CN115927226A - 醇氧化酶PcAOX的突变体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种醇氧化酶PcAOX的突变体及其应用，所述醇氧化酶PcAOX的突变体的氨基酸序列如SEQIDNo.3所示。本发明通过对醇氧化酶PcAOX的三维结构进行多方面对比分析，分析关键氨基酸位点并设计一系列突变体，得到了一个不仅具有醇氧化酶活性，且具有转酰基活性的醇氧化酶PcAOX的突变体，利用该突变体，使得合成某些特殊产物成为可能，为绿色环保合成化工原料提供了新思路和技术基础。

Description

醇氧化酶PcAOX的突变体及其应用

技术领域

本发明属于酶工程技术领域，具体地说，本发明涉及一种醇氧化酶PcAOX的突变体及其应用。

背景技术

醇氧化酶(Alcoholoxidases，AOX，EC1.1.3.13)是一类含有黄素腺嘌呤二核苷酸(FlavinAdeninDinucleotide，FAD)辅因子的氧化还原酶，属于GMC(glucose-methanol-choline)氧化还原酶超家族。其能利用氧气催化氧化醇类生成相应的醛或者酮，并产生过氧化氢。其产物对于生物化工、食品加工等领域具有重要意义。

酰基转移反应(Acyltransferreaction)是一类酰基供体上的酰基转移到酰基受体上，形成新的酯或者酰胺的反应，该反应广泛存在于生物体的生命代谢活动中，同时在有机合成，生物合成等领域具有重要应用。例如通过4-氯苯甲酸甲酯为酰基受体，4-(2-氨乙基)吗啉合成抗抑郁重要药物吗氯贝胺(moclobemide)。

PcAOX是来源于Phanerochaetechrysosporium的醇氧化酶。2014年因其具有能够氧化甘油生成甘油醛的能力而被报道，随后MarcoW.Fraaije等人针对这一特性对该酶进行了理性改造以增强其催化氧化甘油的能力，同时还发现了该酶具有催化功能上的混杂型，不仅能催化甲醇、乙醇等氧化生成过氧化氢，也能催化其他线性多元醇的多步氧化生成相应的醛酸或者二元酸。

目前并未发现PcAOX具有转酰基活性。

发明内容

基于此，本发明的目的之一在于提供一种醇氧化酶PcAOX的突变体，该突变体在具备醇氧化酶活力的同时，还具有转酰基活力。

实现上述发明目的的具体技术方案包括如下：

一种醇氧化酶PcAOX的突变体，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。

本发明还提供了上述醇氧化酶PcAOX的突变体的编码基因。

在其中一些实施例中，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

本发明还提供了上述醇氧化酶PcAOX的突变体、和/或所述编码基因在催化酰基转移反应中的应用。

本发明还提供了插入有上述编码基因的重组表达载体。

本发明还提供了转入有上述重组表达载体的重组工程菌株。

本发明还提供了上述重组表达载体、或上述重组工程菌株在催化酰基转移反应中的应用。

本发明还提供了一种催化酰基转移反应的方法，使用上述醇氧化酶PcAOX的突变体进行催化反应。

在其中一些实施例中，所述催化反应为：催化苯甲醇与乙酸乙烯酯生成乙酸苯甲酯。

在其中一些实施例中，所述催化反应为：催化苯乙醇与乙酸乙烯酯生成乙酸苯乙酯。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明通过对醇氧化酶PcAOX的三维结构进行多方面对比分析，分析关键氨基酸位点并设计一系列突变体，得到了一个不仅具有醇氧化酶活性，且具有转酰基活性的醇氧化酶PcAOX的突变体，利用该突变体，使得合成某些特殊产物成为可能，为绿色环保合成化工原料提供了新思路和技术基础。

附图说明

图1为本发明实施例2中野生型醇氧化酶PcAOX纯化过程中各组分的SDS-PAGE结果，其中，泳道M：marker；泳道1：总菌破碎液；泳道2：破碎后上清液；泳道3：破碎后沉淀；泳道4：纯化穿过液；泳道5～7：不同浓度的纯PcAOX酶液。

图2为本发明实施例2中醇氧化酶PcAOX突变体纯化过程中各组分的SDS-PAGE结果，其中，泳道M：marker；泳道1：PcAOX-VPN粗酶液；泳道2：PcAOX-VPN；沉淀；泳道3：PcAOX-VPN穿过液；泳道4：PcAOX-VPN纯酶液；泳道5：PcAOX-VPN粗酶液；泳道6：PcAOX-VPN沉淀；泳道7：PcAOX-VPN穿过液；泳道8：PcAOX-VPN纯酶液。

图3为本发明实施例3中过氧化氢的标准曲线。

图4为本发明实施例4中以苯甲醇为酰基受体的反应结果图。

图5为本发明实施例4中以苯乙醇为酰基受体的反应结果图。

图6为本发明实施例5中PcAOX突变体(PcAOX-VPN)的分子筛色谱图。

图7为本发明实施例5中PcAOX突变体(PcAOX-VPN)分子筛样品SDS-PAGE检测结果图，其中M为marker，泳道1-11分别为不同时间出峰样品。

图8为本发明实施例5中PcAOX突变体(PcAOX-VPN)的晶体初筛结果。

图9为本发明实施例5中PcAOX突变体(PcAOX-VPN)的晶体优化示意图。

图10为本发明实施例5中PcAOX突变体(PcAOX-VPN)的晶体逐步优化后的形状图。

图11为本发明实施例5中PcAOX突变体(PcAOX-VPN)的晶体的结构解析图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

在本发明中，发明人以PcAOX酶为目标蛋白，应用全基因合成技术获得了来源于Phanerochaetechrysosporium的PcAOX基因(GenbankID：HG425201)，并构建了pET28a(+)-PcAOX表达载体，以E.coliBL21(DE3)为表达宿主获得了PcAOX蛋白。发明人通过分析野生型醇氧化酶PcAOX(核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示，氨基酸序列如SEQ ID No.1所示)的三维结构，通过在数据库中进行结构对比分析，从该酶的催化活性中心进行结构与功能比对，分析发现其催化中心可能具有第二种活性，在经过多尺度序列对比后，认为可能是其紧窄的催化通道妨碍了转酰基活性的体现。因此，分析关键氨基酸位点并进行设计了一系列突变体，扩大原来的底物催化通道，使得催化中心暴露，使该酶转酰基活性展现出来。后续进行实验验证，对突变体性质进行表征，最终获得了具有醇氧化酶活性及催化酰基转移活性的双功能活性的突变体(以下命名为PcAOX-VPN，其核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，氨基酸序列如SEQ ID No.3所示)，并进一步分析了该突变体的三维结构。现有研究并未发现醇氧化酶PcAOX具有酰基转移酶的活性，因此这是该家族氧化酶类具有酰基转移酶活性的首次发现。这为多功能酶的发现、发掘、设计及研究提供了新的思路，也为进一步研究此类酶的结构功能关系提供研究基础。

野生型醇氧化酶PcAOX的氨基酸序列SEQ ID No.1MGHPEEVDVIVCGGGPAGCVVAGRLAYADPTLKVMLIEGGANNRDDPWVYRPGIYVRNMQRNGINDKATFYTDTMASSYLRGRRSIVPCANILGGGSSINFQMYTRASASDWDDFKTEGWTCKDLLPLMKRLENYQKPCNNDTHGYDGPIAISNGGQIMPVAQDFLRAAHAIGVPYSDDIQDLTTAHGAEIWAKYINRHTGRRSDAATAYVHSVMDVQDNLFLRCNARVSRVLFDDNNKAVGVAYVPSRNRTHGGKLHETIVKARKMVVLSSGTLGTPQILERSGVGNGELLRQLGIKIVSDLPGVGEQYQDHYTTLSIYRVSNESITTDDFLRGVKDVQRELFTEWEVSPEKARLSSNAIDAGFKIRPTEEELKEMGPEFNELWNRYFKDKPDKPVMFGSIVAGAYADHTLLPPGKYITMFQYLEYPASRGKIHIKSQNPYVEPFFDSGFMNNKADFAPIRWSYKKTREVARRMDAFRGELTSHHPRFHPASPAACKDIDIETAKQIYPDGLTVGIHMGSWHQPSEPYKHDKVIEDIPYTEEDDKAIDDWVADHVETTWHSLGTCAMKPREQGGVVDKRLNVYGTQNLKCVDLSICPDNLGTNTYSSALLVGEKGADLIAEELGLKIKTPHAPVPHAPVPTGRPATQQVR

野生型醇氧化酶PcAOX的核苷酸序列SEQ ID No.2ATGGGTCATCCGGAAGAAGTTGATGTTATCGTGTGCGGTGGTGGCCCGGCTGGCTGTGTCGTTGCTGGTCGCCTGGCTTACGCAGATCCGACCCTGAAAGTTATGCTGATTGAAGGCGGTGCCAACAATCGTGATGACCCGTGGGTTTATCGCCCGGGTATTTACGTCCGTAACATGCAGCGCAACGGCATCAATGATAAAGCCACCTTTTATACCGACACGATGGCAAGCTCTTACCTGCGTGGTCGTCGCAGCATTGTTCCGTGTGCCAACATCCTGGGCGGTGGCAGTTCCATTAATTTTCAGATGTATACCCGCGCATCAGCTTCGGATTGGGATGACTTCAAAACCGAAGGCTGGACGTGCAAAGACCTGCTGCCGCTGATGAAACGTCTGGAAAACTACCAAAAACCGTGTAACAACGATACCCACGGCTACGACGGTCCGATTGCGATCTCGAATGGTGGCCAGATTATGCCGGTCGCTCAAGATTTTCTGCGTGCCGCACATGCCATTGGTGTGCCGTATAGCGATGACATCCAGGATCTGACCACGGCTCATGGTGCGGAAATTTGGGCTAAATATATCAATCGTCATACCGGTCGTCGCAGCGATGCAGCTACCGCATACGTGCATTCTGTTATGGATGTCCAGGACAACCTGTTTCTGCGTTGTAATGCGCGTGTGTCCCGCGTTCTGTTCGATGACAACAATAAAGCCGTTGGCGTCGCGTATGTGCCGTCACGTAACCGTACCCACGGCGGCAAACTGCACGAAACGATTGTCAAAGCCCGCAAAATGGTGGTTCTGTCAAGCGGTACCCTGGGTACGCCGCAGATCCTGGAACGTAGCGGTGTTGGCAATGGTGAACTGCTGCGCCAACTGGGTATTAAAATCGTGTCTGATCTGCCGGGCGTTGGTGAACAGTATCAAGACCATTACACCACGCTGAGTATTTATCGTGTCAGCAACGAATCTATCACCACGGATGACTTTCTGCGTGGCGTCAAAGATGTGCAGCGCGAACTGTTCACCGAATGGGAAGTGTCTCCGGAAAAAGCCCGTCTGAGCTCTAATGCCATTGATGCAGGTTTTAAAATCCGCCCGACCGAAGAAGAACTGAAAGAAATGGGCCCGGAATTTAACGAACTGTGGAATCGCTACTTCAAAGATAAACCGGACAAACCGGTCATGTTTGGTAGCATTGTGGCGGGCGCCTATGCAGATCATACCCTGCTGCCGCCGGGTAAATACATCACGATGTTCCAGTATCTGGAATACCCGGCGTCACGTGGCAAAATTCACATCAAATCGCAAAACCCGTATGTTGAACCGTTTTTCGATTCAGGTTTCATGAACAACAAAGCTGACTTCGCGCCGATTCGTTGGTCGTACAAGAAAACCCGCGAAGTGGCCCGTCGCATGGATGCATTTCGTGGCGAACTGACGAGTCATCACCCGCGCTTCCATCCGGCATCCCCGGCGGCATGCAAAGATATTGACATCGAAACCGCAAAACAGATTTATCCGGATGGCCTGACGGTGGGCATTCACATGGGCAGTTGGCACCAACCGTCCGAACCGTACAAACACGATAAAGTTATCGAAGACATCCCGTACACCGAAGAAGATGACAAAGCTATTGATGACTGGGTTGCGGATCATGTCGAAACCACGTGGCACTCTCTGGGTACCTGTGCAATGAAACCGCGTGAACAGGGTGGCGTCGTGGATAAACGCCTGAACGTGTATGGTACGCAAAATCTGAAATGCGTTGATCTGAGTATCTGTCCGGACAACCTGGGCACCAATACGTACAGTTCCGCGCTGCTGGTTGGCGAAAAAGGTGCTGATCTGATTGCGGAAGAACTGGGCCTGAAAATCAAAACCCCGCACGCCCCGGTTCCGCACGCCCCGGTCCCGACGGGTCGCCCGGCTACGCAACAAGTCCGCCTCGAG

醇氧化酶PcAOX突变体的氨基酸序列SEQ ID No.3

MGHPEEVDVIVCGGGPAGCVVAGRLAYADPTLKVMLIEGGANNRDDPWVY

RPGIYVRNVPNNGINDKATFYTDTMASSYLRGRRSIVPCANILGGGSSINFQM

YTRASASDWDDFKTEGWTCKDLLPLMKRLENYQKPCNNDTHGYDGPIAISN

GGQIMPVAQDFLRAAHAIGVPYSDDIQDLTTAHGAEIWAKYINRHTGRRSDA

ATAYVHSVMDVQDNLFLRCNARVSRVLFDDNNKAVGVAYVPSRNRTHGGKL

HETIVKARKMVVLSSGTLGTPQILERSGVGNGELLRQLGIKIVSDLPGVGEQY

QDHYTTLSIYRVSNESITTDDFLRGVKDVQRELFTEWEVSPEKARLSSNAIDA

GFKIRPTEEELKEMGPEFNELWNRYFKDKPDKPVMFGSIVAGAYADHTLLPPG

KYITMFQYLEYPASRGKIHIKSQNPYVEPFFDSGFMNNKADFAPIRWSYKKTR

EVARRMDAFRGELTSHHPRFHPASPAACKDIDIETAKQIYPDGLTVGIHMGSW

HQPSEPYKHDKVIEDIPYTEEDDKAIDDWVADHVETTWHSLGTCAMKPREQ

GGVVDKRLNVYGTQNLKCVDLSICPDNLGTNTYSSALLVGEKGADLIAEELG

LKIKTPHAPVPHAPVPTGRPATQQVRLE

醇氧化酶PcAOX突变体的核苷酸序列SEQ ID No.4

ATGGGTCATCCGGAAGAAGTTGATGTTATCGTGTGCGGTGGTGGCCCGGCT

GGCTGTGTCGTTGCTGGTCGCCTGGCTTACGCAGATCCGACCCTGAAAGTT

ATGCTGATTGAAGGCGGTGCCAACAATCGTGATGACCCGTGGGTTTATCGC

CCGGGTATTTACGTCCGTAACGTTCCGAATAACGGCATCAATGATAAAGCC

ACCTTTTATACCGACACGATGGCAAGCTCTTACCTGCGTGGTCGTCGCAGC

ATTGTTCCGTGTGCCAACATCCTGGGCGGTGGCAGTTCCATTAATTTTCAGA

TGTATACCCGCGCATCAGCTTCGGATTGGGATGACTTCAAAACCGAAGGCT

GGACGTGCAAAGACCTGCTGCCGCTGATGAAACGTCTGGAAAACTACCAA

AAACCGTGTAACAACGATACCCACGGCTACGACGGTCCGATTGCGATCTCG

AATGGTGGCCAGATTATGCCGGTCGCTCAAGATTTTCTGCGTGCCGCACAT

GCCATTGGTGTGCCGTATAGCGATGACATCCAGGATCTGACCACGGCTCAT

GGTGCGGAAATTTGGGCTAAATATATCAATCGTCATACCGGTCGTCGCAGC

GATGCAGCTACCGCATACGTGCATTCTGTTATGGATGTCCAGGACAACCTG

TTTCTGCGTTGTAATGCGCGTGTGTCCCGCGTTCTGTTCGATGACAACAATA

AAGCCGTTGGCGTCGCGTATGTGCCGTCACGTAACCGTACCCACGGCGGC

AAACTGCACGAAACGATTGTCAAAGCCCGCAAAATGGTGGTTCTGTCAAG

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TTGGTGAACAGTATCAAGACCATTACACCACGCTGAGTATTTATCGTGTCA

GCAACGAATCTATCACCACGGATGACTTTCTGCGTGGCGTCAAAGATGTGC

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CTGAAAGAAATGGGCCCGGAATTTAACGAACTGTGGAATCGCTACTTCAA

AGATAAACCGGACAAACCGGTCATGTTTGGTAGCATTGTGGCGGGCGCCTA

TGCAGATCATACCCTGCTGCCGCCGGGTAAATACATCACGATGTTCCAGTAT

CTGGAATACCCGGCGTCACGTGGCAAAATTCACATCAAATCGCAAAACCC

GTATGTTGAACCGTTTTTCGATTCAGGTTTCATGAACAACAAAGCTGACTT

CGCGCCGATTCGTTGGTCGTACAAGAAAACCCGCGAAGTGGCCCGTCGCA

TGGATGCATTTCGTGGCGAACTGACGAGTCATCACCCGCGCTTCCATCCGG

CATCCCCGGCGGCATGCAAAGATATTGACATCGAAACCGCAAAACAGATTT

ATCCGGATGGCCTGACGGTGGGCATTCACATGGGCAGTTGGCACCAACCG

TCCGAACCGTACAAACACGATAAAGTTATCGAAGACATCCCGTACACCGA

AGAAGATGACAAAGCTATTGATGACTGGGTTGCGGATCATGTCGAAACCA

CGTGGCACTCTCTGGGTACCTGTGCAATGAAACCGCGTGAACAGGGTGGC

GTCGTGGATAAACGCCTGAACGTGTATGGTACGCAAAATCTGAAATGCGTT

GATCTGAGTATCTGTCCGGACAACCTGGGCACCAATACGTACAGTTCCGCG

CTGCTGGTTGGCGAAAAAGGTGCTGATCTGATTGCGGAAGAACTGGGCCT

GAAAATCAAAACCCCGCACGCCCCGGTTCCGCACGCCCCGGTCCCGACGG

GTCGCCCGGCTACGCAACAAGTCCGCCTCGAG

以下实施例中，所使用的材料包括：质粒pET28a(+)-PcAOX为申请人实验室保存；大肠杆菌TOP10和BL21(DE3)感受态细胞，购于唯地生物科技有限公司；无缝克隆试剂盒，购于中美泰和生物技术(北京)有限公司；质粒提取试剂盒，购于生工生物工程(上海)股份有限公司；预结晶试剂盒，购于美国Hampton Research公司；苯甲醇、苯乙醇、乙酸乙烯酯、乙酸乙酯等试剂，购于阿拉丁试剂有限公司。

以下结合附图和具体实施例来详细说明本发明。

实施例1PcAOX三维结构的分析及突变体工程菌的构建

PcAOX三维结构分析结果显示在其催化通道侧上方具有多个遮挡催化中心的氨基酸残基，这使得大分子底物无法进入PcAOX活性中心，且转酰基反应后的产物无法释放，推测原有的这一结构特性可能是其无法体现出转酰基活性的重要原因。

发明人在经过多尺度对比分析后，锁定了三个连续氨基酸位点M59、Q60、R61，在不改变其亲疏水性、带电荷前提下，设计了5个突变体M59A、Q60A、R61A、F101S和M59V-Q60P-R61N。

具体包括以下步骤：

(1)、引物设计

以PCR产物扩增的方法进行定点突变，在PcAOX成熟肽的固定位置上进行固定氨基酸的替换。使用SnapGene软件进行引物设计，涉及的主要引物如表1所示。

表1主要引物设计表

(2)、PcAOX野生型定点突变

根据表1所设计的引物，通过PCR反应对PcAOX野生型进行定点突变，突变后的PCR产物使用限制性核酸内切酶Dpn I进行消化。

定点突变PCR反应体系及程序、消化体系及程序分别如表2所示。

表2PCR及消化程序和体系

(3)、PcAOX突变体(M59A、Q60A、R61A、F101S和M59V-Q60P-R61N)工程菌构建

将上述经过模板消化后的PCR产物通过热激转化法转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中。具体步骤如下：将感受态细胞从-80℃冰箱取出置于冰上5-10min，待其融化后加入PCR产物2-3μL，于冰上静置30min。取出静置后的感受态细胞置于预热至42℃的水浴锅中，热激90s后立即置于冰上，2-3min后加入750μL的LB培养基，37℃、220rpm培养40min。培养完成后，1000rpm、3min离心去掉一定比例上清，将感受态细胞涂布于含有50ng/mL卡那霉素的LB固体平板上，培养12-16h。挑取单克隆进行菌落PCR反应以验证是否正确转化，将阳性克隆子进行测序以进一步验证突变是否正确。最后将构建完成的工程菌于-20℃保存于25％甘油中，备用。

实施例2PcAOX突变体的发酵与纯化

1、PcAOX突变体的发酵

将实施例1保存好的PcAOX突变体(M59A、Q60A、R61A、F101S和M59V-Q60P-R61N)工程菌(PcAOX野生型工程菌作为对照)进行划线活化，挑取单克隆于含有50ng/mL卡那霉素的LB培养基中，37℃、220rpm培养至OD₆₀₀为0.8～0.9左右时，以2％的接种量接种于100mLLB培养基中，培养至OD₆₀₀为0.9～1.0左右时，以5％的接种量接种于500mL含有1％(w/v)葡萄糖的TB培养基中，培养至OD₆₀₀为0.9～1.0时，添加终浓度为1mM的IPTG，于24℃、220rpm条件下诱导20h。

2、PcAOX野生型及其5个突变体的纯化

将发酵完成的培养基于4000rpm、4℃离心30min去掉上清，以1：10(w/v)的比例加入bufferA(50mM磷酸盐缓冲液，pH7.5，400mMNaCl，100mMKCl)悬浮，将细胞悬浮液于冰上超声破碎20min。将破碎液于12000rpm、4℃离心25min，弃去沉淀。将离心后的上清上载至使用bufferA充分平衡后的Ni亲核层析色谱柱上，先以40mM咪唑洗脱杂蛋白，再以500mM咪唑洗脱目的蛋白并收集，将洗脱的各组分进行SDS-PAGE检测及活性检测，最后将分子量大小正确，有活性的蛋白洗脱液合并进行脱盐柱换盐至buffer C(50mM磷酸盐缓冲液pH 7.5)，4℃保存备用。

实施例3PcAOX野生型及其5个突变体醇氧化酶活性

1、醇氧化酶活性测定反应体系如表3所示。

表3AOX活力测定反应体系

醇氧化酶活性测定公式如下：

其中：

ΔAbs₅₁₅----------------515nm下吸收值的差值

12.236/0.0474----------标准曲线的a/b值

V_体--------------------反应体系总体积(μL)

n_x--------------------酶液稀释倍数

Δt--------------------产生吸收值差值所对应的时间(min)

N--------------------酶液的蛋白浓度(mg/mL)

2、标准曲线如图3所示。

3、PcAOX野生型及其5个突变体的醇氧化酶活性结果如表4所示。

表4醇氧化酶活性测定结果

酶	底物	酶活力(U/mg)
			PcAOX野生型	乙醇	2.4
PcAOX突变体M59A	乙醇	2.1
			PcAOX突变体Q60A	乙醇	2.2
PcAOX突变体R61A	乙醇	1.4
			PcAOX突变体F101S	乙醇	1.8
PcAOX突变体M59V-Q60P-R61N	乙醇	1.9

由表4结果可知，PcAOX野生型及其5个突变体，均具有醇氧化酶活性。

实施例4PcAOX野生型及其5个突变体转酰基活性测定

1、催化转酰基反应体系的建立

以苯甲醇、苯乙醇为酰基受体，乙酸乙烯酯为酰基供体，PcAOX野生型及其5个突变体为酶，按照表5的反应体系表，分别构建催化转酰基反应体系。

表5反应体系表

组分	终浓度
		酶	5μM
酰基受体	20mM、40mM、100mM、200mM
		酰基供体	20mM
缓冲液	补足至1mL

2、气相色谱检测方法的建立

使用HP-5色谱柱，柱箱初始温度为80℃，8℃/min升温至150℃保持3min，15℃/min升温至300℃保持10min。检测器温度为280℃，进样口温度为250℃。

3、PcAOX突变体转酰基活性检测结果

(1)、以苯甲醇为酰基受体的反应式如下：

以苯乙醇为酰基受体的反应式如下：

(2)、PcAOX野生型及其5个突变体转酰基验证反应中，仅PcAOX突变体M59V-Q60P-R61N(PcAOX-VPN)具有转酰基活性。

以苯甲醇为酰基受体，PcAOX突变体(M59V-Q60P-R61N)为酶的反应结果如图4所示。在水相中催化以苯甲醇为酰基受体，乙酸乙烯酯为酰基供体生成乙酸苯甲酯的反应中，最佳条件为酰基受体与酰基供体摩尔比为1：5，最终最高转化率为35％。

以苯乙醇为酰基受体，PcAOX突变体(M59V-Q60P-R61N)为酶的反应结果如图5所示。以苯乙醇为酰基受体，乙酸乙烯酯为酰基供体生成乙酸苯乙酯的反应中，最佳条件为酰基受体与酰基供体摩尔比为1：5，最终最高转化率为51％。

本实施例的结果表明，PcAOX突变体M59V-Q60P-R61N(简称PcAOX-VPN)在具有醇氧化酶活力的同时，还具有转酰基活性。

实施例5PcAOX突变体(PcAOX-VPN)的晶体制备以及其结构解析

1、晶体生长初筛高纯度蛋白的制备

将镍柱纯化后的PcAOX突变体(PcAOX-VPN)进行换盐，使用10kDa截留超滤浓缩管进行浓缩，直至5mL以内。将浓缩完的蛋白加载至使用含有150mM NaCl的10mM Tris-HClpH8.0缓冲液平衡后的分子筛(200pg)中，PcAOX突变体的分子筛色谱图如图6所示，结果表明只有一个峰，且峰形对称，蛋白均一性高，为结晶初筛提供基础。待UV吸收值开始上升时，按照1mL/min的规格进行样品收集，标记好收集好的样品并进行SDS-PAGE检测。SDS-PAGE检测结果如图7所示，结果表明纯度达到90％以上，样品达到蛋白结晶初筛的要求。

2、PcAOX突变体(PcAOX-VPN)预结晶检测

使用预结晶试剂盒检测当前蛋白浓度是否适合进行晶体初筛，准确吸取400μL试剂盒A₁液与B₁液以及A₂液和B₂液于24孔悬滴板中，以蛋白：池液＝1：1(v/v)的比例进行点晶。30min后使用光学晶体显微镜观察液滴沉淀情况并根据试剂盒说明判断是否可以进行晶体初筛。

吸取晶体初筛试剂盒中的试剂于96孔坐滴板(共8*48个条件)中，每个条件60μL，将PcAOX突变体(PcAOX-VPN)蛋白液体置于晶体点样机器人盘中，按照设定好的程序进行点样。结果如图8和表6所示(图8中左边图表示结晶条件为Classic 1-12，中间图表示结晶条件为HR2112-23，右边图表示结晶条件为Classic 4-8)。

表6晶体初筛结果

由图8和表6的PcAOX突变体(PcAOX-VPN)的晶体初筛结果可知，晶体能够生长，但是晶体质量较差，未能达到衍射标准，与其他两个结晶条件相比，结晶条件HR2112-23的晶型较好，故而使用结晶条件HR2112-23进行晶体优化。

3、PcAOX突变体(PcAOX-VPN)晶体优化

在已结晶的条件下进行晶体晶型及大小的进一步优化，优化条件有两个，一是沉淀剂的浓度，二是池液的pH值。配制好各个条件下的优化试剂后，准确吸取150μL池液于24孔悬滴板中，在硅化玻璃片上进行点样，点样规格为1μL：1μL。点样完成的悬滴板至于18℃静置等待晶体生长。

晶体优化结果如图9和图10所示，从图9和图10可知，晶体由原本的颗粒小，形状不规则转变为具有边界清晰、形状规则且大小合适的晶体(1.6M硫酸铵、0.1M MES pH 7.5、8％(v/v)1,4-Dioxane)，满足进行X-ray衍射的要求。

4、PcAOX突变体(PcAOX-VPN)晶体结构的解析

PcAOX突变体(PcAOX-VPN)晶体的衍射数据如表7所示。

表7晶体衍射数据

PcAOX突变体(PcAOX-VPN)晶体的结构如图11所示。从图11可知，PcAOX突变体(PcAOX-VPN)除却突变位点外其余位置的结构信息是相同的，这表明这三个位点(M59V-Q60P-R61N)的突变没有改变该酶原本的结构，在M59V-Q60P-R61N三个位点发生突变后，其结果展示为能够一定程度上暴露内部的活性中心FAD活性基头。

对于转酰基活性的产生，该反应的催化机制还尚不明确，推测是由于该酶本身具有一个双功能的催化中心，未突变时通道狭窄，且活性中心没有暴露，故而无法催化转酰基活性，但是在经过M59V-Q60P-R61N三个位点突变后，活性中心的暴露使得该突变体表现出转酰基活力。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种醇氧化酶PcAOX的突变体，其特征在于，所述醇氧化酶PcAOX的突变体的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。

2.权利要求1所述醇氧化酶PcAOX的突变体的编码基因。

3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ IDNo.4所示。

4.权利要求1所述的醇氧化酶PcAOX的突变体、和/或权利要求2或3所述编码基因在催化酰基转移反应中的应用。

5.插入有权利要求2或3所述编码基因的重组表达载体。

6.转入有权利要求5所述重组表达载体的重组工程菌株。

7.权利要求5所述重组表达载体、或权利要求6所述重组工程菌株在催化酰基转移反应中的应用。

8.一种催化酰基转移反应的方法，其特征在于，使用权利要求1所述醇氧化酶PcAOX的突变体进行催化反应。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述催化反应为：催化苯甲醇与乙酸乙烯酯生成乙酸苯甲酯。

10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述催化反应为：催化苯乙醇与乙酸乙烯酯生成乙酸苯乙酯。

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