PL205785B1 - Cząsteczki DNA, biologicznie czynne wektory, cząsteczka DNA kodująca rybozym, sposób otrzymywania cDNA, sposób klonowania GlcNAc-α1, 3-fukozylotrasferazy, cząsteczki kwasu peptydonukleinowego i sposób otrzymywani roślin - Google Patents

Cząsteczki DNA, biologicznie czynne wektory, cząsteczka DNA kodująca rybozym, sposób otrzymywania cDNA, sposób klonowania GlcNAc-α1, 3-fukozylotrasferazy, cząsteczki kwasu peptydonukleinowego i sposób otrzymywani roślin

Info

Publication number
PL205785B1
PL205785B1 PL363438A PL36343800A PL205785B1 PL 205785 B1 PL205785 B1 PL 205785B1 PL 363438 A PL363438 A PL 363438A PL 36343800 A PL36343800 A PL 36343800A PL 205785 B1 PL205785 B1 PL 205785B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
sequence
dna molecule
glcnac
dna
fucosyltransferase
Prior art date
Application number
PL363438A
Other languages
English (en)
Other versions
PL363438A1 (pl
Inventor
Friedrich Altmann
Original Assignee
Friedrich Altmann
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=3486087&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=PL205785(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Friedrich Altmann filed Critical Friedrich Altmann
Publication of PL363438A1 publication Critical patent/PL363438A1/pl
Publication of PL205785B1 publication Critical patent/PL205785B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12N9/1051—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/18—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a glycosyl transferase, e.g. alpha-, beta- or gamma-cyclodextrins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/005—Glycopeptides, glycoproteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8218—Antisense, co-suppression, viral induced gene silencing [VIGS], post-transcriptional induced gene silencing [PTGS]

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

Opis wynalazku
Wynalazek dotyczy cząsteczek DNA kodujących białko roślinne o aktywności fukozylotransferazy, biologicznie czynnych wektorów zawierających takie cząsteczki DNA, cząsteczki DNA kodującej rybozym, sposobu otrzymywania cDNA, sposobu klonowania GlcNAc-a1,3-fukozylotrasferazy, cząsteczek kwasu peptydonukleinowego i sposobu otrzymywania roślin z zablokowaną ekspresją GlcNAc-a1,3-fukozylotrasferazy.
Glikoproteiny wykazują różnorodność i kompleksowość jednostek węglowodanowych, przy czym skład i uporządkowanie węglowodanów jest charakterystyczne dla różnych organizmów. Jednostki oligosacharydowe glikoprotein posiadają wiele funkcji, i tak są one np. ważne w regulacji przemiany materii, pośredniczą we wzajemnym oddziaływaniu komórek, określają czasy trwania białek w układzie krążenia i są decydujące dla rozpoznania epitopów w reakcjach przeciwciało-antygen.
Glikozylacja glikoprotein rozpoczyna się w retikulum endoplazmatycznym (ER), gdzie oligosacharydy są wiązane poprzez wiązania N-glikozydowe do łańcucha bocznego asparaginy lub poprzez wiązania O-glikozydowe do łańcucha bocznego seryny lub treoniny. N-związane oligosacharydy posiadają wspólny rdzeń składający się z jednostki pentasacharydowej, która składa się z trzech reszt mannozowych i dwóch reszt N-acetyloglukozaminowych. W celu dalszej modyfikacji jednostek węglowodanowych białka są transportowane z ER do kompleksu Golgiego. Struktura N-związanych jednostek oligosacharydowych glikoprotein jest określana przez ich konformację i skład glikozylotransferaz przedziałów Golgiego, w których ulegają one obróbce.
Wykazano, że w kompleksie Golgiego pewnych komórek roślinnych i owadzich rdzeniowe jednostki pentasacharydowe są zastępowane ksylozą i a1,3-związaną fukozą (P. Lerouge i wsp. 1998 Plant Mol. Biol. 38, 31-48; Rayon i wsp. 1998 L. Exp. Bot. 49, 1463-1472). Powstający heptasacharyd „MMXF3” stanowi główny rodzaj oligosacharydu roślinnego (Kurosaka i wsp. 1991 J. Biol. Chem., 266, 4168-4172). Świadczą o tym np. peroksydaza chrzanowa, β-fruktozydaza z marchwi i lektyna z Erythrina cristagalli jak również fosfolipaza A2 z jadu pszczelego lub reszty a1,3-fukozy z glikoproteiny z błony neuronowej embrionów owadzich, które są związane z rdzeniem glikanowym. Struktury te definiuje się też jako kompleksowe N-glikany, ewentualnie mannozy lub są one określane jako skrócone N-glikany. Reszty α-mannozylowe mogą być następnie zastępowane przez GlcNAc, z którymi są związane galaktoza i fukoza, dzięki czemu powstaje struktura, która odpowiada ludzkiemu epitopowi Lewis-a (Melo i wsp., 1997, FEBS Lett. 415, 186-191; Fitchette-Laine i wsp. 1997 Plant J. 12, 14111417).
W ssaczych glikoproteinach nie występuje ani ksyloza ani a1,3-związana fukoza. Okazało się, że rdzeniowa a1,3-fukoza odgrywa ważną rolę w rozpoznawaniu epitopów przez przeciwciała, które są skierowane przeciwko roślinnym i owadzim N-związanym oligosacharydom (I.B.H. Wilson i wsp., Glycobiology Vol. 8, Nr. 7, S. 651-661, 1998) i dzięki temu wyzwalają w organizmie ludzkim lub zwierzęcym reakcje immunologiczne skierowane przeciwko tym oligosacharydom. Reszta a1,3-fukozy wydaje się być także główną przyczyną szeroko rozpowszechnionej krzyżowej reaktywności alergicznej między różnymi roślinnymi i owadzimi alergenami (Tretter i wsp., Int. Arch. Allergy Immunol. 1993; 102: 259-266), i jest nazywana także „reaktywną krzyżową determinantą węglowodanową” (CCD). W trakcie badania epitopów z pomidorów i pyłków traw ustalono również reszty a1,3-związanej fukozy jako wspólną determinantę, co wydaje się być przyczyną częstego wspólnego występowania u pacjentów alergii na pomidory i pyłek traw (Petersen i wsp. 1996, J. Allergy Clin. Immunol., Vol 98, 4; 805-814). CCD fałszują następnie przez częste występowanie alergicznych reakcji krzyżowych diagnozę alergii.
Takie reakcje immunologiczne, wyzwalane przez białka roślinne w ludzkim organizmie, są głównym problemem w zastosowaniu medycznym produkowanych w roślinach, rekombinowanych ludzkich białek. Aby obejść ten problem, należałoby zapobiec rdzeniowej α1,3-fukozylacji. Podczas badań wykazano, że oligosacharydy, które zamiast L-fukozy (6-deoksy-L-galaktozy) posiadają L-galaktozę, są nadal całkowicie aktywne biologicznie (E. Zablackis i wsp. 1996, Science, Vol 272). Zgodnie z innym badaniem wyizolowano mutanta rośliny Arabidopsis thaliana, który nie posiadał N-acetylo-glukozoaminowej transferazy I, która jest pierwszym enzymem w biosyntezie kompleksowych glikanów. Dzięki temu, biosynteza kompleksowych glikoprotein w tym mutancie została zaburzona. Pomimo tego, te zmutowane rośliny są w stanie rozwijać się normalnie w określonych warunkach (A. Schaewen i wsp., 1993, Plant Physiol. 102; 1109-1118).
PL 205 785 B1
Aby świadomie obniżyć wiązanie rdzeniowej a1,3-fukozy w oligosacharydzie, bez jednoczesnego ingerowania w inne etapy glikozylacji, należałoby wykluczyć jedynie ten enzym, który jest bezpośrednio odpowiedzialny za tą specyficzną glikozylację, mianowicie rdzeniową a1,3-fukozylotransferazę. Została ona po raz pierwszy wyizolowana z fasoli Mung i scharakteryzowana, przy czym stwierdzono, że aktywność tego enzymu jest zależna od obecności nieredukujących końców GlcNAc (Staudacher i wsp., 1995, Glycoconjugate J. 12, 780-786). Transferaza ta, która występuje tylko u roślin i owadów, lecz nie występuje u człowieka i innych kręgowców, musiałaby być specyficznie inaktywowana lub hamowana, dzięki czemu białka produkowane w roślinnych komórkach lub roślinach ewentualnie także w komórkach owadzich lub owadach, nie zawierałyby już jak dotychczas tego wyzwalającego reakcje immunologiczne epitopu. Praca Johna M. Burke „Clearing the way for ribozymes” (Nature Biotechnology 15: 414-415; 1997) dotyczy ogólnego sposobu działania rybozymów.
Praca Pooga i wsp. „Cell penetrating PNA constructs regulate galanin receptor levels and modify pain transmission in vivo” (Nature Biotechnology 16: 857-861; 1998) dotyczy ogólnie cząsteczek PNA a w szczególności cząsteczki PNA, która jest komplementarna wobec mRNA ludzkiego receptora galaninowego typu 1.
Dokument US 5 272 066 dotyczy sposobu zmiany eukariotycznych i prokariotycznych białek, aby przedłużyć ich krążenie in vivo. W tym celu zmieniane są związane oligosacharydy za pomocą różnych enzymów, między innymi również GlcNAc-a1 >3(4)-fukozylotransferazy.
Dokument EP 0 643 132 A1 dotyczy klonowania a1,3-fukozylotransferazy, która jest izolowana z ludzkich komórek (THP-1). Opisane w tym dokumencie łańcuchy węglowodanowe odpowiadają ludzkim oligosacharydom sjalo-Lewis a i sjalo-Lewis x. Specyficzność enzymu z ludzkich komórek jest całkiem inna niż fukozylotransferazy z komórek roślinnych.
Celem niniejszego wynalazku jest sklonowanie i zsekwencjonowanie genu kodującego roślinną fukozylotransferazę, otrzymanie wektorów obejmujących ten gen, części DNA pochodzących z niego lub DNA zmienionego albo wywodzącego się z niego, transfekowanie jednym z tych komórek gospodarza lub gospodarza oraz opracowanie odpowiednich sposobów.
Przedmiotem wynalazku jest cząsteczka DNA, charakteryzująca się tym, że obejmuje sekwencję według SEQ ID NO: 1 z otwartą ramką odczytu od pary zasad 211 do pary zasad 1740 lub wykazuje przynajmniej 50% identyczność z tą sekwencją lub hybrydyzuje w ostrych warunkach z tą sekwencją lub obejmuje sekwencję, która ze względu na kod genetyczny zdegenerowała do tej sekwencji DNA, przy czym ta sekwencja koduje białko roślinne o aktywności fukozylotransferazy lub jest komplementarna do niej.
Korzystnie cząsteczka ta koduje białko o aktywności GlcNAc-a1,3-fukozylotrasferazy, zwłaszcza o aktywności rdzeniowej a1,3-fukozylotrasferazy.
Korzystnie cząsteczka ta wykazuje przynajmniej 70-80%, zwłaszcza przynajmniej 95%, identyczność z sekwencją według SEQ ID NO: 1.
Korzystnie cząsteczka ta obejmuje pary zasad 2150 do 2250, zwłaszcza 2198.
Przedmiotem wynalazku jest także cząsteczka DNA, charakteryzująca się tym, że obejmuje sekwencję według SEQ ID NO: 3 lub obejmuje sekwencję, która wykazuje przynajmniej 85%, zwłaszcza przynajmniej 95% identyczność z tą sekwencją lub hybrydyzuje w ostrych warunkach z tą sekwencją lub obejmuje sekwencję, która która ze względu na kod genetyczny zdegenerowała do tej sekwencji DNA.
Przedmiotem wynalazku jest także cząsteczka DNA, charakteryzująca się tym, że obejmuje częściową sekwencję jednej z cząsteczek DNA określonych powyżej oraz wykazuje przynajmniej 80% identyczność z sekwencją według SEQ ID NO: 1 oraz ma wielkość od 20 do 200, zwłaszcza 30 do 50 par zasad.
Korzystnie opisane powyżej cząsteczki związane są kowalencyjnie z odpowiednią wykrywalną substancją znacznikową.
Przedmiotem wynalazku jest także biologicznie czynny wektor, charakteryzujący się tym, że obejmuje jedną z cząsteczek DNA określonych powyżej.
Przedmiotem wynalazku jest również biologicznie czynny wektor, charakteryzujący się tym, że obejmuje jedną z cząsteczek DNA określonych powyżej o orientacji odwróconej wobec promotora.
Przedmiotem wynalazku jest też cząsteczka DNA kodująca rybozym, charakteryzująca się tym, że posiada dwa odcinki sekwencji, każdy o długości przynajmniej 10 do 15 par zasad, które są komplementarne do odcinków sekwencji jednej z cząsteczek DNA określonych powyżej, przez co rybozym
PL 205 785 B1 przyłącza i tnie mRNA, które jest produktem transkrypcji naturalnej cząsteczki DNA GlcNAc-a1,3-fukozylotrasferazy.
Przedmiotem wynalazku jest także biologicznie czynny wektor, charakteryzujący się tym, że obejmuje cząsteczkę DNA kodującą rybozym.
Przedmiotem wynalazku jest także sposób otrzymywania cDNA obejmującego jedną z określonych powyżej cząsteczek DNA kodujących białko roślinne o aktywności fukozylotransferazy, polegający na tym, że izoluje się RNA z komórek roślinnych, zwłaszcza z komórek liścienia, oraz przeprowadza się odwrotną transkrypcję po dodaniu odwrotnej transkryptazy oraz starterów specyficznych dla takiej cząsteczki DNA określonej powyżej, albo starterów hybrydyzujących z taką cząsteczką DNA określoną powyżej.
Przedmiotem wynalazku jest także sposób klonowania GlcNAc-a1,3-fukozylotrasferazy, polegający na tym, że klonuje się jedną z określonych powyżej cząsteczek DNA kodujących białko roślinne o aktywności fukozylotransferazy, do wektora, którym następnie transfekuje się komórkę gospodarza lub gospodarza, przy czym poprzez selekcję i namnażanie transfekowanych komórek gospodarza otrzymuje się linie komórkowe z ekspresją aktywnej GlcNAc-a1,3-fukozylotrasferazy.
Przedmiotem wynalazku jest również cząsteczka kwasu peptydonukleinowego (PNA), charakteryzująca się tym, że zawiera sekwencję zasad, która jest komplementarna do jednej z określonych powyżej cząsteczek DNA, kodujących GlcNAc-a1,3-fukozylotrasferazę.
Przedmiotem wynalazku jest też cząsteczka kwasu peptydonukleinowego (PNA), charakteryzująca się tym, że zawiera sekwencję zasad, która odpowiada sekwencji jednej z określonych powyżej cząsteczek DNA, kodujących GlcNAc-a1,3-fukozylotrasferazę.
Przedmiotem wynalazku jest ponadto sposób otrzymywania roślin, które wykazują zablokowaną ekspresję GlcNAc-a1,3-fukozylotrasferazy na poziomie transkrypcji lub translacji, polegający na tym, że wprowadza się do roślin jedną z określonych powyżej cząsteczek PNA.
Cel wynalazku realizuje się dzięki cząsteczce DNA, która obejmuje sekwencję według SEQ ID No. 1 (w tym opisie zastosowano kod IUPAC, przy czym „N” oznacza inozynę) z otwartą ramką odczytu od pary zasad 211 do pary zasad 1740 lub która wykazuje przynajmniej 50% homologię do powyższej sekwencji lub hybrydyzuje w zaostrzonych warunkach z powyższą sekwencją lub obejmuje sekwencję, która ze względu na zdegenerowanie kodu genetycznego odpowiada powyższej sekwencji DNA, przy czym sekwencja ta koduje białko roślinne o aktywności fukozylotransferazy lub jest komplementarna do niej.
Sekwencja taka, dotychczas jeszcze nieopisana, nadaje się doskonale do wszelkich eksperymentów, analiz i sposobów wytwarzania itp., które dotyczą aktywności roślinnej fukozylotransferazy. Przy tym przedmiotem zainteresowania są zarówno sekwencja DNA jak również białko kodowane przez tę sekwencję, przy czym jednak zwłaszcza sekwencja DNA jest stosowana do tłumienia aktywności fukozylotransferazy.
Otwarta ramka odczytu z sekwencji SEQ ID No: 1 koduje białko składające się z 510 aminokwasów o teoretycznej masie cząsteczkowej wynoszącej 56,8 kDa, przy czym w obszarze pomiędzy Asn36 i Gly54 znajduje się prawdopodobnie odcinek przezbłonowy. Wyliczona wartość pI kodowanego białka o sekwencji według SEQ ID No: 1 wynosi 7,51.
Aktywność roślinnej fukozylotransferazy bada się i mierzy się w sposobie, w którym fukozylotransferaza jest dodawana do próbki zawierającej znakowaną fukozę i akceptor (np. glikoproteinę) związany z nośnikiem, np. Sepharose. Po czasie reakcji próbkę przemywa się i mierzy się zawartość związanej fukozy. Aktywność fukozylotransferazy jest uznawana przy tym, gdy pomiary aktywności są wyższe o przynajmniej 10 do 20%, zwłaszcza co najmniej 30 do 50% od mierzonej aktywności dla kontroli negatywnej. Strukturę glikoproteiny można dodatkowo zweryfikować za pomocą HPLC. Takie protokoły stanowią stan techniki (Staudacher et al. 1998, Anal. Biochem. 246, 96-101; Staudacher et al. 1991, Eur. J. Biochem. 199, 745-751).
Przykładowo fukozylotransferaza jest dodawana do próbki zawierającej znakowaną radioaktywnie fukozę i akceptor, np. GlcNAce1-2Mana1-3(GlcNAce1-2Mana1-6)Mane1-4GlcNAce1-4GlcNAce1-Asn. Po czasie reakcji próbka jest oczyszczana w chromatografii anionowymiennej i mierzona jest zawartość związanej fukozy. Z różnicy mierzonej radioaktywności próbki z akceptorem i radioaktywności kontroli negatywnej bez akceptora może być wyliczona aktywność. Aktywność fukozylotransferazy uznaje się już za pozytywną, gdy mierzona radioaktywność jest wyższa przynajmniej o 30-40% niż mierzona radioaktywność próby negatywnej.
PL 205 785 B1
Łączenie się w pary dwóch cząsteczek DNA może być zmieniane przez dobór temperatury i siły jonowej próbki. Zgodnie z wynalazkiem jako warunki zaostrzone są rozumiane warunki, które umożliwiają dokładne i ścisłe wiązanie. Przykładowo cząsteczki DNA są hybrydyzowane w 7% siarczanie dodecylu sodu (SDS), 0,5 M NaPO4 pH 7,0; 1 mM EDTA w 50°C i przemywane 1% SDS w 42°C.
Czy sekwencja wykazuje przynajmniej 50% homologię do SEQ ID No: 1, może być stwierdzone np. za pomocą programu FastDB z baz danych EMBL lub SWISSPROT.
Korzystnie sekwencja cząsteczki DNA według wynalazku koduje białko z aktywnością GlcNAc-α1,3-fukozylotransferazy, w szczególności z aktywnością rdzeniowej α1,3-fukozylotransferazy. Jak już wyżej napisano, rdzeniowa a1,3-fukozylotransferaza występuje w roślinach i owadach, lecz nie występuje w organizmie człowieka, przez co w szczególności ta sekwencja DNA nadaje się do stosowania w analizach i eksperymentach oraz sposobach wytwarzania specyficznych dla fukozylotransferazy. Jako rdzeniową a1,3-fukozylotransferazę rozumiana jest w szczególności GlcNAc-a1,3-fukozylotransferaza związana z GDP-L-Fuc:Asn. W ramach niniejszego wynalazku określenie α1,3-fukozylotransferaza oznacza z reguły w szczególności rdzeniową a1,3-fukozylotransferazę. Do powyżej opisanych pomiarów aktywności służą przy tym w szczególności akceptory z nieredukującym końcem GlcNAc. Takimi akceptorami są np. GlcNAce1-2Mana1-3(GlcNAce1-2Mana1-6)Mane14GlcNAce1-4GlcNAce1 Asn, GlcNAce1-2Mana1-3(GlcNAce1-2Mana1-6)Mane1-4GlcNAce1-4(Fuca16GlcNAce1 -Asn i GlcNAce1-2Mana1-3[Mana1-3(Mana1-6)Mana1-6]Mane1-4GlcNAce1-4GlcNAce1Asn. Czy fukoza jest związana, może być stwierdzone następnie przez pomiar niewrażliwości na N-glikozydazę F, co może być wykazane za pomocą spektroskopii masowej.
Korzystnie cząsteczka DNA według wynalazku wykazuje przynajmniej 70-80%, szczególnie korzystnie przynajmniej 95%, homologii do sekwencji według SEQ ID No: 1. Sekwencja ta koduje szczególnie aktywną GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazę. Ponieważ sekwencja DNA może być zmieniana mniej lub bardziej zależnie od rośliny lub owada, sekwencja wykazująca, np. 70% homologię do sekwencji według SEQ ID No: 1, wykazuje także aktywność fukozylotransferazy, która jest wystarczająca aby być wykorzystana do analiz, eksperymentów lub sposobów wytwarzania opisanych powyżej.
Zgodnie z inną korzystną realizacją cząsteczka DNA zawiera 2150 do 2250, w szczególności 2198, pary zasad. Cząsteczka DNA posiada 100 do 300, zwłaszcza 210, pary zasad w górę przed kodonem startu oraz 350 do 440, w szczególności 458, pary zasad w dół po kodonie stopu otwartej ramki odczytu, przy czym koniec cząsteczki DNA dogodnie zawiera 3'-ogon poli(A). W ten sposób zapewniona jest właściwa regulacja na poziomie translacji, i otrzymywana jest cząsteczka DNA, która koduje szczególnie efektywnie i wydajnie aktywną GlcNAca1,3-fukozylotransferazę.
Przedmiotem niniejszego wynalazku jest także cząsteczka DNA, która obejmuje sekwencję według SEQ ID No. 3 lub obejmuje sekwencję, która wykazuje przynajmniej 85%, zwłaszcza przynajmniej 95%, w szczególności przynajmniej 99% homologię do wyżej wymienionej sekwencji lub hybrydyzuje w ostrych warunkach z tą sekwencją lub obejmuje sekwencję, która ze względu na zdegenerowanie kodu genetycznego odpowiada rzeczonej sekwencji DNA.
Homologia jest określana dogodnie za pomocą programu, który rozpoznaje insercje i delecje i nie bierze ich pod uwagę w obliczaniu homologii. Taka sekwencja nukleotydowa koduje konserwatywny motyw peptydowy, co oznacza, że większość aktywnych i działających GlcNAc-a1,3-fukozylotransferaz zawiera sekwencję aminokwasową kodowaną przez tą sekwencję. Sekwencja może przy tym mieć zarówno tą samą wielkość co sekwencja według SEQ ID No: 3, jak również, co jest zrozumiałe, być od niej także większa. Ta sekwencja ma mniejszą długość od sekwencji kodującej całe białko, i jest więc mniej wrażliwa na rekombinacje, delecje i inne mutacje. Ze względu na motyw konserwowany i jej podwyższoną stabilność sekwencja ta nadaje się szczególnie dobrze do testów rozpoznawania sekwencji.
SEQ ID No: 3 posiada następującą sekwencję: 5'-gaagccctgaagcactacaaatttagcttagcgtttgaaaattcgaatgaggaagattatgtaactgaaaaattcttccaatcccttgttgctggaactgtccct-3'
Zgodnie z kolejnym aspektem niniejszego wynalazku opisano cząsteczkę DNA, która obejmuje częściową sekwencję jednej z wyżej wymienionych cząsteczek DNA i ma wielkość od 20 do 200, korzystnie 30 do 50 par zasad. Cząsteczka DNA może być przykładowo wykorzystana jako sonda do wiązania komplementarnych sekwencji GlcNAc-a1,3-fukozylotransferaz, dzięki czemu mogą być one selekcjonowane z próbki. W ten sposób mogą być selekcjonowane, izolowane i charakteryzowane kolejne GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazy z najróżniejszych roślin i owadów. Mogą być stosowane każde dowolne lub także kilka różnych sekwencji częściowych, w szczególności fragmenty powyżej opisanego motywu konserwatywnego.
PL 205 785 B1
Jest przy tym szczególnie zalecane, gdy jedna z opisanych wyżej cząsteczek DNA jest związana kowalencyjnie z możliwą do wykazania substancją znacznikową. Jako substancję znacznikową można zastosować każdy stosowany znacznik, a więc np. markery fluorescencyjne, luminescencyjne, radioaktywne, znacznik nieizotopowy, jak biotyna, etc. W ten sposób otrzymuje się reagenty, które są przydatne dla wykazania, selekcjonowania i oceny ilościowej odpowiednich cząsteczek DNA w stałych próbkach tkanek (np. roślinnych) jak również w próbkach płynnych za pomocą metod hybrydyzacji.
Kolejny aspekt wynalazku dotyczy biologicznie czynnego wektora, który obejmuje jedną z wyżej wymienionych cząsteczek DNA lub części o różnej długości przynajmniej 20 par zasad. Do transfekcji komórek gospodarza wymagany jest jednoniciowy, zdolny do samopowielania się wektor, przy czym w zależności od komórki gospodarza, mechanizmu transfekcji, celu i rozmiaru cząsteczki DNA, może być zastosowany odpowiedni wektor. Ponieważ znana jest duża liczba różnych wektorów, których wymienienie przekroczyłoby objętość zgłoszenia, tak, że rezygnuje się tutaj z tego, zwłaszcza że wektory są bardzo dobrze znane fachowcom (w odniesieniu do wektorów jak i wszystkich w tym opisie stosowanych technik i określeń, znanych fachowcom, patrz również Sambrook Maniatis). Idealnie wektor powinien mieć małą masę cząsteczkową i zawierać gen selektywny, pozwalający na łatwe rozpoznanie fenotypu w komórce, dzięki czemu możliwa jest łatwa selekcja zawierających i nie zawierających wektor komórek gospodarza. Aby utrzymać wysoką ilość DNA i odpowiednich produktów genowych, wektor powinien posiadać silny promotor, oraz wzmacniacz, sygnały amplifikacji genu i sekwencje regulacyjne. Dla uzyskania niezależ nej replikacji wektora istotne jest nastę pnie posiadanie miejsca inicjacji replikacji. Miejsca poliadenylacji są odpowiedzialne za właściwą obróbkę mRNA, a sygnały splicingu (składania RNA) odpowiedzialne są za transkrypty RNA. W przypadku stosowania fagów, wirusów lub cząsteczek wirusowych jako wektorów, sygnały pakowania kierują pakowaniem wektorowego DNA. Przykładowo do transkrypcji w roślinach odpowiednie są plazmidy Ti, a do transkrypcji w komórkach owadzich bakulowirusy lub transpozony owadzie, jak element P.
W przypadku wprowadzania do roś liny lub komórki roś linnej wyż ej opisanego wektora według wynalazku, dochodzi do posttranskrypcyjnego stłumienia ekspresji genu endogennej a1,3-fukozylotransferazy przez transkrypcję homologicznego wobec niego genu lub jego części wprowadzanych w orientacji sensownej. Opis tej techniki sensownej znajduje się w dokumencie Baulcombe 1996, Plant. Mol. Biol.. 9: 373-382 i Brigneti et al. 1998, EMBO J. 17: 67 39-674 6. Ta strategia „wyciszania genu” stanowi efektywną możliwość stłumienia ekspresji genu al,3-fukozylotransferazy, patrz również Waterhouse et al. 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: 13959-13964.
Wynalazek dotyczy także biologicznie czynnego wektora, który obejmuje jedną z opisanych powyżej cząsteczek DNA lub jej część o różnej długości, w orientacji odwróconej wobec promotora. Po transfekowaniu komórki gospodarza tym wektorem, odczytany zostaje „antysensowny mRNA”, który jest komplementarny do mRNA GlcNAc a1,3-fukozylotransferazy i zdolny do tworzenia z nim kompleksów. To wiązanie obniża poprawną obróbkę, transport, stabilność, lub poprzez wygaszenie przyłączania rybosomów tłumi translację i w ten sposób naturalną ekspresję genu GlcNAc α1,3-fukozylotransferazy.
Chociaż cała sekwencja cząsteczki DNA mogłaby być wbudowana do wektora dla określonych celów, mogą być zalecone jej sekwencje częściowe ze względu na ich niską masę. Ważne jest np. w aspekcie antysensownym, żeby cząsteczka DNA była dostatecznie duża, aby tworzyć dostatecznie duże antysensowne mRNA, które przyłączy się do mRNA transferazy. Przykładowo odpowiednia antysensowna cząsteczka RNA zawiera 50 do 200 nukleotydów, ponieważ wiele ze znanych naturalnie występujących antysensownych cząsteczek RNA obejmuje około 100 nukleotydów.
Dla szczególnie efektywnego hamowania ekspresji aktywnej a1,3-fukozylotransferazy przydatna jest kombinacja techniki sensownej i antysensownej (Waterhouse i wsp. 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: 13959-13964).
Zalecane jest stosowanie szybko hybrydyzujących cząsteczek RNA. Wydajność antysensownych cząsteczek RNA, o wielkości od ponad 50 nukleotydów, zależy od kinetyki przyłączania się in vitro. I tak np. szybko przyłączające się antysensowne cząsteczki RNA wykazują silniejsze hamowanie ekspresji białka niż powoli hybrydyzujące cząsteczki RNA (Wagner et al. 1994, Annu. Rev. Microbiol., 48: 713-742; Rittner et al. 1993, Nucl. Acids Res, 21: 1381-1387). Takie szybko hybrydyzujące antysensowne cząsteczki RNA wykazują w szczególności dużą liczbę zewnętrznych zasad (wolne końce i sekwencje łączące), dużą liczbę strukturalnych subdomen (składniki) oraz niską temperaturę topnienia. (Patzel et al. 1998; Nature Biotechnology, 16; 64-68). Hipotetyczne drugorzędowe struktury antyPL 205 785 B1 sensownej cząsteczki RNA mogą być uzyskane np. za pomocą programu komputerowego, według którego wyszukuje się odpowiedniego antysensownego RNA dla sekwencji DNA.
Do wektora mogą zostać wbudowane różne regiony sekwencyjne cząsteczki DNA. Jedną z moż liwoś ci jest np. wbudowanie do wektora tylko części odpowiedzialnej za przyłączanie rybosomów. Zablokowanie mRNA w tym obszarze wystarcza do zatrzymania całej translacji. Szczególnie wysoką wydajność antysensownych cząsteczek uzyskuje się również dla 5'- i 3'- nie ulegających translacji regionów genu.
Zalecane jest aby opisana tu cząsteczka DNA zawierała sekwencję posiadającą mutację delecji, insercji i/lub substytucji. Liczba zmutowanych nukleotydów jest przy tym zmienna i wystarcza, aby zawierała od jednego do kilku nukleotydów poddanych delecji, insercji lub substytucji. Możliwe jest także, że w wyniku mutacji ramka odczytu ulegnie przesunięciu. Ważne jest jedynie przy tego rodzaju znokautowanym genie, że ekspresja GlcNAc a1,3-fukozylotransferazy jest zakłócona, i uniemożliwia się tworzenie aktywnego, funkcjonalnego enzymu. Miejsce mutacji jest przy tym zmienne, pod warunkiem że tłumiona jest ekspresja enzymatycznie aktywnego białka. Dogodnie mutacja znajduje się w katalitycznym obszarze enzymu, który znajduje się w obszarze C-końcowym. Sposoby wprowadzania mutacji w sekwencjach DNA, są znane najlepiej fachowcowi, dlatego rezygnuje się tutaj z bliższego omówienia różnych możliwych sposobów mutagenezy. Można tutaj stosować zarówno mutagenezę losową jak też dogodnie mutagenezę ukierunkowaną, np. site-directed-mutagenesis, mutagenezę ukierunkowywaną przez oligonukleotydy lub mutagenezę za pomocą enzymów restrykcyjnych.
Wynalazek dotyczy także cząsteczki DNA kodującej rybozym, która posiada dwa odcinki sekwencji, każdy o długości przynajmniej 10 do 15 par zasad, przy czym odcinki sekwencji cząsteczki DNA jak wyżej opisano są komplementarne, dzięki czemu rybozym przyłącza i tnie mRNA, które jest produktem transkrypcji naturalnej cząsteczki DNA kodującej GlcNAc-a1,3-fukozylotrasferazę. Rybozym rozpoznaje mRNA GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazy przez komplementarne łączenie się zasad z mRNA. Następnie rybozym tnie i niszczy RNA w sposób specyficzny dla sekwencji, zanim enzym ulegnie translacji. Po dysocjacji z pociętego substratu, rybozym ponownie hybrydyzuje z cząsteczkami RNA i działa jak specyficzna endonukleaza. Ogólnie, rybozymy można wytwarzać specyficznie do innaktywacji określonego mRNA, nawet w przypadku gdy nie jest znana cała sekwencja DNA kodująca białko. Rybozymy są szczególnie wydajne, gdy rybosomy powoli przesuwają się wzdłuż mRNA. W tym przypadku jest łatwiej znaleźć rybozymowi wolne od rybosomów miejsce na mRNA. Z tego powodu powolne mutanty rybosomów nadają się również do wykorzystania w systemach rybosomowych (J. Burke, 1997, Nature Biotechnology; 15, 414-415). Taka cząsteczka DNA nadaje się szczególnie dobrze do tłumienia lub wyciszania ekspresji roślinnej GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazy.
Kolejną możliwością jest również zastosowanie zmienionej formy rybozymu, mianowicie minizymu. W szczególności minizymy są wydajne do cięcia większych cząsteczek mRNA. Minizym jest głowicą rybosomu, która w miejsce struktury Stem/Loop II posiada krótki łącznik oligonukleotydowy. Szczególnie wydajne są dimery minizymowe (Kuwabara et al. 1998, Nature Biotechnology, 16; 961-965).
Wynalazek dotyczy także biologicznie czynnego wektora, który zawiera jedną z obu ostatnio wymienionych cząsteczek DNA (cząsteczka DNA zmutowana lub rybozymu). W związku z tym jest ważne to, co już wyżej opisano odnośnie wektorów. Taki wektor może np. być wprowadzony do mikroorganizmu i zastosowany do produkcji wysokich stężeń opisanych wyżej cząsteczek DNA. Następnie taki wektor nadaje się szczególnie dobrze do wprowadzania specyficznej cząsteczki DNA do organizmu roślinnego lub owada, w celu ograniczenia lub pełnego wyciszenia produkcji GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazy w tym organizmie.
Przedmiotem wynalazku jest także sposób wytwarzania cDNA obejmującego cząsteczkę DNA według wynalazku, przy czym izoluje się RNA z komórek owadzich lub roślinnych, zwłaszcza z komórek liścienia oraz przeprowadza się odwrotną transkrypcję po dodaniu odwrotnej transkryptazy oraz starterów. Poszczególne etapy tego sposobu są przeprowadzane zgodnie ze znanymi protokołami. W celu przeprowadzenia odwrotnej transkrypcji istnieje z jednej strony możliwość otrzymania za pomocą starterów oligo(dT) cDNA całej cząsteczki mRNA, a następnie za pomocą wybranych starterów przeprowadzenie PCR, aby otrzymać cząsteczki DNA zawierające gen GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazy. Z drugiej strony można wybrane startery zastosować bezpośrednio do odwrotnej transkrypcji, w celu otrzymania krótkiego, specyficznego cDNA. Stosowne startery mogą być otrzymane np. syntetycznie po przedłożeniu sekwencji cDNA transferazy. Za pomocą tego sposobu mogą być
PL 205 785 B1 wytwarzane bardzo szybko i łatwo, z małą ilością pomyłek, duże ilości cząsteczek DNA według wynalazku.
Przedmiotem wynalazku jest następnie sposób klonowania GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazy, charakteryzujący się tym, że klonuje się cząsteczkę DNA według wynalazku do wektora, którym następnie transfekuje się komórkę gospodarza lub gospodarza, przy czym poprzez selekcję i namnażanie transfekowanych komórek gospodarza otrzymuje się linie komórkowe, które ekspresjonują aktywną GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazę. Cząsteczka DNA wprowadzana jest przykładowo za pomocą endonukleaz restrykcyjnych do wektora. Jako wektor rozumie się to co opisano już powyżej. Ważne jest, aby dla tego sposobu wybrać wydajny system wektor-gospodarz. Dla otrzymania aktywnego enzymu szczególnie właściwe są eukariotyczne komórki gospodarza. Jedną z możliwości jest transfekowanie wektora do komórek owadzich. W tym przypadku należałoby szczególnie zastosować wirus owadzi jako wektor np. bakulowirus.
Oczywiście można też transfekować komórki ludzkie lub inne komórki kręgowców, przy czym ekspresjonowałyby one obcy im enzym.
Zgodnie z wynalazkiem opisano także sposób wytwarzania rekombinowanych komórek gospodarza, zwłaszcza komórek roślinnych lub owadzich lub roślin lub owadów z wytłumioną lub całkowicie wyłączoną produkcją GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazy, w którym przynajmniej jeden z wektorów według wynalazku, mianowicie wektor obejmujący cząsteczkę DNA według wynalazku, zmutowaną cząsteczkę DNA lub cząsteczkę DNA kodującą rybozym lub obejmujący cząsteczkę DNA w odwrotnej orientacji względem promotora, wprowadza się do genomu komórki gospodarza lub rośliny lub owada. Tutaj jest również ważne to co opisano powyżej dla transfekcji.
Jako komórki gospodarza mogą być zastosowane np. komórki roślinne, przy czym przykładowo stosuje się tu plazmid Ti w systemie z Agrobacterium. Za pomocą systemu z Agrobacterium możliwe jest bezpośrednie transfekowanie rośliny: agrobakterie wywołują u roślin powstawanie galasów na korzeniach. Gdy agrobakterie infekują uszkodzoną roślinę, same bakterie nie przenikają do rośliny, lecz wprowadzają do komórek roślinnych rekombinowany odcinek DNA, tak zwany T-DNA składający się z kolistego, pozachromosomalnego, onkogennego plazmidu Ti. T-DNA, a zatem także wprowadzona do niego cząsteczka DNA zostaje stabilnie wbudowana do DNA chromosomalnego komórki, dzięki czemu geny T-DNA ulegają ekspresji w roślinie.
Istnieje wiele znanych, wydajnych mechanizmów transfekcji do różnych układów gospodarzy. Kilkoma przykładami są elektroporacja, metoda fosforanowowapniowa, mikroiniekcja, metoda liposomowa.
Komórki transfekowane są następnie selekcjonowane, np. w oparciu o oporność na antybiotyki, dla których istnieje odpowiedni gen wektora, lub inny gen markerowy. Następnie transfekowane linie komórkowe są namnażane, albo w mniejszych ilościach np. na płytkach Petriego, albo w dużych ilościach, np. w fermentorach. Następnie, rośliny posiadają szczególną właściwość, mianowicie są zdolne do odtworzenia z (transfekowanej) komórki lub protoplastu całej rośliny, która może być uprawiana.
W zależności od zastosowanego wektora dochodzi u gospodarza do procesów zahamowania lub całkowitego wyciszenia ekspresji enzymu.
Gdy wektor zawierający cząsteczkę DNA z mutacją w postaci delecji, insercji lub substytucji ulega transfekcji, dochodzi do rekombinacji homologicznej. Zmutowana cząsteczka DNA rozpoznaje pomimo mutacji identyczną sekwencję w genomie komórki gospodarza i jest wbudowywana w dokładnie określonym miejscu, dzięki czemu dochodzi do nokautu (wyłączenia) genu. W ten sposób do genu GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazy zostaje wprowadzona mutacja, która może hamować właściwą ekspresję GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazy. Jak już wyjaśniono powyżej w technice tej ważne jest, aby mutacja była wystarczająca do wyciszenia ekspresji aktywnego białka. Po selekcji i amplifikacji dla dodatkowej kontroli można zsekwencjonować gen, w celu ustalenia wyniku rekombinacji homologicznej lub stopnia zmutowania.
Gdy wektor zawierający cząsteczkę DNA kodującą rybozym jest poddawany transfekcji, w komórce gospodarza ekspresjonowany jest aktywny rybozym. Rybozym tworzy kompleks z komplementarną sekwencją mRNA GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazy przynajmniej w określonym miejscu, nacina to miejsce i może w ten sposób hamować translację enzymu. W tej komórce gospodarza jak również w wywodzących się z niej liniach komórkowych lub ewentualnie roślinie nie jest ekspresjonowana GlcNAc-a1,3-fukozylotransferaza.
Gdy wektor zawierający cząsteczkę DNA według wynalazku w sensownej lub odwróconej orientacji wobec promotora zostanie wprowadzony do transfekowanej komórki (lub rośliny) ekspresjonowaPL 205 785 B1 ny jest sensowny lub antysensowny mRNA. Antysensowny mRNA jest komplementarny przynajmniej do jednej części sekwencji mRNA GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazy i może również hamować translację enzymu. Przykładem sposobu wyciszania ekspresji genu techniką antysensowną jest dokument Smith i wsp. 1990, Mol. Gen. Genet. 224: 477-481, przy czym w tej publikacji opisano hamowanie ekspresji genu zaangażowanego w proces dojrzewania pomidorów.
We wszystkich systemach ekspresja GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazy jest przynajmniej tłumiona, dogodnie nawet całkiem hamowana. Stopień zaburzenia ekspresji genu zależy od stopnia kompleksowania, rekombinacji homologicznej, ewentualnych kolejnych przypadkowych mutacji, i innych procesów w obszarze genomu. Komórki transfekowane są kontrolowane pod względem aktywności GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazy i selekcjonowane.
Istnieje następnie możliwość jeszcze dalszego wzmocnienia stłumienia ekspresji a1,3-fukozylotransferazy, polegającego na wprowadzeniu do gospodarza oprócz opisanego wektora, dodatkowo wektora zawierającego gen kodujący białko ssacze, np. e1,4-galaktozylotransferazę. Fukozylacja może być obniżona poprzez działanie innych ssaczych enzymów, przy czym połączenie hamowania ekspresji aktywnej a1,3-fukozylotransferazy za pomocą wektora według wynalazku i za pomocą wektora z enzymem ssaczym jest szczególnie skuteczna.
Do transfekcji może być zastosowany każdy rodzaj rośliny, przykładowo fasola Mung, tytoń, pomidor i/lub ziemniak.
Inny, zalecany sposób wytwarzania rekombinowanych komórek gospodarza, zwłaszcza komórek roślinnych lub owadzich lub roślin lub owadów obejmuje etapy, w których cząsteczkę DNA zawierająca mutację wprowadza się do genomu komórki gospodarza lub rośliny lub owada w miejsce niezmutowanej sekwencji homologicznej. (Schaefer et al. 1997, Plant J.; 11 (6): 1195-1206). W sposobie tym nie stosuje się wektora, lecz czystą cząsteczkę DNA. Cząsteczka DNA jest wprowadzana do gospodarza np. poprzez strzelbę genową, mikroiniekcję lub elektroporację, aby wymienić tylko trzy przykłady. Jak już wyjaśniono wyżej, cząsteczka DNA łączy się z homologiczną sekwencją w genomie gospodarza i dochodzi do rekombinacji homologicznej i w ten sposób przyjęcia do genomu mutacji delecji, insercji lub substytucji: ekspresja GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazy może zostać wyciszona lub całkowicie przerwana.
Zgodnie z wynalazkiem opisano też rośliny lub komórki roślinne oraz owady lub komórki owadzie, w których aktywność GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazy wynosi poniżej 50%, w szczególności poniżej 20%, a zwłaszcza 0%, występującej w naturalnych roślinach lub komórkach roślinnych oraz owadach lub komórkach owadów aktywności GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazowej. Zaletą takich roślin lub komórek roślinnych jest to, że glikoproteiny, które są przez nie produkowane, nie posiadają żadnej lub prawie żadnej a1,3-związanej fukozy. Jeśli więc produkty tych roślin lub owadów są przyjmowane przez organizm ludzki lub kręgowców, nie dochodzi do żadnej reakcji immunologicznej wobec epitopu a1,3-fukozy.
W rekombinowanych roślinach lub komórkach roślinnych, które otrzymano jednym z wyżej opisanych sposobów, produkcja GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazy jest wytłumiona lub całkowicie przerwana.
W rekombinowanych owadach lub komórkach owadzich, które otrzymano jednym z wyżej opisanych sposobów, produkcja GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazy jest wytłumiona lub całkowicie przerwana. Również tutaj nie są produkowane żadne glikoproteiny z a1,3-związanymi resztami fukozy, dzięki czemu również nie dochodzi do reakcji immunologicznej na epitop a1,3-fukozy.
Wynalazek dotyczy także cząsteczki PNA, która zawiera sekwencję zasad, która jest komplementarna do sekwencji cząsteczki DNA według wynalazku oraz jej sekwencji częściowych. PNA (kwas peptydonukleinowy) jest sekwencją podobną do DNA, przy czym zasady nukleotydowe są przyłączone do szkieletu pseudopeptydowego. PNA hybrydyzuje ogólnie z komplementarnymi oligomerami DNA, RNA lub PNA na zasadzie tworzenia par Watsona-Cricka oraz tworzenia helis. Szkielet peptydowy zapewnia większą odporność na degradację enzymatyczną. Dzięki temu cząsteczka PNA jest ulepszonym reagentem w technologii antysensownej. Cząsteczki PNA nie są w stanie strawić ani nukleazy, ani proteazy. Stabilność cząsteczki PNA, gdy jest związana z sekwencją komplementarną, wykazuje dostateczne steryczne blokowanie polimeraz DNA i RNA, odwrotnej transkryptazy, telomerazy i rybosomów.
Gdy cząsteczka PNA zawiera wyżej wymienioną sekwencję, wiąże się ona z DNA lub z miejscem DNA kodującym GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazę, i może w ten sposób hamować transkrypcję
PL 205 785 B1 tego enzymu. Cząsteczka PNA, ze względu na to, że nie ulega ani transkrypcji ani translacji, jest wytwarzana na drodze syntezy, np. za pomocą techniki t-Boc.
Wynalazek dotyczy też cząsteczki kwasu peptydonukleinowego (PNA), która zawiera sekwencję zasad, która odpowiada sekwencji cząsteczki DNA według wynalazku oraz jej sekwencjom częściowym. Taka cząsteczka PNA tworzy kompleks z mRNA lub miejscem mRNA GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazy, hamując w ten sposób translację tego enzymu. Jest to podobne do działania antysensownego RNA. I tak np. szczególnie efektywnym obszarem tworzenia kompleksów jest region startu translacji lub również nie podlegające translacji regiony 5' mRNA.
Zgodnie z wynalazkiem opisano także sposób otrzymywania roślin lub owadów lub komórek, zwłaszcza komórek roślinnych lub owadzich, które wykazują zablokowaną ekspresję GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazy na poziomie transkrypcji lub translacji, w którym wprowadza się do komórek cząsteczki PNA według wynalazku. Do wprowadzenia cząsteczki PNA lub cząsteczek PNA do komórki stosuje się ponownie znane metody np. elektroporację lub mikroiniekcję. Wprowadzanie jest szczególnie efektywne gdy oligomery PNA są związane z peptydami przenikającymi do komórek np. transportanem lub pAntp (Pooga et al. 1998, Nature Biotechnology, 16; 857-861).
Zgodnie z wynalazkiem opisano także sposób otrzymywania rekombinowanych glikoprotein, w którym opisane tu rekombinowane rośliny lub komórki roślinne oraz rekombinowane owady lub komórki owadzie, w których wyciszono lub całkowicie stłumiono produkcję GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazy, lub rośliny lub owady lub komórki, do których wprowadzono sposobem według wynalazku cząsteczki PNA, transfekuje się genem, kodującym glikoproteinę, dzięki czemu są ekspresjonowane rekombinowane glikoproteiny. Przy tym komórki gospodarza lub gospodarz jak już powyżej także opisano są transfekowani opisanymi już powyżej wektorami zawierającymi geny dla pożądanych białek. Poddane transfekcji komórki roślinne lub owadzie ekspresjonują pożądane białka, przy czym nie posiadają one żadnej lub prawie żadnej a1,3-związanej fukozy. Dzięki temu nie są wyzwalane wspomniane już powyżej żadne reakcje immunologiczne w organizmie ludzkim lub kręgowców. W tych systemach mogą być produkowane wszelkie białka.
Zgodnie z wynalazkiem opisano też sposób otrzymywania rekombinowanych ludzkich glikoprotein, w którym według wynalazku rekombinowane rośliny lub komórki roślinne oraz rekombinowane owady lub komórki owadzie, w których wyciszono lub całkowicie stłumiono produkcję GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazy, lub rośliny lub owady lub komórki, do których wprowadzono sposobem według wynalazku cząsteczki PNA, transfekuje się genem, kodującym glikoproteinę, dzięki czemu są ekspresjonowane rekombinowane glikoproteiny. Sposób ten umożliwia produkcję ludzkich białek w roślinach (komórkach roślinnych), które, jeśli są przyjmowane przez ludzki organizm, nie wyzwalają żadnej reakcji immunologicznej skierowanej wobec a1,3-związanej reszty fukozy. Przy tym możliwe jest dzięki temu stosowanie w produkcji rekombinowanych glikoprotein gatunków roślin, które służą jako środki spożywcze, takie jak np. banan, ziemniak i/lub pomidor. Tkanki tej rośliny zawierają rekombinowaną glikoproteinę, dzięki czemu np. przez ekstrakcję rekombinowanej glikoproteiny z tej tkanki i następnie zaaplikowanie lub bezpośrednio przez spożycie tkanki roślinnej, rekombinowaną glikoproteina jest przyjmowana przez organizm ludzki.
Zalecany przy tym jest sposób otrzymywania rekombinowanych ludzkich glikoprotein do stosowania w medycynie, w którym rekombinowane rośliny lub komórki roślinne oraz rekombinowane owady lub komórki owadzie, w których wyciszono lub całkowicie stłumiono produkcję GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazy, lub rośliny lub owady lub komórki, do których wprowadzono opisanym tu sposobem cząsteczki PNA, transfekuje się genem, kodującym glikoproteinę, dzięki czemu są ekspresjonowane rekombinowane glikoproteiny. Przy tym uwzględnia się każde białko będące przedmiotem zainteresowania medycyny.
Zgodnie z wynalazkiem opisano także rekombinowane glikoproteiny, otrzymane sposobem wyżej opisanym w systemach roślinnych lub owadzich, i których sekwencja peptydowa wykazuje poniżej 50%, zwłaszcza poniżej 20%, szczególnie 0%, a1,3-związanych reszt fukozy występujących w białkach ekspresjonowanych w układach roślinnych lub owadzich o nie zredukowanej ilości fukozylotransferazy. Zalecane są oczywiście glikoproteiny, które nie posiadają a1,3-związanych reszt fukozy. Ilość a1,3-związanej fukozy jest zależna od stopnia wyciszenia GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazy opisanego powyżej.
Zgodnie z wynalazkiem opisano także rekombinowane ludzkie glikoproteiny, otrzymane sposobem powyżej opisanym w systemach roślinnych lub owadzich, i których sekwencja peptydowa wykazuje poniżej 50%, zwłaszcza poniżej 20%, szczególnie 0%, a1,3-związanych reszt fukozy występująPL 205 785 B1 cych w białkach ekspresjonowanych w układach roślinnych lub owadzich o nie zredukowanej ilości fukozylotransferazy.
Szczególnie zalecane są rekombinowane glikoproteiny do zastosowania w medycynie, wytworzone sposobem powyżej opisanym w systemach roślinnych lub owadzich, i których sekwencja peptydowa wykazuje poniżej 50%, zwłaszcza poniżej 20%, szczególnie 0%, a1,3-związanych reszt fukozy występujących w białkach ekspresjonowanych w układach roślinnych lub owadzich o nie zredukowanej ilości fukozylotransferazy.
Te glikoproteiny mogą posiadać inne związane jednostki oligosacharydowe, które są specyficzne dla roślin lub owadów, czym w przypadku ludzkich glikoprotein różnią się od naturalnie występujących glikoprotein. Pomimo tego, opisane tu glikoproteiny będą wywoływały mniejszą lub nie będą wywoływały prawie żadnej reakcji immunologicznej w organizmie ludzkim, ponieważ, jak już przedstawiono we wstępie opisu, a1,3-związane reszty fukozy są główną przyczyną reakcji immunologicznych lub krzyżowych reakcji immunologicznych wywoływanych przez glikoproteiny roślinne i owadzie.
Zgodnie z wynalazkiem opisano także kompozycję farmaceutyczną, zawierającą opisane tu glikoproteiny. Obok opisanych tu glikoprotein kompozycja farmaceutyczna zawiera inne dodatki powszechnie stosowane w takich kompozycjach. Są to np. odpowiednie rozcieńczalniki z różnymi buforami (np. Tris-HCl, octan, fosforan), pH i siłą jonową, dodatkami, takimi jak np. związki powierzchniowo czynne i rozpuszczalniki (np. Tween 80, Polysorbate 80), konserwanty (np. Thimerosal, alkohol benzylowy) adiuwanty, antyutleniacze (np. kwas askorbinowy, disiarczyn disodu), emulgatory, wypełniacze (np. laktoza, mannitol), kowalencyjnie związane z białkiem polimery, takie jak np. glikol polietylowy, wbudowanie materiału w uformowane w cząsteczki preparaty z połączeń polimerowych, takie jak np. kwas polimlekowy, kwas poliglikolowy, itp., lub w liposomy, środki pomocnicze i/lub nośniki, które podczas każdego leczenia są przydatne. Takie kompozycje będą wpływać na stan fizyczny, stabilność, szybkość uwalniania in vivo, i szybkość wydzielania in vivo opisanych tu glikoprotein.
Zgodnie z wynalazkiem opisano także sposób selekcjonowania cząsteczek DNA kodujących GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazę w próbce, w którym do próbki dodaje się znakowane cząsteczki DNA według wynalazku, które wiążą się z cząsteczkami DNA kodującymi GlcNAc-a1,3-fukozylotrasferazę. Hybrydyzujące cząsteczki DNA mogą być poddawane detekcji, mierzone i selekcjonowane. Aby w próbce występował jednoniciowy DNA, z którym mogą hybrydyzować znakowane cząsteczki DNA, próbkę poddaje się denaturacji, np. przez podgrzewanie.
Jedną z możliwości jest, ewentualnie po dodaniu endonukleazy, rozdzielenie badanego DNA elektroforezą żelową na żelu agarozowym. Po przeniesieniu na błonę nitrocelulozową dodaje się znakowane cząsteczki DNA według wynalazku, które hybrydyzują z odpowiednią homologiczną cząsteczką DNA („Southern Blotting”).
Inną możliwością jest uzyskanie homologicznych genów z innych gatunków sposobami wykorzystującymi PCR poprzez zastosowanie specyficznych i/lub zdegenerowanych starterów, wywodzących się z sekwencji cząsteczki DNA według wynalazku.
Zalecane jest aby w wyżej wymienionym sposobie próbka zawierała genomowy DNA organizmu roślinnego lub owada. Tym sposobem można bardzo szybko i wydajnie zbadać dużą ilość roślin i owadów pod kątem występowania genu GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazy. W ten sposób można selekcjonować rośliny i owady, które nie posiadają tego genu albo w takich roślinach i owadach, które posiadają ten gen, powyżej opisanym sposobem według wynalazku może być wyciszona lub całkowicie stłumiona ekspresja GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazy, dzięki czemu mogą być stosowane następnie do transfekcji i wytwarzania (ludzkich) glikoprotein.
Opisano tu także cząsteczki DNA kodujące GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazę, które zostały wyselekcjonowane dwoma sposobami opisanymi powyżej, a następnie zostały wyizolowane z próbki. Te cząsteczki mogą być zastosowane w dalszych badaniach. Mogą być one zsekwencjonowane i zastosowane też jako sondy DNA do znajdywania GlcNAc-a1,3-fukozylotransferaz. Te znakowane cząsteczki DNA dla organizmów, które są spokrewnione z organizmami, z których zostały one wyizolowane, będą funkcjonować wydajniej jako sondy, niż cząsteczki DNA według wynalazku.
Zgodnie z wynalazkiem - opisano także preparat sklonowanej zgodnie z wynalazkiem GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazy, która posiada izoformy o wartościach pI pomiędzy 6,0, a 9,0, zwłaszcza pomiędzy 6,8, a 8,2. Wartość pI dla białka jest tą wartością pH, dla której jego ładunek netto wynosi zero i zależy od sekwencji aminokwasów, wzoru glikozylacji oraz struktury przestrzennej białka. GlcNAc-a1,3-fukozylotransferaza ma przynajmniej 7 izoform, które mają wartość pI w tym zakresie. Przyczyną istnienia różnych izoform transferazy są np. różne glikozylacje oraz ograniczona proteoliza.
PL 205 785 B1
Badania pokazały, że w siewkach z fasoli Mung pochodzących z różnych roślin są różne proporcje izozymów. Wartość pl białka może być określona za pomocą izoogniskowania elektrycznego, które jest znane specjaliście.
Główna izoforma enzymu wykazuje masę cząsteczkową 54 kDa.
Dogodnie opisany tu preparat posiada izoformy o wartościach pl wynoszących 6,8, 7,1 i 7,6.
Zgodnie z wynalazkiem opisano także sposób otrzymywania „uroślinnionych” jednostek węglowodanowych z ludzkich lub innych kręgowcowych glikoprotein, przy czym do próbki, która zawiera jednostkę węglowodanową lub glikoproteinę, dodaje się jednostki fukozowe oraz kodowaną przez wyżej opisaną cząsteczkę DNA GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazę, dzięki czemu fukoza zostaje związana w pozycji α1,3 przez GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazę z jednostką węglowodanową lub glikoproteiną. Sposób klonowania GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazy umożliwia otrzymanie dużych ilości oczyszczonego enzymu. W celu uzyskania w pełni aktywnej transferazy, stosuje się odpowiednie warunki reakcji. Okazało się, że transferaza posiada szczególnie wysoką aktywność przy wartości pH około 7, gdy stosuje się bufor kwasu 2-(N-morfolino)etanosulfonowego-HCl. W obecności dwuwartościowych kationów, zwłaszcza Mn2+, wzmacniana jest aktywność rekombinowanej transferazy. Jednostka węglowodanowa jest dodawana do próbki w postaci związanej lub w postaci niezwiązanej z białkiem. Rekombinowana transferaza wykazuje aktywność wobec obu form.
Wynalazek zostanie dalej wyjaśniony na podstawie figur i rysunków, do których nie jest oczywiście ograniczony. Figura 1a i 1b przedstawia szczegółowo na rysunku mierzone ilości białka i mierzoną aktywność enzymatyczną w pojedynczych frakcjach eluatu w postaci krzywej; Fig. 2 przedstawia zdjęcie żelu po elektroforezie GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazy; Fig. 3 przedstawia wynik izoogniskowania elektrycznego i mierzoną aktywność transferazową poszczególnych izoform; Fig. 4 N-końcowe sekwencje 4 tryptycznych peptydów 1-4 oraz sekwencję DNA trzech starterów S1, A2 i A3; Fig. 5a i 5b sekwencję cDNA a1,3-fukozylotransferazy; Fig. 6a i 6b pochodzącą od nich sekwencję aminokwasową a1,3-fukozylotransferazy; Fig. 7 przedstawia schemat a1,3-fukozylotransferazy i hydrofobowość reszt aminokwasowych; Fig. 8 porównanie motywów konserwowanych różnych fukozylotransferaz; Fig. 9 porównanie aktywności fukozylotransferazy z komórek owadzich transfekowanych genem GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazy z kontrolą negatywną; Fig. 10a i 10b struktury różnych akceptorów a1,3-fukozylotransferazy; Fig. 11 i 12 widma masowe; i Fig. 13 wynik HPLC.
P r z y k ł a d 1
Izolowanie rdzeniowej-a1,3-fukozylotransferazy
Wszystkie etapy prowadzono w 4°C. Siewki fasoli Mung homogenizowano w mikserze, przy czym stosowano 0,75 objętości buforu ekstrakcyjnego na kg fasoli. Homogenizat był następnie filtrowany przez dwie warstwy bawełny i filtrat odwirowywano przy 30000 x g przez 40 min. Supernatant odrzucano a osad ekstrahowano przez noc w buforze do rozcieńczeń stale mieszając. Następnie odwirowywano przy 30000 x g przez 40 min otrzymując ekstrakt Tritonowy.
Ekstrakt Tritonowy oczyszczano następująco:
Etap 1: Ekstrakt Tritonowy nanoszono na mikrogranularny wymieniacz anionowy dietyloaminoetylocelulozowy DE52 kolumny celulozowej (5x28 cm, Fa. Whatman), zrównoważony wcześniej buforem A. Niezwiązana frakcja była obrabiana dalej w etapie 2.
Etap 2: Próbkę nanoszono na zrównoważoną buforem A kolumnę Affi-Gel Blue (2,5x32). Po przemyciu kolumny tym buforem zaadsorbowane białko eluowano buforem A zawierającym 0,5 M NaCl.
Etap 3: Po dializie eluatu z etapu 2 wobec buforu B był on równoważony w tym samym buforze i nanoszony na kolumnę S-Sepharose. Związane białko eluowano liniowym gradientem od 0 do 0,5 M NaCl w buforze B. Frakcje z GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazą zbierano i dializowano wobec buforu C.
Etap 4: Dializowana próbka była nanoszona na zrównoważoną buforem C kolumnę GnGnSepharose. Związane białko eluowano buforem C zawierającym 1 M NaCl w miejsce MnCl2.
Etap 5: Enzym następnie dializowano wobec buforu D i nanoszono na kolumnę GDPheksanoloamino-Sepharose. Po przemyciu kolumny buforem D eluowano transferazę zastępując MgCl2 i NaCl przez 0,5 mM GDP. Aktywne frakcje zbierano, dializowano wobec buforu 20 mM TrisHCl, pH 7,3, i liofilizowano.
Aktywność enzymatyczną GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazy określano przez zastosowanie peptydu GnGn i GDP-L-[U-14C] fukozy przy stężeniach substratu każdorazowo 0,5 i 0,25, w obecności buforu kwasu 2-(N-morfolino)etanosulfonowego-HCl, Triton X-100, MnCl2, GlcNAc i AMP (według
PL 205 785 B1
Staudacher et al. 1998 Glycoconjugate J. 15, 355-360; Staudacher et al. 1991 Eur. J. Biochem. 199,
745-751).
Stężenia białka określano za pomocą metody kwasu bicinchoninowego (Pierce) lub, w ostatnich etapach oczyszczania enzymu, za pomocą analizy aminokwasów (Altmann 1992 Anal. Biochem. 204,
215-219).
Fig. 1a i 1b przedstawia w postaci krzywych mierzone ilości białka i mierzoną aktywność enzymatyczną pojedynczych frakcji eluatu. Fig. 1a pokazuje opisany powyżej rozdział na kolumnie z S-Sepharose, Fig. 1b pokazuje rozdział na kolumnie z GnGn-Sepharose, przy czym kółko oznacza białko, czarne, pełne koło GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazę a kwadrat N-acetyl-e-glukozaminidazę. U określa ilość enzymu, która przenosi 1 μmol fukozy na akceptor przez jedną minutę.
Tabela 1 pokazuje poszczególne etapy oczyszczania transferazy.
T a b e l a 1
etap oczyszczania całkowite białko całkowita aktywność aktywność specyficzna stopień oczyszczenia wydajność
Triton X-100 mg mU mU/mg x-razy %
ekstrakt 91500 4846 0,05 1 100
DE52 43700 4750 0,10 2 98,0
Affigel Blue 180,5 4134 23 460 85,3
S-Sepharose 8,4 3251 390 7800 67,1
GnGn-Sepharose 0,131 1044 8030 160000 21,5
GDP-Heksanolamino-Sepharose 0,021 867 43350 867000 17,9
1 uzyskano za pomocą analizy aminokwasów bufor ekstrakcyjny:
0,5 mM ditiotreitol mM EDTA
0,5% poliwinylopolipirolidon 0,25 M sacharoza bufor 50 mM Tris-HCl, pH 7.3 bufor do roztworu:
0,5 mM ditiotreitol 1 mM EDTA 1,5% triton X-100 50 mM Tris-HCl, pH 7,3 bufor A:
mM Tris-HCl bufor, pH 7,3 z:
0,1% Triton X-100 i
0,02% NaN3 bufor B:
mM bufor Na-cytrynianowy, pH 5,3 z: 0,1% Triton X-100 i
0,02% NaN3 bufor C:
mM bufor Tris-HCl, pH 7,3 z:
mM MnCl2 i
0,02% NaN3 bufor D:
mM Tris-HCl, pH 7,3 z:
mM MgCl2,
0,1 M NaCl i
0,02% NaN3
PL 205 785 B1
P r z y k ł a d 2:
SDS-Page i izoogniskowanie elektryczne
SDS-Page prowadzono w oprawie Biorad-Mini-Protean na żelach z 12,5% akrylamidem i 1% bisakrylamidem. Żele wybarwiano Coomassie Brilliant Blue R-250 lub srebrem. Izoogniskowanie elektryczne fukozylotransferazy przeprowadzono na gotowych żelach z zakresem pl pomiędzy 6-9 (Servalyt precotes 6-9, Serva). Żele wybarwiano srebrem według protokołu producenta. Do elektroforezy dwuwymiarowej prążki z elektroforezy wycinano z żelu do ogniskowania, traktowano odczynnikiem S-akilującym i SDS, i prowadzono SDS-Page jak wyżej opisano.
Fig. 2 przedstawia zdjęcie żelu GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazy po elektroforezie, przy czym po lewej stronie przedstawiono elektroforezę dwuwymiarową a po prawej stronie jednowymiarową SDS-Page. Przy czym linia oznaczona jako A to standard, linia oznaczona jako B to GlcNAc-a1,3-fukozylotransferaza z kolumny GnGn-Sepharose i linia oznaczona jako C to „oczyszczona” GlcNAc-a1,3-fukozylotransferaza, tj. frakcja z kolumny GDP-heksanoloaminowej-Sepharose. Dwa prążki odpowiadające 54 i 56 kDa przedstawiają izoformy transferazy.
Fig. 3 przedstawia wynik izoogniskowania elektrycznego. Linia A była wybarwiana srebrem, na linii B testowano aktywność izoform transferazy. Aktywność podano przy tym jako ilość fukozy w %, która była przenoszona z GDP-Fukozy na substrat.
P r z y k ł a d 3:
Sekwencjonowanie peptydu
Do sekwencjonowania białka wycinano prążki z żelu SDS-poliakrylamidowego wybarwionego przy użyciu Coomassie, karboksyamidmetylowano i wycięto trypsyną według Gorg et al. 1988, Electrophoresis, 9, 681-692. Tryptyczne peptydy rozdzielano na HPLC z odwróconą fazą na 1,0 x 250 mm Vydac C18 w 40°C z przepływem 0,05 ml/min, przy czym stosowano aparat HP 1100 (HewlettPackard). Izolowane peptydy sekwencjonowano w układzie do sekwencjonowania białek z HewlettPackard G1005A postępując według protokołu producenta. Następnie mieszaninę peptydów analizowano przez trawienie Ingel za pomocą MALDI-TOF MS (patrz niżej).
Fig. 4 przedstawia N-końcowe sekwencje 4 peptydów tryptycznych 1-4 (SEQ ID No: 5-8). W oparciu o pierwsze trzy peptydy otrzymano startery S1, A2 i A3 (numery identyfikacyjne sekwencji 9-11).
P r z y k ł a d 4:
RT-PCR i klonowanie cDNA
Całkowity RNA izolowano z 3 dniowych liścieni fasoli Mung, przy czym stosowano system do izolacji SV Total RNA produkowany przez Promega. Do uzyskania pierwszej nici cDNA inkubowano całkowity RNA przez 1 godz. w 48°C z odwrotną transkryptazą AMV i starterami Oligo(dT), przy czym stosowano Reverse Transkription System z Promega.
Pierwszą nić cDNA poddawano reakcji PCR, przy czym stosowano kombinację sensownych i antysensownych starterów: Do 10 μl mieszaniny reakcji do reakcji odwrotnej transkrpcji dodawano następujące składniki: 50 μl każdego z 0,1 μmol roztworu starterów, 0,1 mM dNTP, 2 mM MgCl2, 10 mM bufor Tris-HCl, pH 9,0, 50 mM KCl i 0,1% Triton X-100.
Po pierwszym etapie denaturacji w 95°C przez 2 min, następowały 40 cykle po 1 min w 95°C, 1 min w 49°C i 2 min w 72°C. Ostatni etap wydłużania przeprowadzono w 72°C przez 8 min. Produkty PCR subklonowano do wektora pCR2.1, przy czym stosowano zestaw TA Cloning Kit z Invitrogen i sekwencjonowano. Produktami tej PCR były dwa fragmenty DNA o długości od 744 bp i 780 bp, przy czym obydwa fragmenty DNA wykazywały taki sam koniec 5' (patrz również Fig. 7).
W oparciu o te dwa fragmenty DNA, brakujące regiony 5' i 3' cDNA otrzymywano szybką amplifikacją 5'- i 3'- końców cDNA (RACE), przy czym stosowano zestaw RACE Kit z Gibco-BRL. Jako starter antysensowny zastosowano uniwersalny starter do amplifikacji z zestawu a jako starter sensowny stosowano albo 5'-CTGGAACTGTCCCTGTGGTT-3' (SEQ ID No: 12) albo 5'AGTGCACTAGAGGGCCAGAA-3' (SEQ ID No: 13). Jako starter sensowny stosowano też skrócony starter kotwiczący z zestawu a jako starter antysensowny stosowano 5'-TTCGAGCACCACAATTGGAAAT-3' (SEQ ID No: 14) albo 5'-GAATGCAAAGACGGCACGATGAAT-3' (SEQ ID No: 15).
PCR przeprowadzono w warunkach opisanych powyżej w temperaturze przyłączania starterów 55°C. Produkty 5' i 3' RACE subklonowano do wektora pCR2.1 i sekwencjonowano. Sekwencje subklonowanych fragmentów sekwencjonowano metodą dideoksy-nukleotydową (ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Ready reaction Kit i ABI PRISM 310 Genetic analyser (Perkin Elmer)). Do sekwencjonowania produktów wklonowanych do wektora pCR2.1 stosowano startery zgodne T7
PL 205 785 B1 i M13. Obydwie nicie regionu kodującego sekwencjonowano w wiedeńskim VBC GenomicsSequencing Service, przy czym stosowano znakowane w podczerwieni startery (IRD700 i IRD800) i sekwentor LI-COR Long Read IR 4200 (Lincoln, NE).
Fig. 5a i 5b pokazują całkowity cDNA, o wielkości 2198 bp z otwartą ramką odczytu 1530 bp (SEQ ID No: 1). Otwarta ramka odczytu (kodon startu przy parach zasad 211-213, kodon stopu przy parach zasad 1740-1743) koduje białko z 510 aminokwasów o masie cząsteczkowej 56,8 kDa i teoretyczną wartością pl 7.51.
Fig. 6a i 6b pokazują sekwencję aminokwasową uzyskaną z cDNA GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazy (SEQ ID No: 2). Miejsca glikozylycji asparaginowej znajdują się w pozycjach Asn346 i Asn429.
Fig. 7 przedstawia schematycznie cDNA GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazy (na górze) i uzyskany wskaźnik hydrofobowości kodowanego białka (na dole), przy czym dodatni wskaźnik hydrofobowości oznacza podwyższoną hydrofobowość. Jednocześnie przedstawiono wielkości obydwu wyżej wspomnianych produktów PCR w odniesieniu do pełnego cDNA. Obszar kodujący oznaczono kreską, przy czym „C” oznacza postulowy obszar cytoplazmatyczny, T oznacza postulowany obszar przezbłonowy i G oznacza postulowany katalityczny obszar transferazy znajdujący się wewnątrz pęcherzyka Golgiego. Analiza sekwencji DNA za pomocą „TMpred” (EMBnet, Szwajcaria) umiejscawia przypuszczalny region przezbłonowy pomiędzy Asn36 i Gly54. C-końcowy obszar enzymu zawiera przypuszczalnie region katalityczny i powinien wobec tego znajdować się wewnątrz aparatu Golgiego. Zatem transferaza wydaje się być białkiem przezbłonowym typu II, jak wszystkie dotychczas analizowane glikozylotransferazy, które odgrywają rolę w biosyntezie glikoprotein (Joziasse, 1992 Glycobiology 2, 271-277). Obszary szare przedstawiają cztery peptydy tryptyczne, a sześciokąt miejsca potencjalnej N-glikozylacji. Dostępne przez NCBI przeszukiwanie BLASTP wszystkich baz danych wykazało istnienie podobieństwa pomiędzy GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazą i innymi a1,3/4-fukozylotransferazami, np. ludzką fukozylotransferazą VI. W przypadku 18-21% (zbadane przez SIM-LALNVIEW, Expase, Szwajcaria) całkowite podobieństwo okazało się ono znaczące. Jednak, obszar sekwencji z 35 aminokwasów (SEQ ID No: 4) posiada niezwykle wysoką homologię do innych a1,3-fukozylotransferaz (Fig. 8). Ten obszar sekwencji znajduje się pomiędzy Glu267 i Pro301 z SEQ ID No: 2.
P r z y k ł a d 5:
Ekspresja rekombinowanej GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazy w komórkach owadów
Region kodujący przypuszczalnej GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazy wraz z regionem cytoplazmatycznym i przezbłonowym amplifikowano korzystając z zestawu Expand High Fidelity PCR System z Boehringer Mannheim stosując starter zgodny 5'-CGGCGGATCCGCAATTGAATGATG-3' (SEQ ID NO: 16) i starter odwrotny 5'-CCGGCTGCAGTACCATTTAGCGCAT-3' (SEQ ID No: 17). Produkt PCR trawiono dwukrotnie z użyciem Pstl i BamHl i subklonowano do traktowanego alkaliczną fosfatazą bakulowirusowego wektora do transferu pVL1393, który uprzednio strawiono z użyciem Pstl i Bamtil. Aby zapewnić rekombinację homologiczną, wektor transferowy z wirusowym DNA Baculo Gold (PharMingen, San Diego, CA) był współtransfekowany do komórek owadów Sf9 w medium IPL-41 z lipofektyną. Po 5-dniowej inkubacji w 27°C stosowano różne objętości supernatantu z rekombinowanym wirusem do infekowania owadzich komórek Sf21. Po 4 dniowej inkubacji w 27°C w medium IPL41 z 5% FCS, komórki Sf1 zbierano i przemywano dwukrotnie buforowanym fosforanem roztworem soli. Komórki zawieszano w 25 mM buforu Tris HCl, pH 7.4, z 2% Triton X-100 i przez sonifikację otwierano dla uzyskania białka.
P r z y k ł a d 6:
Test aktywności GlcNAc a1,3-fukozylotransferazy
Homogenat i supernatant komórkowy testowano pod względem aktywności GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazową. Próby ślepe zostały przeprowadzone z rekombinowanym bakulowirusem kodującym GlcNAc-transferazę I tytoniu (Strasser et al. 1999, Glycobiology, w druku).
Fig. 9 pokazuje mierzoną aktywność enzymatyczną rekombinowanej GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazy oraz kontroli negatywnej. W najlepszym przypadku aktywność enzymatyczna komórek poddanych kotransfekcji i ich supernatantów komórkowych była 30-krotnie wyższa niż aktywność kontroli negatywnych. Ta aktywność endogenna, która jest mierzona przy braku rekombinowanej transferazy, zasadniczo pochodzi od owadziej a1,6-fukozylotransferazy i tylko w niewielkim procencie od GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazy. Dlatego też podwyższenie GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazy, pochodzącej od rekombinowanych bakulowirusów, przekracza 100-krotność.
PL 205 785 B1
Enzym wykazał szeroką aktywność maksymalną przy wartości pH 7,0, gdy aktywność była mierzona w buforze kwasu 2-(N-morfolino)etanosulfonowego-HCl. Jak widać w tabeli 2, dodanie kationów dwuwartościowych, szczególnie Mn2+, zwiększa aktywność rekombinowanej transferazy.
T a b e l a 2 środek dodatkowy (stęż. 10 mM) względna aktywność (Akceptor: Peptyd GnGn)
%
nie ma 21
EDTA 18
MnCl2 100
CaCl2 82
MgCl2 52
CdCl2 44
CoCl2 35
CuCl2 3
NiCl2 24
ZnCl2 0,6
Tabela 3 pokazuje, że spośród zastosowanych akceptorów peptyd GnGn posiada najwyższy stopień wbudowywania w standardowych warunkach badań, tuż za nim są peptyd GnGnF6 i M5GnAsn. Nie można było stwierdzić przenoszenia na peptyd MM, który nie posiada redukującego końca GlcNAc na 3-związanej mannozie. Struktura ta wydaje się być konieczna dla rdzeniowej fukozylotransferazy. Rekombinowana transferaza była ponadto nieaktywna wobec dostępnych akceptorów, przy czym a1,3/4-fukozylotransferaza stosowana do określenia grup krwi, przenosi fukozę na GlcNAc na nieredukujących końcach oligosacharydów. Pozorne wartości Km dla substratów akceptorowych peptyd GnGn, peptyd GnGnF6, M5Gn-Asn i dla substratu donorowego GDP-fukozy wynosiły odpowiednio 0,19, 0,13, 0,23 lub 0,11. Struktury cząsteczek zostały przedstawione na Fig. 10a i 10b.
T a b e l a 3
Substrat akceptorowy aktywność wzgl. wartość Km
% mM
Peptyd GnGn 100 0,19
Peptyd GnGnF6 87 0,13
M5Gn-Asn 71 0,23
Peptyd MM 0
Galp1-4GlcNAc 0
Galp1-3GlcNAc 0
Galp1-3GlcNAcp1-3Galp1-4Glc 0
P r z y k ł a d 7:
Spektrometria masowa produktu fukozylotransferazy
Dabsylowany heksapeptyd GnGn (2 nmol) inkubowano wraz z homogenatem z komórek owadzich zawierających rekombinowaną GlcNAc-a1,3 fukozylotransferazę (0.08 mU) w obecności nieradioaktywnej GDP-L-fukozy (10 nmol), buforu kwasu 2-(N-morfolino)etanosulfonowego-HCl, Triton X-100, MnCl2, GlcNAc i AMP. Kontrola negatywna została przeprowadzona przy użyciu homogenatu komórek owadzich zainfekowanych próbami ślepymi. Próbki inkubowano przez 16 godz. w 37°C i analizowano za pomocą spektrometrii masowej MALDI TOF.
Spektrometria masowa była przeprowadzona za pomocą DYNAMO (Therrmo BioAnalysis, Santa Fe, NM), spektrometru typu MALDI-TOF MS, który zdolny jest do dynamicznej ekstrakcji (synonim
PL 205 785 B1 późnej ekstrakcji). Zastosowano dwa rodzaje preparatów macierzy prób: peptydy i dabsylowane glikolipidy rozpuszczano w 5% kwasie mrówkowym i nanoszono równoważnik na cel, suszono na powietrzu i przykrywano 1% kwasem a-cyjano-4-hydroksycynamonowym. Pirydyloaminowane glikany, zredukowane oligosacharydy i glikopeptydy nie poddawane obróbce rozcieńczano w wodzie, nanoszono na cel i suszono na powietrzu. Po dodaniu 2% kwasu 2,5-dihydroksybenzoesowego suszono próby bezzwłocznie pod próżnią.
Fig. 11 pokazuje widmo masowe tych próbek, przy czym A przedstawia kontrolę negatywną: główny pik (S) przedstawia substrat dabsylo-Val-Gly-Glu-(GlcNAc4Man3)Asn-Arg-Thr, przy czym wyliczona wartość [M+H]+ wynosi 2262.3. Substrat ten wydaje się być również produktem addycji na sodzie i jako mniejszy jon, który powstaje przez fragmentację grupy azotowej w grupie dabsylowej, przy (S*). Małą ilość produktu (P, [M+H] + = 2408.4) należy sprowadzić do endogennej a1,6-fukozylotransferazy. Pik przy m/z - 2424.0 przedstawia niepełną degalaktozylację substratu. Widmo masowe B pokazuje próbkę z rekombinowaną a1,3-fukozylotransferazą. Główny pik (P) stanowi produkt fukozylacji, (P*) jego jon fragmentowany.
Dodatkowo zmieszano równe ilości obydwu próbek, aby uzyskać podobne stężenia substratu i produktu (Próbka A). Tę mieszaninę rozcieńczano 0,1 M octanem amonu, pH 4,0, zawierającym 10 ąU N-glikozydazy A (Próbka B) lub 50 mM Tris/HCl, pH 8,5, zawierającym 100 μU (1 U hydrolizuje 1 μ mol substratu na minutę) N-glikozydazy F (Próbka c). Po 2 i 20 godz. pobierano małe równe ilości tych mieszanin i analizowano za pomocą MALDI-TOF MS.
Fig. 12 przedstawia trzy widma masowe próbek A, B i C. Niestrawiona próbka A pokazuje dwa główne piki: substrat przy 2261.4 m/z i fukozylowany produkt przy 2407.7 m/z. Środkowa krzywa pokazuje widmo masowe próbki B, traktowanej N-glikozydazą A, która hydrolizuje obydwa glikopeptydy. Pik przy 963.32 stanowi deglikozylowany produkt. Dolna krzywa pokazuje widmo masowe próbki C. N-glikozydaza F nie jest w stanie hydrolizować substratu α1,3 fukozylowanego, przez co widmo posiada pik przy 2406,7 m/z odpowiadający produktowi fukozylowanemu, podczas gdy pik hydrolizowanego substratu występuje przy 963,08 m/z.
P r z y k ł a d 8:
Analiza HPLC pirydyloaminowanego produktu fukozylotransferazy
Obydwie wyżej opisane próbki (produkt fukozylowany i kontrola negatywna) trawiono N-glikozydazą A. Otrzymane oligosacharydy pirydyloaminowano i analizowano techniką HPLC z odwróconą fazą (Wilson et al. 1998 Glycobiology 8, 651-661; Kubelka et al. 1994 Arch. Biochem. Biophys. 308, 148-157; Hase et al. 1984 J. Biochem. 95, 197-203).
Fig. 13 przedstawia na górnym diagramie B kontrolę negatywną, przy czym obok resztkowego substratu (peptyd GnGn) można zobaczyć produkt α1,6 fukozylowany. A prezentuje pik o znacznie obniżonym czasie retencji, co jest specyficzne dla a1,3-fukozy związanej z redukującym GlcNAc.
Na dolnym diagramie porównano wyizolowany produkt transferazy przed (krzywa A) i po trawieniu N-Acetylo-e-glukozoaminidazą (krzywa B) z MMF3 z pszczelej fosfolipazy Az (krzywa C).
PL 205 785 B1
Wykaz sekwencji <110> Altmann Dr., Friedrich <120> Cząsteczki DNA, biologicznie czynne wektory, cząsteczka DNA kodująca rybozym, sposób otrzymywania cDNA, sposób klonowania GlcNAc-al, 3fukozylotrasferazy, cząsteczki kwasu peptydonukleinowego i sposób otrzymywania roślin <130> R 36247 <140>
<141>
<160> 17 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 2198 <212> DNA <213> roślina <400> 1
actaactcaa acgctgcatt ttcttttttc tttcagggaa ccatccaccc ataacaacaa 60
aaaaaacaac agcaagctgt gtttttttta tcgttctttt tctttaaaca agcaccccca 120
tcatggaatc gtgctcataa cgccaaaatt ttccatttcc ctttgatttt tagtttattt 180
tgcggaattg gcagttgggg gcgcaattga atgatgggtc tgttgacgaa tcttcgaggc 240
tcgagaacag atggtgccca acaagacagc ttacccgttt tggctccggg aggcaaccca 300
aagaggaaat ggagcaatct aatgcctctt gttgttgccc ttgtggtcat cgcggagatc 360
gcgtttctgg gtaggttgga tatggccaaa aacgccgcca tggttgactc cctcgctgac 420
ttcttctacc gctctcgagc ggtcgttgaa ggtgacgatt tggggttggg tttggtggct 480
PL 205 785 B1
tctgatcgga attctgaatc gtatagttgt gaggaatggt tggagaggga ggatgctgtc 540
acgtattcga ggggcttttc caaagagcct atttttgttt ctggagctga tcaggagtgg 600
aagtcgtgtt cggttggatg taaatttggg tttagtgggg atagaaagcc agatgccgca 660
tttgggttac ctcaaccaag tggaacagct agcattctgc gatcaatgga atcagcagaa 720
tactatgctg agaacaatat tgccatggca agacggaggg gatataacat cgtaatgaca 780
accagtctat cttcggatgt tcctgttgga tatttttcat gggctgagta tgatatgatg 840
gcaccagtgc agccgaaaac tgaagctgct cttgcagctg ctttcatttc caattgtggt 900
gctcgaaatt tccggttgca agctcttgag gcccttgaaa aatcaaacat caaaattgat 960
tcttatggtg gttgtcacag gaaccgtgat ggaagagtga acaaagtgga agccctgaag 1020
cactacaaat ttagcttagc gtttgaaaat tcgaatgagg aagattatgt aactgaaaaa 1080
ttcttccaat cccttgttgc tggaactgtc cctgtggttg ttggtgctcc aaatattcag 1140
gactttgctc cttctcctgg ttcaatttta catattaaag agatagagga tgttgagtct 1200
gttgcaaaga ccatgagata tctagcagaa aatcccgaag catataatca atcattgagg 1260
tggaagtatg agggtccatc tgactccttc aaggcccttg tggatatggc agctgtgcat 1320
tcatcgtgcc gtctttgcat tcacttggcc acagtgagta gagagaagga agaaaataat 1380
ccaagcctta agagacgtcc ttgcaagtgc actagagggc cagaaaccgt atatcatatc 1440
tatgtcagag aaaggggaag gtttgagatg gagtccattt acctgaggtc tagcaattta 1500
actctgaatg ctgtgaaggc tgctgttgtt ttgaagttca catccctgaa tcttgtgcct 1560
gtatggaaga ctgaaaggcc tgaagttata agagggggga gtgctttaaa actctacaaa 1620
atatacccaa ttggcttgac acagagacaa gctctttata ccttcagctt caaaggtgat 1680
gctgatttca ggagtcactt ggagaacaat ccttgtgcca agtttgaagt catttttgtg 1740
tagcatgcgc taaatggtac ctctgctcta cctgaattag cttcacttag ctgagcacta 1800
gctagagttt taggaatgag tatggcagtg aatatggcat ggctttattt atgcctagtt 1860
tcttggccaa ctcattgatg ttttgtataa gacatcacac tttaatttta aacttgtttc 1920
tgtagaagtg caaatccata tttaatgctt agttttagtg ctcttatctg atcatctaga 1980
agtcacagtt cttgtatatt gtgagtgaaa actgaaatct aatagaagga tcagatgttt 2040
cactcaagac acattattac ttcatgttgt tttgatgatc tcgagctttt ttagtgtctg 2100
gaactgtccc tgtggtttga gcacctgtta ttgcttcagt gttactgtcc agtggttatc 2160
gtttttgacc tctaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaa 2198
PL 205 785 B1
PL 205 785 B1
Ser Arg Gly 115 Phe Ser Lys Glu Pro 120 Ile Phe Val Ser Gly 125 Ala Asp Gin
Glu Trp Lys Ser Cys Ser Val Gly Cys Lys Phe Gly Phe Ser Gly Asp
130 135 140
Arg Lys Pro Asp Ala Ala Phe Gly Leu Pro Gin Pro Ser Gly Thr Ala
145 150 155 160
Ser Ile Leu Arg Ser Met Glu Ser Ala Glu Tyr Tyr Ala Glu Asn Asn
165 170 175
Ile Ala Met Ala Arg Arg Arg Gly Tyr Asn Ile Val Met Thr Thr Ser
180 185 190
Leu Ser Ser Asp Val Pro Val Gly Tyr Phe Ser Trp Ala Glu Tyr Asp
195 200 205
Met Met Ala Pro Val Gin Pro Lys Thr Glu Ala Ala Leu Ala Ala Ala
210 215 220
Phe Ile Ser Asn Cys Gly Ala Arg Asn Phe Arg Leu Gin Ala Leu Glu
225 230 235 240
Ala Leu Glu Lys Ser Asn Ile Lys Ile Asp Ser Tyr Gly Gly Cys His
245 250 255
Arg Asn Arg Asp Gly Arg Yal Asn Lys Yal Glu Ala Leu Lys His Tyr
260 265 270
PL 205 785 B1
Lys Phe Ser Leu Ala Phe Glu Asn Ser Asn Glu Glu Asp Tyr Val Thr
275 280 285
Glu Lys Phe Phe Gin Ser Leu Val Ala Gly Thr Val Pro Val Val Val
290 295 300
Gly Ala Pro Asn Ile Gin Asp Phe Ala Pro Ser Pro Gly Ser Ile Leu
305 310 315 320
His Ile Lys Glu Ile Glu Asp Val Glu Ser Val Ala Lys Thr Met Arg
325 330 335
Tyr Leu Ala Glu Asn Pro Glu Ala Tyr Asn Gin Ser Leu Arg Trp Lys
340 345 350
Tyr Glu Gly Pro Ser Asp Ser Phe Lys Ala Leu Val Asp Met Ala Ala
355 360 365
Val His Ser Ser Cys Arg Leu Cys Ile His Leu Ala Thr Val Ser Arg
370 375 380
Glu Lys Glu Glu Asn Asn Pro Ser Leu Lys Arg Arg Pro Cys Lys Cys
385 390 395 400
Thr Arg Gly Pro Glu Thr Val Tyr His Ile Tyr Val Arg Glu Arg Gly
405 410 415
PL 205 785 B1
Arg Phe Glu Met Glu Ser Ile Tyr
420
Asn Ala Val Lys Ala Ala Val Val
435 440
Val Pro Val Trp Lys Thr Glu Arg
450 455
Ala Leu Lys Leu Tyr Lys Ile Tyr
465 470
Ala Leu Tyr Thr Phe Ser Phe Lys
485
Leu Glu Asn Asn Pro Cys Ala Lys
500
Leu Arg Ser Ser Asn Leu Thr Leu
425 430
Leu Lys Phe Thr Ser Leu Asn Leu
445
Pro Glu Val Ile Arg Gly Gly Ser
460
Pro Ile Gly Leu Thr Gin Arg Gin
475 480
Gly Asp Ala Asp Phe Arg Ser His
490 495
Phe Glu Val Ile Phe Val
505 510 <210> 3 <211> 105 <212> DNA <213> sekwencja sztuczna <220>
<223> Opis sekwencji sztucznej:cDNA <400> 3 gaagccctga agcactacaa atttagctta gcgtttgaaa attcgaatga ggaagattat 60
PL 205 785 B1 gtaactgaaa aattcttcca atcccttgtt gctggaactg tccct 105 <210> 4 <211> 35 <212> PRT <213> sekwencja sztuczna <220>
<223> Opis sekwencji sztucznej:peptyd <400> 4
Glu Ala Leu Lys His Tyr Lys Phe Ser Leu Ala Phe Glu Asn Ser Asn
10 15
Glu Glu Asp Tyr Val Thr Glu Lys Phe Phe Gin Ser Leu Val Ala Gly 20 25 30
Thr Val Pro <210> 5 <211> 15 <212> PRT <213> sekwencja sztuczna <220>
<223> Opis sekwencji sztucznej:peptyd
PL 205 785 B1 <400> 5
Lys Pro Asp Ala Xaa Phe Gly Leu Pro Gin Pro Ser Thr Ala Ser
10 15 <210> 6 <211> 10 <212> PRT <213> sekwencja sztuczna <220>
<223> Opis sekwencji sztucznej:peptyd <400> 6
Pro Glu Thr Val Tyr His Ile Tyr Val Arg
10 <210> 7 <211> 13 <212> PRT <213> sekwencja sztuczna <220>
<223> Opis sekwencji sztucznej:peptyd <400> 7
Met Glu Ser Ala Glu Tyr Tyr Ala Glu Asn Asn Ile Ala
10
PL 205 785 B1 <210> 8 <211> 10 <212> PRT <213> sekwencja sztuczna <220>
<223> Opis sekwencji sztucznej:peptyd <400> 8
Gly Arg Phe Glu Met Glu Ser Ile Tyr Leu
10 <210> 9 <211> 29 <212> DNA <213> sekwencja sztuczna <220>
<223> Opis sekwencji sztucznej:DNA <400> 9 gcngartayt aygcngaraa yaayathgc 29
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
PL 205 785 B1 <213> sekwencja sztuczna <220>
<223> Opis sekwencji sztucznej:DNA <400> 10 crtadatrtg rtanacngty tc 22 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> sekwencja sztuczna <220>
<223> Opis sekwencji sztucznej:DNA <400> 11 tadatnswyt ccatytcraa 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> sekwencja sztuczna <220>
<223> Opis sekwencji sztucznej:DNA <400> 12 ctggaactgt ccctgtggtt 20
PL 205 785 B1 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> sekwencja sztuczna
<220>
<223> Opis sekwencji sztucznej:DNA
<400> 13
agtgcactag agggccagaa 20
<210> 14
<211> 22
<212> DNA
<213> sekwencja sztuczna
<220>
<223> Opis sekwencji sztucznej:DNA <400> 14 ttcgagcacc acaattggaa at 22
<210> 15
<211> 24
<212> DNA
<213> sekwencja sztuczna
<220>
PL 205 785 B1 <223> Opis sekwencji sztucznej:DNA <400> 15 gaatgcaaag acggcacgat gaat 24 <210> 16 <211> 24 <212> DNA <213> sekwencja sztuczna <220>
<223> Opis sekwencji sztucznej:DNA <400> 16 cggcggatcc gcaattgaat gatg 24 <210> 17 <211> 25 <212> DNA <213> sekwencja sztuczna <220>
<223> Opis sekwencji sztucznej:DNA <400> 17 ccggctgcag taccatttag cgcat 25

Claims (16)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Cząsteczka DNA, znamienna tym, że obejmuje sekwencję według SEQ ID NO: 1 z otwartą ramką odczytu od pary zasad 211 do pary zasad 1740 lub wykazuje przynajmniej 50% identyczność z tą sekwencją lub hybrydyzuje w ostrych warunkach z tą sekwencją lub obejmuje sekwencję, która ze względu na kod genetyczny zdegenerowała do tej sekwencji DNA, przy czym ta sekwencja koduje białko roślinne o aktywności fukozylotransferazy lub jest komplementarna do niej.
  2. 2. Cząsteczka DNA według zastrz. 1, znamienna tym, że koduje białko o aktywności GlcNAc-a1,3-fukozylotrasferazy, zwłaszcza o aktywności rdzeniowej a1,3-fukozylotrasferazy.
  3. 3. Cząsteczka DNA według zastrz. 1 albo 2, znamienna tym, że wykazuje przynajmniej 70-80%, zwłaszcza przynajmniej 95%, identyczność z sekwencją według SEQ ID NO: 1.
  4. 4. Cząsteczka DNA według zastrz. 1 albo 2, albo 3, znamienna tym, że obejmuje pary zasad 2150 do 2250, zwłaszcza 2198.
  5. 5. Cząsteczka DNA, znamienna tym, że obejmuje sekwencję według SEQ ID NO: 3 lub obejmuje sekwencję, która wykazuje przynajmniej 85%, zwłaszcza przynajmniej 95% identyczność z tą sekwencją lub hybrydyzuje w ostrych warunkach z tą sekwencją lub obejmuje sekwencję, która ze względu na kod genetyczny zdegenerowała do tej sekwencji DNA.
  6. 6. Cząsteczka DNA, znamienna tym, że obejmuje częściową sekwencję cząsteczki DNA określonej w zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 4 oraz wykazuje przynajmniej 80% identyczność z sekwencją według SEQ ID NO: 1 oraz ma wielkość od 20 do 200, zwłaszcza 30 do 50 par zasad.
  7. 7. Cząsteczka DNA według zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 4, albo 5, albo 6, znamienna tym, że jest związana kowalencyjnie z odpowiednią wykrywalną substancją znacznikową.
  8. 8. Biologicznie czynny wektor, znamienny tym, że obejmuje cząsteczkę DNA określoną w zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 4, albo 5, albo 6, albo 7.
  9. 9. Biologicznie czynny wektor, znamienny tym, że obejmuje cząsteczkę DNA określoną w zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 4, albo 5, albo 6, albo 7 o orientacji odwróconej wobec promotora.
  10. 10. Cząsteczka DNA kodująca rybozym, znamienna tym, że posiada dwa odcinki sekwencji, każdy o długości przynajmniej 10 do 15 par zasad, które są komplementarne do odcinków sekwencji cząsteczki DNA określonej w zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 4, albo 5, albo 6, albo 7, przez co rybozym przyłącza i tnie mRNA, które jest produktem transkrypcji naturalnej cząsteczki DNA GlcNAc-a1,3-fukozylotrasferazy.
  11. 11. Biologicznie czynny wektor, znamienny tym, że obejmuje cząsteczkę DNA określoną w zastrz. 10.
  12. 12. Sposób otrzymywania cDNA obejmującego cząsteczkę DNA określoną w zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 4, albo 5, znamienny tym, że izoluje się RNA z komórek roślinnych, zwłaszcza z komórek liścienia, oraz przeprowadza się odwrotną transkrypcję po dodaniu odwrotnej transkryptazy oraz starterów specyficznych dla cząsteczki DNA określonej w zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 4, albo 5, albo starterów hybrydyzujących z cząsteczką DNA określoną w zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 4, albo 5.
  13. 13. Sposób klonowania GlcNAc-a1,3-fukozylotrasferazy, znamienny tym, że klonuje się cząsteczkę DNA określoną w zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 4, albo 5, do wektora, którym następnie transfekuje się komórkę gospodarza lub gospodarza, przy czym poprzez selekcję i namnażanie transfekowanych komórek gospodarza otrzymuje się linie komórkowe z ekspresją aktywnej GlcNAc-a1,3-fukozylotrasferazy.
  14. 14. Cząsteczka kwasu peptydonukleinowego (PNA), znamienna tym, że zawiera sekwencję zasad, która jest komplementarna do cząsteczki DNA określonej w zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 4, albo 5, albo 6, kodującej GlcNAc-a1,3-fukozylotrasferazę.
  15. 15. Cząsteczka kwasu peptydonukleinowego (PNA), znamienna tym, że zawiera sekwencję zasad, która odpowiada sekwencji cząsteczki DNA określonej w zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 4, albo 5, albo 6, kodującej GlcNAc-a1,3-fukozylotrasferazę.
  16. 16. Sposób otrzymywania roślin, które wykazują zablokowaną ekspresję GlcNAc-a1,3-fukozylotrasferazy na poziomie transkrypcji lub translacji, znamienny tym, że wprowadza się do roślin cząsteczkę PNA określoną w zastrz. 14 albo 15.
PL363438A 1999-02-18 2000-02-17 Cząsteczki DNA, biologicznie czynne wektory, cząsteczka DNA kodująca rybozym, sposób otrzymywania cDNA, sposób klonowania GlcNAc-α1, 3-fukozylotrasferazy, cząsteczki kwasu peptydonukleinowego i sposób otrzymywani roślin PL205785B1 (pl)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AT0027099A AT408446B (de) 1999-02-18 1999-02-18 Fucosyltransferase-gen
PCT/AT2000/000040 WO2000049153A1 (de) 1999-02-18 2000-02-17 Fucosyltransferase-gen

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL363438A1 PL363438A1 (pl) 2004-11-15
PL205785B1 true PL205785B1 (pl) 2010-05-31

Family

ID=3486087

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL363438A PL205785B1 (pl) 1999-02-18 2000-02-17 Cząsteczki DNA, biologicznie czynne wektory, cząsteczka DNA kodująca rybozym, sposób otrzymywania cDNA, sposób klonowania GlcNAc-α1, 3-fukozylotrasferazy, cząsteczki kwasu peptydonukleinowego i sposób otrzymywani roślin
PL385768A PL205710B1 (pl) 1999-02-18 2000-02-17 Sposoby otrzymywania rekombinowanych glikoprotein, sposób otrzymywania rekombinowanych roślinnych komórek gospodarza lub roślin z wytłumioną lub całkowicie wyłączoną produkcją GlcNAc-α1,3-fukozylotransferazy, sposób otrzymywania rekombinowanych roślinnych komórek gospodarza lub roślin, rekombinowane komórki roślinne, rekombinowane rośliny, sposób otrzymywania rekombinowanych komórek roślinnych z zablokowaną ekspresją GlcNAc-α1,3-fukozylotransferazy, sposoby otrzymywania rekombinowanych ludzkich glikoprotein, zwłaszcza do zastosowań medycznych oraz sposób selekcjonowania cząsteczek DNA

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL385768A PL205710B1 (pl) 1999-02-18 2000-02-17 Sposoby otrzymywania rekombinowanych glikoprotein, sposób otrzymywania rekombinowanych roślinnych komórek gospodarza lub roślin z wytłumioną lub całkowicie wyłączoną produkcją GlcNAc-α1,3-fukozylotransferazy, sposób otrzymywania rekombinowanych roślinnych komórek gospodarza lub roślin, rekombinowane komórki roślinne, rekombinowane rośliny, sposób otrzymywania rekombinowanych komórek roślinnych z zablokowaną ekspresją GlcNAc-α1,3-fukozylotransferazy, sposoby otrzymywania rekombinowanych ludzkich glikoprotein, zwłaszcza do zastosowań medycznych oraz sposób selekcjonowania cząsteczek DNA

Country Status (29)

Country Link
US (3) US8198078B2 (pl)
EP (3) EP1642979A1 (pl)
JP (2) JP5514386B2 (pl)
KR (1) KR20010108234A (pl)
CN (1) CN1360633A (pl)
AT (2) AT408446B (pl)
AU (1) AU771995B2 (pl)
BG (1) BG65140B1 (pl)
BR (1) BR0010114A (pl)
CA (1) CA2362964C (pl)
CZ (2) CZ308081B6 (pl)
DE (1) DE50011116D1 (pl)
DK (2) DK2062977T3 (pl)
EE (1) EE200100432A (pl)
ES (2) ES2444126T3 (pl)
HR (1) HRP20010681A2 (pl)
HU (1) HU230075B1 (pl)
IL (2) IL144777A0 (pl)
IS (1) IS6041A (pl)
MX (1) MXPA01008372A (pl)
NO (1) NO20013993L (pl)
NZ (1) NZ513685A (pl)
PL (2) PL205785B1 (pl)
PT (1) PT2062977E (pl)
SK (1) SK286416B6 (pl)
TR (1) TR200102393T2 (pl)
WO (1) WO2000049153A1 (pl)
YU (1) YU58901A (pl)
ZA (1) ZA200106735B (pl)

Families Citing this family (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2264177B1 (en) 1998-12-09 2015-09-30 Phyton Holdings, LLC Glycoproteins having human-type glycosylation
AT408446B (de) * 1999-02-18 2001-11-26 Altmann Friedrich Dr Fucosyltransferase-gen
EP2275541B1 (en) 1999-04-09 2016-03-23 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Method for controlling the activity of immunologically functional molecule
JP4890712B2 (ja) 1999-10-26 2012-03-07 スティヒティング ディーンスト ランドバウクンディフ オンデルズーク 植物における哺乳類型グリコシレーション
US6946292B2 (en) 2000-10-06 2005-09-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity
CN100385006C (zh) 2001-01-19 2008-04-30 陶氏化学公司 利用植物细胞分泌性生产具有人型糖链的糖蛋白的方法
CA2478297C (en) 2002-03-19 2013-05-14 Plant Research International B.V. Optimizing glycan processing in plants
EP2319935B1 (en) 2002-03-19 2016-04-27 Stichting Dienst Landbouwkundig Onderzoek GnTIII (UDP-N-acetylglucosamine:Beta -D mannoside Beta (1,4)-N-acetylglucosaminyltransferase III) expression in plants.
ES2362419T3 (es) * 2002-04-09 2011-07-05 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Células con depresión o deleción de la actividad de la proteína que participa en el transporte de gdp-fucosa.
AR042145A1 (es) 2002-11-27 2005-06-08 Dow Agrociences Llc Produccion de inmunoglobulinas en plantas con una fucocilacion reducida
ES2322140T3 (es) 2003-08-11 2009-06-17 Greenovation Biotech Gmbh Secuencias promotoras de la expresion de liquines y sus utilizaciones.
FI20055398A0 (fi) 2005-07-08 2005-07-08 Suomen Punainen Risti Veripalv Menetelmä solupopulaatioiden evaluoimiseksi
US8716557B2 (en) 2006-01-17 2014-05-06 Synthon Biopharmaceuticals B.V. Compositions and methods for inhibition of fucosyltransferase and xylosyltransferase expression in plants
US20090060921A1 (en) * 2006-01-17 2009-03-05 Biolex Therapeutics, Inc. Glycan-optimized anti-cd20 antibodies
CN102094020B (zh) * 2007-01-15 2012-11-28 燕秋 用于抑制LeY糖抗原合成的岩藻糖基转移酶I的RNA干涉序列及重组干涉质粒
CN102094019B (zh) * 2007-01-15 2012-11-28 燕秋 用于抑制LeY糖抗原合成的岩藻糖基转移酶Ⅳ的RNA干涉序列及重组干涉质粒
CA2684370C (en) 2007-04-17 2017-10-17 Plant Research International B.V. Mammalian-type glycosylation in plants by expression of non-mammalian glycosyltransferases
WO2009033011A1 (en) * 2007-09-07 2009-03-12 Children's Hospital Medical Center Use of secretor, lewis and sialyl antigen levels as predictors for disease
CA2704108A1 (en) * 2007-10-31 2009-05-07 Bayer Bioscience N.V. Method to produce modified plants with altered n-glycosylation pattern
EP2166085A1 (en) 2008-07-16 2010-03-24 Suomen Punainen Risti Veripalvelu Divalent modified cells
PL2944690T3 (pl) 2010-10-11 2018-05-30 Jennewein Biotechnologie Gmbh Nowe fukozylotransferazy i ich zastosowanie
KR101293658B1 (ko) * 2010-12-30 2013-08-07 대한민국 알파-1,3-푸코실트랜스퍼라아제 및/또는 베타-1,2-자일로실트렌스퍼라아제 유전자를 포함하는 벼 형질전환용 벡터 및 형질전환된 벼
ES2439507T3 (es) * 2011-01-20 2014-01-23 Jennewein Biotechnologie Gmbh Fucosiltransferasas novedosas y sus aplicaciones
EP2789686A1 (en) 2013-04-11 2014-10-15 Greenovation Biotech GmbH Expression of phosphorylated glycoproteins in plants
EP3050973A1 (en) * 2015-01-30 2016-08-03 Jennewein Biotechnologie GmbH Fermentation process for producing monosaccharides in free form from nucleotide-activated sugars
CN110317799A (zh) * 2019-07-18 2019-10-11 江南大学 一种人源岩藻糖转移酶8的原核表达方法及其产品
EP3871687A1 (en) 2020-02-27 2021-09-01 eleva GmbH Enzyme replacement therapy for treating pompe disease

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5272066A (en) 1986-03-07 1993-12-21 Massachusetts Institute Of Technology Synthetic method for enhancing glycoprotein stability
SG49117A1 (en) 1993-03-29 1998-05-18 Kyowa Hakko Kogyo Kk Alfa -1, 3-fucosyltransferase
US6509149B2 (en) * 1995-06-06 2003-01-21 Hybridon, Inc. HPV-specific oligonucleotides
US5770420A (en) * 1995-09-08 1998-06-23 The Regents Of The University Of Michigan Methods and products for the synthesis of oligosaccharide structures on glycoproteins, glycolipids, or as free molecules, and for the isolation of cloned genetic sequences that determine these structures
AT408446B (de) * 1999-02-18 2001-11-26 Altmann Friedrich Dr Fucosyltransferase-gen

Also Published As

Publication number Publication date
PT2062977E (pt) 2014-04-07
SK11182001A3 (sk) 2002-01-07
BR0010114A (pt) 2002-06-04
US20080234471A1 (en) 2008-09-25
MXPA01008372A (es) 2003-06-06
AU771995B2 (en) 2004-04-08
CA2362964C (en) 2012-03-27
HUP0200394A3 (en) 2006-06-28
CZ308081B6 (cs) 2019-12-27
US20090199306A1 (en) 2009-08-06
PL363438A1 (pl) 2004-11-15
IS6041A (is) 2001-08-08
EP1151109A1 (de) 2001-11-07
US8198078B2 (en) 2012-06-12
AT408446B (de) 2001-11-26
SK286416B6 (sk) 2008-09-05
ZA200106735B (en) 2002-08-15
CZ299622B6 (cs) 2008-09-24
DE50011116D1 (en) 2005-10-13
KR20010108234A (ko) 2001-12-07
CZ20012943A3 (cs) 2002-04-17
BG105899A (en) 2002-12-29
ATE304053T1 (de) 2005-09-15
IL144777A (en) 2007-12-03
CA2362964A1 (en) 2000-08-24
ATA27099A (de) 2001-04-15
AU2646000A (en) 2000-09-04
JP2011120592A (ja) 2011-06-23
NZ513685A (en) 2001-09-28
PL205710B1 (pl) 2010-05-31
JP5514386B2 (ja) 2014-06-04
HRP20010681A2 (en) 2003-08-31
JP2002536978A (ja) 2002-11-05
EE200100432A (et) 2002-12-16
DK2062977T3 (da) 2014-04-07
TR200102393T2 (tr) 2002-04-22
WO2000049153A1 (de) 2000-08-24
NO20013993L (no) 2001-10-17
ES2246222T3 (es) 2006-02-16
HU230075B1 (hu) 2015-06-29
EP2062977A1 (de) 2009-05-27
CN1360633A (zh) 2002-07-24
NO20013993D0 (no) 2001-08-16
YU58901A (sh) 2004-03-12
ES2444126T3 (es) 2014-02-24
IL144777A0 (en) 2002-06-30
EP1151109B1 (de) 2005-09-07
DK1151109T3 (da) 2006-01-16
BG65140B1 (bg) 2007-03-30
EP1642979A1 (de) 2006-04-05
US20130212740A1 (en) 2013-08-15
HUP0200394A2 (hu) 2002-05-29
US8895806B2 (en) 2014-11-25
EP2062977B1 (de) 2014-01-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US8895806B2 (en) Fucosyl transferase gene
US20070186311A1 (en) BETA 1,2-xylosyltransferase-gene from arabidopsis

Legal Events

Date Code Title Description
RECP Rectifications of patent specification