ES2386380T3 - Procedimiento para la reducción enzimática enantioselectiva de derivados de secodiona por regeneración de cofactor en continuo - Google Patents

Procedimiento para la reducción enzimática enantioselectiva de derivados de secodiona por regeneración de cofactor en continuo Download PDF

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Abstract

Procedimiento para la reducción enzimática enantioselectiva de derivados de secodiona de fórmula general Ien la queR1 es hidrógeno o un grupo alquilo C1-C4,R2 es hidrógeno, un grupo alquilo C1-C8 o un grupo protector de OH conocido en el estado de la técnica, como un éster,R3 es hidrógeno, un grupo metilo o un haluro,el elemento estructuralrepresenta un anillo de benceno o un anillo C6 con 0, 1 o 2 dobles enlaces C-C,que contiene en las posiciones 6/7 o 7/8 eventualmente un doble enlace y el carbono en las posiciones 1, 2, 4, 5, 6, 7, 8,9, 11, 12 y 16 está independientemente sustituido con hidrógeno, un grupo alquilo C1-C4, un haluro o un grupo fenilo,en el que el derivado de secodiona se reduce con una oxidorreductasa/deshidrogenasa en presencia de NADH oNADPH como cofactor,caracterizado porque el derivado de secodiona se utiliza a una concentración >=10 g/l en el lote de reacción y porque elcofactor NAD o NADP oxidado formado por la oxidorreductasa/deshidrogenasa se regenera continuamente

Description

Procedimiento para la reducción enzimática enantioselectiva de derivados de secodiona por regeneración de cofactor en continuo
La presente invención se refiere a un procedimiento para la reducción enzimática enantioselectiva de derivados de 5 secodiona de fórmula general I, en el que el derivado de secodiona se reduce con una oxidorreductasa/deshidrogenasa en presencia de NADH o NADPH como cofactor.
La producción industrial de hormonas esteroideas se realiza de dos modos independientes entre sí, a saber, por un lado a partir de compuestos esteroideos de origen natural de fuentes vegetales y por otro lado de forma totalmente sintética mediante síntesis enantioselectiva a partir de precursores proquirales. De estos dos modos, la síntesis total de
10 esteroides se está volviendo cada vez más importante, sobre todo porque esta permite también la introducción de elementos estructurales que no están incluidos en esteroides de origen natural.
Los componentes clave de la síntesis total de esteroides enantioméricamente puros son a este respecto compuestos de fórmula general I que se designan también como secoesteroides, 8,14-seco-gona-tetraen-14,17-dionas o secodionas. Son representantes especiales de este grupo, por ejemplo, los compuestos metilsecodiona (fórmula II, 13-metil-3
15 metoxi-8,14-seco-gona-1,3,5(10),9(11)-tetraen-14,17-diona) y etilsecodiona (fórmula III, 13-etil-3-metoxi-8,14-secogona-1,3,5(10),9(11)-tetraen-14,17-diona), a partir de los cuales pueden prepararse, por ejemplo, los compuestos farmacológicamente activos etinilestradiol (fórmula IV) y norgestrel (fórmula V).
Fórmula II Fórmula III
Fórmula IVI Fórmula V
La etapa clave en la producción de compuestos esteroideos enantioméricamente puros es a este respecto la transformación del compuesto de fórmula I (por ejemplo, II y III) en un compuesto ópticamente activo con C-13 asimétrico preformado mediante reducción enantioselectiva de uno de los grupos cetona hasta grupos hidroxilo. Los
25 compuestos hidroxisecoesteroideos ópticamente activos resultantes (secoles, fórmulas VI a IX) pueden procesarse a continuación mediante ciclación con mantenimiento de la quiralidad hasta compuestos esteroideos quirales.
Mediante la reducción enantioselectiva de un grupo cetona del compuesto de fórmula I pueden formarse teóricamente cuatro compuestos ópticamente activos (fórmulas VI a IX).
Son de especial interés económico a este respecto los compuestos de fórmula VI en los que el grupo hidroxilo en la posición 17 presenta la configuración beta, ya que estos conducen a derivados de estrona natural. Dichos compuestos se designan también como 17-beta-hidroxisecoesteroides.
La reducción estereoselectiva de los derivados de secodiona de fórmula general I con la ayuda de distintos microorganismos se estudió con especial intensidad en los años 60 y 70 del siglo XX. A este respecto, pudo mostrarse que distintas cepas de levadura del género Candida, Debaryomyces, Kloeckera, Pichia, Cryptococcus, Rhodotorula, Torulopsis y Hansenula son capaces de reducir secodionas hasta distintos compuestos hidroxilados (documentos US 3616226, US 1252524, US 3616225).
Particularmente las levaduras del género Saccharomyces, como por ejemplo, S. uvarum, pueden utilizarse ventajosamente para producir, por ejemplo, los correspondientes 17-beta-hidroxisecoesteroides (Kosmol et al.; Liebigs Ann. Chem. 701, 199 (1967)). Otras cepas de levadura como, por ejemplo Saccharomyces drosophilarum, reducen la secodiona preferiblemente hasta el correspondiente 14-alfa-hidroxisecoesteroide (Acta Microbiol. Acad. Sci. Hung. 22, 463-471 (1975)). Se describe además la formación de 14-alfa-hidroxisecoesteroide mediante la reducción de secodiona por Bacillus thuringiensis (Kosmol et al.; Liebigs Ann. Chem. 701, 199 (1967)).
Los principios activos gestagénicos y estrogénicos encuentran una amplia aplicación en el mundo como anticonceptivos y en terapia de sustitución hormonal. Hasta ahora, la mayoría de síntesis de derivados estrogénicos y gestagénicos están constituidas por el principio de reacción anteriormente descrito, cuya etapa clave produce la reducción enantioselectiva de secodionas hasta los correspondientes 17-beta-hidroxisecoesteroides.
La reducción estereoselectiva de los derivados de secodiona se lleva a cabo a este respecto hasta ahora como una biotransformación en célula entera mediante distintas cepas de levadura del género Pichia o Saccharomyces. Estos procedimientos poseen sin embargo la desventaja de que son practicables solo a muy bajas concentraciones de sustrato bastante por debajo del 1% (generalmente de 1 a 5 g/l) (documento US 3697379; Current Science, 5 de feb. (1984), vol. 53, nº 3, página 124; Indian Journal of Experimental Biology, vol. 27, agosto de 1989, páginas 742-743). Así, resulta ser muy costoso particularmente el procesamiento y aislamiento del producto de reacción a partir de grandes volúmenes, así como la separación de grandes cantidades de biomasa.
Szentirmai et al. (Acta Microbiologica Academiae Scientiarum Hungaricae, vol. 22, nº 4, 1975, pág. 463-470) describen un procedimiento para la reducción enzimática enantioselectiva de derivados de secodiona, en el que el derivado de secodiona se reduce con una oxidorreductasa/deshidrogenasa en presencia de NADH o NADPH como cofactor. En este procedimiento, se utiliza el derivado de secodiona a una concentración de únicamente 1 g/l en el lote de reacción.
Al entender del inventor, no se han aislado, identificado ni descrito hasta ahora las enzimas participantes en la reducción. Igualmente, no se han identificado todavía secuencias de ADN que codifiquen oxidorreductasas con las que pueda conseguirse la reducción de derivados de secodiona.
La invención tiene por tanto el objetivo de procurar un procedimiento con el que puedan reducirse enantioselectivamente derivados de secodiona de fórmula general I, particularmente aquellos de fórmula II y III. Entre otros, debe ser posible en este sentido la preparación de los correspondientes 17-beta-hidroxisecoesteroides.
En un primer aspecto, se consigue este objetivo según la invención mediante un procedimiento para la reducción enzimática enantioselectiva de derivados de secodiona de fórmula general I,
en la que
R1 es hidrógeno o un grupo alquilo C1-C4, R2 es hidrógeno, un grupo alquilo C1-C8 o un grupo protector de OH conocido en el estado de la técnica, como un éster, R3 es hidrógeno, un grupo metilo o un haluro, el elemento estructural
representa un anillo de benceno o un anillo C6 con 0, 1 o 2 dobles enlaces C-C, que contiene en las posiciones 6/7 o 7/8 eventualmente un doble enlace y el carbono en las posiciones 1, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12 y 16 está independientemente sustituido con hidrógeno, un grupo alquilo C1-C4, un haluro o un grupo fenilo,
reduciéndose el derivado de secodiona con una oxidorreductasa/deshidrogenasa en presencia de NADH o NADPH como cofactor,
caracterizándose dicho procedimiento porque el derivado de secodiona se utiliza a una concentración ≥10 g/l en el lote de reacción y porque el cofactor NAD o NADP oxidado formado por la oxidorreductasa/deshidrogenasa se regenera continuamente.
Este procedimiento representa una mejora esencial de la reducción enzimática enantioselectiva de derivados de secodiona frente al estado de la técnica. El procedimiento según la invención posibilita la reducción de derivados de secodiona hasta los distintos hidroxisecoesteroideos correspondientes con enzimas libres en intervalos de concentración que superan con mucho los descritos en el estado de la técnica.
Una forma de realización preferida del procedimiento según la invención se caracteriza porque la oxidorreductasa/deshidrogenasa
a) presenta una secuencia de aminoácidos en la que al menos un 50% de los aminoácidos son idénticos a cualquiera de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 o SEQ ID NO: 5,
b) está codificada por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 o SEQ ID NO: 10 o
c) está codificada por una secuencia de ácido nucleico que hibrida en condiciones rigurosas con las SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 o SEQ ID NO: 10.
Se han identificado por los inventores oxidorreductasas que son capaces de reducir derivados de secodiona hasta hidroxisecoesteroides y que pueden prepararse industrialmente de forma recombinante. Mediante el procedimiento según la invención, pueden conseguirse concentraciones de sustrato esencialmente mayores que en el procedimiento de célula entera usado actualmente.
En el procedimiento según la invención, pueden utilizarse las oxidorreductasas de secuencia SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 o SEQ ID NO:5 o un polipéptido derivable de estos polipéptidos totalmente purificado, parcialmente purificado o en forma de células que contienen el polipéptido de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 o SEQ ID NO:5. Las células utilizadas pueden presentarse a este respecto en forma nativa, permeabilizada o lisada. Preferiblemente, las oxidorreductasas o derivados derivables de las mismas se sobreexpresan en un organismo hospedador adecuado, como por ejemplo Escherichia coli, y se utiliza el polipéptido recombinante para la reducción de los derivados de secodiona de fórmula general I.
Una secuencia de ADN de SEQ ID NO: 6 que codifica un polipéptido de SEQ ID NO: 1 es obtenible, por ejemplo, a partir del genoma del organismo Chloroflexus aurantiacus DSM 635.
Una secuencia de ADN de SEQ ID NO: 7 que codifica un polipéptido de SEQ ID NO: 2 es obtenible, por ejemplo, a partir del genoma del organismo Rubrobacter xylanophilus DSM 9941.
Una secuencia de ADN de SEQ ID NO: 8 que codifica un polipéptido de SEQ ID NO: 3 es obtenible a partir de una levadura Candida magnoliae CBS 6396.
Las oxidorreductasas de SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5 son obtenibles, por ejemplo, mediante cribado de homología a partir de Candida magnoliae DSMZ 70638.
Se entiende por una secuencia de ácido nucleico que hibrida, por ejemplo, con la SEQ ID NO: 6 en condiciones rigurosas, un polinucleótido que puede identificarse mediante el procedimiento de hibridación de colonias, el procedimiento de hibridación de placas, el procedimiento de hibridación Southern o similares usando la SEQ ID NO: 6 o secuencias parciales de la SEQ ID NO: 6 como sonda de ADN. Con este fin, se hibrida el polinucleótido inmovilizado sobre un filtro, por ejemplo, con la SEQ ID NO: 6 en una solución de NaCl 0,7-1 M a 60ºC. La hibridación se lleva a cabo como se describe, por ejemplo, en “Molecular Cloning, A Laboratory Manual”, 2ª edición (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) o publicaciones similares. A continuación, se lava el filtro con solución de 0,1 a 2 x SSC a 65ºC, entendiéndose por solución de 1 x SSC una mezcla compuesta por NaCl 150 mM y citrato de sodio 15 mM.
Un polinucleótido que hibrida con los polinucleótidos de SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO:8 , SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 10 de la lista de secuencias en las condiciones rigurosas anteriormente citadas debería presentar al menos un 60% de identidad de secuencia con las secuencias de polinucleótidos de SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 10, mejor al menos un 80% de identidad, aún mejor un 95% de identidad.
Otra forma de realización preferida del procedimiento según la invención se caracteriza porque la oxidorreductasa/deshidrogenasa presenta una longitud de 230 a 260 aminoácidos y comprende una o varias de las secuencias parciales seleccionadas del grupo que consiste en [las secuencias de SEQ ID NO:18 a SEQ ID NO:42]:
nalvtgasrgig, nalvtggsrgig, nalitggsrgig, nalitgasrgig, nalitggsrgmg, halvtgasrgig,
gysvtla, gynvtla, gysvtlv, gynvtlv,
fkgaplpa, fkaaplpa,
fvsnag, ffsnag, fvcnag, fvanag,
spialtkal, spvaltkti, spialtktl, spvamtkal, sqialtkal,
avysask, avysatk,
pikgwi y pisgwi.
En el procedimiento según la invención, se utiliza como cofactor NADH o NADPH. Se entiende por el término “NADP” fosfato del dinucleótido de nicotinamida y adenina, y por “NADPH” fosfato del dinucleótido de nicotinamida y adenina reducido. El término “NAD” significa dinucleótido de nicotinamida y adenina, el término “NADH” dinucleótido de nicotinamida y adenina reducido”.
Según una forma de realización preferida del procedimiento según la invención, se regenera el cofactor oxidado NAD o NADP mediante la oxidación de un alcohol.
Se utilizan como cosustrato preferiblemente a este respecto alcoholes primarios y secundarios como etanol, 2-propanol, 2-butanol, 2-pentanol, 3-pentanol, 4-metil-2-pentanol, 2-hexanol, 2-heptanol, 2-octanol o ciclohexanol. La proporción de cosustrato para la regeneración puede ascender a 5 a 95% en vol., referido al volumen total.
Preferiblemente, se usa para la regeneración de cofactor un alcohol secundario de fórmula general RxRyCHOH, en la que Rx y Ry son independientemente entre sí hidrógeno, un grupo alquilo C1-C8 ramificado o no ramificado y Ctotales ≥ 3.
Según otra forma de realización preferida del procedimiento según la invención, se añade para la regeneración del cofactor adicionalmente una oxidorreductasa/deshidrogenasa.
Las alcohol deshidrogenasas dependientes de NADH adecuadas son obtenibles, por ejemplo, a partir de levadura de panadería, de Candida parapsilosis (CPCR) (documentos US 5.523.223 y US 5.763.236, Enzyme Microb. Technol., 1993, 15(11): 950-8), Pichia capsulata (documento DE 10327454.4), de Rhodococcus erythropolis (RECR) (documento US 5.523.223), Norcardia fusca (Biosci. Biotechnol. Biochem., 63(10), 1999, pág. 1721-1729; Appl. Microbiol. Biotechnol., 2003, 62(4): 380-6; Epub 26 de abril de 2003) o Rhodococcus ruber (J. Org. Chem., 2003, 68(2): 402-6). Los cosustratos adecuados para estas alcohol deshidrogenasas son, por ejemplo, los alcoholes secundarios ya citados como 2-propanol (isopropanol), 2-butanol, 2-pentanol, 4-metil-2-pentanol, 2-octanol o ciclohexanol.
Son alcohol secundario deshidrogenasas adecuadas para la regeneración del NADPH, por ejemplo, aquellas que se describen y aíslan a partir de organismos del orden lactobacilar, por ejemplo, Lactobacillus kefir (documento US 5.200.335), Lactobacillus brevis (DE 19610984 A1; Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. diciembre de 2000; 56 Pt 12: 1696-8), Lactobacillus minor (documento DE 10119274), Leuconostoc carnosum (A 1261/2005, Kl. C12N) o aquellas como se describen a partir de Thermoanerobium brockii, Thermoanerobium ethanolicus o Clostridium beijerinckii.
Para la regeneración del cofactor, pueden usarse en principio también otros sistemas enzimáticos. Por ejemplo, puede llevarse a cabo la regeneración del cofactor mediante formiato deshidrogenasas dependientes de NAD o NADP (Tishkov et al., J. Biotechnol. Bioeng. [1999] 64, 187-193, “Pilot-scale production and isolation of recombinant NAD and NADP specific formate dehydrogenase”). Son cosustratos adecuados de la formiato deshidrogenasa, por ejemplo, sales de ácido fórmico como formiato de amonio, formiato de sodio o formiato de calcio.
El TTN (número de recambio total = mol de compuesto de secodiona reducida/mol de cofactor utilizado) alcanzado en el procedimiento según la invención se encuentra generalmente en el intervalo de 102 a 105, preferiblemente asciende sin embargo a ≥ 103.
Según una forma de realización preferida, se lleva a cabo el procedimiento según la invención en un sistema bifásico acuoso-orgánico.
Por consiguiente, la reacción del derivado de secodiona se realiza en un sistema bifásico que contiene, por ejemplo, un 2-alcohol para la regeneración del cofactor, una oxidorreductasa, agua, cofactor y el compuesto de secodiona. Pueden incluirse sin embargo también disolventes orgánicos adicionales que no participan en la regeneración del cofactor, es decir, que no contienen grupos hidroxilo oxidables. Preferiblemente, se utilizan como disolventes orgánicos adicionales dietiléter, terc-butilmetiléter, diisopropiléter, dibutiléter, acetato de etilo, acetato de butilo, heptano, hexano, tolueno, diclorometano, ciclohexano o mezclas de los mismos.
La proporción de componentes orgánicos inmiscibles con agua del sistema bifásico puede ascender a este respecto de 10% a 90%, preferiblemente de 20% a 80%, referido al volumen total del lote de reacción. La proporción acuosa puede ascender a 90% a 10%, preferiblemente de 80% a 20%, referida al volumen total del lote de reacción.
Puede añadirse también un tampón al agua, por ejemplo, tampón fosfato de potasio, Tris/HCl, glicina o trietanolamina con un valor de pH de 5 a 10, preferiblemente de 6 a 9. El tampón puede contener adicionalmente iones para la estabilización o activación de ambas enzimas, por ejemplo iones de magnesio o iones de cinc.
Además, pueden utilizarse en los procedimientos según la invención otros aditivos para la estabilización de la enzima usada, por ejemplo, glicerina, sorbitol, 1,4-D,L-ditiotreitol (DTT) o dimetilsulfóxido (DMSO).
La concentración del cofactor NAD(P)H, referida a la fase acuosa, asciende de 0,001 mM a 10 mM, particularmente de 0,01 mM a 1,0 mM. La temperatura puede ascender, dependiendo de las propiedades especiales de las enzimas utilizadas, a 10ºC a 70ºC, preferiblemente a 20ºC a 35ºC.
Los derivados de secodiona a reducir son generalmente poco hidrosolubles. El sustrato puede presentarse por tanto durante la reacción completa o también incompletamente disuelto. Si el sustrato no se disuelve completamente en la mezcla de reacción, una parte del sustrato se presenta en forma sólida y puede formar así una tercera fase sólida. La mezcla de reacción puede formar durante la reacción también temporalmente una emulsión.
El derivado de secodiona de fórmula general I se utiliza en el procedimiento según la invención preferiblemente en una cantidad de 10 g/l a 500 g/l, preferiblemente de 25 g/l a 300 g/l, con especial preferencia de 50 g/l a 200 g/l, referida del volumen total en el lote de reacción.
Las formas de realización preferidas de la invención se caracterizan además porque se utiliza como derivado de secodiona 13-etil-3-metoxi-8,14-seco-gona-1,3,5(10),9(11)-tetraen-14,17-diona (etilsecodiona – fórmula III) o 13-metil-3metoxi-8,14-seco-gona-1,3,5(10),9(11)-tetraen-14,17-diona (metilsecodiona-fórmula II).
Los procedimientos según la invención se llevan a cabo, por ejemplo, en un recipiente de reacción de vidrio o metal. Para ello, se incorporan los componentes individualmente al recipiente de reacción y se agitan bajo atmósfera, por ejemplo, de nitrógeno o aire. Según el compuesto de secodiona utilizado y la oxidorreductasa, el tiempo de reacción asciende a una hora hasta 7 días, particularmente a 2 horas hasta 48 horas. En este tiempo, se reduce el compuesto de secodiona al menos un 50% hasta el correspondiente compuesto hidroxisecoesteroideo.
La presente invención se ilustra a continuación mediante los ejemplos.
Ejemplo 1 no según la invención
Clonación de una oxidorreductasa de Chloroflexus aurantiacus DSM 635
A) Cultivo de Chloroflexus aurantiacus DSM 635
Se cultivaron células de Chloroflexus aurantiacus DSM 635 en el siguiente medio (pH 8,2) a 48ºC en un incubador bacteriano a la luz: 0,1% de extracto de levadura, 0,1% de glicilglicina, 0,01% de Na2HPO4 x 2 H2O, 0,01% de MgSO4 x 7 H2O, 0,01% de KNO3, 0,05% de NaNO3 , 0,01% de NaCl, 0,005% de CaCl2 x 2 H2O, 5 ml de una solución de citrato de hierro (III), 1 ml de solución de oligoelementos SL-6 [H2SO4 500 μl/l, MnSO4 x H2O 2,28 g/l, ZnSO4 x 7 H2O 500 mg/l, 500 mg de H3BO3, CuSO4 x 5 H2O 25 mg/l, Na2MoO4 x 2 H2O 25 mg/l, CoCl2 x 6 H2O 45 mg/l]. El día 12 del cultivo, se separaron las células mediante centrifugación del medio de cultivo y se almacenaron a -80ºC.
B) Amplificación del gen que codifica la oxidorreductasa selectiva
Se extrajo ADN genómico según el procedimiento descrito en “Molecular Cloning” de Manniatis y Sambrook. El ácido nucleico resultante sirvió como matriz para la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con cebadores específicos, que se derivaron de la secuencia génica publicada con el número 76258197 en el banco de datos NCBI. A este
respecto, se proporcionaron los cebadores para una posterior clonación en un vector de expresión 5’ terminal con sitios de corte de restricción para las endonucleasas Nde I e Hind III o Sph I (SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13).
Se llevó a cabo la amplificación en un tampón de PCR [Tris-HCl 10 mM, (pH 8,0); KCl 50 mM; MgSO4 10 mM; mezcla de dNTP 1 mM; 20 pmol de cada cebador y 2,5 U de ADN polimerasa Pfx Platinum (Invitrogen)] con 500 ng de ADN genómico y los siguientes ciclos de temperaturas:
ciclo 1:
94ºC, 2 min
ciclo 2 x 30:
94°C, 30 s
56°C, 30 s
68°C, 60 s
ciclo 3:
68°C, 7 min
4°C, ∞
Se digirió el producto de PCR resultante de un tamaño de aproximadamente 750 pb después de la purificación sobre un gel de agarosa al 1% con ayuda de las endonucleasas de restricción NdeI e Hind III, o con las endonucleasas SphI e Hind III y se ligó con el esqueleto tratado con las mismas endonucleasas de los vectores pET21a (Novagen) o pQE70 (Qiagen). Después de la transformación de 2 μl de la preparación de ligamiento en células Top 10 F’ de E. coli (Invitrogen), se ensayó en ADN de plásmido de colonias resistentes a ampicilina (o kanamicina), mediante un análisis de restricción con las endonucleasas Nde I e Hind III o las endonucleasas SphI e Hind III, la presencia de un inserto de 750 pb de tamaño. Se sometieron las preparaciones de plásmido de los clones positivos de fragmento a un análisis de secuencia y a continuación se transformaron en Escherichia coli BL21 Star (Invitrogen) o E. coli RB791 (reserva genética, Yale).
Ejemplo 2 no según la invención
Expresión de oxidorreductasa de Chloroflexus recombinante en E. coli
Se cultivaron las cepas de Escherichia coli transformadas con el constructo de expresión BL21 Star (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania) o RB791 (reserva genética de E. coli, Yale, EE.UU.) en 200 ml de medio LB (1% de triptona, 0,5% de extracto de levadura, 1% de NaCl) con ampicilina (50 μg/ml) o carbenicilina (50 μg/ml), hasta alcanzar una densidad óptica (DO) de 0,5, medida a 550 nm. Se indujo la expresión de proteína recombinante mediante la adición de tiogalactósido de isopropilo (IPTG) a una concentración de 0,1 mM. Después de 8 horas o 16 horas de inducción a 25ºC y 220 rpm, se recogieron las células y se congelaron a -20ºC. Para el ensayo de actividad, se mezclaron 10 mg de células con 500 μl de tampón TEA 100 mM pH 7,0 y 500 μl de perlas de vidrio y se disgregaron durante 10 minutos mediante un molino de bolas. Se diluyó entonces el lisado obtenido para utilizar en las correspondientes medidas. El ensayo de actividad estaba compuesto como sigue: 870 μl de tampón TEA 100 mM pH 7,0, 160 μg de NADH, 10 μl de lisado celular diluido. Se inició la reacción mediante la adición de 100 μl de una solución de sustrato 100 mM a la mezcla de reacción.
Para la obtención de enzima en grandes cantidades, se resuspendieron 30 g de células en 150 ml de tampón trietanolamina (100 mM, pH 7, MgCl2 2 mM, 10% de glicerina) y se disgregaron mediante un homogeneizador de alta presión. Se mezcló a continuación la solución enzimática con 150 ml de glicerina y se almacenó a -20ºC.
Ejemplo 3 no según la invención
Cultivo de organismos y cribado de reacción reductiva de etilsecodiona (fórmula III)
Para el cribado, se cultivaron las cepas de levadura Pichia farinosa DSM 70362, Candida gropengiesseri MUCL 29836, Candida vaccinii CBS 7318, Pichia farinosa DSM 3316, Saccharomyces cerevisiae CBS 1508 y Candida magnoliae CBS 6396 en el siguiente medio: extracto de levadura (5), peptona (5) y glucosa (20) (los números entre paréntesis son respectivamente g/l). Se esterilizó el medio a 121ºC y cultivaron las levaduras sin más regulación del pH a 25ºC con un agitador a 140 rpm.
Se ensayó la reacción reductiva de etilsecodiona de fórmula III hasta el correspondiente compuesto hidroxisecoesteroideo en las siguientes preparaciones de biotransformación de célula entera:
Se agitaron 400 mg de células recién recogidas en un lote con 50 mg de glucosa, 10 mg de etilsecodiona de fórmula III y 900 μl de tampón trietanolamina (TEA) 100 mM pH 7,0 durante 24 horas a 28ºC y a 1400 rpm. A continuación, se extrajeron los lotes con 1 ml de diclorometano, se centrifugaron, se secaron con nitrógeno y se suspendieron en acetonitrilo para dar el análisis de HPLC.
Los resultados del cribado se resumen en la tabla 1.
Tabla 1
Nº de cepa
Microorganismo Reacción de etilsecodiona después de 24 h con cepas Wt
Lote 24 h
DSM 70362
Pichia farinosa 0,7%
MUCL 29836
Candida gropengiesseri 0,2%
CBS 7318
Candida vaccinii 3,2%
DSM 3316
Pichia farinosa 15,8%
CBS 1508
Saccharomyces cerevisiae 0,7%
CBS 6396
Candida magnoliae 41%
La cepa CBS 6396 mostraba la mayor reacción de etilsecodiona y se seleccionó por tanto como organismo de partida para la preparación de una biblioteca de ADNc.
Ejemplo 4 no según la invención
Preparación de una biblioteca de ADNc a partir de Candida magnoliae CBS 6396 y la clonación de oxidorreductasa
A) Aislamiento (de ARN total y ARNm) así como preparación de la biblioteca de ADNc
Se resuspendieron 600 mg de células recientes en 2,5 ml de tampón LETS enfriado con hielo. Se añadieron a esta suspensión celular 5 ml (aproximadamente 20 g) de perlas de vidrio lavadas con ácido nítrico y se equilibró con 3 ml de fenol (pH 7,0). Se trató el lote total entonces respectivamente con 30 s de vórtex y 30 s de enfriamiento sobre hielo alternativamente para un total de 10 min. A continuación, se añadieron 5 ml de tampón LETS enfriado con hielo y se mezcló de nuevo fuertemente con vórtex. Se centrifugó esta suspensión celular durante 5 min a 11000 g a 4ºC. Se obtuvo la fase acuosa y se extrajo dos veces con el mismo volumen de fenol:cloroformo:alcohol isoamílico (24:24:1). A continuación, siguió la extracción con cloroformo. Después de la última extracción, se precipitó el ARN total mediante la adición de 1/10 vol. de LiCl2 5 M a -20ºC durante 4 h.
Se empleó 1 mg del ARN total así obtenido sobre oligo-dT celulosa (NEB Biolabs) para el enriquecimiento de las moléculas de ARNm. Después de la precipitación posterior, se usaron 5 μg de ARNm para la síntesis de ADNc (kit de construcción de la biblioteca de ADNc de pBluescript IIXR, Stratagene). La biblioteca construida según las instrucciones del fabricante se transformó en E. coli XL-10 y se cribó la actividad de una ADH. Por la reducción de la extinción con NADPH o NADH como cofactor y etilsecodiona (fórmula III) como sustrato, se identificó y aisló un clon (cM4). La secuenciación del plásmido aislado del clon con el cebador T7 y el cebador T3 dio como resultado un ORF de 789 pb. Este fragmento codificaba una proteína de fusión de un tamaño de 262 aminoácidos y estaba compuesto por el fragmento a de la β-galactosidasa y la secuencia de una presunta alcohol deshidrogenasa de cadena corta.
B) Síntesis de una ADH de cadena corta a partir de Candida magnoliae CBS 6396 que codifica tránscritos completos mediante PCR
Se construyeron cebadores específicos para una posterior clonación del tránscrito completo en el sistema de expresión oportuno. A este respecto, se modificó el cebador 5’ con una secuencia de reconocimiento de Nde I o Sph I y el cebador 3’ con una secuencia de reconocimiento de Xhol o SacI (SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17). El ADN de plásmido, aislado a partir del clon (cM4) de la biblioteca de expresión de Candida magnoliae, sirvió como matriz para la reacción en cadena de la polimerasa. La amplificación se llevó a cabo en un tampón de PCR [Tris-HCl 10 mM (pH 8,0); KCl 50 mM; MgSO4 10 mM; mezcla de dNTP 1 mM; 20 pmol de cada cebador y 2,5 U de ADN polimerasa Pfx Platinum (Invitrogen)] con 50 ng de matriz y los siguientes ciclos de temperatura:
ciclo 1 :
94º C, 2 min
ciclo 2 x 30:
94ºC, 15 s
58°C, 30 s
68°C, 75 s
ciclo 3:
68°C, 7 min
4°C, ∞
Se digirió el producto de PCR resultante después de purificación sobre gel de agarosa al 1% con ayuda de las endonucleasas de restricción Nde I y Xho I o las endonucleasas Sph I y Sac I y se ligó el esqueleto tratado con las mismas endonucleasas de los vectores pET21a (Novagen) o pQME70. Después de la transformación de 2 μl de la
preparación de ligamiento en células Top 10 F’ de E. coli (Invitrogen), se ensayó en ADN de plásmido de colonias resistentes a ampicilina (o kanamicina) mediante un análisis de restricción con las endonucleasas Nde I y Xho I o las endonucleasas Sph I y SacI la presencia de un inserto de 750 pb de tamaño. Se secuenciaron los constructos de expresión de pET21-MgIV y pQME70-MgIV. El gen que codifica una oxidorreductasa de cadena corta de Candida magnoliae poseía un marco de lectura abierto de en total 729 pb (contenido en la SEQ ID NO:8) que correspondía a una proteína de 243 aminoácidos (SEQ ID NO:3)
Ejemplo 5 no según la invención
Expresión de oxidorredutasa recombinante en células de E. coli
Se transformaron con los constructos de expresión que codifican oxidorreductasas pET21-MgIV o pQME70-MgIV células de Escherichia coli competentes StarBL21(De3) (Invitrogen) o RB791 (reserva genética de E.coli, Yale, EE.UU.). Se cultivaron entonces las colonias de Escherichia coli transformadas con los constructos de expresión en 200 ml de medio LB (1% de triptona, 0,5% de extracto de levadura, 1% de NaCl) con ampicilina 50 μg/ml o kanamicina 40 μg/ml, hasta alcanzar una densidad óptica de 0,5, medida a 550 nm. Se indujo la expresión de proteína recombinante mediante la adición de tiogalactósido de isopropilo (IPTG) a una concentración de 0,1 mM. Después de 16 horas de inducción a 25ºC y 220 rpm, se recogieron las células y se congelaron a -20ºC. Para el ensayo de actividad, se mezclaron 10 mg de células con 500 μl de tampón TEA 100 mM pH 7,0, MgCl2 1 mM y 500 μl de perlas de vidrio y se disgregaron durante 10 min mediante un molino de bolas. Se diluyó entonces el lisado para utilizar en las correspondientes medidas.
El ensayo de actividad estaba compuesto como sigue: 960 μl de tampón TEA 100 mM pH 7,0, MgCl2 1bmM, 160 μg de NADPH, 10 μl de lisado celular diluido. Se inició la reacción mediante la adición de 10 μl de una solución de sustrato 100 mM en 70% de metanol a la mezcla de reacción.
Para la obtención de enzima en grandes cantidades, se resuspendieron 30 g de células en 150 ml de tampón trietanolamina (100 mM, pH 7, MgCl2 2 mM, 10% de glicerina) y se disgregaron mediante homogeneizador de alta presión. Se mezcló a continuación la solución enzimática con 150 ml de glicerina y se almacenó a -20ºC.
Ejemplo 6
Reducción de etilsecodiona (fórmula III) mediante la oxidorreductasa de SEQ ID NO:1
Para la reducción de etilsecodiona (fórmula III), se incubó en un recipiente de reacción una mezcla de 800 μl de tampón (fosfato de potasio 100 mM, pH = 7, MgCl2 2 mM), 1,2 ml de 2-propanol, 0,08 mg de NAD, 100 mg de etilsecodiona (fórmula III) y 1 ml de suspensión enzimática de oxidorreductasa de SEQ ID NO:1 (véase el ejemplo 3) durante 24 h a temperatura ambiente con agitación constante. Después de 96 h, se redujo >90% de la etilsecodiona utilizada (fórmula III).
Después de terminada la reacción, se procesó la mezcla de reacción mediante extracción con diclorometano, se separó la fase orgánica que contenía el producto y se obtuvo el compuesto de 17-beta-hidroxilo (etilsecol) mediante evaporación/destilación del disolvente.
La reacción de la etilsecodiona hasta etilsecol se siguió mediante HPLC. Para ello, se usó una columna de separación EC 125/4 Nucleodur 100-5 C18ec (Machery-Nagel, Düren, Alemania) con acetonitrilo y agua como fase móvil. Para la analítica, se empleó un gradiente lineal de la proporción de acetonitrilo en la fase móvil de 30 a 70%. La identificación de los productos de reacción se realizó mediante comparación con sustancias de referencia.
Ejemplo 7
Reducción de etilsecodiona (fórmula III) mediante la oxidorreductasa de SEQ ID NO:2
Para la reducción de etilsecodiona (fórmula III), se incubó en un recipiente de reacción una mezcla de 250 μl de tampón (trietanolamina 100 mM, pH = 8, MgCl2 2 mM), 250 μl de 4-metil-2-pentanol, 0,02 mg de NAD, 25 mg de etilsecodiona (fórmula III) y 25 μl de suspensión enzimática de la oxidorreductasa de SEQ ID NO:2 (véase el ejemplo 3) durante 96 h a temperatura ambiente con agitación continua. Después de 96 h, se redujo >30% de la etilsecodiona utilizada (fórmula III) hasta el compuesto hidroxilado.
Después de terminada la reacción, se procesó la mezcla de reacción mediante extracción con diclorometano, se separó la fase orgánica que contenía el producto y se obtuvo el compuesto de 17-beta-hidroxilo (etilsecol) mediante evaporación/destilación del disolvente.
Ejemplo 8
Reducción de etilsecodiona (fórmula III) mediante la oxidorreductasa de SEQ ID NO:3
Para la reducción de etilsecodiona (fórmula III), se incubó en un recipiente de reacción una mezcla de 100 μl de tampón (trietanolamina 100 mM, pH = 7, MgCl2 2 mM), 400 μl de 4-metil-2-pentanol, 0,02 mg de NADP, 25 mg de etilsecodiona (fórmula III) y 100 μl de suspensión enzimática de la oxidorreductasa de SEQ ID NO:3 (véase el ejemplo 3) durante 72 h a temperatura ambiente con agitación constante. Después de 72 h, se redujo >95% de la etilsecodiona utilizada (fórmula III) hasta el compuesto hidroxilado.
Ejemplo 9
Reducción de etilsecodiona (fórmula III) mediante la oxidorreductasa de SEQ ID NO:4
5 Para la reducción de etilsecodiona (fórmula III), se incubó en un recipiente de reacción una mezcla de 200 μl de tampón (trietanolamina 100 mM, pH = 9, MgCl2 2 mM), 300 μl de 2-heptanol, 0,025 mg de NADP, 100 mg de etilsecodiona (fórmula III) y 50 μl de suspensión enzimática de la oxidorreductasa de SEQ ID NO:4 (véase el ejemplo 3) durante 72 h a temperatura ambiente con agitación constante. Después de 72 h, se redujo >80% de la etilsecodiona utilizada (fórmula III) hasta el compuesto hidroxilado.
10 Ejemplo 10
Reducción de etilsecodiona (fórmula III) mediante la oxidorreductasa de SEQ ID NO:5
Para la reducción de etilsecodiona (fórmula III), se incubó en un recipiente de reacción una mezcla de 300 μl de tampón (trietanolamina 100 mM, pH = 7, MgCl2 2 mM), 1,2 ml de 4-metil-2-pentanol, 0,12 mg de NADP, 150 mg de etilsecodiona (fórmula III) y 0,6 ml de suspensión enzimática de la oxidorreductasa de SEQ ID NO:5 (véase el ejemplo 3) durante 72 h
15 a temperatura ambiente con agitación constante. Después de 72 h, se redujo >90% de la etilsecodiona utilizada (fórmula III) hasta el compuesto hidroxilado.
LISTADO DE SECUENCIAS
<110>
IEP GmbH
<120>
Procedimiento para la reducción enzimática enantioselectiva de derivados de secodiona
<130>
I 11005
5
<160> 42
<170>
PatentIn versión 3.3
<210>
1
<211>
252
<212>
PRT
10
<213> Chloroflexus aurantiacus DSM 635
<400>
1
<210>
2
<211>
249
<212>
PRT
<213>
Rubrobacter xylanophilus DSM 9941
5
<400> 2
<210>
3
<211>
243
5
<212> PRT
<213>
Candida magnoliae CBS 6396
<400>
3
<210>
4
<211>
241
<212>
PRT
<213>
Candida magnoliae DSM 70638
5
<400> 4
<210>
5
<211>
241
5
<212> PRT
<213>
Candida magnoliae DSM 70638
<400>
5
<210>
6
<211>
759
<212>
ADN
<213>
Chloroflexus aurantiacus DSM 635
5
<400> 6
<210>
7
<211>
750
10
<212> ADN
<213>
Rubrobacter xylanophilus DSM 9941
<400>
7
<210>
8
<211>
732
5
<212> ADN
<213>
Candida magnoliae CBS 6396
<400>
8
10 <210> 9
<211> 726
<212>
ADN
<213>
Candida magnoliae DSM 70638
<400>
9
<210>
10
<211>
726
<212>
ADN
10
<213> Candida magnoliae DSM 70638
<400>
10
<210>
11
<211>
38
5
<212> ADN
<213>
Constructo sintético
<220>
<221>
misc_feature
<222>
(1)…(38)
10
<400> 11
<210>
12
<211>
34
15
<212> ADN
<213>
Constructo sintético
<220>
<221>
misc_feature
<222>
(1)…(34)
20
<400> 12
<210> 13
<211>
34
<212>
ADN
<213>
Constructo sintético
<220>
5
<221> misc_feature
<222>
(1)…(34)
<400>
13
10
<210> 14
<211>
35
<212>
ADN
<213>
Constructo sintético
<220>
15
<221> misc_feature
<222>
(1)…(35)
<400>
14
20
<210> 15
<211>
33
<212>
ADN
<213>
Constructo sintético
<220>
25
<221> misc_feature
<222>
(1)…(33)
<400>
15
30
<210> 16
<211>
35
<212>
ADN
<213>
Constructo sintético
<400>
16
<210>
17
<211>
34
<212>
ADN
<213>
Constructo sintético
<220>
<221>
misc_feature
<222>
(1)…(34)
<400>
17
<210>
18
<211>
12
<212>
PRT
<213>
Constructo sintético
<400>
18
<210>
19
<211>
12
<212>
PRT
<213>
Constructo sintético
<400>
19
<210>
20
<211>
12
<212>
PRT
<213>
Constructo sintético
<400>
20
<210>
21
<211>
12
<212>
PRT
<213> Constructo sintético
<400> 21
5
<210> 22
<211>
12
<212>
PRT
<213>
Constructo sintético
<400>
22
<210>
23
<211>
12
<212>
PRT
15
<213> Constructo sintético
<400>
23
<210>
24
20
<211> 7
<212>
PRT
<213>
Constructo sintético
<400>
24
25
<210>
25
<211>
7
<212>
PRT
<213>
Constructo sintético
30
<400> 25
<210>
26
<211>
7
<212>
PRT
<213>
Constructo sintético
<400>
26
<210>
27
<211>
7
<212>
PRT
<213>
Constructo sintético
<400>
27
<210>
28
<211>
8
<212>
PRT
<213>
Constructo sintético
<400>
28
<210>
29
<211>
8
<212>
PRT
<213>
Constructo sintético
<400>
29
<210>
30
<211>
6
<212>
PRT
<213>
Constructo sintético
<400>
30
<210>
31
<211>
6
<212>
PRT
<213>
Constructo sintético
<400>
31
<210>
32
<211>
6
<212>
PRT
<213>
Constructo sintético
<400>
32
<210>
33
<211>
6
<212>
PRT
<213>
Constructo sintético
<400>
33
<210>
34
<211>
9
<212>
PRT
<213>
Constructo sintético
<400>
34
<210> 35
<211> 9
<212>
PRT
<213>
Constructo sintético
<400>
35
5
<210>
36
<211>
9
<212>
PRT
<213>
Constructo sintético
10
<400> 36
<210>
37
<211>
9
15
<212> PRT
<213>
Constructo sintético
<400>
37
20
<210> 38
<211>
9
<212>
PRT
<213>
Constructo sintético
<400>
38
<210>
39
<211>
7
<212>
PRT
30
<213> Constructo sintético
<400>
39
<210>
40
<211>
7
<212>
PRT
<213>
Constructo sintético
5
<400> 40
<210>
41
<211>
6
10
<212> PRT
<213>
Constructo sintético
<400>
41
15
<210> 42
<211>
6
<212>
PRT
<213>
Constructo sintético
<400>
42

Claims (16)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Procedimiento para la reducción enzimática enantioselectiva de derivados de secodiona de fórmula general I
    en la que R1 es hidrógeno o un grupo alquilo C1-C4, R2 es hidrógeno, un grupo alquilo C1-C8 o un grupo protector de OH conocido en el estado de la técnica, como un éster, R3 es hidrógeno, un grupo metilo o un haluro, el elemento estructural
    10 representa un anillo de benceno o un anillo C6 con 0, 1 o 2 dobles enlaces C-C,
    que contiene en las posiciones 6/7 o 7/8 eventualmente un doble enlace y el carbono en las posiciones 1, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12 y 16 está independientemente sustituido con hidrógeno, un grupo alquilo C1-C4, un haluro o un grupo fenilo,
    en el que el derivado de secodiona se reduce con una oxidorreductasa/deshidrogenasa en presencia de NADH o NADPH como cofactor,
    15 caracterizado porque el derivado de secodiona se utiliza a una concentración ≥10 g/l en el lote de reacción y porque el cofactor NAD o NADP oxidado formado por la oxidorreductasa/deshidrogenasa se regenera continuamente.
  2. 2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque la oxidorreductasa/deshidrogenasa
    a) presenta una secuencia de aminoácidos en la que al menos un 50% de los aminoácidos son idénticos a cualquiera de las secuencias aminoacídicas de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 o SEQ ID NO: 20 5,
    b) está codificada por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 o SEQ ID NO:10 o
    c) está codificada por una secuencia de ácido nucleico que hibrida en condiciones rigurosas con las SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 o SEQ ID NO:10.
  3. 3. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque la oxidorreductasa/deshidrogenasa presenta una longitud de 230 a 260 aminoácidos y comprende una o varias de las secuencias parciales seleccionadas del grupo compuesto las secuencias de SEQ ID NO:18 a SEQ ID NO:42:
    nalvtgasrgig, nalvtggsrgig, nalitggsrgig, nalitgasrgig, nalitggsrgmg, halvtgasrgig,
    30 gysvtla, gynvtla, gysvtlv, gynvtlv,
    fkgaplpa, fkaaplpa, fvsnag, ffsnag, fvcnag, fvanag, spialtkal, spvaltkti, spialtktl, spvamtkal, sqialtkal, avysask, avysatk, pikgwi y pisgwi.
  4. 4.
    Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el cofactor oxidado NAD o NADP se regenera mediante la oxidación de un alcohol.
  5. 5.
    Procedimiento según la reivindicación 4, caracterizado porque para la regeneración del cofactor se usa un alcohol secundario de fórmula general RxRyCHOH en la que Rx yRy son independientemente entre sí un grupo alquilo C1-C8 ramificado o no ramificado y Ctotales ≥ 3.
  6. 6.
    Procedimiento según la reivindicación 5, caracterizado porque para la regeneración del cofactor se usa un alcohol del grupo que consiste en 2-propanol, 2-butanol, 2-pentanol, 4-metil-2-pentanol, 2-hexanol, 2-heptanol, 5-metil2-hexanol, ciclohexanol o 2-octanol.
  7. 7.
    Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque para la regeneración del cofactor se añade adicionalmente una oxidorreductasa/deshidrogenasa.
  8. 8.
    Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque el TTN, es decir el número de recambio total = mol de derivado de secodiona reducida/ml de cofactor utilizado, es ≥103.
  9. 9.
    Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque se lleva a cabo en un sistema bifásico acuoso-orgánico.
  10. 10.
    Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque se utiliza adicionalmente un disolvente orgánico, preferiblemente dietiléter, terc-butilmetiléter, diisopropiléter, dibutiléter, acetato de etilo, acetato de butilo, heptano, hexano, tolueno, diclorometano, ciclohexano o mezclas de los mismos.
  11. 11.
    Procedimiento según la reivindicación 10, caracterizado porque se utiliza como disolvente orgánico dietiléter, terc-butilmetiléter, diisopropiléter, dibutiléter, acetato de etilo, acetato de butilo, heptano, hexano, tolueno, diclorometano, ciclohexano o una mezcla de los mismos.
  12. 12.
    Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque el derivado de secodiona se utiliza en una cantidad de 10 g/l a 500 g/l, referida al volumen total, preferiblemente de 25 g/l a 300 g/l, con especial preferencia de 50 g/l a 200 g/l, en el lote de reacción.
  13. 13.
    Procedimiento según la reivindicación 12, caracterizado porque el derivado de secodiona se utiliza en una cantidad de 25 g/l a 300 g/l, referida al volumen total, en el lote de reacción.
  14. 14.
    Procedimiento según la reivindicación 13, caracterizado porque el derivado de secodiona se utiliza en una cantidad de 50 g/l a 200 g/l, referida al volumen total, en el lote de reacción.
  15. 15.
    Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 14, caracterizado porque se utiliza como derivado de secodiona 13-etil-3-metoxi-8,14-seco-gona-1,3,5(10),9(11)-tetraen-14,17-diona, es decir, etilsecodiona-fórmula III.
  16. 16.
    Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 14, caracterizado porque se utiliza como derivado de secodiona 13-metil-3-metoxi-8,14-seco-gona-1,3,5(10),9(11)-tetraen-14,17-diona, es decir, metilsecodiona-fórmula II.
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