HU230075B1 - Fukozil-transzferáz gén - Google Patents

Fukozil-transzferáz gén Download PDF

Info

Publication number
HU230075B1
HU230075B1 HU0200394A HUP0200394A HU230075B1 HU 230075 B1 HU230075 B1 HU 230075B1 HU 0200394 A HU0200394 A HU 0200394A HU P0200394 A HUP0200394 A HU P0200394A HU 230075 B1 HU230075 B1 HU 230075B1
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
sequence
plant
dna
recombinant
cell
Prior art date
Application number
HU0200394A
Other languages
English (en)
Inventor
Friedrich Altmann
Original Assignee
Friedrich Altmann
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=3486087&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=HU230075(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Friedrich Altmann filed Critical Friedrich Altmann
Publication of HUP0200394A2 publication Critical patent/HUP0200394A2/hu
Publication of HUP0200394A3 publication Critical patent/HUP0200394A3/hu
Publication of HU230075B1 publication Critical patent/HU230075B1/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12N9/1051—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/18—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a glycosyl transferase, e.g. alpha-, beta- or gamma-cyclodextrins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/005—Glycopeptides, glycoproteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8218—Antisense, co-suppression, viral induced gene silencing [VIGS], post-transcriptional induced gene silencing [PTGS]

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Description

FakozjMrsaszferáz gén
A találmány isrgya fokozil-transzfí-tázl kódoló polinukteotidok. A tólálmá-ty tárgyát képezik továbbá ezen poltrmkieosidoií részleges szekvenciái, valamint a polínuklei^tidokkal r agy azokból származó DNS-sel transzfekáií rekonfbínáns gazdasejtek, növények és rovarok. vslattriu- ezen rendszerekhez előállítok: glíkoproteínek.
Á giikoprotemek szésbiárát-egységek nagy változatosságát és bonyolultságát mutatják, a szénhidrátok öszszetétele és elrendezése jellemző a különböző orgaruznu-snkra, A glikoproteinek ollgoszacharid-egységeirtek számos feladató van, például fontosak az anyagcsere szabályozásában, részt vesznek sejtek közti kölcsönhatások átvitelében, meghatározza». a kenngeahen leső febet gk kvrtugest idejét es döntő sze-encéK eoiiopok felismerésére autjgén-elienanyag reakciókban,
A glikoproteinek glisezriálasa az endoplazmadkus retiknlnrnban i EK) kezdődik, ahol az ollgoszacbaridök vagy aszparagin-oldalláncekhoz kötődnek N-glikozid-kőtésekkel. vagy szerín- vagy tteorílri-oldniláneokhoz Ö~ glikoziö-kötésekkei. Az N-kötött oligoszacharidok egy közös, pemaszueharid-egységböi álló magéi tartóltnázn&k, amely három mannóz es két N-acc-ii-glökózatnin egységből áll, A szénhidrátegységek további módosításához a fehérjék az PR-böl a Golgi-készülékhe trsnszporiálódnak. A glskoproteinek N-kötöt; oligoszacharidegységeínek szerkezetét azok konformációja határozza meg, és a Golgi-készülók (a feldolgozás helye} glikoztf· transzferázainak összetétele,,
Megmutatták, hogy egyes növény- és rovarsejtek Goigj-készüléscben ti peataszachaná-egység alkotta magot xílóz és «I-o-kőtésii fokóz helyettesíti [Leronge és mtsai., Plánt. Mól. Bioi. 38, 31-38. old. (1998); Rayonés mtsai., L. Exp. Bot. 49, 1463-1472. old. (1998)1. A keletkezett „MMXP”' heptaszsebartd a növények fö oSigoszaeharid típusa [Kurosaka és nttsas,, J, Bioi. Chem. 266, 4 i68-4172. old. ( 1991)], Ezáltal például a tömni peroxkláza, répa 3-fruktozídáza. Zfr/rártóü effoiírgiíBi iektlröe, valamint 3 tnsbméregben lévő foszfolipáz-Az. vagy rovarembriók rieuronmsmhránjának glikoprc-teinjei a glikánmaghoz kötött ul-3-fukózt tartalmaznak. Ezen szerkezeteket komplex N-glskánoknak, vagy mannőzmentos vagy csonkol; N-glíkánoknak is nevezzük. Az «maanoztl egységeket helyedesithetjük GlcNae-e&l. amelyhez gaíaktóz és fokoz kapcsolódik oly módon, hogy az emberi Lewis-féle a-cpitópnak megfelelő szerkezet jön létre [Meló és mtsai., f'EBS Lett. 415. 186-191, old. (1997); Fichede-Latne és mtsai., Plánt I .12,1911-1417. old. < 199?)].
Sem a xilóz, sem az ο i-3-köíésö fokoz nem létezik emlős glikoprotetnekben. Úgy találták, hogy 3 nrag-ol3-fokoz fontos szerepet játszik a növényeit és rovarok N-kőtott oligoszaeharidjat ellen irányuló ellenanyagok epitóp-lelismerésSben [Wilson és mtsai., Glycobioiogy 8, 651-661. old. (1998)1, és ezáltal rmmunreakerót váltanak ki ezen oligoszaehaddok ellen emberi vagy emlős szervezetekben. A?, a 1 -S-fakóz egység ezenfelül a különböző növény és rovar alletgének közti széleskörű allergiás kereszíreakció egyik ÍÖ okának látszik [Tretter és mtsai., Int, Atvh, Aliergy hmt-onoi. 102. 259-266. old. (1993)j, és kemsztreagáló szénhidrái determinánsnak (CCD, „cross-reac-ive carbohydrafe determinanf') ts nevezik. Paradicsom és íü pollenjének vizsgálata során szudén cti-3-foköz egységeket találtak m;nt közös determinánst. ami az oka lehet annak, hogy parttdicsom és itl pollenailergia gyakran együtt fordul elő betegekben ÍPetersen és mtsai., .1- Aliergy Cin;. Immunoi 98. 895-814. old, (1990)1. Az Immunológiai kcresztreakciók gyakori előfordulása miatt a CCD-k ezenkívül elleplezik az allergia diagnózisokat.
Aktaszám unk: 95155-1395 LT
-2A növényt fehérjék áhxl sz emberi szervezetben kiválton Immunológiai reakciók a fő probléma 3 növényekben -érméit rekombináns imtó fehérjék orvosi alkalmazásával kapcsolatban. Ezen probléma megkerüléséhez meg kellene akadályozni az o.l-3-tbkozdációt. Egy vizsgálatban megmutatták. hogy L-fuköz ló-deoxi-Lgalaktózj helyei·; L-galaktózt tartalmazó oligeszaehandok minöamessen biológiailag teljesen aktívak IZabbckss <--> mtsai 'íctence 2T <5 %)l I g\ m.isú sszsgákt n «/ bmtí, \w m rum’ r elvan nmunsái oefeltak amelyben az ^γ-aeett^glüke·^xam^nil·tmnszferá;-·^ I · ami a komplex giikánok bioszintéztsének első enzimje - hiányzik A komplex ghkcproíemek bioszintézrse ezen mutánsban tehát zavart. Mindazonáltal ezen mutáns növények képesek normálisan fejlődni bizonyos körülmények kozott fSehaewes és rtttssi.. Elánt Physlol 1Ö2, 110911 IS. old. 11993)].
A mag-al-3-fnkóz kötésének tervszerű gát lásához (a többi glikoziiálásl lépés akadályozása, néiktli t pusztán azt az enzimet kellene ínakltválm, amelyik közvetlenül felelős ezen specifikus glikoziiálásért, azaz a mag-o 1 -3fiíkozsl-u-anszíerázs. Azt először ntunghaöból {..m.ung bean’b ,fefesí?o/«.s mmom?) izolálták és jellemezték, és ügv találták, hogy az enzim aktivitása a nem-redukálö GlóNÁe végek jelenlététől filgg (Staudaeher és mtsai., Glyeoconjugate .1. 12, 780-7-3Ő. old. (i995tí. Ezen trsnszíerázt, antely kizárólag növényekben és rovarokban fordul elő. és emberben és tnás gerincesekben nem, szándékosan tr·,aktiválni vagy szupoesszálm kellene azért, bogy a növényekben vagy növényi sejtekben, illetve rovarokban vagy rovarsejtekben termeltetett emberi fehérjék ne tartalmazzák ezt az ímrnuineakeiöt kiváltó epitopot, mint. ahogy az eddig történt,
John M, Bürke publikációjának („Clearíng the w&y tor ríbozymes, Natúré Bioteehnofogy 15, 414-115, oki, (1997)1 tárgya ribozimok általános működésmódja.
Pooga és mtsai, publikáeióiártak í,,Cell penetrating PNA constructs reguláié galanis receptor levels and modiív pala traosmission. ír: vivő, Natúré Biofechnology ló, 857-861, old, (1998)] tárgya PN'5-molekulák általában, és specifikusan egy olyan PNS-molekula, amely az 1-es típusú emberi galanin-receptor mRNS-ével komplementer.
Az 5 .272 t)6ő. számé amerikai egyeséit államokbeli szabadalmi irat tárgya eljárás eukanóta és prokarióta fehérjék megváltoztatása fe rfvo keringésük meghosszabbítására. Ebben az esetben a kötött ohgöszacfcandokat változtatják meg különböző enzimek segítségével, köztük GlcNAc-al ~*3(4Efukoz.tl-tíattszfetázza.l ís.
A 0 643 132. számú európai szabadalmi írat tárgya emberi sejtekből (THP-1) izolált αΐ,ο-fukozxltranszferáz klónozása. Az ebben a publikációban feltárt szénhidrát-láncok megfelelnek az. emberi Lewjs-féle szialil -x- és L-ewis-féle sztalil-a-ongoszaeitarídtrak, .Az emberi sejtekből származó enzim spcclfilása teljesen különbözik a növényi sejtekből származó íukozii-transzfetázótöl.
A találmány szerinti megoldás kidolgozásakor az volt a célunk, hogy a növényi fukozíl-transzferází kódoló gént megklónozzuk és szekvenáljuk, és a gént vagy fragmeuseit, vagy abból származó megváltoztatott BNS-t vagy DNS-ι tartalmazó vektorokat állítsunk elő, növényeket, rovarokat valamint azok sejtjeit transzfektűijuRk ezen vektorok egyikét el olyan ghkopt ötéinek elóállttásata. amelyek nem tartalmazzák a normatsxun előforduló :H3g-s!-3~fukázL valamint ezen célok meg valósításához megfelelő eljárásokat hozzunk létre.
A találmány szerinti célkitűzést az 1. azonosítószámú szekvenciát tartalmazó DNS-molekmával érjük el (a feltárásban az 1UEAC nómeukiatúrá; alkalmazzuk, „N” jelentése inozin), amely DNS-molekuia egy nyílt leolvasási fázist tartalmaz a 2II.-tői az 174(k-ig bázispárig, vagy legalább 50%-bsn homológ a fenti szekvenciával, vagy hibridízái a fenti szekvenciával szítingens körülmények között, vagy olyan szekvenciát tartalmaz, amely a fenti DNS-szekvcöciához képest degeneráls a genetikai kőd miatt, és amely szekvencia rtíkozd-íranszferáz aktivitású aövény? fehérjét kódol vagy azzal komplementer.
Ez as eddig feltáratlan .szekvencia tökéletesen alkalmazható bármilyen kísérlet, elemzés és termelési eljárás sth. eéljára, ami növényi fehozil-rtanezforáz aktivitással kapcsolatos. Itt a DNS-szekvencia, valamint az ezen szekvencia állal kódol! fehérie az érdeklődés tárgya. Azonban a DNS-szekveneíás előnyöset· alkalmazhatjuk a ukozil-transzferáz akuvuás gátlására.
Az 1. azonositószámú szekvencia nyílt leolvasási fázisa egy 510 arnínosavbói álló fehérjéi kódol, amelynek elméleti molekulatömege 56,8 kdA, és feltehetőleg egy franszmembrán régiót tartalmaz az Asn36 és Giy54 közölt. Az 1. azonosítószámú szekvtmcta szerint kódolt fehérie. számított pl ériéke 7,5 .
A növényi íúkozdl-lranszferáz aktivitását egy eljárással detekláljtfe és mérjük, amely szedni jelölt fokózt és egy hordozóhoz (például Sephatoae) kötőd akceptort (példán! gljkoprotem) tartaltnazó mintához fekoziltrarsszferází adunk. A reakcióidő letelte után a mintát mossuk, és tt kőlőlt fukóz mennyiségét ráérjük. A fokoziltranszferáz aktivitása ebben az őseiben pozitív, ha a mért aktivitás legalább lQ~2Q%-kaí. előnyösen legalább 3050%-kai nagyobb, min! a negatív koattoii méri aktivitása. Ezenfelül a gíikoprotettt szerkezetét igazolhatjuk HPLC’ alkalmazásával, ilyen eljárások megtalálhatók a szakirodalomban [Slaudacher és mtsai., Anal. Bioehem. 246, 96-101. oíd. (1998); Standacber és mtsai., Eur, 1. Bioehem. 199, 745-751. oki, (199 !)·].
Példán! fukozü-Eanszferázt hozzákeverünk radíoakfivan jelöli fokőzt és akceptort [például GkNAcjH7Marso.l-3íGieblAcpl-2M3nn.l-6iManpl-4G!eNz\epl-4G;cNAepi-Asnj tartalmazó mintához. A reakcióidő letelte után a mintát aatoncserélő kromatógráHavai tisziiljnk. és a kötött fuköz mennyiségét mérjék. Az akceport tartalmazó minta és az akceptor nélküli negatív kontroll mért radioaktivitásának a különbségéből számíthatjuk az aktivitást. A inkozb-rtanszferáz aktivitása pozitív, ha a mért radioaktivitás legalább 30-40%-kai nagyobb, mist a negatív kontroil mén radioaktivitása.
Két DSN-molekula párosodási? megváltoztatható s minta hőmérsékletének és íonerőssógéstek megválasztásával. A találmány szerinti „sztríngens körülmények” alatr olyat? körülményeket értünk, amelyek lehetővé teszik a pontos, azaz szigorú kötődési. Például a DNS-molekulákar 7% oáfriutö-dodecilszuífát (SDS). 0,5 M NaPO*. pH-7,0, 3 mM EDTA pufTerben lúbritlizáljuk $0'C-on, és 1% SDS-sel mossuk 42'C-oti,
Azt, hogy szekvenciák legalább 5ö%-baa homológok az 1. azonostiószánn': szekvenciával. meghatározhalö, például az. EMB.L vagy SWISSPRÖT adatbankfaslDB programjával.
A találmány szerűn? szekvencia előnyösen GlcNAc-alJ fukozil-transzferáz aktivitású fehérjét kódol, küiórtósen snag-OicN/ke-srl J-fukozil-íraaszferáz aktivitásút
Mint ahogy fest feltártuk, az ni ,.3-fekozil-transzferáz magja növényekben és rovarokban fordul elő, de em~ herbeo nesn, ily módon ezen DNS-szekvencia előnyösen alkalmazható fokozil-trauszferázj-a specifikus elemzés és kísérletek, valamint termelési ellátások céljára.
,.Mag-at,3-fukozu-íTanszferáz'' alatt előnyösen GDP-L-Fuc;Asn-kötört GlcNAc-ai,3-fekozü-tra?'*szferázt ériünk. A találmány oltalmi körén lseiül az al,3-fekozíi-transzféráz kifejezés rendszerint tőképpen tnag-öl,3fakozíl-traaszferázt jelent. A fent leírt aküvitástnsréshez előnyösen nem-redukálő GlcNAc véget tartalmazó akcepic-r; alkalmazunk, ilyen akeepterok például GlcNÁcpi-2M;mn.l-3(GicN'Ac01-2M3r?írl-6)Majtpl4GicN Αοβ 1 -4GíeNAep 1 -Asn, GkN Acpí-2M;m?x!-3(GlcbiAepl-2Ma??« !~6)Man01 -4GieNAe[>! -4(Eueo.l f?)GlcNAcpl-Asu és GíeNAepl-2Ma,nul-3(ManaI-3(Manul -őlManal-6jMar?3i-4GleNAeül-4GfeNAcp1 -As?:.
-4Azt, hogy a útköz kSsódött-e vagy sem, megbatározbsíjttk az N-glikozadás-E-re való érzékodcnség átérésével, amit tőmegspektrc-metnás’aí detektálhatunk.
A találmány szerinti DNS-molekula előnyösen legalább 70-80%-ban. különösen előnyösen legalább 95%bats homológ az 1. azonosítószámú szekvencia szerin'i szekvenciával. Ezen szekvencia egy különösen aktív GlcNAc-u 1.S-úsko^l-trartszfeázt kódol.
Mivel a DNS-szekveneta töbhé-kevásbé változhat a növény vagy rovar szerint, egy' olyan szekvencia, amely példánI 70% homológiát mutat az 1. azonosítószámú azekvencmak szintén fekozíl-traaszfesóz aktivitású, ami elegendő a fönt féltén fnkozil-íranszferázra specifikus elemzés, kísérletek, vagy termelési eljárásokban való alk iilmszásra.
Egy további előnyös megvalósítási mód szerint a DNS-molekula 2150-2250 bázispárt, előnyösen 2198 bázispárt tartalmaz. Ezen DNS-molekula 500-300. előnyösen 2 50 bázispárt, tartalmaz a start-kodoatöl a leolvasással ellentétes iránybajt, valamint 350-440, előnyöseit 458 bázispárt tartalmaz a stop-kodon után a leolvasással megegyező irányban, ahol a DNS-molekula vége előnyösen 3’-poli(,A) farkat tartalmaz. ily módon biztosított a transzláció hibátlan szabályozása, és oiyart DNS-moleknla adott, amely különösen hatásos és problémamentes aktív GlcbíAc-al,3-fúkozil-trartszféráz kódolására,
A találmány tárgya továbbá DNS-molekula, amely a 3. azososltőszámú szekvenciái tartalmazza, vagy legalább 85%-ban, kúlonbscn e löov őse tt ^S^v-ban, előnyösen Sw'K-bur donrolog a fönt megadott s!,ek\en< tavai, vagy hibrídízál a fen; megadott szekvenciával sztringens körülmények között, vagy olyan szekvenciát tartalmaz, amely a fönti DNS-szekvenciáboz képest degenerált a genetikai kód miatt, A homológiát előnyösen olyan programinál határozzuk meg, amely fölismeri az iazeretókat és deléciókat, és nem veszi ezeket figyelembe a homológia számításakor. Ezen nukleodá-szekvencia egy konzervált pepíidmotivumct kódol, ami azt jelenti, hogy az. aktív és működőképes GlcNAc-αΙ ,3-fukozii-mmszferázok többsége tartalmazza az általa kódolt amittosav-szekvencíát. Ebbett az esetben a szekvencia leltet ugyanolyan hosszú, mint a 3. azonosítószámú szekvencia, vagy természetesen nagyobb is lehet. Ezen szekvencia rövidebb, mini a teljes fehérjét kódoló szekvencia, éa ezáltal kevésbé érzékeny rekombinációra, deíóciöra, vagy bármilyen más mutációkra. A konzervált motívum és annak nagyobb stabilitása miatt ezen szekvencia különösen előnyős szekvenciafel ismerő tesztekben.
A 3 azonosítószámú szekvencia as alábbi szekvenciát tartalmazza: 5'-GAA GCC CTG .RAG CAC f AC AAA ΤΠ' AGC TTA GCG ΤΓΤ GAA AAT TCG A AT GAG GAA GAT TAT GTA ACT GAA AAA TTC TTC C.AA TCC G TT GTT GCT GGA ACT GTC CCT-3*.
Egy további megvalósítási mód szerint a találmány tárgya D'NS-molekula, amely a fent megadott DNSmolekulák egyiknek részleges szekvenciáját tartalmazza, és méret 20-20Ö, előnyösen 30-5ö bázisbár. A DNSmolekulát alkalmazhatjuk például próbakésit GleNAc-o i .3-fukozii-tomszferázok komplementer szekvenciáinak kötésére oly módon, hogy azok kiválaszthatók egy mintából, ily módon további Gk:NAe-«í,3-fukoziltranszferázokat választhatunk ki, izolálhatunk és jellemezhetünk a legkülönbözőbb növényekből és rovarokból. Bármilyen kívánt, egy vagy·· több szekvencia alkalmazható, előnyösen a fönt feltárt konzerv&h. motívum egy része.
Különösen előnyös, ha a fent' megadott ONS-meíekulák kovalensen kapcsoltak egy detektálható jelölőanyaggal, jelölóanyagkém bármilyen elterjedt markét' alkalmazható, mint például íluoreszeens. lumineszcens, radioaktív markerek, nem-izotópos markerek, mint például hiotm, stb. ily módon olyan reagenseket biztosítha-5 tünk, ameiyek alkalmasak a megfelelő DNS-molekulák detektáláséin, kiválasztására és mennyiségi meghatározására szilárd szöveti mintákban (példáéi növényekből származó minták), vagy folyékony mintákban is, híbrídízáesős ebarasek slkaimazasávsl.
Egy további megvalósítási mód szerint a találmány tárgya biológiailag működőképes vektor, amely a fent megadott ONS-molekulák egyikéi vagy annak különböző hosszúságú, legalább 30 bázispár bosszú részeit tartairnazza. Gazdasejtekbe történő transzíektálás céljára ónálló sokszorozódásra képes vektorra van szükség, & gazdasejttől. transzfekeks» mezben izmostól, feladattól, a DNS-molekula méretétől foggően megfelelő vektort alkalmazhatunk. Mtvel nagyszámú különböző vektor ismeri, azok felsorolása tútmenne a bejelenlés keretem, ezáltal azt mellőzzük, különöset; íjsí vei a vektorok nagyon jól ismertek a szakember szántára fa vektorok, valamin: a bejelentésben alkalmazod módszerek és kifejezések tekintetében, amelyek ismének a szakember szamára, vő, még Saambrook-Msmatisl Ideális esetben & vektor molekulatömege kicsi, és szelektálható géneket tartalmaz oly módon, hogy könnyen felismerhető fenotipust okoz a sejtben, tehetővé téve ezáltal a vektort tartalmazó és vektortól ntenres gazdasejtek könnyű szelekcióját. A DNS és a megfelelő géntermákek magas hozama érdekében a vektornak tartalmaznia kell egy erős protnötért. valamint egy enhancett, géttatnptifikáeiéx szignált és szabályozó szekvenciákat. .A vektor autonóm replíkáeiójához fontos továbbá a replikáctós origó. Poliadentlácíős helyek felelősek az tnRNS pontos feldolgozásáért, és az RNS-lranszkriptutnok splicing szignáljaiért. Ma fásokat, vírusokat vagy vírnsréssíeeskéket alkalmazunk vektorként. pakolószignál szabályozza s vektor-DNS pakolását. Például növényekben történő transzkripcióra megfelelőek Ts-plazm'tdok, rovarsejtekbett történő transzkripcióra megfelelőek bakuio vírusok, és rovarokban transzpozonok, ro int például tt P-elem.
Ha a fent feltárt találmány szerinti vektor bejuttatjuk egy növénybe vagy növényi sejtbe, az endogén GlcNAc-aljO-fukozil-tnasszferáz-gén génexpresszlójának poszt&anszkripiós szupresszióját elérhetjük egy azzal vagy annak részeivel homológ szensz irányítottságó. transzgén transzkripciójával. Ezen szensz-snódszert tárják tél öartcombe és mtsai. [Plánt Mól. Bioi. 9, 373-382. old. (Í996)l és Brigneti és mtsai. [EMBO ), 17, 67396746, old. (1998)]. A „génelnémháíO („gene silencíng) ezen módszere az «i,3-fekozil-traoszfeíáz gén expressziőja szupressziójáttak hatásos módja [vő. Waterhouse és nmeti., Proc. Natl. Arad. Ser USA 95, 1395913964. old. (í998».
A. raláltnány tárgya továbbá biológiailag működőképes vektor, amely a tént megadott megvalósítási módok egyike seermti DNS-moiekuíát vagy annak különböző hosszúságú részeit .tartalmazza a proroőterltez képest fordított irányítottsággal Ha ezt a vektort bejuttatjuk egy gazdasejtbe. anttszeasz tnRNS íródik át, amely kompiémentei a Gl.cNvAe~al,3-inkozil-transzferé;: tnRNS-éveí, és azza; komplexet képez. Ez a kötés gátolja a pontos feldolgozást, továbbítást, stabilitást, vagy pedig a riboszörna-annsálás megakadályozásával gátolja a transzlációt, és ezáltal a GlcNAc-o 1,3- fukoesl-transzferáz normális génexpressziójáí.
Mabár a DN8~moleknia teljes szekvenciáját beépíthetjük a vektorba, részleges szekvenciák azok kisebb mérete miatt előnyösek lehetitek bizonyos célokra. Az antiszensz megvalósítást roed esetén például fontos, hogy a DNS-tnolekula elég nagy legyen elegendően nagy antiszensz mRNS kialakításához, amely kötődik a transztéráz-tnRNS-bez. Egy megfelelő antiszensz tnRNS-rooIekula példán; 50-200 ntjkleotkfot tartalmaz, mivel az ismert, termeszeiben előforduló antiszensz RNS-molekulák többsége megközelítőleg b3Ö nukieotidot tartalmaz.
-6 Az aktív ol,3-fukoz.il-írat-szferáz expresszióiát?ak különösen hatásos gáüásáfec® a sseobsz- és astiszesszmödssef komb;t?áciö>át alkalmazhatjuk [Waterhot?se és mtsai., Proc. Natl. Acad- Scl. USA 95, 13959-13964. old. 0998}].
Előnyösen gyorsan bibridizóló RNS-molekniákat alkalmazunk. Az 50 nukieoíidnái nagyobb méretű aotiszensz RNS-ntoickuiak hatékonysága függhet az aníiszensz RNS-molekuiák 1« «‘tro anncálási kinetikájától. Ezért például gyorsat} anneáló antiszettsz R.N8-molekttlák a febétjeexpresszró nagyobb mértékű gátlását mutatják, mint a lassabban hibrkhzáló RNS-molekulák (Wagner és mtsai., Am, Rév. Mierobtol. 48, 713-743 old. (1994): Rirmer és mtsai., Nud. Aeids Rés. 21, 13S1-B87. <?ld (1993)], Ilyen gyorsan hibrid-zálő antiszensz RNS-tnolekuiák elötjvösen nagyszámú külső bázist (szabad végek és összekötő szekvenciák), nagyszámú szerkezeti alegységet (komponensek), valamint kevés hurkot ÍRatzel és mtsai., Natúré Btotecbaoiogv 16, 64-68. old. <1998}] tartalmaznak, Az atttiszensz RNS-molekulák hip<?te-ikus másodlagos szerkezetét például számítógépes program segítségével határozhatjuk meg, ami szerint a megfelelő antiszensz RNS/DNS szekvenciát kiválaszthatjuk..
A DNS-molekttla különböző szekvcnoia-régiótt illeszthetjük be a vektorba. Egyik lehetőség pékiául csak a nboszótxta-artneálásért felelős rész beillesztése a vektorba. Az m.RNS gátlása ebben a régióban elegendő lehet a teljes transzláció mcgállitásárs. Különösen magas hatékonyságú antiszensz molekulák kaphatók a gén nem transztálödő 5’ és 3* régióiból.
A találmány szedni; DNS-tnolekula előnyösen deléciőt, Inzeretóí és/vagy hely ettesítéses mutációt tartalmazó szekvenciát tartalmaz. A mutált nukleotidok szánut változó, és egyetlen egytől számos deieráit inzertéit vagy helyettesítőit nukleotldig változik. Az is lehetséges, hogy a leolvasási fázis eltolódik a mutáció következtében. Az riyen „knock-out” gén pusztán annyiban fontos, hogy a GlcNAc-tti ,3-fúkczíi-transzferaz. expresszi-ója 'zavart, és az. aktív, működőképes enzim kialakulását megakadályozzak. A mutáció helye változhat, amennyiben az enzímsUkusan aktív fehérje expresszióját megakadályozzuk, Előnyöset? a mutáció az enzim katalitikus régiójában található, amely a C-tennínális részen van. Mutációk beépítésére szolgáló eljárás DNS-szekvcneiákban jói ismertek a szakember szamára, és ezért a mutsgenazis számos lehetőségét nett? keli a leírásban részletesen tárgyalnunk. Véletlenszerű mutagenezis, valamint előnyöset: irányított mutagenezis. például helyspeeiltkus mutagenzis, oügonttkleotid-szabályozta mutagenezis, vagy restrikciós enzimek segítségével végzett mutagenezis alkalmazható ebben az esetben.
A Saiáltxsány tárgya továbbá DNS-moiekula, amely rihoztmot kódol, amely két, legalább 10-15 bázispár nagyságú szekvetteiarészt tartalmaz, amelyek a fen; megadott, találmány szerinti DNS-molekula szekvenciarészesvel komplementerek oly módon, hogy a rihozim komplexet képez a természetes GlcNAc-al,3-fukoziltraoszíéráz DNS-moiekulárói áífródő r?xRN$-sel. és elvágja azt. A rsbozsm felismeri a GicNAc-til.3-fúkoz?l· trauszíeráz mRNS-él komplementer bázispárképzés révén. Ezt követően a rsbozhn elvágja és megsemtnisit? az. RNS-t szekvecia-fűggő módon, mielőtt az enzim transzlálódik. Az elvágott szuhszíráfról való disszociáció mmt a rtbozins ismételten hibridizái RNS-rnoleknlákal. és specifikus sndontiklezáként triöködik. Áitaiában ribozimok specifikusan készíthetők bizonyos tnRNS-ek inaktiválására, még ha nem is ismerjük a teljes fehérjét kódoló szekvenciát, A ribozimok különösen itatásosak, ha a rifeoszómák lassan mozognak az nsENS mentés. Ebben az esetbe:? ti ríboztm könnyebben talál nboszömsmentes helyet az mRNS-an. Emiatt lassú riboszónta-mutáasok . 7 .
szintén alkalmasak riixirim-teusrizerekben [Bürke, Natúré Biotechnology 15,414-415. old. (199)]. Ezen DNSmolekula különösen előnyős ·& növény i GkNAe-o 1 .S-óokozíl-transzíerázok alulszabalys^zására és gátlására.
Egy lehetséges mód ribozhn más formájának, mmizimnek t\mmisyms'’.t az alkalmazása ts, Mktizünek különösen hatásosak nagyobb RNS-ntoleknlák hasítására. A máskam egy kalapácsísj alakú ríbozim, amelyben egy rövid obgonukleotid kapcsolószakasz van a fi. hurok helyest. Dimer-ntbizbtek különösen előnyösek [Kuwabara és mtsai., Natúré Biotechnology 16,961-96S, old. (1998)],
A találmány tárgyát képezik olyan biológiailag működőképes vektor, amelyek a két utóbbi DNS-moieknia (mutáció vagy ribozim-DNS) egyikét tartalmazza, A fentebb ts vektorokról mondottak ebben sz esetben is érvényesek, Ilyen vektort például bejuttárhatunk mikroorganizmusba, és alkalmazhatjuk a feni feltár: molekulák nagy koncentrációban való előáliitására. Ezenkívül az ilyen vektor különösen jó specifikus DNS-molekula növénybe vagy rovarba való beillesztésére, annak érdekében, hogy alnlszabályozzak vagy teljeset! gátoljuk a szervezet GlcNAc-a 1,3-fukozti-íranszfetáz termelését
A találmány tárgya eljárás a találmány szerinti DNS-molekulát tartalmazó cDNS előáliitására, amely eljárás szerűd RNS-t izolálunk rovar- vagy növény? sejtből, előnyösen szikiévé! sejtekből, amellyel reverz transzkripciót hajtunk végre reverz transzkriptázza! ás láncúul ttokkal történő összekeverés után. Az eljárás egyes lépéseit Ismert módszerek szerint hajtjuk végre. Λ reverz transzkripcióval egyrészről lehetséges a teljes mRNS cDNS-et előállítani etígotd Γ) Íárctndítők seg jegével, es csupán ezután végrehajtani a PCR-t kiválasztott láncfoditékkal & GlcNAe-o!,3-fukozi!-transzferázt géni tartalmazó DNS-molskulák létrehozására. Másrész} a kiválasztott láncindítókat közvetlenül alkalmazhatjuk a reverz transzkripcióra, specifikus rövid DNS kinyeréséhez. Az alkalmas iánetndífókat például szintetikus úton állíthatjuk elő ts transzferáz eDNS-szekveaciájának mirttázata alapját!. Ezen eljárás segítségéve! a találmány szerint! cDNS-moíekala nagy mennyiségét állíthatjuk elő gyorsan, egyszerűen és kevés hibával,
A találmány tárgya továbbá eljárás Gk:N'Ac-al,3-fukozil-traoszferáz klónozására, amely szerint a találmány szerinti DNS-molekulát vektorba klónozzuk, amelyet ezt követően gazdasejtbe vagy gazdába transzíéfeálnnk, tsajd a transzfektált gazdasejtek szelekciójával és szaporításával olyan .sejtvonalakat nyerünk, amelyek az aktív öteNAc-tri ,3-iukozil-transzfeází expresszálják. A DNS-molekulát például restrikciós enzimek segítségévet illesztjük be a vektorba. A vektorra a fent elmondottak érvényesek. Ami ebben az eljárásban fontos, az egy hatásos gazda-vektor rendszer kiválasztása. Aktív enzim eléréséhez eukaríóta gazdasejtek kaiöttöset! alkalmasak. Bgy lehetséges mód a vektor rovarsejtekbe történő ttanszfektálása. Élthez előnyösen towrvínist kell vektorkém. ttlkaimaznunk, mint példán! bakníovírnst.
Természetesen emberi vagy más gerinces sejtek is trauszfekhtihatók, amely esetért az utóbbiak számukra ideget! enzimet sxpresszálnánsk.
Előnyösen a találmány tárgya eljárás rekombináns gazdasejtek - előnyösen növényt vagy' revarsejteh, növények vagy rovarok - előállítására, amelyek GleNAe-ct 1,3 - fukezii-íranszferáz termelése szttpresszált vagy teljesen gátolt, amely ellátás szerint legalább egy, a találmány szerint! vektort - azaz olyan vektort, amely a íttlálmárty szerint! DNS-molekulát, a mutáns DNS-molekulát vagy ribozimet kódoló DNS-molekulát vagy a promöterhez képest fordított trártyítottságú DNS-molekulát tartalmaz - juttatunk be a gszdaseithe, vagy növénybe vagy a rovarba, Amtt fent elmondtunk a transzfeketórók az itt is érvényes.
- 8 Gaxdasejtként például növényi sejteket alkalmazhatunk. amelyekben például a Ti-plazmidct és az rtg^íó^vfcnurjs-renászert választhatjuk. Az .dgíoóijcíerümj.rend.szerrel lehetséges sövényeket közsetienüi harívfektaha: az /(grobúoícrói.v; gyókérhölyagobat okoz növényekben. 1-ls á^robucrermffj megíeröz egy sérült növényt, a baktériumok maguk neus kerülnek be a növénybe, esak a rekombiuáus DNS-· - az úgynevezett Τ’DNS-! - juttatják be az gyűrűs, e>ürakmnmoszómál.is, tumort kiváltó Fi-plazmidjukról a növénybe. A T-DNS. és ezáltal tt beleillesztett DNS-molekuía stabilan beépül a sejt kresnoszörnáiába oly módon, hogy a T-DNS génjei expresszálödhatnak a növényben.
Számos ismert, hatásos transzfékciós eljárás létezik különböző gazdarendszcrekbez. Néhátiy példa az eiektroporáció, köieium-ioszíátos. eljárás, uiiktoiniekció. liposzómás eljárások.
Ezt követőét: a transzfektált sejteket szelektáljuk, például antibiotikum-rezisztencia alapján, amelynek génien a vektor tartalmazza, vagy más uutrker-genek alapján. Ezután a mmszfekták sejtvonalakat ielszaporitjuk akár kis mennyiségben, például petricsészékhen. akár nagy mennyiségben, például íermentorban Ezenkívül a növényeknek van egy előnyős tulajdonsága, miszerint képesek teljes növénnyé kifejlődni egyetlen ip&osztektálí) •sejtből vagy protoplasztból, amely növény termeszthető.
Az alknlmuzott vektortól függő folyamatok mennek végbe a gazdában az enzim expressztöjának szupresszálására vagy teljes gátlására:
Ha delécios, inzerciös vagy helyettesítéses mutációi hordozó DNS-molekuiát tartalmazó vektort transzfekíálímk. homológ rekombináció mehet végbe: a mutáns DNS-molekula a mutációja ellenére felismerheti az azonos szekvenciát a gazdasejt genomjábart, és beépülhet pontosait ugyanarra a helyre oly módon, hogy „krtixfk-ons gén jön létre. Ily módon a GlcNAo-uiJ-íükozil-transzíeráz génijén motáció alakul ki, amely képes gátolni a GlcNAc-ol,3-fukozil-íra.nszféráz hibátlan expresszióját. Mini ahogy fent megmagyaráztuk, ennél a módszernél fontos, hogy a mutáció elegendő legyen az aktív fehérje expresszójának gátlására. Szelekciót és szaporítást kővetően a gént: további ellenőrzésként szekvenálhatjnk a homológ rekourbiuáclő sikerének vagy a mutáció mértékének meghatározására.
Ha rihozimot kódoló DNS-atolekuiát tartalmazó vektort transzfektahtnk, az aktív ribozim expresszálődik a giízdsscjiheu. A nbozim komplexet képez a GlcNAc~«l,3~fukozi1-tm-jazfcráz keuuplemeáter mRNS szekvenciájának legalább egy bizonyos részévek és azt eihasítja, és ily módon gátolja az enzim transzlációját. Ebben a gazdasejtbers, valamint sz ebből szátrnazó sejt vonalban, vagy opcionálisan az ebből származó növényben nem expresszídódik GlcNÁc-ol,3-fakozii-irnnszferáz.
Abban az esetben, ba a vektor a taláhsáoy szerinti DNS-molekulát. szánsz vagy fordított irányítottságban tartalmazza a promóterhez. képest, szeusz vagy antiszensz mRNS expresszálődtk a transzfektált sejtben (vagy növényben>, Az antiszensz mRNS a GlcNAc-ai,3-iukozil-transzíéráz mRNS szekvenciájának legalább egy rétonpemerto e«ugxan.‘•skeníoil ru ven rt rvt*damovt ínrrexpmssztoantoaenszmcd'Zemelto''íénő szupresszíójára szolgáló eljárás példájaként Smiih és mtsai. publikációjára [Mól. Geo. Génét. 324, 477481. old. i199ö>] hivatkozunk, amelyben paradicsom érési folyamatában részi vevő gén expressziója gátolt.
Az összes rendszerben a GicNAc-ol .o-iukxxííl-Íranssferáz expressziója legalább szapresszált, előnyösen akár teijiesen gátolt. A génexpresszíó megzavarásának mértéke függhet a komplexképzéstöh homológ rekombinációtól. lehetséges véletlen mutációktól, és egyéb folyamatoktól a genom ezen részében. A transzfektált sejteket teszteljük GkNAc-oJ ,3-fukozii-uanszferáz aktivitásra és szelektáljuk.
,. 9 Ezenfelül lehetséges még tovább növelni a GicNAc-ahS-fukazii-traaszfetáz expressziójáinsR fest leírt sznprcssziőjá? a fent Feltúrt vektor mellett egy oly ári vektor bejuttatásával a gazdába. amely egy emlős fehérjét, például plA-galaktozIl-transzferází kódoló gént tartalmaz. A fukozilációt más emlős enzimek működése csőkkenthetl, az aktív GleNAc-cti J-fukozil-hansztbíáz expressziójának együttes gátlása a találmány szerinti vektorral és emlős enzimet hordozd vektosaal ktilN.ö^et? hatásos.
Bármilyen sfeény alkahriaxbde honszlektaláshc c, példám tnuugKib, dohány, paradicsom .és/vagy burgonya.
£gy másik előnyös eljárás rekombináns gazdasejtck, - előnyösen növényi vagy tovarsejteh. növények vagy rovarok - előállítására abból áll. hogy a mtitácíóf tartahnazó DN5-molekulát bedieszijnk a gazdagéit, vagy növény vagy rovar genomjába a nem mutáns homológ szekvencia helyére [Schaeíer és ousai., Plán; .1. 11, '1951206, old. (1997)1. Ez az eljárás tehát nem vektorjai műkőink, hanem tiszta DNS-molekulával. A DNS-molekulát például génbombázással, mikxolnjekclóval vagy elelctroporációval juttatjuk be a gazdába, hogy csak három példát, említsünk. Mint ahogy már feltártuk, a DNS-molekula kötődik tt homológ szekvenciához a gazda genomyában oly módon, hogy· homológ rekombináció, és ezáltal a deléciós. inzcrciós vagy helyettesítéses mutáció beépülése megy végbe a genomban: a Glchi/kc-al,3-fekozii-uranszfcáz expressziója szupresszálható vagy teljesen gátolható.
A találmány tárgyát képezik továbbá olyan növények vagy növényi sejtek, valamint rovarok és rovarsejtek, amelyek GlcNAc-aU-fuke-zíi-transziéráz aktivitása a természetben előforduló növények vagy növényi sejtek, valamint rovarok és rovarsejtek GichfAc-o i .3-fukozil-transzferáz aktivkástkisk kevesebb mint 50%-a, előnyösen kevesebb mint 20%-a, különösen előnyösen 0%-&. Ezen növény eknek és növényi sejteknek az az. előnye, hogy az általuk termelt giikoproteittek nem tartalmaznak vagy alig tartalmaznak al-i-kőtö-t fukózt lla az ilyen növényekből vagy rovarokból származó termékek bekerülnek emberi vagy gerinces szervezetbe, nem alakul ki ünmunjeakció az ol-3-fuköz epitop ellen,
A találmány tárgyát képezik előnyöse-? növények vagy növényi sejtek, amelyeket a fent feltárt eljárások valamelyikévé állítottunk elő, és GlcNAc-öl,3-fekczil-transzferaz aktivitásuk szapresszált vagy teljesen gátolt.
A taiáimány tárgyát, képezik továbbá rekombináns rovarok vagy nwvarsejtek, amelyeket a fent feltárt eljárások valamelyikévé állítottunk elő, és amelyek CdcNÁc-«l,3-fukezií-transzferáz aktivitásuk szupresszák vagy teljesen gátolt. Ebbe-? as esetben sem termelődnek ul-3-íukóz egységet tartalmazó glikoprofeinek, és ugyancsak ueo:s alakul k> immunreaketo az o í -3-faköz epitop ellen.
A laiálmáay tárgya továbbá PNS-molekula, amely a találmány szerinti DNS-molekuls szekvenciájával, vala?nmí annak részleges szekvenciáival koínplesnenser bázisszekvencíat tartalmaz. A FNS (peptíd-nukieinsav) DNS-szerű szekvencia, a r.ukleobazssok pszeudo-peptid-kötéstt gerinchez kapcsolódnak. FNS általában a Watson-CHck-féle bazispárosodási szabályok és hélixképzés szerint hibrtdistrl a komplementer DNS-sel, RNS-sel vagy PNS-sd. A peptidgerinc fokozott ellenállást biztosít essimaókus lehostással Sitemte. Ezáltal a FN'S-molekuls javított anüszessz reagens. Sem rmkleázok, sem proteázök nem képesek megtámadni & PNS-t??olekhlát. A PNS-molektila stabilitása kempleme-er szekvenciához kötődve elegendő térbeli gátlást okoz DNS- és RNS-polínteráaok, reverz transzkripíáz, telomeráz és riboszómák számára. Ha a PNS-moleKula a fent feltárt szekvenciát tartalmazza, kötődhet ahhoz a DNS-hez vagy a DNS ázott részéhez. amely a GlcNAc-al.a-fukozíi-uanszferáz;
- ιοkódolja, és ily módott képe? gátolni az enzim transzkripcióját. Mivel a PNS-molekula sem transzkripció, sem riare>z χ>ο t<.v<.n mm a’b'CoeH „íoMívUs „tón kc< il et A e x.kt?a s r ^λγ
Előnyösen a találmány tárgya FNS-molcknla, amelynek bázisszekveneiája megfelel a találmány szerinti DNS-molekula szekvenciájának, valamint annak részleges szekvenciáinak. Ezen FNS-molekula komplexet képezne? a GkNAc-u ' ük. sl tmszleraz mRNS e\e v ig v ea-'a^ „g? részéte' oly modor., Ixgv a/ etzru transzlációját gátolja. Az antiszensz mRNS-nél feltárt érvek vonatkoznak erre az esetre is. Ezáltal például különösen hatásos komplexkepzö rész a transzlációs start, vág;/ az tnRNS 5', nem transzlálóáó régiója is.
A találmány rárgyá; képezi továbbá eljárás növények vagy rovarok, vagy sejtek előállítására. előnyösen növényi vagy rovarsejtek előállítására, amelyek a GicNAc-aU-fuktízii-transzferáz gátolt eapresszióját tartalmazzák transzkripciós vagy transzlációs szinten, oly módon, hogy a találmány szerinti PNS-moieku iákat juttatónk be a sejtekbe. A PNS-molekula vagy PNS-rnolekuíák sejtekbe történő bejuttatásához hagyományos eljárásokat, mint például elektroporaciós vagy mikjoiojekcios alkalmaznak. Különösen hatásos a bejuttatás, ha a PNSoligomereket sej · beje ható pcptídekhez, mini például traaszporiánhoz vagy pAntp-boz kötjük [Pocga és mtsai,, Natúré Biotechnology 16, 857-861. old. fl99Mj.
A találmány tárgya eljárás rekombináns glikoproteinek előállítására, amely szerint a találmány szerinti rekombináns növényeket vagy növényi sejteket, valamint rovarokat vagy rovarsejteket - amelyeknek tt GlcN'Ac«1,3 -íukozti-transriéráz termelése szapresszált vagy teljesen gátolt , vagy olyan növényeket vagy rovarokat vagy sejteket, amelyekbe a mláhnány szerinti eljárással FNS-molekniákat juttattunk be, a giikoproiemt expresszáló génnel transzfektábmk oly módom hogy a g.nkoprosein expresszálódik. Mint ahogy már fent feltártűk, a kívánt fehérjék génjeit tartalmazó vektorral transzfektáijuk a gazdát vagy gazdasejtet, amint ezt ts fent már feltártuk. A trsnszfekíák növényi vagy rov&rseítek expresszálják a kivánt fehérjéket, és azokon nincs vagy alig van al-3-kötötf fukóz. Ezáltal azok nem váltják ki az emberi vagy gerinces szervezetben a fent már említett immntueakciók&L Bárót ilyen fehérjét előállíthatnak ezekben a rendszerekben.
A találmány tárgya előnyösen eljárás rekombináns emberi gbkoproteinek előállítására, amely szerint a találmány szerinti rekombináns növényeket vagy növényt sejteket. valamin! rekombináns rovarokat vagy rovarsejteket - amelyeknek a GlcNAc-a 1,3-íukozil-transzferáz termelése szupreszszáit vagy teljesen gátolt -, vagy olyan növényeket vagy rovarokat vagy sejteket, amelyek x< t,. lálmánv szerinti eljárással PNS-moleknlákat juttattunk be, a glikoproteini expresszáló génnel transz:ekeinek oly módon, hogy a rekombináns glikoprotein expresszáiödik. Ezzel az eljárással lehetővé válik olyart emberi fehérjék növényekben (növényt sejtekben) történő előállítása, amelyek, Ita bekerülnek az. estben szervezetbe, sem váltanak ki semmilyen immusreakeiét ai-3kötfl-t fnköz-egységek ellen
Lehetséges tápláiéknövények, például banán, burgonya. és/vagy paradicsom alkalmazása rekombináns glikopreteinek előállítására. A növény szövetet tartalmazzák a rekombináns gllkoprotelnt oly módon, hogy p él díttti a rekombináns gíikoprotein szövetből való kivonásával és azt követő beadásával, vagy a növényi szövet közvetlen elfogyasztásával a rekombináns glikoprotein bekerül az emberi szervezetbe.
A találmány tárgya előnyösen eljárás rekombináns embert gltkoproteínek előállítása orvosi alkalmazásra, amely szerint a találmány szerinti rekombináns növényeket vagy növény) sejteket, valamint rekombináns rovarokat vagy rovás-sejteket - amelyeknek a G!eNAe~öi,3-mkozíi-u«nszferáz termelése szupresszáli vagy teljesen gátolt vagy olyan növényeket, vagy' rovarokat vagy sejteket, amelyekbe a találmány szerinti eljárással PNSmolekulákat jvttstíuak be, a gbkopmtemí expresszálö génnel transzfektáintík oly módon. hogy a rekombináns glíkoprosein expresszálódik. Bármilyen, orvosi céiú fehérjét alkalmazhatunkebben az eljárásban.
Ezenfelül a i&lálruárry tárgya; képezik a fenn eljárás szerinti rekombináns glikoproteisek, amelyeket nővéry, \agy rovart cnás/eseklxt uh Jöttünk ekk es atae.yeknek penóé-seekvenejajs a nem csexkenteh i-jkozsb tmnszferú/, tanaim. t.öse’-yj tégy Otarvid./erekben evpscss/u’t fahe-iCKbetí előforduló ul-3-kokU fakor egysegeknek kevesebb mint 50%-át, előnyösen kevesebb mint 2ö':f-át, különösen előnyösen ö%-át tartalmazza. Természetesen előnyösek azon gitkoprotemak, amelyek nem tarral marnak u 1-3 -kötött fukozt. Az ai-t-kotmt ftikóz mennyisége függ a GlcNAc-a 1 J-fokozib transzferé?: fent feltárt szupressziójátsak ín értékéről
A találmány tárgyát képezik előnyösen rekombtuáns emberi glikoproteirsek, amelyeke} a fenti eljárás szerinti növényi vagy rovarrendszerekben állítottunk elő, és amelyeknek pepsid-szekvenciája a néni csökkentett fokozd-iranszferáz tartalmú növényi vagy rovarrendszerekben expresszáit fehérjékben előforduló ul-3-kölört fokóz egységeknek kevesebb mrnt 50%-át előnyösen kevesebb mint 2Q%~át, különösen előnyösen 0%-át tártálEgy különösen előnyös megvalósítási mM szerint a találmány tárgyát képezik orvosi eéld rékomőmáss emberi giikoproteinek, amelyeket a fenti eljárás szerinti növényt vagy rovarrendszerekben állítottunk elő, és amelyeknek pepud-szekvenciája a nem csökkenteti fukozil-transzferáz tartalmú növényi vagy rovarrendszerekben expresszáit fehérjékben előforduló al-3-kötöt· fukóz egységeknek kevesebb mint 58%-át, előnyösen kevesebb mini 20%-át, különösen előnyöset; (S%-át tartalmazza,
A találmány szerinti giikoproteinek tartalmazhatnak más kötött, növényekre vagy rovarokra specifikus ohgoszacb&rid-egységeket, találtai - embert glikoproietnek esetében - különbözhetnek a természetes glikoprofeInekrÖl. Mtodazofiálíal a találmányszerinti giikoproteinek gyengébb immmunreakeíót, vagy semmilyen immunreakciót váltanak ki az emberi szervezetben, mivel ahogy már a leírás bevezető részében feltártuk, az al-3-kötött fokózegységek a fő okai a növényi és árovar-glikeproteinek efen immunmakeioknák ősi kéreszf-immunteakcióknak.
Egy további megvalósítási mód « Udáhaásy szerinti glíkoproteineket tartalmazó gyógyszerészeti készítmény. A találmány szerinti giikoproteinek mellett « gyógyszerészen készílnsérsy az ilyen készítményekben szokásos további komponenseket tartalmaz. Ezek például különböző megfelelő puffer-lügitószerek (például TrisHC1, acetát, foszfát, pH- és ionerősség-n-ódosiíő szerek), additívak, ndtíí példát3l tenzidek és szolubilizálő szerek (például Tween-80, Políszorbát -kö}, tartósítószerek (például Thnerozál, benzil-alkohoi), adjuvánsok. anrioxidánsok (például aszkorbin&av, nátrium-metabisznlftf), emuiziftkáló szerek, kötőanyagok (például Isktóz, mannitol), polimerek, mint például polietiíéogiikol kovalens kötése a fehérjéhez, az anyag polimer vegyüietböl, mint például poli-tejsavbél. poli-glikolsavból stb. álló részecskébe vagy liposzóntába való beépítése, az adott kezelésbe?, megfelelő kiegészítő reagensek és/vagy hordozók. Ilyen készítmények befolyásolhatják s ;aláltnáísy szeriííti giikoproteinek flzákttí állapotát. stabilitását, in vivő felszabadulásai és in vivő kiválasztódását,
A ialáh&ásíy tárgyát képezi eljárás GicNAe-ai.S-fuközíi-tr&nszfetúzt kódoló DNS-molekulák mintából való kiválasztására, amely szerint a találmány szerinti jelölt £»NS-moleki:l&kaí hozzákeverjük· a mintához, amelyek kötődnek a GleNAe-«;.3-fukozd-tmnszferázt kódoló DNS-;nolekuktkboz. A bíbriálzálí DNS-tnolekulákat detektálhatjuk, mennyiségüket meghaiározhatjuk és kiválaszthatjuk. Azért, nogy a minta egyszálü DNS-t nuttslmazzon, amelyhez a jelöl; DNS-moleknlák képesek hibridizálsú, a ndmá; denaturáljuk, például melegítéssel. Egye
12lehetságes mód a vizsgálat kiváal DNS elválasztása - lehetőleg endottukleázok hozzáadás uíáts - gélakktrotorézissel agarózgélben. Miután azokat nittocellulóz rttetahrártra vtttűk át, a találmány szerinti DNS-tnolebrlákat hozzákeverjük. amelyek hibriöizáln&k a megfelelő homológ DNS-ntölekulákka? í„Sonthern-bíoO.
Másik lehetséges mód tnás fajokból származó homológ gének megtalálására PGR-alapú eljárás, specihkus és/vagy áegeneralt la ac indítók alkahrazásával, amelyek a. találnáoy szériád DNS-nmlekulá szekv«rtsiáj:ából származnak.
A fsat megadott, találmány szerinti eljáráshoz a minta előnyösen növény vagy rovar gentsmíális DNS-έί laríamiiKzza. Ezzel az eljárással nagyszámó növény és rovar vizsgálható nagyon gyorsan és hatékonyan a GlcNAcöi d-fukozil-transzfenáz gén jelenlétére. Hy módon lehetséges olyan sövények és rovarok szelektálása, amelyek sem tartalmazzák ezen gént, vagy a GleNAe-ö.l,3-tókozil-trarss?.feráz expresszíéjánnk szupresszáláse. vagy teljes gátlása olyan növényekben és rovarokban, amelyek tartalmazzák ezen gént. valamelyik feni megadott találmány szeritsíi eljárással oly módost, hogy azok azt kővetően alkalmasak lehetnek transsíekcíóra és (emberi) glikoprtrteíssk előállítására.
A találmány tárgyát képezik továbbá DNS-motekulák, amelyek olyas GlcNAc-«1.3-fok<»íl-trsas2fatázt kódolnak, amelyet a két legutóbb említett eljárás szerint választottunk ki, és azt követően izoláltunk a mitstáböi, Ezen molekulákat tovább; vizsgálati eljárásokban alkalmstzhattuk. Szekvenáihasjuk azokat, majd DNS-próbskétti alkalmazhatlak GleNAc-a.},3-lukazii'öe«S2derázok keresésésre. Ezen -- jelölt - DNS-ntolekulák hatásosabban működnek DNS-próbaként olyan szervezetekben, amelyok rokonságban állnak azzal a szervezettel, amelyikből ezeket izoláltuk, mint a találmány szernstj DNS-molekulák.
A találmány tárgyát képezi továbbá a találmány szerint klónozott Gk'N:Ae-al..3-tókozil-transzferá? pteparáta®, amely 6,0-9,0, előnyösen 6,S-8,2 pl-értékü izotermákat tartalmaz. Egy fehérje pl-értéke az a pH-érték, ahol annak nettó töltése zéró, ami az aminosav-szskvendától, glikozilációs mintázattól, valamint a fehérje térszerkezetétől függ, AGleN?\c-ai,3-tókozil-íraaszféráz legalább 7 olyan izofortnáí tartalmaz, amelynekpl-értéke ebben s tartományban van, Á transzferáz különböző Izotermáinak a magyarázata például az elíérő glikoztládos mintázat, valamint a limitált proteolizis. Vizsgálatok azt mutatták, hogy különböző tnungbab estranövényekben az izoformák aránya különböző. Egy fehérje pl-értékér szaketnber számára ismert izoelekíromos fókuszálással határozhítíjtik meg. Az enzim ló Izoformájának látszólagos molekulatömege 54 kDa.
A találmány szerinti preparátum előnyösen 6,8, 7,1 és 7,6 pl-értékü tzofor-nákat tartalmaz.
A találmány tárgyát képezi továbbá eljárás enrbert és gerinces glikoprotemek „növényiesitett szénhidrátegysegeinek előállítására, amely szerint íbkőzegysógeket, valatníní egy lent tnegad.öö DNíS--ísoÍekula által kődöí; GleN.Ac-ul,3-tókozil-transzferázt hozzákeverünk szénhidrát-egységet vagy glikoproíeiní tartalmazó mintához oly módon, hogy a GleN'Ac-al,3-hskozíl-danszfcráz a tóközt ni-3-kötésben kapcsolja a szénhidrát-egységhez vagy glikoproteitthez, A találmány szerinti, GieNLAe-tt l ,3-fukozil-íranszíeráz klónozására szolgáló eljárással lehetséges a tisztított enzim nagy mennyiségben való előállítása. Az enzim teljes aktivitásához megfelelő reakciókörütmétiyek szükségesek, Xlmotattttk, hogy a transzferázok aktlvlfáss különösen magas megközelítőleg ?-es pH-η, ha 2-(N-fnorfolítto)etánszttlfonsavat alkalmazunk pufféiként. Blvalens kationok, előnyösen Mrf jelenlétében a rekembináns transzferét aktivitása fokozott. A szénhidrát-egységet szabad vagy fehérjéhez kötött fortnábart keverjük a ntmíához. Λ. rekomhináns transzferé?. mindkét formán aktív.
-13Az alább: példákon és ábrákon keresztöl a találmányt részletesebben is bemutsljuk. amelyekkel azonban az oltalmi kör: nem kívánjuk korlátozni.
Az alábbiakban röviden ismertetjük a leíráshoz tartozó ábsákat
Az la és Ib ábrán a mér- fehér:ctnermyiségel és enzűnakUMtást mutatjuk be az eluátum egyes ffakeíáíbaít,
A 2. ábrán a GlcNAe-etl ,3-fukozii-:r:mszíeráz elektrotoretikns elemzését mutatjuk be.
A 3. ábrán az izoelekfiomos fókuszálás eredményét és egyes izotermák traRszfcráz-aktréiíásáí mutáljuk be,
A 4. ábrán 4 triptikns pepiid íi-4) N-;ennmális szekvenciáját muraijuk be, valamim károm láncmdtíó, Sl, A2 és A3 DNS-szekvenciáját.
Az 5a és 5b ábrán a GlcNAc-ul J-iukctzil-transzferáz cDNS-ének szekvenciáját mutatjuk be.
A ba és bb ábrán a G;e.N.Ao-y.í,3-tükoztl-transzfcráz aminosav-szekvenciáját mutatjuk be,
A 7. ábrán a GícNAe-clJ-tukoztl-lxanszferáz szerkezetének sematikus ábrázolását mutatjuk be, valamint az aminosav-oldailáncok hidrofobitását.
A 8. ábrán különbőzé fitkozíl-sranszferazok konzervált motívumainak összeitnsordíását mutatjuk be.
A 9. ábrás az. «1,3-fukozií-transzleráz génnel transzfektált rovarsejtek lúkozh-transzferáz aktivitásának a negatív kontroliéval való összehasonlítását mutatjuk be.
A 10a és löb ábrán az alj-tökozil-transzíeráz különböző akceptoraínak szerkezetéi mutatjuk be.
Ali. és 12. ábrán tömegspektrumokat mutatunk bs'.
A 13 . ábrán HPLC eredményi mutatunk be.
1. példa: zá mag-ní ,3~fukozil-transzferáz izolálása
Az összes lépést 4C-on kajroítuk végre. Mtmgbab eslranövénveke: keveröben komogbenizálmnk. 0.75 ré.rfogatnyi extrakctós-puffer alkalmazva minden kg babhoz. Ezt kővetően a homogenátumot két réteg pamutszövésén átszűrtük, és a szűrletet 40 percig centrifugáltuk 3Ö0ÖÜ g-vel. A íelüiüszót eldobtuk, és a csapadékot folyamatos keverés mellen íeloldó-pufferrel escttahsltus. egy éjszakán kérésziül. Az ezt kővető 40 perces eersrrifugálással 3 Oööög-n kaptuk a tritos-extraktumot, zk thton-exfiaktemot az alábbiak szerűd tbzbtoííak;
1. lépes: .A tritoR-extraktumot Ώ.Ε52 «dfaoszemcsés dielii-amino-etil-eellulőz anioncserélö oszlopra (5x2-8 cm, Whatman! vlttök fel, amelyet előzőleg A-pnlferrel kalibráltunk. A nem kötődő frakciói tovább kezeltük a 2, lépésben.
2. lépés: A mintát A-puíferel kalibrál: .-bfi-Ce/ Blue oszlopra (2,5x32 cm) Antik fel. Mtutáa mostuk az oszlopé: ezzel a pufferrel, a kóron fehérjét 0,5 M NaClot. tartalmazó A-pufferrel eluáltuk.
3. lépés: B-pofferret szemben: dialízis után a 2. lépésből származó eluátumot ugyanezen pufferrel kalibrált Ó'-úepáuí'ove oszlopra vittük fel. A kötött fehérjét R-puífer 0-0,5 M N&Cl-ot tartalmazó lineáris gradiensével eluálttik. A €ik:NAe~«l.3~£ukozihtranszíeráz aktivitású fiák csóka: összeöntöttűk, és C-puilérrel szemben dializáltuk.
4. lépés: A diakzah miutát C-pufferrel kalibrált GAGn-.fepáorore oszlopra vittük fel, A kötött fehérjét MnCl·: helyett 1 M NsCi-oí tartalmazó A-pu dérrel elváltuk.
5. lépés; Ezt kővetően az enzimet D-pufferrel szemben dialtzáhuk, es <íf.fi-AV.vnnofew:n-5<?páa’rose oszlopra vittük fel. Miután mostak az oszlopos D-pufferrel, rt traaszferázt a MgCU és NaCl 0,5 M GDP-vel való he- Η lyetíesstésével duákak. Az stoiv frakciókat összecntóttük. és 20 raM Tris-HCi, pH~7,3 paffénál szemben diabzálsuk, majd lioAhzáirttk,
A GlcNAc~« 1,3-fakad!· transzferár eazíntstskus aktivitását Gm'3n-pcptid és GDP-L-[U-:4Cj-iukéz alkalmazásával határoztuk meg egyenként 0,5 és 0,25 sznbsztrái-koacsatráeiöknál, 2~(N-m<;rfolin<;)etáaszuifon,sav({Ci-pufTer, Triton X-100. MnCl;, GlcN?\c Á- AMP jdenletéber· (Stsudacher es mtstu, Giycocnmagate 5 15. 355-360, old. (1998); Síaudaeher és mtsaí., Eur. J. Büx:hem. 199, 745-751, old, <,1ί}<>1 ti,
A febérjeknncenírációkat bfeinkotüusav-eljárás íPieree) segítségével határoztuk meg, vagy - az enzímrtsztb tás utolsó lépéseiben - amísosav-elesnzéssei [Altaan». Anai. Bíochem. 204.215-219. old. (1.992)].
Az la. és 1b ábrán a mért íehérjemenuyiséget és enzimakttvitást muraijuk be az eluátum egyes frakcióiban. Az la ábrán a fent ismertetett o-5epWo«e oszlopot! történő elválasztást mutattuk be, az !b ábrán a 6406bí?p««?'í>>t? oszlopon történő elválasztást mutatjuk be, a kör jelenti a fehérje·, a fekete teli kör jelenti a GlcNAcá;,3-ftikozil-tra»szferazt. és a négyzet jelenti az. N-acetil-3-glükozamínidázt. Egy U az enzimnek az; a mennyisége, amely 1 mmol iukőzt visz át akeeptorra percenként..
Az 1, táblázatban a Srartszíeráz tisztításának egyes lépéseit matatjuk be.
.1. tábiázat.
Tisztítási lépés Totál fehérje Totál aktivitás Specifikus aktivitás Tisztítási faktor Hozam
mg tnlT nt ü-rttg -szoros; %
Trífem-exíracf 91500 4846 0,05 1 1.0Ü
D.E52 43700 4750 0,10 2. 98,0
Aflrgel Bitté IMS 4134 23 460 85,3
S-Sepísarose a,4 3231 390 7500 67,1
önön- Sepbaro.se 0,13: 1044 3050 160000 21,5
GDP-Hexanolamia- 0,02’ 867 43350 367090 17,9
Scpharose Tantinosav-ele?nzéssel meghatározva
Extrskciös-puííer:
0,5 nrM ditiotreitoí 1 mM EDTA 0,5% poii vinil-pirroíiáon 0,25 M szakié® mM Tns-HCi, pK-7,3
Peloldo-pöfiér:
0,5 tnM ditiotreitoí 1 mM EDTA 1,5% Triton X-100 50 mM Trts-HCl, pH-7,3
-15 A -puffer:
öiM Tris-KCl. nH-7.3
0,1% Triton X-í 00
0,02% NaN,
B-pnlfer:
mM Na-eiírát, pR~7,3 ¢,1% Triton X-Í0O
0,02% NaN';
C-puiíer:
mM Tris-KCl, ρ}'%7,3 mM MnCl,
0,02% NaNs D-purier:
tnMTris-HCL pH';7,3
ICmMMgCk
IMHaO
0,02% NaN, példa:
Az SDS-PAGE-t cellában bsjtottuk, végre 12,5% afethsxídöt és 1% bíszakrifemideí:
tartalmazó géleken. A géleket Chowiísífe Ariieam SÍue J?-250-nd vagy ezüst-el festettük. A fukozil-tmoszferáz ízoeiektromos fókuszálását előre gyártott géleken - amelyek pí-tariománya 6-9 volt (Servö/vt /raw ö-Ű, Serva) - hajtottuk végre. A géleket ezüsttel festettük a gyártó eljárása szerint. Á kétdimenziós elektroforézísbez 3 fókuszáló gélből sávokat vágtunk ki, S-aikiláló-reagctsssel és 5DS~sel kezeltük azokat, és a fenti leírás szerint SDS-PAGE-t hajtottunk végre.
Á 2. ábrán GtcNAc-ftlJ-fttkozii-lranszferaz eiektroforézis gélt otuta-unk be. kfednnetíziós eíektrofcréxist a baloldalon, és egydimenziós SDS-PAGE-· a jobboldalon, Az A jelű sáv standard, a 3 teli! sáv GicN.Ac-«í.3-fukozii-transzferáz. a GoGn-oszlopról, és a C jelű sáv a „tisztított GlcNAc-« 1 ,3-íukazil-íranszféráz, azaz a G.DPKexano.lamin-Sepharo.se oszlop frakciója. A két esik 54 és 56 kDa-nál a transzferáz. informálnak felel meg.
A 3. ábrát! az. izoeiektromos fókuszálás eredményé· mutatják be. Az Á jelű sáv ezüsttel van festve, a B jelű sávban a trteszferáz aktivitását teszteltük. Az aktivitást a GDP-fukózrói a szubsztrátra transzferált fokoz %-aban adjuk rag.
3. példa:
A fehérje szekvenálásához a Caamasste-val festett SDS-PoKakriateid gélből csikókat vágtunk ki, azokat karboxiamide-tnettlábok, és tripsz-nnel hasítottuk Gőrg és mtsai. [Electrophoresis 9, 6§1-692. old. (195$)) eljárása szerint. A tripíikus peptideket fordiScít fázisú HPLC-vel választottuk ei 1,(1x250 mm-es tüzfec CA? oszlopon, 40’C-oo 0,O5 ntíliperc folyási sebesség mellett. //7% ϊΰΟ készülék (Hwies-Packard) alkalmazásával. Az izolál; pepitáékor Hewleti-Packard &7t)05 iVoíe.ns Sysíerx-tnet választottuk et a gyártó eljárása szétüti. Ezenkívül a pepttd-elegye? ingel-féle emésztéssel analizáltuk MALDl-TOF MS-sel (lásd lenti.
- 16 ··
Λ 4 ábrán 4 tnpűkus pentiáe: (1-4. ;-<-8 ázonosiUtSAiPtn szekvencia! muutunk be A.f cNó maont perié alapján eiöállit<íttnk az Sl, A2. és AJ lánc. indítókat (9-11. azonosítószámú szekvencia).
4. példa: RT:.M„gs d)NS Mónnzás
Az összes RNS~t izoláltuk 3 napos nntttgbab sziklevéíböí, SF fótíd ΑΛ/? Zm/símg dyrúvn (Fromega) alkalmazásával. A cDNS első szálának előállításához az. összes RNS-t 1 órán ál inkubáltuk 48vC-on AMV reverz iranszkrtptázzai és Oiigo(dT)-lánei;5dítö>kkal, ftererse ?>r;«renpíí'oa· Sysfem (Promega) alkalmazásával. A e-DNS első szálai PCR-nék vetettük alá szensz és antiszetisz láncinili-ók alkalmazásával;
p.i reverz transzkripciós reakcíéafegyhez 50 ul oldatot adtunk, amely minden egyes lánemdiióböl 0,1 tnmoi-í, 0,1 saM dNT?-t, 2 tn.M MgQj-k 10 rnM Tris-HCl, pH-9,C> paffért, 50 31M KCl-t és 0,1% Triton X100-t tartalmazót;. Az első áena-urációs lépés után, amely 2 percig tartott 95'C-on, 40 ciklust hajtottunk végre; I perc 95’C-on, 1 perc 49 C-on és 2 pere 72'C-on. Az utolsó kiterjesztési lépés 8 percig tartott 7?.’C-on. A PCRtemékeket pCR2.1-vektorba szubldónoztuk a ?14 Civning &;í ílnvitroger·) alkalmazásával. és szekvenáiiuk, A PCR terméke két DNS-fragmms volt 744 és 780 bp hosszúsággal, mindkét DNS-fragmensnek azonos vol; az 5’ vége {vb. még 7, ábra).
Kezdve ezzel a két DNS-fragmenssel. 3 cDNS hiányzó 5 és 3' részeit .Rapid Amplifeation of cDNA ends” (RAGÉ) eljárással kaptuk meg, R-lCT Al? (Gihco-BRL) alkalmazásával. A reagenskészle; univerzális lánemdltóját alkalmaztuk snliszensz lancmdilöként, és szensz láneinditóként 5'......CTGGA,4Cí'GTCCCTGTGGTT-3’ (12. azonosítószámú szekvencia! vagy 5'......AGTGCÁCl'A.GÁGGGCCAGAA-3’ (13. azonosítószámú szekvencia) szekvenciát alkalmazísnk. A reagenskésziet rövidített horgonyzó láncindsicját is alkalmaztuk szensz láncí.r-dltőkéuk és astiszensz lárteínds tök ét; t 5’ T TCGAGCACCA€AATTGGAAÁT-.V (14, azonosítószámú szekvencia) vagy 5'.....-GAATGCAAAGaCGGCACGaTGAáT-u' (15. azonosítószámú szekvencia) szekvenciát tdkaimazúsuk.
a FCR~t 55'C-os tutneáíá»; hőmérséklettel hajtottuk végre a fen; feltárt körülmények között. Az 5’ és 5’ RACE-tennékeket pCR2, 1-vektorba sznbksónozhtk, és szekvenáltuk: a szubklósozotl íragmenseke· a dideoxinukleotid eljárás (.f&' fVtó'w /Jye '/etomsutor Q ck: &?ί?;,<ίν:α?ϊ« A'eödv reagenskészlet és ASi lú&SM 3(0 (jened? Aneifvser. Ferkin Elmer) alkalmazásával szekvenáltuk. T7 és ML3 első lánctríd hókat alkalmaztunk a pCR2.1-vektorba klónozott termékek szekvenálására. A kódoló régió mindkét szálai szelivenálttatíuk a Vlenna VBC Genomics-Sequencíisg Service által, infravörös jelölésű lándndítók (IRD70Ö és ÍRD80Ö) és ÚACÖr? Leng Re«.e ZR 4200 Ses/uencer (Lincoln, NE) alkalmazásával.
Az 5a és 5b ábrán a teljes eD'NS-t mutáljuk be, amelynek a mérete 2198 bp, és 1350 bp hosszúságú nyák leolvasási fázist tartalmaz )ü{i. ábra). .A nyílt leolvasási fázis (start kodon a 211-213. bázispárnái, stop kodon az 1740-1743. bázispárttá!) egy 510 aminosav hosszú fehérjét kódol, aminek a molekulatömege 56,8 kDa, és elméleti pl-értéke 7,51.
A ba és 6b ábrákon a Gk;NAe-«L3-fukozil-tmnszferáz eDNS-ből származtatott artünosav-azekvetteiájás mutatjuk be (2. azonosítószámú szekvencia). A2 aszparagín-kötött glikoziláció helyei az Asn34ó és Asn429.
A 7, ábrán a OkNAe-oiG-fukoíol-tratiszferáz cDNS-ί (felül), és a kódolt fehérje származtatott hidroíóbitási indexét iáiul) mutatjuk be sematikusan, pozitív hidrofóbitási index jelentése megnővekedett hidrofőbltás. A kettő között a kát fent emhtett FCR-terméket is bemutatjuk a teljes cDNS-hez való viszonyukkal.
A kódoló régiót a téglalap mutatja. C jelentést a javasolt citoplazmatikus régió, T jelentése a javasolt transz- 1? membrán régió, ós G jelentése a iranszferáz javasok katalitikus régióin a Golgi-készülsk üregében. A DNSszekveneia elemzése Tbjpred programmal (EMSnet, Switzeríand) alapján a feltételeseit transzmembrán régsó az Asn3ö és Gly54 között van. Az e.m:itn C-tennináiís része valószínűleg a katalitikus régiót tartalmazza, és következésképpen a Goigi-készüiék üregében kell lennie. Eszerint ez a transzferáz látszólag Π.. típusú trsnsKmentbtún fehérje, mint az összes eddig elemzett, glikoproteútek bioszintézisében részt vevó gíikozíi-transzferáz [Joziasse, Glyeobsclogy 2,271 -277. old. (1992)j. A szürke részek mutatják a négy trípf ikus pepiidet, a hatszögek jelenük a potenciális glíkoziiáctó» helyeket. Az NCBl-u kérésziül elérhető összes adatbankban végzett BLASTP-keresés hasonlóságot mutatott a GlcNAc-öí,3-fnkozií-transzferáz és egyéb sxí.SM-fukoztírtranszferázok, például VI, típusú emberi íükozil-transzferáz között. A teljes hasonlóság !8-2í%-kal (SIM-LALN-VIEW programmal, Espase, Switzerland) kívül volt bármilyen szigniíikancián. Mindazonáltal egy 35 aminosavbóí álló tartomány (4. azonosítószámú szekvencia) feltűnően magas homológját mutat más ai,3/4-{úsozii~iranszferazokkai (8. ábra). Ezen szekvencsarégió a 2, azonosítószámú szekvenciába·: a GÍ«2Ó7 és Eredői között helyezkedik ei, s- Pétóa: B.9.k9.(n.WÁgsGigNAe-«.l>feknz?iA íeíiéteíezett GleN/Ae-ixlJ-fttkczil-tiaaszíéráz kódoló régióját, beleértve a citoplazmatikus és transzmembrán régiót, amplifiká-tuk az 5'-CGGCGGATCCGCAATrGAATGATG-3’ első lárteinditö <16. azonosítószámú szekvencia) és 5'-€CGGCTGCAGTÁCCAITFaGCGCAT-3' reverz láncindiió <17. azonosítószámú szekvencia), és az &spa?íd Hígé Fi3e/úy PCR Swrrttm {Boehringer Mamtheitn) alkalmazásával. A PCR-íerméket kétszeresen emésztettük ?st I és Bam Hl restrikciós enzimek alkalmazásával, és aikallkus foszíaiázz&i kezeli pVL1393 jelű bakulovírus íranszfervektorha szubklóuoztuk, amelyet előzőleg Psi í és Sámlii enzimekkel emésztettünk, A homológ rekombináció biztosítására a transzfervektorr Bűcuío Gmk/ vira? ö/Gí-val (PharMingen. San Diego, CA) kotransziektáituk Sí9-rovamejtekbe lipofekiint tartalmazó 1PL-41 iápközeghett. Öt napon át tartó 27€~os inkubáció ntáa a rekombináns vírus; tartalmazó félíilúszó különböző térfogatú menvnyiségeii alkalmaztuk: Söl-rovarsejtek fertőzésére. 5% FCS-t tartalmazó l'PL-4- tápközeghea való, négy napon át tartó 27T'-os inkubáció utón az Sfl-sejteket begyűjtöttük, és kétszer mostuk foszfát-pufíereit söo’dattal A sejteket 2% Triton X-löO-at-tartalmazó 25 taM Tris-HCl, pí í~7,4 puiferben újra felszuszpendáítuk, és jégen ultrahanggal feltártuk.
<>· péláa: ÓjrNÁ^ul^fekpzíl-fe^s^áz ak8áyírés.msguljrtí.glaá§a
A honrogenízátumot és a sejtek íeiüíászoját GleNÁc-ul.S-fukoztl-transzferáz aktivitásra teszteltük. A vak minták dohány 1. típusú G’cNAe-transzferázt tartalmazó rekombináns bakuíovírusl tattal mázták IStrasser és mtsat., Glycobiology, nyomdában],
A 9, ábrán a rekombináns GlcNAc-ai,3~fhkozi1~tr&nszferáz, valamint a negatív kontroll enzimaktlvitását mutatjuk be. A legjobb esetben a koíranszfektáh: sejtek és íelulúszőiuk enzimaktivitása 30-szor magasabb volt, mint a negatív kontrolié. Az endogén aktivitás, ami a rekombináns transzferár: hiányában ís mérhető, alapvetően a tovar «Ló-fukozil-transzferázátöt származik,és estik kis százaléka származik a GlcNAc-«l,5-iukoAMr;raszferáztól. Ennek megfelelően a GicNAe-ölG-íúkozil-transzferáz aktivitás növekedése a rekombináns bakulovirusokban jóval nagyobb, mint íOö-szoros. Az enzim, széles tartományban maximális aktivitást mulatott p.l.i 7,0 körül, ha az aktivitást 2“fN-mo!ÍbUuo)etánszulfonsav-HCl puffét jelenteiében mértük. Mini ahogy a 2. táblázatból nyilvánvaló, kétértékű kationok, különösen Mn2' hozzáadása javítja a rekombináns trartszferáz aktivitását.
- 182. táblázat
Addibv Relatív aktivitás (lö mM koacesaráeíó) Akcepior: GaGu-pepüá
kontroll 21
EDTA 18
MrtCl· 100
CaCÍ? 82
MgCI; 52
GdClj 44
CoCl, 35
CuCb 3
NiCb 24
ZnCb 0,0
A 3. táblázatban bemutatják, begy az alkalmazott akeeplarok közül a GnGn-peptiá mutatja a legmagasabb beépülést arányt normális körülmények között, szorosan követve a Gn.GnFc-peptíd és M5Gn-A»n által. Nem találjunk transzfert az MM-pepúdrs, amely nem tartalmaz redukáló GícNAc-véget a 3-kötött mar-nózon. Ez a szerkezet szükségesnek látszik a mag fuiiozil-Íranszferázok számára. A rekombináns transzferén ezenfelül, inaklív volt a közönségesen alkalmazott akeeptorokra, a. vércsoport meghatározására alkalmazott a,3/4-fnkozi;transzferázokhoz képest, amelyek az oíigoszseharidok nem redukáló végét? lévő GlcNÁc-ra transzferálják a fokózt. A látszólagos Ks,-érték az: akeeptor GnGn-pepdá, GsGnpÉpepud, MSGn-Asn sznbsztráíra, és GDPútköz donor szubsztrátra vonatkoztatva sorrendben 0,19, 0,13, 0,23 és 0,11 volt. A molekulák szerkezetét a iötös 10b ábrákon mutatjuk be.
Akoeptor szubszöál
3.. táblázat
Relato aktivitás
Κ,,-érték
GnGn-peptid
GnörsFvpepíid
M5Gn-Asrt
MM-pepúö
GalfMGleNAc
Galpl-3GleNAe
Galg 1 - JGlcNAcp 1 -3Gaip 1 -4Glc
7í>:
100
S7
Ö ö
mM
0,1.9
0,13
0,23 réz termék tőmegsoektrometrlája
Dabzilesett Gnört-peptidet 12 tűnd) a rekombstárts GlcNAc-«-l,3-ftJkozáí-transzfefázt (0,03 mü) tartalmazó rovarsejt hornogenízátutntnal iskubálmnk nem radioaktív GDP-L-fukóz (10 tusai), 2'(N-tn«riöi.ino)ei:án- 19szuIfonsav-HCi puffer. Intőn X-iöö, MnCU. GleNAc é» AMF jelenlétében. A negatív kontrollt a. vak minták fertőzött to varsejtjeinek homogenizátun-ával készítettük eh A mintákat 16 érén át inkubáituk 3?®C~oa, és MALDl-TOF A1S slkateazárévsl elemeztük. A törnegspekirorne-riát IKlAbhVG (Thernno BioAnalysis, Santa fe, NM) készüléken végeztük, amely dinamikus estrakcióra képes (ez a késői extrakci-á .szinonimája}. Kétféle niátrlx-nmré-késziiést aikaln-sztuttk: peptídeket és dabzíláh giikopcptideket 5%-os hangyasavban feloldottunk, és alikvötok&t adtunk a ürgéihez, levegőn megszűrhettük, és 1% a-ciano-4-kulros i-fabéjsavval fedtük fe. Fmidilaminák glikánokat, redukált oagoszacharidofcat, és származékok nélküli glikopeptideket vízzel hígítottunk, a targethez adtunk, és levegőn szárítottunk. 2%-c-s 2.5-dilúdroxybenzoesav hozzáadása után a mintákat azonnal megszárítottuk vákuum alkalmazásával.
.A il, ábrán ezen minták femegspektítur-út mutatjuk be, A a negatív kontroll: a fö csecs tS) mutatja a D^ízd-Val-ölj'-Glu-íGlcNAc^Mau-.jAsn-Arg-'nir szubszirútot, a számított (M-Hf-erték 2262.?. Ezen sznbsztrát nátrium-addímós terméknek tűnik, és egy kisebb ioné, amely a Dabzii-csoporí Azo-íut?kdőj átrak fragmentációjávai keletkezett (S*). Kis mennyiségű termák (P, [Mr lí]'“2408,4} az endogén α-1,6-fukoziisrartszfer-áz következménye. Az m/z^2424,0-nál lévő csúcs a szubsztrát nem teljes degaiaktozilálódásáí mutatja. A 8 jelű törnegspekUum a rekombináns o-LS-fUkozil-trat-sz.feráz.í tartalmazó mintát mutatja. Λ fö esiács (?) a fukozdált terméket jelenti, <?*} annak frégmemált ionja.
Ezenfelül mindkét minin aiikvoíjan kevertük egymással oly módon, hogy a szuhsztrét és termék hasonló koncentrációi: kapjuk (A jelű minta). Ezen elegyet lő mlJ N-glikezidáz-A-t tartalmazó 0,1 M ummöniumacetáitai ípffebO) (B jelű minta) vagy töO ml) (í Lí enzim 1 mmol «zubszrrátot hítírolizáí i perc alatt) Nglikozidáz--r-t tartalmazó Sö mM Trts-HCMel (pH~4.ö) (C jelű minta) hígítottuk. Két és 2Ö óra elteltével ezen elegyek kis alíkvotjait véstük és MALD1-TOF MS-sel elemeztük.
A 12. ábrán az A. S és C jelű minták tSmegspekírnmái mutatjuk be. Az A jelű emésztetlen minta két fe csúcsot rnutíí-.· a szubszírátet 2261,4 m/z-rsél, és a. fukozilált termékei 2407,7 tn/z-nél, A középső görbe a 8 jelű minta tomegspektrumát mutatja, amelyet N-glikozidáz-A-val kezeltünk, ami hidrosizálja mindkét ghkopeptsdet. A 963,32-néi lévő csúcs a degíikoziiál- terméket tartalmazza. Az alsó görbe a € jelű minta tőtnegspektrumáí mutatja. Az N-glikozidás-E nem képes hidroiizáh-í az «-1.3-fúkozüáit szubszöátokat, tehát a spektrumon ott van a fukozilált termek csúcsa 2406,7 tn-'z-uél, míg a hidrokzálí szubsztrát 963,08 m/z-nél található.
8. példa: Ajúndk-ammált, fWQ?ÍB.r.4.4szf^
A két fent leírt mintát (fukozilált termes és negatív kontroll) N~glik<sódá.z-A-val emésztettük. A kapott oügoszacharidokat pirídíl-amínáltuk, és fordított fázisú KPLC-vel elemeztük fWilson és mtsai., Gtycobioiogy 8, 651-661. old. (1998); Kubelka és mtsai., Arcb. Bíochem, Biopbys. 308, 148-45. old. (1994}; Kasé és mtsai., J. Bíochem. 95, 197-2Ö3. old. (i984}].
A 13, ábrát? a felső, B jelű diagramon mutatjuk be a negatív kontrollt áltól a maradók szubszfrát (GaGnpeptíd) melleit α-Ló-íukoziláit termék is látható. Az A jelű drégrartmn alapvetően rövidebb retencíós idejű csúcs vart, ami a redukáló, GluNAc-a-l,3-hoz kötöd fokozta specifikus.
Az alsó diagramon az izolált transzferáz terméket N-aoetil-p-giakozart'ünidáz emésztés előtt (A jelű görbe) és után (B jelű görbe) hasonlítottuk össze MMF házi méh foszfolipáz-Arvel (C jelű görbe).
-20S/Üveí!£Í5sHs<<;
<210> 1
<211> 2120
<212 > Cl
<23.3> a&véxry
<4 00> 1
se feaactcas acgetgcatfe. ttetttttte tttsagggae eeateeaecc sísscsecse 03
saaaaaeaac agcafigcfegfc- gtttttttta legfeletttt tctfelsfiscs. sgcsceccca 120:
fccafcggaafcc gfcgctcatss cgcaaaaatt ttecetfctcc; ct.fe.fe.gatttt tagttisttt 180
tgeggaattg gcsgfefegggg g égess ttes: sfe:g;stgggte tgttgacgas te 11; cg agg;; 240
tcg«gaacag stggcgceca aeasgacagc ttscceettt feggetccggg aggcaaccca :300
aagaggaaat ggageaatc.t aatgcctett gtfegttgccc fctgt.ggt.csfe •egeggagate 300
gegtttctgg gtsggfetgga tst ggccaaa asegccgccs tggtfcgacte ccfecgetgac 420
tt ct ':·?. t sec gctetcgagc ggtcgttgaa ggtgacgatt fcgygytcggg tttggtggct 480
tctgatcgga attctgaatc gta legfel;, gt gaggsstggt tggagaggga ggaégccgtc 54 0
aegtattcgs ggggci: tfefec caaagagcct afeetttgttfe etggsqefega teaggagteg 000
aast.cgtgtt cygttggstg aeaatttggg tttagtgggg ataysa.agee agatgccgca 002
fcttggetfeac i. <; ...:::1. :: c a ·λί g tggaaeegcfe: ageattctgc gst.ca;st:gg<a afe cagcagas 720
tactátgctg agss ce afe:sfe: tgccatggca agaege segg gatataacat cgtaatigsca 200
accsgfe ctst cttcggatgfe. fecctgttgga tatfcttteat gggetgygts tgacsfe.gafeg 840:
gcaceagtgc agccgsaaac tgssgcfegcfe. ct t g ca g c t g; gt t ·: csille caafetgtggt 00:0
get cgaaatt tceggttgca. sgctcttgsy gecct.tqsaa aatcaaaeat csat a fel. gat. 0:00
te ttatggtg gttgtcscsg csaccgtgat ggssgaatgs acaaagtgga agecetgaag 1020
cactaeaest ttfigettágc gtttgsaa&fe. tcgastgsgg aagafctatgt aacfe.gsaaaa 1080
ttct fe ecsa t ecettgetgc tggaactgte cetgtggttg t fe. ggtgetcc sastattess 1140
gactttgcfe.c efeletectgg tt. caa. t.t: tta ca tat fess ág- agafeagagga tgttgagtcé 1200
gttgcaaags ecstgegats tetageagaa ast eccgaag catsfcaatcs a tea fel segg 1200
tggaagtafcg agggccca te ege c t ce t feie aa.ggeecétg fcggatatggc agctgfegcat 13:00:
tea t.cgtgcc gtetttguat. tcacttggee scsgCgegfea gagagaagga s. gas.:u as s 1000:
ccssgcetífi sgsgaegtec fetgcaagtgc aetagaggge cagssficcgt atálcátatc 14 4 0
tacgtesgsg fia.agggg&ag gt t. tgagsfe.g cíagtccattt acetgaggtc tagess;: feles 1500
actctgaaLg etgtgesggc tgctgttgtt ttgsagcécs cstcccfe gaa feefcéytgeefc 1500
gtatggaaga etgasfiggcc tgasgttsta agaggygijga gtgcatfca&a aetctscsas 1020
saataccsaa ttg-gcttgec scagaigacsa getetttata cc fele egei: fe. Cfifisggtgat 1283
getgatttcs. ggsgfeesett ggagsscesfe ccttgfegcca sgtfcfcgasgt cattettgtg 1740
t-agcstgcgc taaatggtac etetgetets ccégsatteg cfe.tcacfctag etgsgcaets 22:00^
setagagt fe t. taggaatgsg tstggeagég a.atstggcat ggctfelatfcfe; atsectagat IS oo
tctfcggecaa ct cat bgafcg fe tere tata;· ga c at ca ca c tttsaéttta aaettgrfefe e 1020
tgsagfifigtg eaaatscata tttssfegett agtfefe:tagtg etettstetg atcstctsgs 1550
agteacsgtt ettgt at :stt gtgagtgess acégsas cet se:: aga agg a tcagafcgttl 2043
csctcasgac sca fefe attac tfccatgttgt tttgatgatc fe; ecetefe fe: t.t tfeagtgtcfeg 23.00
gaactgtcee tgtggttt.ga qeac ctg fel a ttgcttcagt gttactgtcc agtegéta te 2150
gfettttgscc tefcaaaassa aaa sas-sasa sasasasa 2158
•2i <2ΪΩ> 2 <2ll> 510;
<212> 2222 <213> növény <4Q0> 2
Met Mer Giy ree Asn Lee Arg 16 ?. V <v •:nr Asp Gl V ·: T Ais
ülői Gin Asp Sex Leu λ*\ΧΌ \Ά .χ Χ,'ξχΐ} Als;: Pro Giy Giy Asn Pro lys Arg
i O 33? 20;
L ysr T ee Ser Asn Leu :?Xéí‘ Pro Lse vul 3 cS:l. X\ j < ,$>u vei Vei Iie AiS
35 42 z
.gl-vy Lla LOS: .l€Q :,3 ly Arg Ic’u Asp· [1¾ t’ •<l*í ·* .'•xi « Lys Aun Aie Ais elet
b. j'·’· 33 g.g
V a 1 χ··-Φ ’C* Űk *^ Les AT& Asp Phe Phe ’i'yr Arg Sexe X'iv.VT»· ΛΤ. << Ara Vei Val X-d . . Ά. j. X;
65 “j A .· V 80
£ v y Aep Asp Leu 511.7/ Leu yx -ί λ * ÜÍ U. v' Leu 7:¾.}. A.lU 3e í? Asp Arg Asn Ser G1 u
0 c„ <.x? gg 2:5
S^x Ty;:' Ser Cys Giu Giu Trp Le-xj Giu Arg G2.u Asn i- íiú'U Vei; r!' hi Tyr
200 iSL i;LG
Ser Arg Giy Phu Ser Lys G.í u Pre He Tl·*- 7jLH'tL 7·3.χ P'ex' Giy Ais Aso Gin
51x3 222 225
Giu Trp Lys; Ser / 5)¾ X yii Giy Cys Lys UTV: P<3 r Giy Asp
133 140
Arg Lys Pro AsO ?:í Phe Giy UUU Pro .—ί ·'; v. Pro S^'Xx xuy Thr Ά Ϊ ·'
245 ISA η Ca <; iPO
3?^ X* lle Ar g Ser Met GlU Ser A :; Glu 'txrr Tyr vX-i. jS* Gin Asn
IfeS 12: LA5
n*. Α·:·3. Met Alá Άτρ Ar g Arg Giy Tyt A^STí lle Ősi PL$ í* Thr Thr Ser
32 jjyS 183 i2ö;
Leu Sex* Ser Asx? Vei Pro w Giy Tyr Phe Sur Alá G.xu Tyr Asp
: 95 200 225
Mer; Pfet Alá Pre X *. X VQi ca v., Pro r< y.s Thr •&L.u Al® T <v L^u Ais rX.i.U Aj. u
210 225 .2 z 0
Phe 2.Le ?v Λ V Asfl CVs Giy Al a Arg X> Phí: Arg í őu G.Le Ais Leu Giu
225 7 -Xe 235 2 40
Alá Lee öle; Lys Ser Asn He Lys iie Asp Ser .{yx. Giy ni X7 — -Μ- Cys Mr u
ö.·: x 'í -.y 3 5 0 255
Αβχχ Arg Asp uuy Arg ξ/·;, .;· Arn Lys Isi. Glu Aia Lí3U. L VU His Tyr
2 hí) 255 ;23§;
Lys Phe Ser X (<X”2< Ara Phé ' ”3 Arn GxUr Gin Giu Asp Tyr Vei Th r
/7 5 230 285
Giu Lvs Phe Phe X'il 7-, i\>y Leu Val AIS Giy Thr •cysv \ VC* Pre Vei Vei; Val
222 2 2“ 30 ö
Gly Alá Pro Asn Tie Gin Asp Phe ..'X ... -:i Pre Ser Pro Gly Ser Tie Lse
305 310 315 320
kis lia .Lys: Giu lig GÍU: Asp :VáÍ Gla: Ser Vei Alá Lys Thr Gefc Arg
325 220 335
Tyr Leu Ara GÍU : ASX: Pro Giu Aia Tyr Asu Cin Ser TAG Arg Trp Lys
3« 345 353
Tyr Giu Gly Pro Ser Asp Ser Phe Lys Alá Leu Val Asp Met: Ai a Alá
255 350 3 SS
Vsl v ;- Ser Ser Cys Arg Leu Cys Tie His Lee Aia GAP Vei Ser Arg
370 375 330
Glu Lys Giy Giu Asn Asp arc Ser Leu Lys Arg Arg Pro Cys Lys Cys
3S5 33c 335 4 ÖL
Thr :&2'£f GLy Pro Giu Thr Vei »r: Pisi Tie Tyr Ve 1 Arg Giu Arg Gly
455 410 415
Arg the Giu Gefc? Giu Ser Tie Tyr TAG Ar g Ser Ser Asn Leu Thr Lee
42:0 422 430
Asn Aia Val Lys Aia Aia Val Val Leu Lys Phe Thr Ser Le·:; A.SXs Leu
425 440 44 5
Val Pre Vsl Trp Lys Thr Giu Arg Pro GlG Val lle Reg Oly Gly Ser
4S5 455 4SL
Alá Lsa .Lys Leu Tyr Lys 1 ie Tyr Pro iis Gly Leu' Thr Cix; Arg Cin
465 470 475 130·
Aia Leu -'y- Thr Ph® Ser Phe Lys Giy: Asp A.l a Asp Phe Arg Ser His
451 4 30 455
Leu Giu Asu Asu Pro Cys Alá Lys Phe Giu Val Lle Phe Vei
500 W 313 <210> 3 <211> LOS <2Í2> ÖRS < s (-17-,2 ''es SZt -V <220 >
<2 2 3 > Mas & e r s á c e s s s e kva χ · o i s leír á c a; eSG S <400> 3 eaegecctge agceufcacsá aiifcsgcfcta gegtttgase áttegaalga ggeágattat »0 gtaacfegasa eattcrtooa atacofc getggaactg teccfc 155 <210> 4 <211> 35 <222> PAT <213> Aesfcsrséges s:-ze;kvsnc:la <2.2 0>
<2 2 3> Re s fc erségss s zekvsn cla lelr Asax pepfc1c <4 00> 4
Gle Alá les hys His Tyr Lys The Ge r les Alá Phe Slu As;; Ser Asn
r 5 TG 22
® GJ..U Asp Tyr Vai Thr SZU Lys Phe Phe Gin Ser Les Val Als í:tl. y
20 22 30
Thr val Pro
<21G> 5 <2.U> 25 <222> 22Τ <213> Mesterséges szekvencia <220 <223.> Mesterséges szekvencia leirássrpeptid <20 5
Lys Pro .Asp Alá Xaa Phe Gly Leó. Pro Gin Pro Ser Thr Ara Ser IS 20 55 <22O> S
A25O TG <212> 02 <2 23.> Mesterséges szekvencia:
<220>
<22 3> Mesterséges szekvencia leírása:peptid <500> f$
Oo Giu Thr Vei Tyr Kis Oe Tyr Vai Arg 5 5: OT <21O> 7 <2 55> 23 <O2> RRT <2 13> Me sterséges s rekvartciá <220>
<223> Mesterséges szekvencia: leírass:pepiid
OO 7
M?ít: Glu -Ser Alá: Glu Tyr Tyr Alá Glu Asn Asn Ile Aia 1 ö 05 <220> 8 <0.0 TG <20· RRT <213> Mást er sé ge s sec kvencia.
<220>
<223> Mesterséges szekvencia leírásaxpeptid <400> 3
j. :o: Phe Sitt Bei 21c Ser éle Tyr Lee 5 1Ό
<21ö> $
<211 > 29
<212> DNS
<23.3> Me st e r s ege s s z.s kve ne :i. a
<220>
<223> Dúst ervéges szekvencia leírása;DNS <100> .9 gcnge rtayt avgeegaraa yaayathgc
”x.<- i A? ·** Ív
<2ll> 22
<212.> CMS
<213> Mesterséges s::ekvencia
<220>
<223> Mesterséges szekvencia leiráss;: ONS- Λ Λ
'x^íW >' <L V
crtad:: jurtg rtanácnetv te 22
<210> 11
<2I1> •ώ v
<212>
<213> Mesterséges s zek ven ciá
<220>
-·· Ο Ί1 ·'< x . > - ct ΛηΟ - - Mesterséges szekvencia leírása:DBS
< 4 Ö 0 > 11
tadstnswyt ccatytcraa 20
<2ie> 12
<211> 20
<212> T\X'i< ,c?gy.s>
<211> Mester séges s zskvencis
<220>
<2:2 3 > Mesterséges szekvencia lelrése;DNS
<40ü> 12 ctggaactgt cccfcgfcggtt 20
<210> 13
<:21i> 2
<2i2> DNS
<213> Más tességes s sekre a·:: ia
-25<222> Mess:erségsís: szgkvenci.á leírása: DNS <40C> 13 agfegcsstag a gggtcag «« 2 S <210> 14 <21!> 22 <212> ÖRS <213 > Me ;s ·:.··;r s ég s s s z a kv<=:r;c re <22 0>
<222> Kasfeerséges szel.<er<:.i a leírássá: DRS <4 00> 14
Wcgagcaee araaétggaa at 2.2 <21ö> 15 <21!> 24 <212> DRS < 213> Més fe ersséges s ze-ksfetwí á <220>
<223> Mesterséges szekvencia leírassa; 2RS <4C0> 15 gaatgcasag acggcacgafe geefe 24 <210> 15 <211> 24 <212> 22 < 213 > Mestersége ss ss ss e k v a a z l a <22é>
<223> Mesterséges szekvencia leírásaífeMS <4(12- lé c^gcggátee gcaatfegaat gatg 24 <21G> 17 <2 ·.!.> 2 5 <212> 3RS <213 > Mesterséges s zekvencía <220:>
<223> Mesterséges .Szekvencia ieixé.s-ax:2RS <400> 17 ccggcigcag fesceattiag cgcát

Claims (28)

  1. Szabadalmi igénypontok
    I, .BőíS-molekala, amely toríahnazza az-1, azonoshttszfe szerinti szekvenciát, egy «yüt leolvasási fázissal a 211 ,-től az 1748. bázispáríg, vagy szekvenciája legalább 50%-ban homológ a lenti szekvenciával, vagy hibridizái a fenti szekvenciával szíringens. körülmények közöd, vagy olyan szekvenciát tartalmaz, amely a lenti DNSszekvessciáboz képest a genetikai kád érteimében degeneráít, és amely szekvencia ftteíí-íranszféráz aktivitásán növényi fehérjét kódol vagy azzal kontplesnenter.
  2. 2.. Az 1, igénypont szerinti DNS-ínoleknia, amely GfeNAé-aifai,3-fi.tkozii-transzferáz áktlvltásü, előnyösen ?«ag-allái,3-felíozii-ir8sszferáz aktivitású fehérjét kódol,
  3. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti DNS-molekula, amely legalább 7 Ö-8Ő%-ban, kliiönöseti előnyösen legalább 9S%-ban homológ,-az .1,. szonesitösízáJmi szekvencia szerinti szekvenciával,
  4. 4. Az. 1-3. igénypontok bármelyike szerűn? DNS-moleküia, amely 2150-2258, elő?xySssn 2198 bázispárt tartalmaz,
  5. 5. BNS~?nsleiísla, anxeiy a 3, azor?osííöszá?x! - szent í< \ vk\e ?< iát tartalmaz, vagy olyat? szekvenciái, amely legalább 85%-ban, előnyöset? legalább 95%-bas homo.og a festi szekvenciával, vagy híhrídízál. a festi szekve??masal szíringens körüln?é«yefe kozott, vagy a fenti DNS-s/ekvcocához képest a genetikai kod értelmébe» áegenerak
  6. 6. DNS-moleküia, amely az 1-4,. igénypontok bármelyike szerinti DNS-molekula részleges szekvenciáját íaóaimazza, és legalább 88%-bast homológ az I. azonosítószámú szekveneis szerből szekvenciával, és a ráérnie 30-50 bázispár.
  7. 7. Az i-ő, igénypontok bármelyike szerinti DNS-molekula, mely kovalensen kapcsolt egy detektálható je~ földanyaghoz.
  8. 8. Biológiailag működőképes; vektor, amely i-7. igénypontok bármelyike szerinti DNS-moiekaW íattalmaz,
  9. 9. Biológiailag működőképes vétóm; amely i-7. igénypontok feánnalyike szerinti DNS-xnofekuiái tartalmaz: a pj'Omóterhez képest ellent étes irányítottsággal.
    18. Rlbozlmoí: kódoló DNS-jaolekaia, ;rmely;?ak két: szekvenciarésze van, melyek mindegyike legalább 1Ö1.5 bázispár hosszú, és amelyek komple?nenterek egy 1-7. igénypontok bármelyike szerinri DNS-moleküia szekveneiarészeivei oly sstótíon, w a ribözlm komplexei kepe/ a természetes GtoNÁc-aífeLJ-ihkoziiito?xszferáz ÖNS-moÍekuÍá??óÍ átlri do mRNSrsei, és elvágj®:azt,
    II. Biológiailag működőképes vektor, a?nely 10. Igé?xypöst szerint? Ö'MS-?®oiehuiát íurialntaz,
  10. 12, Eijárás 1-5. igénypothöfe bármelyike szerbül DNS-snoieknlát. tartalmazó cDNS előállítására musal feífeímsrve, begy 8NS-E izolálunk növényi sejtekből, előnyösen szikievélsejlekhöi, és az RNS-rsel revem transzkripciót hajtunk végre re-verz írauszkríptáz és lánemdltök hozzáadása után.
  11. 13. Eljárás GíeXAe-a? fo 1,.3-hikozíl-toaitszferáz klónozására ítrrp/ygfe^eave, hogy vektorba klőjtozsh 1-5, Igénypontók bármelyike szerinti DNS-moidtótíát gazdasejíbe: vagy gazdába transzfektálunk, a transzfektáll gsz~ dasejfek szelekciójával és szaporításával sejtvonafokat ?tyerönk, amely sepvemttek az. aktív GicNAe-olíalJfekozii-basszferázt expresszálják.
  12. 14, Eljárás rekombináns gazdasejt, előnyösen növényi sejt, növény előállítására, amelynek GleNAcai:iál,3-fekozil-b'ansz&ráz termelése szupresszált vagy teljesen gátolt. «rra/jW&wesve, hogy legalább egy, &, 9 vagy 11. Igénypont szerinti vektort vagy 1-7. igénypontok bármelyike szerinti DNS-molekulát tartalmazó vektort - ahol a DNS-szokvencia deléeiőt, mzercíót és/vagy helyettesítéses mutációt tartalmaz. - juttatunk be a gazdasejtbe, vagy uövésyybe.
  13. 15, Eljárás rekombluárargazdaseji:, előnyösen növényt sejt vagy növény előáliitására ozeo/teeíítísve, hogy ax: 1-7. igénypontok bármelyike szerte DNS-molekulát - ahol a DNS-szekvencia deléciót, teerciot és/vagy helyettesitéses mutációt tartalmaz - juttatunk be a gazdasejt vagy növény gtmontiáha a netn mutált, homológ, szekvencia beiyén, ló, Rekombináns 'sövény vagy sövényt sejt mázd/e/fesíuzve, hogy abba legalább egy, 8,9 vagy 11L igénypont szerint! vektor vagy 1-7. igénypontok bármelyike szerte DNS-tnoleknisí tartalmazd vektor ahol a DNSszekveneia deléeiőt, inzsretét és/vagy helyettesítéses mutációt tartalmaz - van bejuttatva, és az endogén GlcNAo-siial ,3-bikozii-öanszlbráz termelése szupresszált vagy teljesen gátolt,
    Í7. Rekomhinátss növény vagy növényi sejt,, assa//g/femeere,, hogy az 1-7.. igénypontok bfesélyíks szerinti DNS-molekula ahol a DNS-szekvenela deiéeioí, tnze> csőt és/vagy helyettesítéses mutációt tartalmaz - van bejuttatva be a sejt vagy növény genomjába a nem mutált, homológ szekvencia helyén, és az endogén GlcNAcaífa 1,3-lbkosí 1-transzferáz tetmelése szepressxsk vagy teljesen gátolt.
    IS. Pepiid-nukleinsav molekula (PNSl, amely az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti DNS-molekula szekvenciájával, és annak részleges szekvenciáival komplementer bázisszekyetscláí bírtalírsaz.
  14. 19. Pepííd-nuklemsav molekula tP\S\ amely az M, igénypontok báímelyike szerinti ÖNS-nmleknla szekvenciájának és annak részleges szekvenciáinak tneg&ieíö bázisszefevenciát tartalmaz.
  15. 20. Eljárás növény vagy sejt, előnyösen növényi sejt - amelynek GlcNAc-3lfal3-Sátt>xiMrttBSxferúz exprsssziója transzkripció vagy transzláció szintjén gátolt - előállítására ózzíí/ /eteve-oe. hogy Ik. vsgy 19. igénypont szerinti FNS-o-oiekuiát juttatunk be a sejtbe,
  16. 21. Eljárás rekornbináns gíikoproiein előállítására. «ssaijW/wem, hogy a lö, vagy 17. igénypont szerinti rekombináns növényt, növényi: sejtet vagy növényi szövetet, vagy olyan sövényt vagy növényi szövetei vagy sejtet, amelybe a 18, Vágy 19. igénypont szerinti FNS-molekula van bejuttatva és amelynek GíoNAe-ulfalDőakozil-transzferáz expressziója transzkripció vagy transzláció színijén gátolt iransztfekiáiimk a glíkoproieim kódoló génnel, oly ötödön, hogy a rekombináns glikóprotsin expresszáiődik.
  17. 22. Eljárás rekombináns emberi gflkoproteín előáliitására rcteye/fernssve,hogy a 16, vagy 1:7. igénypont szerinti rekombináns növényt, növényi sejtet vagy. növényi szövetet, vagy olyan növényt: vagy növényi szövetet vagy sejtek amelybe a ÍS. vagy 19. ígénypoth szerinti DNS-molekula van: bejuttatva és amelynek GícNAoal&l^-fekoaáí-tettsiEterfe expressziéin transzkripció vagy transzláció szintién gátolt transzíeklálunk a gliköprateíní kódoló génnek oly módon, hogy a rekombináns gíikoproiein expresszáiődik.
  18. 23. Eljárás orvosi alkalmazásra való rekombináns emberi gítkoproteín előállítására hogy a lő, vagy 17. igénypont szerinti reksmbmáos növényt, sövényt sejtet vagy növényi szövetet, vagy olyas növényi vagy növényi szövetet vagy sejtek amelybe a 18, vagy 19. Igénypont szerinti ENS-moiekuia van bejuttatva és amelynek GfcNAe-al&iG-fokozll-transzféraz expmsxíója transzkripció vagy transzláció szintjén gátolt: íransxlekíáhmk a gbkoprotemt kódoló génnel, oly módon, hogy a rekombináns glikspnotela expresszálédtk.
    .
  19. 24. Eljárás GfeNAc-atfe.1,3--Tukúzs1-lraííSz&rázf kódoló SNS-molekölák kiválasztására mintában: azzal jellemezve, hegy 7. Igénypont szerisí; DNS-molekalákat adunk a mintához, amelyek kötődnek g GlcHAc-alfel ,3~ fekőztl-transzferází kódoló DHS-tnöfe ládákhoz.
  20. 25, A 24. ígénypoot szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy mintaként sövény genomiálls DNS-ét tartalmazó mintát alkalmazunk.
  21. 26. Eljárás rekontntnáns gliknprnteiu előállítására, amelynek során rekombináns gllköproterat termelőnk növényekben vagy növényi sejtekben, amelyeknek GleNAe~alfei,3-fekozli-transzferáz termelése sznpresszált: vagy teljesen gátolt és amelyeknek endogén OkNAc-alfííLJ-fukozd-traííszferaz akovhása a természetes növényekben vagy növényi sejtekben előforduló GlcNAc-alfa 1,3-lukozil-banszfcráz aktivitás 50 %-ánál kisebb, és a GleNAc-alfel ,3-fekoztl-íranszferáz egy olyan DNS-molekniával van kódolva, ntnely tartalmazza az 1, azonosftószám szerinti szekvenciát, egy nyílt leolvasási fázissal a 211.-tói az 1740. bázispárig, vagy szekvenciája legalább 50%-ban homológ a fenti szekvenciával, vagy hihridlzál a festi szekvenciával sztringens körülmények között, vagy olyan szekvenciát tartalmaz, amely a fenti WiS-szekyescíáhóz képest a genetikai kód értelmében de
  22. 27. A .26·. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a rekombináns glikoproteín embert; glikoproteín, különösen orvosi alk?almsxásr&.
  23. 28. A 26. vagy 27. Igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy endogén GleNAc-&lfel,3-fük<szii~ iranszferáz aktivitás a természete» növényekben vagy növényi sejtekben előforduló GiöN Ac-alfa i,3-&koziitranszfémz aktivitás 2Ö %-ánál kisebb.
  24. 29. A 26-28. igénypont szennti eljárás össra/yíf/Zeme^'e, hogy endogén GleNAe-alfat.3-feke>ál-bn«S2;feráz aktivitás a természetes növényekben vagy növényi sejtekben előforduló GlcNAc-aitá!,3-fbkoztí-transzféráz aktivitás 6 %-a.
    38. A 36-29. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a GfeNAc-alfel G-inkezil-transzferáz aktivitás csökkentései astíszensz gátlással végezzük, ahol egy polinukle<slidot alkalmazunk., amely legalább részben komplementer a DNS-mofekóla szekvenciájával,
  25. 31, A 2ó-3Ö.: igésrypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a GlcWAe-aifei,3~ötkozl!-transzferáz: aktivitás csökkentését a DblS-molekala szekvenciájának knock-out imitációjával végezzük.
  26. 32, Növény vagy növényt sejt, amelyeknek ÖicNÁc-ál&lJ-bátozil-transzferáz termelése sznpresszált vagy teljesen gátolt és amelyeknek endogén GleNAe-alfal ,.3-iuk<utu-traa.szíeráz aktivitása a fenttészetes növényekben vagy növényt sejtekben előforduló CílebiAc-allál,3-fekozil-tmnszferáz aktivitás 5Ö %-ánál kisebb, és a GIcNAca.lfai,3-fekozil-transzferáz egy olyan DNS-molekuláyal van kódolva, amely tartalmazza az 1. azísnositószám szerinti szekvenciát,, egy nyílt leolvasási fázissal a 211.-től. az 1740. bázispárig, vagy szekvenciája legalább 5S%-h&n hosttolőg a fenti szekvenciával, vagy feíhrtdtxdl a fenti szekvenciával sztringens körülmények között, vagy olyan szekvenciát tartalmaz, amely a fenti DbiS-szekvertciáhox képest a genetikai kód értelmében degenerált.
  27. 33, A 34, igénypont szerinti növény vagy növényi sejt azzal jellemezve, hogy a GlcNAe-alfel,3-fekoziíiranszferáz aktivitás csökkentése untiszensz: gátlással történik, ahol egy polmókleotidőt: afahnazstik, amely legalább részben komplementer a DNS-metekula szekvenciájával.
  28. 34. Á 33. igénypert! szerinti növény vagy növényi sejt <6s«t hogy a öieNAc-atinlJ-fokssziitranszferár aktivitás csökkentése a DNS-mofekida szekvenciájának hieek-antnujtáe injával történik.
HU0200394A 1999-02-18 2000-02-17 Fukozil-transzferáz gén HU230075B1 (hu)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AT0027099A AT408446B (de) 1999-02-18 1999-02-18 Fucosyltransferase-gen
ATA270/99 1999-02-18
PCT/AT2000/000040 WO2000049153A1 (de) 1999-02-18 2000-02-17 Fucosyltransferase-gen

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HUP0200394A2 HUP0200394A2 (hu) 2002-05-29
HUP0200394A3 HUP0200394A3 (en) 2006-06-28
HU230075B1 true HU230075B1 (hu) 2015-06-29

Family

ID=3486087

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU0200394A HU230075B1 (hu) 1999-02-18 2000-02-17 Fukozil-transzferáz gén

Country Status (29)

Country Link
US (3) US20080234471A1 (hu)
EP (3) EP1642979A1 (hu)
JP (2) JP5514386B2 (hu)
KR (1) KR20010108234A (hu)
CN (1) CN1360633A (hu)
AT (2) AT408446B (hu)
AU (1) AU771995B2 (hu)
BG (1) BG65140B1 (hu)
BR (1) BR0010114A (hu)
CA (1) CA2362964C (hu)
CZ (2) CZ308081B6 (hu)
DE (1) DE50011116D1 (hu)
DK (2) DK2062977T3 (hu)
EE (1) EE200100432A (hu)
ES (2) ES2246222T3 (hu)
HR (1) HRP20010681A2 (hu)
HU (1) HU230075B1 (hu)
IL (2) IL144777A0 (hu)
IS (1) IS6041A (hu)
MX (1) MXPA01008372A (hu)
NO (1) NO20013993L (hu)
NZ (1) NZ513685A (hu)
PL (2) PL205785B1 (hu)
PT (1) PT2062977E (hu)
SK (1) SK286416B6 (hu)
TR (1) TR200102393T2 (hu)
WO (1) WO2000049153A1 (hu)
YU (1) YU58901A (hu)
ZA (1) ZA200106735B (hu)

Families Citing this family (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU771908C (en) 1998-12-09 2005-03-10 Phyton Holdings, Llc A method for manufacturing glycoproteins having human-type glycosylation
AT408446B (de) * 1999-02-18 2001-11-26 Altmann Friedrich Dr Fucosyltransferase-gen
ES2571230T3 (es) 1999-04-09 2016-05-24 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd Procedimiento para controlar la actividad de una molécula inmunofuncional
IL149271A0 (en) 1999-10-26 2002-11-10 Plant Res Int Bv Mammalian-type glycosylation in plants
US6946292B2 (en) 2000-10-06 2005-09-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity
ZA200306406B (en) 2001-01-19 2004-09-06 Dow Chemical Co Method for secretory production of glycoprotein having human-type sugar chain using plant cell.
NZ534881A (en) 2002-03-19 2006-09-29 Plant Res Internat B Mammalian GnTIII expression in plants
KR101196023B1 (ko) 2002-03-19 2012-10-30 스티칭 디엔스트 랜드보위쿤디그 온데조에크 식물에서 글리칸 프로세싱의 최적화
AU2003236020B2 (en) * 2002-04-09 2009-03-19 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Cell with depression or deletion of the activity of protein participating in GDP-fucose transport
CL2003002461A1 (es) 2002-11-27 2005-01-07 Dow Chemical Company Agroscien Inmunoglobulina que comprende al menos un glicano afucosilado, composicion que la contiene, secuencia nucleotidica y vector que la comprende, procedimiento para producir dicha inmunoglobulina en plantas.
EP1510584B1 (en) 2003-08-11 2009-03-18 Greenovation Biotech GmbH Expression promoting sequences from mosses and their uses
FI20055398A0 (fi) 2005-07-08 2005-07-08 Suomen Punainen Risti Veripalv Menetelmä solupopulaatioiden evaluoimiseksi
AU2007205935B2 (en) 2006-01-17 2013-07-11 Synthon Biopharmaceuticals B.V. Compositions and methods for humanization and optimization of N-glycans in plants
US20090060921A1 (en) * 2006-01-17 2009-03-05 Biolex Therapeutics, Inc. Glycan-optimized anti-cd20 antibodies
CN102094020B (zh) * 2007-01-15 2012-11-28 燕秋 用于抑制LeY糖抗原合成的岩藻糖基转移酶I的RNA干涉序列及重组干涉质粒
CN102094019B (zh) * 2007-01-15 2012-11-28 燕秋 用于抑制LeY糖抗原合成的岩藻糖基转移酶Ⅳ的RNA干涉序列及重组干涉质粒
AU2008237632B2 (en) 2007-04-17 2014-01-16 Stichting Dienst Landbouwkundig Onderzoek Mammalian-type glycosylation in plants by expression of non-mammalian glycosyltransferases
JP5766947B2 (ja) * 2007-09-07 2015-08-19 チルドレンズ ホスピタル メディカル センター 臨床サンプルにおける分泌性のルイス抗原およびシアル化抗原のレベルの疾患リスクの予測指標としての使用
US20100242128A1 (en) * 2007-10-31 2010-09-23 Bayer BioSceince NV Method to produce modified plants with altered n-glycosylation pattern
EP2166085A1 (en) 2008-07-16 2010-03-24 Suomen Punainen Risti Veripalvelu Divalent modified cells
ES2663627T3 (es) 2010-10-11 2018-04-16 Jennewein Biotechnologie Gmbh Fucosiltransferasas novedosas y sus aplicaciones
KR101293658B1 (ko) * 2010-12-30 2013-08-07 대한민국 알파-1,3-푸코실트랜스퍼라아제 및/또는 베타-1,2-자일로실트렌스퍼라아제 유전자를 포함하는 벼 형질전환용 벡터 및 형질전환된 벼
ES2439507T3 (es) * 2011-01-20 2014-01-23 Jennewein Biotechnologie Gmbh Fucosiltransferasas novedosas y sus aplicaciones
EP2789686A1 (en) 2013-04-11 2014-10-15 Greenovation Biotech GmbH Expression of phosphorylated glycoproteins in plants
EP3050973A1 (en) * 2015-01-30 2016-08-03 Jennewein Biotechnologie GmbH Fermentation process for producing monosaccharides in free form from nucleotide-activated sugars
CN110317799A (zh) * 2019-07-18 2019-10-11 江南大学 一种人源岩藻糖转移酶8的原核表达方法及其产品
EP3871687A1 (en) 2020-02-27 2021-09-01 eleva GmbH Enzyme replacement therapy for treating pompe disease

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5272066A (en) 1986-03-07 1993-12-21 Massachusetts Institute Of Technology Synthetic method for enhancing glycoprotein stability
JP3756946B2 (ja) 1993-03-29 2006-03-22 協和醗酵工業株式会社 α１，３−フコシルトランスフェラーゼ
US6509149B2 (en) * 1995-06-06 2003-01-21 Hybridon, Inc. HPV-specific oligonucleotides
US5770420A (en) * 1995-09-08 1998-06-23 The Regents Of The University Of Michigan Methods and products for the synthesis of oligosaccharide structures on glycoproteins, glycolipids, or as free molecules, and for the isolation of cloned genetic sequences that determine these structures
AT408446B (de) * 1999-02-18 2001-11-26 Altmann Friedrich Dr Fucosyltransferase-gen

Also Published As

Publication number Publication date
US8895806B2 (en) 2014-11-25
EP2062977A1 (de) 2009-05-27
EP1642979A1 (de) 2006-04-05
DK2062977T3 (da) 2014-04-07
CZ299622B6 (cs) 2008-09-24
IL144777A (en) 2007-12-03
NO20013993D0 (no) 2001-08-16
EP2062977B1 (de) 2014-01-08
PL363438A1 (en) 2004-11-15
HRP20010681A2 (en) 2003-08-31
WO2000049153A1 (de) 2000-08-24
AU2646000A (en) 2000-09-04
NO20013993L (no) 2001-10-17
AU771995B2 (en) 2004-04-08
JP2002536978A (ja) 2002-11-05
US20130212740A1 (en) 2013-08-15
CA2362964C (en) 2012-03-27
JP5514386B2 (ja) 2014-06-04
BG65140B1 (bg) 2007-03-30
IS6041A (is) 2001-08-08
EE200100432A (et) 2002-12-16
PL205785B1 (pl) 2010-05-31
BR0010114A (pt) 2002-06-04
KR20010108234A (ko) 2001-12-07
HUP0200394A3 (en) 2006-06-28
IL144777A0 (en) 2002-06-30
SK286416B6 (sk) 2008-09-05
AT408446B (de) 2001-11-26
JP2011120592A (ja) 2011-06-23
US8198078B2 (en) 2012-06-12
BG105899A (en) 2002-12-29
EP1151109B1 (de) 2005-09-07
ES2444126T3 (es) 2014-02-24
DK1151109T3 (da) 2006-01-16
ATE304053T1 (de) 2005-09-15
CZ308081B6 (cs) 2019-12-27
US20080234471A1 (en) 2008-09-25
PT2062977E (pt) 2014-04-07
CA2362964A1 (en) 2000-08-24
DE50011116D1 (en) 2005-10-13
EP1151109A1 (de) 2001-11-07
ES2246222T3 (es) 2006-02-16
YU58901A (sh) 2004-03-12
HUP0200394A2 (hu) 2002-05-29
CZ20012943A3 (cs) 2002-04-17
NZ513685A (en) 2001-09-28
US20090199306A1 (en) 2009-08-06
MXPA01008372A (es) 2003-06-06
CN1360633A (zh) 2002-07-24
SK11182001A3 (sk) 2002-01-07
ZA200106735B (en) 2002-08-15
ATA27099A (de) 2001-04-15
PL205710B1 (pl) 2010-05-31
TR200102393T2 (tr) 2002-04-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU230075B1 (hu) Fukozil-transzferáz gén
Cubellis et al. Isolation and sequencing of a new β-galactosidase-encoding archaebacterial gene
JPH09501044A (ja) ＵＤＰ−ＧＡＬＮＡｃ：ポリペプチド、Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼをコードするクローン化されたＤＮＡ
JPH09501317A (ja) シアリルトランスフェラーゼを製造するための組成物および方法
KR20150058478A (ko) 글루칸 중합체의 생성을 위한 글루코실트랜스퍼라제 효소
CZ299825B6 (cs) Molekuly nukleové kyseliny kódující protein s enzymatickou aktivitou fruktosyltransferázy, vektor, hostitelská bunka, zpusob prípravy FFT, FFT kódovaná molekulou nukleové kyseliny, zpusob prípravy transformovaných hostitelských bunek, transformovaná
WO1997027303A1 (fr) Alpha-1-6 fucosyltransferases
WO2016119756A1 (zh) 糖基转移酶突变蛋白及其应用
US20230039694A1 (en) Hyoscyamine aldehyde reductase and uses thereof
KR100859919B1 (ko) 아라비돕시스로부터의 베타1,2-크실로실트랜스퍼라제-유전자
Ramon et al. A novel cell wall protein specific to the mycelial form of Yarrowia lipolytica
CN114107240A (zh) 苦荞来源的大黄素糖基转移酶及其编码基因和应用
JPH06510914A (ja) Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼｖコーディング配列
WO1995018217A1 (fr) Nouvelle synthetase a chaine de sucres, et procede pour produire cette derniere
JP3921271B2 (ja) グルクロン酸転移酵素をコードするｄｎａ
CN110885365A (zh) Ataf2蛋白及其相关生物材料在调控植物对橡胶树白粉菌的抗病性中的应用
CN107058351B (zh) 一种水稻核酸酶基因OsGEN-L的突变基因及其应用
TW530087B (en) Amphipathic protein-1
CN111926000B (zh) 绞股蓝糖基转移酶及其应用
JP3349440B2 (ja) 植物の制御方法
KR100715372B1 (ko) 우라실 포스포리보실트랜스퍼라제와 우리딘 인산화효소의 이중 활성을 갖는 단백질 및 이를 코딩하는 유전자