ES2588706T3

ES2588706T3 - Oxidorreductasa y su uso para la reducción de derivados de secodiona

Info

Publication number: ES2588706T3
Application number: ES11177932.8T
Authority: ES
Inventors: Antje Gupta; Anke Tschentscher; Maria Dupont
Original assignee: Cambrex IEP GmbH
Current assignee: Cambrex IEP GmbH
Priority date: 2006-12-07
Filing date: 2007-12-07
Publication date: 2016-11-04
Anticipated expiration: 2027-12-07
Also published as: CA2671319A1; AT504542B1; KR20110107874A; US20120040424A1; PL2410047T3; PT2087127E; ES2386380T3; WO2008068030A3; JP2012005497A; CA2671319C; CN102382805A; EP2087127B1; CN101595224A; KR101445191B1; AU2007327842B2; EP2410047B9; KR101474816B1; ZA200904235B; CN101595224B; JP5627546B2

Abstract

Polipéptido con actividad oxidorreductasa que a) presenta la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 3 o b) es codificado por la secuencia de ácido nucleico SEQ ID NO: 8 y reduce derivados de secodiona de fórmula general I**Fórmula** en la que las estructuras de anillo no comprenden heteroátomos o comprenden uno o varios heteroátomos, R1 es hidrógeno o un grupo alquilo C1-C4, R2 es hidrógeno, un grupo alquilo C1-C8 o un grupo protector de OH, tal como un éster, R3 es hidrógeno, un grupo metilo o un haluro, el elemento estructural**Fórmula** representa un anillo de benceno o un anillo C6 con 0, 1 o 2 dobles enlaces C-C, en las posiciones 6/7 o 7/8 está contenido dado el caso un doble enlace y el carbono en las posiciones 1, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12 y 16 está independientemente sustituido con hidrógeno, un grupo alquilo C1-C4, un haluro o un grupo fenilo, en presencia de NADH o NADPH como cofactor.

Description

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DESCRIPCION

Oxidorreductasa y su uso para la reduccion de derivados de secodiona

La presente invencion se refiere a una oxidorreductasa para la reduccion enzimatica enantioselectiva de derivados de secodiona de formula general I, en la que el derivado de secodiona se reduce con una oxidorreductasa/deshidrogenasa en presencia de NADH o NADPH como cofactor.

La produccion industrial de hormonas esteroideas se realiza de dos modos independientes entre sf, a saber, por un lado a partir de compuestos esteroideos de origen natural de fuentes vegetales y por otro lado de forma totalmente sintetica mediante smtesis enantioselectiva a partir de precursores proquirales. De estos dos modos, la smtesis total de esteroides esta volviendose cada vez mas importante, sobre todo porque esta permite tambien la introduccion de elementos estructurales que no estan contenidos en esteroides de origen natural.

Los componentes clave de la smtesis total de esteroides enantiomericamente puros son a este respecto compuestos de formula general I que se designan tambien como secoesteroides, 8,14-seco-gona-tetraen-14,17-dionas o secodionas. Son representantes especiales de este grupo, por ejemplo, los compuestos metilsecodiona (formula II, 13-metil-3-metoxi-8,14-seco-gona-1,3,5(10),9(11)-tetraen-14,17-diona) y etilsecodiona (formula III, 13-etil-3-metoxi- 8,14-seco-gona-1,3,5(10),9(11)-tetraen-14,17-diona), a partir de los cuales pueden prepararse, por ejemplo, los compuestos farmacologicamente activos etinilestradiol (formula IV) y norgestrel (formula V).

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La etapa clave en la preparacion de compuestos esteroideos enantiomericamente puros es a este respecto la transformacion del compuesto de formula I (por ejemplo, II y III) en un compuesto opticamente activo con C-13 asimetrico preformado mediante reduccion enantioselectiva de uno de los grupos cetona para dar el grupo hidroxilo. Los compuestos hidroxisecoesteroideos opticamente activos resultantes (secoles, formulas VI a IX) pueden procesarse a continuacion mediante ciclacion con mantenimiento de la quiralidad para dar compuestos esteroideos quirales.

Mediante la reduccion enantioselectiva de un grupo cetona del compuesto de formula I pueden formarse teoricamente cuatro compuestos opticamente activos (formulas VI a IX).

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Son de especial interes economico a este respecto los compuestos de formula VI en los que el grupo hidroxilo en la position 17 presenta la configuration beta, ya que estos conducen a derivados de estrona natural. Dichos compuestos se designan tambien como 17-beta-hidroxisecoesteroides.

La reduction estereoselectiva de los derivados de secodiona de formula general I con la ayuda de distintos microorganismos se estudio con especial intensidad en los anos 60 y 70 del siglo XX. A este respecto, pudo mostrarse que distintas cepas de levadura del genero Candida, Debaryomyces, Kloeckera, Pichia, Cryptococcus, Rhodotorula, Torulopsis y Hansenula pueden reducir secodionas para dar los distintos compuestos de hidroxilo (documentos US 3616226, US 1252524, US 3616225).

Particularmente, las levaduras del genero Saccharomyces, como por ejemplo, S. uvarum, pueden usarse ventajosamente para preparar, por ejemplo, los correspondientes 17-beta-hidroxisecoesteroides (Kosmol et al.; Liebigs Ann. Chem. 701, 199 (1967)). Otras cepas de levadura, como por ejemplo Saccharomyces drosophilarum, reducen la secodiona preferentemente para dar el correspondiente 14-alfa-hidroxisecoesteroide (Acta Microbiol. Acad. Sci. hung. 22, 463-471 (1975)). Se describe ademas la formation de 14-alfa-hidroxisecoesteroide tambien mediante reduccion de secodiona por medio de Bacillus thuringiensis (Kosmol et al.; Liebigs Ann. Chem. 701, 199 (1967)).

Los principios activos gestagenicos y estrogenicos encuentran una amplia aplicacion en el mundo como anticonceptivos y en terapia de sustitucion hormonal. Hasta ahora, la mayoria de las smtesis de derivados estrogenicos y gestagenicos se basan en el principio de reaction anteriormente descrito, cuya etapa clave representa la reduccion enantioselectiva de secodionas para dar los correspondientes 17-beta- hidroxisecoesteroides.

La reduccion estereoselectiva de los derivados de secodiona se realiza a este respecto hasta ahora como una biotransformacion en celula entera mediante distintas cepas de levadura del genero Pichia o Saccharomyces. Estos procedimientos poseen sin embargo la desventaja de que son practicables solo a muy bajas concentraciones de sustrato bastante por debajo del 1 % (generalmente de 1 a 5 g/l) (documento US 3697379; Current Science, 5 de feb. (1984), vol. 53, n° 3, pagina 124; Indian Journal of Experimental Biology, vol. 27, agosto de 1989, paginas 742743). Asi, resulta ser muy costoso particularmente el procesamiento y aislamiento del producto de reaccion a partir de grandes volumenes, asi como la separation de grandes cantidades de biomasa.

Al entender del inventor, no se han aislado, identificado ni descrito hasta ahora las enzimas participates en la reduccion. Igualmente, no se han identificado todavia secuencias de ADN que codifiquen oxidorreductasas con las que pueda conseguirse la reduccion de derivados de secodiona.

La invention tiene por tanto el objetivo de proporcionar una oxidorreductasa, con la que puedan reducirse enantioselectivamente derivados de secodiona de formula general I, particularmente aquellos de formula II y III. Entre otros, debe ser posible en este sentido la preparation de los correspondientes 17-beta-hidroxisecoesteroides.

El alcance de protection de la invencion se determina por las reivindicaciones 1 a 3. En un primer aspecto se soluciona este objetivo de acuerdo con la invencion mediante una oxidorreductasa para la reduccion enzimatica enantioselectiva de derivados de secodiona de formula general I,

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El documento EP 1 152 054 B1 divulga un polinucleotido, un polipeptido codificado por el polinucleotido y un procedimiento para la reduccion asimetrica de (S)-6-cloro-5-hidroxi-3-oxohexanoato de terc-butilo para dar (3R,5S)- 6-cloro-3,5-dihidroxihexanoato de terc-butilo, catalizandose la reaccion de reduccion por medio del polipeptido. El polinucleotido y el polipeptido pueden derivarse de microorganismos del genero Candida, en particular de la especie Candida magnoliae IFO 0705. En la que las estructuras de anillo no comprenden heteroatomos o comprenden uno o varios heteroatomos,

R1 es hidrogeno o un grupo alquilo C1-C4,

R2 es hidrogeno, un grupo alquilo C1-C8 o un grupo protector de OH, tal como un ester,

R3 es hidrogeno, un grupo metilo o un haluro,

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el elemento estructural

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representa un anillo de benceno o un anillo C6 con 0, 1 o 2 dobles enlaces C-C, en las posiciones 6/7 o 7/8 esta contenido eventualmente un doble enlace y el carbono en las posiciones 1, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12 y 16 esta independientemente sustituido con hidrogeno, un grupo alquilo C1-C4, un haluro o un grupo fenilo, reduciendo la oxidorreductasa/deshidrogenasa el derivado de secodiona en presencia de NADH o NADPH como cofactor.

El derivado de secodiona se usa en una concentracion de >10 g/l en la mezcla de reaccion y el cofactor NAD o NADP oxidado formado por la oxidorreductasa/deshidrogenasa se regenera continuamente.

Este procedimiento representa una mejora esencial de la reduccion enzimatica enantioselectiva de derivados de secodiona frente al estado de la tecnica. La oxidorreductasa de acuerdo con la invencion permite la reduccion de derivados de secodiona para dar los distintos hidroxisecoesteroideos correspondientes con enzimas libres en intervalos de concentracion que superan con mucho los descritos en el estado de la tecnica. En un segundo aspecto se usa una oxidorreductasa de acuerdo con la invencion para la reduccion enzimatica enantioselectiva de derivados de secodiona de formula general I, reduciendose el derivado de secodiona con una oxidorreductasa/deshidrogenasa en presencia de NADH o NADPH como cofactor, y la oxidorreductasa/deshidrogenasa

a) presenta una secuencia de aminoacidos, en la que al menos el 80 % de los aminoacidos son identicos con la secuencia de aminoacidos SEQ ID NO: 3 o

b) se codifica por la secuencia de acido nucleico SEQ ID NO: 8 y se codifica por una secuencia de acido nucleico, que hibrida con la SEQ ID NO: 8 en condiciones rigurosas, comprendiendo las condiciones rigurosas la hibridacion en solucion NaCl 0,7-1 M a 60 °C.

Se han identificado por los inventores oxidorreductasas que pueden reducir derivados de secodiona para dar hidroxisecoesteroides y que pueden prepararse industrialmente de forma recombinante. Mediante la oxidorreductasa de acuerdo con la invencion pueden conseguirse concentraciones de sustrato esencialmente mayores que en el procedimiento de celula entera usado actualmente.

En el procedimiento puede usarse la oxidorreductasa con la secuencia SEQ ID NO: 3 o un polipeptido que puede derivarse de este polipeptido o bien totalmente purificado, parcialmente purificado o como celulas que contienen el polipeptido SEQ ID NO: 3. Las celulas usadas pueden presentarse a este respecto en forma nativa, permeabilizada o lisada. Preferentemente, las oxidorreductasas o derivados que pueden derivarse de las mismas se sobreexpresan en un organismo huesped adecuado, como por ejemplo Escherichia coli, y se usa el polipeptido recombinante para la reduccion de los derivados de secodiona de formula general I.

Una secuencia de ADN no de acuerdo con la invencion de SEQ ID NO: 6, que codifica un polipeptido con la SEQ ID NO: 1, puede obtenerse por ejemplo a partir del genoma del organismo Chloroflexus aurantiacus DSM 635.

Una secuencia de ADN no de acuerdo con la invencion de SEQ ID NO: 7, que codifica un polipeptido con la SEQ ID NO: 2, puede obtenerse por ejemplo a partir del genoma del organismo Rubrobacterxylanophilus DSM 9941.

Una secuencia de ADN SEQ ID NO: 8, que codifica un polipeptido con la SEQ ID NO: 3, puede obtenerse a partir de una levadura Candida magnoliae CBS 6396.

Las oxidorreductasas de SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5 no de acuerdo con la invencion pueden obtenerse por ejemplo mediante cribado de homologfa a partir de Candida magnoliae DSMZ 70638. Se entiende por una secuencia de acido nucleico que hibrida, por ejemplo, con la SEQ ID NO: 6 en condiciones rigurosas, un polinucleotido que puede identificarse mediante el procedimiento de hibridacion de colonias, el procedimiento de hibridacion de placas, el procedimiento de hibridacion Southern o similares usando la SEQ ID NO: 6 o secuencias parciales de la SEQ ID NO: 6 como sonda de ADN. Con este fin, se hibrida el polinucleotido inmovilizado sobre un filtro, por ejemplo, con la SEQ ID NO: 6 en una solucion de NaCl 0,7-1 M a 60 °C. La hibridacion se realiza tal como se describe por ejemplo en Molecular Cloning, A Laboratory Manual, segunda edicion (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) o publicaciones similares.

A continuacion se lava el filtro con solucion de 0,1 a 2 x SSC a 65 °C, entendiendose por solucion de 1 x SSC una mezcla compuesta por NaCl 150 mM y citrato de sodio 15 mM.

Un polinucleotido que hibrida con los polinucleotidos de SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 , SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 10 de la lista de secuencias en las condiciones rigurosas anteriormente citadas, presenta al menos un 80 % de identidad de secuencia con las secuencias de polinucleotidos SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 10, preferentemente al menos un 95 % de identidad.

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En otro aspecto, en un procedimiento para la reduccion enzimatica enantioselectiva de derivados de secodiona de formula general I se reduce el derivado de secodiona con una oxidorreductasa/deshidrogenasa en presencia de NADH o NADPH como cofactor, en el que la oxidorreductasa/deshidrogenasa presenta una longitud de 230 a 260 aminoacidos y comprende una o varias de las secuencias parciales, seleccionadas del grupo constituido por [las secuencias SEQ ID NO: 18 a SEQ ID NO: 42]

nalvtgasrgig, nalvtggsrgig, nalitggsrgig, nalitgasrgig, nalitggsrgmg, halvtgasrgig,

gysvtla, gynvtla, gysvtlv, gynvtlv,

fkgaplpa, fkaaplpa,

fvsnag, ffsnag, fvcnag, fvanag,

spialtkal, spvaltkti, spialtktl, spvamtkal, sqialtkal,

avysask, avysatk,

pikgwi y pisgwi.

En los procedimientos se usa como cofactor NADH o NADPH. Se entiende por el termino “NADP” fosfato del dinucleotido de nicotinamida y adenina, y por “NADPH” fosfato del dinucleotido de nicotinamida y adenina reducido. El termino “NAD” significa dinucleotido de nicotinamida y adenina, el termino “NADH” dinucleotido de nicotinamida y adenina reducido.

De acuerdo con una forma de realizacion del procedimiento, en el que se usa el derivado de secodiona en una concentracion de >10 g/l en la mezcla de reaccion y se regenera continuamente el cofactor NAD o NADP oxidado formado por la oxidorreductasa/deshidrogenasa, presenta la oxidorreductasa/deshidrogenasa

a) una secuencia de aminoacidos, en la que al menos un 80 % de los aminoacidos son identicos con aquellos de la secuencia de aminoacidos SEQ ID NO: 3 o

b) se codifica la oxidorreductasa/deshidrogenasa por la secuencia de acido nucleico SEQ ID NO: 8.

De acuerdo con otra forma de realizacion del procedimiento, en el que se usa el derivado de secodiona en una concentracion de >10 g/l en la mezcla de reaccion y se regenera continuamente el cofactor NAD o NADP oxidado formado por la oxidorreductasa/deshidrogenasa, presenta la oxidorreductasa/deshidrogenasa una longitud de 230 a 260 aminoacidos y comprende una o varias de las secuencias parciales, seleccionadas del grupo constituido por [las secuencias SEQ ID NO: 18 a SEQ ID NO: 42] nalvtgasrgig, nalvtggsrgig, nalitggsrgig, nalitgasrgig, nalitggsrgmg, halvtgasrgig, gysvtla, gynvtla, gysvtlv, gynvtlv, fkgaplpa, fkaaplpa, fvsnag, ffsnag, fvcnag, fvanag, spialtkal, spvaltkti, spialtktl, spvamtkal, sqialtkal, avysask, avysatk, pikgwi y pisgwi. Preferentemente, en el procedimiento de acuerdo con el segundo y tercer aspecto se regenera continuamente el cofactor NAD o NADP oxidado formados por la oxidorreductasa/deshidrogenasa.

De acuerdo con una forma de realizacion de los procedimientos se regenera el cofactor NAD o NADP oxidado mediante oxidacion de un alcohol.

Se usan como cosustrato preferentemente a este respecto alcoholes primarios y secundarios, tales como etanol, 2- propanol, 2-butanol, 2-pentanol, 3-pentanol, 4-metil-2-pentanol, 2-hexanol, 2-heptanol, 2-octanol o ciclohexanol. La proporcion de cosustrato para la regeneracion puede ascender a del 5 % al 95 % en volumen, con respecto al volumen total.

Preferentemente, se usa para la regeneracion del cofactor un alcohol secundario con la formula general RxRyCHOH, en la que Rx y Ry son independientemente entre sf hidrogeno, un grupo alquilo C-i-Cs ramificado o no ramificado y

Ctotales — 3.

De acuerdo con otra forma de realizacion de los procedimientos se anade para la regeneracion del cofactor adicionalmente una oxidorreductasa/deshidrogenasa.

Las alcohol deshidrogenasas dependientes de NADH adecuadas pueden obtenerse, por ejemplo, a partir de levadura de panadena, de Candida parapsilosis (CPCR) (documentos US 5.523.223 y US 5.763.236, Enzyme Microb. Technol., 1993, 15(11):950-8), Pichia capsulata (documento DE 10327454.4), a partir de Rhodococcus erythropolis (RECR) (documento US 5.523.223), Norcardia fusca (Biosci. Biotechnol. Biochem., 63(10), 1999, pag. 1721-1729; Appl. Microbiol. Biotechnol., 2003, 62(4):380-6; Epub 26 de abril de 2003) o Rhodococcus ruber (J. Org. Chem., 2003, 68(2):402-6). Los cosustratos adecuados para estas alcohol deshidrogenasas son, por ejemplo, los alcoholes secundarios ya citados, tales como 2-propanol (isopropanol), 2-butanol, 2-pentanol, 4-metil-2-pentanol, 2- octanol o ciclohexanol.

Las alcohol secundario deshidrogenasas adecuadas para la regeneracion del NADPH son por ejemplo aquellas que se describen y afslan a partir de organismos del orden lactobacilar, por ejemplo, Lactobacillus kefir (documento US 5.200.335), Lactobacillus brevis (DE 19610984 A1; Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. diciembre de 2000; 56 Pt 12: 1696-8), Lactobacillus minor (documento DE 10119274), Leuconostoc carnosum (A 1261/2005, Kl. C12N) o aquellas que se describen a partir de Thermoanerobium brockii, Thermoanerobium ethanolicus o Clostridium beijerincki i.

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Para la regeneracion del cofactor, pueden usarse en principio tambien otros sistemas enzimaticos. Por ejemplo, puede realizarse la regeneracion del cofactor por medio de formiato deshidrogenasa dependiente de NAD o NADP (Tishkov et al., J. Biotechnol. Bioeng. [1999] 64, 187-193, Pilot-scale production and isolation of recombinant NAD and NADP specific formate dehydrogenase). Son cosustratos adecuados de la formiato deshidrogenasa, por ejemplo, sales de acido formico tales como formiato de amonio, formiato de sodio o formiato de calcio.

El TTN (numero de recambio total = mol de compuesto de secodiona reducida/mol de cofactor usado) alcanzado en los procedimientos se encuentra generalmente en el intervalo de 102 a 105, preferentemente asciende este sin embargo a > 103.

De acuerdo con una forma de realizacion se realizan los procedimientos en un sistema organico acuoso de dos fases.

De acuerdo con esto se realiza la reaccion del derivado de secodiona en un sistema de dos fases, que contiene, por ejemplo, un 2-alcohol para la regeneracion del cofactor, una oxidorreductasa, agua, cofactor y el compuesto de secodiona. Sin embargo, pueden estar contenidos aun disolventes organicos adicionales que no participan en la regeneracion del cofactor, es decir, que no contienen grupos hidroxilo oxidables. Preferentemente se usan como disolventes organicos adicionales dietileter, terc-butilmetileter, diisopropileter, dibutileter, acetato de etilo, acetato de butilo, heptano, hexano, tolueno, diclorometano, ciclohexano o mezclas de los mismos.

La proporcion de componentes organicos inmiscibles con agua del sistema de dos fases puede ascender a este respecto a del 10 % al 90 %, preferentemente a del 20 % al 80 %, con respecto al volumen total de la mezcla de reaccion. La proporcion acuosa puede ascender a del 90 % al 10 %, preferentemente a del 80 % al 20 %, con respecto al volumen total de la mezcla de reaccion.

Puede anadirse tambien un tampon al agua, por ejemplo, tampon fosfato de potasio, Tris/HCl, glicina o trietanolamina con un valor de pH de 5 a 10, preferiblemente de 6 a 9. El tampon puede contener adicionalmente aun iones para la estabilizacion o activacion de ambas enzimas, por ejemplo iones magnesio o iones cinc.

Ademas, pueden usarse en los procedimientos aun otros aditivos para la estabilizacion de la enzima usada, por ejemplo glicerina, sorbitol, 1,4-D,L-ditiotreitol (DTT) o dimetilsulfoxido (DMSO).

La concentracion del cofactor NAD(P)H, con respecto a la fase acuosa, asciende a de 0,001 mM a 10 mM, en particular a de 0,01 mM a 1,0 mM. La temperatura puede ascender, dependiendo de las propiedades especiales de las enzimas usadas, a de 10 °C a 70 °C, preferentemente a de 20 °C a 35 °C.

Los derivados de secodiona que van a reducirse son por regla general diffcilmente solubles en agua. El sustrato puede presentarse por tanto durante la reaccion completa o tambien incompletamente disuelto. Si el sustrato no esta completamente disuelto en la mezcla de reaccion, una parte del sustrato se presenta en forma solida y puede formar asf una tercera fase solida. La mezcla de reaccion puede formar durante la reaccion tambien temporalmente una emulsion.

El derivado de secodiona de formula general I se usa en los procedimientos preferentemente en una cantidad de 10 g/l a 500 g/l, preferentemente de 25 g/l a 300 g/l, de manera especialmente preferente de 50 g/l a 200 g/l, con respecto al volumen total, en la mezcla de reaccion.

Las formas de realizacion preferentes de la invencion estan caracterizadas ademas porque se usa como derivado de secodiona 13-etil-3-metoxi-8,14-seco-gona-1,3,5(10),9(11)-tetraen-14,17-diona (etilsecodiona - formula III) o 13- metil-3-metoxi-8,14-seco-gona-1,3,5(10),9(11)-tetraen-14,17-diona (metilsecodiona - formula II).

Los procedimientos se realizan, por ejemplo, en un recipiente de reaccion de vidrio o metal. Para ello, se incorporan los componentes individualmente al recipiente de reaccion y se agitan bajo una atmosfera, por ejemplo, de nitrogeno o aire. Segun el compuesto de secodiona usado y la oxidorreductasa, el tiempo de reaccion asciende a de una hora a 7 dfas, en particular a de 2 horas a 48 horas. En este tiempo, se reduce el compuesto de secodiona en al menos un 50 % para dar el correspondiente compuesto hidroxisecoesteroideo.

La presente invencion se explica en mas detalle a continuacion por medio de ejemplos.

Ejemplo 1 (no de acuerdo con la invencion)

Clonacion de una oxidorreductasa de Chloroflexus auratiacus DSM 635 A) Cultivo de Chloroflexus auratiacus DSM 635

Se cultivaron celulas de Chloroflexus auratiacus DSM 635 en el siguiente medio (pH 8,2) a 48 °C en un incubador de bacterias a la luz: 0,1 % de extracto de levadura, 0,1 % de glicil-glicina, 0,01 % de Na2HPO4 x 2 H2O, 0,01 % de MgSO4 x 7 H2O, 0,01 % de KNO3, 0,05 % de NaNOa, 0,01 % de NaCl, 0,005 % de CaCh x 2 H2O, 5 ml de una solucion de citrato de hierro(III) al 0,01 %, 1 ml de solucion de oligoelementos SL-6 [H2SO4 500 |il/l, MnSO4 x H2O 2,28 g/l, ZnSO4 x 7 H2O 500 mg/l, 500 mg de H3BO3, CuSO4 x 5 H2O 25 mg/l, Na2MoO4 x 2 H2O 25 mg/l, CoCl2 x 6

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H2O 45 mg/l]. El d^a 12 del cultivo, se separaron las celulas mediante centrifugacion del medio de cultivo y se almacenaron a -80 °C.

B) Amplificacion del gen que codifica la oxidorreductasa selectiva

Se extrajo ADN genomico segun el procedimiento descrito en “Molecular Cloning” de Manniatis & Sambrook. El acido nucleico resultante sirvio como matriz para la reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) con cebadores espedficos, que se derivaron de la secuencia genica publicada con el numero 76258197 en el banco de datos NCBI. A este respecto, se proporcionaron los cebadores para una posterior clonacion en un vector de expresion 5' terminal con sitios de corte de restriccion para las endonucleasas Nde I e Hind III o Sph I (SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13).

Se realizo la amplificacion en un tampon de PCR [Tris-HCl 10 mM, (pH 8,0); KCl 50 mM; MgSO4 10 mM; mezcla de dNTP 1 mM; 20 pmol de cada cebador y 2,5 U de ADN polimerasa Pfx Platinum (Invitrogen)] con 500 ng de ADN genomico y los siguientes ciclos de temperaturas:

ciclo 1:: 94 °C, 2 min

ciclo 2 x 30:: 94 °C, 30 s

: 56 °C, 30 s

: 68 °C, 60 s

ciclo 3:: 68 °C, 7 min

: 4 °C, ~

Se restringio el producto de PCR resultante de un tamano de aproximadamente 750 pb despues de la purificacion sobre un gel de agarosa al 1 % con ayuda de las endonucleasas Nde I e Hind III, o con las endonucleasas Sph I e Hind III y se ligo en el esqueleto tratado con las mismas endonucleasas de los vectores pET21a (Novagen) o pQE70 (Qiagen). Despues de la transformacion de 2 |il de la preparacion de ligamiento en celulas Top 10 F' de E. coli (Invitrogen), se sometio a ensayo el ADN de plasmido de colonias resistentes a ampicilina (o kanamicina) mediante un analisis de restriccion con las endonucleasas Nde I e Hind III o las endonucleasas Nde I e Hind III para determinar la presencia de un inserto de 750 pb de tamano. Se sometieron las preparaciones de plasmido de los clones positivos para el fragmento a un analisis de secuencia y a continuacion se transformaron en Escherichia coli BL21 Star (Invitrogen) o E. coli RB791 (reserva genetica, Yale).

Ejemplo 2 (no de acuerdo con la invencion)

Expresion de oxidorreductasa de Chloroflexus recombinante en E. coli

Se cultivaron las cepas de Escherichia coli transformadas con el constructo de expresion BL21 Star (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania) o RB791 (reserva genetica de E. coli, Yale, EE.UU.) en 200 ml de medio LB (1 % de triptona, 0,5 % de extracto de levadura, 1 % de NaCl) con ampicilina (50 |ig/ml) o carbenicilina (50 |ig/ml), hasta alcanzar una densidad optica (DO) de 0,5, medida a 550 nm. Se indujo la expresion de protema recombinante mediante adicion de tiogalactosido de isopropilo (IPTG) a una concentracion de 0,1 mM. Despues de 8 horas o 16 horas de induccion a 25 °C y 220 rpm, se recogieron las celulas y se congelaron a -20 °C. Para el ensayo de actividad, se mezclaron 10 mg de celulas con 500 |il de tampon TEA 100 mM pH 7,0 y 500 |il de perlas de vidrio y se disgregaron durante 10 minutos mediante un molino de bolas. El lisado obtenido se uso entonces diluido para las correspondientes mediciones. El ensayo de actividad estaba compuesto como sigue: 870 |il de tampon TEA 100 mM pH 7,0, 160 |ig de NADH, 10 |il de lisado celular diluido. Se inicio la reaccion mediante adicion de 100 |il de una solucion de sustrato 100 mM a la mezcla de reaccion.

Para la obtencion de enzima en grandes cantidades, se resuspendieron 30 g de celulas en 150 ml de tampon trietanolamina (100 mM, pH 7, MgCh 2 mM, 10 % de glicerina) y se disgregaron mediante un homogeneizador de alta presion. Se mezclo a continuacion la solucion enzimatica con 150 ml de glicerina y se almaceno a -20 °C.

Ejemplo 3

Cultivo de organismos y cribado tras reaccion reductora de etilsecodiona (formula III)

Para el cribado se cultivaron las cepas de levadura Pichia farinosa DSM 70362, Candida gropengiesseri MUCL 29836, Candida vaccinii CBS 7318, Pichia farinosa DSM 3316, Saccharomyces cerevisiae CBS 1508 y Candida magnoliae CBS 6396 en el siguiente medio: extracto de levadura (5), peptona (5) y glucosa (20) (los numeros entre parentesis son respectivamente g/l). Se esterilizo el medio a 121 °C y se cultivaron las levaduras sin regulacion del pH adicional a 25 °C con un agitador a 140 revoluciones por minuto.

Se sometio a ensayo la reaccion reductora de etilsecodiona de formula III para dar el correspondiente compuesto hidroxisecoesteroideo en las siguientes preparaciones de biotransformacion de celula entera:

se agitaron 400 mg de celulas recien recogidas en una mezcla de reaccion con 50 mg de glucosa, 10 mg de etilsecodiona de formula III y 900 |il de tampon trietanolamina (TEA) 100 mM pH 7,0 durante 24 horas a 28 °C y a

5

10

15

20

25

30

35

40

1400 rpm. A continuacion se extrajeron las mezclas de reaccion con 1 ml de diclorometano, se centrifugaron, se secaron con nitrogeno y se proporcionaron suspendidas en acetonitrilo para el analisis de HPLC.

Los resultados del cribado se resumen en la tabla 1.

N.° de cepa: Microorganismo Reaccion de etilsecodiona despues de 24 h con cepas Wt

Mezcla de reaccion 24 h

DSM 70362: Pichia farinosa 0,7 %

MUCL 29836: Candida gropengiesseri 0,2 %

CBS 7318: Candida vaccinii 3,2 %

DSM 3316: Pichia farinosa 15,8 %

CBS 1508: Saccharomyces cerevisiae 0,7 %

CBS 6396: Candida magnoliae 41 %

La cepa CBS 6396 mostraba la mayor reaccion de etilsecodiona y se selecciono por tanto como organismo de partida para la preparacion de una biblioteca de ADNc.

Ejemplo 4

Preparacion de una biblioteca de ADNc a partir de Candida magnoliae CBS 6396 y clonacion de oxidorreductasa

A) Aislamiento (de ARN total y ARNm) asf como preparacion de la biblioteca de ADNc

Se resuspendieron 600 mg de celulas recientes en 2,5 ml de tampon LETS enfriado con hielo. Se anadieron a esta suspension celular 5 ml (aproximadamente 20 g) de perlas de vidrio lavadas con acido mtrico, equilibradas con 3 ml de fenol (pH 7,0). Se trato la mezcla de reaccion total entonces respectivamente con 30 s de vortex y 30 s de enfriamiento sobre hielo alternativamente durante en total 10 min. A continuacion se anadieron 5 ml de tampon LETS enfriado con hielo y se mezclo de nuevo fuertemente con vortex. Se centrifugo esta suspension celular durante 5 min a 11000 g a 4 °C. Se obtuvo la fase acuosa y se extrajo dos veces con el mismo volumen de fenol:cloroformo:alcohol isoairnlico (24:24:1). A continuacion siguio la extraccion con cloroformo. Despues de la ultima extraccion se precipito el ARN total mediante adicion de 1/10 vol. de LiCh 5 M a -20 °C durante 4 h.

Se empleo 1 mg del ARN total asf obtenido sobre oligo-dT celulosa (NEB Biolabs) para el enriquecimiento de las moleculas de ARNm. Despues de la precipitacion posterior se usaron 5 |ig de ARNm para la smtesis de ADNc (kit de construccion de la biblioteca de ADNc de pBluescript IIXR, Stratagene). La biblioteca construida segun las instrucciones del fabricante se transformo en E. coli XL-10 Gold y se cribo para determinar la actividad de una ADH. Por medio de la reduccion de la extincion con NADPH o NADH como cofactor y etilsecodiona (formula III) como sustrato, se identifico y aislo un clon (cM4). La secuenciacion del plasmido aislado del clon con el cebador T7 y el cebador T3 dio como resultado un ORF de 789 pb. Este fragmento codificaba una protema de fusion de un tamano de 262 aminoacidos y estaba compuesto por el fragmento a de la p-galactosidasa y la secuencia de una presunta alcohol deshidrogenasa de cadena corta.

B) Smtesis de un transcrito de longitud completa que codifica una ADH de cadena corta de Candida magnoliae CBS 6396 mediante PCR

Se construyeron cebadores espedficos para una posterior clonacion del transcrito de longitud completa en el sistema de expresion oportuno. A este respecto se modifico el cebador en 5' con una secuencia de reconocimiento de Nde I o Sph I y el cebador en 3' con una secuencia de reconocimiento de Xhol o SacI (SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SeQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17). El ADN de plasmido, aislado a partir del clon (cM4) de la biblioteca de expresion de Candida magnoliae, sirvio como matriz para la reaccion en cadena de la polimerasa. La amplificacion se realizo en un tampon de PCR [Tris-HCl 10 mM (pH 8,0); KCl 50 mM; MgSO4 10 mM; mezcla de dNTP 1 mM; 20 pmol de cada cebador y 2,5 U de ADN polimerasa Pfx Platinum (Invitrogen)] con 50 ng de matriz y los siguientes ciclos de temperatura:

ciclo 1: ciclo 2 x 30:

ciclo 3:

94 °C, 2 min 94 °C, 15 s 58 °C, 30 s 68 °C, 75 s 68 °C, 7 min 4 °C, ~

Se restringio el producto de PCR resultante despues de purificacion sobre gel de agarosa al 1 % con ayuda de las endonucleasas Nde I y Xho I o las endonucleasas Sph I y Sac I y se ligo el esqueleto tratado con las mismas

5

10

15

20

25

30

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45

50

endonucleasas de los vectores pET21 a (Novagen) o pQME70. Despues de la transformacion de 2 |il de la preparacion de ligamiento en celulas Top 10 F' de E. coli (Invitrogen), se sometio a ensayo el ADN de plasmido de colonias resistentes a ampicilina (o kanamicina) mediante un analisis de restriccion con las endonucleasas Nde I y Xho I o las endonucleasas Sph I y SacI para determinar la presencia de un inserto de 750 pb de tamano. Se secuenciaron los constructos de expresion pET21-MgIV y pQME70-MgIV. El gen que codifica una oxidorreductasa de cadena corta de Candida magnoliae posefa un marco de lectura abierto de en total 729 pb (contenido en la SEQ ID NO: 8) que correspondfa a una protema de 243 aminoacidos (SEQ ID NO: 3).

Ejemplo 5

Expresion de oxidorreductasa recombinante en celulas de E. coli

Se transformaron celulas de Escherichia coli competentes StarBL21 (De3) (Invitrogen) o RB791 (reserva genetica de E. coli, Yale, EE.UU.) con los constructos de expresion pET21-MgIV o pQME70-MgIV, que codifican la oxidorreductasa. Se cultivaron entonces las colonias de Escherichia coli transformadas con los constructos de expresion en 200 ml de medio LB (1 % de triptona, 0,5 % de extracto de levadura, 1 % de NaCl) con ampicilina 50 |ig/ml o kanamicina 40 |ig/ml, hasta alcanzar una densidad optica de 0,5, medida a 550 nm. Se indujo la expresion de protema recombinante mediante adicion de tiogalactosido de isopropilo (IPTG) en una concentracion de 0, 1 mM. Despues de 16 horas de induccion a 25 °C y 220 rpm, se recogieron las celulas y se congelaron a -20 °C. Para el ensayo de actividad se mezclaron 10 mg de celulas con 500 |il de tampon TEA 100 mM pH 7,0, MgCh 1 mM y 500 |il de perlas de vidrio y se disgregaron durante 10 min mediante un molino de bolas. El lisado obtenido se uso entonces diluido para las correspondientes mediciones.

El ensayo de actividad estaba compuesto como sigue: 960 |il de tampon TEA 100 mM pH 7,0, MgCh 1 mM, 160 |ig de NADPH, 10 |il de lisado celular diluido. Se inicio la reaccion mediante adicion de 10 |il de una solucion de sustrato 100 mM en 70 % de metanol a la mezcla de reaccion.

Para la obtencion de enzima en grandes cantidades se resuspendieron 30 g de celulas en 150 ml de tampon trietanolamina (100 mM, pH 7, MgCh 2 mM, 10 % de glicerina) y se disgregaron mediante homogeneizador de alta presion. Se mezclo a continuacion la solucion enzimatica con 150 ml de glicerina y se almaceno a -20 °C.

Ejemplo 6 (no de acuerdo con la invencion)

Reduccion de etilsecodiona (formula III) mediante la oxidorreductasa de SEQ ID NO: 1

Para la reduccion de etilsecodiona (formula III) se incubo en un recipiente de reaccion una mezcla de 800 |il de tampon (fosfato de potasio 100 mM, pH = 7, MgCh 2 mM), 1, 2 ml de 2-propanol, 0, 08 mg de NAD, 100 mg de etilsecodiona (formula III) y 1 ml de suspension enzimatica de oxidorreductasa de SEQ ID NO: 1 (vease el ejemplo 3) durante 24 h a temperatura ambiente con mezclado constante. Despues de 96 h se redujo >90 % de la etilsecodiona (formula III) usada.

Tras finalizar la reaccion se proceso la mezcla de reaccion mediante extraccion con diclorometano, se separo la fase organica que contema el producto y se obtuvo el compuesto de 17-beta-hidroxilo (etilsecol) mediante evaporacion/destilacion del disolvente.

La reaccion de la etilsecodiona para dar etilsecol se siguio mediante HPLC. Para ello se uso una columna de separacion EC 125/4 Nucleodur 100-5 C18ec (Machery-Nagel, Duren, Alemania) con acetonitrilo y agua como eluyente. Para la analftica se empleo un gradiente lineal de la proporcion de acetonitrilo en el eluyente del 30 % al 70 %. La identificacion de los productos de reaccion se realizo mediante comparacion con sustancias de referencia.

Ejemplo 7 (no de acuerdo con la invencion)

Reduccion de etilsecodiona (formula III) por medio de la oxidorreductasa de SEQ ID NO: 2

Para la reduccion de etilsecodiona (formula III) se incubo en un recipiente de reaccion una mezcla de 250 |il de tampon (trietanolamina 100 mM, pH = 8, MgCh 2 mM), 250 |il de 4-metil-2-pentanol, 0,02 mg de NAD, 25 mg de etilsecodiona (formula III) y 25 |il de suspension enzimatica de la oxidorreductasa de SEQ ID NO: 2 (vease el ejemplo 3) durante 96 h a temperatura ambiente con mezclado continua. Despues de 96 h se redujo >30 % de la etilsecodiona (formula III) usada para dar el compuesto de hidroxilo.

Ejemplo 8

Reduccion de etilsecodiona (formula III) por medio de la oxidorreductasa de SEQ ID NO: 3

5

10

15

20

25

30

Para la reduccion de etilsecodiona (formula III) se incubo en un recipiente de reaccion una mezcla de 100 |il de tampon (trietanolamina 100 mM, pH = 7, MgCl2 2 mM), 400 |il de 4-metil-2-pentanol, 0,02 mg de NADP, 25 mg de etilsecodiona (formula III) y 100 |il de suspension enzimatica de la oxidorreductasa de SEQ ID NO: 3 (vease el ejemplo 3) durante 72 h a temperatura ambiente con mezclado constante. Despues de 72 h se redujo >95 % de la etilsecodiona (formula III) usada para dar el compuesto de hidroxilo.

Ejemplo 9 (no de acuerdo con la invencion)

Reduccion de etilsecodiona (formula III) por medio de la oxidorreductasa de SEQ ID NO: 4

Para la reduccion de etilsecodiona (formula III) se incubo en un recipiente de reaccion una mezcla de 200 |il de tampon (trietanolamina 100 mM, pH = 9, MgCh 2 mM), 300 |il de 2-heptanol, 0,025 mg de NADP, 100 mg de etilsecodiona (formula III) y 50 |il de suspension enzimatica de la oxidorreductasa de SEQ ID NO: 4 (vease el ejemplo 3) durante 72 h a temperatura ambiente con mezclado constante. Despues de 72 h se redujo >80 % de la etilsecodiona (formula III) usada para dar el compuesto de hidroxilo.

Ejemplo 10 (no de acuerdo con la invencion)

Reduccion de etilsecodiona (formula III) por medio de la oxidorreductasa de SEQ ID NO: 5

Para la reduccion de etilsecodiona (formula III) se incubo en un recipiente de reaccion una mezcla de 300 |il de tampon (trietanolamina 100 mM, pH = 7, MgCh 2 mM), 1,2 ml de 4-metil-2-pentanol, 0,12 mg de NADP, 150 mg de etilsecodiona (formula III) y 0,6 ml de suspension enzimatica de la oxidorreductasa de SEQ ID NO: 5 (vease el ejemplo 3) durante 72 h a temperatura ambiente con mezclado constante. Despues de 72 h se redujo >90 % de la etilsecodiona (formula III) usada para dar el compuesto de hidroxilo.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> IEP GmbH

<120> Procedimiento para la reduccion enzimatica enantioselectiva de derivados de secodiona

<130>I12274A

<140> EP 11177932.8 <141> 2007-12-07

<160> 42

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1 <211> 252 <212> PRT

<213> Chloroflexus auratiacus <400> 1

imagen6

Arg Asn Gly lie Arg Val Asn Ala lie Cys Pro Gly Thr lie His Thr 180 185 190

Ala Met lie Asp Arg Phe Thr Gin Gly Asp Pro Gin Leu Leu Ala Gin 195 200 205

Phe Ala Glu Gly Glu Pro lie Gly Arg Leu Gly Ser Pro Glu Glu Val 210 215 220

Ala Asn Ala Val lie Trp Leu Cys Ser Asp Lys Ala Ser Phe Val Thr 225 230 235 240

Gly Ala Thr Leu Ala Val Asp Gly Gly Arg Leu Ala 245 250

<210>2 <211> 249 5 <212> PRT

<213> Rubrobacter xylanophilus

Gly Arg Ala Thr Ala Leu Lys Phe Ala Arg Glu Gly Ala Arg Val Val 20 25 30

Ala Ala Glu Leu Asp Glu Arg Gly Gly Glu Gly Val Val Arg Glu Val 35 40 45

Arg Ser Leu Gly Gly Glu Ala Val Phe Val Arg Thr Asp Val Ser Glu 50 55 60

Phe Ala Gin Val Glu Asp Ala Val Glu Arg Ala Val Gly Glu Tyr Gly 65 70 75 80

Thr Leu Asp Val Met Phe Asn Asn Ala Gly lie Gly His Tyr Ala Pro 85 90 95

Leu Leu Glu His Glu Pro Glu His Tyr Asp Arg Val Val Arg Val Asn 100 105 110

Gin Tyr Gly Val Tyr Tyr Gly lie Leu Ala Ala Gly Arg Lys Met Val 115 120 125

Ala Leu Lys Asn Pro Gly Leu lie lie Asn Thr Ala Ser Val Tyr Ala 130 135 140

Phe Leu Ala Ser Pro Gly Val lie Gly Tyr His Ala Ala Lys Gly Ala 145 150 155 160

Val Lys Met Met Thr Gin Ala Ala Ala Leu Glu Leu Ala Pro His Gly 165 170 175

lie Arg Val Val Ala lie Ala Pro Gly Gly Val Asp Thr Pro lie lie 180 185 190

Gin Gly Tyr Lys Asp Met Gly Leu Gly Glu Arg Leu Ala Arg Gly Gin 195 200 205

Met Arg Arg Arg Leu Gin Thr Pro Glu Gin lie Ala Gly Ala Val Ala 210 215 220

Leu Leu Ala Thr Asp Glu Ala Asp Ala lie Asn Gly Ser Val Val Met 225 230 235 240

Thr Asp Asp Gly Tyr Ala Glu Phe Lys 245

<210>3 <211> 243 5 <212> PRT

<213> Candida magnoliae

Gly Glu Ala Thr Ala lie Lys Leu Ala Leu Glu Gly Tyr Ser Val Thr 20 25 30

Leu Ala Ser Arg Gly lie Glu Gin Leu Asn Ala lie Lys Glu Lys Leu 35 40 45

Pro lie Val Lys Lys Gly Gin Gin His Tyr Val Trp Gin Leu Asp Leu 50 55 60

Ser Asp lie Glu Ala Ala Ser Thr Phe Lys Gly Ala Pro Leu Pro Ala 65 70 75 80

Ser Ser Tyr Asp Val Phe Phe Ser Asn Ala Gly Val Val Asp Phe Ala 85 90 95

Pro Phe Ala Asp Gin Ser Glu Thr Ala Gin Lys Asp Leu Phe Thr Val 100 105 110

Asn Leu Leu Ser Pro Val Ala Leu Thr Lys Thr lie Val Lys Ala lie 115 120 125

Ala Asp Lys Pro Arg Glu Thr Pro Ala His lie lie Phe Thr Ser Ser 130 135 140

lie Val Gly lie Arg Gly Val Pro Asn Val Ala Val Tyr Ser Ala Thr 145 150 155 160

Lys Gly Ala lie Asp Ser Phe Ala Arg Ser Leu Ala Arg Glu Phe Gly 165 170 175

Pro Lys Asn lie His Val Asn Cys Val Asn Pro Gly Thr Thr Arg Thr 180 185 190

Glu Met Thr Lys Gly Val Asp Leu Ala Ala Phe Gly Asp Val Pro lie 195 200 205

Lys Gly Trp lie Glu Val Asp Ala lie Ala Asp Ala Val Leu Phe Leu 210 215 220

lie Lys Ser Lys Asn lie Thr Gly Gin Ser Leu Val Val Asp Asn Gly 225 230 235 240

Phe Gly Val

<210>4 <211> 241 <212> PRT

<213> Candida magnoliae <400> 4

Gly Ala Ser Ala Ala lie Lys Leu Ala Gin Glu Gly Tyr Ser Val Thr 20 25 30

Leu Ala Ser Arg Asp Leu Glu Lys Leu Thr Glu Val Lys Asp Lys Leu 35 40 45

Pro lie Val Arg Gly Gly Gin Lys His Tyr Val Trp Gin Leu Asp Leu 50 55 60

Ala Asp Val Glu Ala Ala Ser Ser Phe Lys Ala Ala Pro Leu Pro Ala 65 70 75 80

Ser Ser Tyr Asp Leu Phe Val Ser Asn Ala Gly lie Ala Gin Phe Ser 85 90 95

Pro Thr Ala Glu His Thr Asn Ser Glu Trp Leu Asn lie Met Thr lie 100 105 110

Asn Leu Val Ser Pro lie Ala Leu Thr Lys Ala Leu Leu Gin Ala Val 115 120 125

Ser Gly Arg Ser Ser Glu Asn Pro Phe Gin lie Val Phe lie Ser Ser 130 135 140

Val Ala Ala Leu Arg Gly Val Ala Gin Thr Ala Val Tyr Ser Ala Ser 145 150 155 160

Lys Ala Gly Thr Asp Gly Phe Ala Arg Ser Leu Ala Arg Glu Leu Gly 165 170 175

Pro Gin Gly Val His Val Asn Val Val Asn Pro Gly Trp Thr Lys Thr 180 185 190

Asp Met Thr Glu Gly Val Glu Thr Pro Lys Asp Met Pro lie Lys Gly 195 200 205

Trp lie Gin Pro Glu Ala lie Ala Asp Ala Val Val Phe Leu Ala Arg 210 215 220

Ser Lys Asn lie Thr Gly Ala Asn lie Val Val Asp Asn Gly Phe Ser

225

230

235

240

Thr

<210>5 <211> 241 5 <212> PRT

<213> Candida magnoliae

Gly Ala Ala Ser Ala lie Lys Leu Ala Gin Glu Gly Tyr Asn Val Thr 20 25 30

Leu Ala Ser Arg Ser Val Asp Lys Leu Asn Glu Val Lys Ala Lys Leu 35 40 45

Pro lie Val Gin Asp Gly Gin Lys His Tyr lie Trp Glu Leu Asp Leu 50 55 60

Ala Asp Val Glu Ala Ala Ser Ser Phe Lys Gly Ala Pro Leu Pro Ala

65 70 75 80

Arg Ser Tyr Asp Val Phe Val Ser Asn Ala Gly Val Ala Ala Phe Ser

85 90 95

Pro Thr Ala Asp His Asp Asp Lys Glu Trp Gin Asn Leu Leu Ala Val 100 105 110

Asn Leu Ser Ser Pro lie Ala Leu Thr Lys Ala Leu Leu Lys Asp Val 115 120 125

Ser Glu Arg Pro Val Asp Lys Pro Leu Gin lie lie Tyr lie Ser Ser 130 135 140

Val: Ala Gly Leu His Gly Ala Ala Gin Val Ala Val Tyr Ser Ala Ser

145: 150 155 160

Lys: Ala Gly Leu Asp Gly Phe Met Arg Ser Val Ala Arg Glu Val Gly

165

170

175

Pro Lys Gly lie His Val Asn Ser lie Asn Pro Gly Tyr Thr Lys Thr 180 185 190

Glu Met Thr Ala Gly lie Glu Ala Leu Pro Asp Leu Pro lie Lys Gly 195 200 205

Trp lie Glu Pro Glu Ala lie Ala Asp Ala Val Leu Phe Leu Ala Lys 210 215 220

Ser Lys Asn lie Thr Gly Thr Asn lie Val Val Asp Asn Gly Leu lie 225 230 235 240

Ala

<210>6 <211> 759 5 <212> ADN

<213> Chloroflexus aurantiacus

5

10

atggagccac ctttcattgg gaaggttgcg cgtgcttcag cactggcgtt tgcccgtgag gtcgagggcg gggaagagac gattgcgctg gtgcgttgtg atgtttcgca acgcgatgaa acgttcggtc ggatcgactt tgcgcacaac ctggccgatt atcccgaaga ggtctgggat tggttgtgta tgaagtacga aatccggcac aatacctcat cggtcgccgg tctggccgga aagcacggta ttgttggtat taccaaagcg cgtgtcaacg caatctgtcc aggtacgatt ggtgatcccc aactgcttgc ccagttcgct cctgaagagg tcgccaatgc ggtgatctgg ggagcgacac tggcggttga tggtggccgc

<210>7 <211> 750 <212> ADN

<213> Rubrobacter xylanophilus <400>7

atgctcgagg ggaaggtcgc ggtcatcacg gcgctcaagt tcgcccgcga gggggcccgg ggggaggggg tggtccggga ggtgcgcagc gacgtctcgg agttcgcgca ggtggaggac accctcgacg tgatgttcaa caacgccggc gagcccgagc actacgaccg ggtggtccgg ctcgccgccg ggagaaagat ggtcgccctg tcggtctacg ccttcctcgc ctcgccgggg gtcaagatga tgacccaggc ggcggcgctg gccatcgccc cgggcggggt ggacaccccc ggcgagaggc tggcccgcgg ccagatgcgc ggggcggtcg ccctgctcgc caccgacgag accgacgacg gctacgcgga gttcaagtag

<210>8 <211> 732 <212> ADN

<213> Candida magnoliae <400> 8

ctggtcaccg gcgcagcagc cggtattggt 60 ggtgccaagg ttgtcgttgc tgatgtgaat 120 tgtcgggctt tgaataccga tgcaatgttc 180 gtggagcgat taattgctct ggcagttgac 240 aacgccggga ttgaaggcgt gcaggcaatg 300 cgggtgatcg agatcaacct caaaggggtc 360 atgctcaagc agggtggcgg tgcgattgtg 420 tcacgtggcg tttcggcgta tgtagccagc 480 gcagcccttg agtatgcgcg taacggtatt 540 catactgcga tgatcgaccg ctttacccag 600 gagggtgaac cgattggtcg gctcggctcg 660 ctctgctcag ataaggcttc gtttgtgacc 720 ctggcgtaa 759

ggggccggaa: gcggcatagg ccgggccacc 60

gtcgtcgccg: ccgagctcga cgagcgcggc 120

ctcgggggcg: aggcggtctt cgtccggacc 180

gccgtcgagc: gggcggtcgg ggagtacggc 240

atcgggcact: acgcccccct gctggagcac 300

gtgaaccagt: acggcgtcta ctacgggata 360

aagaaccccg: gcttgatcat caacaccgcc 420

gtcatcggct: accacgccgc caagggggcg 480

gagctcgccc: cgcacggcat aagggtcgtc 540

atcatccagg: gctacaagga catggggctc 600

cgccggctcc: agacccccga gcagatcgcc 660

gccgacgcca: taaacggctc ggtggtcatg 720



: 750

5

10

atgtctgcta cttcgaacgc tcttatcact ggtgccagcc gcggaatggg cgaggccaca gctattaagc ttgcccttga ggggtacagc gtcacccttg catcacgcgg tattgagcag ctcaatgcca tcaaggaaaa actacccatc gtgaagaagg gccagcagca ctacgtttgg cagctcgatc ttagtgacat cgaggcggct tccaccttca agggggctcc tctgcctgcc agcagctacg acgtgttctt cagcaacgcc ggtgtggtgg actttgctcc gttcgcagac caaagcgaga ctgcgcaaaa ggacctgttc acggttaacc tgctgtcgcc tgttgcgttg accaagacca ttgttaaggc catcgccgac aagccccgcg agacgcctgc tcacattatc ttcacctcgt ccattgtcgg aattcgcggt gttcccaacg tggcggtcta cagcgccacc aagggcgcga ttgacagctt tgcgcgctcg cttgctcgtg agttcggtcc caagaacatc cacgttaact gcgtgaaccc gggcacgacg cgcaccgaga tgacaaaggg cgttgatctc gcggctttcg gcgatgttcc tatcaagggc tggatcgagg tcgatgcgat tgccgacgct gtgctgtttt tgatcaagtc caagaacatc actggccagt cgctcgttgt tgacaacgga ttcggtgttt aa

<210>9 <211> 726 <212> ADN

<213> Candida magnoliae <400>9

<210> 10 <211> 726 <212> ADN

<213> Candida magnoliae <400> 10

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

720

732

atgacatcta: cacctaatgc cctcatcacg ggaggcagcc gcggcattgg cgcttccgcc 60

gccatcaaac: tggctcaaga agggtacagc gtcacgctgg cgtcccgcga ccttgagaaa 120

cttactgagg: tcaaggacaa gctgccaatc gtgagaggtg gacagaaaca ctacgtttgg 180

cagctcgatc: ttgccgatgt ggaggctgca tcgtctttca aggcggctcc tctgccggcc 240

agcagctacg: atttgtttgt ttcgaacgcc ggaattgccc agttctcgcc tacggcagag 300

catactaata: gtgagtggct gaacattatg accattaact tagtgtcccc gattgccctg 360

acgaaggctc: ttttgcaggc cgtttctggg aggtcgagcg agaacccgtt tcagatcgtc 420

ttcatctcgt: cggttgcagc actacgtggc gttgcacaaa cggccgtcta cagtgcgtcg 480

aaggctggta: ctgatggatt cgcacgctca cttgctcgcg aactaggtcc tcaaggtgtt 540

catgtgaacg: tggtgaaccc tggctggact aagacagaca tgacggaagg agtcgaaacc 600

ccaaaggaca: tgcccattaa gggctggatc cagcctgagg caattgctga tgctgtagta 660

ttccttgcga: ggtcgaaaaa cattaccggc gcgaatattg tagtggacaa tggtttctcg 720

acgtaa: 726

5

10

15

20

25

30

35

atgacgacta cttcaaacgc gcttgtcact ggaggcagcc gcggcattgg cgctgcctcc

gccattaagc tggctcagga gggctacaat gttacgctgg cctctcgcag tgttgataaa

ctgaatgaag taaaggcgaa actcccaatt gtacaggacg ggcagaagca ctacatttgg

gaactcgatc tggctgatgt ggaagctgct tcgtcgttca agggtgctcc tttgcctgct

cgcagctacg acgtctttgt ttcgaacgcg ggcgtcgctg cgttctcgcc cacagccgac

cacgatgata aggagtggca gaacttgctt gccgtgaact tgtcgtcgcc cattgccctc

acgaaggccc tcttgaagga tgtctccgaa aggcctgtgg acaagccact gcagattatc

tacatttcgt cggtggccgg cttgcatggc gccgcgcagg tcgccgtgta cagtgcatct

aaggccggtc ttgatggttt tatgcgctcc gtcgcccgtg aggtgggccc gaagggcatc

catgtgaact ccatcaaccc cggatacacg aagactgaaa tgaccgcggg cattgaagcc

cttcctgatt tgcctatcaa ggggtggatc gagcccgagg caattgctga cgcggttctg

tttctggcaa agtccaagaa tatcaccggc acaaacattg tggtcgacaa tggcttgatt

gcttaa

<210> 11 <211> 38 <212> ADN

<213> secuencia artificial <220>

<221> misc_feature <222> (1)..(38)

<223> cebador para la clonacion de gen de oxidorreductasa de SEQ ID NO: 6 de Chloroflexus aurantiacus en vector de expresion

<400> 11

ggaattccat atgatggagc cacctttcat tgggaagg 38

<210> 12 <211> 34 <212> ADN

<213> secuencia artificial <220>

<221> misc_feature <222> (1)..(34)

<400> 12

cccaagctta ttattacgcc aggcggccac catc 34

<210> 13 <211> 38 <212> ADN

<213> secuencia artificial <220>

<221> misc_feature <222> (1)..(38)

<400> 13

cacatgcatg cagatggagc cacctttcat tgggaagg 38

60

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

720

726

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

<210> 14 <211> 35 <212>ADN

<213> secuencia artificial <220>

<221> misc_feature <222> (1)..(35)

<223> cebador para la clonacion de gen de oxidorreductasa de SEQ ID NO: 8 de Candida magnoliae en vector de expresion

<400> 14

ggaattccat atgatgtctg ctacttcgaa cgctc 35

<210> 15 <211> 33 <212> ADN

<213> secuencia artificial <220>

<221> misc_feature <222> (1)..(33)

<400> 15

ccgctcgagt tattaaacac cgaatccgtt gtc 33

<210> 16 <211> 35 <212> ADN

<213> secuencia artificial <220>

<221> misc_feature <222> (1)..(35)

<400> 16

cacatgcatg cagatgtctg ctacttcgaa cgctc 35

<210> 17 <211> 34 <212> ADN

<213> secuencia artificial <220>

<221> misc_feature <222> (1)..(34)

<400> 17

gcccgagctc ttattaaaca ccgaatccgt tgtc 34

<210> 18 <211> 12 <212> PRT

<213> secuencia artificial <220>

<221> PEPTIDO <222> (1)..(12)

<223> secuencia parcial de oxidorreductasa <400> 18

5

10

15

20

25

30

35

40

45

Asn Ala Leu Val Thr Gly Ala Ser Arg Gly lie Gly 15 10

<210> 19 <211> 12 <212> PRT

<213> secuencia artificial <220>

<221> PEPTIDO <222> (1) . . (12)

<223> secuencia parcial de oxidorreductasa <400> 19

Asn Ala Leu Val Thr Gly Gly Ser Arg Gly lie Gly 15 10

<210> 20 <211> 12 <212> PRT

<213> secuencia artificial <220>

<221> PEPTIDO <222> (1)..(12)

<223> secuencia parcial de oxidorreductasa <400> 20

Asn Ala Leu lie Thr Gly Gly Ser Arg Gly lie Gly 15 10

<210> 21 <211> 12 <212> PRT

<213> secuencia artificial <220>

<221> PEPTIDO <222> (1)..(12)

<223> secuencia parcial de oxidorreductasa <400> 21

Asn Ala Leu lie Thr Gly Ala Ser Arg Gly lie Gly 15 10

<210> 22 <211> 12 <212> PRT

<213> secuencia artificial

<220>

<221> PEPTIDO <222> (1)..(12)

<223> secuencia parcial de oxidorreductasa <400> 22

Asn Ala Leu lie Thr Gly Gly Ser Arg Gly Met Gly 15 10

<210> 23 <211> 12 <212> PRT

<213> secuencia artificial

5

10

15

20

25

30

35

40

45

<220>

<221> PEPTIDO <222> (1)..(12)

<223> secuencia parcial de oxidorreductasa <400> 23

His Ala Leu Val Thr Gly Ala Ser Arg Gly lie Gly 15 10

<210> 24 <211>7 <212> PRT

<213> secuencia artificial <220>

<221> PEPTIDO <222> (1)..(7)

<223> secuencia parcial de oxidorreductasa <400> 24

Gly Tyr Ser Val Thr Leu Ala 1 5

<210> 25 <211>7 <212> PRT

<213> secuencia artificial <220>

<221> PEPTIDO <222> (1)..(7)

<223> secuencia parcial de oxidorreductasa <400> 25

Gly Tyr Asn Val Thr Leu Ala 1 5

<210> 26 <211>7 <212> PRT

<213> secuencia artificial <220>

<221> PEPTIDO <222> (1)..(7)

<223> secuencia parcial de oxidorreductasa <400> 26

Gly Tyr Ser Val Thr Leu Val 1 5

<210> 27 <211>7 <212> PRT

<213> secuencia artificial <220>

<221> PEPTIDO <222> (1)..(7)

<223> secuencia parcial de oxidorreductasa <400> 27

5

10

15

20

25

30

35

40

45

Gly Tyr Asn Val Thr Leu Val 1 5

<210> 28 <211>8 <212> PRT

<213> secuencia artificial <220>

<221> PEPTIDO <222> (1)..(8)

<223> secuencia parcial de oxidorreductasa <400> 28

Phe Lys Gly Ala Pro Leu Pro Ala 1 5

<210> 29 <211>8 <212> PRT

<213> secuencia artificial <220>

<221> PEPTIDO <222> (1)..(8)

<223> secuencia parcial de oxidorreductasa <400> 29

Phe Lys Ala Ala Pro Leu Pro Ala

1 5

<210> 30 <211>6 <212> PRT

<213> secuencia artificial <220>

<221> PEPTIDO <222> (1)..(6)

<223> secuencia parcial de oxidorreductasa <400> 30

Phe Val Ser Asn Ala Gly

1 5

<210> 31 <211>6 <212> PRT

<213> secuencia artificial <220>

<221> PEPTIDO <222> (1)..(6)

<223> secuencia parcial de oxidorreductasa <400> 31

Phe Phe Ser Asn Ala Gly

1 5

<210> 32 <211>6 <212> PRT

<213> secuencia artificial

5

10

15

20

25

30

35

40

45

<220>

<221> PEPTIDO <222> (1)..(6)

<223> secuencia parcial de oxidorreductasa <400> 32

Phe Val Cys Asn Ala Gly 1 5

<210> 33 <211>6 <212> PRT

<213> secuencia artificial <220>

<221> PEPTIDO <222> (1)..(6)

<223> secuencia parcial de oxidorreductasa <400> 33

Phe Val Ala Asn Ala Gly 1 5

<210> 34 <211>9 <212> PRT

<213> secuencia artificial <220>

<221> PEPTIDO <222> (1)..(9)

<223> secuencia parcial de oxidorreductasa <400> 34

Ser Pro lie Ala Leu Thr Lys Ala Leu 1 5

<210> 35 <211>9 <212> PRT

<213> secuencia artificial <220>

<221> PEPTIDO <222> (1)..(9)

<223> secuencia parcial de oxidorreductasa <400> 35

Ser Pro Val Ala Leu Thr Lys Thr lie 1 5

<210> 36 <211>9 <212> PRT

<213> secuencia artificial <220>

<221> PEPTIDO <222> (1)..(9)

<223> secuencia parcial de oxidorreductasa <400> 36

5

10

15

20

25

30

35

40

45

Ser Pro lie Ala Leu Thr Lys Thr Leu 1 5

<210> 37 <211>9 <212> PRT

<213> secuencia artificial <220>

<221> PEPTIDO <222> (1)..(9)

<223> secuencia parcial de oxidorreductasa <400> 37

Ser Pro Val Ala Met Thr Lys Ala Leu 1 5

<210> 38 <211>9 <212> PRT

<213> secuencia artificial <220>

<221> PEPTIDO <222> (1)..(9)

<223> secuencia parcial de oxidorreductasa <400> 38

Ser Gin lie Ala Leu Thr Lys Ala Leu 1 5

<210> 39 <211>7 <212> PRT

<213> secuencia artificial <220>

<221> PEPTIDO <222> (1)..(7)

<223> secuencia parcial de oxidorreductasa <400> 39

Ala Val Tyr Ser Ala Ser Lys 1 5

<210> 40 <211>7 <212> PRT

<213> secuencia artificial <220>

<221> PEPTIDO <222> (1)..(7)

<223> secuencia parcial de oxidorreductasa <400> 40

Ala Val Tyr Ser Ala Thr Lys 1 5

<210> 41 <211>6 <212> PRT

<213> secuencia artificial

10

15

<220>

<221> PEPTIDO <222> (1)..(6)

<223> secuencia parcial de oxidorreductasa <400> 41

Pro lie Lys Gly Trp lie 1 5

<210> 42 <211>6 <212> PRT

<213> secuencia artificial <220>

<221> PEPTIDO <222> (1)..(6)

<223> secuencia parcial de oxidorreductasa <400> 42

Pro lie Ser Gly Trp lie 1 5

Claims

5

10

15

20

25

30

REIVINDICACIONES

1. Polipeptido con actividad oxidorreductasa que

a) presenta la secuencia de aminoacidos SEQ ID NO: 3 o

b) es codificado por la secuencia de acido nucleico SEQ ID NO: 8 y reduce derivados de secodiona de formula general I

imagen1

en la que las estructuras de anillo no comprenden heteroatomos o comprenden uno o varios heteroatomos, Ri es hidrogeno o un grupo alquilo C1-C4,

R2 es hidrogeno, un grupo alquilo C1-C8 o un grupo protector de OH, tal como un ester,

R3 es hidrogeno, un grupo metilo o un haluro, el elemento estructural

imagen2

representa un anillo de benceno o un anillo C6 con 0, 1 o 2 dobles enlaces C-C, en las posiciones 6/7 o 7/8 esta contenido dado el caso un doble enlace y el carbono en las posiciones 1, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12 y 16 esta independientemente sustituido con hidrogeno, un grupo alquilo C1-C4, un haluro o un grupo fenilo, en presencia de NADH o NADPH como cofactor.
2. Polipeptido con actividad oxidorreductasa que reduce derivados de secodiona de formula general I

imagen3

en la que las estructuras de anillo no comprenden heteroatomos o comprenden uno o varios heteroatomos, R1 es hidrogeno o un grupo alquilo C1-C4,

R2 es hidrogeno, un grupo alquilo C1-C8 o un grupo protector de OH, tal como un ester,

R3 es hidrogeno, un grupo metilo o un haluro, el elemento estructural

imagen4

representa un anillo de benceno o un anillo C6 con 0, 1 o 2 dobles enlaces C-C, en las posiciones 6/7 o 7/8 esta contenido eventualmente un doble enlace y el carbono en las posiciones 1, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12 y 16 esta independientemente sustituido con hidrogeno, un grupo alquilo C1-C4, un haluro o un grupo fenilo, en presencia de NADH o NADPH como cofactor y es codificado por una secuencia de acido nucleico que presenta con la secuencia de acido nucleico SEQ ID NO: 8 al menos un 80 % de identidad e hibrida en condiciones rigurosas, comprendiendo las condiciones rigurosas la hibridacion en solucion de NaCl 0,7-1 M a 60 °C.
3. Polipeptido aislado segun las reivindicaciones 1 o 2, que puede obtenerse de Candida magnoliae CBS 6396.