CN113025589B - 3α-羟基类固醇脱氢酶、编码基因及其在催化剂中的应用 - Google Patents

3α-羟基类固醇脱氢酶、编码基因及其在催化剂中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种新的NAD(H)依赖型3α‑羟基类固醇脱氢酶，该酶能够催化胆汁酸C3位α‑羟基的氧化反应，催化TCDCA的C3位α‑羟基氧化生成Tauro‑3‑dehydro‑CDCA，或者催化TUDCA的C3位α‑羟基氧化生成Tauro‑3‑dehydro‑UDCA，催化活性是绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)3α‑羟基类固醇脱氢酶(Accession NO.WP_003109865.1)的12.18倍和15.06倍，在临床检验中具有巨大的应用价值。

Description

3α-羟基类固醇脱氢酶、编码基因及其在催化剂中的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种3α-羟基类固醇脱氢酶、编码基因及其在催化剂中的应用。
背景技术
总胆汁酸是胆固醇在肝脏分解及肠-肝循环中的代谢产物，是胆固醇在肝脏分解代谢的最终产物，其与胆固醇的吸收、代谢及调节关系密切。血液、组织液中总胆汁酸的含量测定一直是研究的热点。目前临床检测中通常使用3α-羟基类固醇脱氢酶催化待检测样品中的胆汁酸C3羟基进行氧化反应，该反应同时将氧化型辅酶I或II还原为还原性辅酶I或II，通过测定340nm处的光吸收变化值计算得到待测样品中总胆汁酸的含量。该检测过程中，具有较高催化活性和稳定性的新酶挖掘和发现是研究的热点之一。发现活性更高的3α-羟基类固醇脱氢酶有助于试剂盒检测能力的提升和更加广泛的应用。
发明内容
根据本发明的第一方面，本发明提供一种新的3α-羟基类固醇脱氢酶，该3α-羟基类固醇脱氢酶催化TCDCA、TUDCA的C3位α-羟基氧化分别生成Tauro-3-dehydro-CDCA与Tauro-3-dehydro-UDCA，催化活性高，具有巨大的实际应用价值。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种3α-羟基类固醇脱氢酶，其序列如SEQ ID NO.1所示。
Figure GDA0004093667530000011
Figure GDA0004093667530000021
根据本发明的第二方面，本发明提供上述3α-羟基类固醇脱氢酶的编码基因。
上述3α-羟基类固醇脱氢酶的编码基因，其序列如SEQ ID NO.2所示。
Figure GDA0004093667530000022
Figure GDA0004093667530000031
本发明的第三方面，提供一种表达载体，其含有上述3α-羟基类固醇脱氢酶的编码基因。
一种表达载体，其含有上述3α-羟基类固醇脱氢酶的编码基因。进一步的，本发明还提供一种重组菌，其被上述的表达载体转化。更进一步，经表达载体转化的重组菌选自重组大肠杆菌。
本发明的第四方面，本发明还提供一种酶蛋白表达盒，其包含上述3α-羟基类固醇脱氢酶的编码基因。进一步，本发明还提供一种重组细胞，其包含上述酶蛋白表达盒。
本发明的第五方面，提供上述3α-羟基类固醇脱氢酶或3α-羟基类固醇脱氢酶的编码基因在总胆汁酸含量的检测中的应用，所述应用用于非疾病的诊断和治疗。上述3α-羟基类固醇脱氢酶或3α-羟基类固醇脱氢酶的编码基因在催化胆汁酸C3位α-羟基的氧化反应中的应用，所述应用用于非疾病的诊断和治疗。
本发明的第六方面，提供一种催化剂，其有效成分包含上述3α-羟基类固醇脱氢酶。
本发明的第七方面，提供一种催化胆汁酸C3位α-羟基氧化反应的方法，其特征在于：所述催化剂包含上述3α-羟基类固醇脱氢酶，所述方法用于非疾病的诊断和治疗。进一步，所述催化胆汁酸C3位α-羟基氧化反应为催化TCDCA的C3位α-羟基氧化生成Tauro-3-dehydro-CDCA或催化TUDCA的C3位α-羟基氧化生成Tauro-3-dehydro-UDCA。
有益效果：
本发明提供一种新的NAD(H)依赖型3α-羟基类固醇脱氢酶(命名为G003)，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明通过全基因合成的方式获得了一个新的3α-羟基类固醇脱氢酶的编码基因(核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)。本发明新的NAD(H)依赖型3α-羟基类固醇脱氢酶能够催化胆汁酸C3位α-羟基的氧化反应，如催化TCDCA的C3位α-羟基氧化生成Tauro-3-dehydro-CDCA，或者催化TUDCA的C3位α-羟基氧化生成Tauro-3-dehydro-UDCA，催化活性是绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)3α-羟基类固醇脱氢酶(AccessionNO.WP_003109865.1)的12.18倍和15.06倍。本发明为总胆汁酸含量的检测提供了检测效率更高的3α-羟基类固醇脱氢酶，在临床检验中具有巨大的应用价值。
附图说明
图1是本发明新的3α-羟基类固醇脱氢酶G003的SDS-PAGE分析。
具体实施方式
为了使本发明的目的和技术方案更加清楚，下面对本发明的优选实施例进行详细的描述。要说明的是：以下实施例只用于对本发明进行进一步的说明，而不能理解为对本发明保护范围的限制。本领域的技术人员根据本发明的上述内容做出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。
实施例1新3α-羟基类固醇脱氢酶(G003)的基因设计和获取。
通过对现已报道的3α-羟基类固醇脱氢酶的序列进行比对分析，综合SDR超家族基因序列结构的特征，设计本发明所述的3α-羟基类固醇脱氢酶(G003)的基因序列，其序列如SEQ ID NO.2所示，由上海生工生物科技有限公司进行全基因合成，并克隆入pEGX-6p-1载体，酶切位点为BamH I/Xho I，并将该重组质粒转化大肠杆菌BL21。操作如下：-80℃中取出大肠杆菌BL21感受态细胞冰上放置；加入pEGX-6p-1/G003重组质粒2μL，冰上放置30min；热休克42℃，90秒；冰上放置2分钟；复苏，加入600μL LB培养基，37℃，150rpm，45min；吸取200μL培养基涂布于含有氨苄青霉素的LB平板培养基中；37℃培养过夜；挑取单菌落进行扩大培养并保种。
实施例2新的3α-羟基类固醇脱氢酶(G003)在大肠杆菌BL21中的表达。
接种pEGX-6p-1/G003/BL21菌种入无菌LB培养基中，37℃，180rpm培养；待OD600≈0.8时，加入终浓度为0.2mM的IPTG，16℃诱导12小时。8000rpm，5min收集菌体；按1L培养体系加30mL Lysis buffer的比例重悬菌体，超声破菌至澄清。12000rpm，20min。取上清；上清与Glutathione Sepharose 4B结合，4℃结合2h。轻轻垂直颠倒混悬；结合完毕后，5000rpm，5min沉淀填料。填料用4℃预冷PBS冲洗3-5个柱体积；加入PreScission Protease酶切缓冲液，加入PreScission Protease酶，4℃酶切过夜。酶切完毕后，将上清从层析柱中放出。
本发明NAD(H)依赖型3α-羟基类固醇脱氢酶G003的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，本发明3α-羟基类固醇脱氢酶G003的SDS-PAGE分析如图1所示。
实施例3新的3α-羟基类固醇脱氢酶(G003)活性检测。
配置pH 7.550mM Tris-HCl缓冲液测试酶活性。具体操作如下：在2mL比色皿中依次加入反应缓冲液、NAD+、酶，凋零后加入底物，在340nm处记录光吸收变化。根据NADH的标准曲线计算产物的生成量计算酶活性。酶活单位定义为：相应条件下，每分钟转化1μmol底物所需的酶量，定义为一个酶活单位U。
按上述方法对绿脓杆菌3α-羟基类固醇脱氢酶进行异源表达和活性检测。
表1.本发明所述3α-羟基类固醇脱氢酶与绿脓杆菌3α-羟基类固醇脱氢酶的比活力
Figure GDA0004093667530000051
检测结果显示，本发明新的NAD(H)依赖型3α-羟基类固醇脱氢酶能够催化胆汁酸C3位α-羟基的氧化反应，催化TCDCA的C3位α-羟基氧化生成Tauro-3-dehydro-CDCA，或者催化TU DC A的C3位α-羟基氧化生成Ta uro-3-d ehyd ro-UDC A，催化活性是绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)3α-羟基类固醇脱氢酶(Accession NO.WP_003109865.1)的12.18倍和15.06倍。本发明为总胆汁酸含量的检测提供了检测效率更高的3α-羟基类固醇脱氢酶，在临床检验中具有巨大的应用价值。
                         序列表
<110>  重庆第二师范学院
<120>  3α-羟基类固醇脱氢酶、编码基因及其在催化剂中的应用
<130>  20210420
<160>  2
<170>  SIPOSequenceListing 1.0
<210>  1
<211>  251
<212>  PRT
<213>  synthetic construct
<400>  1
Met Ile Asp Tyr Gly Met Ala Gly Lys Val Ala Leu Val Thr Gly Ala
1               5                   10                  15
Gly Gly Gly Ile Gly Arg Ala Thr Ala Leu Gly Phe Ala Arg Leu Gly
            20                  25                  30
Ala Ala Val Leu Val Cys Asp Val Asn Asp Glu Ala Gly Ala Glu Thr
        35                  40                  45
Val Ala Leu Ile Gly Ser Gln Gly Gly Lys Ala Ala Phe Gln His Cys
    50                  55                  60
Asp Val Ser Asp Pro Ala Gln Val Lys Ala Met Val Ala Ala Ala Val
65                  70                  75                  80
Ser Thr Phe Gly Gly Leu Asp Tyr Ala Phe Asn Asn Ala Gly Ile Asn
                85                  90                  95
Ser Ile Ala Ala Asn Glu Tyr Asp Asp Ala Thr Trp Ala Arg Ser Ile
            100                 105                 110
Asp Ile Asn Leu Thr Gly Val Met Leu Cys Met Arg Glu Glu Ala Glu
        115                 120                 125
Val Met Leu Arg Asn Gly Gly Gly Ala Ile Val Asn Thr Ala Ser Ile
    130                 135                 140
Asn Gly Leu Val Gly Asn Gly Ala Gln Pro Ala Tyr Thr Ala Ser Lys
145                 150                 155                 160
His Gly Val Val Gly Leu Thr Arg His Gly Ala Leu Arg Trp Ala Lys
                165                 170                 175
Gln Gly Ile Arg Val Asn Ala Val Cys Pro Gly Val Thr Asp Thr Ala
            180                 185                 190
Met Thr Ala Gln Ala Thr Ala Asn Pro Ala Ala Lys Ala Ala Ile Glu
        195                 200                 205
Gln Met Thr Pro Met Gly Arg Met Gly Gln Ala Glu Glu Ile Ala Ala
    210                 215                 220
Ala Val Leu Trp Leu Cys Ser Asp Ala Ala Ser Phe Val Thr Gly Gln
225                 230                 235                 240
Pro Leu Ala Val Asp Gly Gly Val Thr Ala Phe
                245                 250
<210>  2
<211>  756
<212>  DNA
<213>  synthetic construct
<400>  2
atgattgatt atggcatggc gggcaaagtt gcgctggtta ccggcgcggg cggcggcatc  60
ggccgtgcta ccgcgctggg tttcgcgcgt ctgggcgcgg cggttctggt ttgcgatgtt 120
aacgatgaag cgggcgcgga aaccgttgcg ctgatcggca gccagggtgg taaagcggcg 180
ttccagcact gcgatgttag cgatccggcg caggttaaag cgatggttgc ggcggcggtt 240
tctaccttcg gtggtctgga ttacgcgttc aacaacgcgg gcatcaactc catcgcggcg 300
aacgaatacg atgatgcgac ctgggcgcgt agcatcgata tcaacctgac cggtgtgatg 360
ctgtgcatgc gtgaagaagc ggaagttatg ctgcgtaacg gcggcggcgc gatcgtgaac 420
accgcgagca tcaacggcct ggttggtaac ggtgctcagc cggcgtacac cgcgtctaaa 480
cacggcgttg ttggtctgac tcgtcacggc gcgctgcgtt gggcaaaaca gggcatccgt 540
gttaacgctg tttgcccagg tgttactgat actgcaatga ccgctcaggc tactgctaat 600
ccggctgcga aagctgcaat tgaacagatg accccgatgg gtcgtatggg tcaggctgaa 660
gaaatcgctg cagctgttct gtggctgtgc agcgatgcgg cgagcttcgt taccggccag 720
ccgctggcgg ttgacggtgg cgtaactgcg ttctaa                           756

Claims (10)

1.一种3α-羟基类固醇脱氢酶，其序列如SEQ ID NO.1所示。
2.如权利要求1所述3α-羟基类固醇脱氢酶的编码基因，其序列如SEQ ID NO.2所示。
3.一种表达载体，其含有如权利要求2所述3α-羟基类固醇脱氢酶的编码基因。
4.一种重组菌，其被如权利要求3所述的表达载体转化；经表达载体转化的重组菌选自重组大肠杆菌。
5.一种酶蛋白表达盒，其包含如权利要求2所述3α-羟基类固醇脱氢酶的编码基因。
6.一种重组细胞，其包含如权利要求5所述酶蛋白表达盒。
7.如权利要求1所述3α-羟基类固醇脱氢酶或如权利要求2所述3α-羟基类固醇脱氢酶的编码基因在总胆汁酸含量检测中的应用,所述应用用于非疾病的诊断和治疗；所述3α-羟基类固醇脱氢酶或3α-羟基类固醇脱氢酶的编码基因在催化胆汁酸C3位α-羟基的氧化反应中的应用，所述应用用于非疾病的诊断和治疗。
8.一种催化剂，其有效成分包含如权利要求1所述3α-羟基类固醇脱氢酶。
9.一种催化胆汁酸C3位α-羟基氧化反应的方法，其特征在于：催化剂包含如权利要求1所述3α-羟基类固醇脱氢酶，所述方法用于非疾病的诊断和治疗。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于：所述催化胆汁酸C3位α-羟基氧化反应为催化TCDCA的C3位α-羟基氧化生成Tauro-3-dehydro-CDCA或催化TUDCA的C3位α-羟基氧化生成Tauro-3-dehydro-UDCA。
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