CN102382805B - 具有氧化还原酶活性的多肽及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及通式I的开环二酮(Secodion)衍生物的对映体选择性酶促还原方法<CNIPR:IMG <CNIPR:IMG file="DSA00000567684700011.GIF" wi="85" he="47" img-format="tif"其中环结构不包括杂原子、包括一个杂原子或包括数个杂原子，R1是氢或C1-C4烷基，R2是氢、C1-C8烷基或现有技术已知的对OH的保护基，诸如酯，R3是氢、甲基或卤化物所述结构单元(A)<CNIPR:IMG <CNIPR:IMG file="DSA00000567684700012.GIF" wi="26" he="16" img-format="tif"表示苯环或具有0、1或2个C-C双键的C6环，任选地在第6/7或7/8位包括双键，和第1、2、4、5、6、7、8、9、11、12和16位的碳独立地被氢、C1-C4烷基、卤化物或苯基取代，在所述方法中在NADH或NADPH作为辅因子存在的条件下开环二酮衍生物被氧化还原酶/脱氢酶还原。根据本发明，反应批料中使用的开环二酮衍生物浓度≥10g/l，并且由氧化还原酶/脱氢酶形成的氧化的NAD或NADP辅因子被连续再生。
Description
本案是申请号为200780045107.6的中国专利申请的分案申请。
本发明涉及通式I的开环二酮(Secodion)衍生物的对映体选择性酶促还原方法，其中在NADH或NADPH作为辅因子存在的条件下开环二酮衍生物被氧化还原酶/脱氢酶还原。
甾族激素的工业制备存在两条彼此独立的路线，即，一方面，从天然存在的植物来源的甾族化合物开始，和另一方面，从前手性前体通过对映体选择性合成的完全合成方式。在这两条路线中，甾族化合物全合成是日益重要的，尤其是因为它还允许引入天然存在的甾族化合物不具有的结构单元。
对映体纯的甾族化合物的全合成的关键组分是通式I的化合物，其还被称为开环甾族化合物(Secosteroide)，8，14-开环-甾-四烯-14，17-二酮(8，14-seco-gona-tetraen-14，17-dione)或开环二酮。这组的具体代表物是诸如化合物甲基开环二酮(式II，13-甲基-3-甲氧基-8，14-开环-甾-1，3，5(10)，9(11)-四烯-14，17-二酮)和乙基开环二酮(式III，13-乙基-3-甲氧基-8，14-开环-甾-1，3，5(10)，9(11)-四烯-14，17-二酮)，从这些化合物例如可以制备具有药理学活性的化合物乙炔基雌甾二醇(式IV)和炔诺孕酮(式V)。
式II 式III
式IV 式V
制备对映体纯的甾族化合物的关键步骤是通过将酮基团之一对映体选择性还原成羟基，使式I(例如，II和III)的化合物转化为具有预先形成的不对称C-13的光学活性化合物。随后可以通过环化将获得的光学活性羟基开环甾族化合物(开环醇(Secole)，式VI到IX)进一步加工为手性甾族化合物，同时保持手性。
通过式I化合物的酮基团的对映体选择性还原，理论上可以形成4种光学活性化合物(式VI到IX)。
式VI的化合物(其中在第17位羟基显示β-构型)是尤其具有经济利益的，因为它们产生天然雌酮的衍生物。这种化合物还被称为17-β-羟基开环甾族化合物。
尤其在十九世纪六七十年代充分研究了借助于不同的微生物对通式I的开环二酮衍生物的立体选择性还原。由此，能够证明假丝酵母属(Candida)、德巴利酵母属(Debaryomyces)、克勒克酵母属(Kloeckera)、毕赤酵母属(Pichia)、隐球酵母属(Cryptococcus)、红酵母属(Rhodotorula)、球拟酵母属(Torulopsis)和汉逊氏酵母属(Hansenula)的不同酵母菌株能够将开环二酮还原成各种羟基化合物(US 3616226，US 1252524，US 3616225)。
尤其是，酵母属(Saccharomyces)的酵母，诸如葡萄汁酵母(S.uvarum)可有利的用于制备例如相应的17-β-羟基开环甾族化合物(Kosmol等人；Liebigs Ann.Chem.701，199(1967))。其他酵母菌株诸如Saccharomyces drosophilarum优选地将开环二酮还原成对应的14-α-羟基开环甾族化合物(Acta microbiol.Acad.Sci.hung.22，463-471(1975))。此外，还描述了通过苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis) 还原开环二酮形成14-α-羟基开环甾族化合物(Kosmol等人；Liebigs Ann.Chem.701，199(1967))。
在世界范围内孕激素和雌激素试剂被广泛用作避孕剂并在激素替代疗法中使用。到目前为止雌激素和孕激素衍生物的大部分合成还基于上述反应原理，其中的关键步骤是将开环二酮对映体选择性还原为相应的17-β-羟基开环甾族化合物。
在这种情况下，迄今都是利用毕赤酵母属或酵母属的不同酵母菌株以全细胞生物转化形式进行开环二酮衍生物的立体选择性还原。但是，这些方法具有缺点，即只能实现远低于1％(通常从1到5g/l)的极低底物浓度(US 3697379；Current Science，1984年2月5日，第53卷.第3期，第124页；Indian Journal of Experimental Biology，第27卷，1989年8月，第742-743页)。因此，尤其是大体积反应产物的再处理和分离及大量生物质的分离变得非常复杂。就本发明人所知，到目前为止还没有分离、鉴定和描述参与还原的酶。并且，还没有鉴定出编码氧化还原酶(通过该氧化还原酶可以还原开环二酮衍生物)的DNA序列。
因此，本发明的目的是提供一种可以对映体选择性还原通式I的开环二酮衍生物(尤其是式II和III的开环二酮衍生物)的方法。由此尤其还应当可以制备相应的17-β-羟基开环甾族化合物。
第一个方面，根据本发明通过通式I的开环二酮衍生物的对映体选择性酶促还原方法实现所述目的，
其中环结构不包括杂原子、包括一个杂原子或包括数个杂原子，
R1是氢或C1-C4烷基，
R2是氢、C1-C8烷基或现有技术已知的对OH的保护基，诸如酯，
R3是氢、甲基或卤化物
所述结构单元
表示苯环或具有0、1或2个C-C双键的C6环，
任选地在第6/7或7/8位包括双键，和
第1、2、4、5、6、7、8、9、11、12和16位的碳独立地被氢、C1-C4烷基、卤化物或苯基取代，
其中在NADH或NADPH作为辅因子存在的条件下开环二酮衍生物被氧化还原酶/脱氢酶还原，
该方法的特征在于在反应批料中使用的开环二酮衍生物浓度≥10g/l，并且由氧化还原酶/脱氢酶形成的氧化的辅因子NAD或NADP被连续再生。
该方法代表了开环二酮衍生物的对映体选择性酶促还原相对于现有技术的显著改进。本发明方法允许利用远远超过现有技术描述的浓度范围的游离酶将开环二酮衍生物还原为不同的相应羟基开环甾族化合物。
第二个方面，根据本发明通过通式I的开环二酮衍生物的对映体选择性酶促还原方法实现上述目的，其中在NADH或NADPH作为辅因子存在的条件下开环二酮衍生物被氧化还原酶/脱氢酶还原，该方法的特征在于所述氧化还原酶/脱氢酶
a)包括与氨基酸序列SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5至少50％氨基酸相同的氨基酸序列，
b)由核酸序列SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10编码，或
c)由严格条件下与SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10杂交的核酸序列编码。
本发明人已经鉴定出能够将开环二酮衍生物还原为羟基开环甾族化合物并且可以在工业规模上重组产生的氧化还原酶。与目前使用的全细胞方法相比，按照本发明的方法可以实现显著更高的底物浓 度。
在本发明的方法中，具有序列SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5的氧化还原酶或可衍生自这些多肽的多肽可以分别以完全纯化的状态，部分纯化的状态或作为包含多肽SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5的细胞而被使用。由此，所用细胞可以天然、透化或裂解状态提供。优选地，氧化还原酶及可由其衍生的衍生物可分别在合适的宿主生物诸如大肠杆菌(Escherichia coli)中过表达，并且重组多肽被用于通式I的开环二酮衍生物的还原。
例如从生物橙色绿屈挠菌(Chloroflexus aurantiacus)DSM 635的基因组可获得编码具有SEQ ID NO：1的多肽的DNA序列SEQ ID NO：6。
例如从生物Rubrobacter xylanophilus DSM 9941的基因组可获得编码具有SEQ ID NO：2的多肽的DNA序列SEQ ID NO：7。
从酵母木兰假丝酵母(Candida magnoliae)CBS 6396可获得编码具有SEQ ID NO：3的多肽的DNA序列SEQ ID NO：8。
例如通过同源性筛选从木兰假丝酵母(Candida magnoliae)DSMZ70638可获得SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5的氧化还原酶。
在严格条件下例如与SEQ ID NO：6杂交的核酸序列应被理解为可以通过集落杂交法、噬菌斑杂交法、DNA杂交法或可比较的方法利用SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：6的部分序列作为DNA探针鉴定出的多核苷酸。为了这个目的，在60℃0.7-1M NaCl溶液中，固定在滤器上的多核苷酸与诸如SEQ ID NO：6杂交。按照例如分子克隆，实验室手册(Molecular Cloning，A Laboratory Manual)，第二版(Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)或类似出版物的描述进行杂交。随后，在65℃用0.1到2倍SSC溶液洗涤滤器，其中1倍SSC溶液理解为由150mM NaCl和15mM柠檬酸钠组成的混合物。
在上述严格条件下与序列表的多核苷酸SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10杂交的多核苷酸应该与多核苷酸序列SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10显示至少60％的序列同一性，更好的是同一性为至少80％，甚至更好的是同一性为95％。
在另一个方面，根据本发明通过通式I的开环二酮衍生物的对映体选择性酶促还原方法实现上述目的，其中在NADH或NADPH作为辅因子存在的条件下开环二酮衍生物被氧化还原酶/脱氢酶还原，该方法的特征在于所述氧化还原酶/脱氢酶长度为230到260个氨基酸，并包括选自[序列SEQ ID NO：18到SEQ ID NO：42]：
nalvtgasrgig，nalvtggsrgig，nalitggsrgig，nalitgasrgig，nalitggsrgmg，halvtgasrgig，
gysvtla，gynvtla，gysvtlv，gynvtlv，
fkgaplpa，fkaaplpa，
fvsnag，ffsnag，fvcnag，fvanag，
spialtkal，spvaltkti，spialtktl，spvamtkal，sqialtkal，
avysask，avysatk，
pikgwi和pisgwi，
的一个或数个部分序列。
在本发明的方法中，NADH或NADPH被用作辅因子。术语“NADP”理解为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，“NADPH”理解为还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸。术语“NAD”表示烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，术语“NADH”表示还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸。
根据所述方法的优选实施方案，在反应批料中使用的开环二酮衍生物浓度≥10g/l，并且由氧化还原酶/脱氢酶形成的氧化的辅因子NAD或NADP被连续再生，所述氧化还原酶/脱氢酶
a)包括与氨基酸序列SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5至少50％氨基酸相同的氨基酸序列，
b)所述氧化还原酶/脱氢酶由核酸序列SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10编码，或
c)所述氧化还原酶/脱氢酶由严格条件下与SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10杂交的核酸序列编码。
根据所述方法另一个优选的实施方案，反应批料中使用的开环二酮衍生物浓度≥10g/l，并且由氧化还原酶/脱氢酶形成的氧化的辅因子NAD或NADP被连续再生，所述氧化还原酶/脱氢酶长度为230到260个氨基酸，包括选自[序列SEQ ID NO：18到SEQ ID NO：42]：
nalvtgasrgig，nalvtggsrgig，nalitggsrgig，nalitgasrgig，nalitggsrgmg，halvtgasrgig，gysvtla，gynvtla，gysvtlv，gynvtlv，fkgaplpa，fkaaplpa，fvsnag，ffsnag，fvcnag，fvanag，spialtkal，spvaltkti，spialtktl，spvamtkal，sqialtkal，avysask，avysatk，pikgwi和pisgwi的一个或数个部分序列。
在根据本发明第二和第三个方面的方法中，由氧化还原酶/脱氢酶形成的氧化的辅因子NAD或NADP优选的被连续再生。
根据本发明所有方法的优选实施方案，通过醇的氧化来再生氧化的辅因子NAD或NADP。
在这种情况下，伯醇和仲醇诸如乙醇，2-丙醇，2-丁醇，2-戊醇，3-戊醇，4-甲基-2-戊醇，2-己醇，2-庚醇，2-辛醇或环己醇优选地被用作共底物。以总体积计，用于再生的共底物比例为5到95％(体积比)。
具有通式RXRYCHOH的仲醇优选被用于辅因子再生，其中RX和RY彼此独立的是氢、分枝或未分枝的C1-C8烷基并且C总数≥3。
根据本发明方法另一个优选的实施方案，还添加氧化还原酶/脱氢酶用于辅因子的再生。
合适的NADH依赖性醇脱氢酶例如可获自面包酵母，近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis，CPCR)(US 5,523,223和US 5,763,236，Enzyme Microb.Technol.，1993，15(11)：950-8)，Pichia capsulata(DE10327454.4)，红串红球菌(Rhodococcus erythropolis，RECR)(US5,523,223)，褐色诺卡氏菌(Norcardia fusca)(Biosci.Biotechnol.Biochem.，63(10)，1999，第1721-1729页；Appl.Microbiol.Biotechnol，2003，62(4)：380-6；Epub 2003年4月26日)或赤红球菌(Rhodococcus ruber)(J.Org.Chem.，2003，68(2)：402-6)。这些醇脱氢酶的合适共底物是，例如，已经提及的仲醇诸如2-丙醇(异丙醇)，2-丁醇，2-戊醇，4-甲基-2-戊醇，2-辛醇或环己醇。
用于NADPH再生的合适仲醇脱氢酶是例如上文描述的及从乳杆菌目生物分离的那些仲醇脱氢酶，诸如高加索酸奶乳杆菌(Lactobacillus kefir)(US 5,200,335)，短乳杆菌(Lactobacillus brevis)(DE 19610984A1；Acta Crystallogr.D.Biol.Crystallogr.2000年12月；56Pt 12：1696-8)，稍小乳杆菌(Lactobacillus minor)(DE 10119274)，肉色明串珠菌(Leuconostoc carnosum)(A 1261/2005，Kl.C12N)，或所述来自布氏热厌氧菌(Thermoanerobium brockii)，Thermoanerobium ethanolicus 或拜氏梭状芽孢杆菌(Clostridium beijerinckii)的那些仲醇脱氢酶。
但是，原则上其他酶系统也可用于辅因子再生。例如，可以利用NAD或NADP依赖性甲酸脱氢酶进行辅因子再生(Tishkov等人，J.Biotechnol.Bioeng.[1999]64，187-193，Pilot-scale production and isolation of recombinant NAD and NADP specific formate dehydrogenase)。甲酸脱氢酶的合适共底物是，例如，甲酸盐诸如甲酸铵、甲酸钠或甲酸钙。
本发明方法获得的TTN(总转换数＝还原的开环二酮化合物的摩尔数/使用的辅因子的摩尔数)范围通常是102到105，但是优选≥103。
根据优选的实施方案，在含水有机两相系统中实施本发明的方法。
因此，开环二酮衍生物的转化发生在两相系统中，其包含诸如，用于辅因子再生的2-醇、氧化还原酶、水、辅因子和开环二酮化合物。但是，还可以包括另外的有机溶剂，这些有机溶剂不参与辅因子再生，即，不包含任何可氧化的羟基。二乙醚、叔丁基甲醚、二异丙醚、二丁醚、醋酸乙酯、醋酸丁酯、庚烷、己烷、甲苯、二氯甲烷、环己烷或其混合物优选被用作另外的有机溶剂。
因此，两相系统中不可与水共混的有机组分的比例相对于反应批料总体积可以为10％到90％，优选20％到80％。水相的比例相对于反应批料总体积可以为90％到10％，优选80％到20％。
还可以向水中添加缓冲剂，诸如，磷酸钾、Tris/盐酸、甘氨酸或三乙醇胺缓冲剂，其pH值为5到10，优选的6到9。此外，所述缓冲液可以包含稳定或活化上述两种酶的离子，诸如，镁离子或锌离子。
此外，在本发明方法中可以使用稳定所用酶的其他添加剂，例如，甘油，山梨糖醇，1，4-DL-二硫苏糖醇(DTT)或二甲基亚砜(DMSO)。
根据水相计算，辅因子NAD(P)H的浓度为0.001mM到10mM，尤其是0.01mM到1.0mM。根据所用酶的特性，温度可以是10℃到70℃，优选20℃到35℃。
通常，有待还原的开环二酮衍生物难溶于水。因此，在反应期间底物可以以完全或不完全溶解状态存在。如果底物不完全溶于反应混合物，则底物的一部分以固体形式存在，从而可以形成第三固相。在转化期间反应混合物还可能暂时形成乳状液。
在本发明的方法中，按总体积计算，反应批料中使用的通式I的开环二酮衍生物的量优选为10g/l到500g/l，更优选为25g/l到300g/l，尤其优选为50g/l到200g/l。
本发明优选实施方案的特征还在于13-乙基-3-甲氧基-8，14-开环-甾-1，3，5(10)，9(11)-四烯-14，17-二酮(乙基开环二酮-式III)或13-甲基-3-甲氧基-8，14-开环-甾-1，3，5(10)，9(11)-四烯-14，17-二酮(甲基开环二酮-式II)被用作开环二酮衍生物。
在例如由玻璃或金属制成的反应容器中实施本发明的方法。为了这个目的，将组分分别转移入反应容器，并在例如氮气或空气的气氛中搅拌。根据使用的开环二酮化合物及氧化还原酶，反应时间为1小时到7天，尤其是2小时到48小时。在此期间，至少50％的开环二酮化合物被还原为对应的羟基开环甾族化合物。
下面，将通过实施例更详细的阐述本发明。
实施例1
从橙色绿屈挠菌(Chloroflexus auratiacus)DSM 635克隆氧化还原酶
A)橙色绿屈挠菌DSM 635的培养
在48℃光照环境的细菌培养箱中，橙色绿屈挠菌DSM 635的细胞在下列培养基(pH 8.2)中培养：0.1％酵母抽提物，0.1％甘氨酰甘氨酸，0.01％Na2HPO4x 2H2O，0.01％MgSO4x 7H2O，0.01％KNO3，0.05％NaNO3，0.01％NaCl，0.005％CaCl2x 2H2O，5ml 0.01％Fe(III)柠檬酸盐溶液，1ml痕量元素溶液SL-6[500μl/l H2SO4，2.28g/lMnSO4x H2O，500mg/l ZnSO4x 7H2O，500mg H3BO3，25mg/l CuSO4x 5H2O，25mg/l Na2MoO4x 2H2O，45mg/l CoCl2x 6H2O]。在培养的第12天，通过离心从培养基分离细胞，并在-80℃保存。
B)扩增编码选择性氧化还原酶的基因
按照Manniatis & Sambrook的“Molecular Cloning(分子克隆)”中描述的方法提取基因组DNA。获得的核酸用作含特异性引物的聚合酶链式反应(PCR)的模板，所述特异性引物源自NCBI数据库编号76258197公开的基因序列。在这种情况下，引物在其5′末端分别配置有核酸内切酶Nde I和Hind III或Sph I的限制性酶切位点(SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：13)，以便随后克隆入表达载体。
在含有500ng基因组DNA的PCR缓冲液[10mM Tris-HCl，(pH8.0)；50mM KCl；10mM MgSO4；1mM dNTP Mix；在每一情形下20pMol引物和2.5U Platinum Pfx DNA聚合酶(Invitrogen)]中和如下温度循环进行扩增：
循环1：94℃，2min
循环2x 30：94℃，30sec
56℃，30sec
68℃，60sec
循环3：68℃，7min
4℃，∞
获得的大小约750bp的PCR产物在1％琼脂糖凝胶上纯化后分别用核酸内切酶NdeI和Hind III或核酸内切酶Sph I和Hind III限制性酶切，将其分别连接入pET21a载体(Novagen)或pQE70载体(Qiagen)的骨架(该骨架已经用相同的核酸内切酶处理)。将2μl连接批料转化入大肠杆菌Top 10F′细胞(Invitrogen)后，分别通过核酸内切酶Nde I和Hind III或核酸内切酶Sph I和Hind III的限制性分析检测氨苄青霉素(或卡那霉素)抗性菌落的质粒DNAs中大小为750bp的插入物的存在。来自所述片段阳性的克隆的质粒制品被用于序列分析，随后将其分别转化入大肠杆菌BL21Star(Invitrogen)和大肠杆菌RB791(genetic stock，Yale)。
实施例2
重组绿屈挠菌氧化还原酶在大肠杆菌中的表达
用表达构建体转化的大肠杆菌菌株BL21 Star(Invitrogen，Karlsruhe，德国)和RB791(E.coli genetic stock，Yale，USA)分别在含有氨苄青霉素(50μg/ml)或羧苄青霉素(50μg/ml)的200ml LB-培养基(1％胰蛋白胨，0.5％酵母抽提物，1％NaCl)中培养，直至550nm测量的光密度(OD)达到0.5。通过添加浓度为0.1mM的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组蛋白的表达。在25℃和220rpm诱导8小时或16小时后，收获细胞并冷冻于-20℃。为了进行活性试验，将10mg细胞与500μl100mM TEA缓冲液pH 7.0和500μl玻璃珠混合，利用球磨机消化10分钟。然后所获裂解物在稀释状态下进行相应的测量。活 性试验组成如下：870μl 100mM TEA缓冲液pH 7.0，160μg NADH，10μl稀释的细胞裂解物。通过向反应混合物中添加100μl100mM底物溶液开始反应。
为了大量回收酶，将30g细胞重悬于150ml三乙醇胺缓冲液(100mM，pH 7，2mM MgCl2，10％甘油)，并使用高压匀浆器消化。随后，将酶溶液与150ml甘油混合，-20℃保存。
实施例3
生物的培养及乙基开环二酮(式III)还原转化后的筛选
为了进行筛选，酵母菌株粉状毕赤氏酵母(Pichia farinosa)DSM70362，Candida gropengiesseri MUCL 29836，Candida vaccinii CBS7318，粉状毕赤氏酵母(Pichia farinosa)DSM 3316，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CBS 1508和木兰假丝酵母(Candida magnoliae)CBS 6396在下列培养基中培养：酵母抽提物(5)，蛋白胨(5)和葡萄糖(20)(括号中数字的单位都是g/l)。培养基在121℃灭菌，酵母在25℃140转每分的摇床上培养，无需进一步的pH调节。
在下列全细胞生物转化批料中检测式III的乙基开环二酮向对应羟基开环甾族化合物的还原转化：将一批次中400mg新收获的细胞与50mg葡萄糖、10mg式III的乙基开环二酮和900μl 100mM三乙醇胺缓冲液(TEA)pH 7.0在28℃和1400rpm振荡24小时。随后，所述批料用1ml二氯甲烷抽提，离心，用氮气干燥，在容纳于乙腈后进行HPLC分析。
筛选结果概述于表1。
表1
菌株CBS 6396显示乙基开环二酮的最高转化，因此被挑选为制备cDNA文库的起始生物。
实施例4
从木兰假丝酵母CBS 6396制备cDNA文库及克隆氧花还原酶
A)cDNA文库的分离(全部和mRNA)及制备
将600mg新鲜细胞重悬于2.5ml冰冷却的LETS缓冲液。向所述细胞悬液中添加5ml(约20g)玻璃珠，所述玻璃珠已用硝酸洗涤并用3ml苯酚平衡(pH 7.0)。全体批料交替经30秒的涡旋和30秒的冰上冷却处理，共10分钟。随后，添加5ml冰冷却的LETS缓冲液，再将其激烈涡旋混合。在4℃将所述细胞悬液用11000g离心5分钟。回收水相，并用等体积的苯酚∶氯仿∶异戊醇(24∶24∶1)抽提两次。然后用氯仿抽提。在最后一次抽提后，在-20℃通过添加1/10体积的5M LiCl2沉淀总RNA 4小时。
将获得的1mg总RNA通过Oligo-dT纤维素(NEB Biolabs)以富集mRNA分子。在随后的沉淀后，5μg mRNA用于cDNA合成(pBluescript IIXR cDNA文库构建试剂盒，Stratagene)。按照制造商的说明书将构建的文库转化入XL-10Gold大肠杆菌并筛选ADH的活性。利用NADPH或NADH分别作为辅因子和乙基开环二酮(式III)作为底物，根据吸光度的降低鉴定并分离出克隆(cM4)。利用引物T7和引物T3测序从所述克隆分离的质粒，获得789bp的ORF。所述片段编码大小为262个氨基酸的融合蛋白，由β-半乳糖苷酶的a-片段和推定的短链醇脱氢酶序列组成。
B)通过PCR合成编码来自木兰假丝酵母CBS 6396的短链ADH的全长转录物
构建特异性引物用于后续将全长转录物克隆入合适的表达系统。在这种情况下，分别具有Nde I和Sph I识别序列的5′引物和分别具有XhoI和SacI识别序列的3′引物被修饰(SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：15， SEQ ID NO：16，SEQ ID NO：17)。从木兰假丝酵母表达文库的克隆(cM4)分离的质粒DNA用作聚合酶链式反应的模板。在含有50ng模板的PCR缓冲液[10mM Tris-HCl，(pH 8.0)；50mM KCl；10mM MgSO4；1mM dNTP Mix；在每一情形下20pMol引物和2.5U Platinum Pfx DNA聚合酶(Invitrogen)]中和下面温度循环条件下进行扩增：
循环1：94℃，2min
循环2x 30：94℃，15sec
58℃，30sec
68℃，75sec
循环3：68℃，7min
4℃，∞
获得的PCR产物在1％琼脂糖凝胶上纯化后分别用核酸内切酶Nde I和Xho I或核酸内切酶Sph I和Sac I限制性酶切，将其分别连接入pET21a载体(Novagen)或pQME70载体的骨架(该骨架已经用相同的核酸内切酶处理)。将2μl连接批料转化入大肠杆菌Top 10F′细胞(Invitrogen)后，分别通过核酸内切酶Nde I和Xho I或核酸内切酶Sph I和Sac I的限制性分析检测氨苄青霉素(或卡那霉素)抗性菌落的质粒DNAs中大小为750bp的插入物的存在。对表达构建体pET21-MgIV和pQME70-MgIV进行测序。编码短链氧化还原酶的木兰假丝酵母基因具有共729bp(包含于SEQ ID NO：8)的开放阅读框，其对应于243个氨基酸的蛋白(SEQ ID NO：3)。
实施例5
重组氧化还原酶在大肠杆菌细胞中的表达
用分别编码氧化还原酶的表达构建体pET21-MgIV和pQME70-MgIV分别转化感受态的大肠杆菌StarBL21(De3)细胞(Invitrogen)和RB791细胞(大肠杆菌genetic stock，Yale，USA)。然后将用表达构建体转化的大肠杆菌菌落分别在200ml含有50μg/ml氨苄青霉素或40μg/ml卡那霉素的LB培养基(1％胰蛋白胨，0.5％酵母抽提物，1％NaCl)中培养，直至在550nm时测量的光密度达到0.5。通过添加0.1mM浓度的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组蛋白的表达。在25℃和220rpm诱导16小时后，收获细胞并冷冻于-20℃。为 了进行活性试验，将10mg细胞与500μl 1o0mM TEA缓冲液pH 7.0、1mM MgCl2和500μl玻璃珠混合，利用球磨机消化10分钟。然后所获裂解物在稀释状态下进行相应的测量。
活性试验组成如下：960μl100mM TEA缓冲液pH 7.0，1bmM MgCl2，160μg NADH，10μl稀释的细胞裂解物。通过向反应混合物中添加10μl100mM底物溶液(溶于70％甲醇)开始反应。
为了大量回收酶，将30g细胞重悬于150ml三乙醇胺缓冲液(100mM，pH 7，2mM MgCl2，10％甘油)，并用高压匀浆器消化。随后，将酶溶液与150ml甘油混合，在-20℃保存。
实施例6
通过氧化还原酶SEQ ID NO：1还原乙基开环二酮(式III)
为了还原乙基开环二酮(式III)，室温下800μl缓冲液(100mM磷酸钾，pH＝7，2mM MgCl2)，1.2ml 2-丙醇，0.08mg NAD，100mg乙基开环二酮(式III)和1ml酶悬液氧化还原酶SEQ ID NO：1(参见实施例3)的混合物在恒定充分混合条件下在反应容器中温育24小时。96小时后，＞90％的使用的乙基开环二酮(式III)被还原。
在反应完成时，通过用二氯甲烷抽提对反应混合物进行再处理，分离包含产物的有机相，通过蒸发/馏出溶剂获得17-β-羟基化合物(乙基开环醇(Ethylsecol))。
然后通过HPLC将乙基开环二酮转化为乙基开环醇(Ethylsecol)。为了这个目的，使用乙腈和水作为流动相的分离柱EC 125/4Nucleodur100-5 C18ec(Machery-Nagel，Düren，德国)。为了进行分析，使用流动相中乙腈比例从30％到70％的线性梯度。通过与参照物比较进行反应产物的鉴定。
实施例7
通过氧化还原酶SEQ ID NO：2还原乙基开环二酮(式III)
为了还原乙基开环二酮(式III)，室温下250μl缓冲液(100mM三乙醇胺，pH＝8，2mM MgCl2)，250μl 4-甲基-2-戊醇，0.02mg NAD，25mg乙基开环二酮(式III)和25μl酶悬液氧化还原酶SEQ ID NO：2(参见实施例3)的混合物在恒定充分混合条件下在反应容器中温育96 小时。96小时后，＞30％的使用的乙基开环二酮(式III)被还原为羟基化合物。
在反应完成时，通过用二氯甲烷抽提对反应混合物进行再处理，分离包含产物的有机相，通过蒸发/馏出溶剂获得17-β-羟基化合物(乙基开环醇(Ethylsecol))。
实施例8
通过氧化还原酶SEQ ID NO：3还原乙基开环二酮(式III)
为了还原乙基开环二酮(式III)，室温下100μl缓冲液(100mM三乙醇胺，pH＝7，2mM MgCl2)，400μl 4-甲基-2-戊醇，0.02mg NADP，25mg乙基开环二酮(式III)和100μl酶悬液氧化还原酶SEQ ID NO：3(参见实施例3)的混合物在恒定充分混合条件下在反应容器中温育72小时。72小时后，＞95％的所用乙基开环二酮(式III)被还原为羟基化合物。
实施例9
通过氧化还原酶SEQ ID NO：4还原乙基开环二酮(式III)
为了还原乙基开环二酮(式III)，室温下200μl缓冲液(100mM三乙醇胺，pH＝9，2mM MgCl2)，300μl 2-庚醇，0.025mg NADP，100mg乙基开环二酮(式III)和50μl酶悬液氧化还原酶SEQ ID NO：4(参见实施例3)的混合物在恒定充分混合条件下在反应容器中温育72小时。72小时后，＞80％的所用乙基开环二酮(式III)被还原为羟基化合物。
实施例10
通过氧化还原酶SEQ ID NO：5还原乙基开环二酮(式III)
为了还原乙基开环二酮(式III)，室温下300μl缓冲液(100mM三乙醇胺，pH＝7，2mM MgCl2)，1.2ml 4-甲基-2-戊醇，0.12mg NADP，150mg乙基开环二酮(式III)和0.6ml酶悬液氧化还原酶SEQ ID NO：5(参见实施例3)的混合物在恒定充分混合条件下在反应容器中温育72小时。72小时后，＞90％的所用乙基开环二酮(式III)被还原为羟基化合物。
Claims (3)
1.具有氧化还原酶活性的多肽，其特征在于所述多肽
a)为氨基酸序列SEQ ID NO：3或
b)由核酸序列SEQ ID NO：8编码并且具有在辅因子NADH或NADPH的存在下还原通式I的开环二酮衍生物的活性
其中
R1是氢或C1-C4烷基，
R2是氢、C1-C8烷基或现有技术已知的对OH的保护基，
R3是氢、甲基或卤化物，
所述结构单元
表示苯环或具有0、1或2个C-C双键的C6环，
任选地在第6/7或7/8位包括双键，和
第1、2、4、5、6、7、8、11、12和16位的碳独立地被氢、C1-C4烷基、卤化物或苯基取代。
2.根据权利要求1的多肽，其中所述对OH的保护基是酯。
3.根据权利要求1或2的多肽，其中所述多肽获自木兰假丝酵母(Candida magnoliae)。
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