ES2322140T3 - Secuencias promotoras de la expresion de liquines y sus utilizaciones. - Google Patents
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Abstract
Molécula de ácido nucleico aislada que codifica una región promotora de la expresión de un liquen (MEPR), caracterizada porque la MEPR se selecciona de entre las SEC.ID nº 1 a 27, o de sus fragmentos promotores de la expresión.
Description
Secuencias promotoras de la expresión de
líquenes y sus utilizaciones.
La presente invención se refiere a moléculas
aisladas de ácidos nucleicos que promueven la expresión de
polipéptidos en células huésped eucarióticas genéticamente
modificadas.
A la expresión de sustancias proteinaceas
(proteínas, péptidos, polipéptidos, sus fragmentos, así como formas
modificadas postraduccionalmente de estas moléculas) se hace
referencia a continuación en la presente invención
como"polipéptidos" (que se utilizan de forma sinónima
conjuntamente con "proteína", por ejemplo, en la parte de los
ejemplos) en células modificadas genéticamente como fuente
importante para proporcionar preparaciones de dichas sustancias a
menudo raras y valiosas. Para expresar dichos polipéptidos en
células huésped genéticamente modificadas, es necesaria la
presencia de una región de ADN que controla positivamente
("activa", "promueve") esta expresión. Los promotores
constituyen ejemplos importantes para dichas regiones, que permiten
que las ARN polimerasas se unan al ADN para iniciar la
transcripción al ARNm (Watson et al., "Recombinant DNA"
(1992), capítulo I.1 y 2).
Los líquenes han experimentado una atención
creciente como objetos útiles para la investigación en el desarrollo
y la fisiología vegetal, ya que su sencilla naturaleza (están
situados en la base de la evolución de las plantas superiores)
proporciona conocimientos de la compleja biología de las plantas
superiores. La sencilla morfología de los líquenes y sus
posibilidades de cultivo ventajoso les ha llevado a constituir
organismos modelos populares para estudios de la fisiología vegetal
y de la biología del desarrollo: las especies de líquenes pueden
cultivarse sin dificultad bajo condiciones controladas, utilizando
técnicas in vitro que incluyen el cultivo axénico, no sólo
en discos de Petri, sino también en cultivos líquidos, por ejemplo,
en bioreactores. Los gametofitos haploides pueden desarrollarse
fotoautotróficamente en cultivos estériles y observarse fácilmente a
nivel celular.
Otra ventaja importante de los líquenes es su
capacidad de transformación: a pesar de numerosos estudios, la tasa
de eventos diana de integración en las plantas alcanza difícilmente
10^{-4}, lo que previene la utilización general de enfoques
génicos diana para la genómica funcional vegetal. Contrariamente a
todas las otras plantas que se han ensayado, la integración de
secuencias homólogas de ADN en el genoma de los líquenes
(especialmente los organismos establecidos modelo liquen tales como
Physcomitrella patens (para una revisión de su genética
molecular: Reski, 1999), tiene lugar predominantemente mediante
recombinación homóloga en localizaciones diana. La transformación
de los líquenes se lleva a cabo habitual y fácilmente vía la
absorción de ADN plasmídico mediante protoplastos mediada por PEG,
la transferencia de ADN por bombardeo mediante microproyectiles, la
electroporación y la microinyección (Cove et al., 1997).
Dependiendo del diseño del constructo transformante, tiene lugar
predominantemente la integración dirigida o al azar.
A pesar de la utilización de líquenes como
herramientas científicas para la investigación de la fisiología
vegetal, dicha utilización para producir polipéptidos heterólogos
recombinantes en las células de los líquenes ha estado bastante
limitada, aunque procedimientos eficientes de producción se han
vuelto disponibles (por ejemplo, el cultivo de tejido protonémico
liquénico tal como se describe en el documento EP 1 206 561 A).
Una limitación importante de las tecnologías de
transformación en las células huésped eucarióticas, especialmente
en las células animales o en las células de las plantas superiores,
ha sido siempre la falta de un promotor eficiente para la expresión
constitutiva intensa de genes extraños en dichas células huéspedes
transgénicas. El promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor
(CaMV) se ha utilizado ampliamente con esta finalidad en diversos
sistemas de transformación vegetales (véase por ejemplo WO 01/25456
A), habiendo mostrado este promotor CaMV 35S, sin embargo, una baja
actividad en algunas especies de plantas (especialmente,
monocotiledóneas como el arroz (McElroy et al, (1991)). Para
la transformación de las monocotiledóneas, la región 5' de la
actina 1 del arroz se ha utilizado para la expresión heteróloga de
las proteínas (McElroy et al, 1991). Sin embargo, todavía
existe la necesidad continua de proporcionar nuevos medios de
promoción de la expresión de polipéptidos recombinantes (extraños)
en células huésped eucarióticas genéticamente modificadas.
Para los líquenes, especialmente para
Physcomitrella patens, hasta ahora, no se han publicado
promotores de expresión derivados de núcleos homólogos apropiados
(en este caso, homólogo se define como: derivado del liquen), u
otras secuencias derivadas de otros núcleos, que promuevan la
expresión (Holtdorf et al., 2002). Los investigadores han
utilizado por tanto promotores heterólogos (en este caso, heterólogo
se define como:no derivado del liquen) para la expresión de genes
marcadores de selección y otros genes de interés. Sin embargo, se
ha informado de que sólo algunos de dichos promotores funcionan de
forma fiable en algunos líquenes (por ejemplo, el promotor CaMV
35S; sumarizado en Holtdorf et al., 2002; el promotor CaMV
35S no funciona en algunas otras especies (Zeidler et al.,
1999); el promotor TET (revisado en Reski (1998)). Por tanto, se
han desarrollado otros medios en la técnica para manipular
genéticamente a los líquenes, por ejemplo, los medios para bloqueo
génico y potenciadores del bloqueo génico (Hiwatashi et al.,
2001; sin embargo, utilizando también el promotor CaMV 35S).
Mientras que en la investigación mencionada
anteriormente en los líquenes utilizando la recombinación homóloga,
la utilización de promotores heterólogos es necesaria, (y por lo
tanto, los promotores homólogos no son necesarios, es más, en la
mayoría de los casos no son útiles), todavía existe y no está
resuelta la necesidad de medios para promover la expresión
apropiada, derivada de los líquenes, para la utilización industrial
de éstos con objeto de producir polipéptidos recombinantes, o para
la sobreexpresión de polipéptidos homólogos. Dichos medios
promotores de la expresión permitirán una expresión constitutiva y
estable bajo las condiciones de cultivo que se apliquen, y
permitirán preferentemente una realización expresiva comparable o
incluso mayor como el promotor CaMV 35S.
Por tanto, la presente invención proporciona una
molécula aislada de ácido nucleico que codifica una región
promotora de la expresión de un liquen (MEPR) seleccionada de entre
las SEC ID nº 1 a 27 o de fragmentos suyos que promuevan la
expresión. Con la presente invención, se proporcionan regiones de
expresión derivadas de los líquenes que permiten una expresión
constitutiva en células huésped modificadas genéticamente,
especialmente líquenes, para dirigir, por tanto, los requerimientos
para dichas herramientas que emergieron en la técnica anterior
(Holtdorf et al, 2002; Schaefer et al, 2002). Una
característica esencial de las MEPR según la presente invención es,
también, que la actividad promotora de la expresión de las MEPR es
por lo menos, del 30%, preferentemente de por lo menos el 50%, de
la actividad promotora de la expresión de un promotor actuante
heterólogo en la célula huésped específica (por ejemplo, CaMV 35S
para la expresión de un péptido recombinante en Physcomitrella
patens), porque los promotores del liquen que no poseen dicha
actividad promotora de la expresión, no pueden utilizarse
apropiadamente para resolver los objetivos de la presente
invención, y no se consideran, por tanto, como MERPs.
Según la presente invención, las MEPR que
promueven la expresión que no es esporófito específica, se definen
como MEPR constitutivas, promoviendo preferentemente la expresión en
las células derivadas del gametófito, promoviendo las MEPR más
preferentemente la expresión en las células protonémicas.
Según la presente invención, la expresión
constitutiva se define preferentemente como la expresión de una
proteína que dé lugar a cantidades detectables de ella bajo
condiciones de cultivo líquido que se utilizan generalmente para
los líquenes que se han desarrollado fotoautotróficamente, por
ejemplo cultivos en matraz, cultivos en bioreactor (EP 1 206 561
A), condiciones que se utilizan para el sistema transitorio de
expresión que se describe más adelante. Por tanto, la expresión
constitutiva tiene que proporcionarse para las MERPs según la
presente invención, preferentemente sin la necesidad de aditivos
específicos para el cultivo, preferentemente también sin la
necesidad de azúcares añadidos, fitohormonas o mezclas de dichas
sustancias en el medio de cultivo. La expresión constitutiva tiene
que llevarse a cabo en un modo equilibrado; por tanto, puede ser
transitoria.
El término "liquen" o "líquenes", tal
como se utiliza en la presente memoria, se refiere a todos los
briófitos (hepáticas, hepáticas de agua y líquenes). Característica
para los líquenes es su Generationswechsel heteromórfica, la
alternancia de dos generaciones que son diferentes entre sí en
términos de cantidades del ADN nuclear y morfología. El esporófito
diploide sólo es fotosintéticamente activo en su juventud y
requiere suministro a partir del gametófito haploide verde y
dominante. El gametófito existe en dos formas morfológicamente
distintas: el gametófito juvenil, denominado protonema y el
gametófito adulto, denominado gametofor. Al contrario que en el
protonema, el gametófito adulto (gametofor) transporta los órganos
sexuales.
En el contexto de la presente invención, la
expresión transitoria se define como la introducción de un
constructo basado en un ácido nucleico episómico (por ejemplo, las
MEPR y gen de interés), tal como se describe a continuación, en un
protoplasto liquénico y causando o permitiendo la expresión
transitoria a partir del vector, que da lugar preferentemente, a su
vez, a la secreción de la proteína extracelular al medio. Los
protoplastos se derivan de las células liquénicas, preferentemente,
de las células gametofíticas, más preferentemente de las células
protonémicas.
Las MEPR según la presente invención se
seleccionan de entre las SEC ID nº 1 a 27, o de los fragmentos suyos
que promueven la expresión. Un "fragmento que promueve la
expresión" es un fragmento de una MEPR que posee una actividad
promotora de la expresión de las MEPR de por lo menos el 30%,
preferentemente por lo menos del 50%, de la actividad promotora de
la expresión de un promotor heterólogo actuante en la célula huésped
específica (por ejemplo, CaMV 35S para la expresión de un
polipéptido recombinante en Physcomitrela patens).
Las MEPR según la presente invención pueden
comprender regiones específicas, tales como una región promotora
("promotor"), regiones no traducidas del extremo 5'
("5'-UTR"), intrones del extremo 5' o UTR del
extremo 3'. Para algunas MEPR, existen fragmentos promotores de la
expresión que sólo contienen el intrón del extremo 5'.
Habitualmente, el promotor es siempre activo solo como un fragmento
que promueve la expresión. Por tanto, la MEPR según la presente
invención comprende preferentemente un promotor liquénico y
preferentemente una región UTR del extremo 5' y/o un intrón del
extremo 5' y/o un UTR del extremo 3'.
Aunque es a menudo suficiente, si se alcanza una
cierta expresión constitutiva, se prefiere en muchos casos obtener
una alta tasa de expresión, especialmente para producir
industrialmente polipéptidos recombinantes. Se ha demostrado que la
mayoría de las MEPR, según la presente invención, permiten tasas de
expresión significativamente más altas que el promotor CaMV 35S,
para un polipéptido recombinante dado, especialmente en sistemas
homólogos (por ejemplo, una MEPR Physcomitrella para la
expresión de un polipéptido en Physcomitrella). Por tanto,
las MEPR preferidas según la presente invención presentan una
actividad promotora de la expresión que es, como mínimo, igual que
la actividad promotora de la expresión del promotor CaMV 35S del
virus del mosaico de la coliflor, especialmente, pero que no se
limita a las especies liquénicas a partir de las cuales se aisló la
MEPR. Incluso, las MEPR más preferidas presentan una actividad
promotora de la expresión que son, por lo menos, el 200%, siendo
preferentemente por lo menos el 500%, siendo especialmente por lo
menos, el 1000%, de la actividad promotora de la expresión del
promotor del virus del mosaico de la coliflor (CaMV) 35S,
especialmente, pero que no se limita a las especies liquénicas a
partir de las cuales se aisló la MEPR.
Las moléculas aisladas de ácido nucleico según
la presente invención se utilizan preferentemente para transformar
una célula huésped específica para producir un polipéptido
recombinante transgénico, preferentemente a una escala industrial,
pero no limitado a ella. Por tanto, la molécula de ácido nucleico se
proporciona como un vector apropiado que permite la transformación
y la expresión del transgén en la célula huésped. Entre la
posibilidad de que una MEPR según la presente invención se utilice
para reemplazar un promotor natural en los líquenes, [llevando a
cabo, por lo tanto, la expresión de un polipéptido homólogo
liquénico bajo el control de una MEPR localizada posicionalmente en
el genoma del liquen, el cual no está normalmente presente en las
cepas de tipo salvaje], está la aplicabilidad industrial prevalente
de las MEPR, que consiste en el control de la expresión de un gen
heterólogo ("extraño") en una célula huésped productora,
especialmente en una célula liquénica. Por tanto, la molécula de
ácido nucleico según la presente invención, comprende además una
región codificante para un producto polipeptídico recombinante,
estando dicha región codificante bajo el control de la MEPR.
Asimismo, es ventajoso si las moléculas de ácido
nucleico aisladas según la presente invención comprenden además un
marcador de selección y/o otras regiones necesarias para permitir el
procedimiento apropiado de transformación seleccionado (véase, por
ejemplo, Cove et al., 1997; Schaefer, 2002). Por ejemplo, si
se prefiere la integración dirigida, la molécula de ácido nucleico
según la presente invención comprenderá asimismo unas secuencias
que son homólogas a las secuencias genómicas de las especies que van
a ser transformadas. Permitiendo, de este modo, la integración
dirigida de la molécula aislada del ácido nucleico mediante la
recombinación homóloga en el genoma de las especies que van a ser
transformadas.
Además, las moléculas aisladas del ácido
nucleico según la presente invención pueden utilizarse para rastrear
y definir secuencias de consenso para las regiones promotoras de la
expresión. El hallazgo y rastreo de dichas secuencias de consenso
(regiones, encuadres (en las figuras), que son importantes y/o
esenciales para la actividad promotora de la expresión, constituyen
una valiosa ventaja en la tecnología del ADN recombinante, con
respecto especialmente a la biotecnología industrial que utiliza
los líquenes.
Según otro aspecto, la presente invención se
refiere asimismo a un procedimiento para la expresión de un producto
polipéptido recombinante en una célula huésped eucariótica, que
comprende:
- -
- proporcionar un vehículo de clonación del ADN recombinante que comprende una molécula de ácido nucleico aislada que codifica una MEPR según la presente invención, y, opcionalmente una región codificante para dicho producto polipéptido recombinante, estando dicha secuencia codificante bajo el control de la MEPR de dicha molécula de ácido nucleico en dicho huésped,
- -
- transformar dicha célula huésped eucariótica que no aloja de forma natural dicha secuencia codificante, de manera que esté bajo el control de dicha MEPR,
- -
- cultivar la célula huésped eucariótica transformada en un medio de cultivo apropiado,
- -
- permitir la expresión de dicho polipéptido recombinante,y
- -
- aislar el polipéptido recombinante expresado
Tal como se ha mencionado anteriormente, las
MEPR según la presente invención, tienen la capacidad, en principio,
de obtener la expresión constitutiva en diversos tipos celulares,
seleccionándose preferentemente la célula huésped eucariótica de
entre unas células vegetales, preferentemente de células liquénicas,
especialmente de células de Physcomitrella patens.
Un sistema que se prefiere específicamente para
la presente invención, es el cultivo protonémico liquénicos
(tejidos protonémicos liquénicos). Para llevarlo a cabo, el
procedimiento que se describe en el documento EP 1 206 561 A y sus
formas de realización preferidas, se incorporan explícitamente como
referencia en la presente memoria, y son aplicables inmediatamente
a la presente invención.
La expresión constitutiva del polipéptido con
los medios según la presente invención, es posible sin necesidad de
aditivos diversos en el medio de cultivo, específicamente sin
aditivos para la diferenciación específica o la promoción del
desarrollo de distintos tejidos. Por tanto, además de electrólitos,
agentes selectivos y estabilizadores del medio, el medio de cultivo
no contiene preferentemente ningún otro aditivo para el suministro
celular. El medio de cultivo para las plantas transformadas
establemente está preferentemente libre de azúcares añadidos,
fitohormonas o sus mezclas. El medio de cultivo para los
protoplastos transformados transitoriamente está preferentemente
libre de fitohormonas añadidas.
Las células liquénicas preferidas son células
liquénicas de los grupos Physcomitrella, Funaria,
Sphagnum, Ceratodon, Marchantia y Sphaerocarpos,
especialmente en cultivos protonémicos.
Según otro aspecto, la presente invención
proporciona también la utilización de una molécula aislada de ácido
nucleico que codifica una MEPR según la presente invención, para la
producción industrial de un polipéptido, especialmente para
proporcionar células recombinantes que produzcan dicho polipéptido.
La producción industrial permite una preparación a gran escala, en
bioreactores, de un polipéptido dado de interés, por ejemplo, en
cantidades de gramos o incluso más altas (rendimientos comerciales).
Esto es al contrario que la producción suficiente para la
utilización en investigación (cantidades en mg) o con finalidades
analíticas (cantidades en \mug), que puede llevarse también a
cabo, por supuesto, mediante la presente invención. En los sistemas
de expresión transitorios, las cantidades de proteínas que son
suficientes para dicha finalidad analítica, pueden obtenerse
fácilmente con estas moléculas de ADN.
De acuerdo con esto, la presente invención
abarca también la utilización de una molécula de ácido nucleico
aislada, que codifica una MEPR según la presente invención, para la
expresión de un polipéptido liquénico, no estando controlada de
forma natural por dicha MEPR la expresión de dicho polipéptido
liquénico, especialmente para proporcionar células recombinantes
liquénicas que expresen dicho polipéptido. Esta utilización puede
reducirse a practicar ambos, las finalidades de investigación y la
producción a escala industrial de los polipéptidos liquénicos.
Según otro aspecto, la presente invención
proporciona también la utilización de una molécula de ácido nucleico
aislada que codifica una MEPR según la presente invención para la
expresión de proteínas implicadas en modificaciones
postraduccionales específicas (por ejemplo, glicosiltransferasas),
especialmente para proporcionar células liquénicas recombinantes
que expresen polipéptidos con modificaciones postraduccionales que
no existen normalmente o existen normalmente en otra proporción en
las células liquénicas no transformadas.
Según otro aspecto, la presente invención
proporciona asimismo la utilización de una molécula de ácido
nucleico aislada que codifica una MEPR según la presente invención,
para la expresión de proteínas implicadas en vías metabólicas,
especialmente para proporcionar células liquénicas recombinantes
alteradas en su contenido de metabolitos, por ejemplo, metabolitos
secundarios.
Según otro aspecto, la presente invención
proporciona asimismo la utilización de una molécula de ácido
nucleico aislada que codifica una MEPR según la presente invención,
para la expresión de moléculas antisentido, moléculas siARN o
ribozimas, para proporcionar especialmente células liquénicas
recombinantes con cantidades reducidas de proteínas específicas que
den lugar a fenotipos alterados, por ejemplo, morfológica, o
bioquímicamente.
Según otro aspecto preferido, la presente
invención se refiere asimismo a la utilización de una molécula de
ácido nucleico aislada que codifica una MEPR según la presente
invención, para la expresión recombinante de proteínas que se
modifiquen postraduccionalmente, especialmente para la producción de
proteínas modificadas postraduccionalmente. Con dicha tecnología,
es posible producir proteínas que están modificadas de manera
postraduccional y de forma específica (de modo distinto que en la
célula huésped original, permitiendo de este modo, por ejemplo, que
las células vegetales o los cultivos liquénicos produzcan proteínas
con patrones de glicosilación de mamíferos o incluso, humanos).
Ejemplos en los que dichas tecnologías se aplican con
glicosiltransferasas específicas se describen, por ejemplo, en WO
00/49153 y WO 01/64901 A.
Otra utilización preferida de la molécula de
ácido nucleico aislada que codifica una MEPR según la presente
invención, se refiere a la expresión in vitro de proteínas
recombinantes. Esta técnica de traducción in vitro permite
una producción más controlada del producto recombinante, sin la
necesidad de aceptar las incertidumbres que se relacionan con las
células huésped.
Otra utilización preferida de la molécula de
ácido nucleico según la presente invención, es su utilización para
la expresión recombinante de proteínas modificantes del metabolismo,
por ejemplo, proteínas que modifican, (a su vez) la modificación
(postraduccional) de una cadena aminoácida traducida (véase, por
ejemplo, Berlin et al, 1994).
La presente invención se ilustra a continuación
mediante los siguientes ejemplos y figuras, aunque sin limitarse a
los mismos, en los que:
la Fig 1 muestra genes de la
\beta-tubulina en Physcomitrella
patens.
la Fig 2 muestra un análisis de las regiones
promotoras de las \beta-tubulinas en
Physcomitrella patens.
la Fig 3 muestra un análisis de las regiones
promotoras de la expresión de Pptub 1 mediante la transformación
transitoria de los constructos rhVEGF.
la Fig 4 muestra un análisis de las regiones
promotoras de la expresión de Pptub 2 mediante la transformación
transitoria de los constructos rhVEGF.
la Fig 5 muestra un análisis de las regiones
promotoras de la expresión de Pptub 3 mediante la transformación
transitoria de los constructos rhVEGF.
la Fig 6 muestra un análisis de las regiones
promotoras de la expresión de Pptub 4 mediante la transformación
transitoria de los constructos rhVEGF.
la Fig 7 muestra una estructura genómica de los
genes de la actina de Physcomitrella patens
la Fig 8 muestra una comparación de la actividad
de la expresión de las distintas regiones de la actina del extremo
5',
la Fig 9 muestra unos constructos Ppact1
la Fig 10 muestra unos constructos Ppact 5
la Fig 11 muestra unos constructos Ppact 7
la Fig 12 muestra unos constructos Pp
act3:vegf
la Fig 13 muestra un promotor
Ppact1:sustituciones del intrón en el extremo 5'
la Fig 14 muestra un promotor Ppact1:constructos
de deleción vegf
la Fig 15 muestra un promotor Ppact3:constructos
de deleción vegf
la Fig 16 muestra un promotor Ppact5:constructos
de deleción vegf
la Fig 17 muestra un promotor Ppact7:constructos
de deleción vegf
la Fig 18 muestra genes de la actina en diversas
especies de líquenes, y
la Fig 19 muestra una comparación de secuencias
promotoras de genes homólogos de la actina de Physcomitrella
patens y Funaria hygrometrica.
Physcomitrella patens (Hedw.) B.S.G. se
ha caracterizado previamente (Reski et al. 1994). Es un
subcultivo de la cepa 16/14 que fue recuperado por H.L.K.
Whitehouse en Gransden Wood, Huntingdonshire, Reino Unido, y fue
propagada por Engel (1968; Am J Bot 55,438-446).
Las plantas se desarrollaron axénicamente bajo
condiciones estériles en medio Knop plano modificado de líquido
inorgánico (1000 mg/1 Ca (NO_{3})_{2} x 4 H_{2}O, 250
mg/l KCl, 250 mg/l KH_{2}PO_{4}, 250 mg/l MgSO_{4} x 7
H_{2}O y 12,5 mg/l FeSO_{4} x 7 H_{2}O; pH 5,8 (Reski y Abel
(1985) Planta 165, 354-358). Las plantas se
desarrollaron en matraces Erlenmeyer de 500 ml que contenían 200 ml
de medio de cultivo o en discos de Petri de 9 cm con medio de Knop
solidificado (10 g/l agar). Los matraces se agitaron en un equipo
que contenía un agitador Certomat R (B. Braun Biotech International,
Alemania) a 120 rpm. Las condiciones en la cámara de crecimiento
fueron de 25 +/- 3ºC y un régimen luz-oscuridad de
16:8 horas. Los cultivos fueron iluminados por arriba mediante dos
tubos fluorescentes (Osram L 58 W/25) que proporcionaban 35
micromol/m^{-2}s^{-1}. El subcultivo de los cultivos líquidos
se llevó a cabo una vez a la semana mediante desintegración
utilizando un homogeneizador Ultra-Turrax (IKA,
Staufen, Alemania) y la inoculación de dos nuevos matraces
Erlenmeyer de 500 ml, que contenían 100 ml de medio Knop recién
preparado. Además,
los cultivos se filtraron 3 o 4 días después de la desintegración y se transfirieron a medio Knop recién preparado.
los cultivos se filtraron 3 o 4 días después de la desintegración y se transfirieron a medio Knop recién preparado.
Los cultivos de los bioreactores se
desarrollaron en medio Knop o en medio Knop 1/10, respectivamente,
en tanques bioreactores de vidrio que estaban sometidos a agitación
(Aplikon, Schiedam, Holanda), con un volumen de trabajo de 5 litros
(tal como se describe en Hohe y Reski, Plant Sci. 2002, 163
69-74). La agitación se llevó a cabo mediante una
operación propulsora marina con una velocidad de 500 rpm, aireándose
los cultivos con 0,3 vvm [(volumen de aireación)/(volumen del
medio)/minuto] de aire. La temperatura del cultivo de 25ºC en el
recipiente se controló mediante un sistema de enfriamiento de doble
camisa. La intensidad de la luz fue de 50 micromol/m^{-2}s^{-1}
provisto por tubos de fluorescencia (Osram L 8W/25) con un ritmo
luz-oscuridad de 16/8 horas. El valor del pH en los
cultivos (pH 6,5-7,0) no se ajustó.
Se han descrito diversos distintos protocolos
para el aislamiento de protoplastos (Grimsley et al. 1977;
Schaefer et al. 1991; Rother et al.1994; Zeidler et
al, 1999; Hohe y Reski 2002; Schaefer 2001) para
Physcomitrella patens. Para el trabajo que se presenta en
esta memoria, se utilizó una modificación/combinación de los
procedimientos anteriormente descritos:
El tejido liquénico se cultivó durante 7 días en
medio de Knop con un contenido reducido (10%) en Ca
(NO_{3})_{2}. Los cultivos se filtraron entre 3 y 4 días
después de la desintegración y se transfirieron a medio Knop recién
preparado con un contenido reducido (10%) en Ca
(NO_{3})_{2}. Después de filtración, los tejidos
protonémicos liquénicos se preincubaron en 0,5 M manitol, Después
de 30 minutos, se añadió a la suspensión Driselase al 4% (Sigma,
Deisenhofen, Alemania). Driselase se disolvió en 0,5M de manitol (pH
5,6-5,8), se centrifugó a 3600 rpm durante 10
minutos y se esterilizó haciéndola pasar a través de un filtro de
0,22 \mum Millex GP, Millipore Corporation, USA). La suspensión,
conteniendo Driselase al 1% (concentración final), se incubó en la
oscuridad en RT y se agitó suavemente (después de 2 horas de
incubación, se obtuvieron los mejores rendimientos de
protoplastos). La suspensión se hizo pasar a través de filtros
(Wilson, CLF, Alemania) con tamaños de poro de 100 y 50
micrómetros. La suspensión se centrifugó en tubos estériles de
centrífuga y los protoplastos se sedimentaron en RT durante 10
minutos a 55 g (aceleración de 3; descenso lento a 3; Multífuga 3
S-R, Kendro, Alemania). Los protoplastos se
volvieron a suspender suavemente en medio W5 (125 mM CaCl_{2} x 2
H_{2}O; 137 mM NaCl; 5,5 mM glucosa; 10 mM KCl; pH 5,6;
660-680 mOsm; filtrado estéril; Menczel et
al, 1981). Se centrifugó otra vez la suspensión en RT durante
10 minutos a 55 g (aceleración de 3; descenso lento a 3; Multífuga
3 S-R, Kendro, Alemania). Los protoplastos se
volvieron a suspender suavemente en medio W5. Para llevar a cabo el
contaje de los protoplastos se transfirió un pequeño volumen de la
solución a una cámara Fuchs-Rosenthal.
Para Physcomitrella patens se han
descrito diversos protocolos para la transformación (Schaefer et
al. 1991; Reutter y Reski 1996, Schaefer 2001). Para el trabajo
que se presenta en esta memoria, se utilizó una
modificación/combinación de los procedimientos anteriormente
descritos:
Para la transformación, los protoplastos se
incubaron sobre hielo en la oscuridad durante 30 minutos. A
continuación, se sedimentaron los protoplastos mediante
centrifugación en RT durante 10 minutos a 55 g (aceleración de 3;
descenso lento a 3; Multífuga 3 S-R, Kendro,
Alemania). Los protoplastos se volvieron a suspender suavemente en
medio 3M (15 mM CaCl_{2} x 2 H_{2}O; 0,1% MES; 0,48 M manitol;
pH 5,6; 540 mOsm; filtrado estéril; Schaefer et al, 1991,
Mol. Gen. Genet. 226, 418-424) a una concentración
de 1,2 x 106 protoplastos/ml. 250 microlitros de esta suspensión
protoplástica se suministraron a un nuevo tubo estéril de
centrífuga, 50 microlitros de solución de ADN (ADN purificado en
columna en H_{2}O (Qiagen, Hilden, Alemania); se añadieron
10-100 microlitros de una cantidad óptima de ADN de
60 microgramos, y finalmente, 250 microlitros de solución PEG
(PEG-4000 al 40%; 0,4 M manitol; 0,1 M Ca
(NO_{3})_{2}; pH de 6 después de utilizar el autoclave).
La suspensión se mezcló inmediata pero suavemente, y se incubó
entonces durante 6 minutos en RT con un mezclado suave ocasional.
La suspensión se diluyó progresivamente añadiendo 1, 2, 3 y 4 ml de
medio 3M. La suspensión se centrifugó a 20ºC durante 10 minutos a
55 g (aceleración de 3; descenso lento a 3; Multífuga 3
S-R, Kendro, Alemania). El sedimento se volvió a
suspender en 400 microlitros de medio 3M. El cultivo de los
protoplastos transformados se llevó a cabo en placas de 48 pocillos
(Cellstar, Greiner Bio-One, Frickenhausen,
Alemania).
Las transformaciones transitorias se incubaron
en luz oscurecida (4,6
micromoles-1m-2) a 25ºC. Las
muestras se tomaron después de 24 h y 48 h, respectivamente,
reemplazando cuidadosamente la mitad del medio (200 microlitros)
por medio recién preparado. El medio no se reemplazó completamente,
ya que los protoplastos tienen que mantenerse en medio líquido. El
medio eliminado (incluyendo las proteínas recombinantes) se guardó a
-20ºC. Las muestras de 48 horas se midieron en un ELISA.
Se han descrito diversos distintos protocolos
para la transformación (Schaefer et al. 1991; Reutter y
Reski 1996, Protocolo Schaefer 2001) para Physcomitrella
patens. Para el trabajo que se presenta en esta memoria, se
utilizó una modificación/combinación de los procedimientos
anteriormente descritos:
Para la transformación, los protoplastos se
incubaron sobre hielo en la oscuridad durante 30 minutos. A
continuación, se sedimentaron los protoplastos mediante
centrifugación en RT durante 10 minutos a 55 g (aceleración de 3;
descenso lento a 3; Multífuga 3 S-R, Kendro). Los
protoplastos se volvieron a suspender en medio 3M (15 mM CaCl_{2}
x 2 H_{2}O; 0,1% MES; 0,48 M manitol; pH 5,6; 540 mOsm; filtrado
estéril; Schaefer et al, 1991, Mol. Gen. Genet. 226,
418-424) a una concentración de 1,2 x 10^{6}
protoplastos/ml. 250 microlitros de esta suspensión protoplástica
se suministraron a un nuevo tubo estéril de centrífuga, 50
microlitros de solución de ADN (ADN purificado en columna en
H_{2}O (Qiagen, Hilden, Alemania); se añadieron
10-100 microlitros de una cantidad óptima de ADN de
60 microgramos, y finalmente, 250 microlitros de solución PEG
(PEG-4000 al 40%; 0,4 M manitol; 0,1 M Ca
(NO_{3})_{2}; pH de 6 después de utilizar el autoclave).
La suspensión se mezcló inmediata pero suavemente, y se incubó
entonces durante 6 minutos en RT con un mezclado suave ocasional.
La suspensión se diluyó progresivamente añadiendo 1, 2, 3 y 4 ml de
medio 3M. La suspensión se centrifugó a 20ºC durante 10 minutos a
55 g (aceleración de 3; ralentización a 3; Multífuga 3
S-R, Kendro). El sedimento se volvió a suspender en
3 ml de medio de regeneración. El procedimiento de selección se
llevó a cabo tal como se describe por Strepp et al
(1998).
EL VEGF121 recombinante que se expresa mediante
los protoplastos liquénicos transformados transitoriamente, se
cuantificó mediante ELISA (R&D Systems, Wiesbaden, Alemania). El
ELISA se llevó a cabo según las instrucciones del fabricante. Para
la cuantificación, se diluyeron las muestras.
Para todos los experimentos de clonación y
propagación, se utilizó la cepa Top10 de Escherichia coli
(Invitrogen, Karlsruhe, Alemania). Para la clonación de los
fragmentos de ADN, se utilizaron como vectores
pCR2,1-TOPO (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania),
pCR4-TOPO (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania),
pZErO-2 (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania), o pRT101
(Töpfet et al. (1987), NAR, 15, p5890).
Se aisló ADN genómico de Physcomitrella
patens del tejido protonémico con una edad de13 días, siguiendo
el protocolo CTAB (Schlink y Reski, 2002).
El ADN genómico (3-5
microgramos) se sometió a digestión con 30 unidades de diversas
endonucleasas de restricción (por ejemplo, BamHI, EcoRI, HindIII,
KpnI, NcoI, NdeI, PaeI, PagI, XbaI; todos MBI Fermentas, St.
Leon-Rot, Alemania) en un volumen total de 30
microlitros durante 2 horas a 37ºC, utilizando una endonucleasa por
digestión. El ADN digerido se sometió a purificación utilizando
columnas PCR de purificación (Qiagen, Hilden, Alemania), siguiendo
el manual del suministrador (30 microlitros del digesto + 200
microlitros de tampón PB). La elución se llevó a cabo en 50
microlitros de Tampón de Elución (EB; Qiagen, Hilden, Alemania).
Antes de otro tratamiento, se analizaron, sobre un gel de agarosa
(0,5%) 10 microlitros del eluado.
El ADN restante se volvió a unir con 5 unidades
de T4 Ligasa MBI Fermentas. St.Leon-Rot, Alemania)
en un volumen total de 300 microlitros durante 2 horas en RT, y
durante 2 días más a 4ºC. La adición anterior de las mezclas
enzimáticas de unión se llevó a cabo durante cinco minutos a 50ºC y
a continuación en hielo, para disolver los bases de pares con
extremos pegajosos. Después de precipitación etanólica con 0,3 M de
acetato sódico (pH 4,8) y dos lavados con etanol al 70%, el ADN
vuelto a unir se volvió a suspender en 200 microlitros de EB. De
uno a tres microlitros de este ADN genómico vuelto a unir, se
utilizaron para I-PCR.
Se preparó el ARN total de Physcomitrella
patens mediante tejido pulverizado bajo nitrógeno líquido y
mediante la utilización del Equipo E.Z.N.A de ARN vegetal (PeqLab) o
del Equipo vegetal RNeasy Mini (Qiagen, Hilden, Alemania) siguiendo
los manuales de los proveedores. Se analizaron en gel los ARNs
totales, se cuantificaron (OD260) y se guardaron a -20ºC o -80ºC,
respectivamente.
1 microgramo de los ARNs totales se sometió a
digestión mediante ADNasa (GIBCO BRL) en un volumen total de 11
microlitros, siguiendo el manual de los proveedores. 4,5 microlitros
de este ARN total tratado con ADNasa (-400 ng) se utilizaron con
iniciadores oligo dT (12-18) y Transcriptasa Inversa
SUPERSCRIPT II RNasa H (GIBCO BRL) para preparar la primera hebra
del ADNc, siguiendo el manual de los proveedores. El ADNc resultante
se diluyó 10 veces con ddH_{2}O estéril y se guardó a -20ºC.
Si no se indica en particular, las PCR se
llevaron a cabo con la mezcla Advantaje ADNc Polimerasa (BD
Biosciences Clontech, Heidelberg, Alemania). Para todas los demás
sistemas PCR, se utilizaron las siguientes ADN polimerasas:
Polimerasa recombinante Taq (MBI Fermentas, St.
Leon-Rot, Alemania), Polimerasa original Pfu (MBI
Fermentas, St. Leon-Rot, Alemania), ADN Polimerasa
Platino Pfx (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania), o Sistema PCR
TripleMAster (Eppendorf, Hamburgo, Alemania).
Termo-cicladores con licencia fueron
Mastercicladores de gradiente (Eppendorf, Hamburgo, Alemania).
Todos los iniciadores fueron sintetizados por MWG Biotech AG,
Ebersberg, Alemania. Para la purificación del producto PCR o la
elución del gel, se utilizaron GFX PCR DNA y el Equipo de
Purificación de Bandas de Gel (Amersham Bioscience, Freiburg,
Alemania), siguiendo el manual de proveedores.
Los protocolos de biología molecular
convencional fueron esencialmente como los descritos por Sambrook
et al. (1989), Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 2ª
edición, Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory
Press.
I-PCR se llevó a cabo con 0,25
microlitros de la mezcla Advantaje ADNc Polimerasa y tampón
(incluyendo 3,5 mM Mg (OAc)_{2}), ambos BD Biosciences
Clontech, Heidelberg, Alemania), 0,2 mM de cada iniciador, 0,2 mM
dNTPs y de uno a tres microlitros de las re-uniones
genómicas (véase anteriormente) en un volumen total de 25
microlitros. Las condiciones de ciclación fueron: una etapa inicial
de 2 minutos a 96ºC, entonces 20 segundos a 96ºC, 10 segundos a
67ºC inicialmente, (retoque descendente: -0,15ºC/ciclo) y 10 minutos
a 68ºC como una segunda etapa, con 35 a 40 repeticiones, seguido
por una etapa terminal de 20 minutos a 68ºC y enfriando a 4ºC al
final del programa. Los productos PCR se eluyeron a partir de geles
de agarosa. La elución se llevó a cabo en 30 microlitros. Los
productos PCR eluídos se clonaron directamente en los vectores TOPO
TA (pCR4-TOPO, Invitrogen, Karlsruhe, Alemania), o
se utilizaron como una matriz para la reconfirmación en los PCR con
cebadores internos. En el último caso, los geles eluídos, y los
productos PCR con cebadores internos se clonaron en vectores TOPO
TA (pCR4-TOPO, Invitrogen, Karlsruhe, Alemania). Las
condiciones de ciclación para los PCR con cebadores internos
fueron:una etapa inicial de 1 minuto a 96ºC, entonces 20 segundos a
94ºC, 10 segundos a 56ºC y 4 minutos a 68ºC como una segunda etapa,
con 25 repeticiones, seguido por una etapa terminal de 10 minutos a
68ºC.
pRT101p21 (Gorr 1999) se volvió a amplificar con
la polimerasa original Pfu (MBI Fermentas,
St.Leon-Rot, Alemania) utilizando el iniciador 320
y 321 (para este y todos los demás iniciadores subsiguientes, véase
la Tabla 1). El iniciador 320 empieza (hacia adelante) en el codon
2º (5'- (atg)aac...) del péptido señal VEGF. El iniciador
321 (inverso) empieza en la mitad del sitio HincII en el interior
del sitio múltiple de clonación enfrente del promotor 35S
(5'-gac..). Con el iniciador 321, se introdujo un
sitio XhoI adicional. La re-unión del producto PCR
dio lugar a una pérdida del promotor 35S y a la reconstitución de un
sitio HincII. La secuencia del gen VEGF se comprobó mediante
secuenciación. Este nuevo vector se denominó nuevopRT101 y se
utilizó para la clonación de regiones de promoción de la expresión
mediante el sitio XhoI o HincII, respectivamente, enfrente del gen
informador.
Todas las reacciones de secuenciación se
llevaron a cabo por los Laboratorios SECLAB de Secuenciación,
Göttingen, Alemania.
Sci Ed Central, Clone Manager Suite se
utilizaron para el diseño de los iniciadores, los pares de bases y
las alineaciones de múltiples secuencias. Lasergene, DNASTAR
(versión 5), Megalign y SeqMan se utilizaron para el análisis de
los datos de la secuenciación. Las búsquedas de homología se
llevaron a cabo mediante BLAST 2 (Altschul et al.,
1997).
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención se ilustra mediante cuatro
ejemplos para las regiones promotoras de la expresión liquénica: en
primer lugar, el aislamiento y análisis de diversos miembros de una
familia de regiones promotoras de la expresión de la tubulina de
Physcomitrella patens. En el segundo ejemplo, se proporcionan
regiones promotoras de la expresión de distintos líquenes para la
familia génica de la actina. El tercer y cuarto ejemplos tratan de
las regiones promotoras de la expresión de la ubiquitina y de las
regiones promotoras de la expresión de RBCS.
Para obtener secuencias promotoras/seguladoras
de la \beta-tubulina (tub) de Physcomitrella
patens, en una primera etapa se aislaron secuencias
codificantes de homólogos de la \beta-tubulina
mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Entonces,
una alineación de la totalidad de las 9 secuencias genómicas
publicadas de la \beta-tubulina de Arabidopsis
thaliana (Attub 1-9) se utilizó para diseñar
iniciadores en el interior de las secuencias codificantes muy
conservadas (8F, 9F y 10R; para éste y todos los demás iniciadores
subsiguientes, véase la Tabla 1). Además, se utilizó la información
secuencial de los datos públicos EST de Physcomitrella
patens, pero sólo tres mostraron homologías con las
\beta-tubulinas. Una de estas se utilizó para
diseñar un iniciador génico específico (F7) (situado) por encima de
la región de codificación prevista. La comparación secuencial de
todos los productos PCR clonados, generados con los iniciadores
mencionados y los datos EST, condujeron a 3 grupos de clones con un
ADN idéntico en su interior, pero con diferencias entre los grupos,
debido principal pero no exclusivamente, a las diferencias en el
interior de los intrones. Estos ortólogos de la
\beta-tubulina se denominaron Pptub 1, Pptub 2 y
Pptub 3, respectivamente.
Además, ya que durante el proyecto de
procesamiento, hubo más datos EST disponibles, (más de 50.000 nuevas
entradas en NCBI/dbEST empezando en el año 2002), un ensayo
detallado de la totalidad de los 121 EST de Physcomitrella
patens que presentaban una gran similitud con la
\beta-tubulina, condujo a tres nuevos grupos
adicionales EST (situados) por encima, y a tres grupos (situados)
por debajo, siendo idénticos dentro de un grupo, pero ni idénticos
a cualquier otro grupo ni a Pptub 1-3. Los PCR con
iniciadores derivados de regiones previstas no codificantes
(situados) por encima y por debajo (véase a continuación) de cada
nuevo grupo, y la permutación de todas las combinaciones de
iniciadores, ayudó a correlacionar los grupos correspondientes
(situados) por encima y por debajo de un locus particular,
denominado Pptub 4, Pptub 5 y Ppetub 6, respectivamente. Ambas
amplificaciones de los tres nuevos loci, tanto las genómicas como
las del ADNc, se clonaron y secuenciaron, elevando el número de
ortólogos de \beta-tubulina a 6 en
Physcomitrella patenss.
Pptub 1 a 4 (al revés que Pptub 5 y 6), están
representados mucho más frecuentemente en las bases de datos EST.
Se obtuvieron las bibliotecas ADNc correspondientes utilizando ARN
principalmente del protonema y de los gametóforos jóvenes. Por
tanto, sólo para estos cuatro genes, basados en los datos
secuenciales obtenidos, se llevó a cabo una aproximación mediante
un PCR inverso (I-PCR), para recorrer las regiones
genómicas franqueantes.
\vskip1.000000\baselineskip
Como ya se ha mencionado en una primera etapa,
fragmentos Taq PCR (MBI Fermentas, St. Leon-Rot,
Alemania) de dos PCR independientes se clonaron sobre ADN genómico
de Physcomitrella patens, utilizando los iniciadores 8F y
10R. Un clon (2-1) y dos clones
(8-1, 8-2), respectivamente, de cada
PCR, se secuenciaron parcialmente y se vaciaron para que fueran
idénticos. El locus correspondiente se denominó Pptub 1.
Esta información secuencial preliminar se
utilizó para diseñar iniciadores, para llevar a cabo un recorrido
genómico en las regiones franqueantes de Pptub 1, utilizando un
enfoque I-PCR sobre los digestos genómicos EcoR I y
Hind III re-unidos (iniciadores 35, 36). La
reconfirmación de los productos se realizó mediante PCR con
cebadores internos (iniciadores 40,38). Dos clones generados
mediante productos PCR con cebadores internos (E#1 y H 1.7) se
secuenciaron completamente.
El clon H 1.7 Hind III no aloja un sitio HindIII
interno, debido probablemente en su mayor parte a la actividad
inicial de la enzima o a la unión de una ruptura de ds al azar. Sin
embargo, las secuencias (situadas) por encima del primer sitio EcoR
T fueron confirmadas mediante dos PCR independientes sobre el ADN
genómico (iniciadores 113, 67 y 113, 90). Además, se clonó un
producto PCR adicional ADNc (89,91; Pfu original (Fermentas MBI,St.
Leon-Rot, Alemania).
Todos los clones mencionados fueron de ayuda
para generar y reconfirmar datos secuenciales. En total, se ganaron
aproximadamente 1500 pares de bases (situadas) por encima del codon
de inicio y aproximadamente 1500 pares de bases (situadas) por
debajo del codon de detención.
\vskip1.000000\baselineskip
Como ya se ha descrito anteriormente, la
información secuencial de los EST publicados de Physcomitrella
patens, se utilizó para diseñar un iniciador génico específico
(F7), (situado) por encima de la región codificante prevista. El
PCR sobre el ADN genómico de Physcomitrella patens
(iniciadores F7, 1OR) y la clonación subsiguiente y la
secuenciación del producto PCR, probó que, juntamente con la
totalidad de los tres PptubEST (Pptub EST 1-3) ya
publicados, pertenece a un locus, denominado Pptub 2. Las posiciones
del intrón podrían comprobarse comparando EST con las secuencias
genómicas. Esta información de la secuencia preliminar se utilizó
para diseñar iniciadores génicos específicos en el interior de
intrones (iniciadores 95 y 71) para llevar a cabo un recorrido
genómico en las regiones genómicas adyacentes de Pptub 2, utilizando
un enfoque I-PCR sobre los digestos genómicos
re-unidos Pag, BamH I y Nde I. Los productos PCR se
reconfirmaron mediante PCR con cebadores internos (iniciadores 38,
35). Se secuenciaron completamente dos clones generados mediante
productos PCR con cebadores internos (C#2Pag y D#2nde). El clon Nde
I D#2 no alojó un sitio interno Nde I, debido probablemente en su
mayor parte a la actividad inicial de la enzima o a la unión de una
ruptura de ds al azar. Sin embargo, los datos secuenciales fueron
confirmados mediante C#2Pag y un tercer clon I-PCR
(95#8BaMHI; iniciadores 149 y 71). Además dos 2 PCR independientes
sobre el ADN genómico (iniciadores 205, 149; Taq (MBI Fermentas, St.
Leon-Rot, Alemania) e iniciadores 205, 206)
confirmaron la longitud del producto. El producto PCR
205-206 y un producto PCR genómico adicional
(situado) por debajo (iniciadores 71, 206: Pfu original (MBI
Fermentas, St. Leon-Rot, Alemania) se clonaron, y
ayudaron a comprobar los datos secuenciales.
Todos los clones mencionados ayudaron a generar
y reconfirmar los datos secuenciales. En total, se ganaron -1400
pares de bases, (situadas) por encima del codon de inicio, y -1400
pares de bases (situadas) por debajo del codon de detención.
\vskip1.000000\baselineskip
Como ya se ha mencionado en una primera etapa,
fragmentos Taq PCR (MBI Fermentas, St. Leon-Rot,
Alemania) de dos PCR independientes sobre ADN genómico de
Physcomitrella patens y ADNc utilizando los iniciadores 9F y
10R se clonaron. Clones de cada PCR (#3-3 genómico,
#4-3 ADNc) se secuenciaron parcialmente y se
vaciaron para ser idénticos. El locus correspondiente se denominó
Pptub 3.
Esta información secuencial preliminar se
utilizó para diseñar iniciadores génicos específicos en el interior
de los intrones (iniciadores 69, 70) para llevar a cabo un recorrido
genómico en las regiones adyacentes de Pptub 3, utilizando un
enfoque I-PCR sobre los digestos genómicos Pag I y
Nco I re-unidos. La reconfirmación de los productos
PCR se realizó mediante PCR con cebadores internos (iniciadores
38,35). Dos clones (A#1Nco y #4-1Pag) se
secuenciaron completamente. A#1Nco es un clon generado por un
producto PCR con cebadores internos (38,35), mientras que
#4-1PagI se generó mediante el producto
I-PCE original (69,70). Además, un producto PCR
genómico (iniciadores 203, 204) se clonó y ayudó a comprobar los
datos secuenciales.
Todos los clones mencionados ayudaron para
generar y reconfirmar datos secuenciales. En total, se ganaron
aproximadamente 1900 pares de bases (situadas) por encima del codon
de inicio y aproximadamente 1100 pares de bases (situadas) por
debajo del codon de detención.
\global\parskip0.900000\baselineskip
Como se ha mencionado anteriormente, en el caso
de Pptub 4, los datos EST se utilizaron para diseñar iniciadores
génico específicos situados por encima y por debajo (297, 299) para
generar clones genómicos y ADNc. Clones genómicos adicionales que
utilizaron la Pfu polimerasa original (MBI Fermentas, St Leon- Rot,
Alemania), ayudaron a comprobar los datos secuenciales.
El iniciador 297 y 299 se invirtieron (337, 383)
y se utilizaron para llevar a cabo un recorrido en las regiones
genómicas adyacentes de Pptub 4, utilizando un enfoque
I-PCR sobre los digestos genómicos Nde I y Nco I
re-unidos. Se generaron dos clones (48#2Nco y
A02#3Nde) y clones genómicos adicionales (iniciadores 547 y 374; se
generaron Mezcla Advantage de la ADNc polimerasa (BD Biosciences
Clontech, Heidelberg, Alemania) y Triple Master (Eppendorf,
Hamburg, Alemania).
Todos los clones mencionados fueron de ayuda
para generar y reconfirmar datos secuenciales. En total, se ganaron
2300 pares de bases aproximadamente (situadas) por encima del codon
de inicio y 1100 pares de bases aproximadamente (situadas) por
debajo del codon de detención.
\vskip1.000000\baselineskip
Como ya se ha mencionado, en el caso de Pptub 5
y 6, los datos EST se utilizaron para diseñar iniciadores génicos
situados por encima y por debajo (Pptub 5:298, 300 y Pptub 6: 296,
336) para generar clones genómicos y ADNc de cada gen. En el caso
de Pptub 5, clones genómicos adicionales que utilizaban Pfu
polimerasa original (MBI Fermentas, St. Leon-Rot,
Alemania), ayudaron a comprobar los datos secuenciales.
Todos los clones mencionados fueron de ayuda
para generar y reconfirmar datos secuenciales. En total, se ganaron
2031 pares de la secuencia genómica para Pptub 5 y 3161 pares de
bases de la secuencia genómica para Pptub 6.
\vskip1.000000\baselineskip
Los clones preliminares Pptub 1
(2-1, 8-1, 8-1;
todos genómicos) y Pptub 3 (3-3 genómicos,
4-3 ADNc) se generaron con polimerasa Taq
recombinante. Los productos PCR se unieron a vectores TOPO TA
(pCR4-TOPO,Invitrogen, Karlsruhe, Alemania). Las
condiciones de la PCR fueron: 2,5 unidades de polimerasa Taq
recombinante, tampón enzimático, 3,3 mM MgCl_{2} (todos MBI
Fermentas, St.Leon-Rot, Alemania), 0,4 mM cada
iniciador, 100 nanogramos de ADNc o de ADN genómico como matriz en
un volumen total de 25 microlitros. Las condiciones de ciclación
fueron: una etapa inicial de 5 minutos a 95ºC, entonces 45 segundos
a 95ºC, 10 segundos a 60ºC (iniciador 8F) o a 65ºC (iniciador 9F) y
1 minuto a 72ºC como etapa secundaria, con 30 a 35 repeticiones,
seguido por una etapa terminal de 5 minutos a 72ºC y enfriando a
4ºC al final del programa.
Todos los otros clones genómicos y de ADNc
fueron:
- Pptub 1:
- \underbar{113-67}, \underbar{113-90}, 89-90, 89-91 ADNc
- Pptub 2:
- \underbar{F7/R10}, \underbar{205-206}, 71-206
- Pptub 3:
- \underbar{203-204}
- Pptub 4:
- \underbar{547-374} (+TrippleMaster), \underbar{297-299 ADNc} + \underbar{génomico} (+ Pfu)
- Pptub 5:
- \underbar{298-300 ADNc} + \underbar{genómico} (+ Pfu)
- Pptub 6:
- \underbar{296-336 ADNc} + \underbar{genómico}
Los genes subrayados anteriormente se generaron
con la Mezcla ADNc Polimerasa Advantage, utilizando una mezcla
enzimática de 0,25 microlitros, tampón (incluyendo 3,5 mM
Mg(OAc)_{2}, ambos BD Biosciences Clontech,
Heidelberg, Alemania), 0,25 mM de cada iniciador, 0,25 mM dNTPs y
10-20 nanogramos de matriz por 20 microlitros de
PCR. Las condiciones de ciclación fueron: una etapa inicial de 2
minutos a 96ºC, a continuación, 20 segundos a 96ºC, 10 segundos a
60ºC y 2 minutos/kb a 68ºC como segunda etapa,con 35 a 40
repeticiones, seguido por una etapa terminal de 15 minutos a 68ºC,
y enfriando a 4ºC al final del programa. Los productos PCR de
longitud apropiada se eluyeron a partir de los geles de agarosa. La
elución se llevó a cabo en 30-50 microlitros,
dependiendo de la cantidad de amplificado. Los productos PCR
eluídos se clonaron en vectores TOPO TA (pCR4-TOPO,
Invitrogen, Karlsruhe, Alemania).
\global\parskip0.880000\baselineskip
Todos los otros clones se generaron con la
polimerasa Pfu original, como lo fueron los dos clones genómicos
adicionales 297-299 y 298-300,
utilizando 0,3 microlitros de polimerasa (= 0,75 unidades); tampón,
2-4 mM MgSO_{4} (todos, MBI Fermentas, St.
Leon-Rot, Alemania), 0,25 mM cada iniciador, 0,2 mM
dNTPs y 10-20 nanogramos de matriz por 20
microlitros PCR. Las condiciones de clonación fueron: una etapa
inicial de 2 minutos a 96ºC, entonces 20 segundos a 96ºC, 10
segundos a 60ºC y 2 minutos/kb 72ºC como una segunda etapa, con 35 a
40 repeticiones, seguido por una etapa final a 72ºC de 10 minutos,
y enfriando a 4ºC al final del programa. Los productos PCR de
longitud apropiada se eluyeron a partir de geles de agarosa. La
elución se llevó a cabo en 30-50 microlitros,
dependiendo de la cantidad de amplificado. Los productos PCR eluídos
se clonaron en pZErO-2 (Invitrogen, Karlsruhe,
Alemania), y se linearizaron con EcoRV.
Un clon adicional de 547-374 se
generó con el Sistema PCR TripleMAster, utilizando 0,25 microlitros
de mezcla polimerásica (= 1,25 unidades), tampón incluyendo 2,5 mM
de Mg^{+2}, ambos Eppendorf, Hamburg, Alemania), 0,2 mM de cada
iniciador, 0,2 mM dNTPs y 10-20 nanogramos de matriz
por 20 microlitros PCR. Las condiciones de ciclación fueron: una
etapa inicial de 2 minutos a 96ºC, entonces, 20 segundos a 96ºC, 20
segundos a 60ºC y 3 minutos/kb a 72ºC como segunda etapa, con 40
repeticiones, seguido por una etapa terminal de 10 minutos a 72ºC,
y enfriando a 4ºC al final del programa. Los productos PCR de
longitud apropiada se eluyeron a partir de los geles de agarosa. La
elución se llevó a cabo en 30-50 microlitros,
dependiendo de la cantidad de amplificado. Los productos PCR
eluídos se clonaron en vectores TOPO TA (pCR4-TOPO
Invitrogen, Karlsruhe, Alemania).
En resumen, la PCR sobre el ADN genómico de
Physcomitrella patens y la clonación de los productos PCR
condujeron a la información secuencial de seis genes transcritos de
\beta-tubulina de Physcomitrella patens.
Además, se utilizaron datos EST y ADNc para confirmar los datos
secuenciales genómicos y los límites intrón/exón. En el caso de
Pptub 1 a 4, la PCR inversa condujo a secuencias genómicas no
transcritas que franqueaban los extremos 5'y 3'. En la Figura 1 se
proporciona una visión general de la totalidad de las seis
secuencias genómicas.
\vskip1.000000\baselineskip
Como ya se ha comentado, Pptub 1 a 4 constituyen
los más abundantemente representados en las bases de datos EST.
Además, la gran mayoría de sus EST correspondientes se generaron a
partir de las bibliotecas de ADNc de longitud completa. Estos dos
hechos ayudaron a determinar el sitio de inicio transcripcional
(TSS) de Pptub 1 a 4 in silico. Una alienación múltiple de
los EST en el extremo 5' contra las correspondientes regiones
genómicas situadas por encima, mostró que Pptub 1 a 3 tiene un
inicio transcripcional preciso: 20 externamente a 27 EST 5' para
Pptub 1, 16 externamente a 20 EST 5' para Pptub 2, 9 externamente a
14 EST 5' para Pptub 3, y empiezan en idéntica posición en su mayor
parte situada por encima, marcada con +1 (Figura
3-6). Además, los tres TSSs están rodeados por una
secuencia consenso (véase a continuación). En el caso de Pptub 4,
los 23 EST 5' indican TSSs múltiples en el interior de 100 pares de
bases. El sitio inicial del EST 5' en su mayor parte por encima, se
definió como +1.
Una alineación análoga múltiple de EST 3' contra
las correspondientes regiones genómicas situadas por debajo,
reconfirmó que los genes vegetales casi siempre presentan más de un
sitio poly (A) y que las secuencias de consenso están definidas
mucho menos claramente que en, por ejemplo, los genes de los
mamíferos, en las que la secuencia AAUAAA es casi ubicuota (para
una revisión, véase: Rothnie et al., 1996).
Los seis loci clonados de Physcomitrella
patens no mostraron ningún codón de detención sin sentido y
pudieron predecirse proteínas apropiadas muy similares a las
\beta-tubulinas conocidas. Por fuera de las
regiones codificantes, generalmente, las similitudes disminuyen
inmediata y significativamente. Con respecto a los elementos
reguladores putativos del extremo 5', una comparación detallada de
la totalidad de las cuatro regiones situadas por encima, no reveló
una conservación total dentro de la familia génica o con las
regiones del extremo 5' de otros conocidos genes
\beta-tubulina de las plantas. Sin embargo, se
pudieron detectar algunas coincidencias de conservación
interesantes dentro de la familia génica:
- a)
- Los TSSs determinados de Pptub 1 a 3 en la totalidad de los tres casos, se encontraron en el interior de la secuencia de consenso T/C C \underbar{A} (+1) G/C T G T G C y están inmersos en regiones ricas en C/T (compárense los consensos de 171 promotores vegetales TATA no relacionados: T/C C \underbar{A} (+1) N M N en la Base de datos plantProm bajo http://mendel. cs. rhul.ac.uk/mendel.php?.topic=plantprom).
- b)
- 22-24 pares de bases por encima del TSS-que se encuentra dentro de la distancia típica para los promotores TATA vegetales, (véase plantProm DB)- puede concontrarse en Pptub 1 a 3 una débil secuencia TATA de 8 pares de bases inmersa en un segmento conservado de 20-25 pares de bases. El consenso de la secuencia TATA a partir de 171 promotores vegetales no relacionados es: T_{96} A_{95} T_{96} A_{100} A_{62}/T_{38} A_{97} T_{61}/A_{38} A_{73} (véase plantProm DB) y para Pptub 1-3, es: T t T A T c T c/t/A, con las letras capitales indicando correlación con el consenso.
- c)
- Los cuatro genes presentan un grado muy escaso de Adenosina (9-16%) en sus 5'UTR.
- d)
- El 5'UTR de Pptub 4 tiene un contenido C/T total de 74%, que -además- aloja un segmento C/T (de 50 pares de bases aproximadamente), directamente por detrás del punto de inicio del 5'EST corto y (situado) en su mayor parte, por debajo.
- e)
- Pptub 2 aloja un fragmento poly A de 40 pares de bases alrededor de 450 pares de bases (situadas) por encima del TSS (-450 hasta -489).
- f)
- En Pptub 1 y 4, por encima de la posición -420 empiezan regiones muy largas, ricas en A/T (en Pptub 1, sobre el 80% para casi 900 pares de bases, y en Pptub 4, el 75% sobre 1750 pares de bases), dejando abierta la posibilidad para que se puedan localizar regiones que se unan a la estructura/matriz (S/MAR; (Liebich et al., 2002), por encima de estos genes.
\global\parskip1.000000\baselineskip
La definición de
fragmentos-promotores mínimos que proporcionan un
máximo de actividad promotora, se llevó a cabo mediante la
cuantificación funcional de secuencias putativas reguladoras en el
extremo 5' de Pptub 1 a 4 en un sistema de expresión transitoria,
utilizando como sistema de expresión protoplastos no regenerativos
de Physicomitrella patens. Para cada promotor, varios constructos de
distintas longitudes, incluyendo regiones (situadas) por encima y
5'UTR, se se pusieron de forma precisa enfrente del codon de inicio
del gen informador. Como gen informador, una proteína humana
(factorde crecimiento 121 endotelial vascular humano recombinante
rhVEGF121; Gorr 1999) se secretó al medio mediante su propio péptido
señal. La cantidad de rhVEGF121 en el sobrenadante del cultivo
liquénico, se cuantificó mediante ELISA y reflejó la intensidad del
promotor o del fragmento del promotor en el sistema. Los valores se
relacionaron con los valores obtenidos por el promotor 35S. Cada
constructo se transformó un mínimo de seis veces en dos a tres
distintos experimentos de transformación. Las muestras se tomaron
después de 24 y 48 horas, respectivamente, midiendo dos veces las
muestras de 48 horas en diluciones apropiadas mediante un ELISA.
Una visión general de los resultados se proporciona en la Figura
2.
Las regiones promotoras de la expresión de Pptub
1 a 4 se dan a conocer como SEC.ID nº 1 a 8.
\vskip1.000000\baselineskip
- Pptub 1:
- 1-0 (iniciador 364XhoI,363cat)
- \quad
- 1-1 (iniciador 219XhoI,363cat)
- \quad
- 1-3 (iniciador 549XhoI,363cat)
- \quad
- 1-4 (iniciador 226XhoI,363cat)
- \quad
- 1-5 (iniciador 550XhoI,363cat)
- Pptub 2:
- 2-0 (iniciador 291, 225cat)
- Pptub 3:
- 3-0 (iniciador 292, 223cat)
- Pptub 4:
- 4-0 (iniciador 373XhoI, 374cat)
- \quad
- 4-1 (iniciador 548XhoI, 374car)
\vskip1.000000\baselineskip
Los fragmentos del promotor que se
proporcionaron anteriormente, se amplificaron con polimerasa Pfu
original (MBI Fermentas, St. Leon-Rot, Alemania)
sobre ADN genómico, utilizando iniciadores inversos que empezaban
con la secuencia inversa complementaria del codon inicial ATG
(cat..) y, en parte, (utilizando) iniciadores delanteros que
contenían sitios XhoI. Los productos PCR se seccionaron con XhoI y
se unieron en XhoI/HincII, o no se seccionaron en absoluto y se
unieron a pRT101nuevo abierto con HincII, respectivamente. Los
clones que se generaron se comprobaron mediante secuenciación. Los
clones 1-2 (XhoI/EcoRI), 2-1
(Bg1II), 2-2 (Sa1I), 2-3
(EcoRI/Sa1I), 2-4 (EcoRI/Sa1I), 3-2
(Sa1I), 3-3 (EcoRI/HincII) y 3-4
(XhoI/Sa1I) se generaron mediante deleciones internas de clones más
largos. Los vectores restantes se eluyeron en gel y se volvieron a
unir. En el caso de que las estructuras monocatenarias que
sobresalen, no se ajustaran, la unión se llevó a cabo después de
rellenar los extremos 3' ocultos con el Fragmento de Klenow (MBI
Fermentas, St. Leon-Rot, Alemania), siguiendo el
manual del proveedor.
\vskip1.000000\baselineskip
Seis distintas longitudes de promotores se
clonaron en el vector de transformación pRT101p21 enfrente del gen
informador. Los datos de todos los constructos se dan en la figura
3. (5' UTR= + 1 (TSS) hasta + 226, + 227=ATG)
1-0 - 1307 pares bases (pb)
(1533 pb región 5' de Pptub 1)
1-1 - 985 pares bases (pb) (1211
pb región 5' de Pptub 1)
1-2 - 416 pares bases (pb) (642
pb región 5' de Pptub 1)
1-3 - 248 pares bases (pb) (474
pb región 5' de Pptub 1)
1-4 - 83 pares bases (pb) (309
pb región 5' de Pptub 1)
1-5 - 71 pares bases (pb) (297
pb región 5' de Pptub 1)
\newpage
El fragmento 1-2 del promotor
puede definirse como el fragmento más corto del promotor que da
lugar a tasas altas de expresión. Las tasas son aproximadamente de
150% comparadas con los valores generados con el promotor 35S, en
el cual se fijaron a 100%. Téngase en cuenta que por encima del
fragmento mínimo del promotor 1-2, empieza una
larga región muy rica en A/T (sobre un 80% de A/T para casi 900
pares de bases).
\vskip1.000000\baselineskip
Cinco distintas longitudes de promotores se
clonaron en el vector de transformación pRT101p21 enfrente del gen
informador. Los datos de todos los constructos se dan en la figura
4. (5' UTR= + 1 (TSS) hasta + 122, + 123=ATG)
2-0 - 1075 pares bases pb (1197
pb región 5' de Pptub 2)
2-1 - 676 pares bases pb (798 pb
región 5' de Pptub 2)
2-2 - 425 pares bases pb (547 pb
región 5' de Pptub 2)
2-3 - 245 pares bases pb (367 pb
región 5' de Pptub 2)
2-4 - 67 pares bases pb (189 pb
región 5' de Pptub 2)
El fragmento 2-2 del promotor
puede definirse como el fragmento más corto del promotor que da
lugar a tasas altas de expresión. Las tasas son comparables a los
valores generados con el promotor 35S, (100%).
\vskip1.000000\baselineskip
Distintas longitudes de promotores se clonaron
en el vector de transformación pRT101p21 enfrente del gen
informador. Los datos de los cuatro constructos se dan en la figura
5. (5' UTR= + 1 (TSS) hasta + 112, + 113=ATG)
3-0 - 1274 pares bases (pb)
(1386 pb región 5' de Pptub 3)
3-2 - 765 pares bases (pb) (879
pb región 5' de Pptub 3)
3-3 - 272 pares bases (pb) (384
pb región 5' de Pptub 3)
3-4 + 52 pares bases (pb) (60 pb
UTR 5' de Pptub 3)
El fragmento 3-2 del promotor
puede definirse como el fragmento más corto del promotor que da
lugar a tasas altas de expresión. Las tasas son aproximadamente de
300% comparadas con los valores generados con el promotor 35S, el
cual se fijó a 100%.
\vskip1.000000\baselineskip
Dos distintas longitudes de promotores se
clonaron en el vector de transformación pRT101p21 enfrente del gen
informador. Los datos se dan en la figura 6.
(5' UTR= TSSs (+ 1 hasta + 103) hasta + 205, +
206 = ATG)
4-0 - 419 pares bases (pb) (624
pb región 5' de Pptub 4)
4-1 - 1 pares bases (pb) (206 pb
región 5' de Pptub 4)
El fragmento 4-1 da lugar a
tasas de expresión que son aproximadamente del 250% comparadas con
los valores generados con el promotor 35S, en el cual se fijaron a
100%. Téngase en cuenta que por encima de este fragmento mínimo del
promotor (4-0), empieza una larga región muy rica en
A/T (75% de A/T para 1750 pares de
bases).
bases).
En síntesis, se caracterizó la actividad
promotora transitoria de las regiones genómicas superiores de Pptub
1 a 4 Se definieron los fragmentos promotores mínimos que mostraban
un máximo de actividad promotora y que dieron lugar a rendimientos
de hasta 3 veces los de la actividad promotora de 35S.
\newpage
Sumario de constructos Pptub (véase
también:listado se secuencias)
Regiones genómicas superiores de Pptub1:
-1533 hasta -1 (+ 1 = codon de inicio)
-1533 hasta -644 =81% AT
-1533 VEGF 1-0 (iniciador
364)
-1211 VEGF 1-1 (iniciador
219)
-642 VEGF 1-2 (EcoRI/XhoI)
-474 VEGF 1-3 (iniciador
549)
-309 VEGF 1-4 (iniciador
226)
-297 VEGF 1-5 (iniciador 550;
sin secuencia TATA putativa: -304 hasta -295)
-226 TSS (inicio de 5'UTR)
\vskip1.000000\baselineskip
Regiones genómicas inferiores de Pptub1
1 hasta 1539 (1= directamente por detrás del
codon de detención)
332 extremo del EST más largo (3' UTR)
1539 comienzo del iniciador 90
\vskip1.000000\baselineskip
Regiones genómicas superiores de Pptub2:
-1197 hasta -1 (+1 =codon de inicio)
-1197 VEGF 2-0 (iniciador
291)
-798 VEGF 2-1 (BglII)
-547 VEGF 2-2 (SalI)
-450 hasta - 489 =fragmento polyA
-367 VEGF 2-3 (EcoRI/SalI)
-189 VEGF 2-4 (XhoI/SalI)
-122 TSS (comienzo de 5'UTR)
\vskip1.000000\baselineskip
Regiones genómicas inferiores de Pptub2
1 hasta 1012 (1=directamente por detrás del
codon de detención)
297 extremo del EST más largo (3' UTR)
1012 comienzo del iniciador 206
\vskip1.000000\baselineskip
Regiones genómicas superiores de Pptub3
-1386 hasta -1 (+ 1= codon de iniciación)
-1386 VEGF 3-0 (iniciador
292)
-879 VEGF 3-2 (SalI)
-384 VEGF 3-3
(Eco147I/HincII)
-112 TSS (comienzo de 5' UTR)
-60 VEGF 2-4 (XhoI/SalI)
\vskip1.000000\baselineskip
Regiones genómicas inferiores de Pptub3
1 hasta 997 (1 = directamente por detrás del
codon de detención)
203 extremo del EST más largo (3' UTR)
1012 comienzo del iniciador 204
\vskip1.000000\baselineskip
Regiones genómicas superiores de Pptub4
-624 hasta -1 (+1 = codon de inicio)
-624 VEGF 4-1 (iniciador
373)
-206 VEGF 4-2 (iniciador
548)
-205 hasta -103 área de TSS (comienzo de
5'UTR)
-55 hasta -93 segmento CT
\vskip1.000000\baselineskip
Regiones genómicas inferiores de Pptub4
1 hasta 1146 (1 =directamente por detrás del
codon de detención)
466 extremo del EST más largo (3'UTR)
1141 hasta 1164 NcoI
\vskip1.000000\baselineskip
Cuatro genes de actina y regiones promotoras del
liquen Physcomitrella patens y tres de Funaria
hygrometrica, y de la hepática de agua Marchantia
polymorpha, se aislaron para construir vectores de expresión
para su utilización en los líquenes.
Utilizando oligonucleótidos específicos
diseñados a partir de secuencias EST de Physcomitrella que se
encuentran en las bases públicas de datos, se aislaron cuatro genes
de actina (Ppact1, Ppact3, Ppact5 y Ppact7) en varias tandas de
(realización del) iPCR del ADN genómico, y se secuenciaron.
En Physcomitrella la estructura de los
genes aislados se parece en un caso (Ppact1) a la organización
estructural conservada de los genes de la actina de las plantas
superiores. El (gen) conductor no traducido se interrumpe por un
intrón relativamente largo (955 pares de bases) que se localiza 14
nt por encima del iniciador ATG. La región codificante presenta
tres intrones más pequeños que están situados en las mismas
posiciones que los intrones de los genes de la actina de otras
especies vegetales. El primero se localiza entre los codones 20
(lys) y 21 (ala), el segundo es el codon dividido 152 (gly) y el
tercero está entre el codon 356 (gln) y 357 (met). Esta estructura
general parece ser diferente para los otros tres genes de actina
aislados de Physcomitrella (Ppact3, Ppact5, y Ppact7). En
estos casos el intrón 5' UTR (434 pares de bases, 1006 pares de
bases y 1055 pares de bases respectivamente) también está localizado
14 nt antes del ATG, pero la región codificante se interrumpe sólo
por un intrón posicionado entre los codones 21 (lys) y 22 (ala) (Fig
7).
Para estudiar la actividad de las distintas
regiones promotoras de la expresión de actina de
Physcomitrella (SEC ID nº 5 a 8), así como el efecto de los
5'UTR de los diferentes genes, se diseñaron varios vectores para la
expresión de la proteína hVEGF bajo el control de las regiones 5'
bajo estudio.
Alrededor de 2 kb de regiones genómicas
(situadas) por encima del sitio de iniciación de la transcripción,
se aislaron mediante iPCR, a partir del ADN genómico, y se
secuenciaron. Para la transfección transitoria de protoplastos
liquénicos, se construyeron vectores que contenían el ADNc del VEGF
humano gobernado por los promotores, y que contenían las secuencias
conductoras exactas incluyendo el intrón del extremo 5'. Las
regiones completas de promoción 5' de la expresión se amplificaron
mediante PCR de corrección, utilizando los iniciadores 395 y 332
para Ppact1, 408 y 333 para Ppact3, 511 y 334 para Ppact5, y 413 y
335 para Ppact7.
La transformación de los protoplastos se llevó a
cabo utilizando el mismo número de moléculas para cada constructo
que fuera a ser ensayado, y en paralelo para un constructo que
transporta el hVEGF ADNc bajo el control del promotor CamV 35 S. La
proteína hVEGF contiene, en la parte N-terminal, un
péptido señal de 26 aminoácidos, que permite la secreción al medio
de la proteína recombinante. El análisis de las transformaciones se
llevó a cabo mediante ELISA, tomando distintas diluciones del medio
en el que se incubaron los protoplastos 48 horas después de la
transformación.
La capacidad para gobernar la expresión de las
distintas regiones de la actina 5' de Physcomitrella, se
comparó con la actividad del promotor constitutivo 35S.
En todos los casos analizados, las regiones del
extremo 5' de los genes de la actina alcanzaron una actividad más
intensa que la del promotor 35S. Sin embargo, el nivel de expresión
varió para las distintas secuencias reguladoras de la actina. Así,
la secuencia del extremo 5' de Ppact3 promocionó una expresión de
VEGF alrededor de sólo 2 veces más intensa que la del promotor 35S.
Se midieron niveles más altos de VEGF cuando vectores que contenían
las regiones 5' de Ppact1 y Ppact7 se utilizaron para la
transformación. En aquellos casos, se obtuvieron valores de entre 4
y 8 veces los valores de 35S. Sin embargo, las diferencias más
importantes se observaron en el caso del gen 5'Ppact5, en el que se
obtuvieron en algunos casos valores de hasta 11 veces más altos,
comparados con los encontrados en 35S. (Fig 8).
Para investigar posteriormente la función de la
región 5' UTR de los genes de actina de actividad intensa de
Physcomitrela, se prepararon vectores que contenían deleciones,
combinaciones y sustituciones del intrón 5'UTR, y se utilizaron
para ensayos transitorios en protoplastos liquénicos.
La deleción del intrón del extremo 5' de Ppact1
disminuyó de forma importante los niveles de la expresión
transitoria, en comparación con los obtenidos cuando se utilizó la
región intacta del extremo 5' de Ppact1. En este caso, la cantidad
de proteína VEGF secretada que podría detectarse en el medio
protoplasmático era muy similar a la obtenida mediante el promotor
CaMV 35S. Esto podría indicar que el intrón del extremo 5' de
Papact1 es esencial para la expresión génica eficiente del promotor
Ppact1. Se obtuvieron algunos resultados cuando el 5'UTR incluyendo
el intrón conductor se fusionó por debajo del promotor 35 S. Este
constructo produjo la misma cantidad de proteína secretada que el
promotor 35S intacto, indicando que la región 5'UTR no tiene
ninguna influencia importante sobre la actividad de promotores
distintos que el Ppactl. Es importante indicar que un constructo
que transporta justamente la región 5'UTR Ppact1 pudo promover la
producción proteica sólo en una cantidad 30% inferior que el
promotor 35S sólo. Esto pudiera sugerir una pequeña actividad
promotora en esta región del gen, o un resto de actividad promotora
que estuviera presente en la secuencia estructural del vector (Fig
9).
Se utilizó el mismo enfoque para investigar la
influencia sobre las actividades promotoras de los intrones 5'UTR
contenidos en los genes Ppact5 y Ppact7. Se analizaron los
constructos en los que el intrón del extremo 5' se suprimió,
obteniéndose resultados similares que en el caso de Ppact1, es
decir, que la cantidad de proteínas que se obtuvieron fue
aproximadamente la misma que con el promotor 35S en el caso de
Ppact5 y ligeramente inferior en el caso de Ppact7, indicando que
la presencia del intrón en el 5'UTR es esencial para la actividad
eficiente de los promotores. También se observó alguna actividad
promotora residual cuando la transformación se llevó a cabo con
constructos que contenían sólo la región transcrita del extremo 5',
hasta el ATG. Además, en el caso de estos 2 genes, la fusión del
5'UTR por debajo del promotor 35S produjo tasas más altas (2 a 7
veces) de la expresión de la proteína VEGF, cuando se compara con el
promotor 35 S sólo (Fig 10, 11). Se observaron resultados similares
en el caso de Ppact3, en los cuales el 5'UTR solo o fusionado por
debajo del CaMV 35 S, produjo alrededor de 2 a 3 veces más,
respectivamente, en comparación con el 35 S (Fig 12). Estas
indicaciones podrían sugerir la presencia de una potenciación de la
actividad en las regiones transcritas en el extremo 5' para estos
tres genes, incluso cuando se encuentran dispuestos por debajo de un
promotor distinto.
Para investigar posteriormente la función del
intrón del extremo 5' que se encuentra en los genes Ppact1, Ppact5
y Ppact7, se manipularon mediante ingeniería genética, en vectores,
sustituciones del intrón conductor del gen Ppact1 con el intrón del
extremo 5' de Ppact5 y Ppact7, para (llevar a cabo) una
transformación transitoria. Se llevaron a cabo sustituciones
paralelas del intrón del extremo 5' de Papct1 con los intrones
ppact1 presentes en la región codificante del gen.
Sustituciones del intrón del extremo 5' de
Ppact1, por los intrones 1 y 3 de la región codificante de Ppact 1,
dieron lugar a una disminución de los niveles de expresión de
alrededor del 25%. La cantidad de proteína detectada todavía fue de
alrededor de 2-3 veces superior que la obtenida con
el promotor CaMV 35S. La sustitución del intrón del extremo 5' por
el intrón 2 de la región codificante dio lugar, sorprendentemente,
al cese en la actividad del promotor (Fig 13). El constructo, sin
embargo, se sometió a comprobación, mostrando la secuencia que el
sitio de corte y empalme para el intrón no era correcto. Se preparó
un nuevo constructo que transportaba la secuencia de corte y
empalme correcta, indicando los resultados después de la
transformación liquénica que el efecto del intrón 2 es el mismo que
para las otras sustituciones.
Asimismo, se observó una disminución de la
expresión proteica cuando la sustitución se llevó a cabo con los
intrones del extremo 5' que correspondían a los genes Ppact5 y
Ppact7, pero en este caso la reducción fue ligeramente más
pequeña.
Se llevó a cabo otra caracterización de los
distintos promotores de los genes de la actina, preparando
constructos de deleción de las regiones del extremo 5' no
transcritas, y analizándolos mediante la transformación transitoria
de los protoplastos liquénicos.
Así, se llevó a cabo dicho análisis para los
constructos Ppact1 que transportan distintas longitudes de regiones
genómicas, (-1823 pares de bases, -992 pares de bases, -790 pares de
bases, -569 pares de bases, -383 pares de bases, -237 pares de
bases, y -82 pares de bases) (que se encuentran) por encima del
inicio de la transcripción (+1).
En principio, todos los constructos, excepto el
de -82 pares de bases, podrían tener una actividad promotora total.
Sin embargo, el de -383 pares de bases muestra una disminución de la
actividad y alcanza niveles similares que el constructo de -82
pares de bases (Fig 14).
El análisis de los constructos de deleción de la
región promotora de Ppact3 reveló algunas características
interesantes. Tal como se ha descrito, este promotor presentaba una
actividad inferior comparada con los otros promotores de los genes
de la actina, aunque en relación con el CaMV 35S, era ligeramente
más activa. En este caso, se ensayaron las siguientes regiones del
extremo 5' no transcritas: -2210 pares de bases, -995 pares de
bases, -821 pares de bases, -523 pares de bases, -323 pares de
bases, -182 pares de bases y -81 pares de bases. De forma
sorprendente, la actividad del promotor fue aproximadamente la misma
que la del CamV 35S para los constructos que contenían hasta -821
pares de bases de la región promotora. Sin embargo, los constructos
que contenían a partir de -523 pares de bases, y regiones más cortas
hacia el inicio de la transcripción, produjeron una cantidad dos
veces más de la proteína recombinante. Esto podría indicar regiones
actuantes cis situadas por encima de la región de -523 pares de
bases que regularían por disminución la transcripción de este gen
durante el ensayo de transitorio de transformación (Fig 15).
En el caso de Ppact5, se generaron constructos
que contenían fragmentos de -1872 pares de bases, -758 pares de
bases, -544 pares de bases, -355 pares de bases, y 121 pares de
bases por encima del inicio transcripcional del gen. Los resultados
obtenidos a partir de los ensayos transitorios, indican que la
actividad completa del promotor reside en una región entre -758 y
-121 a partir del inicio de la transcripción (+1) (Fig 16).
Se analizaron los siguientes constructos de
deleción para la región del extremo 5' no transcrita de Ppact7:
-1790 pares de bases, -1070 pares de bases, -854 pares de bases,
-659 pares de bases, -484 pares de bases, -299 pares de bases, y
-66 pares de bases. Los resultados obtenidos indican que la región
comprendida entre -484 pares de bases y -299 pares de bases, es
esencial para la actividad completa del promotor durante los
ensayos de experimentación transitoria (Fig 17).
Para obtener un conjunto de promotores
heterólogos de los genes de actina de Physcomitrella, otras
dos especies, el liquen Funaria hygrometrica y la hepática
de agua Marchantia polymorpha, se utilizaron para aislar
fragmentos de ADN genómico que contenían genes de actina. Con esta
finalidad, se diseñaron oligonucleótidos con distintos grados de
degeneración para llevar a cabo reacciones PCR utilizando como
matriz ADN genómico aislado de dos especies.
Las cuatro distintas secuencias genómicas de la
actina aisladas a partir de Physcomirella patens representan
probablemente las secuencias funcionales completas de los genes, que
incluyen la secuencia del promotor del extremo 5, 5'UTR + el intrón
del extremo 5', el ORF + intrones internos y el 3'UTR y además la
secuencia (situada) por debajo del extremo 3'. En total, se
aislaron 5809 pares de bases de Ppact1, 5633 pares de bases de
Ppact3, 8653 pares de bases de Ppact5 6351 pares de bases de Ppact7
de la secuencia genómica (Fig 18A). Las regiones codificantes de
los ADNc de actina aislados de Physcomitrella tienen casi
todos una longitud de 1137 pares de bases, excepto Ppact1 que posee
un ORF de 1134 pares de bases. Las proteínas correspondientes son de
378 aminoácidos de longitud, excepto Ppact1 que tiene 377
aminoácidos. A nivel nucleótido, las secuencias codificantes
comparten homologías de entre el 86,6 y el 98,9%. Las secuencias
proteicas poseen una identidad de entre el 97,1 y el 99,7%
(alineamiento secuencial (pesado) DNA STAR, MegAlign Program,
Clustal V).
Para la totalidad de los cuatro genes de actina
de Physcomitrella, pudieron aislarse mediante iPCR y
secuenciarse (ulteriormente) secuencias del extremo 5' del ADN
genómico prolongado del codon de iniciación ATG: 2973 nt para
Ppact1, 3091 nt para Ppact3, 3095 nt para Ppact5 y 3069 nt para
Ppact7. Para Ppact1, Ppact5 y Ppact7, se llevó a cabo la
amplificción rápida del extremo 5' del ADNc, utilizando el Equipo
Racer Gene (Invitrogen), que permite la amplificación de sólo ADNc
de longitud entera, para determinar los 5' UTR de los genes. Para
Ppact3, el 5' UTR se determinó por la longitud de distintos EST de
la base de datos. Comparando los ADNc con los fragmentos genómicos
iPCR, podría mostrarse la presencia de grandes intrones del extremo
5'. Las longitudes de los intrones del extremo 5' que están todos
localizados en la posición -14 para el codon de Iniciación ATG, son
955 pares de bases, 434 pares de bases, 1006 pares de bases y 1055
pares de bases para Ppact1, Ppact3, Ppact5 y Ppact7,
respectivamente (Fig 18A). Las posiciones de los intrones internos
de ORF se determinaron comparando las secuencias genómicas y las
secuencias proteicas derivadas con las secuencias ADNc y las
secuencias proteicas de los genes de actina de Arabidopsis
thaliana. Las secuencias del promotor del extremo 5' disponibles
para los genes de actina de Physcomitrella son 1824 nt para
Ppact1, 2270 nt para Ppact3, 1909 pares de bases para Ppact5 y 1805
pares de bases para Ppact7 (Fig 18A).
En total, se pudieron identificar mediante PCR
degenerada sobre ADN genómico 4 distintos genes de actina de
Funaria hygrometrica (regiones promotoras de la expresión:SEC
ID nº 9 a 12) y 3 genes distintos de Marchantia polymorpha
(regiones promotoras de la expresión:SEC ID nº 13 a 15). Como el
objetivo era predominantemente aislar las regiones promotoras del
extremo 5' de los distintos homólogos putativos del gen de la actina
a partir de las diferentes especies liquénicas, la mayoría de las
secuencias, hasta la fecha, están incompletas en el extremo 3'
(Fig.18 B/C).
Para Funaria, los genes de la actina que
se identificaron se denominaron Fhact1, Fhact4.4, Fhact5 y Fhact5b.
Mediante iPCR, para los distintos genes de actina, se pudieron
aislar 3951 pares de bases de Fhact1, 2417 pares de bases de
Fhact4, 4432 pares de bases de Fhact5 y 722 pares de bases de
Fhact5b de secuencias genómicas. La secuencia completa codificante
de ADNc pudo aislarse para el gen Fhact1 que posee una secuencia
codificante de 1134 nucleótidos. Para los otros genes de actina de
Funaria están disponibles, actualmente, secuencias
parciales, en las que faltan los extremos 3': 906 pares de bases
para Fhact4.4, 965 pares de bases para Fhact5 y 722 pares de bases
para Fhact5b (Fig 18B). Las secuencias codificantes aisladas
comparten homologías del orden del 87,4 y del 99,2% a nivel
nucleótido. Las secuencias proteicas derivadas son idénticas entre
el 90,8 y el 99,2% (alineamiento secuencial (pesado) DNA STAR,
MegAlign Program, Clustal V).
Excepto para Fhact5b, las secuencias del extremo
5' (situadas) por encima del codon de inicio ATG, pudieron aislarse
mediante iPCR y secuenciarse. En el caso de Fhact1, están
disponibles 1824 pares de bases, para Fhact4.4, 1333 pares de
bases, y para Fhact5, 3289 pares de bases. Las longitudes de los
distintos 5'UTR se determinaron mediante la técnica RACE del
extremo 5', utilizando el Equipo Racer Gene (Invitrogen). La
estructura intrón-exón se determinó comparando la
secuencia del ADNc con las secuencias genómicas obtenidas mediante
iPCR y mediante la comparación con los genes de
Physcomitrella. Como en el caso de los genes de actina de
Physcomitrella, los genes de actina identificados de
Funaria contienen grandes intrones del extremo 5' localizados
en la posición -14 de los ADNc, y 928 pares de bases, 1015 pares de
bases y 656 pares de bases de largo para Fhact1, Fhact4.4 y Fhact5
respectivamente. Por ahora, los 700 pares de bases para Fhact1, las
145 pares de bases para Fhact4.t4, y para Fhact5, los 2515 pares de
bases de la secuencia promotora del extremo 5', se aislaron y
secuenciaron. Para Fhact1, se aislaron 419 pares de bases de la
región del extremo 3'. Las regiones del extremo 5' o las regiones
del extremo 3' de los genes de actina de Funaria se
amplificaron mediante PCR sobre el ADN genómico de Funaria
hygrometrica utilizando los iniciadores 908 y 909 para la región
del extremo 5' de Fhact1, 983 y 984 para la región del extremo 3'
de Fhact1, 1000 y 1001 para la región del extremo 5' de Fhact4.4 y
611 y 612 para la región del extremo 5' de Fhact5.
Para Marchantia, los genes de actina que
se identificaron, se denominaron Mpact1, Mpact4 y Mpact15. Para la
totalidad de las tres secuencias, faltan los extremos 3'. Para
Mpact1 2229 pares de bases, para Mpact4 3987 pares de bases y para
Mpact15 2174 pares de bases, se aislaron y secuenciaron. Las
longitudes de las secuencias codificantes ADNc que se aislaron
fueron de 997 nt, 962 nt y 995 nt para Mpact1, Mpact4 y Mpact15
respectivamente (Fig 18 C). Las homologías secuenciales en el
interior de los genes de Marchantia Polymorpha constituyen
una pequeña unidad de información inferior, comparadas con las otras
dos especies liquénicas, del orden de entre el 78,3 y el 85,5% a
nivel nucleótido, y de entre el 94,7 y el 96,1% a nivel aminoácido.
(alineamiento secuencial (pesado) DNA STAR, MegAlign Program,
Clustal V). La secuencia (situada) por encima del extremo 5' del
ATG para la totalidad de los tres genes distintos de actina de
Marchantia que se identificaron, se aislaron mediante iPCR y
se secuenciaron: 937 pares de bases para Mpact1, 3025 pares de bases
para Mpact4 y 910 pares de bases para Mpact15. Las regiones del
extremo 5'de los genes homólogos de actina de Marchantia, se
amplificaron mediante PCR sobre ADN genómico de Marchantia
polymorpha, utilizando el iniciador 950 y 951 para 5'Mpact1,
960 y 961 para Mpact4 y 970 y 971 para Mpact15. La estructura
intrón-extrón del ORF se obtuvo comparando las
distintas secuencias del gen de la actina de las diferentes especies
liquénicas. La secuencia del extremo 5' aislada de Mpact1 muestra
la secuencia de consenso para los sitios de corte y empalme del
intrón (aggt) en la posición -14, que indica la presencia de un
intrón del extremo 5' como en el caso de los otros genes de
Physcomitrella y Funaria. Dentro de las secuencias
(situadas) por encima de Mpact4 y Mpact15, no se encuentran
secuencias de consenso del sitio de corte y empalme del intrón, lo
cual podría explicar la falta de los intrones del extremo 5' (Fig
18C).
\newpage
Como se ha mencionado anteriormente, en general,
las homologías de nucleótidos y secuencias proteicas para los
distintos genes de actina aislados dentro de una especie, son muy
altas, especialmente a nivel proteico. Las homologías entre las
especies liquénicas estrechamente relacionadas Physcomitrella
patens y Funaria hygrometrica parecen también ser muy
altas. A nivel nucleótido, los genes de actina muestran homologías
de identidad entre 86,9 y 96,3%, y a nivel aminoácido, del orden del
95,5 al 99,7%.
Contrariamente a esto, la relación más distante
de la. hepática de agua Marchantia polymorpha con las otras
dos especies, se refleja en las homologías más bajas de los genes a
nivel nucleótido. Las homologías entre los genes de actina de
Physcomitrella y Marchantia es sólo del orden del
75,2% y del 78,8%, y entre Funaria y Marchantia las
homologías son del orden del 75,5% al 80,4%. A nivel aminoácido, las
homologías de los genes de actina de Marchantia varían entre
el 93,0% y el 96,1% comparadas con Physcomitrella, y entre
el 93,4% y el 96,7% comparadas con Funaria.
Tal como se ha indicado anteriormente, la
estructura intrón-exón de los genes de actina de
Physcomitrella, hasta cierto grado, es similar a la de
plantas superiores, pero también con diferencias claras. Todos los
genes de actina de Physcomitrella aislados, contienen un gran
intrón del extremo 5' en la región del extremo 5' no traducida, el
cual contienen casi todas las actinas de las plantas superiores
investigadas. Sólo Ppact1 contiene 3 intrones internos en el
interior del ORF, reflejando la situación, por ejemplo, para todos
los genes de actina aislados de Arabidopsis thaliana. Las
posiciones de los intrones internos del ORF de Ppact1 se conservan
también, comparadas con los genes de actina de las plantas
superiores. Contrariamente a esto, Ppact3, Ppact5 y Ppact7
contienen sólo un intrón interno en el interior del ORF.
La misma estructura genómica puede encontrarse
en los genes de actina aislados de Funaria, con un intrón
del extremo 5' prolongado dentro del 5'UTR. Fhact1 tiene la misma
estructura intrón-exón conservada como Ppact1,
mientras que Fhact4.4 y Fhact5 contienen sólo un intrón interno
dentro de la secuencia ORF. La secuencia aislada de Fhact5b es
demasiado corta para decir algo claro acerca de la estructura
intrón-exón, pero por lo menos no contiene el
intrón 2 interno, comparado con Fhact1 o Ppact1.
En Marchantia, las estructuras genómicas
de los genes de actina aislados parecen ser más distintas. Es
importante para indicar que el número de diferentes genes de actina
en las tres distintas especies liquénicas no es conocido, y que
podría ser que los tres genes de actina aislados de
Marchantia no representen los genes individuales
funcionalmente homólogos. Es probable que existan más de tres genes
de actina presentes en Marchantia y más de cuatro genes de
actina en Physcomitrella y en Funaria.
Sin embargo, la estructura
intrón-exón de Mpact1 parece ser la misma que en el
caso de Ppact1 y Fhact1 con un intrón del extremo 5' en el interior
del 5'UTR y las posiciones conservadas de los intrones internos 1 y
2 de ORF. Mpact15 contiene también el intrón 1 y el intrón 2
internos conservados de ORF, pero no tiene un sitio de corte y
empalme conservado del intrón en la posición -14 en el interior del
5'UTR o en la posición -10, tal como se ha encontrado para
Physcomitrella o para algunos intrones del extremo 5' de
actina de Arabidopsis, respectivamente, apuntando a la falta de un
intrón del extremo 5'. Además, Mpact4 tampoco tiene el intrón 1 o
el intrón 2 en el interior de ORF, el cual es distinto de todos los
genes de actina liquénicos aislados.
Aunque la estructura
intrón-extrón de los distintos genes de actina
aislados de Physcomitrella y Funaria podría sugerir
(proponer) conclusiones acerca de los genes homólogos entre las dos
especies, no se puede concluir esto de la estructura genómica. Por
ejemplo, Ppact1 y Fhacet1 comparten la misma estructura
intrón-exón conservada, pero no está claro, tal
como se indicó anteriormente, si existen más genes que se encuentran
presentes en el genoma de ambas plantas, que podrían tener las
mismas estructuras genómicas. Para llevar a cabo una declaración
respecto de los genes homólogos, también serían necesarios los datos
de la expresión para proponer homologías funcionales. Asimismo, a
partir de las homologías secuenciales de las proteínas o de las
secuencias codificantes del ADNc, no es posible llevar a cabo
ninguna suposición con respecto a los genes homólogos
correspondientes entre las especies, pues son demasiado similares
en general.
Pero en el caso de Physcomitrella y
Funaria fue interesante encontrar también homologías
secuenciales muy altas dentro de las secuencias no codificantes con
respecto a las secuencias UTR, secuencias intrónicas y secuencias
promotoras. Entonces, se encontraron homologías altas entre Ppact1 y
Fhact1 y entre Ppact3 y Fhact5. En ambos casos, las secuencias
intrónicas mostraron una inusual alta conservación. En el caso de
Ppact1 y Phact1, las homologías fueron de la manera siguiente:
intrón del extremo 5':58%; intrón1:64%, intrón2: 52% e intrón3:55%.
En el caso de Ppact3 y Fhact5, las homologías son para el intrón del
extremo 5' (51%) y el intrón1 muestra una identidad del 48%.
Para ambos casos, también las secuencias
promotoras del extremo 5' aisladas, muestran altas homologías. La
Figura 19A muestra una comparación esquemática de las regiones
promotoras aisladas de Ppact1 y Fhact1. Se dice que el inicio de la
transcripción está en la posición 1, y se dice que el primer nt de
la región promotora del extremo 5' es -1. Las 267 pares de bases
aisladas de la región promotora del extremo 5' de Fhact1 muestran
una homología total sobre los primeros 267 pares de bases de la
región promotora del extremo 5' de Ppact1 del 58%. Dentro de esta
secuencia existen bloques observables de distintas homologías. La
secuencia entre -267 y -129 muestra una homología del 51%. Los
siguientes 29 pares de bases muestran un 62% de identidad y dentro
de la posición -100 y -1 la homología es casi del 70%. Con respecto
a estas altas identidades secuenciales entre las secuencias
promotoras e intrónicas de Fhact1 y Ppact1, es razonable situar
estos dos genes como los genes homólogos en estos dos líquenes.
Otro interesante aspecto es la observación de la disminución de la
expresión que se observó entre los distintos constructos de deleción
Ppact1:vegf (Fig 15). La importante disminución de la expresión
parece estar entre los constructos de deleción -237 y -82. Esto
sugiere una función importante de la región promotora del extremo
5' entre -129 y -1, pues en este caso la secuencia de las regiones
promotoras de Ppact1 y Fhact1 está muy conservada como se acaba de
mencionar, y el constructo de deleción de -82 no contiene la
totalidad de la secuencia altamente conservada, pero el constructo
de deleción de -237, la contiene.
Asimismo, pueden observarse regiones altamente
conservadas en el interior de los promotores de Ppact3 y Fhact5. En
este caso, las regiones promotoras para ambos genes aislados, son
mucho más largas. Incluso, entre las dos regiones promotoras del
extremo 5', se encuentran más regiones homológicas (Fig 19B). En
este caso, las regiones promotoras de Ppact3 desde -1 a -2270 y de
Fhact5 desde -64 a -2325 muestran algunas características
homológicas interesantes. La diferencia en la posición de TS podría
deberse al hecho de que el 5'UTR de Fhact5 se determinó
experimentalmente y el de Ppact3 se determinó analizando los EST a
partir de las bases de datos.
La secuencia de Ppact3 entre -2270 y -1876
muestra sólo una homología escasa del 29% con respecto a la misma
área secuencial de Fhact5 localizada entre -2325 y -1948. Entonces,
sigue una región prolongada de alrededor de 1100 nt, que muestra
una homología muy alta del 82%. Los próximos 140 nt de Ppact3 y 152
nt del promotor de Fhact5 muestran "sólo" una homología del
53%. La secuencia de Ppact3 que se localiza entre -641 y -463
muestra otra vez una alta conservación del 76% con respecto a la
región entre -705 y -528 de Fhact5. La siguiente (secuencia)
alrededor de 180 nt muestra otra vez una escasa homología del 53%.
Los últimos 288 pares de bases de la secuencia promotora de Ppact3
presentan entonces, otra vez, más homología, con el 73%, con
respecto a las próximas 280 pares de bases de Fhact5. Estas
regiones de distintos grados de homologías entre los dos genes
homólogos, podrían indicar la presencia de elementos activos
reguladores en el interior de la región promotora del extremo
5'.
Como para el caso de Ppact1 y Fhact1, también en
este caso el análisis de la expresión de los distintos constructos
de deleción Ppact3:vrgf es interesante en este contexto (Fig 17). En
este caso se observó un aumento significativo del nivel de
expresión del vegf de los constructos de deleción de -2210, -995,
-821, comparados con el constructo de deleción de -523. Los tres
constructos de deleción que contienen por lo menos partes de la
región homóloga prolongada entre -1876 y -779 que se encontró en
Ppact3 y Fhact5, alcanzaron niveles de alrededor de los del
promotor 35S, mientras que el constructo de deleción de -523 mostró
un aumento de dos veces y media de la expresión, comparado con el
promotor 35S, o de los constructos de deleción más largos. Esto
podría sugerir la presencia de un regulador negativo en el interior
de esta región de un 82% de homología entre Ppact3 y Fhact5.
En el caso de Marchantia, no pudieron
encontrarse homologías secuenciales comparables entre los distintos
genes de actina de Physcomitrella y Funaria.
Para el gen Fhact5, se preparó un constructo que
contenía 1157 pares de bases de la región no transcrita del extremo
5', fusionada con el hVEGF ADNc, que se utilizó para experimentos de
transformación transitoria sobre los protoplastos de
Physcomitrella. La cantidad de proteína detectada en este
caso fue del mismo orden, pero ligeramente más alta (hasta 2 veces)
que con el promotor CaMV 35S. El gen Fhact5 presenta la homología
más alta para el gen PpAct3, y, de forma interesante, ambos
promotores mostraron una actividad similar en los protoplastos de
Physcomitrella durante los ensayos transitorios.
Las casettes que contenían Ppact1, Ppact5 y
Ppact7 5' MEPR gobernando la expresión del VEGF ADNc se introdujeron
en el genoma de las plantas de Physcomitrella. Para cada uno
de los MEPR, se recuperaron de 5 a 10 plantas transformadas
establemente, que se ensayaron con respecto a la expresión de
rhVEGF. Para estos tres MEPR que se ensayaron, en los sobrenadantes
de los cultivos en los que las plantas se estaban desarrollando
(medio Knop estándar), se detectó rhVEGF derivado de los líquenes
en los que se había expresado y secretado, indicando que los MEPR
promueven la expresión proteica bajo condiciones de no inducción
(condiciones estándar), cuando se integran en otras partes del
genoma. La cantidad de proteína que pudo medirse en estas progenies
fue del orden de 7 ng de VEGF/mg de peso seco del liquen, hasta 53
ng de VEGF/mg de peso seco del liquen, dependiendo del constructo y
de la progenie estable.
Una cepa transgénica liquénica que contenía VEGF
ADNc bajo control de Ppact5, se utilizó para llevar a cabo cultivos
en el bioreactor. La cantidad de VEGF recombinante que se derivó del
liquen en el sobrenadante del cultivo del bioreactor, medida
mediante ELISA, fue de 40-50 ng de VEGF/mg de peso
seco del liquen.
\vskip1.000000\baselineskip
Aprovechando la presencia de varias secuencias
EST que correspondían a genes de poliubiquitina de
Physcomitrella, se diseñaron oligonucleótidos específicos
para aislar las correspondientes secuencias genómicas de la EST que
se encontraba presente de forma más abundante de la secuencia
homóloga del gen de la ubiquitina en las bases de datos, denominada
Ppubq1. 2146 pares de bases de la región del extremo 5' de Ppubq1
pudieron identificarse mediante iPCR. Un conductor del extremo
5'transcrito de 129 pares de bases, se encuentra antes de que se
inicie el ORF, determinado por técnicas RACE del extremo 5'. La
región del extremo 5' de Ppubq1 se amplificó mediante PCR sobre el
ADN genómico de Physcomitrella patens, utilizando los
iniciadores 777 y 602.
Se construyeron vectores que contenían distintas
partes del promotor y del gobierno de la expresión de la región
5'UTR del hVEGF ADNc, para analizar la actividad del promotor
durante la transformación transitoria de los protoplastos de
Physcomitrella.
Los resultados indicaron una actividad similar
para este promotor con respecto al promotor Ppact5 (o incluso
mayor). Los constructos que se ensayaron, fragmentos de 1,6 Kb y 1,3
Kb del promotor, alcanzaron niveles de expresión de alrededor de 4
veces y casi de 7 veces más altos que los de CaMV 35S.
El gen de la ubiquitina de Funaria,
Fhubq1, se identificó llevando a cabo una amplificación rápida
mediante PCR del extremo 5' del ARN total de Funaria, con un
iniciador derivado de la secuencia codificante de Ppubq1. Se
utilizaron la secuencia aislada de 5' UTR y la secuencia parcial
codificante para diseñar iniciadores para iPCR sobre uniones
genómicas de Funaria hygrometrica. De esta forma, se
identificó la secuencia de 5' UTR (situada) por encima del extremo
5'. La región del extremo 5' se amplificó mediante PCR sobre el ADN
genómico de Funaria hygrometrica, utilizando los iniciadores
943 y 944.
\vskip1.000000\baselineskip
Como candidatos putativos próximos a los genes
de actina, tubulina y ubiquitina, se consideraron los genes rbcS,
de pequeñas subunidades de
ribulosa-1,5-bifosfato
carboxilasa/oxigenasa. Los distintos genes rbcS están codificados
en el genoma nuclear. Los genes rbcS pertenecen a una familia de
genes. Los genes rbcS se expresan básicamente en todas las partes
verdes de las plantas que sean capaces de fijar el Co_{2}. Por
tanto, esta familia de genes es de interés para obtener las
regiones promotoras de expresión que franquean a los extremos 5'y
3'de los distintos genes rbcS de los diferentes líquenes. Como
primer paso, se analizaron las bases de datos EST de
Physcomitrella. Se encontró que los genes rbcS de
Physcomitrella patens se organizan en una familia génica,
que comprende 12 genes. Los EST de los genes rbcS que se encuentran
más abundantemente, denominados PprbcS12, se tomaron como
candidatos para encontrar las secuencias promotoras de la expresión
de los extremos 5' y 3'. Empezando con los datos secuenciales de
EST, se identificaron mediante iPCR las regiones franqueantes de
los extremos 5' y 3', secuenciándose las regiones clonadas 5' y 3'.
La región del extremo 5' se amplificó mediante PCR sobre el ADN
genómico de Physcomitrella patens, utilizando los iniciadores
839 y 858. La región del extremo 3' se amplificó mediante PCR
utilizando los iniciadores 904 y 901.
En el Listado de Secuencias que se adjunta, se
proporcionan las secuencias siguientes (SEC ID nº/nombre de
la secuencia/región del extremo 5' o del extremo 3' relativa a la
región codificante proteica) :
1 Pptub1 5'
2 Pptub1 3'
3 Pptub2 5'
4 Pptub2 3'
5 Pptub3 5'
6 Pptub3 3'
7 Pptub4 5'
8 Pptub4 3'
9 Ppact1 5'
10 Ppact1 3'
11 Ppact3 5'
12 Ppact3 3'
13 Ppact5 5'
14 Ppact5 3'
15 Ppact7 5'
16 Ppact7 3'
17 Fhact1 5'
18 Fhact1 3'
19 Fhact4.4 5'
20 Fhact5 5'
21 Mpact1 5'
22 Mpact4 5'
23 Mpact15 5'
24 Ppubq1 5'
25 Fhubq1 5'
26 PprbcS12 5'
27 PprbcS12 3'
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siguiente)
Altschul et al., Nucleic Acids
Research 25 (1997), 3389-3402.
Berlin et al., Genetic
modification of plant secondary metabolism: Alteration of product
levels by overexpression of amino acid decarboxylases, in: Advances
in Plant Biology, Studies in Plant Science, Vol. 4, pp
57-81, DdY Ryu and S Furasaki (eds),
Elsevier, Amsterdam 1994.
Cove et al. Trends Plant
Sci. 2 (1997), 99-105
Engel, Am. J. Bot. 55
(1968), 438-446
EP 1 206 561 A
Frahm"Biologie der Moose"
(2001), Spektrum Akad. Verlag
Gorr (1999) Biotechnologische
Nutzung von Physcomitrella patens (Hedw.) B.S.G..
Dissertation, Universitat Hamburg.
Grimsley et al., Mol. Gen.
Genet. 154 (1977), 97-100
Hiwatashi et al., Plant J.
28 (1) (2001), 105-116
Hohe et al., Plant Sci. 163
(2002), 69-74
Holtdorf et al., Plant Cell
Rep. 21 (2002), 341-346
Liebich et al., Nucleic Acids
Research 30 (2002), 3433-3442.
McElroy et al., Mol. Gen.
Genet. 231 (1991), 150-160
Reski et al., Planta 165
(1985), 354-358
Reski et al., Mol. Gen.
Genet. 244 (1994), 352-359
Reski, Botanica Acta III
(1998), 1-15
Reski, Planta 208 (1999),
301-309
Reutter et al., Plant Tissue
Culture and Biotechnology 2 (1996),
142-147
Richter et al., Gene 290
(2002), 95-105
Rothnie et al., Plant Mol
Biol. 32 (1996), 43-61.
Rother et al., J. Plant
Physiol. 143 (1994), 72-77
Sambrook et al. (1989),
Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edn. Cold Spring
Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press
Schaefer et al., Mol Gen
Genet 226 (1991), 418-424
Schaefer (2001) Principles and
protocols for the moss Physcomitrella patens.
http://www.unil.ch/lpc/docs/
PPprotocols2001.pdf
PPprotocols2001.pdf
Schaefer, Annu. Rev. Plant Biol.
53 (2002), 477-501
Schlink et al., Plant Mol.
Biol. Rep. 20 (2002), 423a-423f
Strepp et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 95 (1998), 4368-4373
Töpfer et al., NAR 15
(1987), 5890
Watson et al., "Recombinant
DNA" (1992), Chapter I.1 y 2
Zeidler et al., J. Plant
Physiol. 154 (1999), 641-650
\global\parskip0.000000\baselineskip
<110> greenovation Biotech GmbH
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<120> Regiones que favorecen la expresión
de briófitos
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<130> R 42095
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<160> 27
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<170> Patente en versión 3.1
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<210> 1
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<211> 1533
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<212> ADN
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<213> Physcomitrella patens
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<400> 1
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<210> 2
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<211> 1539
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<212> ADN
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<213> Physcomitrella patens
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<400> 2
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<210> 3
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<211> 1197
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<212> ADN
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<213> Physcomitrella patens
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<400> 3
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<210> 4
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<211> 1012
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<212> ADN
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<213> Physcomitrella patens
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<400> 4
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<210> 5
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<211> 1386
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<212> ADN
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<213> Physcomitrella patens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
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<211> 997
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<212> ADN
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<213> Physcomitrella patens
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<400> 6
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<210> 7
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<211> 624
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Physcomitrella patens
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 7
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<210> 8
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<211> 1146
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<212> ADN
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<213> Physcomitrella patens
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<400> 8
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<210> 9
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<211> 2973
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<212> ADN
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<213> Physcomitrella patens
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 9
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
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<211> 1128
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Physcomitrella patens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
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<211> 3035
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<212> ADN
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<213> Physcomitrella patens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
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<211> 1221
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Physcomitrella patens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3060
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Physcomitrella patens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1).. (2301)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> a, t, g o c
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4124
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Physcomitrella patens
\newpage
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<400> 14
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<210> 15
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<211> 3053
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Physcomitrella patens
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1879
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Physcomitrella patens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
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<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1823
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Funaria hygrometrica
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 17
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<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 419
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Funaria hygrometrica
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
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<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1333
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Funaria hygrometrica
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 19
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\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3289
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Funaria hygrometrica
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 21
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<211> 937
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Marchantia polymorpha
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3025
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Marchantia polymorpha
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 909
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Marchantia polymorpha
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2146
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Physcomitrella patens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 524
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Funaria hygrometrica
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2088
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Physcomitrella patens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 500
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Physcomitrella patens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (17)
1. Molécula de ácido nucleico aislada que
codifica una región promotora de la expresión de un liquen (MEPR),
caracterizada porque la MEPR se selecciona de entre las
SEC.ID nº 1 a 27, o de sus fragmentos promotores de la
expresión.
2. Moléculas de ácido nucleico aisladas según la
reivindicación 1, caracterizadas porque comprenden asimismo
una región codificante para un producto polipeptídico recombinante,
estando dicha región codificante bajo el control de la MEPR.
3. Moléculas de ácido nucleico aisladas según la
reivindicación 1 ó 2, caracterizadas porque comprenden
asimismo un marcador de selección.
4. Moléculas de ácido nucleico aisladas según la
reivindicación 1 ó 2, caracterizadas porque comprenden
asimismo unas secuencias que son homólogas a las secuencias
genómicas de las especies que van a transformarse, permitiendo por
tanto, en estas especies, la integración dirigida.
5. Moléculas de ácido nucleico aisladas según la
reivindicación 1, caracterizadas porque está prevista como
molécula antisentido o ribozímica.
6. Procedimiento para la expresión de un
producto polipéptido recombinante en una célula huésped eucariótica,
que comprende las siguientes etapas:
- -
- proporcionar un vehículo de clonación del ADN recombinante que comprende una molécula de ácido nucleico aislada que codifica una MEPR según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, y opcionalmente, una región codificante para dicho producto polipeptídico recombinante, estando dicha secuencia codificante bajo el control de la MEPR de dicha molécula de ácido nucleico en dicho huésped,
- -
- transformar dicha célula huésped eucariótica que naturalmente no aloja dicha secuencia codificante, de forma que esté bajo el control de dicha MEPR,
- -
- cultivar la célula huésped eucariótica transformada en un medio de cultivo apropiado,
- -
- permitir la expresión de dicho polipéptido recombinante y
- -
- aislar el polipéptido recombinante expresado.
7. Procedimiento según la reivindicación 6,
caracterizado porque dicha célula huésped eucariótica se
selecciona de entre células vegetales, preferentemente de células
liquénicas, en particular células de Physcomitrella
patens.
8. Procedimiento según la reivindicación 6 ó 7,
caracterizado porque dicha célula huésped es una célula del
tejido protonémico liquénico.
9. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 6 a 8, caracterizado porque el medio de
cultivo está libre de sus fitohormonas añadidas.
10. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 6 a 9, caracterizado porque la célula
selecciona de entre células liquénicas de los grupos
Physcomitrella, Funaria, Sphagnum, Ceratodon,
Marchantia y Sphaerocarpos.
11. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 6 a 10, caracterizado porque la célula
huésped expresa dicho producto polipeptídico recombinante de forma
transitoria.
12. Utilización de una molécula de ácido
nucleico aislada que codifica una MEPR según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, para producir industrialmente un
polipéptido, en particular para proporcionar células recombinantes
que produzcan dicho polipéptido.
13. Utilización de una molécula de ácido
nucleico aislada que codifica una MEPR según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, para la expresión de un polipéptido
liquénico, no estando controlada naturalmente la expresión de dicho
polipéptido liquénico mediante dicha MEPR, en particular para
proporcionar células liquénicas recombinantes que expresen dicho
polipéptido.
14. Utilización de una molécula de ácido
nucleico aislada que codifica una MEPR según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5 para el rastreo y definición de secuencias
de consenso para la expresión de regiones promotoras.
15. Utilización de una molécula de ácido
nucleico aislada que codifica una MEPR según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5 para la expresión recombinante de proteínas
de modificación postraduccional, preferentemente para la producción
de proteínas modificadas de manera postraduccional.
16. Utilización de una molécula de ácido
nucleico aislada que codifica una MEPR según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, para la expresión in vitro de
proteínas recombinantes.
17. Utilización de una molécula de ácido
nucleico aislada que codifica una MEPR según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, para la expresión recombinante de proteínas
que modifican el metabolismo.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP03450184A EP1510584B1 (en) | 2003-08-11 | 2003-08-11 | Expression promoting sequences from mosses and their uses |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2322140T3 true ES2322140T3 (es) | 2009-06-17 |
Family
ID=34089803
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES03450184T Expired - Lifetime ES2322140T3 (es) | 2003-08-11 | 2003-08-11 | Secuencias promotoras de la expresion de liquines y sus utilizaciones. |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US7538259B2 (es) |
| EP (2) | EP1510584B1 (es) |
| JP (1) | JP4750028B2 (es) |
| KR (1) | KR101125448B1 (es) |
| CN (3) | CN101962643A (es) |
| AT (1) | ATE426033T1 (es) |
| AU (1) | AU2004262676B2 (es) |
| CA (1) | CA2533860C (es) |
| DE (1) | DE60326716D1 (es) |
| ES (1) | ES2322140T3 (es) |
| WO (1) | WO2005014807A2 (es) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ES2348857T3 (es) | 2005-07-12 | 2010-12-03 | Greenovation Biotech Gmbh | Mejoras en o relacionadas con la produccion de proteinas. |
| CN103709241B (zh) * | 2014-01-02 | 2015-11-18 | 中国农业科学院生物技术研究所 | 来源于苔藓植物的抗旱蛋白PpLEA3-25及其编码基因和应用 |
| CA2962852A1 (en) | 2017-03-31 | 2018-09-30 | Chuanxin Sun | Carbohydrate producing plant material |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6047683A (ja) * | 1983-08-24 | 1985-03-15 | Kirin Brewery Co Ltd | プロモ−タ− |
| WO1999050428A2 (en) * | 1998-04-01 | 1999-10-07 | Mogen International N.V. | Pathogen-inducible promoter |
| AT408446B (de) | 1999-02-18 | 2001-11-26 | Altmann Friedrich Dr | Fucosyltransferase-gen |
| DE19947290A1 (de) | 1999-10-01 | 2001-04-19 | Greenovation Pflanzenbiotechno | Verfahren zur Herstellung proteinöser Substanzen |
| AT409381B (de) | 2000-03-03 | 2002-07-25 | Gloessl Josef Dr | Xylosyltransferase-gen |
-
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