HUE029907T2 - Oxidoreduktáz és alkalmazása szekodionszármazékok redukálására - Google Patents

Description

ALKALMAZÁSA SZ L K Ö » ? O N SZA R M AZ.ÈKO L REMíKÁLÁSÁttA A táláímátty tárgya oxidereduktaz (í) Általános képletö sïsfeoâiîïôszârmazékok ilk as fedtikailsfet, ahol a szeködkiosztírnlazékktríáktoídíébt HASH jelenlétében oxidcsredak^ dáx/dfthNÍroge«d^ka} redukált. A kék egymástól íögpt ten átöbeénifc, mégpedig egyrészt pövébyí dttvásből sréianazcg ígnnésztdésén előforduló szteröidvegydtetekdM kiindulva, másrészt teljesen színietíkits mó-Öon, profciréíís prekuíZörokhók enabböSZSÍektiv szintézissei A két jede Aég közál a sztsroidok télies szintézisének jeteKíösege növekszik* nővé! lehetővé tészr a temrészetesert elötördalö sztezöldokdaa jelen nam lévő szerkezeti elemek bevitelét.

Az enaníltmieriktísan tiszta szteroidók teljes sziníézíréneR Rufes épitókőveí m fl) általános képlet szerinti vegyntetefc, amelyeket szekoszterqidakiiak, kvlérszeko-gona-iedadtt-lé^n-diotinak vagy szekodmnttak is neveznek, A esöpert speciftkas képviselői példáit! a kővetkező vegyaktek: ntétilszeködtön f(ü) képlet, 13-mettÍ--á-tnetöSkSíM-s^kö-göSá-íidJiiöXSCl IMetraétt-l-LlT-díon] és idbszéködta {|ííí j Répteíi í3réíii~3-meiöxi~ -8.14-szek<:vgona-1,3,5( 10),9( i 1 )-tett;iem 1 d, i 7-dión], anudyekböi például a gyógyászaíilag aktív vegytífetek, m táiíiiidsztradiöi:jjjld) képlet] és sorgesztre! i(Ví képlet 1 állíthatók elő.

A sztöroidyegyiiietek ensnifetnedkessti tiszta elöállitásápák kidcslépése az (1) jpéídáuS (11) &amp;> rélíjj kép-fedi vegyidét: átalakítása elote kialakítóit, aszimtaétrikus €-13-at tartabnazö, optikailag aktív vegyttledé m egyik ketocsöport hidroxiesoporldVtdrtdntk enantöszélektív teditkálásával, A kupelt optikailag aktív lyidAskisze· ködíönvegytlieteí^t Iszekok (ViA(íX) képlet] végöl gytirézgréssái* a kfealiíás ategtartása méllett királis szferóid^ vegyüietekké alakíthatók tovább.

Az (í) képletö vegyidet egy ketoosoporíjának eHaotioszeiektiy mdíikáiásaváléhnéledleg ttégy optikáikig aktív ve^ötó ^ezliatö{fAl)-(íX} kepíetekj.

__ A (Vl) képlgtís vegyüljek, a 17 helyzetit hidroxiesopori béta; kö«%üi#^j|lj,ik^ßS%ÄW: sptnpontból különösen étdekesek., mivel ezeka természetes Ösztron szármatékaihox vezetitek, Izeket a vegyü-: leteket 17-béSn-h kiroxi,vzekoszterosdoknak Is m vevik. AZ (Î) általános képlett! szeködionszárntazékök különböző n'iikrööi^ántzrmssok segítségével történő: sziereösxeíektív rwdukálását különös«« iménziven kataltük az 1 SlpO-as ŐS i ^7Ö»«s években, ΚΐίΡΡίδίΐ^ htfgy ä Candida* Debftryomyces, K/< veként, PicM^'Ctyptecrngmik MhüdfgorMle, yümfapsss es Hemmuhi nemzetségbe tartozó eieszüMörzsek képesek a szekodionpkat likîroxiyegyllleüé redukálllí: (US 3616226, US 1252524, US 3616225), feitidnösen p Saccharomyces nemzetségbe tartozó törzsek, például a X imirum alkalmazhatók előnyős »tódon, példán] a megteleló 17-héla-ln'droxis/ekosztemid éSőátíllásárá IKosmoli és munkatársai: Líebtgs Anti, Ősein, 701, W (SQ<>7)]. Más élesztótörzsek, példa«! a SaccM&amp;mmyees dmsophiim^mM^áioáiüfíi előnyösért » megfelelő Í4~áÍlá%idroxiSzekosrteroidda redukálják (Aetá fnleröbioi Arad, Sok: kittig. 22,463-471 (1975)), beírták továbbá, bogy a M-alíádddrosiszefcuszteroid előáll libáié szkodba BmtMm 'tHm'htgiensisMM íséöÉi»· lásávtd: f&amp;osmol ós< munkatársai: ! aebigs Asm. Ebem. 701,190(15167)]. Ä gesxtagén és ösztrogén hatóanyagokat viiágsxerte széles körbe·« alkalmtááöÉÉi: föjpiíáíiilltóötoÉít és bormönbelyettealtÖ terápiában, Jelenleg az Ösztrogén- és gesztagén-szártniizékok szintéziséítek többsége a fent leírt reakciöelv szerint történik, amelynek knleslépése;:%;Szekodiönők eoáÍtfkrtifeléktív redukálása a megfelelő )7*béíít-h idroxlszekoszteroklokká.

Jelenleg a szeködionszármazékök sztereoszcleki iv redukálását különböző, a f'íehia vagy Saccharomyces nemzetségbe ístiozó éleszlösejtek ábtd történő teljes sejt blötransklörmáelőval végzik, Ezen stjámsök bÉrányá, bogy csak nagyon kis sznbsztrálköneesítráeiövjőya! ÍTfe alaltí (általában 1-5 g/1) Válósítbaló «reg (11$ 3697379; Gurroni Selene«, Fob.5 (1964), 53· kőtök 3, szátn. 12% oldal; Biology, 27, kötet,

Aiípxt 1989, 742-743 oldal). Ezáltal különösen a reaMőtermók nagy tértegatból lörtértb íddöígözásá éá ízőtá"· láss, vaiatst tnt a nagy memt y Bégek el választása a biomasszától Igét« kíMlmégyes. A feltalálók tudósítása szerint a makeiőhan resztvevő enzimeket ezidálg nem izolálták, item áZönöslMták és ness írták le, Nem azouosítótíák 'üPM,:tetxi^edükiá2e^t:.]ké(loti :fíPSS^ekvenclák'8i sém, amelyekkel ä spködionszárrnazékek redukálása megválósitbatő, A találmány (i| áUáíáoos képlet«. kólóiméért (11) és (111) képíelö szeködii>nszárs«azékók értenteszelékrtven rsdökálbaíok. Ezáltal a megfelelő 1 ? >béta#ldîPkisZfertîiélok előállítása is lehetségessé válik.

Az EP 1 152 054 Ml szórná szabadalmi itat tere-bmsl-($3^6%lóf'-5-%ídF>kíG-óxobesánOát tePshmibpR, ,5S)-6- k!ór-3,5-dii)idroxihexanoá1tá redukálására szolgáló eprást, püliniikteotidöt, a poiioapeotid áltál kódolt polipoptídet és Ismertet, ahol a redakeiőt a pöíipeptíd kátalizá|á, A föllMfcieötí#:%a polipeptid a Candida ; nemzetségbe tartozó imfaöorgamZümsokböl, különösen (^mciidamägmhimWQ ö?Ö5sbőí előálíídtaló. A találmány öllakni körtA az 1-3. igénypontok határozzák meg. Egy első aspkfes szerint a tslálmárty tárgya; oxidoroduktázaz (1) áitelástos képlet« szekodtonszámtazék onsnitiOszoíektív, onzlmes rednkálásáta,

ähol &amp; gyüniszerkezeteh nein tartalmaznak heíeroáíomot, vagy egy vagytöbb heteföstotnoi tstiälmaznäk, R s jelentess hidrogén vagy Ci A4-alkildkÖpöÍ&amp; R? jélentése hidrogén, CrOs--;dkilesopmt vágy öB-védóesopon, például észter, R·? jelentése hidrogén, met! lumpon vagy balogénál, a

szerkezeti ©lem jelemése: beazoigyíM vagy (Rí vagy 2 kettős C-0 kötési tartalmazó C,·, gyűrő, ahol adott esetben 8 helyzsífeen RettŐS: kötés viifís Ós az 1, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9. il, 12 és !6 helyzetű szén egytnásioí ítig~ géiiénüi hidrogénnek O^^sMcsoporílál, halpgenkidel vagy rendcsoporttal szubsztltoált, ahol az oxkbreduktáz/dohidrogenáz a szekodionszármazékot kofakkfrként ΝΑΟΙ I vagy ΝΛ1 )PM jelenlétében redukálja A szekodíonszárotítzék >4# g-t koncettűdcíéhan alkahnazött a reaké tétételben, és m ögidoreÄtazide^ hidrogenáz által képzett oxidált hl AP vagy NA0P kofaktort folyamatosan mgenerfjjufc,

Ak éljárás a szekodtöíiszáisnazéknk emmíioszelekttv, enzirn&amp;tikus redukálásának jatesrős javRását jéiénli á technika állásához képest, A találmány szerinti oxidoreduktáz lehetővé teszi a szekcsdinoszánnazékok redukálását a különböző mogMeíö htdrnxiszekosztërnidokkàj szabad etízimőkkei, olyan koncentrác^áte^lpbas, ámely sokkal magasabb a technika állása szerint leírthoz képest. A. találmány egy másik aspektasa szerint taláR niátty szerinti öxidoreduktázi alkalmazunk az {1} képiéi szerinti szekodionszármazékok enamioszeiektív, mm-mátikus redukálására, ábní a szekndínnszármszéknt koíakiorkéat NAPB vagy HADPH jelenlétében oxído-reduktáz/dehidrogenázzal redukáljuk, és az íjxideíeduktáz/dehidrugenáztt}

á| amrnpsav-sKekveneiht tartalomz. mely ammosavslnak legalább bt)%-a aznnps a SEQ |í> NQQ szerinti amínosav-sxekvenefa atninosavaival vagy b> SBQ10 NO:8 szerinti nukleinsav-szekvencía kódolja és SEQ ID ^^$Éá^á%M)Íii»ény)ÉiÉŐZdtt hibridizáíó tiukieinssv-szekvenda këdoRb abol a sztringpns körüíméayék magukban föglaluák hibridtzáeiötMA-1 M bfaíll oldatban, ŐOöCkon. •A-f^l##t:^pm-::óxíéte^«l.!fe#^sá?bOPá{í#8fe-:*!tné|y*fe.M^6k''SZPk'ötfi®Etónníeisék«Éát-:hidrosi-iSzdkôSj^btiiâ és amelyek iparilag mknnibinsns módon előállilltatok, A találmány szerinti ősidő-.tédufetázókkái jéíéníŐsep magasabb sznbsztrstkoneenträcid érhető el, máit a;jelenleg alkalmazott teljes: seji éljá* fásokkal.

Az eljárásban a &amp;Rí| IIAKÖQ szerinti szekvenciáid polipeptid vagy: az ebből a polípeptídbSS szárma^ :4ntbatő|pdfípéptIi4::ttkSr teljesen tisztított áliapoibany részben tisztított állapotban, akár SEQ: IP NO:3 szerinti ^ökvéttélllipt .pj'Mjpé^tidét g»tairaazd sejtként alkaimazbató. Az alkalmazott sejtek tehetnek natívak, penneabili- záltakvagy lizâitak, Előnyösen a»oxiditreduktázolO illetve abbéi szàrtmztatisttô származékok tnegielélô gazda* szervezéíben;.például BscBpéhia eoii-ban overekpfésszáltak, es a rekombmáns poüpptiM aikaîUMZznfe az |l) általános képiétő $zek<Kli<miÉ&amp;8ázdk redukálásánál, :&amp; SB^.'ÍD NO:6 szerinti, mm találmány szerinti MlS^s^kveitóia, amely !|g^: IP NPïî szerit# pofipeptidsí köviöl, példáid eiiállithaté a Ehforqßexm mvwifia&amp;m BSM Ő3S genomjabol, .&amp; SEQ 4P NO:? szerméi, nem találmány szerinti DNS:A>mkvőnei&amp;, amely ISIÉI · :ö>;· Ä&amp;: -«sÄf.' polipeptidet ködei, példán! ókőáliítható a fhihrohacfer^lm^hitmtMM 9941 gemtnyáMk A SBQ IP NO: 8 sKéríníí PNS-saekvéaëk>> amely SEQiDNQO szerinti ûMâiifêmâgmlîM CBS 6396 élesztőből > A SEQ IP NQ:4 és SEQ 10 NO;S szekvencia szerinti, nmn találmány szeiinti pyidoredtiktázök péiddal eídáiliihatők Candida megmíim PSME ?Ö638-bőlbomolőgiaszkdoeiésseE Egy ouklgmsav'szekvfinsla alatt, amely például SEQ IP NO;é szerinti szekvenciával szttingens körülmények között tid érteítdői aasely kolónke-hibridizalás iRódszsnel, piakk'híbrkiízálás tnédszeiteí, S»Äi»sÄÄ3^el#:Äi!* szerrel vagy hasonló eljárással, SEQ4P biP:6 szerinti szekvencia vagy SEp 5D Nö:6 szerinti szekveeeia része iőNS-prőhákéhí történő alkaimazásávaí azenesitkatö; Ennek megvalositásához a ÍIIIsreiiítömöBílizálipóliftükle“ ötidöt például SEQ 4P NPtő szefltití szekye«eikvai Itíbridízáljnk (),?- I M Na£4-old;tthán, 6Ő*C-öm A bMblzá-· clôt például a Molecular Ckming, A Laboratory Mámtal, Second Edition {Cold Spring Parbcff EaimrâPay Éress, i 989); című munkában vagy basímlő pnbiikáeiőfean .leírt módon végezzük·.. Végül a filter! 0.1 C- szeres SSO ·οΙ0ήίρ3; 65yO-nn mosstik, ahol az I-szeres SSO-öklat ISÖmMNáCI ás l 5 ibM nátrium-cilrát keveréke, Λ lenti szekveticialístálkut Szeiéplő SEp IP Nö;6, SEQ IT4 NO:?; SEQ ffî blÔ:k, SEp IP 440:9 vagy SBC5 IP NO: 10 szerinti poiamkiebtiddal szíringens körülmények között hibndizálö polinnkleetid iepíább EÖSQ -es szekvencia-azonosságot, előnyösen 95tibos: azonosságéi annal a SBQ IP NO;6, SEQ ID 440:7; SEP 4P Ni ):8, SEQ ID NO:9 vagy SEQ ID NO: 10 szerintii poiínnk lemid-szekveneláva!·

Egy további aspektus szerint a szekodtonszárnmzékot ludakíorkéitt MADliyagy NAPÉN: jelenlétében (ísidofeduktázAiehidrégenázza! redukáljuk egv (;}) íáltaiátms képiető szekodionszármazékok eoatitiöszéíekiiv, enzimsbkus redukálására szolgáló eljárásban, altok az oxidoredtsktizAleliídfogenáz 230-4160 amtttositv írnsszásá-gú, és egy vagy több, a kővetkezőkből [SEQ ÍDNO: 18 - SEQ tP NP;43 szerinti szekvenciák^ álló esoporiből kiválasztott részszekvéneiát tartalmaz: ftal'vtggsri^.-sallvdgptiiii.náiHtg^gíjg, nalligasrgig, nailtgprptg, itslyígasrgig,: gysvtla, gynvlía, gysvtív, gynvtiv, íkgaplpa, íkaapipn. tvsnag. tísuag, iveuag, fvanag, spialikak apváÉkii, : spiáitidí, ppvamikal, sg la Ilkái, avyytsk, avysaik, pifcgwi és pisgiyt.

Az eljárásban kofaktorként N.APH-t vagy NADEH-t alkalmazunk. A „NADP" kilejezós jelentése nÉtâÂümli^ëni»^Ssük4«tôilâlÉ«^r:â>3iÂH^vjeîi^l§e redukált nikpenamid-ad^in^mökted^i^Äl^r Á. Jêléniéàë. :mlbli^mtd^Éso.m^Wfâ^itj4 a: „NAPID jelentése: redukált luketmaraíd- -adenio-dimtkíeotid. M· eljárás egy megvalósítási módja sr.ei'mi: a s^ködióftszátstazékot >10 g/1 kbnoerííráéiőöao állták mstzzuk a reakclőíéteiben, és az oxidoreduktázfelehidrogenáz által képzett oxidált NAD vagy NA DP ko faktor folyamatosan regenerálódik, az á) exídnreduktá^déhídrogésáz olyan áminosav-szekveactát tartalmaz, amely amísösavaí leplább S8%4san azonosak a SRQ i.0 NO:3 Szerjnd advinösa^Szekvenela ammosavalyal, vagy fe| az oxtdoredttlaázÁiehidrögérsáát ä SBC? P ΝΕΜ szédíti máiémsay-szekveocia: ködö)já.

Az eljárás egy másik megváibsitásj móífjá .szerit« á szeködÍonszármazék«l: > 10 g/i koncentrációban alkalmazzuk a reákeiótéteíhen, és az bxik>jt^íuktM^y^g^«-ÍMi képzett oxidált NAD vagy NADP koÄtor folyamatosán regenerálódik« lünmosá^itoszóságú vagy több, a kővetkezőkből [SEQ ÍD NÖ; 18 - SEQ ÍL> NÖ:42i szerinti szefcvenéiáR} átlő csoportból kíválásztolt részszekveït-elás iartaltnaz; näivigasrgig, náivtggsrgig, mtliíggsrgif, («dttpsfgig, nálHggsrgmg, häivtgaSrgig;: gysvtla, gynvtia, gysvfiv, gynvíiv, ikgáplpa, íkaaplpa, ivsttag, ílpág, feénág, fvamtg, spialtkäl, spvaltklí, spíaltkll. spvímnkaf, sqialíkal, avysssk, avysatk, pskgwi és písgwj. Előnyösen a második és hutmadlk aspektus: szeriott eljárásban az oxldoredoktáztdebidítjgesáz által képzett oxidált NAD vagy NADP koittktqf íblyamátösáFrégébe-rálődik.

Az eljárás egy megvalósítási média szerint az oxidált NA!) vagy NA DP Kofaktor regenerációja alkohol oxidációjával történik.

Koszubszirátként előnyösen primer és szekunder alkőbolokat, például etartoB, 2-propapolt, E-bUtánolt, ;!« peníaaoít, d-peotanolt, 4-metli-2-pent8n«St, 2dtexanolt, 2-hepíanolt, 2-okianolt vagy eiklobexatiolt aikáítSá-zunk. A regeneráláshoz alkabnazoít koszubsztrát aránya ateíjes lértbgát S-95 térfópt%-a lehet.

Előnyösen a kofaktor-repneráfáshoz Rxk y<.'l IOH általános képien szekunder alkoholt alkalmazunk, ahol % és :RV jelentése egymástól Sggeileníll hidrogén, elágazó vagy et netn ágazó GrCa-Alkijesoport, és ( -> ·>,

Az eljárás egy másik megvaiösitási módja szerint a koíaktorok regenerálásához összeseit égy oxide* fédtiktázédehldrogettázt alkalmazunk,

Megfelelő NADH-fuggö alkohol-dehldrogenázok péidátij előállíthatok sdlőélesziöbŐli: Candida pampsdosisAM. (CPCR) fUS 5,523,223 és US 5,7b3,23ő, Enzyme Mierob. Téohnol, 1993, 15(1)):950-8), Fichia capmietilbCl (DE 19327054,:4¾ Fíwdmmá&amp; M0FápölÍ$4>őI (REGE) (US 5,523,223¾ Mwcerdkt fmeSsM. (Biösei Bioteclmok Btocbem,, 03(19), 1999, S, 1721-1229; Appt. Microbiol Sioisehooi,, 2003, 02(4):3804)5 Bpub 3003:, Apr, 30} vagyMfmfmaccm möt/rböl .(.3,. :örg.· Ebem., 2003, 68(2):402-6), Megfelelő kósztibsAfáíok az aiköhör-dehídtx/ges'íázokitoz például a már ismertetett szekunder alkoholok,: például 2-prbpíUKsl (íxopropanhí), 2-butanoi, S-pentanőI, 4-metíl-2-pentauol, 2-oktanol vagy cikfohexáoök A NADPl I regenerálásához megfelelő szekunder aikolKil-dehídrogenázok például azok, amtdyekei kurták és izoláltak a / actohmliefm wná szervezeteiből például Lmt&amp;baeilim ΜβΜϊφΒ 5,200,335), lmt&amp;° kimjUw. kffvkMI tDK 19010984 AI; Aeía Crystállogr, D. M; Crystallogr, 2060 Béig 56 Pt 12:1696*8), í,mmbmiUus »/mórból (DE 50119274), 'bemmmtw·· e<mimwé&amp;iA í3bl720OS, RI, GI2M), vagy ttzok, ame-lyekef leírlak Themoamrabium brockiiböl ÍFermoiimrobium edimoik-mhól vagy ChsMdmtn beijmmkiMií

A kotáktor-regenerálásboz azonbatt elméletileg más enzimrendszerek is aíkaimazbatók. A koláktor-«regénemiás elvégezhető például NAIS- vagy NADP-fdggö lörtniát^ehldfogetíázzál (Eishkov és tnutikaiárssi; 3. Biöteéhnöí. Etóeng. lí999) ő4, 187-193, pilm-seale: prodttetion and isolation: of recombinant N AD and KAUF specific^ formate dehydrogenase] > Ä fenifedehtdrögenä^ megfelelő koszubsztrátjai például a hangyasav sói, például ammónltmt-femdáí, nátrinm-fermiát vagy kalcium-fömuát.

Az eljárással eléri TTN (teljes / mol alkalmazott kpfektor) rendszerint Í0? - H>\ előnyösen azonban >lö\

Egy megvalósítási mód szerint az végre.

Ennek megfelelőén a rensíszerbén íÖPénik, amely tartalmaz például 2-alkoholt a IfeMtor repnat#ásóifezs oxkloreduktázt, íaimazhai azonban íöyábbi szerves (ildÓsMröke5 is. amelyek nem vesznek feszt a koíikíor regenerálódban, azaz nem tartalmaznak oxidálható hidroxicsoporioi. További oldószerként előnyösen díefílétert, tercier hutllmetil-óíert, dl:ÍSlőprpplÍi|l.^·..difeidiét#t*;butílaeelátnt, heptáák bexäbb toíunlg Jiklórrnetánt, eiklohexánt alkalmazunk vagy ezek kevefekéi::ítÍbtJtnítz,gtÉ. A kétfázisú rendszer yfifeeinen· eivgvodő komponenseinek-áÉítp^féaJd^fe^vtrék gatára vonatkoztatott 10-911¾¾. előnyösen 20-80% leltet, A vizes fesz a reakctőkeysrék teljes térfogatára vonab koztaküt 90-18¾¾ előnyösen: 80-20 leltet. A vízhez hozzáadhatunk pulten, például ká 1 mm - fo s/fô;, Tm-líCf, gítetn vagy tnetannkm«» pufïcrt, amelynek pl 1-értéke 5-1¾ előnyösen 6-{>. A púder tartalmazhat továbbá Ionokat tnittdkéí enzim stabilizálására vagy aktiválására, péidáül magnézium- vagy einktonokat.

Az eljárásban továbhi adalékok alkalmazhatók az sikáltiwotí .ô«2lm#;.:§iabili2àîâsâiâ, példM giipena, szorbb, lyi-dltioireit (DTT) vagy durusii-szultVixid (DMSOV AMAD(Ep-l: köíáktor konceniráclója a vtzes fázisra vonatkoztatva 0,081-10 ttiM, különösen 0,01-1 ntM A bőntérséklel: -· az alkabitaZött enzimek speciális sajátosságaitól ligáén - Í0-70A2, előnyösen 28-35 C iehei, A fedakálafidó székodktnszártítazélok Sitóiában nelezén oldidnak vízben. A szobszhá? ezért a reakció során teljese« vagy nem tejesen oid^baÿk^itlçli^iriy'lb^i.^^Mbâaarâx nem teljesén oldódott léi a reakciókevefek-ben, egy része szilárd formában van jelen, és ezáltal egy harmadik fázis képződhet, A feakeiőkeyéfek a, kényem Zimsofáo áfemneftíeg: emulziói: képezhek

Az (I) általános képietö széköpiönszáí tnazéknt az e||árásbán a teljés térfogatra vonatkoztatott; lO^SOÖ gfe előnyösen 25-308 g/1, különösén előnyösen 5Ö-2ÖÖ g/1 tpeimyíségben aikalmazbayuk a reákélőtéteíhejí, A találmány előnyös nmgvaíösiíásl módjait továbbá az jellemzi bógv spkmiionsgártnazékkéní f l-ebl-d--metoxi'Si14-szefeO';pna-!,3,5(lÖX90Ílbietfeén-14,i7'dlpnt jettjszekodinn - till) képleij vagy iáAUédfej--metom-8,;l4-szeko^gona-1,3,5( 10)59{f l}-tetraén-14,17~díöot jnieítisfeködfen “ (11) képiéij alkalmazunk.

Az eljárást például üveg vagy :fêm nmketéedéïtybên végétpfiÉ,. vezélpk a reakckkxlénybe, és például nitrogén- vagy levegöatmoszféra alatt keverjük. Az alkalmazott szekodionvegyüíet-tőí és omtiofedukfáztól ílggőes a toakeíőidő 1 óra ~ 7 nap* különösön 2-48 óra. Hz alatt az idő alatt a szekodion-vegynlet legalább 50%-a a megfelelő bidt^i®fe^diion-v#i^ötett04*ib|ÄM^ A találmányt a továbbiakban a példák alapján részíeieseblxtn ismertetjük, í. példa (aem a találmány szerinti)

CbtidöyedaktäAli^nozdsa^Æftlmtfïëxm iiuMíiimsIiiBMM&amp;Má AXMmsflëxm mradacus DSM 435 setéket a köveikező közegben (pH 8,2) tenyésztjük díE’C-on, bak* iérium ínkubáterbam feny mellett: 0,1 % élesAiklvonal, Otí % gíidi-gilcin, 0,01 % hladiPÜ« x 2 112€> 0,81 %

MgSO., X ? \12<Κ 0,01 % K.NO;,, 0,0 S % NaNO;. 0,0 Í % NaCi. 0,005 % CaCij x 2 1¾ 5 nil 0,01 % Fe()ll)e tirât· iddsis Í ml trypnißtetn-oidat SL-6 1500 pl/l 2,2¾ gd MnSOit * HjO, « 1·

HjO, 500 mg Η5Β05( 2S mg)l ÇÙSO4 x 5 11>0 25 mgd Ha«MoO< x 2 H_>0, 4H tes ! 2. napján a sejteket eentrríkgáiéssai elválasztjuk a tenyésztökö/vgtöl és. -SíDC-cm tároljuk, B) A szelektív óxKÍörétÍpÍitá«i kótlolo gének ainpSlíllíáíásü A genom! DhiS-t Satobroofc „Molecular cloning·* etmi münkájáhaft ismertetett eprtissai exirahálíuk. A kapott nukletüSíMkszolgáltak mâtïi-xkM. :|^^|ei6ho« (PCR), ax PßBi atlas> bázisban 76258197 számon'közzétettgénszekveneiából szártnázíaíöítspeétfikps printerekkel. Λ pr jmerefesl ép 'következő klónozáshoz exprcsszlök vektorban bizfesttíiíittfc az ÓMerthmáiíSsöm. bide i és Hírűi Ifk ipívn |ph| etKlonnkleázok számára restrikciós helyekkel (8EQ ID NO: 11, SfQilOéNö; lg, SEQ ID NO: Π).

Az amplifikálást PCR-putTerbett [10 tuM 7'rls-MO!r (pH 8,0|; Sö mM MSI; 10 mM: MgSÖ*; I rnM dbítP Mix; minden cselben 20 pmol primer és 2,5 E Platinunt Fik ONS"|telÍníeráz (lnvítrtsaen):]; SOO ng genomi DNS·· -se! és a kővetkező hömérsékietdkhtsokkal végeztük:

Λ köpött, mintegy 750 bp méret« PCR-termékét a tisztítás után 1%-ós agarózgéien N<k ( és Hind ///» Illetve SphSés MindM endonukkázokkul entesztettilk, és m azonos eiKlcoukteázokkul kezeit pET2Ía vekter-INttvagen) illetve :{3{|É7Ö vektorgerincbe íQtagen) iígáitttk. 2 pl ligáeiós tétel &amp; mii Top 1Ö F sejtbe (invttto-gett) transzfbnnáíásaüián: az smpfcílím· {Illetve kánattptem) rezisztens kolóniák plazmid-öNS-ett az Nde / és MndJH, illetve Sfth i és Mind /// cndonukleázokkai végzett ^$0 bp nagyság gft inszert jelenlétére. A éjragrnetisre pozitív piáí^lBk^ziiteésyók^.'Éte^éttjémátlÉ^i^kr^etiSk alá, majd végül -Escherißhitt mitMídí Star (Itrvltrogeü). illetve fi coli RÖ7M' 1?itó§).í&amp;§!tekfcc. transztót·· máitok. 2< példa (nem a talál sstásiy szerinti)

Rekombináns ehterotlexns-nxkkirethiktáz exnresszálása E.aiHbmí

Az expressZíós körisírtikcíóvaf transzformált B1..21 Star (Jovitrogetg .Kail^jliáí^NólöétiófSíit), illetve RB791 (E.coií getretlc: stöck, Yale, USA) Escherichia mH törzseket 20ö ipí EB-közégben (1% triptetp Ö,5% "élessáSkivoaat, 1% N:aOÍ): ampieiHínne! (50 pg/ml), illetve karbe«icillittaáit(I^.i|SÍ{fiSÍ) :tetty#üBÖÍE .ölig 510 mntett mért:ö,S optikai aürtlséget értünk el. A rekombináns fehérje exptessgtijdt ÍZbp:tti|SÍIttepÍaktozid (IPTö) 0,1 i«M korseentradébaii történő ImKZásdáíávptjttdukáímk. 8, illetve 16 óra, 25*X>os hőmérsékleten és 220 rpm mellett történő- ittâôMiÔfiiëiVélSén á sejteket begyűjtöttük és -20°€~on iefagyasztötttik. Az ákíivitesteszitíez ÍÖ mg -sejtet 500 pl ítíÖ-piM TEA pitffén-eí tpH 7,0) és 500 μί üveggyönggyel összekevertük és Í0 percig golyói •mdoonmtl emésztettük. Λ megfélelö mérésekhez a lizátumot hígítva alkalmaztuk. Az akíivitásteszt menete a következő volt; 960 pl lÖO:tPM TEA puffer ípH 7.0), 160 pg NADII, i0 pl Ittgííptt::se)tlíz|{tiip<: A reakciót í00 μ!; t00nsM'öS inditotbik be.

Nagy nterntyiségOetótt kinyeréséhez dö g:sejtet 150 ml triétánölámin puflmBe*} (lűömkik píí'7,2mlVÍ Mg€|?, id 1i glicerin! m^zpgn^SűíÉ: és magas nyomású böspögenixátormi emésztettük, Az enzmtokiatet végűi ! 50 mi glicerinnel összekevertük és-2Ö^C tároltuk. 3, példa

Az ornnntzmnsak tenyésztése és szkfínelés etiiszekoditm i ti Il i kénieli lanlpitfév léalaMtás&amp;ra A szkef ne léshez Miéin farmmá·. Candida grapmgí&amp;ssm MÜ'QI* illMfeMi* Candida vdminij CBS 731:8:, idchiafarmma E>SM 33ki% Saeaharmiyce.'i cewhlae CBS 1508 és Candida magnóliád CBS 0300 éÎesïtétûrtïSekei tettyesztettuKk a kővetkező : közögfeett: élesztöki vonat (5), pépton ($)-4¾ glökéz (20j ja záZöjéh beit lévő szántókhoz tartózó mértékegység mittden esetben g/l}j< A: közegét 12 PC -orr síeríieztŰkcés az élesztő" két tóvábhi pH-SZáfeitlyözás nélkül, 25®C:^ötvráé^öedétyvben 140: férdtslat per perc mellett tenyésztettük, À (Ili} képiétű ettiszekodíun reéjiűívdiaÍűktiiásái a megft;Íe!$ hídroxtszekosKtéröJtkvegyŰlelté: a köv^t?·: kezű teljes sejt blötranszformáetös tételekben iesztehflk:: 46Ô tag ÍTíssen begyujtűtt sejtet 30 mg giÜközzaL 3(1 mg (IÏ11 képlett) etilsZekodionnai és 9t)0j.if 3 00 :®P trietasmktrran pufíérre! (TEA) tpí-i 7,0) egy tételben 24 órán keresztül, 28'Ό·οη és 1400 rpm melléd rázáttvittk. Végül a tételeket ! nrldikfömietáítnál extraháltak, eetttrifit-gálluk, nitrogénnel szántottuk és aeeisniittáiben félveitök a BELC-elemzéshez. A szkrírtmg eredményeit az 1,tábtlzai foglalja össze I» táblázat

Azeólszekodkmlegnagyobb : mérvű kötpíetzkípi a CBS 6396 törzs mtitttttä, ezért knoáulásí szervezet" ként- váiasztoííufcki: eI3Ni“könyvtát"el0áilííásábo:Zi 4, példa A) ePNS-Mttyvtár izolálása psszes és talÍbiS} és előállítása 000 ing: Bass sejtet 2,5 mí jéghideg BBdlS'ptrííerbén reszuszpendáhank, A. SéjfsZiíszjtenziöhoz 5 ml jtámtegy 20 g} salétfűdtsavljan wü és .3 pl fenolM: (pll ?,ö) ekvliibrált üveggyöngyöt ádmnk. JÂ teljés tétéit ézntán váltakozva 30 : másodpercig yortesszek 30 másodpérctg jégen hűtéssel kezeltük, Összesen iö percig, Vegöl liozzáadűihk S ml jéghideg IkEl^pniprí: és még egyszer erőteljesen összekevertük vortepzel. Bét a sejtszoszpenziűt 3 percig 1 iöOO g-vel esníi'ihsgáhok 4!,Ckm. A vizes fázist eliávoifíettuk és azonos térfogatú íenokkiOröBtrmt izuamllaiköboi p4:24::t) keverékkel kétszer extraháltak, Végül kioroibrrnös e.xírahálás követkézéit:. Az utolsó exímketót kővetően a teljés BNB-t: l/lö térfegatú, S !ví IdClj hozzáadásával -20':,C-oií 4 érán keresztül kicsaptuk. 3 mg így kinyert összes-KNS-t használtunk a:·?. míiNS molekuIák dóshasára 0ligo-dT cellulózon ÍNEB Biolabs): A végső kicsapás «tán 5 ,ug mRNS-t használitnik a eDSS-SKtaítóshex (pRksescnpt ÍIXR eDNA ybrary Corístoettöo kítv Stratágene). A gyártó utasításai szerint előállított könyvtárat XL-30 «Md £eoft%t transziormáímk, és ADíLáitiviiásra szkrineltük, A N A DPH, illetve N ADM mint köíaktorós dilszekodioa [(Hí) ké|>let| mint szubszlrát abszörbancia-csökkenéss aiapjámazolmsiioitunk és izoláltunk egy Äni tek?34}. A kíóts-bóí izolált plszmití T? Ós 1'3 príménél töflénő szekvenálása 789 bp hosszóságú ORF i epBimésyezeti, A Bag-mens 2Ő2 ammosav nagyságú, a O-galaktozidáz a-iragmensébdl és egy lehetséges geoázbdi álló fúziós fehérjét kódbit, R) €imáMá magnetieé CBS 0390-bdf származó rhvkliáneó AlMl-i kódoló, teljes hosszúságú fraos^knjá s»iötézise FCR-raf A fe|es bosszúsan traitszkripi éZt köveid klónozásához a megfeleld expressziósrendszerben specifikus prímért állóotomk elő. Az 5'-primőrt Nae / illetve Sph / által felismert felismerd szekvenciával és a 3'-pránert Ahol Ölelve Sm7 által fölismeri felismerd szekvenciával módosítottuk (SEQ ID NO: 14, $EQ 3D NO: 35, SEQ ]D NO:Í6, HFQ iD NOí !?), A CaiuMu magmliae. expessziós könyvtár klónjáhói (eM4) izolált pla^ff-DNS szolgált a pdimeniiz íáncteskeid mátrixaként, Az amplífikalást RCR-prflérben [ÍÖ mM Yrís-MCÍ, fpll 8,0); 50 snM KG, 10 mM MgSQg 1 mM dNTP Mix; minden esetben 20 pmol primer és 2,5 E Fiatínum Elk ©NS--poiimerax (invlfrogen}], 50 ág mátdixszal és a követkeÁiltómérsékleíeiklusokkaí vógeztok:

A kapott PCR-termékei a ο'νοίηΑ után Pv-os agarózgéíen Máé l ésXho i, illetve φή / és fixel endonuklcázokkal emésztettük, és az azonos eodonukleázokkal kezelt pKT2 ia vektor- (Novagen) ilíefve pC|Mi7Ö yekiorgerinebe ligáitok, 2 pl ügáoiós léte! E <:«//Top i0 ©sejtbe (Invitrogen) transzformálása után m ampíéiilín" (síiéivé kanamioln-} rezisztens kolóniák piazmid-DNS-eít az Alá? / és M&amp;í illetve φύ / ésfiml entíonókleázókkaí végzett restrikdds analízissel teszteltük egy 750 bp nagyságó lőszert jelenlétére, A pET21~ -MgliV és pQME?ó~Mgf\í: expresszios konstrukciókat szekvenáítuk, A OsmMt mngmimekM származó, rö~ vailátteó oxidnretloktazt kódold génnek Összesen 729 bp méretű nyitott leolvasási kerete (a ΒΕφΙΜ NO: 8 szerinti szekvenoia tartalrntizzá) volt, amely megtelel egy 243 amnittosav hosszúságéi léhétpnekpECt 1D NO:3). 5, példa

Kompetens Esehemkí® mii StarBti2i(BeV) sejteket Cinvitix>gen). Iliéivé RB79I sejteket ifi,mii genetic stock, Ybléi ©FA) transzformáltunk az oxidóretktktází kódoló pl:.T21 MglV. illetve pQME70-MglV expresszi·· Őstkonstrukeiökkai; Az expresszios konsiptkelökkal irmtszformált fschertchm ít&amp;li telepeket 200 tnlLB-közég-iben:p:%dripíon, 0,53¾ élesztők!vorcsp 1% NaC!) rendre 50 pg/mí anspidilinnel illetve 40 ng/mí kanatnlctnnel íenyésAtBlük, míg 550 mn-nél méit 0,5 optikai: sűrűséget értünkéi, A rekomfeinóns iebétje expressziójátIzopro-píitiögaíaktfízid (1PTO) 0,1 niM koncenbtteiôbsn Sönénö hozMadásávai indttkálitik, tó órás, 25ç,C-àïs hőméi- s<àkliitën tS 220 φϊη infölieíl lOriénô .»»{«kdlÉÉtMtM a sejteket begyűjtöttük és -3ÖöC-ös fefegyaszlöttpfe,Az iaktiviíásteszite; 10 mg sejtes 500 pl 100 mM TEA pitffend (pl I 7,0),1 raM Mg^|?^1.4r5lÉ&amp; gyei ÎjssxekeyetiîHsk es 10 percig golyód nrniotmtmj .ffftesztettünk. A megfelelő #è^kfees5î«:If?Â8M«rtM|ftvâ alkíilína^ük, 060 pl löt) mM TEA puffer (pH 7.0}, 1 mlví MgCl>, 160 μ g NADPH, 10 pl hígított sejtiizátum. A reak-dótfiÖ pl, TOÍéids metanolban lévő f öOmMbos sznbszírátoídat a-afcctókeverékhe» adásával iruiitottuk be. dagy inennymégn enzim kfnyvi'éséhéx 30 g séjfeí 150 ml trfetawdamin pufferen ( 100 i»M, pH 'K 2 ι»Μ ATgíTH, 10 5^ gljeerirt) reszus^endáltunk és magas nyomási.) lK»n«gen«?âtofral emésaetttmk. Az enzimöldatöt végíll 150 ttO: glleerltittël Összekevertük és -20lVC tároUuji, 0, példa á Odáhnány szerinti)

Etilsze&amp;ndmn Kill) képletl redukálása Sf'.O Ift NO: 1 szerinti {mdortdükfáziisai

Az et'fcefeödíóa:|pií|Mpl^i|-redukálásához 800 pl puffer (íOö mM köllüsntl^lllsi:-“'"fy:l MM íMgCUT 1,2 «§ 2~prop<»mí, ÖiÖ8 mg $íAD, 100 mg etiUaeekwfbo f(lH) képlet} ésí M) SEQ ll> Női! áttenni oxkíoreduMú/. (lásd 3, példa) enzánszuszpenzió keverékét í-eakcióedéityben 24 Órán keresztül, szobahőmérsékleten. állandó kikeverés mellett InkuMlítik, 96 óra elteltével az alkalmazott mint oo-'-iva redukálódotí. A reakció befejezess után a reákeiókevefekst díkíőrmetanos taltáuzó szerves fázna eivÉaszíódnk, és a Π-héta-lddrödvegxületet (etílszefcöl) az ofdöszer pátölögtatásé-vai/desztíllálásával kinyertük.

Az etdszekodíon etiíszekoílá alakulását HFLC-vsi követtük. Szzípatáláöszkspkéut ECt25(f · Httefeotlőr Ί00-5 C18ec (Machery-fdapk ßüren, îüéOtetsrszâg} oszlopot alkalmaztunk, iutíaiófelyadekként acetonitriHei és vízzel Az analízishez áz:ae«tönibái 30-7íl5lí'ós gradiensét vettük fel a fettatöEílyadékOaíí, Ά reákeiőíörmékek azonosítását ttífem\c$aaRyágpkfeÍ^]b;:íte»hi«^ö»lÉtedívége2iök, 7, példa (sem a találmány szerinti)

Az etilszekMiou ((IIÍ| képlet} redukálásához. 800: pl puffer (100 tnM trfeianölmnm. pi-i ~ ®j. 2 mM MgC!>), 250 pl 4-metii-2'penfeftol, 0,02 mg N’AD, 35 mg etilsxekodion [(111) képlet}: :és 25 μΙ:8Εί| 10 510-:2 szerimi osidnreduktaz (lásd 3. példa) enzímxzuszpeozió keverékét reaketdedduyben 9&amp; érán kefeszíd, ázöbSP hőmérsékleten, állandó átkevérés mellett snktibáiíisk. 9b óra elteltével az. alkalmazóit etiiszekodkm [(Hl) képlet) több mint 30%-a redukálódott. A reakció befejezése után a reakcióké verőket díkiórmetános e xtí'áke ióval fe idő Igoztn k, a terméke! tartalmazó szerves fázist elválasztottuk, és a 1?T>éWHÉmi-vegyüÉetet' :(<áils3tekói>?»z oldószer párol ogtaiúsá-y ai/deszt i Oá Hsával kinyertük. 8, példa

Az etll-aekod km fplJ) iiképiöti: treíltikalásábox 100 pl puffer (100 mM metanoiamin, pH “ 7, 2 níM MgCfó, döö ISung etilszekodio?) [(Ifi) képlet) és: 100: pl SEQ ft) Nö:3 szerinti öMdoreddktáizifásd 3, példa) efizlmsznszpenzió keverékét reakejóedényben 72 órán kemsztuk szeba·' hőmérsékleten, állandó áíkeverés mdiett inknbálOík. 72 óra elteltével az alkalmazott etiiszekodion j(ili) képlet] több mint 05%-a redukáiódc<tt. 9, példa (ftem a ta tó ián y smérínti) EülszekMloiLiíllllMplm^

Ax «uiszekodion í(üli képiéi] redukálásához 200 pi pufféi Π00 inM irietaiKdamín, pH ~ 9, 2 mM MgCy > 3ÖÓ pl 2-hepíadol, Ö,Ö2§ mg MADE* í00 mg eiilsáskodion ί(ΠΙ) képiéi] és 50 μί SFQ SD NO:4 szerinti pMdoreduktáz (lásd 3, példa) e«x!msKUS2peptló keverékéi: reafceióedényben 72 ónki kétestől, saobahönrérsék-íétén, állandó áíkeverés inellatt mknbáltuk. W óra elteltével as aikaispazod eiííaxekodkm k^iet] ipfnt 80%~a redukálódott. 10. példa (»ei« a taíáímany szerint i)

Etilsatkodfcn U llli kéiítetl redakálésa SEÖ UtimCfcf .

Az etikxekodion [(111) képiéi] redukálásához 300 pl puffi* (IÔÔ mMirieiäfiüiäiibn, pH == ?. 2 mM MgOj). 1,2 mi AmetSká-penísnol Ö,!2mg NADP, I5Ö mg etiisxekodioo [{Jiii képlet] és Öj ml SEQ ID NO:5 mfiMi öMdörödnktáz (lásd 3; páldá) énaímsaiisxpenxld kévére két reakeióedényben 72 órán keresxtök sznóa-hömérsékletéik állandó 12 óta «ítéltével az aíiksímazöít etdszekodmn 1(111} képlet] több minf. 90%-a redukálódott.

SZEKVENCIÁI,ISiPA <··-o> 1 kp c-abn <'|:2ÖA :Sliiá:eá;;s saekoclo:mseáníuizékok nanties selektiv, mszi nub: :s kuss rooukái.á-s ár a <"i3o> 1 %mim mm> kp 1 :ii::73ö32,8 <.1 4 1 > 2007--12-37 <!60> 42

<170> Pat.c; fi I r; versi on 3.3 <3:l#s I <21 !.> 232 <2127 PRT <21.3 > Chlor of leatis aéra;: iacsuss <4G0> .1 «et (Sta gm Pm gm lie Glÿ X:ÿS Val Ala Assu Val Tfcr G ly Ala Ala 1 5 10 15

Ala Gly Tl« 81 y Arg Ala Ser Ha Aeu Ala Ph» Aia Arg Glu Gl y AS« 20 25 30

Ay» Val Val Val Ala Aap Val As« Val Glu öly Oly G Hi Glu fhs? 11»

3 S 40 4 S

Ms Ae« Cys Arg M» Aeu Aim l‘hr Asp kl» Misst Ph» Val Arg Çy» Asp

S0 SS iSO

Val Ser Gin Arg ksp 81« Val 81a Arg La« lia Al a Aeu Alá Val Asp 6 S 70 7S 80 ïhr î*he 81y Ár8 XX» ÁSp 3?hn Ala Sis As« Asn Alá Gly lia 81« Gly 85 m m

Val Gin Als Kar. lau Al* Asp ly*' Pm Sla Sla Val ÿrp Asp Arg Val

1.00 1Ö5 HO lie Glu lie Ass lea Ays SI y Val frp heu Cys Met Ayss Tyr 81« lie lis X28 325

Arg Ills 34er AS« Ays Sin Sly Sly* Sly Ala lie Val Assn Thr Ser Ser 130 135 140 Vái Ala Sly Aew Ala Sly SSr Arg Oly Val 8er Ala Syr Vei &amp;1« Ser

145 ISO 155 ISO

Ay* Ais G.ly lie val Gly iXa yhr Lys Ala Ala Ala Ae« Gi« tyr Ala

155 170 17S

Arg Aso Gly île Arg Val As» Ai a lia Oys Vre Gly vfer 11s Hl« Thr 180 185 1.90

Ale Met lie Asp Arg Vha fhr Sin Siy Aap Pro 81« Ae« .fce« Aie Sin 195 200 205

Sh« Ala 81« Gly 81« Pro XIa Sly Arg Ae« Gly Ser Pro 81« Gl« vei 210 215 220

Ala km Ala v»l xla Grp i>«« Oys Ssr Aep x,ys Ala ser ne« vei Th« 225 2.30 235 240

Gly Ala Ihr Ass Ala Val Asp Sly Gly Arg ft»w Ala 245 250

<•2X0 5· 2 <"211 > 24 9 <212> PRT •' 2 i ix·· kià.-robacter: xyläxiophilus <4Ö0v 2: jtëfrfe %m- 81« Olÿ 'fcys Val Alá Val Ils Thr Oly Ala 8iy tout. Oly II«

X. ' 5 Hi IS

Oly Arp Ala Thr Mt LSh Lys Ofca Ala A*g 81« Sly Ala Arg Val. VaX 20 2S 30

Ala Ala Glu h«<i Asp <31« Arg Öljf ßly Ci« Cly Val Val Arg Öl« VAX 35 10 45

Ar« Sasi t.a« O.l.y Oly Glu ÄXa Val Oha Val Arg Thr Äap Val S«r Glu Sí! SS SO

Vb« Ala Sin Val Glu A«p Al« Val Sin Arg Ala VaX Sly ein Tyr ßly 65 ?0 75 8Ö ihr La« Asp Val Mat: Pb« Aars Asn Alá Oly lia Oly Kis $yr Ala Or ο

OS 00 SS X<®u Xa« Öl« Kla Olv Vs‘ó 81« Kis *%£ Asp Arg Val Val Arg Val As» ICO XOS 110

Gin Vyr Sly VaX X’yr yyr 8Xy Ile hau Ala Ala Sly Arg l.ya Mat Val XÎ8 120 125

Ai» As« Lys Äs« Pro 81 y hau Xis Xis As« Tbr Als Ssr Val 'iy*· Ala 130 ......... 13.5 140

Oh« hau Als Ss.r Sly VM. Ha Oly Ζχχ Ki* Ala Ala Lys 81 y Ala

143 ISO 1SS ISO

Val Lys 54sI. >S«i:. Tbx 81« Ala Ala Ala ;L®0 Glu L«u Ala Pro His 8Xy 105 i?0 175 lia Ä*g Val Val Ala XI» Ala »*« Sly sly Val Asp m* :pxa II*. XI« 180 155 150 01« Oly “yx hya Asp «al Oly Ls» Oly Gis Aag Lau Ala Arg Oly Ola

135 ’ 200 20S

Mst Arg Arg Arg hug Sin l’h.r: Pro ßiu Olo Ha Ala OX y Ala Val Ala: 210 215 220

Lsw Ls» Ala Thr A«p ß.i » Ala mp Ala Xis Asn Oly Ssr VaX Val Mat 22S 230 23δ 240 ?hx Asg mp Sly ÿyi· Ala 81« Visa Ays 245

<2!.0> I <213.> 243 <212> PRT <213> Candida magLöiiao <40{)> 3 Sőt. Sör Ala The She Ah«. Ais £:«u its the Sly Ala See Arg Sly Hat 1 5 10 15

Sly 81« Ala the Al» île Lys tea Ala Leu Öl« öly Tyr S«* Val; the 20 m 30 &amp;h» Ala Sar Arg Sly lia Sit Sin tan Ash Ala 1.1« Aye 81m Ay« {»a 35 4:0 45 teo 11« Vai tys ly« Sly sift Sin His tyr v«3 try isin taw Asp t«« 50 55 60

She Asp lie 81h Al* Al« Öhr the PAa LÿS öly Al» Psr« t»y Píré Ala 55 70 75 00

She She Tyr Ahp Vai Ph« Aha S«r A«r> Ala Sly V«i Val Ahp Oh« Alá 85 SO 95 hr» ph« Ala A«p 61» She 81« the Ala Sin LÿS ASp î..«x» Ph« the Vsl 100 1ÖS 110

Aar. Lau Lau Ser Pro VSÎ Ala tea the Lys the lia VaI Ly« Ala 11« 115 120 125

Ala Asp Ly« Pro Ars Ql» the £*©· Ala Sis il« ilh Ph« $hr S«r 0«r 130 1.35 140 11« Val Sly 11« Arg Sly Vsl Pro Ash Val Ala Val î'yr She Ala The

145 ISO 355 ISO tys Sly Ala 11« Asp She Ph« Al« Arg S«r A«« Al« Arg 81« Ph« Sly 165 170 ' 175

Pea Ays As» 13.« Sis V&amp;i As« Cya Val Asn Pro Sly The the Arg the 100 Í8S 130

Siu !4«t The Ays Sly Val Aap Lax» Ala Ala the Sly Asp Val Pro 13« 195 ' 200 205

Sy* Sly Trp II« Slu Val Asp Ala II« Ala Asp Ala Vai tau Ph« Leu 2.10 235 ' 220 31« Lye Ssr Lys Asa lie Thr Sly Slh S«e Lee Val Val Asp Ah« Sly MS 2.3 C 235 240

Ph« Sly Val

<210> 4 ¢211¾ 241 < 212 > PRY ¢213¾ Candida magnot iae ¢400¾ 4 «at Ser Hton :»*β :«»ά *4* Ls» Xté ïhx Oly «ly s«r Axg Sly Μ* 1 5 to ......15 81y Ai» S»x Ai» Ai» il» Lys S«ft Ai» 6.1» SX« SX y yyx s».» Val ihr ÄÖ Μ 30 L»u Ai» 8«x Axg A«p 3*8» Si« Lya Leu ihr Si» v»l Lys Asp Lys L«u 35 40 4£.

Os?» lis Val ÄSf <3iy <31 y «In Lys Oie Tyr Val Txp si.« S»» Asp Ls« 50 55 sc

Al » Asp «si Sla Al a Al» Sex Ser ®&amp;s lys Als Ai» Px® LS» Px® Ala 65 50 75 80

Ses·· Sex 'i'yx A»p La» Oh» Val Set As« Ai» Oly si« M» Sift PAS Sur

85 90 SS

Px® ïte Alá Si» Sis ySx Ass '$«*? Sïw fsép Le» Ass lis Mai ihr SI* 100 105 U0

Ass. La» Val Sex wm il« Al» Leu Ihr lys Ai a L«« LS» gift Ai» Val Ü5 120 125

Sex Oly Arg Sex Sex ΟΧ» Ash PAO Phé Si» lia Val Pbe île Ses Ses 130 I3S 140

Val Al» AI» Lau Arg Oly Val Ala (*ls 'ihr AI» Val 'l’yx sex Ala Sex 145 ISO 155 160

Lya Al» Oly Ihr Asp Gly Phe Ai» Argr 3«x La» Ai» Axg Sla La» slïy iis ivó i m

pm OIn Sly mi Hia Val Aa» y»i Val Asn »re Oly P»w Vkr Lys m» ISO 155 ISO

Asp Met rhx öl« Oly Val 01» ïhr Pro lys A»p Hafc Px® II» Lys Slÿ 195 200 205 ÏÜrp Iis öin Prö Öl» Ala il» Alá Asp Ala Val Val Pfte Là» Ala. Arg 210 215 228

Par Lys Aa» 11« ï'ftr Öly AXa Ae» XI« Val Val Aap Aaa Oly PA» S«r 225 230 235 246

Shr

<2.:0> 5 <211> 241 4212> PÉT

<213> Candida n-agnol ian <400x S MSfc rhr Thx TVir Ser Ann Ala Leu Val Ihr. G ly Sly Aex Arp SI y 11« '4 S #' "" 15 ôly Al» Ma Sex Al» lie Lys Leu Ala Sla Slu öly lyx As» Vai ï‘hx 20 25 SÖ

Leu Ala «ex Sx§ Ser Val Asp Lys Leu &amp;»» iïu Vsl ip Ale Ly« Leu 35 40 «

Vxo lie V«i sin Aap Sly Sin ly« Hl« ly« 2.1« V«p ßlu Leu Äap Lea 50 ' SS 60

Ala Asp Val öl« Als Ala Sex Sex Ph« Lys Oly Ala Sa« Leu Vre Ala 65 70 ?S 80

As'V Ser l’yx lap Val OL« Val Sex Asti Ais «ly Val Ma Ala OH« Sei 65 90 55

Vxo 2%x AI» Asp Hie Asp Asp Ly» Slu ïrp 61« As« l.e« lew Ai« Vel 100' .......105 '110:

Ass« Le« Sex Sex Pro 11« Ala Le« 2hx Lys Ala Leu Leu Lys Asp Val 115 120 J25

Her <51« Axp Axo Val Asp Ly» oxe Lau 01« Ile .tie Vyx lie Sex Sex ISO 135 140

Vai Ala öly Leu Kl® öly Al» Ala öln Val Ala Val Py« Sex Ale Sex 145 150 155 160

Lys Ala Sly Leu Asp Öly Aha He« Axg Ser Val Ala Arg Glu Val öly 165 170 176

Pxö Lys «ly Ile Als Vai Asn Sex Tie As« Pxo öly Tyx l'hx Lys 33ir 160 ISS 190 «lu Mac 1'Ar Alá öly Ile Öl«: Ala Le« ?xo Asp Leu Pxe Ile Lys öly 155 ÄC0 205 •yrp Li« Pia Vre öl« Ala Ile Ala Asp Ala Val Leu Phe Leu Ala Lys 210 216 220

Sa« Lys Aaw Tie PL« Sly ïhx Aars lie Val Val Asp Asn öly Le« Ói 225 230 235 240

Ala <2).0> 6 < 211> 7 29 <2 i.2> DN17 <213> Ch.loroflöAUö aururü: kacus <40(ï> &amp;

*eggäg<S><Sa>» cfcttöattgg »tQgSgawög gggeaggagg eggtat£-gg&amp; SO

egtgeetoag aeetggegOt fegggégfcgag ggfeg««aag9 tfcgfcggfetgg fcgatgigaat läO gfcegsgggeg gggaágagM ga££g<sgetig fcgfcegggefcfc fcgaataeega tgeaatget« ίδΟ gfcgögfctgfcg afcgti:-t;«gf.5ä aegagatgaa gtggagcgafe taattgefcct ggeagttgac 240 ac^tefeeigga« §g&amp;fcߧS*iit fegageaeísa« asagacggga ttgaaggcgt geaggaaatg 300 ctggeggat t ateeagaaos agggfcg&amp;Oeg gga&amp;ß»agefe «asaggggte .3 so >ggtfegfcgt» fcg&amp;agas<«gii. »afcecgge«« afegcteaage »gggtgacgg tgegatfcgtg 420 a&amp;fc»«gfc«sfe eggtegeegg fcafcggeegg» fcaaegfcgggg fctfccggegta fcgtagegagc 420 aageátóggfcá ttgtfcggtat fcseoaaagog göageegttg agfcgtgegcg fcaaoggtafct MÖ

«^gtciáöfí «aatgfegtee sggtacgaet eafcsefcgega tgategaeeg attg*««e*g SM ggtgafeoöce aaetgettgc çe&amp;gtàggcfe gagggtgaae «sg&amp;etggteg gefeaggefcgg ÓSÖ gßtgasg»gg tűgöűaáfcgo ggtgafeöfcgg etctggfceag ataaggefcfcc gttfcgfcgaeiS ?2Ű ggagegasa© Èggsggttga. fcggtgggegá efcggegfeaa 7f$ <2i0:> ? <21J> 7 50 <21 2> DI15 <213¾ Rubírobact er xyioiíophJ lus <4 03:¾ 3

atgeeegagg ggaaggtcgc ygtcatcacg ggggecggaa geggcat&amp;gg cegggccacc SO g«gföt«aagt eegeeeggga ÓSgogöéegg gfeegfeeggeg oegaggtciga cgagögegge *20 304ϊ84&amp;Μ9$ tggfcccggga cjgtgcgcagc ctegggggeg aggcggtate ôgfeggggaçç 180 gaogtefcegg agtfccgegea ggfcggaggac gccgfccgaga gggcggtcgg ggagtsegge 240 agoet-sgacg tgatgtteaa ca&amp;eg«eggé afcegggö&amp;et segeeegget; gatggage&amp;c 300

gagcccgagc actàcgàeeg çgtggfcccgg gfcga*e«sgt aeggegtefc« efcaegggata SSO

Cfeegecgee.g ggagasagab ggt.egccctg aagsaceccg gcfccgatcat caaeaccgcc 420 teggteeaeg «ofctaeOeg« «teggegggg gfcçàteggefe *«eacg«ege caagggggcg 480 gt.eaagat.ga tgaggeagge ggcggeggeg gagctegecsc egosaggeat aagggtagto 540 gee«teg<se© «gggegggg«. ggacscccec afcc&amp;tccagg gctsea&amp;gga eafcggggatc 600 ggegagagge fcggaeegogg ceagstgog© cgccggctcc agsecoccga gesgategee 660 QOggeggfcag éfcetgctégc eacàgæegag gcscgacgcaa taaacggctc ggfcggfecatg 720 accgacgacg getaegagga getcaagtag 7S0

<210> 8 <21 L> 722 <2127- ORO <21 J> Coned! da magno! 1 «e <4 007- 0 afcgtcfcgcfca cttegaaogcs tetfc&amp;fcc&amp;ct ggtgcc&amp;goci gcggaatggg ögagjgäcäöä &amp;ö gäfcatfcaage t£geest ttja ggggtac&amp;ga gfcc.acecttg eatcacgcgg taSfcg&amp;gesg 130 «t«»S*gise» tö&amp;agg«»»» act»e«sa«fcg gtgsagaagg gg«!3s.g<:»g«!a etaegttt.gg 180 «»gcfcegafcis Sfcagtgae&amp;t eg»gg«gg«;t. fcecsteette» »gyggg«toc tcfcg«cfcg«c 240: agcagefcasg acgtgts totst cagceacgec sg6g6ggtgg »«sttfegctcc gfct.egc»gac 300 saaagegsgs ctgogcaaaa ggacsstgfctse acggtfcaac.« tgctgfctgsc fcgtsfcgcgtfcg 300 »«-.(.'.»agace.» ttgttaagge. c&amp;tcgcagae »^««isgcg agacgcctsgc is« a «at tats« 420 t;to»««tcgt. «eattgfcegg: aattcgaggts gtttwaacg tggeggteta cagcgoca«« 480 aagggsgöga fctga«ag«tt tgeg«getcg sfcfcgeitegtg agtteggis«?«: «aaga&amp;catse S40 cacgfcfeaacfe gegfegsaege ggggaggggg egis*«egaga tgaeaaaggg «gt.fcgatcte δ00 gcggefefcteg gegatgtsfcea tateaagggc: fcggatcgagg togatgegat, tg«cgacg«0 680 gfcgctgfcttst fcgatcaap;© eaagaáöátc actggccagts cgetsegfcfegfc tgaeaacgga 720 t-tseggisgtist aa 732

<2.1 0> 9 <211> 726 <2.1 2> DNS <213s Candida ihAunotlan: < 4 0 0 s- 9 atgacatscta c&amp;gefc&amp;afcgt? «st&amp;afceacg ggaggcag«« gcggc&amp;ttgg cgcfctsccgcc 63 gggatgggge fcgggfeg»agia agggtacagg gtgaogctgg «gteoegega esfctgagaaa 120 «tstactgagg fcc»agg«caa gctgccaatc gtgag-aggtg gaaagaaaea «taegtttgg 180 saggfeggs-tg fefcggggafegg gg&amp;gggtgga : fciagtotatssa aggcggctci-a isgtgesggse 280 age«gefeg«g atttgtfcfcgt tfcegaacg«« ggaafctg«';«'.c agttstsegcc t »egge aga g 300 eafcsetsafca gtgagtggct gaaeattaig açesfefeaaet; tggfcg-fcgccs gsttgcectg 380 asgaaggçts tttfcggaggg egfettetggg aggtssgageg »gaacccgfct teagaisegte 420 ttaatefc-ogt «ggifcgtiag« »e.taogfcgsr« gitgcacaaa eggeegteta gagtgegOgg 480 aaggcstggt« «tgafcggatfc cgcaogctca ettgetegeg aactaggtacs fcgaaggfcgtt; 540 «afcgfcgaacg tggt.gaaccc fcggctgg&amp;et aagacagaea tgaeggaagg agtegaa»«« 800 gea&amp;agg««» tgecca&amp;t&amp;a gggctgg&amp;tc cagcctgagg eaafetsgefcga tgo.fcgtagt a 660 Çfccet.fcgwga ggtegaaaaa: egtfcaeggg« gggaatatfcg tagtggacsa» tggtstteteg 720 aßgtsa 72«

<21 Ö> 10 <211> 726 <2:1 2 > DNS 22:1 3> Candida 563¾¾dlia« <400> 10 atgaegacta ct ccaaaag« gettgfcöaet, gf&amp;ggc»gäe geggos.fctgg ggçtgççfee« 40 gesatK&amp;age tggcfcsagga ggget5«e»at gtcacgctgg cetctcgaag fcgttgaf.a&amp;a SUö çtggatçaag ta»«ggega». »etcega&amp;fct gfca««gg&amp;<sg ggeagsago» «tacatttgg 180 gaactcgate fcggctgatgk ggsaggtgst fccgteagfetca »gggtgefcce fcfcfcgactgct; £40 egeageteeg aegfegfcfcfegt v.tegaaegcg ggcgtcgctg egttetegee «aeageegae 300 caggaggafc» «ggagtggcÄ g&amp;acfctgcfct ggggfcgaaafc tgt.egtc.gcw ««.fcfcgccöfce 340 a«g»aggcee Isetfegáagga tgfcatacgaa »ggeßtgfcgg saáág«öágt ggagattatö 420: ftagatttiagt öggOggöagg cttg«Ätgg« gcogogcaqg tegeegtgta oagfcge&amp;töt 430 aagg«eggte ttgatgg'fcfct tafcgegate.c gtegceegt.g ággíbgggagé g&amp;agggeate S40 catgtgaacfc ecateaae.e« eggatgeaeg »agáetgaaa tg&amp;cegeggg «afctga&amp;gce 680 cfctcetgatfc tgcetafccaa ggggtgg»t.é gageeegagg eaattgctga egeggttetg 640 tfctçtggeaa agtegaagaa tálíeaea^ó« aeaaaeatt.g tggtogaeas tgggtfcgatfc 720 gettaa 724 <2:1:9¾ 11 <££$:> 21':'

<212> DNS <2 ? 3 > fiié® 1 :é r.sé g es .¾ zekve női. a < 2/0., -·<·Μ l® is ci: e a,v® re ő22|> ®(. (38:): <22 3 > Pr ifiiér S£0 ÏD NSi;: 6 02e;:inti, CMoro Γ i osas sas anî. iaeusbói számlázó oKidotoCekLfiz k i onozásához expresszló s vektorba <'i00> Il çanaf kocát. atgaí.qqagc eeociKtröS® kgggaaqg Eg

<?10> 12 <211> 34 <212> DNS <21<> :meste>. sé0es szókveocia <220> <221> mise keakcre <222> i 1 ) , . ·; 34 ; <223/· firiítior HEQ ID NO: 6 szerinti , Ch loroflezus autant I uonsbôi. származó ok idő rqduktáz 1 íónozéisához ésprasssiós vekt curbs <4D0> 12

cooaagcr.la ΐ.ίι,Ν 1 acqoo aqgcqqooac catc Mi <210> 13 <211> 38 <212> DNS <213> cos ke-.séges szekvencia <22ü> < 2 21 > ni i. s a ,f e a t a r e <222> {1)..(381 <2232 Primer S&amp;Q ID NO; 6 ssierinai, Chloroflexuss aurantiaousbôi sxásasö oxidoreduktàs k-lcmôsâsàhoæ eretesseles vok torba <'4S0 P 13 eacatgestg e agat g gage caeei: treat tgggaagg 38 <2l()> 24 <2L1> 35 <212> DM5 <213> îu’*··'·· i p r réget. sxekventd.S '-· X a X 5 2 1 > ; i i s c £ <3 at U Ï'S <22 2> U ),.(35): <223> Dr xmor 880 ID MO; S sserinfei, Candida magiad uum-bol sxarsrakb oxidoradektáa klónósásáho?: etc raa;;; (6a ve k torba <4 00> 14 ggaattoegt aagatgaetg ctaetêogaa ο,χο 35 <21 0> 15 <22 1> 33 <2522- DM3 <213> mé&amp;tetsédes axekvenbia <22 Q> <221> miso f sat ura <22 2> (1).,(53) <223> Primer SEQ ID MO; 8 sssrinti, Candida mag·;« I i a s-bol ors tsar 6 ο X I dore du k tár kl 6 ne x à s gho χ exprès e< LO s v s k a m ba <4 0Q> 1.5 ccgetcgaqà. tattaagçao o jaat ecgtt gto 33

<210> 16 <2X1> 35 <212 > DNS <213> mesterséges srekveneia <22 Qr <221> mise feature <222> (1:.),,(35) <223> Primer 5EQ ID MO; 8 sserinti, Candida magnói i.ae-hd 1 ara rmunó oxidoredaikaáx klónotásáhoá expressaids vektorba < 4 0 ü> 16 caratgoaty oggatgfcctg oaa-r tegoa egere 35 <210 17 <211 > 24 <ziz> ms < 213 > nie s te r s ége s s >· :¾ kv éri c i à <2(20 <2.2 i > mise featurê <222> (1; ,,(34) <223> Primer 8ΕΏ ID EG: S oeiioi, Cèn.dida maguoliaa-bôl ssármaso oKidoreQuktár klóriücásáhöz eKpressO.gs oktdrbá <400> 17 gçeagageke etakté*aca çcçiaeteegt tg te .34

<210> :18 <211> 12 <2127 FRT < 213 > :&amp;® s te > ;> ê g es säe k vé η a i a '.:μ> <22I> PEPTTD <2227 U. :).,.(12): <2237 OOdoreduàtàc··téseszekeeiioia ·:. 4(50.:· Iß asm Ms L«u Val fhx Sly al a Sas Arg úly xl&amp; öly I 5 iô <210 19 <211> 12

<212> PET <213> mes;:erségae ssekvencia <2201 -1(75 > PEPTID <277> <1} , , (123 < 2 2 3 > 0¾ i dor edu k6 ä z-ré s z s z e keenci a <4 O0> 19

Aan Al» JLeu Val ïhr öly <*ly $*r Azg Síy 11« Sly 3. 5 Iß <2I0> 20 <2117 12

<2121 ORT O ! je· ïaeaterséges acekvetseia <220 <221> PEPTID -.2 7 27 (1),.(12): <2 2 3 > Gx i do r e du k t á s -- r é s z s s e k s en c í a <4 00 20 ÄSH &amp;ls 1*α Sl« TM Si? Si? S*y My il* Si? I s u

< 210 > 21 <2I1> 22 <2X2> PRT <213> Kisstur séges S5;ukve;:;eia <220 <22·> PEPTID <222;· Ci}.. (12; < 2 2 3 > Clx i d ô î: e d ύ k ï: á a - r è s a s 2 -a k v c ή c i a <4 00 21 Μη Ma fce» lia The Sly Ma Sei Mg Si? Xi« Si? 1 δ 1.0 <2!0> 22 <2ll> 12

<212 > PRT <2E3> msastéx Secies ssekvencia <220> <22 : > PEPTID <22 2:> {!} , M12) < 2 2 3 :> O K i do r s du Et á z - ré a :···..·;:·.··: e: 2 « e n ¢: i a <4 00;> 22 M« Ma Se« il« TM Si? Sly S«r kxg SI? Mat Si? i δ XÔ <2 i(?> 2 3 <211> 12

<212 > PET <2l3> Îitàstsrpêgés « te k. van··; U; <22 0> <221.> PEPTID <322:> {1),.(12} <223 .> 0:κ 1 de r © du k t â z ~ r é s s ppekvuu c i. a < 4 0ü:> 23

Ms Ma i«« VM TM SX? Âia 3®r M?g Si? il* Si? 1 5 ÍÖ <2lO< 22 <211 ·> 7

<2 12·' PET <213> ;©:?· icsèqe.;; seekveocle <220> <221 > PEPIID <222> DU.. {7} <223;·· ôKí dóreduk 1.3 <···<<<<<eu?k venoi a <400 24

Sly Tyr Sar Val ïhr Ls« Ala

1 S

<2!0> 25 <2ii> 7 <2I2> FBT <213> mes1erséges sKekveriéia <2202 <2212 PKPÎX&amp; <2222 {1),.(7} <223> Os i dor edak t â s-· ré: ?: s se kvencl a <4 00:2 25

Sly Tyr Asn V&amp;1 Thr 1«« Als 1 S <2102 20 <2112 7

< 212> P P: T <213> mesterséges :ssekseeelé <220> <221> PEFTÏD <2222 (1),,(7) < 2 2 3> Os i do r eau k 03 2-- t é s 2 s s. e k v.e s ç i a <40ü> 2 2 «ly ïyr S*r Val l’Hr tm Val 1 5 -, s ο ' 2 ' <211 ο 7

<2122 FRT < 213 > aie s t e t a égé s; s /< k veri ci .a <22Q> <22!> PSPTÏD <2222 (.1),,(.7} < 2 2 3 2 O r i si ο r e d é k t á s - r é s s s 2 e kv e n g i a <400> 27

Oly Tyr Asn Val ïhr As« Val 1 S <210> 28 <211> 8

<212t 8RT <213> mesterséges szekvencia: <22ö> <2212 PEPTID <222:> (1),,(3) <2 2 3 > Ox időira du:k t á -- ré s a s X alipe o.c1 a: <400> z3

Ph* iys «ly Ala Pro im\i Pro Aï»

1 S

<2i0> 23 <2X1> 8 <212> PRT < 213 > me at «ree go s s :·· a k v « no i a <220> <221.> PEPTÎD <2 2 2 > CL},, (3} < 2 2 3 > Ox il. de redo kfc á z - r é s x a ze krau ci a <400a 23

Pha Oys Ria Ma Pro La« Pro Ma

X S <21Ö> 30 <2i;> « <21.2 > soi: <21.3> mesterségek sxàkyauc.ià <22Q> <22 X> PEPTID <222> il}.. (g) <223 > 0 a i do a a d a k t á 2-r ê b x s x e kysacl a - 4 00< 30

Pha VM Ser As.n Âla 0!y

1 S

< 2 0> 31 <212L:> 0 <212> PRT · 2 "i 1 > !ï:îo:: L<.: liiôoos szexveaoia <220> <221> PPPT'ÏD <222> {X ; ,. ; 01 < 22 3 > Ox.: do < edo k t â 2 r é s z s z e kyene i. a <4U0> 31 2be Pha Ser hm\ Ma Gly 1 5 <2I0> 32 <21 !.:> f>

<2 ! 2 > PUT < 2 i 3 > s 1: e r â âges s Zé k v e ne i a <22 ü. ···

<22:> PEPT1D <222< U-} > - <e> < 2 2 3 > Dk i do r « da kt: 6 v: ~ 3:és za 2 0 k perm i a <400 32 »ft* Val Gy« Asm Ala Gly 1 5 <210 33 <2ll> %

<212> PUT <213 > ireOers&amp;gea sKaOsneia <220> <22T> PPFTÏ D <22 2> ;i ),, {6): <22 3> Ox iDor«dakt:22- rés23 2ekvenci a <4 GO 33

Jphé v&amp;l Ai&amp; h»n Ala Sly X 5 <210> 34 <211> 3

<212> PET <2l3> meskaraGges ssekvaricia <220? <2 2i > PËPTIB <2?2> (1)..(9} <· 2 20 Okidor4¾duk t:âs ··réssissèkáénc 1 -ä <4 00 34

Sas gso xla Alá A«« Thr Lys Alá hm X δ < 2 : 0 > 35 •02! 1 > 9

< 212'· PEP <213> iaestét:séges sgékvefióia <22ö>

<22l> PEPTIO <222> n}.. ; 3 ; <2230 C'x B:kn:a do k (: â ;?m rè s h s k okve a oi a <450> 33 Sár Pro Val Als Ásu Thr Áys Thr lis i 5

<21(0' 36 <21i> 9 <212> PÉT <213> mas; tier séges S2ekveac:ia <22í;o <2£1> PE;PTÏ&amp; <m> u).-;&amp;) < 22 3 > Ox i do r © d u k t â z ·· r © 3 a aa kr en ci a <400> 32 s«r 3?ro XI« Ms La« ïhr Lys Thr Ls© i 5 <21Q> 37 <211> 9

<212> PET <2133 mestersége:© sxekvapcia <22().> <' 221> PE FT I I) <222> ¢1.} ..:(9; < 2 2 3> Oxide r é du. k fc â :?: -- r á © x $ x e kv © nr I. a <4GQ> 37

Sax Pto Vsl lia Mat ïhr Lys kis hm l % <2χ0> 33 <211> 3 <212> ΡΟΤ <21T© ïaest:«·rsénes rzek yeçeia <220>

<221> PHÏPTPO <222> Cl N . CO <2233 Ox 1 do r ©do k t â ~ r é s ··. :.·: a kve a a i a <4OC» 32

Sea din lia Lia Leu Thr ï.ys Ma Lau 1 5 <£1Ü> 39 <2U> 7 <2].2> PP! <2l3> meskèy©#«®© ssôkvisnel© <22D>

<22 i> PEPTID

< 2 22 3 ( .U . . · C <2 23> Qxidoredu k t á x-ra s zs zefeyaacia < 4 00 > 3 3

Ms Val Tyx· La© Ma- Sax Lys

1 S

<210> 40 <21I> 7 <212> FRT < 213 > mes t ©x s é a © s s z © k v©soi a

Claims (3)

1. <22G> -.:2 21 > PKPTID <222> (1),. .(7) <2 23p Ok IdöréduktáK --résss xékvedel a <4003 415 Ala V&amp;X Xyr S«r Alá Thr Lys 1 5 <210 > 41 <211> 6 <212> FRT <213> mostfô.rs.égèis szekvencia <-220 > <2213 22PTID <222 > (1)..(0} < 2 2 3 > ΟX i Go r e de k t à - r ész s a e k v® πcl « <4GG> 41 Pro 1.1« fcys t*ly Tt'p 11« 1 5 <21G> 42 <211> 6 <2 Ίο PÉT <213> ííieetetadges szokveE^cilá <22 G> <221> PEPTID <22 2> (1):,,(65 < 2 2 3 > Oxl dop ;s Go k: â 2 - r á s z s :/.e k v en c i a <400> 42 9rn 11* &amp;t* My 12« 1 ' 5 SmbsKlaii«i igény p< >n ktk j. Oxkioredukúv. aktivitású pollpeptid, ti) amely tártál mázzá a SBQ ID NO:3 szerinti amÍHOsav-sxékv«8C^i: vagy b) amelyet a gKQ ID NO:8 szeműt nukleinsav-szekvencia bkksí és m(1) általáaös képlett) &amp;zekúdkmszármazék<.íi NADH vagy NADPfí kofák tor jelenlétében redukálja.

   ahöí a gyist^zöikezetek nem í'srtakn&amp;znak béteföatpraob vagyégy V8$y $^&amp;«ί»ί08ΐ«»Μΐ!ΐ &amp;j jelentése hsdröge sí vagy CVCVátkííesoporí, 8;J jelentése hyfi>gétiy:::Crfí^ílÍkiksöp<>it vagy öíl-yédöesogöfh például észtet, Kijelentése hidrogén* raíRtlésöpörí vagy Halogenid, a·

   szerkezeti elem jelentése bettzolgyürft vagy ö,l vagy 2 C-C kettős köíésí tatthlniáző C6 gyűrik ahol adotteséÉen a 6/7 vagy 7/8 helyzetben: kettős kötés van, és az I, 2. -1, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 1:2 és 16 helyzetű szén egytnástőí:ÍÖg-> ptíyntíl hiihpgénUél, Cp^Valkilesctporftai. halogenídde! vág) ténllesop<jJli|z§iiÉÍbs/.ttíuá{l.
2. 2. Oxidoredúktáz aktivitás« pnlipeptid, amely az (I) sltaianus képlet« szekodionszánnazékot N A DM vagy NADPH koíakfor jelenlétében redukálja,

   ahöl a gyüetaefezetek sem t^ltifôiÂÂetêféfâÎâtttbi/va^' égy R s jel gtrtése b líirogés vagy d^^lfcilëSôport, % jelente hkirugén, Cj-C’sAilkticsoport vagy ÓH~védoesö|í»fi? példáéi émm> Rj jelentése h Idmgén, : tnutílcseport vagy haíopnid. szerkezeti eíetb jelentése

   benzölpürő vágy 0,1 vagy 2 C’-C kettős kötést taöalmazéi ő^ gyűrő, hely» ben kettős köles van, és az. I, 2,4, 5, 6, 7, 8, 9, U, 12 és 16 helyzeté szén egymástól függetlenül hMrogemsei, C;-Cra!ki{csoporttál, halopniddeíi vagy ieníicsoporítal szubsziiiuáSt, és a polipcptidet SBQ ΪΠ NO.8 szAYmtbnttk'tetov-'Ssr^kvewclié«»! legalább SOvS-bas azonos és strtítnpns M--riUmények közöd blbridizáló mikk'tnsttv^bkvencia.köde^.'d^ias^ö^pS'R^inip^^Pi^l^/^y'·' rsalí ihibíidizáeibí 0,7-i::M Naföl oldatban, éöANon,
3. 3, Az I. vagy : 2. igénypont szerinti izolált pölipspíib, amely