JP2012005497A - セコジオン誘導体のエナンチオ選択的な酵素的還元の方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】セコジオン誘導体を、コファクターとしてNADHまたはNADPHの存在下、酸化還元酵素/脱水素酵素を用いてエナンチオ選択的に還元する方法。セコジオン誘導体は、反応バッチ中で、≧10g/lの濃度で使用される。結果として生じる光学的に活性なヒドロキシセコステロイド化合物(セコール)は、連続的に、環化によりキラルステロイド化合物へと処理することができ、その間、キラリティーは維持される。また、酸化還元酵素/脱水素酵素により形成される酸化されたコファクターNADまたはNADPは、連続的に再生される。
【選択図】なし
Description
R1は、水素またはC1−C4アルキル基であり、
R2は、水素、C1−C8アルキル基、または例えばエステル等のような先行技術において知られているOHのための保護基であり、
R3は水素、メチル基、またはハロゲンであり、
構造要素
二重結合は、6/7または7/8位において任意に含まれ、
1、2、4、5、6、7、8、9、11、12、および16位の炭素は、それぞれ、水素、C1−C4アルキル基、ハロゲン、またはフェニル基で置換される、
セコジオン誘導体は、コファクターとしてNADHまたはNADPHの存在下、酸化還元酵素/脱水素酵素を用いて還元され、
該方法は、セコジオン誘導体が、反応バッチ中で、≧10g/lの濃度で使用されること、および酸化還元酵素/脱水素酵素により形成される、酸化されたコファクターNADまたはNADPが連続的に再生されることを特徴とする。
a)配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4または配列番号5のアミノ酸配列に対して、少なくとも50%のアミノ酸が一致するアミノ酸配列を含む、
b)配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、または配列番号10の核酸配列によりコードされる、または
c)ストリンジェントな条件下、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、または配列番号10にハイブリダイズする核酸配列によってコードされる
ことを特徴とする。
nalvtgasrgig、nalvtggsrgig、nalitggsrgig、nalitgasrgig、nalitggsrgmg、halvtgasrgig、
gysvtla、gynvtla、gysvtlv、gynvtlv、
fkgaplpa、fkaaplpa、
fvsnag、ffsnag、fvcnag、fvanag、
spialtkal、spvaltkti、spialtktl、spvamtkal、sqialtkal、
avysask、avysatk、
pikgwiおよびpisgwi
からなる群から選択される一またはいくつかの部分配列を含むことを特徴とする。
a)配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4または配列番号5のアミノ酸配列に対して、少なくとも50%のアミノ酸が一致するアミノ酸配列を含む、
b)酸化還元酵素/脱水素酵素が、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、または配列番号10の核酸配列によりコードされる、または
c)ストリンジェントな条件下、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、または配列番号10にハイブリダイズする核酸配列によってコードされる。
A)クロロフレクサス・アウランティアクス(Chloroflexus auratiacus)DSM 635の培養
クロロフレクサス・アウランティアクス(Chloroflexus auratiacus)DSM 635の細胞は、細菌のインキュベーター中、48℃、光の下、以下の培養液(pH8.2)中で培養された:0.1%酵母抽出物、0.1%グリシルグリシン、0.01%リン酸水素二ナトリウム・二水和物、0.01%硫酸マグネシウム・七水和物、0.01%硝酸カリウム、0.05%硝酸ナトリウム、0.01%塩化ナトリウム、0.005%塩化カルシウム・二水和物、5mlの0.01%クエン酸鉄(III)溶液、1mlの微量元素溶液SL-6[500μl/l硫酸、2.28g/l硫酸マンガン・一水和物、500mg/l硫酸亜鉛・七水和物、500mgホウ酸、25mg/l硫酸銅・五水和物、25mg/lモリブデン酸ナトリウム・二水和物、45mg/l塩化コバルト・六水和物]。培養12日目、細胞は遠心分離により培養液から分離され、−80℃にて保存された。
ゲノムDNAは、Manniatis & Sambrookによる「Molecular Cloning」に記載された方法に従って抽出された。得られた核酸は、NCBIデータベースに番号76258197で公開された遺伝子配列に由来する特異的なプライマーに関わるポリメラーゼ連鎖反応(PCR)のためのテンプレートとして役立った。そうすることで、プライマーは、発現ベクターへの次のクローニングのため、それぞれエンドヌクレアーゼNde IおよびHind IIIまたはSph Iの制限部位を有する5’末において提供された(配列番号11、配列番号12、配列番号13)。
サイクル1:94℃・2分
サイクル2x30:94℃・30秒、56℃・30秒、68℃・60秒
サイクル3:68℃・7分、4℃・∞。
それぞれ、発現コンストラクトを用いて形質転換された大腸菌BL21 Star(Invitrogen、Karlsruhe、ドイツ)および大腸菌RB791(E. coli genetic stock, Yale、USA)は、それぞれアンピシリン(50μg/ml)またはカルベニシリン(50μg/ml)を有する200mlLB培地(1%トリプトン、0.5%酵母抽出物、1%塩化ナトリウム)中で、550nmにおける吸光度(OD)が0.5に届くまで培養された。組換えタンパク質の発現は、0.1mMの濃度でイソプロピルチオガラクトシド(IPTG)を添加することによって誘導された。25℃において220rpmでの8時間または16時間の誘導の後、細胞は回収され、−20℃で凍結された。活性試験のために、10mgの細胞は、500μlの100mM TEAバッファーpH7.0と500μlのガラスビーズと混合され、10分間グローブミルを用いて消化された。得られたライセートは、それぞれの測定のため希釈された状態で使用された。活性試験は、以下の通りに構成された:870μlの100mM TEAバッファー pH7.0、NADH160μg、希釈された細胞ライセート10μl。反応は、100μlの100mM基質溶液を反応混合物に添加することにより開始された。
スクリーニングのため、酵母株ピキア・ファリノサ(Pichia farinosa)DSM 70362、カンジダ・グロペンギエセリ(Candida gropengiesseri)MUCL 29836、カンジダ・バクチニ(Candida vaccinii)CBS 7318、ピキア・ファリノサ(Pichia farinosa)DSM 3316、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)CBS 1508およびカンジダ・マグノリアエ(Candida magnoliae)CBS 6396を、以下の培養液中で培養した:酵母抽出物(5)、ペプトン(5)、およびグルコース(20)(括弧内の数字はいずれの場合もg/l)。培養液は121℃で滅菌され、酵母は25℃、毎分140回転のシェーカー上で、さらなるpH調整なしで培養された。
A)単離(全およびmRNA)およびcDNAライブラリーの調製
生きた細胞600mgを、氷冷LETSバッファー2.5ml中に再懸濁した。硝酸で洗浄されて3mlのフェノール(pH7.0)を用いて平衡されたガラスビーズ5ml(約20g)を前記細胞懸濁液に加えた。バッチ全体は、交互にボルテックス30秒と氷上で冷却30秒、合わせて10分間処理された。次に、氷冷LETSバッファーを添加し、これを再び勢いよくボルテックスした。前記細胞懸濁液は、4℃、11000gで5分間遠心分離された。水相は回収され、2回、等量のフェノール:クロロフォルム:イソアミルアルコール(24:24:1)を用いて抽出された。続いてクロロフォルムを用いた抽出が行われた。最後の抽出の後、全RNAは、1/10容量の5M塩化リチウムを添加することにより、−20℃で4時間沈殿された。
特異的なプライマーが、適した発現系への全長転写物のクローニングのために作成された。そうすることで、それぞれNde IおよびSph Iの認識配列を有する5’プライマー、およびそれぞれXho IおよびSac Iの認識配列を有する3’プライマーが修正された(配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17)。カンジダ・マグノリアエ(Candida magnoliae)の発現ライブラリーのクローン(cM4)から単離されたプラスミドDNAは、ポリメラーゼ連鎖反応のためのテンプレートとして役立った。増幅は、PCRバッファー[10mM Tris-HCl(pH 8.0);50mM塩化カリウム;10mM硫酸マグネシウム;1mM dNTP Mix;いずれの場合にも20pMolのプライマーおよび2.5UのPlatinum Pfx DNAポリメラーゼ(Invitrogen)]中で、テンプレート50ngを用いて、以下の温度サイクルで行われた:
サイクル1:94℃・2分
サイクル2x30:94℃・15秒、58℃・30秒、68℃・75秒
サイクル3:68℃・7分、4℃・∞。
コンピテント大腸菌StarBL21(De3)細胞(Invitrogen)およびRB791細胞(E. coli genetic stock, Yale, USA)は、それぞれ、酸化還元酵素をコードする発現コンストラクトpET21−MgIVおよびpQME70−MgIVで形質転換された。発現コンストラクトで形質転換された大腸菌コロニーは、それぞれ50μg/mlのアンピシリンまたは40μg/mlのカナマイシンを含む200mlLB培地(1%トリプトン、0.5%酵母抽出物、1%塩化ナトリウム)中で、550nmにおける吸光度が0.5に届くまで培養された。組換えタンパク質の発現は、0.1mMの濃度でイソプロピルチオガラクトシド(IPTG)を添加することによって誘導された。25℃において220rpmでの16時間の誘導の後、細胞は回収され、−20℃で凍結された。活性試験のために、10mgの細胞は、500μlの100mM TEAバッファーpH7.0、1mM塩化マグネシウムおよび500μlのガラスビーズと混合され、10分間グローブミルを用いて消化された。得られたライセートは、それぞれの測定のため希釈された状態で使用された。
エチルセコジオン(式III)の還元のため、バッファー(100mMリン酸カリウム、pH=7、2mM塩化マグネシウム)800μl、2−プロパノール1.2ml、NAD0.08mg、エチルセコジオン(式III)100mgおよび酵素懸濁液酸化還元酵素 配列番号1(実施例3参照)1mlの混合物を、反応容器中、室温にて24時間、ずっと一定に混合しながら培養した。96時間後、使用したエチルセコジオン(式III)の>90%が還元されていた。
エチルセコジオン(式III)の還元のため、バッファー(100mM トリエタノールアミン、pH=8、2mM塩化マグネシウム)250μl、4−メチル−2−ペンタノール250μl、NAD0.02mg、エチルセコジオン(式III)25mgおよび酵素懸濁液酸化還元酵素 配列番号2(実施例3参照)25μlの混合物を、反応容器中、室温にて96時間、ずっと一定に混合しながら培養した。96時間後、使用したエチルセコジオン(式III)の>30%がヒドロキシ化合物に還元されていた。
エチルセコジオン(式III)の還元のため、バッファー(100mM トリエタノールアミン、pH=7、2mM塩化マグネシウム)100μl、4−メチル−2−ペンタノール400μl、NADP0.02mg、エチルセコジオン(式III)25mgおよび酵素懸濁液酸化還元酵素 配列番号3(実施例3参照)100μlの混合物を、反応容器中、室温にて72時間、ずっと一定に混合しながら培養した。72時間後、使用したエチルセコジオン(式III)の>95%がヒドロキシ化合物に還元されていた。
エチルセコジオン(式III)の還元のため、バッファー(100mM トリエタノールアミン、pH=9、2mM塩化マグネシウム)200μl、2−ヘプタノール300μl、NADP0.025mg、エチルセコジオン(式III)100mgおよび酵素懸濁液酸化還元酵素 配列番号4(実施例3参照)50μlの混合物を、反応容器中、室温にて72時間、ずっと一定に混合しながら培養した。72時間後、使用したエチルセコジオン(式III)の>80%がヒドロキシ化合物に還元されていた。
エチルセコジオン(式III)の還元のため、バッファー(100mM トリエタノールアミン、pH=7、2mM塩化マグネシウム)300μl、4−メチル−2−ペンタノール1.2ml、NADP0.12mg、エチルセコジオン(式III)150mgおよび酵素懸濁液酸化還元酵素 配列番号5(実施例3参照)0.6mlの混合物を、反応容器中、室温にて72時間、ずっと一定に混合しながら培養した。72時間後、使用したエチルセコジオン(式III)の>90%がヒドロキシ化合物に還元されていた。
Claims (16)
- 一般式Iのセコジオン誘導体のエナンチオ選択的な酵素的還元の方法であって、
R1は、水素またはC1−C4アルキル基であり、
R2は、水素、C1−C8アルキル基、またはエステル等のような先行技術において知られているOHのための保護基であり、
R3は水素、メチル基、またはハロゲンであり、
構造要素
二重結合は、6/7または7/8位において任意に含まれ、
1、2、4、5、6、7、8、9、11、12、および16位の炭素は、それぞれ、水素、C1−C4アルキル基、ハロゲン、またはフェニル基で置換される、
セコジオン誘導体は、コファクターとしてNADHまたはNADPHの存在下、酸化還元酵素/脱水素酵素を用いて還元され、
セコジオン誘導体が、反応バッチ中で、≧10g/lの濃度で使用されること、および酸化還元酵素/脱水素酵素により形成される、酸化されたコファクターNADまたはNADPが連続的に再生されることを特徴とする該方法。 - セコジオン誘導体が、コファクターとしてNADHまたはNADPHの存在下、酸化還元酵素/脱水素酵素を用いて還元される、一般式Iのセコジオン誘導体のエナンチオ選択的な酵素的還元の方法であって、酸化還元酵素/脱水素酵素が、
a)配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4または配列番号5のアミノ酸配列に対して、少なくとも50%のアミノ酸が一致するアミノ酸配列を含む、
b)配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、または配列番号10の核酸配列によりコードされる、または
c)ストリンジェントな条件下、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、または配列番号10にハイブリダイズする核酸配列によってコードされる
ことを特徴とする該方法。 - セコジオン誘導体が、コファクターとしてNADHまたはNADPHの存在下、酸化還元酵素/脱水素酵素を用いて還元される、一般式Iのセコジオン誘導体のエナンチオ選択的な酵素的還元の方法であって、酸化還元酵素/脱水素酵素が、230から260アミノ酸長を有し、[配列番号18から配列番号42]
nalvtgasrgig、nalvtggsrgig、nalitggsrgig、nalitgasrgig、nalitggsrgmg、halvtgasrgig、
gysvtla、gynvtla、gysvtlv、gynvtlv、
fkgaplpa、fkaaplpa、
fvsnag、ffsnag、fvcnag、fvanag、
spialtkal、spvaltkti、spialtktl、spvamtkal、sqialtkal、
avysask、avysatk、
pikgwiおよびpisgwi
からなる群から選択される一またはいくつかの部分配列を含むことを特徴とする該方法。 - 酸化還元酵素/脱水素酵素が
a)配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4または配列番号5のアミノ酸配列に対して、少なくとも50%のアミノ酸が一致するアミノ酸配列を含む、
b)配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、または配列番号10の核酸配列によりコードされる、または
c)ストリンジェントな条件下、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、または配列番号10にハイブリダイズする核酸配列によってコードされる
ことを特徴とする請求項1記載の方法。 - 酸化還元酵素/脱水素酵素が、230から260アミノ酸長を有し、[配列番号18から配列番号42]
nalvtgasrgig、nalvtggsrgig、nalitggsrgig、nalitgasrgig、nalitggsrgmg、halvtgasrgig、
gysvtla、gynvtla、gysvtlv、gynvtlv、
fkgaplpa、fkaaplpa、
fvsnag、ffsnag、fvcnag、fvanag、
spialtkal、spvaltkti、spialtktl、spvamtkal、sqialtkal、
avysask、avysatk、
pikgwiおよびpisgwi
からなる群から選択される一またはいくつかの部分配列を含むことを特徴とする請求項1記載の方法。 - 酸化還元酵素/脱水素酵素によって形成される酸化されたコファクターNADまたはNADPが、連続的に再生されることを特徴とする、請求項2または3記載の方法。
- 酸化されたコファクターNADまたはNADPが、アルコールの酸化によって再生されることを特徴とする、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 一般式RXRYCHOHを有する二級アルコールがコファクターの再生のために使用され、ここでRXおよびRYは、それぞれ、水素、分岐したまたは分岐していないC1−C8アルキル基、およびCtotal≧3であることを特徴とする、請求項7記載の方法。
- 2−プロパノール、2−ブタノール、2−ペンタノール、4−メチル−2−ペンタノール、2−ヘキサノール、2−ヘプタノール、5−メチル−2−ヘキサノール、シクロヘキサノール、または2−オクタノールからなる群のアルコールが、コファクターの再生のために使用されることを特徴とする、請求項7記載の方法。
- 酸化還元酵素/脱水素酵素が、コファクターの再生のためにさらに加えられることを特徴とする、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- TTN(全変換率=還元されたセコジオン誘導体のモル/使用されたコファクターのモル)が≧103であることを特徴とする、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
- 水有機二相系で実施されることを特徴とする、請求項1から11のいずれか1項に記載の方法。
- 有機溶媒、好ましくは、ジエチルエーテル、三級ブチルメチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ジブチルエーテル、酢酸エチル、酢酸ブチル、ヘプタン、ヘキサン、トルエン、ジクロロメタン、シクロヘキサン、またはそれらの混合物がさらに使用されることを特徴とする、請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法。
- セコジオン誘導体が、反応バッチ中で、全容量に基づいて、10g/lから500g/l、好ましくは25g/lから300g/l、特に好ましくは50g/lから200g/lの量で使用されることを特徴とする、請求項1から13のいずれか1項に記載の方法。
- セコジオン誘導体として、13−エチル−3−メトキシ−8,14−セコ−ゴナ−1,3,5(10),9(11)−テトラエン−14,17−ジオン(エチルセコジオン−式III)が使用されることを特徴とする、請求項1から14のいずれか1項に記載の方法。
- セコジオン誘導体として、13−メチル−3−メトキシ−8,14−セコ−ゴナ−1,3,5(10),9(11)−テトラエン−14,17−ジオン(メチルセコジオン−式II)が使用されることを特徴とする、請求項1から14のいずれか1項に記載の方法。
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