Asp Tyr Ser Leu Leu

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Trp Lys Ala His Lys Lys Leu Thr Arg Ser Ala Leu Leu Leu Gly Ile

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145 150 155 160

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165 170 175

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Gln Ala Ile Glu Lys Arg Asp His Ile Val Glu Met Gln Leu Arg Gln

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His Lys Glu Ser Leu Val Ala Gly Gln Trp Arg Asp Met Met Asp Tyr

225 230 235 240

Met Leu Gln Gly Val Ala Gln Pro Ser Met Glu Glu Gly Ser Gly Gln

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Leu Leu Glu Gly His Val His Met Ala Ala Val Asp Leu Leu Ile Gly

260 265 270

Gly Thr Glu Thr Thr Ala Asn Thr Leu Ser Trp Ala Val Val Phe Leu

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Ser Val Ile Leu Lys Met Gln Pro Phe Gln Val Arg Leu Gln Pro Arg

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Gly Met Gly Ala His Ser Pro Gly Gln Ser Gln His His His His His

465 470 475 480

His

<210> 4

<211> 482

<212> PRT

<213> 牛

<400> 4

Met Ala Lys Lys Thr Ser Ser Lys Gly Lys Pro Pro Leu Val Pro Gly

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Phe Leu His Leu Leu Gln Pro Asn Leu Pro Ile His Leu Leu Ser Leu

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Glu Arg Met Arg Val Gln Ala Gly Ala Pro Val Thr Ile Gln Lys Glu

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145 150 155 160

Lys Glu Asp Thr Leu Val His Ala Phe His Asp Cys Val Gln Asp Leu

165 170 175

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180 185 190

Phe Leu Arg Phe Phe Pro Asn Pro Gly Leu Trp Arg Leu Lys Gln Ala

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Gly Pro Gly Ala Ser Cys Ser Arg Val Thr Tyr Lys Asp Arg Ala Arg

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Phe Gly Tyr Asp Ile Pro Glu Gly Met Val Val Ile Pro Asn Leu Gln

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Gly Cys Gly Ala Arg Val Cys Leu Gly Glu Ser Leu Ala Arg Leu Glu

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435 440 445

Val Asn Leu Lys Val Gln Pro Phe Gln Val Arg Leu Gln Pro Arg Gly

450 455 460

Val Glu Ala Gly Ala Trp Glu Ser Ala Ser Ala Gln His His His His

465 470 475 480

His His

Claims

1.一种用于羟化类固醇的碳原子21的方法，包括以下步骤：

a)提供细胞，所述细胞表达

(i)异源CYP21A2蛋白或其功能性变体，

(iii)一种或多种促进CYP21A2折叠的分子伴侣；和

b)将类固醇添加至所述细胞，

其中所述类固醇是medrane或deltamedrane。

2.根据权利要求1所述的方法，进一步包括步骤c)从所述细胞的上清液提取21-羟化类固醇。

3.根据权利要求1或2所述的方法，进一步包括在步骤b)之后向所述细胞添加一种或多种细胞透化剂。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述细胞是休眠细胞。

5.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述细胞是原核细胞，特别是大肠杆菌细胞，或真核细胞，特别是酵母细胞。

6.根据权利要求5的方法，其中所述细胞是大肠杆菌细胞。

7.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述至少一种电子转移系统包括

(i)CYP21A2还原酶，和/或

(ii)铁氧还蛋白还原酶，特别是NADPH依赖性铁氧还蛋白还原酶，和铁氧还蛋白。

8.根据权利要求1或2所述的方法，所述异源电子转移系统包含黄素氧还蛋白还原酶和皮质铁氧还蛋白的组合，黄素氧还蛋白还原酶和电子转移结构域的铁氧还蛋白结构域的组合，皮质铁氧还蛋白还原酶同源物和皮质铁氧还蛋白的组合，或皮质铁氧还蛋白还原酶同源物和电子转移结构域的铁氧还蛋白结构域的组合。

9.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述一种或多种分子伴侣是重组表达的分子伴侣。

10.根据权利要求1或2所述的方法，其中至少一种色氨酸酶基因的表达在所述细胞中是降低的或废除的。

11.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述细胞进一步表达异源基因，所述异源基因编码催化血红素生物合成途径中的步骤的酶，特别是hemA基因。

12.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述编码(i)、(ii)和任选的(iii)的基因包含在一个或多个表达盒中，所述一个或多个表达盒整合在所述细胞基因组中。

13.一种细胞用于羟化类固醇的碳原子21的用途，其中所述类固醇是medrane或deltamedrane，并且其中所述细胞表达

(i)异源CYP21A2蛋白或其功能性变体，

(iii)一种或多种促进CYP21A2折叠的分子伴侣。

14.一种多顺反子表达载体用于羟化类固醇的碳原子21的用途，其中所述类固醇是medrane或deltamedrane，其中所述多顺反子表达载体包含(i)编码CYP21A2蛋白或其功能性变体的核酸，(ii)编码至少一种能够将电子转移至CYP21A2的异源电子转移系统的一种或多种核酸，和任选的(iii)编码促进CYP21A2折叠的分子伴侣的一种或多种核酸。

15.一种试剂盒用于羟化类固醇的碳原子21的用途，其中所述类固醇是medrane或deltamedrane，其中所述试剂盒包含

-权利要求13中限定的细胞，

-权利要求14中限定的多顺反子表达载体，或

-(i)包含编码CYP21A2蛋白或其功能性变体的核酸的表达载体，(ii)包含编码至少一种能够将电子转移至CYP21A2的异源电子转移系统的一种或多种核酸的一个或多个表达载体，和任选的(iii)包含编码促进CYP21A2折叠的分子伴侣的一种或多种核酸的一个或多个表达载体。