CN112322597A

CN112322597A - 一种羰基还原酶突变体及其应用

Info

Publication number: CN112322597A
Application number: CN202011318357.6A
Authority: CN
Inventors: 马向辉; 宋丽; 侯伟宏; 薛洪泽
Original assignee: Tianjin Famoxi Biomedical Technology Co Ltd
Current assignee: Tianjin Famoxi Biomedical Technology Co Ltd
Priority date: 2020-11-23
Filing date: 2020-11-23
Publication date: 2021-02-05
Anticipated expiration: 2040-11-23
Also published as: CN112322597B

Abstract

本发明涉及一种羰基还原酶突变体及其应用，该突变体的氨基酸序列具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列中的至少1个突变位点：第32位，第57位，第68位，第127位，第204位，第230位，第262位，第321位；且优选的第32位S突变为A、V、L，第57位P突变为H，第68位H突变为P，第127位F突变为T、M，第204位G突变为F、Y，第230位V突变为Q、N，第262位R突变为I、L、V，第321位I突变为Q、N。具有上述至少一个突变位点或者保留上述突变位点且与其具有90％以上氨基酸序列同源性的羰基还原酶突变体，其酶活力和稳定性大大提高。

Description

一种羰基还原酶突变体及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种可以高活性催化还原羰基类化合物的羰基还原酶突变体及其编码基因及应用。

背景技术

生物催化技术是利用酶或微生物细胞作为生物催化剂进行催化反应的技术。酶作为生物催化剂具有许多优点：酶催化反应一般在常温、常压和近于中性条件下进行，副反应少、选择性强，所以投资少、能耗少且操作安全高；生物催化剂具有极高的催化效率和反应速度，已经在绿色化学和医药领域广泛的应用。其中酶作为一种常见的生物催化剂，在生物催化过程中具有具足轻重的作用。

羰基还原酶(carbonyl reductase)属于氧化还原酶的第一亚类，又可称作酮还原酶、醇脱氢酶。根据其典型的序列和结构组成特征，立体选择性羰基还原酶又分为短链(SDRs)、中链脱氢酶/还原酶家族(MDRs)以及醛酮还原酶家族(AKRs)。

目前，大量研究已经开发了多种立体选择性羰基还原酶，但其中大多数对潜手性羰基底物的酶催化还原活性较低。此外，大部分的立体选择性羰基还原酶还存在半衰期短、热稳定性差的缺陷。

进一步地，针对于本发明中的野生酶，缺少相关研究报道，且该酶针对式I所示类型底物催化活性低，自身稳定性也较差。因此，影响以式1所示底物为中间体的重要手性医药中间体的生产，导致以式1所示底物为重要手性医药中间体的生产成本过高，无法规模化生产。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种高活性催化式I所示化合物，热稳定性高的羰基还原酶突变体及其编码基因，及含有所述编码基因的重组载体及基因工程菌，以及所述羰基还原酶突变体的制备方法及其在制备手性中间体中的应用。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案是：一种羰基还原酶突变体，所述羰基还原酶突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列发生突变的氨基酸序列，所述羰基还原酶突变体的氨基酸序列具有SEQ ID NO：1中的至少一个突变位点：第32位，第57位，第68位，第127位，第204位，第230位，第262位，第321位；且第32位S突变为A、V或L；第57位P突变为H；第68位H突变为P；第127位F突变为T、M；第204位G突变为F、Y；第230位V突变为Q、N；第262位R突变为I、L或V；第321位I突变为Q、N。或者羰基还原酶突变体的氨基酸序列具有发生突变的氨基酸序列中的突变位点，且与发生突变的氨基酸序列具有90％以上同源性的氨基酸序列。

其中，SEQ ID NO：1为Candida parapsilosis(Yeast)野生型羰基还原酶的氨基酸序列，其基因序列如SEQ ID NO：2所示。“野生型”是指在自然界发现的形式。例如，天然存在的或野生型的多肽或多核苷酸序列是存在于生物体中的序列，能够从自然界来源中分离并且没有被人为操作有意修饰。这些基因表达后得到的酶，具有对某些底物的催化活力低，热稳定性较差的特点。

本发明通过理性设计(在了解蛋白质的空间结构的基础上，通过定点突变或其它方法改变蛋白质分子中的个别氨基酸)以及重叠延伸PCR、重组PCR、大引物PCR和环状质粒PCR等方法对其进行突变，从而获得该羰基还原酶基因突变文库。通过酶活力检测方法高通量筛选高活性突变株，并突变后高活性羰基还原酶基因进行鉴定。

作为优选，筛选出的高活性羰基还原酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。

本发明还提供了一种用于编码如SEQ ID NO：3所示羰基还原酶突变体的DNA分子，所述DNA分子的核苷酸序列如式SEQ ID NO：4所示。

本发明还提供了一种羰基还原酶突变体基因的重组质粒，其可通过本领域常规方法将本发明的羰基还原酶突变体基因的核苷酸序列连接于各种原核表达载体或真核表达载体上构建而成。如pGEX，pMAL，pET系列等原核表达载体以及真核表达载体，更优选地选自pET系列。本发明的一个实施例中所使用的质粒为pET-24a。

本发明还提供一种用于生产所述的羰基还原酶突变体的基因工程菌，所述基因工程菌中包含本发明所述的羰基还原酶突变体基因或本发明所述的重组载体。上述基因工程菌的宿主细胞优选为大肠埃希氏菌(Escherichia coli BL21(DE3))。

本发明还提供一种制备所述羰基还原酶突变体的方法，包括发酵培养该基因工程菌，以及收集和制备重组羰基还原酶。

上述方法包括在一定生产罐发酵条件下，进行工业化制备所述重组羰基还原酶的步骤；所述的生产罐发酵条件优选：DO 30％以上，空气流量1:1-2vvm。

本发明所述的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示羰基还原酶突变体在催化还原羰基类化合物制备手性中间体中的应用，所述羰基类化合物的结构通式如式I所示，

(式I)；其中，R₁选自H、OH、CH₂OH、CH₂OHCHOH、SH、COOH、CH₃、CH₂CH₃；R₂选自H、OH、SH、CH₃、CH₂CH₃。

作为优选，当R₁为OH，R₂为OH时，羰基还原酶突变体的酶活为25U/mg，而野生型羰基还原酶则对这类底物的酶活为5U/mg。此外，这种酶突变体在40℃时，半衰期大于48小时，而野生型酶在相同条件下半衰期只有16小时。

本发明同现有技术相比具有以下优点及效果：

1、本发明通过酶活性检测方法高通量筛选高活性突变株，获得了一种催化活性高、耐热性较好、半衰期长的羰基还原酶突变体，其可用于式I所示醛类化合物的还原，制备手性醇类医药中间体。

2、本发明SEQ ID NO：3所示的羰基还原酶突变体，具有优良的催化活力，其所催化的反应简单温和，无废物排放，反应转化率高，具有较好的应用前景。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以下实施例是对本发明的解释而本发明并不局限于以下实施例。

实施例1：野生型羰基还原酶基因工程菌的建立

根据NCBI收录的Candida parapsilosis(Yeast)羰基还原酶野生型基因序列(GenBank:JQ659192.1)(如SEQ ID NO：2所示)进行序列优化后人工合成全基因片段，并经基因合成公司通过NdeI和BamHI内切酶将基因插入pET-24a质粒中，将连接后的载体转入大肠杆菌BL21(DE3)中建立羰基还原酶基因工程菌。

实施例2：羰基还原酶突变体基因的获得

Candida parapsilosis(Yeast)该酶野生型基因的三维结构，目前尚未被揭示。但本发明通过对野生型基因序列(SEQ ID NO：2)进行Blast比对发现，其与Komagataellaphaffii(strain GS115/ATCC 20864)(Yeast)(Pichia pastoris)来源的线粒体醇脱氢酶同工酶Ⅲ(GenBank:CAY69102.1,PDB:5YAT)一致性为77.3％。因此，参考该醇脱氢酶的三维结构进行分析，通过Docking进行式I底物(R₁为羟基，R₂为手性取代基—S型羟基)与蛋白质的结合模拟，最后通过Pymol分析，选择有可能与底物和NAD结合相关、与NADPH质子传递相关的氨基酸作为突变氨基酸。

除上述理性设计外，本发明同时利用易错PCR随机突变的方法，对上述野生型羰基还原酶进行了蛋白质工程改造。一般来说，易错PCR可以通过DNA聚合酶进行目的基因扩增时，调整反应条件(如提高镁离子浓度、加入锰离子、改变体系中四种的dNTP浓度或运用低保真度DNA聚合酶等)来改变扩增过程中的突变频率，从而以一定的频率向目的基因中随机引入突变，获得蛋白质分子的随机突变体。

进一步地，本发明采用较低保真度的Taq聚合酶，同时利用Mn²⁺替代天然辅助因子Mg²⁺增加易错概率。

50μL PCR体系如下:

其中：羰基还原酶模板基因，为按照实施例1的方法PCR扩增羰基还原酶基因并将基因插入至pET-24a质粒中所构建；引物设计，本发明根据实施例1中构建重组质粒中目的基因的上下游序列设计。

PCR反应条件为：95℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火40s，72℃延伸40s，共35个循环；72℃继续延伸10min，冷却至4℃。

所得PCR扩增产物，连接至pET-24a载体，并转入之大肠杆菌BL21(DE3)中建立羰基还原酶基因突变文库。

利用大肠杆菌BL21(DE3)为宿主，pET-24a质粒为载体，表达扩展羰基还原酶突变体。

其中，所述羰基还原酶突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列发生突变的氨基酸序列，所述羰基还原酶突变体的氨基酸序列具有SEQ ID NO：1中的至少一个突变位点：第32位，第57位，第68位，第127位，第204位，第230位，第262位，第321位；且第32位S突变为A、V或L；第57位P突变为H；第68位H突变为P；第127位F突变为T、M；第204位G突变为F、Y；第230位V突变为Q、N；第262位R突变为I、L或V；第321位I突变为Q、N。

进一步地，本发明以实施例5所述酶活力检测方法高通量筛选高活性突变株。对突变后高活性羰基还原酶基因进行鉴定，筛选出的高活性羰基还原酶突变体基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，相应的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。

实施例3：在摇瓶中小规模生产羰基还原酶突变体

将包含实施例1、2构建重组质粒的大肠杆菌(含突变的羰基还原酶基因)，接种到含卡那霉素(50μg/mL)的100mL LB培养基中(蛋白胨10g/L，酵母抽提物5g/L，NaCl 10g/L，pH7.2)。于摇床中培养，37℃、250rpm摇动，培养16小时。然后按1:100比例转接于100mL含卡那霉素的LB培养基中，置于同样条件下振荡培养，定时测量菌液在600nm下的吸光值(OD₆₀₀)，以监测菌体生长密度。当培养物的OD₆₀₀＝0.6～0.8时，加入终浓度1mM的异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)来诱导目的羰基还原酶基因表达，诱导培养过夜(≥16小时)。10000rpm、4℃离心10min，弃上清，细胞沉淀以预冷的50mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)按200g/L重悬后，超声破碎，然后13000rpm、4℃离心30min，收集上清，即粗酶液，储存于-20℃。

实施例4：羰基还原酶突变体的发酵生产

发酵方案：将实施例1、实施例2构建的重组大肠杆菌(含突变的羰基还原酶基因)，单个微生物菌落接种于120mL LB培养基中(含卡那霉素50μg/mL)，37℃、250rpm震荡培养过夜(≥5小时)，然后在15L发酵罐中发酵：种子液按2％的接种量接入6L发酵培养基，发酵液通过加入氨水维持pH7.0-7.2，罐温37℃，搅拌转速300-900rpm，过程中控制溶氧30％左右，空气流量1:1～2vvm。培养8小时后加入IPTG(终浓度1mmol/L)诱导羰基还原酶的表达，罐温调整至22℃，继续发酵12-16小时。发酵过程中需加入补料液(葡萄糖200g/L，酵母提取物100g/L，pH7.2)维持培养物的生长。发酵结束后将培养物直接用高压均质机匀浆破碎。破碎后的发酵液，加入终浓度为2g/L的聚乙烯亚胺和150g/L的硅藻土，搅拌30分钟。絮凝沉降结束后，用铺有硅藻土的滤布过滤。过滤后的酶液用超滤膜过滤浓缩后，制备得到羰基还原酶粗酶液并于-20℃保存。

实施例5：羰基还原酶突变体酶活力的测定

羰基还原酶酶活力测定体系如下：

50mM Tris-HCl缓冲溶液，10mM式I所示底物，7.5mM NAD⁺，调节pH7.5，定容至270μL，混匀后加入96孔板。加入羰基还原酶粗酶液或其稀释液30μL并混匀，然后放入酶标仪，40℃反应并检测340nm光吸收。

酶活力定义：在上述条件下，每分钟催化消耗1μmol的NAD⁺所需的酶量定义为1个酶活单位。

式I为羰基还原酶突变体酶活力检测的底物，其中：R₁选自H、OH、CH₂OH、CH₂OHCHOH、SH、COOH、CH₃、CH₂CH₃；R₂选自H、OH、SH、CH₃、CH₂CH₃。

其中，氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示的羰基还原酶突变体对式I所示部分底物的酶活力测定结果如表1所示。

表1

*N.D.为未检测到酶活力

实施例6：温度对羰基还原酶突变体稳定性的影响

分别取20mL野生和突变的羰基还原酶粗酶液，于不同温度(20～60℃，温度间隔10℃)孵育4、8、12、16、24、48小时，然后冰浴冷却，按照实施例5中的方法测定残余酶活。残余酶活降至原始酶活50％左右的时间，为酶在该温度下的半衰期，以此确定羰基还原酶的温度稳定性。

表2给出了野生羰基还原酶和突变体(SEQ ID NO：3)在不同温度时的酶活半衰期：其中野生羰基还原酶在40℃时，半衰期约16h；而羰基还原酶突变体在40℃半衰期则大于48h。

表2野生羰基还原酶及羰基还原酶突变体在不同温度时半衰期

保温温度	野生羰基还原酶	羰基还原酶突变体
			20℃	>48h	>48h
30℃	24h	>48h
			40℃	16h	>48h
50℃	<4h	16h
			60℃	<4h	4h

此外，需要说明的是，本说明书中所描述的具体实施例，其零、部件的形状、所取名称等可以不同。凡依本发明专利构思所述的构造、特征及原理所做的等效或简单变化，均包括于本发明专利的保护范围内。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离本发明的结构或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。

序列表

<110> 天津法莫西生物医药科技有限公司

<120> 一种羰基还原酶突变体及其应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 349

<212> PRT

<213> 野生羰基还原酶蛋白序列(Candida parapsilosis YeastCarbonyl reductaseCPCR1GenBank: AFD29185.1)

<400> 1

Met Pro Glu Ile Pro Lys Thr Gln Lys Ala Val Val Phe Glu Thr Ser

1 5 10 15

Gly Gly Lys Leu Glu Tyr Lys Asp Ile Pro Val Pro Lys Pro Lys Ser

20 25 30

Asn Glu Leu Leu Ile Asn Val Lys Tyr Ser Gly Val Cys His Thr Asp

35 40 45

Leu His Ala Trp Lys Gly Asp Trp Pro Leu Asp Thr Lys Leu Pro Leu

50 55 60

Val Gly Gly His Glu Gly Ala Gly Val Val Val Gly Met Gly Asp Asn

65 70 75 80

Val Lys Gly Trp Glu Ile Gly Asp Tyr Ala Gly Ile Lys Trp Leu Asn

85 90 95

Gly Ser Cys Leu Asn Cys Glu Phe Cys Glu Gln Gly Ala Glu Pro Asn

100 105 110

Cys Pro Gln Ala Asp Leu Ser Gly Tyr Thr His Asp Gly Ser Phe Glu

115 120 125

Gln Tyr Ala Thr Ala Asp Ala Val Gln Ala Ala Arg Ile Pro Lys Asn

130 135 140

Ala Asp Leu Ala Lys Ala Ala Pro Ile Leu Cys Ala Gly Val Thr Val

145 150 155 160

Tyr Lys Ala Leu Lys Thr Ala Gln Leu Lys Ala Gly Glu Trp Val Cys

165 170 175

Ile Ser Gly Ala Gly Gly Gly Leu Gly Ser Leu Ala Ile Gln Tyr Ala

180 185 190

Ile Ala Met Gly Tyr Arg Val Ile Gly Ile Asp Gly Gly Ala Glu Lys

195 200 205

Gly Glu Tyr Ile Lys Ser Leu Gly Ala Glu Ala Tyr Ile Asp Phe Thr

210 215 220

Lys Glu Lys Asp Ile Val Glu Ala Val Lys Lys Ala Thr Asn Gly Gly

225 230 235 240

Pro His Gly Val Ile Asn Val Ser Val Ser Glu Lys Ala Ile Asn Gln

245 250 255

Ser Val Glu Tyr Val Arg Pro Leu Gly Lys Val Val Leu Val Gly Leu

260 265 270

Pro Ala Gly Ser Lys Val Val Ala Pro Val Phe Asp Ala Val Val Lys

275 280 285

Ser Val Glu Ile Lys Gly Ser Tyr Val Gly Asn Arg Lys Asp Thr Gln

290 295 300

Glu Ala Leu Asp Phe Phe Ala Arg Gly Lys Val Asn Cys Gln Ile Lys

305 310 315 320

Ile Val Gly Leu Ser Glu Leu Pro Glu Val Phe Lys Leu Met Glu Glu

325 330 335

Gly Lys Ile Leu Gly Arg Tyr Val Leu Asp Thr Ser Lys

340 345

<210> 2

<211> 1212

<212> DNA

<213> 野生羰基还原酶核苷酸序列(Candida parapsilosis YeastCarbonylreductase CPCR1GenBank: JQ659192.1)

<400> 2

atgccaattg gctcaacaca tttctttcat ttcaaaagct ttattagatc aattgcagtt 60

aacaaagtaa ctactattcc aattaaagcg ttcactacta ctacaactaa aactaaaact 120

aaaattacaa ctacaactac aacaaacagt tttatatcta caatgccaga aattccaaag 180

acccaaaaag ctgttgtgtt tgaaacaagc ggaggtaaat tagaatacaa ggatattcca 240

gtccccaaac caaaatcaaa tgaattgttg attaatgtca agtactctgg tgtgtgccat 300

actgatttac acgcttggaa aggtgattgg ccattggaca ccaaattacc ccttgttggt 360

ggtcatgagg gtgctggtgt tgttgttggc atgggtgata atgtcaaagg atgggaaatt 420

ggtgattatg ctggtatcaa atggttgaat ggctcttgtt tgaattgtga attttgtgaa 480

caaggagctg aaccaaattg ccctcaagct gacttgtctg gttacaccca tgatggttca 540

ttcgaacaat atgctactgc tgatgctgtc caagctgcta gaatccccaa gaatgctgat 600

ttggctaaag ctgctccaat tttgtgtgct ggtgttactg tatacaaggc tttgaagact 660

gctcaattga aggctggtga atgggtttgt atttctggtg ctggtggtgg attgggttca 720

ttggctattc aatacgctat tgccatgggt tacagagtta ttggtatcga tggaggtgct 780

gaaaagggtg aatacattaa atctttagga gctgaagctt atattgactt taccaaggaa 840

aaagatattg tcgaagctgt taaaaaggca actaatggtg gcccacatgg agttatcaat 900

gtgtctgttt ccgaaaaggc catcaatcaa tcagttgaat atgttagacc attgggtaaa 960

gttgttcttg ttggtttacc agctggatcc aaagttgttg cccctgtttt cgatgctgtt 1020

gttaaatcag ttgaaattaa aggttcttat gttggtaaca gaaaggatac tcaagaggct 1080

ttggatttct ttgctagagg taaagtcaat tgtcaaatca agattgttgg tcttagtgaa 1140

ttaccagaag ttttcaaatt gatggaagaa ggtaagattt tgggaagata cgtacttgac 1200

accagcaagt aa 1212

<210> 3

<211> 349

<212> PRT

<213> 羰基还原酶突变体蛋白序列(Carbonyl reductase )

<400> 3

Met Pro Glu Ile Pro Lys Thr Gln Lys Ala Val Val Phe Glu Thr Ser

1 5 10 15

Gly Gly Lys Leu Glu Tyr Lys Asp Ile Pro Val Pro Lys Pro Lys Ala

20 25 30

Asn Glu Leu Leu Ile Asn Val Lys Tyr Ser Gly Val Cys His Thr Asp

35 40 45

Leu His Ala Trp Lys Gly Asp Trp His Leu Asp Thr Lys Leu Pro Leu

50 55 60

Val Gly Gly Pro Glu Gly Ala Gly Val Val Val Gly Met Gly Asp Asn

65 70 75 80

Val Lys Gly Trp Glu Ile Gly Asp Tyr Ala Gly Ile Lys Trp Leu Asn

85 90 95

Gly Ser Cys Leu Asn Cys Glu Phe Cys Glu Gln Gly Ala Glu Pro Asn

100 105 110

Cys Pro Gln Ala Asp Leu Ser Gly Tyr Thr His Asp Gly Ser Thr Glu

115 120 125

Gln Tyr Ala Thr Ala Asp Ala Val Gln Ala Ala Arg Ile Pro Lys Asn

130 135 140

Ala Asp Leu Ala Lys Ala Ala Pro Ile Leu Cys Ala Gly Val Thr Val

145 150 155 160

Tyr Lys Ala Leu Lys Thr Ala Gln Leu Lys Ala Gly Glu Trp Val Cys

165 170 175

Ile Ser Gly Ala Gly Gly Gly Leu Gly Ser Leu Ala Ile Gln Tyr Ala

180 185 190

Ile Ala Met Gly Tyr Arg Val Ile Gly Ile Asp Phe Gly Ala Glu Lys

195 200 205

Gly Glu Tyr Ile Lys Ser Leu Gly Ala Glu Ala Tyr Ile Asp Phe Thr

210 215 220

Lys Glu Lys Asp Ile Gln Glu Ala Val Lys Lys Ala Thr Asn Gly Gly

225 230 235 240

Pro His Gly Val Ile Asn Val Ser Val Ser Glu Lys Ala Ile Asn Gln

245 250 255

Ser Val Glu Tyr Val Val Pro Leu Gly Lys Val Val Leu Val Gly Leu

260 265 270

Pro Ala Gly Ser Lys Val Val Ala Pro Val Phe Asp Ala Val Val Lys

275 280 285

Ser Val Glu Ile Lys Gly Ser Tyr Val Gly Asn Arg Lys Asp Thr Gln

290 295 300

Glu Ala Leu Asp Phe Phe Ala Arg Gly Lys Val Asn Cys Gln Ile Lys

305 310 315 320

Gln Val Gly Leu Ser Glu Leu Pro Glu Val Phe Lys Leu Met Glu Glu

325 330 335

Gly Lys Ile Leu Gly Arg Tyr Val Leu Asp Thr Ser Lys

340 345

<210> 4

<211> 1212

<212> DNA

<213> 羰基还原酶突变体基因核苷酸序列(Carbonyl reductase )

<400> 4

atgccaattg gctcaacaca tttctttcat ttcaaaagct ttattagatc aattgcagtt 60

aacaaagtaa ctactattcc aattaaagcg ttcgcgacta ctacaactaa aactaaaact 120

aaaattacaa ctacaactac aacaaacagt tttatatcta caatgccaca tattccaaag 180

acccaaaaag ctgttgtgtt tccgacaagc ggaggtaaat tagaatacaa ggatattcca 240

gtccccaaac caaaatcaaa tgaattgttg attaatgtca agtactctgg tgtgtgccat 300

actgatttac acgcttggaa aggtgattgg ccattggaca ccaaattacc ccttgttggt 360

ggtcatgagg gtgctggtac cgttgttggc atgggtgata atgtcaaagg atgggaaatt 420

ggtgattatg ctggtatcaa atggttgaat ggctcttgtt tgaattgtga attttgtgaa 480

caaggagctg aaccaaattg ccctcaagct gacttgtctg gttacaccca tgatggttca 540

ttcgaacaat atgctactgc tgatgctgtc caagctgcta gaatccccaa gaatgctgat 600

ttggctaaat ttgctccaat tttgtgtgct ggtgttactg tatacaaggc tttgaagact 660

gctcaattga aggctggtga atgggttcag atttctggtg ctggtggtgg attgggttca 720

ttggctattc aatacgctat tgccatgggt tacagagtta ttggtatcga tggaggtgct 780

gaagtgggtg aatacattaa atctttagga gctgaagctt atattgactt taccaaggaa 840

aaagatattg tcgaagctgt taaaaaggca actaatggtg gcccacatgg agttatcaat 900

gtgtctgttt ccgaaaaggc catcaatcaa tcagttgaat atgttagacc attgggtaaa 960

caggttcttg ttggtttacc agctggatcc aaagttgttg cccctgtttt cgatgctgtt 1020

gttaaatcag ttgaaattaa aggttcttat gttggtaaca gaaaggatac tcaagaggct 1080

ttggatttct ttgctagagg taaagtcaat tgtcaaatca agattgttgg tcttagtgaa 1140

ttaccagaag ttttcaaatt gatggaagaa ggtaagattt tgggaagata cgtacttgac 1200

accagcaagt aa 1212

Claims

1.一种羰基还原酶突变体，其特征在于，所述羰基还原酶突变体的氨基酸序列为SEQID NO：1所示的氨基酸序列发生突变的氨基酸序列，所述羰基还原酶突变体的氨基酸序列具有SEQ ID NO：1中的至少一个突变位点：第32位，第57位，第68位，第127位，第204位，第230位，第262位，第321位；且第32位S突变为A、V或L；第57位P突变为H；第68位H突变为P；第127位F突变为T、M；第204位G突变为F、Y；第230位V突变为Q、N；第262位R突变为I、L或V；第321位I突变为Q、N。

2.根据权利要求1所述的一种羰基还原酶突变体，其特征在于，所述羰基还原酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。

3.一种用于编码权利要求2所述羰基还原酶突变体的DNA分子，其特征在于，所述DNA分子的核苷酸序列为SEQ ID NO：4。

4.一种含有权利要求3所述DNA分子的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体以pET-24a为重组质粒。

5.一种用于制备权利要求2所述羰基还原酶突变体的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌含有权利要求4所述的重组表达载体，所述基因工程菌的宿主细胞为大肠埃希氏菌(Escherichia coli BL21(DE3))。

6.一种制备权利要求2所述羰基还原酶突变体的方法，其特征在于，包括如下步骤：培养权利要求5所述的基因工程菌，获得重组表达的羰基还原酶突变体。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，还包括在发酵条件下，制备所述羰基还原酶突变体的步骤。

8.一种权利要求2所述羰基还原酶突变体在催化还原羰基类化合物制备手性中间体中的应用，其特征在于，所述羰基类化合物的结构通式如式I所示，

其中，R₁选自H、OH、CH₂OH、CH₂OHCHOH、SH、COOH、CH₃、CH₂CH₃；R₂选自H、OH、SH、CH₃、CH₂CH₃。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述R₁为OH，R₂为OH。