CN103709241B - 来源于苔藓植物的抗旱蛋白PpLEA3-25及其编码基因和应用 - Google Patents

来源于苔藓植物的抗旱蛋白PpLEA3-25及其编码基因和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种来源于苔藓植物的抗旱蛋白PpLEA3-25及其编码基因和应用。本发明提供的蛋白质，来自小立碗藓（Physcomitrella？patens），命名为PpLEA3-25蛋白，是如下（a）或（b）：（a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（b）将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗旱能力相关的由序列1衍生的蛋白质。PpLEA3-25蛋白及其编码基因可以提高植物的耐旱性。本发明对培育抗旱植物新品种，特别是培育抗旱水稻新品种具有重要的理论及实际意义。

Description

来源于苔藓植物的抗旱蛋白PpLEA3-25及其编码基因和应用
技术领域
本发明涉及一种来源于苔藓植物的抗旱蛋白PpLEA3-25及其编码基因和应用。
背景技术
自然环境中的干旱、盐碱、低温等胁迫因素对植物的生长发育有重要影响，严重时会造成农作物大规模减产，培育耐逆性作物是种植业的主要目标之一。当前，通过基因工程育种获得具有耐逆性的作物品种是一种行之有效的方法，而该方法中最关键的技术瓶颈问题是有效抗逆基因的筛选与功能发现。
苔藓植物是5亿年前古奥陶纪出现的陆地先锋植物，其生活史中以“茎叶体”的配子体为主要营养生长阶段。“茎叶体”叶片由单层细胞组成，仅在其“中肋”处由少数几层细胞组成，无输导组织和气孔等调控水分代谢的组织结构，保留着明显的水生植物的特征。由于缺乏水分输导和调控系统，因此，当原始“苔藓植物”离水登陆时，必然首先面对两大胁迫：水分亏损、温度骤变。巨大的选择压力迫使苔藓植物进化出不同于“维管植物”（蕨类、种子植物）的逆境应对机制。
发明内容
本发明的目的是提供一种来源于苔藓植物的抗旱蛋白PpLEA3-25及其编码基因和应用。
本发明提供的蛋白质，来自小立碗藓（Physcomitrellapatens），命名为PpLEA3-25蛋白，是如下（a）或（b）：（a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（b）将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗旱能力相关的由序列1衍生的蛋白质。
为了使（a）中的蛋白质便于纯化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
表1标签的序列
标签 残基 序列
Poly-Arg 5-6（通常为5个） RRRRR
Poly-His 2-10（通常为6个） HHHHHH
FLAG 8 DYKDDDDK
Strep-tag II 8 WSHPQFEK
c-myc 10 EQKLISEEDL
上述（b）中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述（b）中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。
编码PpLEA3-25蛋白的基因（PpLEA3-25基因）也属于本发明的保护范围。
所述PpLEA3-25基因具体可为如下（1）或（2）或（3）或（4）或（5）的DNA分子：（1）编码区如序列表的序列2自5’末端第718-1344位核苷酸所示的DNA分子；（2）序列表的序列2自5’末端第685-1447位核苷酸所示的DNA分子；（3）序列表的序列2所示的DNA分子；（4）在严格条件下与（1）或（2）或（3）限定的DNA序列杂交且编码植物抗旱相关蛋白的DNA分子；（5）与（1）或（2）或（3）限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且编码植物抗旱相关蛋白的DNA分子。上述严格条件可为在6×SSC，0.5%SDS的溶液中，在65oC下杂交，然后用2×SSC、0.1%SDS和1×SSC、0.1%SDS各洗膜一次。
含有所述PpLEA3-25基因的表达盒、重组载体、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。
可用现有的表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。所述表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。使用所述基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，它们可单独使用或与其它的启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于进行鉴定及筛选，可对所述重组表达载体进行加工，如加入编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。所述重组载体具体可为重组质粒PpLEA3-25-pCambia1390-UBI。重组质粒PpLEA3-25-pCambia1390-UBI：以植物双元表达载体pCambia1390为骨架载体，在其多克隆位点分别插入序列3所示的双链DNA分子（HindIII和KpnⅠ酶切位点），和序列表的序列2自5’末端第685-1447位核苷酸所示的双链DNA分子（BamHI和SpeI酶切位点），且由序列3所示双链DNA分子启动序列2自5’末端第718-1344位核苷酸所示的DNA分子的表达。
本发明还保护一种培育转基因植物的方法，是将所述PpLEA3-25基因导入目的植物中，得到抗旱能力高于所述目的植物的转基因植株。所述方法中，携带有所述PpLEA3-25基因的重组表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。所述PpLEA3-25基因具体可通过所述重组质粒PpLEA3-25-pCambia1390-UBI导入所述目的植物中。所述目的植物为单子叶植物或双子叶植物。所述单子叶植物具体为水稻，如水稻品种日本晴。
本发明还保护所述PpLEA3-25蛋白、所述PpLEA3-25基因或所述重组载体在培育抗旱植物中的应用。所述植物为单子叶植物或双子叶植物。所述单子叶植物具体为水稻，如水稻品种日本晴。
本发明从苔藓植物中发现了PpLEA3-25蛋白及其编码基因。将PpLEA3-25基因导入野生型水稻（日本晴），在干旱胁迫实验中，转基因植株的生长状态明显好于出发植株以及转空载体对照植株，即PpLEA3-25蛋白及其编码基因可以提高植物的耐旱性。本发明对培育抗旱植物新品种，特别是培育抗旱水稻新品种具有重要的理论及实际意义。
附图说明
图1为重组质粒PpLEA3-25-pCambia1390-UBI的部分元件示意图。
图2为转基因植株的分子鉴定结果。
图3为转基因植株和出发植株的表型图片。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。植物双元表达载体pCambia1390：Cambia,Queensland.Australia。农杆菌AGL1：北京鼎国生物技术有限责任公司。水稻品种日本晴(OryzasativaL.ssp.Japonica)，用CK表示：中国水稻杂交育种中心(中国，长沙)。小立碗藓（Physcomitrellapatens）：参考文献：耿旭珂等，2008植物基因打靶——模式植物小立碗藓的应用，生物学通报，43（4）：13-15。
实施例1、PpLEA3-25蛋白及其编码基因的发现
1、在BCD培养基上培养小立碗藓。
2、将茎叶体置于浸湿的滤纸上，放入500ml烧杯，用吸水纸封口，24±1℃培养。
3、干旱处理：取原丝体，放入铺有干燥滤纸的结晶皿中，用封口膜封口，24±1℃培养3天（可以观察到，脱水程度达90%以上）；正常对照：取原丝体，放入铺有湿润滤纸的结晶皿中，用封口膜封口，24±1℃培养3天。
4、分别取步骤3和步骤4中的茎叶体，提取总蛋白并进行IEF/SDS-PAGE双向电泳（2DE）和荧光差异凝胶电泳（DIGE），分离干旱条件下丰度变化超过2倍的蛋白质点，将所有的差异蛋白点分别用胰蛋白酶处理，所获多肽用质谱仪（MALDITOF/TOFMS）鉴定，发现一个在干旱条件下上调了10倍的蛋白质。
5、在氨基酸序列的基础上设计引物，然后以干旱处理后的小立碗藓茎叶体的cDNA为模板扩增靶序列，得到编码该蛋白质的核苷酸序列。
将得到的蛋白质命名为PpLEA3-25蛋白，如序列表的序列1所示。将编码PpLEA3-25蛋白的基因命名为PpLEA3-25基因，如序列表的序列2所示（第718-1344位为开放阅读框）。
实施例2、转基因植物的获得和鉴定
一、中间载体的构建
将序列表中序列3所示的玉米Ubiquitin启动子正向插入植物双元表达载体pCambia1390的HindIII和KpnⅠ酶切位点之间，得到中间载体pCambia1390-Ubi。
二、重组质粒的构建
1、提取干旱处理（连续15天未浇水）的小立碗藓茎叶体的总RNA并反转录为cDNA。
2、以步骤1得到的cDNA为模板，用F1和R1组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
F1：5’-GGATCCAGAGAGCAGTAGGCGAACAG-3’；
R1：5’-ACTAGTTGGGCACTCAACATAGGTTTC-3’。
3、用限制性内切酶BamHI和SpeI双酶切步骤2得到的PCR扩增产物，回收酶切产物。
4、用限制性内切酶BamHI和SpeI双酶切中间载体pCambia1390-Ubi，回收约10kb的载体骨架。
5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接，得到重组质粒PpLEA3-25-pCambia1390-UBI。
根据测序结果，对重组质粒PpLEA3-25-pCambia1390-UBI进行结构描述如下：以植物双元表达载体pCambia1390为骨架载体，将HindIII和KpnⅠ酶切位点之间的小片段替换为了序列表的序列3所示的双链DNA分子，将BamHI和SpeI酶切位点之间的小片段替换为了序列表的序列2自5’末端第685-1447位核苷酸所示的双链DNA分子。重组质粒PpLEA3-25-pCambia1390-UBI的部分元件示意图见图1。重组质粒PpLEA3-25-pCambia1390-UBI具有卡纳霉素抗性基因和潮霉素抗性基因。
三、转基因植物的获得
1、将重组质粒PpLEA3-25-pCambia1390-UBI导入农杆菌AGL1，得到重组农杆菌。
2、取步骤1得到的重组农杆菌，重悬于液体共培养培养基（YEP液体培养基+100mg/L乙酰丁香酮，pH5.2），得到OD600nm=0.120-0.140的菌液。
3、取水稻品种日本晴的胚性愈伤组织，用步骤2得到的菌液室温侵染30分钟，然后将愈伤组织移到共培养培养基上，28℃避光培养3-4天。
共培养培养基：MS基本培养基＋2,4-D2mg/L＋CH0.4g/L＋植物凝胶phytagel3.6g/L+AS40mg/L。
4、完成步骤3后，将愈伤组织转移至选择培养基上，28℃避光培养10-15天，然后继代培养基上继代一次。
选择培养基：MS基本培养基＋2,4-D2mg/L＋CH0.4g/L＋植物凝胶phytagel3.6g/L+50mg/L潮霉素。
继代培养基：MS基本培养基＋2,4-D2mg/L＋CH0.4g/L＋植物凝胶phytagel3.6g/L。
5、完成步骤4后，挑取从原愈伤组织表面生长出来的新的抗性愈伤组织，转移到预分化培养基上，28℃避光培养7天。
预分化培养基：MS基本培养基＋ABA5mg/L+6-BA3mg/L＋CH0.1g/L＋植物凝胶phytagel3.6g/L。
6、完成步骤5后，取奶白色、表面光滑的愈伤组织转移到分化培养基上，28℃培养（先在黑暗下培养3天，然后在持续冷光照下培养15-20天）。
分化培养基：MS基本培养基＋6-BA3mg/L＋CH0.1g/L＋植物凝胶phytagel3.6g/L。
7、完成步骤6后，将幼苗转移到生根培养基上，28℃持续光照培养15天，生长状况良好的幼苗直接转移到大田种植，当年秋季收获种子，即为T0代种子。
生根培养基：MS基本培养基＋植物凝胶phytagel3g/L。
8、将T0代种子播种于含30mg/L潮霉素的MS筛选培养基，筛选抗性植株，4-6叶时移栽到大田中，单株收获种子，即为T1代种子。
9、将T1代种子播种于含30mg/L潮霉素的MS筛选培养基，筛选抗性植株，4-6叶时移栽到大田中，单株收获种子，即为T2代种子。
10、将T2代种子播种于含30mg/L潮霉素的MS筛选培养基，4-6叶时移栽到大田中，单株收获种子，即为T3代种子。
11、分别取T1代植株和T2代植株的叶片，提取基因组DNA并进行PCR鉴定（采用F1和R1组成的引物对，靶序列约770bp），对于某一T1代植株来说，如果其抽样检测的T2代植株均为PCR鉴定阳性，该T1代植株为纯合的转基因植株，该T1代植株及其自交后代为一个纯合的转基因株系。部分T1代植株的PCR鉴定结果见图2A。图2A中，M为分子量标记，NT为水稻品种日本晴（阴性对照），泳道1至泳道3为3个阳性植株，泳道4为一个阴性植株，5为重组质粒PpLEA3-25-pCambia1390-UBI（阳性对照）。
12、随机取4个纯合的转基因株系的T2代植株，取叶片并提取总RNA，将总RNA反转录得到cDNA，以cDNA为模板，采用F2和R2组成的引物对进行PCR鉴定（采用Actin1为参照基因），结果见图2B。图2B中，NT为水稻品种日本晴（阴性对照），泳道1、泳道2、泳道3、泳道5依次代表转基因株系1（简称株系1）、转基因株系2（简称株系2）、转基因株系3（简称株系3）、转基因株系5（简称株系5）。
F2：5′-GTAGGCGAACAGGGATTAAG-3′；
R2：5′-TCTGTTGGCTCCCTCTGGAAT-3′。
四、转空载体植物的获得
用中间载体pCambia1390-Ubi代替重组质粒PpLEA3-25-pCambia1390-UBI进行步骤三，得到转空载体植物。
五、转基因植物的鉴定
将4个纯合的转基因株系（株系1、株系2、株系3和株系5）的T3代植株，转空载体植物的T3代植株，水稻品种日本晴的植株分别进行如下鉴定（每个株系50株）：植株种植于营养土，生长1个月后（从播种开始计时）先浇水至饱和，然后停止浇水，从目测营养土干燥(通常停止浇水10-15天可以实现“目测营养土干燥”，本实施例中具体采用了停止浇水15天)开始记为干旱处理时间（干旱处理即不浇水），干旱处理20天后回复正常浇水（即复水）。
干旱处理10天后，水稻品种日本晴和转空载体植物植株萎蔫并叶片发黄，4个转基因株系植株缺水状况不明显。干旱处理20天后，水稻品种日本晴和转空载体植物植株叶片干枯，4个转基因株系植株叶片轻微萎蔫。复水后，水稻品种日本晴和转空载体植物植株大多不能复活，而4个转基因株系植株能够复活。
干旱处理前，植株的表型照片见图3A。复水10天后植株的表型照片见图3B。复水10天后，统计存活率，水稻品种日本晴为0%，转空载体植物为0%，株系1为40%，株系2为45%，株系3为50%，株系5为25%。
结果表明，与出发植株或转空载体植株相比，转基因植株有较强的抗旱性。

Claims (4)

1.一种培育转基因水稻的方法，是将编码序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的基因导入目的水稻中，得到抗旱能力高于所述目的水稻的转基因植株。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述基因为如下(1)或(2)或(3)的DNA分子：
(1)编码区如序列表的序列2自5’末端第718-1344位核苷酸所示的DNA分子；
(2)序列表的序列2自5’末端第685-1447位核苷酸所示的DNA分子；
(3)序列表的序列2所示的DNA分子。
3.序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质在培育抗旱水稻中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于：编码所述蛋白质的基因为如下(1)或(2)或(3)的DNA分子：
(1)编码区如序列表的序列2自5’末端第718-1344位核苷酸所示的DNA分子；
(2)序列表的序列2自5’末端第685-1447位核苷酸所示的DNA分子；
(3)序列表的序列2所示的DNA分子。
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