PL205710B1 - Sposoby otrzymywania rekombinowanych glikoprotein, sposób otrzymywania rekombinowanych roślinnych komórek gospodarza lub roślin z wytłumioną lub całkowicie wyłączoną produkcją GlcNAc-α1,3-fukozylotransferazy, sposób otrzymywania rekombinowanych roślinnych komórek gospodarza lub roślin, rekombinowane komórki roślinne, rekombinowane rośliny, sposób otrzymywania rekombinowanych komórek roślinnych z zablokowaną ekspresją GlcNAc-α1,3-fukozylotransferazy, sposoby otrzymywania rekombinowanych ludzkich glikoprotein, zwłaszcza do zastosowań medycznych oraz sposób selekcjonowania cząsteczek DNA - Google Patents

Sposoby otrzymywania rekombinowanych glikoprotein, sposób otrzymywania rekombinowanych roślinnych komórek gospodarza lub roślin z wytłumioną lub całkowicie wyłączoną produkcją GlcNAc-α1,3-fukozylotransferazy, sposób otrzymywania rekombinowanych roślinnych komórek gospodarza lub roślin, rekombinowane komórki roślinne, rekombinowane rośliny, sposób otrzymywania rekombinowanych komórek roślinnych z zablokowaną ekspresją GlcNAc-α1,3-fukozylotransferazy, sposoby otrzymywania rekombinowanych ludzkich glikoprotein, zwłaszcza do zastosowań medycznych oraz sposób selekcjonowania cząsteczek DNA

Info

Publication number
PL205710B1
PL205710B1 PL385768A PL38576800A PL205710B1 PL 205710 B1 PL205710 B1 PL 205710B1 PL 385768 A PL385768 A PL 385768A PL 38576800 A PL38576800 A PL 38576800A PL 205710 B1 PL205710 B1 PL 205710B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
sequence
fucosyltransferase
dna molecule
glcnac
dna
Prior art date
Application number
PL385768A
Other languages
English (en)
Inventor
Fridrich Altmann
Original Assignee
Altmann Friedrich
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=3486087&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=PL205710(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Altmann Friedrich filed Critical Altmann Friedrich
Publication of PL205710B1 publication Critical patent/PL205710B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12N9/1051—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/18—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a glycosyl transferase, e.g. alpha-, beta- or gamma-cyclodextrins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/005—Glycopeptides, glycoproteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8218—Antisense, co-suppression, viral induced gene silencing [VIGS], post-transcriptional induced gene silencing [PTGS]

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

Wynalazek dotyczy sposobów otrzymywania rekombinowanych glikoprotein w roślinach lub komórkach roślinnych, sposobu otrzymywania rekombinowanych roślinnych komórek gospodarza lub roślin z wytłumioną lub całkowicie wyłączoną produkcją GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazy, sposobu otrzymywania rekombinowanych roślinnych komórek gospodarza lub roślin, rekombinowanych komórek roślinnych lub roślin, sposobu otrzymywania rekombinowanych komórek roślinnych, które wykazują zablokowaną ekspresję GlcNAc-αΙ ,3-fukozylotransferazy na poziomie transkrypcji lub translacji, sposobu otrzymywania rekombinowanych ludzkich glikoprotein, zwłaszcza do zastosowań medycznych oraz sposobu selekcjonowania cząsteczek DNA kodujących GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazę w próbce.
Glikoproteiny wykazują różnorodność i kompleksowość jednostek węglowodanowych, przy czym skład i uporządkowanie węglowodanów jest charakterystyczne dla różnych organizmów. Jednostki oligosacharydowe glikoprotein posiadają wiele funkcji, i tak są one np. ważne w regulacji przemiany materii, pośredniczą we wzajemnym oddziaływaniu komórek, określają czasy trwania białek w układzie krążenia i są decydujące dla rozpoznania epitopów w reakcjach przeciwciało-antygen.
Glikozylacja glikoprotein rozpoczyna się w retikulum endoplazmatycznym (ER), gdzie oligosacharydy są wiązane poprzez wiązania N-glikozydowe do łańcucha bocznego asparaginy lub poprzez wiązania O-glikozydowe do łańcucha bocznego seryny lub treoniny. N-związane oligosacharydy posiadają wspólny rdzeń składający się z jednostki pentasacharydowej, która składa się z trzech reszt mannozowych i dwóch reszt N-acetyloglukozaminowych. W celu dalszej modyfikacji jednostek węglowodanowych białka są transportowane z ER do kompleksu Golgiego. Struktura N-związanych jednostek oligosacharydowych glikoprotein jest określana przez ich konformację i skład glikozylotransferaz przedziałów Golgiego, w których ulegają one obróbce.
Wykazano, że w kompleksie Golgiego pewnych komórek roślinnych i owadzich rdzeniowe jednostki pentasacharydowe są zastępowane ksylozą i a1,3-związaną fukozą (P. Lerouge i wsp. 1998 Plant Mol. Biol. 38, 31-48; Rayon i wsp. 1998 L. Exp. Bot. 49, 1463-1472). Powstający heptasacharyd „MMXF3 stanowi główny rodzaj oligosacharydu roślinnego (Kurosaka i wsp. 1991 J.Biol .Chem., 266, 4168-4172). Świadczą o tym np. peroksydaza chrzanowa, β-fruktozydaza z marchwi i lektyna z Erythrina cristagalli jak również fosfolipaza A2 z jadu pszczelego lub reszty a1,3-fukozy z glikoproteiny z błony neuronowej embrionów owadzich, które są związane z rdzeniem glikanowym. Struktury te definiuje się też jako kompleksowe N-glikany, ewentualnie mannozy lub są one określane jako skrócone N-glikany. Reszty α-mannozylowe mogą być następnie zastępowane przez GlcNAc, z którymi są związane galaktoza i fukoza, dzięki czemu powstaje struktura, która odpowiada ludzkiemu epitopowi Lewis-a (Melo i wsp., 1997, FEBS Lett. 415, 186-191; Fitchette-Laine i wsp. 1997 Plant J. 12, 1411-1417).
W ssaczych glikoproteinach nie występuje ani ksyloza ani a1,3-związana fukoza. Okazało się, że rdzeniowa a1,3-fukoza odgrywa ważną rolę w rozpoznawaniu epitopów przez przeciwciała, które są skierowane przeciwko roślinnym i owadzim N-związanym oligosacharydom (I.B.H. Wilson i wsp., Glycobiology Vol. 8, Nr. 7, S. 651-661, 1998) i dzięki temu wyzwalają w organizmie ludzkim lub zwierzęcym reakcje immunologiczne skierowane przeciwko tym oligosacharydom. Reszta a1,3-fukozy wydaje się być także główną przyczyną szeroko rozpowszechnionej krzyżowej reaktywności alergicznej między różnymi roślinnymi i owadzimi alergenami (Tretter i wsp., Int. Arch. Allergy Immunol. 1993; 102:259-266), i jest nazywana także „reaktywną krzyżową determinantą węglowodanową (CCD). W trakcie badania epitopów z pomidorów i pyłków traw ustalono również reszty a1,3-związanej fukozy jako wspólną determinantę, co wydaje się być przyczyną częstego wspólnego występowania u pacjentów alergii na pomidory i pyłek traw (Petersen i wsp. 1996, J. Allergy Clin. Immunol., Vol 98, 4; 805-814). CCD fałszują następnie przez częste występowanie alergicznych reakcji krzyżowych diagnozę alergii.
Takie reakcje immunologiczne, wyzwalane przez białka roślinne w ludzkim organizmie, są głównym problemem w zastosowaniu medycznym produkowanych w roślinach, rekombinowanych ludzkich białek. Aby obejść ten problem, należałoby zapobiec rdzeniowej α1,3-fukozylacji. Podczas badań wykazano, że oligosacharydy, które zamiast L-fukozy (6-deoksy-L-galaktozy) posiadają L-galaktozę, są nadal całkowicie aktywne biologicznie (E. Zablackis i wsp. 1996, Science, Vol 272). Zgodnie z innym badaniem wyizolowano mutanta rośliny Arabidopsis thaliana, który nie posiadał N-acetylo-glukozoaminowej transferazy I, która jest pierwszym enzymem w biosyntezie kompleksowych glikanów. Dzięki temu, biosynteza kompleksowych glikoprotein w tym mutancie została zaburzoPL 205 710 B1 na. Pomimo tego, te zmutowane rośliny są w stanie rozwijać się normalnie w określonych warunkach (A. Schaewen i wsp., 1993, Plant Physiol. 102; 1109-1118).
Aby świadomie obniżyć wiązanie rdzeniowej a1,3-fukozy w oligosacharydzie, bez jednoczesnego ingerowania w inne etapy glikozylacji, należałoby wykluczyć jedynie ten enzym, który jest bezpośrednio odpowiedzialny za tą specyficzną glikozylację, mianowicie rdzeniową a1,3-fukozylotransferazę. Została ona po raz pierwszy wyizolowana z fasoli Mung i scharakteryzowana, przy czym stwierdzono, że aktywność tego enzymu jest zależna od obecności nieredukujących końców GlcNAc (Staudacher i wsp., 1995, Glycoconjugate J. 12, 780-786). Transferaza ta, która występuje tylko u roślin i owadów, lecz nie występuje u człowieka i innych kręgowców, musiałaby być specyficznie inaktywowana lub hamowana, dzięki czemu białka produkowane w roślinnych komórkach lub roślinach ewentualnie także w komórkach owadzich lub owadach, nie zawierałyby już jak dotychczas tego wyzwalającego reakcje immunologiczne epitopu.
Praca Johna M. Burke „Clearing the way for ribozymes (Nature Biotechnology 15:414-415; 1997) dotyczy ogólnego sposobu działania rybozymów.
Praca Pooga i wsp. „Cell penetrating PNA constructs regulate galanin receptor levels and modify pain transmission in vivo (Nature Biotechnology 16:857-861; 1998) dotyczy ogólnie cząsteczek PNA a w szczególności cząsteczki PNA, która jest komplementarna wobec mRNA ludzkiego receptora galaninowego typu 1.
Dokument US 5 272 066 dotyczy sposobu zmiany eukariotycznych i prokariotycznych białek, aby przedłużyć ich krążenie in vivo. W tym celu zmieniane są związane oligosacharydy za pomocą różnych enzymów, między innymi również GlcNAc-a1 >3(4)-fukozylotransferazy.
Dokument EP 0 643 132 A1 dotyczy klonowania a1,3-fukozylotransferazy, która jest izolowana z ludzkich komórek (THP-1). Opisane w tym dokumencie łańcuchy węglowodanowe odpowiadają ludzkim oligosacharydom sjalo-Lewis a i sjalo-Lewis x. Specyficzność enzymu z ludzkich komórek jest całkiem inna niż fukozylotransferazy z komórek roślinnych.
Celem niniejszego wynalazku jest wykorzystanie sklonowanego i zsekwencjonowanego genu kodującego roślinną fukozylotransferazę, wektorów obejmujących ten gen, części DNA pochodzących z niego lub DNA zmienionego albo wywodzącego się z niego, do transfekcji jednym z tych komórek gospodarza lub gospodarza oraz opracowanie odpowiednich sposobów.
Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania rekombinowanych glikoprotein, polegający na tym, że obejmuje etapy, w których wytwarza się rekombinowane glikoproteiny w roślinach lub komórkach roślinnych, w których endogenna aktywność GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazy jest wytłumiona do poniżej 50% aktywności naturalnych roślin lub komórek roślinnych, przy czym GlcNAc-a1,3-fukozylotransferaza jest kodowana przez sekwencję DNA oznaczoną SEQ ID NO:1 z otwartą ramką odczytu od pary zasad 211 do pary zasad 1740, albo która wykazuje co najmniej 50% identyczność z tą sekwencją lub hybrydyzuje w ostrych warunkach z tą sekwencją lub obejmuje sekwencję, która ze względu na kod genetyczny zdegenerowała do tej sekwencji DNA, przy czym ta sekwencja koduje białko roślinne o aktywności fukozylotransferazy lub jest komplementarna do niej.
Korzystnie w sposobie tym wytwarza się ludzkie białka, zwłaszcza białka do zastosowania medycznego.
Korzystnie endogenna aktywność GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazy jest niższa niż 20% aktywności GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazy naturalnych roślin lub komórek roślinnych.
Korzystnie endogenna aktywność GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazy wynosi 0% aktywności GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazy naturalnych roślin lub komórek roślinnych.
Korzystnie wytłumienie endogennej aktywności GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazy następuje poprzez hamowanie antysensownym RNA, przy czym stosuje się polinukleotyd, który jest co najmniej częściowo komplementarny do sekwencji DNA GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazy.
Korzystnie wytłumienie endogennej aktywności GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazy następuje poprzez mutację knock-out sekwencji DNA GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazy.
Przedmiotem wynalazku jest także sposób otrzymywania rekombinowanych roślinnych komórek gospodarza z wytłumioną lub całkowicie wyłączoną produkcją GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazy, polegający na tym, że do komórki gospodarza wprowadza się przynajmniej jeden wektor zawierający cząsteczkę DNA, która zawiera mutację w postaci delecji, insercji i/lub substytucji, uniemożliwiającą ekspresję aktywnej endogennej fukozylotransferazy, przy czym taka cząsteczka DNA 1) obejmuje sekwencję według SEQ ID NO:1 z otwartą ramką odczytu od pary zasad 211 do pary zasad 1740 lub wykazuje przynajmniej 50% identyczność z tą sekwencją lub hybrydyzuje w ostrych warunkach z tą
PL 205 710 B1 sekwencją lub sekwencję, która ze względu na kod genetyczny zdegenerowała do tej sekwencji DNA, przy czym ta sekwencja koduje białko roślinne o aktywności fukozylotransferazy lub jest komplementarna do niej, albo 2) obejmuje częściową sekwencję cząsteczki DNA kodującej białko roślinne o aktywności fukozylotransferazy, wykazującą przynajmniej 80% identyczność z sekwencją według SEQ ID NO:1 i mającą wielkość od 20 do 200, zwłaszcza 30 do 50 par zasad, albo 3) obejmuje sekwencję według SEQ ID NO:3 lub sekwencję, która wykazuje przynajmniej 85%, zwłaszcza przynajmniej 95% identyczność z tą sekwencją lub hybrydyzuje w ostrych warunkach z tą sekwencją lub obejmuje sekwencję, która ze względu na kod genetyczny zdegenerowała do tej sekwencji DNA, albo 4) koduje rybozym posiadający dwa odcinki sekwencji, każdy o długości przynajmniej 10 do 15 par zasad, które są komplementarne do odcinków sekwencji cząsteczki DNA kodującej białko roślinne o aktywności fukozylotransferazy określonej w punkcie 1), przez co rybozym przyłącza i tnie mRNA, które jest produktem transkrypcji naturalnej cząsteczki DNA GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazy, przy czym ewentualnie cząsteczka DNA w wektorze ma orientację przeciwną wobec promotora.
Korzystnie stosuje się wektor zawierający cząsteczkę DNA, która koduje białko o aktywności GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazy, zwłaszcza o aktywności rdzeniowej a1,3-fukozylotransferazy.
Korzystnie stosuje się wektor zawierający cząsteczkę DNA, która wykazuje przynajmniej 70-80%, zwłaszcza przynajmniej 95%, identyczność z sekwencją według SEQ ID NO:1.
Korzystnie stosuje się wektor zawierający cząsteczkę DNA, która obejmuje pary zasad 2150 do 2250, zwłaszcza 2198 sekwencji według SEQ ID NO: 1.
Korzystnie stosuje się wektor zawierający cząsteczkę DNA, która jest związana kowalencyjnie z odpowiednią wykrywalną substancją znacznikową.
Przedmiotem wynalazku jest również sposób otrzymywania rekombinowanych roślin z wytłumioną lub całkowicie wyłączoną produkcją GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazy, polegający na tym, że do rośliny wprowadza się przynajmniej jeden wektor zawierający cząsteczkę DNA zawierającą mutację w postaci delecji, insercji i/lub substytucji, która uniemożliwia ekspresję aktywnej endogennej fukozylotransferazy, przy czym taka cząsteczka DNA 1) obejmuje sekwencję według SEQ ID NO: 1 z otwartą ramką odczytu od pary zasad 211 do pary zasad 1740 lub wykazuje przynajmniej 50% identyczność z tą sekwencją lub hybrydyzuje w ostrych warunkach z tą sekwencją lub sekwencję, która ze względu na kod genetyczny zdegenerowała do tej sekwencji DNA, przy czym ta sekwencja koduje białko roślinne o aktywności fukozylotransferazy lub jest komplementarna do niej, albo 2) obejmuje częściową sekwencję cząsteczki DNA kodującej białko roślinne o aktywności fukozylotransferazy, wykazującą przynajmniej 80% identyczność z sekwencją według SEQ ID NO:1 i mającą wielkość od 20 do 200, zwłaszcza 30 do 50 par zasad, albo 3) obejmuje sekwencję według SEQ ID NO:3 lub sekwencję, która wykazuje przynajmniej 85%, zwłaszcza przynajmniej 95% identyczność z tą sekwencją lub hybrydyzuje w ostrych warunkach z tą sekwencją lub obejmuje sekwencję, która ze względu na kod genetyczny zdegenerowała do tej sekwencji DNA, albo 4) koduje rybozym posiadający dwa odcinki sekwencji, każdy o długości przynajmniej 10 do 15 par zasad, które są komplementarne do odcinków sekwencji cząsteczki DNA kodującej białko roślinne o aktywności fukozylotransferazy określonej w punkcie 1), przez co rybozym przyłącza i tnie mRNA, które jest produktem transkrypcji naturalnej cząsteczki DNA GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazy, przy czym ewentualnie cząsteczka DNA w wektorze ma orientację przeciwną wobec promotora.
Korzystnie stosuje się wektor zawierający cząsteczkę DNA, która koduje białko o aktywności GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazy, zwłaszcza o aktywności rdzeniowej a1,3-fukozylotransferazy.
Korzystnie stosuje się wektor zawierający cząsteczkę DNA, która wykazuje przynajmniej 70-80%, zwłaszcza przynajmniej 95%, identyczność z sekwencją według SEQ ID NO:1.
Korzystnie stosuje się wektor zawierający cząsteczkę DNA, która obejmuje pary zasad 2150 do 2250, zwłaszcza 2198 sekwencji według SEQ ID NO:1.
Korzystnie stosuje się wektor zawierający cząsteczkę DNA, która jest związana kowalencyjnie z odpowiednią wykrywalną substancją znacznikową.
Przedmiotem wynalazku jest również sposób otrzymywania rekombinowanych roślinnych komórek gospodarza, polegający na tym, że do genomu komórki gospodarza w miejsce niezmutowanej sekwencji homologicznej wprowadza się cząsteczkę DNA obejmującą sekwencję według SEQ ID NO:1 z otwartą ramką odczytu od pary zasad 211 do pary zasad 1740 lub wykazuje przynajmniej 50% identyczność z tą sekwencją lub hybrydyzuje w ostrych warunkach z tą sekwencją lub obejmuje sekwencję, która ze względu na kod genetyczny zdegenerowała do tej sekwencji DNA, przy czym ta sekwencja koduje białko roślinne o aktywności fukozylotransferazy lub jest komplementarna do niej,
PL 205 710 B1 i przy czym ta cząsteczka DNA zawiera mutację w postaci delecji, insercji i/lub substytucji, która uniemożliwia ekspresję aktywnej endogennej fukozylotransferazy.
Korzystnie stosuje się cząsteczkę DNA, która koduje białko o aktywności GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazy, zwłaszcza o aktywności rdzeniowej a1,3-fukozylotransferazy.
Korzystnie stosuje się cząsteczkę DNA, która wykazuje przynajmniej 70-80%, zwłaszcza przynajmniej 95%, identyczność z sekwencją według SEQ ID NO:1.
Korzystnie stosuje się cząsteczkę DNA, która obejmuje pary zasad 2150 do 2250, zwłaszcza 2198 sekwencji według SEQ ID NO:1.
Korzystnie stosuje się cząsteczkę DNA, która jest związana kowalencyjnie z odpowiednią wykrywalną substancją znacznikową.
Przedmiotem wynalazku jest też sposób otrzymywania rekombinowanych roślin, polegający na tym, że do rośliny w miejsce niezmutowanej, sekwencji homologicznej wprowadza się cząsteczkę DNA obejmującą sekwencję według SEQ ID NO:1 z otwartą ramką odczytu od pary zasad 211 do pary zasad 1740 lub wykazuje przynajmniej 50% identyczność z tą sekwencją lub hybrydyzuje w ostrych warunkach z tą sekwencją lub obejmuje sekwencję, która ze względu na kod genetyczny zdegenerowała do tej sekwencji DNA, przy czym ta sekwencja koduje białko roślinne o aktywności fukozylotransferazy lub jest komplementarna do niej, i przy czym ta cząsteczka DNA zawiera mutację w postaci delecji, insercji i/lub substytucji, która uniemożliwia ekspresję aktywnej endogennej fukozylotransferazy.
Korzystnie stosuje się cząsteczkę DNA, która koduje białko o aktywności GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazy, zwłaszcza o aktywności rdzeniowej a1,3-fukozylotransferazy.
Korzystnie stosuje się cząsteczkę DNA, która wykazuje przynajmniej 70-80%, zwłaszcza przynajmniej 95%, identyczność z sekwencją według SEQ ID NO:1.
Korzystnie stosuje się cząsteczkę DNA, która obejmuje pary zasad 2150 do 2250, zwłaszcza 2198 sekwencji według SEQ ID NO: 1.
Korzystnie stosuje się cząsteczkę DNA, która jest związana kowalencyjnie z odpowiednią wykrywalną substancją znacznikową.
Przedmiotem wynalazku są także rekombinowane komórki roślinne, charakteryzujące się tym, że zawierają wprowadzony co najmniej jeden wektor zawierający cząsteczkę DNA zawierającą mutację w postaci delecji, insercji i/lub substytucji, która uniemożliwia ekspresję aktywnej endogennej fukozylotransferazy, przy czym taka cząsteczka DNA 1) obejmuje sekwencję według SEQ ID NO:1 z otwartą ramką odczytu od pary zasad 211 do pary zasad 1740 lub wykazuje przynajmniej 50% identyczność z tą sekwencją lub hybrydyzuje w ostrych warunkach z tą sekwencją lub sekwencję, która ze względu na kod genetyczny zdegenerowała do tej sekwencji DNA, przy czym taka sekwencja koduje białko roślinne o aktywności fukozylotransferazy lub jest komplementarna do niej, albo 2) obejmuje częściową sekwencję cząsteczki DNA kodującej białko roślinne o aktywności fukozylotransferazy, wykazującą przynajmniej 80% identyczność z sekwencją według SEQ ID NO:1 i mającą wielkość od 20 do 200, zwłaszcza 30 do 50 par zasad, albo 3) obejmuje sekwencję według SEQ ID NO:3 lub sekwencję, która wykazuje przynajmniej 85%, zwłaszcza przynajmniej 95% identyczność z tą sekwencją lub hybrydyzuje w ostrych warunkach z tą sekwencją lub obejmuje sekwencję, która ze względu na kod genetyczny zdegenerowała do tej sekwencji DNA, albo 4) koduje rybozym posiadający dwa odcinki sekwencji, każdy o długości przynajmniej 10 do 15 par zasad, które są komplementarne do odcinków sekwencji cząsteczki DNA kodującej białko roślinne o aktywności fukozylotransferazy określonej w punkcie 1), przez co rybozym przyłącza i tnie mRNA, które jest produktem transkrypcji naturalnej cząsteczki DNA GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazy, przy czym ewentualnie cząsteczka DNA w wektorze ma orientację przeciwną wobec promotora, i przy czym endogenna produkcja GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazy w tych komórkach jest wytłumiona lub całkowicie wyłączona.
Korzystnie komórki te zawierają wektor zawierający cząsteczkę DNA, która koduje białko o aktywności GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazy, zwłaszcza o aktywności rdzeniowej α1,3-fukozylotransferazy.
Korzystnie komórki te zawierają wektor zawierający cząsteczkę DNA, która wykazuje przynajmniej 70-80%, zwłaszcza przynajmniej 95%, identyczność z sekwencją według SEQ ID NO:1.
Korzystnie komórki te zawierają wektor zawierający cząsteczkę DNA, która obejmuje pary zasad 2150 do 2250, zwłaszcza 2198 sekwencji według SEQ ID NO:1.
Korzystnie komórki te zawierają wektor zawierający cząsteczkę DNA, która jest związana kowalencyjnie z odpowiednią wykrywalną substancją znacznikową.
PL 205 710 B1
Przedmiotem wynalazku są także rekombinowane rośliny, charakteryzujące się tym, że zawierają wprowadzony co najmniej jeden wektor zawierający cząsteczkę DNA zawierającą mutację w postaci delecji, insercji i/lub substytucji, która uniemożliwia ekspresję aktywnej endogennej fukozylotransferazy, przy czym taka cząsteczka DNA 1) obejmuje sekwencję według SEQ ID NO:1 z otwartą ramką odczytu od pary zasad 211 do pary zasad 1740 lub wykazuje przynajmniej 50% identyczność z tą sekwencją lub hybrydyzuje w ostrych warunkach z tą sekwencją lub sekwencję , która ze wzglę du na kod genetyczny zdegenerowała do tej sekwencji DNA, przy czym ta sekwencja koduje białko roślinne o aktywności fukozylotransferazy lub jest komplementarna do niej, albo 2) obejmuje częściową sekwencję cząsteczki DNA kodującej białko roślinne o aktywności fukozylotransferazy, wykazującą przynajmniej 80% identyczność z sekwencją według SEQ ID NO: 1 i mającą wielkość od 20 do 200, zwłaszcza 30 do 50 par zasad, albo 3) obejmuje sekwencję według SEQ ID NO: 3 lub sekwencję, która wykazuje przynajmniej 85%, zwłaszcza przynajmniej 95% identyczność z tą sekwencją lub hybrydyzuje w ostrych warunkach z tą sekwencją lub obejmuje sekwencję, która ze względu na kod genetyczny zdegenerowała do tej sekwencji DNA, albo 4) koduje rybozym posiadający dwa odcinki sekwencji, każdy o długości przynajmniej 10 do 15 par zasad, które są komplementarne do odcinków sekwencji cząsteczki DNA kodującej białko roślinne o aktywności fukozylotransferazy określonej w punkcie 1), przez co rybozym przyłącza i tnie mRNA, które jest produktem transkrypcji naturalnej cząsteczki DNA GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazy , przy czym ewentualnie cząsteczka DNA w wektorze ma orientacją przeciwną wobec promotora, i przy czym endogenna produkcja GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazy w tych komórkach jest wytłumiona lub całkowicie wyłączona.
Korzystnie rośliny te zawierają wektor zawierający cząsteczkę DNA, która koduje białko o aktywności GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazy, zwłaszcza o aktywności rdzeniowej a1,3-fukozylotransferazy.
Korzystnie rośliny te zawierają wektor zawierający cząsteczkę DNA, która wykazuje przynajmniej 70-80%, zwłaszcza przynajmniej 95%, identyczność z sekwencją według SEQ ID NO:1.
Korzystnie rośliny te zawierają wektor zawierający cząsteczkę DNA, która obejmuje pary zasad 2150 do 2250, zwłaszcza 2198 sekwencji według SEQ ID NO:1.
Korzystnie rośliny te zawierają wektor zawierający cząsteczkę DNA, która jest związana kowalencyjnie z odpowiednią wykrywalną substancją znacznikową.
Przedmiotem wynalazku są też rekombinowane komórki roślinne, charakteryzujące tym, że zawierają wprowadzoną do ich genomu w miejscu niezmutowanej homologicznej sekwencji cząsteczkę DNA zawierającą mutację w postaci delecji, insercji i/lub substytucji, która uniemożliwia ekspresję aktywnej endogennej fukozylotransferazy, przy czym ta cząsteczka DNA 1) obejmuje sekwencję według SEQ ID NO:1 z otwartą ramką odczytu od pary zasad 211 do pary zasad 1740 lub wykazuje przynajmniej 50% identyczność z tą sekwencją lub hybrydyzuje w ostrych warunkach z tą sekwencją lub sekwencję, która ze względu na kod genetyczny zdegenerowała do tej sekwencji DNA, przy czym ta sekwencja koduje białko roślinne o aktywności fukozylotransferazy lub jest komplementarna do niej, albo 2) obejmuje częściową sekwencję takiej cząsteczki DNA, wykazującą przynajmniej 80% identyczność z sekwencją według SEQ ID NO:1 i mającą wielkość od 20 do 200, zwłaszcza 30 do 50 par zasad, albo 3) obejmuje sekwencję według SEQ ID NO:3 lub sekwencję, która wykazuje przynajmniej 85%, zwłaszcza przynajmniej 95% identyczność z tą sekwencją lub hybrydyzuje w ostrych warunkach z tą sekwencją lub obejmuje sekwencję, która ze względu na kod genetyczny zdegenerowała do tej sekwencji DNA, albo 4) koduje rybozym posiadający dwa odcinki sekwencji, każdy o długości przynajmniej 10 do 15 par zasad, które są komplementarne do odcinków sekwencji takiej cząsteczki DNA określonej w punkcie 1), przez co rybozym przyłącza i tnie mRNA, które jest produktem transkrypcji naturalnej cząsteczki DNA GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazy, i przy czym endogenna produkcja w tych roślinach GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazy jest wytłumiona lub całkowicie wyłączona.
Korzystnie komórki te zawierają wektor zawierający cząsteczkę DNA, która koduje białko o aktywności GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazy, zwłaszcza o aktywności rdzeniowej α1,3-fukozylotransferazy.
Korzystnie komórki te zawierają cząsteczkę DNA, która wykazuje przynajmniej 70-80%, zwłaszcza przynajmniej 95%, identyczność z sekwencją według SEQ ID NO:1.
Korzystnie komórki te zawierają cząsteczkę DNA, która obejmuje pary zasad 2150 do 2250, zwłaszcza 2198 sekwencji według SEQ ID NO:1.
Korzystnie komórki te zawierają cząsteczkę DNA, która jest związana kowalencyjnie z odpowiednią wykrywalną substancją znacznikową.
Przedmiotem wynalazku są ponadto rekombinowane rośliny, charakteryzujące się tym, że zawierają wprowadzoną do ich genomu w miejscu niezmutowanej homologicznej sekwencji cząsteczkę
PL 205 710 B1
DNA zawierającą mutację w postaci delecji, insercji i/lub substytucji, która uniemożliwia ekspresję aktywnej endogennej fukozylotransferazy, przy czym ta cząsteczka DNA 1) obejmuje sekwencję według SEQ ID NO: 1 z otwartą ramką odczytu od pary zasad 211 do pary zasad 1740 lub wykazuje przynajmniej 50% identyczność z tą sekwencją lub hybrydyzuje w ostrych warunkach z tą sekwencją lub sekwencję, która ze względu na kod genetyczny zdegenerowała do tej sekwencji DNA, przy czym ta sekwencja koduje białko roślinne o aktywności fukozylotransferazy lub jest komplementarna do niej, albo 2) obejmuje częściową sekwencję takiej cząsteczki DNA, wykazującą przynajmniej 80% identyczność z sekwencją według SEQ ID NO: 1 i mającą wielkość od 20 do 200, zwłaszcza 30 do 50 par zasad, albo 3) obejmuje sekwencję według SEQ ID NO: 3 lub sekwencję, która wykazuje przynajmniej 85%, zwłaszcza przynajmniej 95% identyczność z tą sekwencją lub hybrydyzuje w ostrych warunkach z tą sekwencją lub obejmuje sekwencję , która ze wzglę du na kod genetyczny zdegenerował a do tej sekwencji DNA, albo 4) koduje rybozym posiadający dwa odcinki sekwencji, każdy o długości przynajmniej 10 do 15 par zasad, które są komplementarne do odcinków sekwencji takiej cząsteczki DNA określonej w punkcie 1), przez co rybozym przyłącza i tnie mRNA, które jest produktem transkrypcji naturalnej cząsteczki DNA GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazy, i przy czym endogenna produkcja w tych roślinach GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazy jest wytłumiona lub całkowicie wyłączona.
Korzystnie rośliny te zawierają cząsteczkę DNA, która koduje białko o aktywności GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazy, zwłaszcza o aktywności rdzeniowej a1,3-fukozylotransferazy.
Korzystnie rośliny te zawierają cząsteczkę DNA, która wykazuje przynajmniej 70-80%, zwłaszcza przynajmniej 95%, identyczność z sekwencją według SEQ ID NO:1.
Korzystnie rośliny te zawierają cząsteczkę DNA, która obejmuje pary zasad 2150 do 2250, zwłaszcza 2198 sekwencji według SEQ ID NO:1.
Korzystnie rośliny te zawierają cząsteczkę DNA, która jest związana kowalencyjnie z odpowiednią wykrywalną substancją znacznikową.
Przedmiotem wynalazku jest również sposób otrzymywania rekombinowanych komórek roślinnych, które wykazują zablokowaną ekspresję GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazy na poziomie transkrypcji lub translacji, polegający na tym, że wprowadza się do komórek cząsteczkę kwasu peptydonukleinowego (PNA) zawierającą sekwencję zasad, która jest komplementarna do cząsteczki DNA kodującej GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazę albo cząsteczkę kwasu peptydonukleinowego (PNA) zawierającą sekwencję zasad, która odpowiada sekwencji cząsteczki DNA kodującej GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazę, przy czym taka cząsteczka DNA 1) obejmuje sekwencję według SEQ ID NO:1 z otwartą ramką odczytu od pary zasad 211 do pary zasad 1740 lub wykazuje przynajmniej 50% identyczność z tą sekwencją lub hybrydyzuje w ostrych warunkach z tą sekwencją lub sekwencję, która ze względu na kod genetyczny zdegenerowała do tej sekwencji DNA, przy czym ta sekwencja koduje białko roślinne o aktywności fukozylotransferazy lub jest komplementarna do niej, albo 2) obejmuje częściową sekwencję cząsteczki DNA kodującej białko roślinne o aktywności fukozylotransferazy, wykazującą przynajmniej 80% identyczność z sekwencją według SEQ ID NO:1 i mającą wielkość od 20 do 200, zwłaszcza 30 do 50 par zasad, albo 3) obejmuje sekwencję według SEQ ID NO:3 lub sekwencję, która wykazuje przynajmniej 85%, zwłaszcza przynajmniej 95% identyczność z tą sekwencją lub hybrydyzuje w ostrych warunkach z tą sekwencją lub obejmuje sekwencję, która ze względu na kod genetyczny zdegenerowała do tej sekwencji DNA.
Przedmiotem wynalazku jest też sposób otrzymywania rekombinowanych glikoprotein, polegający na tym, że rekombinowane rośliny lub komórki roślinne opisane powyżej, albo rekombinowane rośliny lub komórki roślinne zawierające wstawioną cząsteczkę kwasu peptydonukleinowego (PNA) zawierającą sekwencję zasad, która jest komplementarna do cząsteczki DNA kodującej GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazę albo cząsteczkę kwasu peptydonukleinowego (PNA) zawierającą sekwencję zasad, która odpowiada sekwencji cząsteczki DNA kodującej GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazę, przy czym taka cząsteczka DNA 1) obejmuje sekwencję według SEQ ID NO:1 z otwartą ramką odczytu od pary zasad 211 do pary zasad 1740 lub wykazuje przynajmniej 50% identyczność z tą sekwencją lub hybrydyzuje w ostrych warunkach z tą sekwencją lub sekwencję, która ze względu na kod genetyczny zdegenerowała do tej sekwencji DNA, przy czym ta sekwencja koduje białko roślinne o aktywności fukozylotransferazy lub jest komplementarna do niej, albo 2) obejmuje częściową sekwencję cząsteczki DNA kodującej białko roślinne o aktywności fukozylotransferazy, wykazującą przynajmniej 80% identyczność z sekwencją według SEQ ID NO: 1 i mającą wielkość od 20 do 200, zwłaszcza 30 do 50 par zasad, albo 3) obejmuje sekwencję według SEQ ID NO:3 lub sekwencję, która wykazuje przynajmniej 85%, zwłaszcza przynajmniej 95% identyczność z tą sekwencją lub hybrydyzuje
PL 205 710 B1 w ostrych warunkach z tą sekwencją lub obejmuje sekwencję, która ze względu na kod genetyczny zdegenerowała do tej sekwencji DNA, i które wykazują zablokowaną ekspresję GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazy na poziomie transkrypcji lub translacji, transfekuje się genem kodującym glikoproteinę, przez co ekspresjonowane są rekombinowane glikoproteiny.
Przedmiotem wynalazku jest ponadto sposób otrzymywania rekombinowanych ludzkich glikoprotein, polegający na tym, że rekombinowane rośliny lub komórki roślinne opisane powyżej, albo rekombinowane rośliny lub komórki roślinne zawierające wstawioną cząsteczkę kwasu peptydonukleinowego (PNA), zawierającą sekwencję zasad, która jest komplementarna do cząsteczki DNA, kodującej GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazę albo cząsteczkę kwasu peptydonukleinowego (PNA), zawierającą sekwencję zasad, która odpowiada sekwencji cząsteczki DNA, kodującej GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazę, przy czym taka cząsteczka DNA 1) obejmuje sekwencję według SEQ ID NO:1 z otwartą ramką odczytu od pary zasad 211 do pary zasad 1740 lub wykazuje przynajmniej 50% identyczność z tą sekwencją lub hybrydyzuje w ostrych warunkach z tą sekwencją lub sekwencję, która ze względu na kod genetyczny zdegenerowała do tej sekwencji DNA, przy czym ta sekwencja koduje białko roślinne o aktywności fukozylotransferazy lub jest komplementarna do niej, albo 2) obejmuje częściową sekwencję cząsteczki DNA kodującej białko roślinne o aktywności fukozylotransferazy, wykazującą przynajmniej 80% identyczność z sekwencją według SEQ ID NO:1 i mającą wielkość od 20 do 200, zwłaszcza 30 do 50 par zasad, albo 3) obejmuje sekwencję według SEQ ID NO:3 lub sekwencję, która wykazuje przynajmniej 85%, zwłaszcza przynajmniej 95% identyczność z tą sekwencją lub hybrydyzuje w ostrych warunkach z tą sekwencją lub obejmuje sekwencję, która ze względu na kod genetyczny zdegenerowała do tej sekwencji DNA, i które wykazują zablokowaną ekspresję GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazy na poziomie transkrypcji lub translacji, transfekuje się genem kodującym glikoproteinę, przez co ekspresjonowane są rekombinowane glikoproteiny.
Przedmiotem wynalazku jest również sposób otrzymywania rekombinowanych ludzkich glikoprotein do zastosowań medycznych, polegający na tym, że rekombinowane rośliny lub komórki roślinne opisane powyżej, albo rekombinowane rośliny lub komórki roślinne zawierające wstawioną cząsteczkę kwasu peptydonukleinowego (PNA) zawierającą sekwencję zasad, która jest komplementarna do cząsteczki DNA kodującej GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazę albo cząsteczkę kwasu peptydonukleinowego (PNA) zawierającą sekwencję zasad, która odpowiada sekwencji cząsteczki DNA kodującej GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazę, przy czym taka cząsteczka DNA 1) obejmuje sekwencję według SEQ ID NO: 1 z otwartą ramką odczytu od pary zasad 211 do pary zasad 1740 lub wykazuje przynajmniej 50% identyczność z tą sekwencją lub hybrydyzuje w ostrych warunkach z tą sekwencją lub sekwencję, która ze względu na kod genetyczny zdegenerowała do tej sekwencji DNA, przy czym ta sekwencja koduje białko roślinne o aktywności fukozylotransferazy lub jest komplementarna do niej, albo 2) obejmuje częściową sekwencję cząsteczki DNA kodującej białko roślinne o aktywności fukozylotransferazy, wykazującą przynajmniej 80% identyczność z sekwencją według SEQ ID NO:1 i mającą wielkość od 20 do 200, zwłaszcza 30 do 50 par zasad, albo 3) obejmuje sekwencję według SEQ ID NO:3 lub sekwencję, która wykazuje przynajmniej 85%, zwłaszcza przynajmniej 95% identyczność z tą sekwencją lub hybrydyzuje w ostrych warunkach z tą sekwencją lub obejmuje sekwencję, która ze względu na kod genetyczny zdegenerowała do tej sekwencji DNA, i które wykazują zablokowaną ekspresję GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazy na poziomie transkrypcji lub translacji, transfekuje się genem kodującym glikoproteinę, przez co ekspresjonowane są rekombinowane glikoproteiny.
Przedmiotem wynalazku jest także sposób selekcjonowania cząsteczek DNA kodujących GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazę w próbce, polegający na tym, że do próbki dodaje się cząsteczkę DNA zawierającą mutację w postaci delecji, insercji i/lub substytucji, która uniemożliwia ekspresję aktywnej endogennej fukozylotransferazy, przy czym ta cząsteczka DNA 1) obejmuje sekwencję według SEQ ID NO:1 z otwartą ramką odczytu od pary zasad 211 do pary zasad 1740 lub wykazuje przynajmniej 50% identyczność z tą sekwencją lub hybrydyzuje w ostrych warunkach z tą sekwencją lub sekwencję, która ze względu na kod genetyczny zdegenerowała do tej sekwencji DNA, przy czym ta sekwencja koduje białko roślinne o aktywności fukozylotransferazy lub jest komplementarna do niej, albo 2) obejmuje częściową sekwencję cząsteczki DNA kodującej białko roślinne o aktywności fukozylotransferazy, wykazującą przynajmniej 80% identyczność z sekwencją według SEQ ID NO:1 i mającą wielkość od 20 do 200, zwłaszcza 30 do 50 par zasad, albo 3) obejmuje sekwencję według SEQ ID NO:3 lub sekwencję, która wykazuje przynajmniej 85%, zwłaszcza przynajmniej 95% identyczność z tą sekwencją lub hybrydyzuje w ostrych warunkach z tą sekwencją lub obejmuje sekwencję, która ze względu na kod genetyczny zdegenerowała do tej sekwencji DNA, albo 4) koduje rybozym posiadająPL 205 710 B1 cy dwa odcinki sekwencji, każdy o długości przynajmniej 10 do 15 par zasad, które są komplementarne do odcinków sekwencji cząsteczki DNA kodującej białko roślinne o aktywności fukozylotransferazy określonej w punkcie 1), przez co rybozym przyłącza i tnie mRNA, które jest produktem transkrypcji naturalnej cząsteczki DNA GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazy, które wiążą się z cząsteczkami DNA kodującymi GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazę, i która to cząsteczka jest związana kowalencyjnie z odpowiednią wykrywalną substancją znacznikową.
Korzystnie stosowana w tym sposobie próbka zawiera genomowy DNA organizmu roślinnego.
Cel wynalazku realizuje się dzięki zastosowaniu cząsteczki DNA, która obejmuje sekwencję według SEQ ID No.1 (w tym opisie zastosowano kod IUPAC, przy czym „N oznacza inozynę) z otwartą ramką odczytu od pary zasad 211 do pary zasad 1740 lub która wykazuje przynajmniej 50% homologię do powyższej sekwencji lub hybrydyzuje w zaostrzonych warunkach z powyższą sekwencją lub obejmuje sekwencję, która ze względu na zdegenerowanie kodu genetycznego odpowiada powyższej sekwencji DNA, przy czym sekwencja ta koduje białko roślinne o aktywności fukozylotransferazy lub jest komplementarna do niej.
Sekwencja taka nadaje się doskonale do wszelkich eksperymentów, analiz i sposobów wytwarzania itp., które dotyczą aktywności roślinnej fukozylotransferazy. Przy tym przedmiotem zainteresowania są zarówno sekwencja DNA jak również białko kodowane przez tę sekwencję, przy czym jednak zwłaszcza sekwencja DNA jest stosowana do tłumienia aktywności fukozylotransferazy.
Otwarta ramka odczytu z sekwencji SEQ ID NO:1 koduje białko składające się z 510 aminokwasów o teoretycznej masie cząsteczkowej wynoszącej 56,8 kDa, przy czym w obszarze pomiędzy Asn36 i Gly54 znajduje się prawdopodobnie odcinek przezbłonowy. Wyliczona wartość pI kodowanego białka o sekwencji według SEQ ID NO:1 wynosi 7,51.
Aktywność roślinnej fukozylotransferazy bada się i mierzy się w sposobie, w którym fukozylotransferaza jest dodawana do próbki zawierającej znakowaną fukozę i akceptor (np. glikoproteinę) związany z nośnikiem, np. Sepharose. Po czasie reakcji próbkę przemywa się i mierzy się zawartość związanej fukozy. Aktywność fukozylotransferazy jest uznawana przy tym, gdy pomiary aktywności są wyższe o przynajmniej 10 do 20%, zwłaszcza co najmniej 30 do 50% od mierzonej aktywności dla kontroli negatywnej. Strukturę glikoproteiny można dodatkowo zweryfikować za pomocą HPLC. Takie protokoły stanowią stan techniki (Staudacher et al. 1998, Anal. Biochem. 246, 96-101; Staudacher et al. 1991, Eur. J. Biochem. 199, 745-751).
Przykładowo fukozylotransferaza jest dodawana do próbki zawierającej znakowaną radioaktywnie fukozę i akceptor, np. GlcNAce1-2Mana1-3(GlcNAce1-2Mana1-6)Mane1-4GlcNAce1-4GlcNAce1-Asn. Po czasie reakcji próbka jest oczyszczana w chromatografii anionowymiennej i mierzona jest zawartość związanej fukozy. Z różnicy mierzonej radioaktywności próbki z akceptorem i radioaktywności kontroli negatywnej bez akceptora może być wyliczona aktywność. Aktywność fukozylotransferazy uznaje się już za pozytywną, gdy mierzona radioaktywność jest wyższa przynajmniej o 30-40% niż mierzona radioaktywność próby negatywnej.
Łączenie się w pary dwóch cząsteczek DNA może być zmieniane przez dobór temperatury i siły jonowej próbki. Zgodnie z wynalazkiem jako warunki zaostrzone są rozumiane warunki, które umożliwiają dokładne i ścisłe wiązanie. Przykładowo cząsteczki DNA są hybrydyzowane w 7% siarczanie dadecylu sodu (SDS), 0,5M NaPO4 pH 7,0; 1mM EDTA w 50°C i przemywane 1% SDS w 42°C.
Czy sekwencja wykazuje przynajmniej 50% homologię do SEQ ID NO:1, może być stwierdzone np. za pomocą programu FastDB z baz danych EMBL lub SWISSPROT.
Dogodnie sekwencja opisanej tu cząsteczki DNA koduje białko o aktywności GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazy, w szczególności o aktywności rdzeniowej a1,3-fukozylotransferazy. Jak już wyżej napisano, rdzeniowa a1,3-fukozylotransferaza występuje w roślinach i owadach, lecz nie występuje w organizmie człowieka, przez co w szczególności ta sekwencja DNA nadaje się do stosowania w analizach i eksperymentach oraz sposobach wytwarzania specyficznych dla fukozylotransferazy. Jako rdzeniową a1,3-fukozylotransferazę rozumiana jest w szczególności GlcNAc-a1,3-fukozylotransferaza związana z GDP-L-Fuc:Asn. W ramach niniejszego wynalazku określenie a1,3-fukozylotransferaza oznacza z reguły w szczególności rdzeniową a1,3-fukozylotransferazę. Do powyżej opisanych pomiarów aktywności służą przy tym w szczególności akceptory z nieredukującym końcem GlcNAc. Takimi akceptorami są np. GlcNAce1-2Mana1-3(GlcNAce1-2Mana1-6)Mane1-4GlcNAce14GlcNAce1Asn, GlcNAce1-2Mana1-3(GlcNAce1-2Mana1-6)Manie1-4GlcNAce1-4(Fuca1-6GlcNAce1Asn i GlcNAce1-2Mana1-3[Mana1-3(Mana1-6)Mana1-6]Mane1-4GlcNAce1-4GlcNAce1-Asn. Czy
PL 205 710 B1 fukoza jest związana, może być stwierdzone następnie przez pomiar niewrażliwości na N-glikozydazę F, co może być wykazane za pomocą spektroskopii masowej.
Dogodnie opisana tu cząsteczka DNA wykazuje przynajmniej 70-80%, szczególnie korzystnie przynajmniej 95%, homologii do sekwencji według SEQ ID NO:1. Sekwencja ta koduje szczególnie aktywną GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazę. Ponieważ sekwencja DNA może być zmieniana mniej lub bardziej zależnie od rośliny lub owada, sekwencja wykazująca, np. 70% homologię do sekwencji według SEQ ID NO:1, wykazuje także aktywność fukozylotransferazy, która jest wystarczająca aby być wykorzystana do analiz, eksperymentów lub sposobów wytwarzania opisanych powyżej.
W innej zalecanej realizacji cząsteczka DNA zawiera 2150 do 2250, w szczególności 2198, pary zasad. Cząsteczka DNA posiada 100 do 300, zwłaszcza 210, pary zasad w górę przed kodonem startu oraz 350 do 440, w szczególności 458, pary zasad w dół po kodonie stopu otwartej ramki odczytu, przy czym koniec cząsteczki DNA dogodnie zawiera 3'- ogon poli(A). W ten sposób zapewniona jest właściwa regulacja na poziomie translacji, i otrzymywana jest cząsteczka DNA, która koduje szczególnie efektywnie i wydajnie aktywną GlcNAca1,3-fukozylotransferazę.
Zgodnie z wynalazkiem opisano także cząsteczkę DNA, która obejmuje sekwencję według SEQ ID NO:3 lub obejmuje sekwencję, która wykazuje przynajmniej 85%, zwłaszcza przynajmniej 95%, w szczególności przynajmniej 99% homologię do wyżej wymienionej sekwencji lub hybrydyzuje w ostrych warunkach z tą sekwencją lub obejmuje sekwencję, która ze względu na zdegenerowanie kodu genetycznego odpowiada rzeczonej sekwencji DNA.
Homologia jest określana dogodnie za pomocą programu, który rozpoznaje insercje i delecje i nie bierze ich pod uwagę w obliczaniu homologii. Taka sekwencja nukleotydowa koduje konserwatywny motyw peptydowy, co oznacza, że większość aktywnych i działających GlcNAc-a1,3-fukozylotransferaz zawiera sekwencję aminokwasową kodowaną przez tą sekwencję. Sekwencja może przy tym mieć zarówno tą samą wielkość co sekwencja według SEQ ID NO: 3, jak również, co jest zrozumiałe, być od niej także większa. Ta sekwencja ma mniejszą długość od sekwencji kodującej całe białko, i jest więc mniej wrażliwa na rekombinacje, delecje i inne mutacje. Ze względu na motyw konserwowany i jej podwyższoną stabilność sekwencja ta nadaje się szczególnie dobrze do testów rozpoznawania sekwencji.
SEQ ID No: 3 posiada następującą sekwencję: 5'-gaagccctgaagcactacaaatttagcttagcgtttgaaaattcgaatgaggaagattatgtaactgaaaaattcttccaatcccttgttgctggaactgtccct-3'
Zgodnie z wynalazkiem opisano cząsteczkę DNA, która obejmuje częściową sekwencję jednej z wyżej wymienionych cząsteczek DNA i ma wielkość od 20 do 200, korzystnie 30 do 50 par zasad. Cząsteczka DNA może być przykładowo wykorzystana jako sonda do wiązania komplementarnych sekwencji GlcNAc-a1,3-fukozylotransferaz, dzięki czemu mogą być one selekcjonowane z próbki. W ten sposób mogą być selekcjonowane, izolowane i charakteryzowane kolejne GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazy z najróżniejszych roślin i owadów. Mogą być stosowane każde dowolne lub także kilka różnych sekwencji częściowych, w szczególności fragmenty powyżej opisanego motywu konserwatywnego.
Jest przy tym szczególnie zalecane, gdy jedna z opisanych wyżej cząsteczek DNA jest związana kowalencyjnie z możliwą do wykazania substancją znacznikową. Jako substancję znacznikową można zastosować każdy stosowany znacznik, a więc np. markery fluorescencyjne, luminescencyjne, radioaktywne, znacznik nieizotopowy, jak biotyna, etc. W ten sposób otrzymuje się reagenty, które są przydatne dla wykazania, selekcjonowania i oceny ilościowej odpowiednich cząsteczek DNA w stałych próbkach tkanek (np. roślinnych) jak również w próbkach płynnych za pomocą metod hybrydyzacji.
Zgodnie z wynalazkiem opisano też biologicznie czynny wektor, który obejmuje jedną z wyżej wymienionych cząsteczek DNA lub części o różnej długości przynajmniej 20 par zasad. Do transfekcji komórek gospodarza wymagany jest jednoniciowy, zdolny do samopowielania się wektor, przy czym w zależności od komórki gospodarza, mechanizmu transfekcji, celu i rozmiaru cząsteczki DNA, może być zastosowany odpowiedni wektor. Ponieważ znana jest duża liczba różnych wektorów, których wymienienie przekroczyłoby objętość zgłoszenia, tak, że rezygnuje się tutaj z tego, zwłaszcza że wektory są bardzo dobrze znane fachowcom (w odniesieniu do wektorów jak i wszystkich w tym opisie stosowanych technik i określeń, znanych fachowcom, patrz również Sambrook Maniatis). Idealnie wektor powinien mieć małą masę cząsteczkową i zawierać gen selektywny, pozwalający na łatwe rozpoznanie fenotypu w komórce, dzięki czemu możliwa jest łatwa selekcja zawierających i nie zawierających wektor komórek gospodarza. Aby utrzymać wysoką ilość DNA i odpowiednich produktów genowych, wektor powinien posiadać silny promotor, oraz wzmacniacz, sygnały amplifikacji genu
PL 205 710 B1 i sekwencje regulacyjne. Dla uzyskania niezależnej replikacji wektora istotne jest następnie posiadanie miejsca inicjacji replikacji. Miejsca poliadenylacji są odpowiedzialne za właściwą obróbkę mRNA, a sygnały splicingu (składania RNA) odpowiedzialne są za transkrypty RNA. W przypadku stosowania fagów, wirusów lub cząsteczek wirusowych jako wektorów, sygnały pakowania kierują pakowaniem wektorowego DNA. Przykładowo do transkrypcji w roślinach odpowiednie są plazmidy Ti, a do transkrypcji w komórkach owadzich bakulowirusy lub transpozony owadzie, jak element P.
W przypadku wprowadzania do rośliny lub komórki roślinnej wyżej opisanego wektora, dochodzi do posttranskrypcyjnego stłumienia ekspresji genu endogennej a1,3-fukozylotransferazy przez transkrypcję homologicznego wobec niego genu lub jego części wprowadzanych w orientacji sensownej. Opis tej techniki sensownej znajduje się w dokumencie Baulcombe 1996, Plant.Mol.Biol. 9:373-382 i Brigneti et al. 1998, EMBO J. 17:6739-6746. Ta strategia „wyciszania genu stanowi efektywną możliwość stłumienia ekspresji genu α1,3-fukozylotransferazy, patrz również Waterhouse et al. 1998, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 95:13959-13964.
Zgodnie z wynalazkiem opisano też biologicznie czynny wektor, który obejmuje jedną z opisanych powyżej cząsteczek DNA lub jej część o różnej długości, w orientacji odwróconej wobec promotora. Po transfekowaniu komórki gospodarza tym wektorem, odczytany zostaje „antysensowny mRNA, który jest komplementarny do mRNA GlcNAc a1,3-fukozylotransferazy i zdolny do tworzenia z nim kompleksów. To wiązanie obniża poprawną obróbkę, transport, stabilność, lub poprzez wygaszenie przyłączania rybosomów tłumi translację i w ten sposób naturalną ekspresję genu GlcNAc a1,3-fukozylotransferazy.
Chociaż cała sekwencja cząsteczki DNA mogłaby być wbudowana do wektora dla określonych celów, mogą być zalecone jej sekwencje częściowe ze względu na ich niską masę. Ważne jest np. w aspekcie antysensownym, żeby cząsteczka DNA była dostatecznie duża, aby tworzyć dostatecznie duże antysensowne mRNA, które przyłączy się do mRNA transferazy. Przykładowo odpowiednia antysensowna cząsteczka RNA zawiera 50 do 200 nukleotydów, ponieważ wiele ze znanych naturalnie występujących antysensownych cząsteczek RNA obejmuje około 100 nukleotydów.
Dla szczególnie efektywnego hamowania ekspresji aktywnej a1,3-fukozylotransferazy przydatna jest kombinacja techniki sensownej i antysensownej (Waterhouse i wsp. 1998, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 95:13 959-13 964).
Zalecane jest stosowanie szybko hybrydyzujących cząsteczek RNA. Wydajność antysensownych cząsteczek RNA, o wielkości od ponad 50 nukleotydów, zależy od kinetyki przyłączania się in vitro. I tak np. szybko przyłączające się antysensowne cząsteczki RNA wykazują silniejsze hamowanie ekspresji białka niż powoli hybrydyzujące cząsteczki RNA (Wagner et al. 1994, Annu. Rev. Microbiol., 48:713-742; Rittner et al. 1993, Nuci. Acids Res, 21:1381-1387). Takie szybko hybrydyzujące antysensowne cząsteczki RNA wykazują w szczególności dużą liczbę zewnętrznych zasad (wolne końce i sekwencje łączące), dużą liczbę strukturalnych subdomen (składniki) oraz niską temperaturę topnienia. (Patzel et al. 1998; Nature Biotechnology, 16; 64-68). Hipotetyczne drugorzędowe struktury antysensownej cząsteczki RNA mogą być uzyskane np. za pomocą programu komputerowego, według którego wyszukuje się odpowiedniego antysensownego RNA dla sekwencji DNA.
Do wektora mogą zostać wbudowane różne regiony sekwencyjne cząsteczki DNA. Jedną z możliwości jest np. wbudowanie do wektora tylko części odpowiedzialnej za przyłączanie rybosomów. Zablokowanie mRNA w tym obszarze wystarcza do zatrzymania całej translacji. Szczególnie wysoką wydajność antysensownych cząsteczek uzyskuje się również dla 5'- i 3'- nie ulegających translacji regionów genu.
Zalecane jest aby opisana tu cząsteczka DNA zawierała sekwencję posiadającą mutację delecji, insercji i/lub substytucji. Liczba zmutowanych nukleotydów jest przy tym zmienna i wystarcza, aby zawierała od jednego do kilku nukleotydów poddanych delecji, insercji lub substytucji. Możliwe jest także, że w wyniku mutacji ramka odczytu ulegnie przesunięciu. Ważne jest jedynie przy tego rodzaju znokautowanym genie, że ekspresja GlcNAc a1,3-fukozylotransferazy jest zakłócona, i uniemożliwia się tworzenie aktywnego, funkcjonalnego enzymu. Miejsce mutacji jest przy tym zmienne, pod warunkiem że tłumiona jest ekspresja enzymatycznie aktywnego białka. Dogodnie mutacja znajduje się w katalitycznym obszarze enzymu, który znajduje się w obszarze C-końcowym. Sposoby wprowadzania mutacji w sekwencjach DNA, są znane najlepiej fachowcowi, dlatego rezygnuje się tutaj z bliższego omówienia różnych możliwych sposobów mutagenezy. Można tutaj stosować zarówno mutagenezę losową jak też dogodnie mutagenezę ukierunkowaną, np. sitedirected-mutagenesis, mutagenezę ukierunkowywaną przez oligonukleotydy lub mutagenezę za pomocą enzymów restrykcyjnych.
PL 205 710 B1
Zgodnie z wynalazkiem opisano także cząsteczkę DNA kodującą rybozym, która posiada dwa odcinki sekwencji, każdy o długości przynajmniej 10 do 15 par zasad, przy czym odcinki sekwencji cząsteczki DNA jak wyżej opisano są komplementarne, dzięki czemu rybozym przyłącza i tnie mRNA, które jest produktem transkrypcji naturalnej cząsteczki DNA kodującej GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazę. Rybozym rozpoznaje mRNA GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazy przez komplementarne łączenie się zasad z mRNA. Następnie rybozym tnie i niszczy RNA w sposób specyficzny dla sekwencji, zanim enzym ulegnie translacji. Po dysocjacji z pociętego substratu, rybozym ponownie hybrydyzuje z cząsteczkami RNA i działa jak specyficzna endonukleaza. Ogólnie, rybozymy można wytwarzać specyficznie do inaktywacji określonego mRNA, nawet w przypadku gdy nie jest znana cała sekwencja DNA kodująca białko. Rybozymy są szczególnie wydajne, gdy rybosomy powoli przesuwają się wzdłuż mRNA. W tym przypadku jest łatwiej znaleźć rybozymowi wolne od rybosomów miejsce na mRNA. Z tego powodu powolne mutanty rybosomów nadają się również do wykorzystania w systemach rybosomowych (J.Burke, 1997, Nature Biotechnology; 15, 414-415). Taka cząsteczka DNA nadaje się szczególnie dobrze do tłumienia lub wyciszania ekspresji roślinnej GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazy.
Kolejną możliwością jest również zastosowanie zmienionej formy rybozymu, mianowicie minizymu. W szczególności minizymy są wydajne do cięcia większych cząsteczek mRNA. Minizym jest głowicą rybosomu, która w miejsce struktury Stem/Loop II posiada krótki łącznik oligonukleotydowy. Szczególnie wydajne są dimery minizymowe (Kuwabara et al. 1998, Nature Biotechnology, 16; 961-965).
Zgodnie z wynalazkiem opisano także biologicznie czynny wektor, który zawiera jedną z obu ostatnio wymienionych cząsteczek DNA (cząsteczka DNA zmutowana lub rybozymu). W związku z tym jest ważne to, co już wyżej opisano odnośnie wektorów. Taki wektor może np. być wprowadzony do mikroorganizmu i zastosowany do produkcji wysokich stężeń opisanych wyżej cząsteczek DNA. Następnie taki wektor nadaje się szczególnie dobrze do wprowadzania specyficznej cząsteczki DNA do organizmu roślinnego lub owada, w celu ograniczenia lub pełnego wyciszenia produkcji GlcNAca1,3-fukozylotransferazy w tym organizmie.
Zgodnie z wynalazkiem opisano także sposób wytwarzania cDNA obejmującego cząsteczkę DNA według wynalazku, przy czym izoluje się RNA z komórek owadzich lub roślinnych, zwłaszcza z komórek liścienia oraz przeprowadza się odwrotną transkrypcję po dodaniu odwrotnej transkryptazy oraz starterów. Poszczególne etapy tego sposobu są przeprowadzane zgodnie ze znanymi protokołami. W celu przeprowadzenia odwrotnej transkrypcji istnieje z jednej strony możliwość otrzymania za pomocą starterów oligo(dT) cDNA całej cząsteczki mRNA, a następnie za pomocą wybranych starterów przeprowadzenie PCR, aby otrzymać cząsteczki DNA zawierające gen GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazy. Z drugiej strony można wybrane startery zastosować bezpośrednio do odwrotnej transkrypcji, w celu otrzymania krótkiego, specyficznego cDNA. Stosowne startery mogą być otrzymane np. syntetycznie po przedłożeniu sekwencji cDNA transferazy. Za pomocą tego sposobu mogą być wytwarzane bardzo szybko i łatwo, z małą ilością pomyłek, duże ilości opisanych tu cząsteczek DNA.
Zgodnie z wynalazkiem opisano następnie sposób klonowania GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazy, w którym klonuje się opisaną tu cząsteczkę DNA do wektora, którym następnie transfekuje się komórkę gospodarza lub gospodarza, przy czym poprzez selekcję i namnażanie transfekowanych komórek gospodarza otrzymuje się linie komórkowe, które ekspresjonują aktywną GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazę. Cząsteczka DNA wprowadzana jest przykładowo za pomocą endonukleaz restrykcyjnych do wektora. Jako wektor rozumie się to co opisano już powyżej. Ważne jest, aby dla tego sposobu wybrać wydajny system wektor-gospodarz. Dla otrzymania aktywnego enzymu szczególnie właściwe są eukariotyczne komórki gospodarza. Jedną z możliwości jest transfekowanie wektora do komórek owadzich. W tym przypadku należałoby szczególnie zastosować wirus owadzi jako wektor np. bakulowirus.
Oczywiście można też transfekować komórki ludzkie lub inne komórki kręgowców, przy czym ekspresjonowałyby one obcy im enzym.
W sposobie wytwarzania rekombinowanych komórek gospodarza, zwłaszcza komórek roślinnych lub roślin według wynalazku, a ewentualnie komórek owadzich lub owadów, z wytłumioną lub całkowicie wyłączoną produkcją GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazy, w którym przynajmniej jeden z opisanych tu wektorów, mianowicie wektor obejmujący opisaną tu cząsteczkę DNA, zmutowaną cząsteczkę DNA lub cząsteczkę DNA kodującą rybozym lub obejmujący cząsteczkę DNA w odwrotnej orientacji względem promotora, wprowadza się do genomu komórki gospodarza lub gospodarza takiego jak roślina lub ewentualnie owad. Tutaj jest również ważne to co opisano powyżej dla transfekcji.
PL 205 710 B1
Jako komórki gospodarza mogą być zastosowane np. komórki roślinne, przy czym przykładowo stosuje się tu plazmid Ti w systemie z Agrobacterium. Za pomocą systemu z Agrobacterium możliwe jest bezpośrednie transfekowanie rośliny: agrobakterie wywołują u roślin powstawanie galasów na korzeniach. Gdy agrobakterie infekują uszkodzoną roślinę, same bakterie nie przenikają do rośliny, lecz wprowadzają do komórek roślinnych rekombinowany odcinek DNA, tak zwany T-DNA składający się z kolistego, pozachromosomalnego, onkogennego plazmidu Ti. T-DNA, a zatem także wprowadzona do niego cząsteczka DNA zostaje stabilnie wbudowana do DNA chromosomalnego komórki, dzięki czemu geny T-DNA ulegają ekspresji w roślinie.
Istnieje wiele znanych, wydajnych mechanizmów transfekcji do różnych układów gospodarzy. Kilkoma przykładami są elektroporacja, metoda fosforanowowapniowa, mikroiniekcja, metoda liposomowa. Komórki transfekowane są następnie selekcjonowane, np. w oparciu o oporność na antybiotyki, dla których istnieje odpowiedni gen wektora, lub inny gen markerowy. Następnie transfekowane linie komórkowe są namnażane, albo w mniejszych ilościach np. na płytkach Petriego, albo w dużych ilościach, np. w fermentorach. Następnie, rośliny posiadają szczególną właściwość, mianowicie są zdolne do odtworzenia z (transfekowanej) komórki lub protoplastu całej rośliny, która może być uprawiana.
W zależności od zastosowanego wektora dochodzi u gospodarza do procesów zahamowania lub całkowitego wyciszenia ekspresji enzymu.
Gdy wektor zawierający cząsteczkę DNA z mutacją w postaci delecji, insercji lub substytucji ulega transfekcji, dochodzi do rekombinacji homologicznej. Zmutowana cząsteczka DNA rozpoznaje pomimo mutacji identyczną sekwencję w genomie komórki gospodarza i jest wbudowywana w dokładnie określonym miejscu, dzięki czemu dochodzi do nokautu (wyłączenia) genu. W ten sposób do genu GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazy zostaje wprowadzona mutacja, która może hamować właściwą ekspresję GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazy. Jak już wyjaśniono powyżej w technice tej ważne jest, aby mutacja była wystarczająca do wyciszenia ekspresji aktywnego białka. Po selekcji i amplifikacji dla dodatkowej kontroli można zsekwencjonować gen, w celu ustalenia wyniku rekombinacji homologicznej lub stopnia zmutowania.
Gdy wektor zawierający cząsteczkę DNA kodującą rybozym jest poddawany transfekcji, w komórce gospodarza ekspresjonowany jest aktywny rybozym. Rybozym tworzy kompleks z komplementarną sekwencją mRNA GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazy przynajmniej w określonym miejscu, nacina to miejsce i może w ten sposób hamować translację enzymu. W tej komórce gospodarza jak również w wywodzących się z niej liniach komórkowych lub ewentualnie roślinie nie jest ekspresjonowana GlcNAc-a1,3-fukozylotransferaza.
Gdy wektor zawierający opisaną tu cząsteczkę DNA w sensownej lub odwróconej orientacji wobec promotora zostanie wprowadzony do transfekowanej komórki (lub rośliny) ekspresjonowany jest sensowny lub antysensowny mRNA. Antysensowny mRNA jest komplementarny przynajmniej do jednej części sekwencji mRNA GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazy i może również hamować translację enzymu. Przykładem sposobu wyciszania ekspresji genu techniką antysensowną jest dokument Smith i wsp. 1990, Mol. Gen. Genet. 224:477-481, przy czym w tej publikacji opisano hamowanie ekspresji genu zaangażowanego w proces dojrzewania pomidorów.
We wszystkich systemach ekspresja GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazy jest przynajmniej tłumiona, dogodnie nawet całkiem hamowana. Stopień zaburzenia ekspresji genu zależy od stopnia kompleksowania, rekombinacji homologicznej, ewentualnych kolejnych przypadkowych mutacji, i innych procesów w obszarze genomu. Komórki transfekowane są kontrolowane pod względem aktywności GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazy i selekcjonowane.
Istnieje następnie możliwość jeszcze dalszego wzmocnienia stłumienia ekspresji a1,3-fukozylotransferazy, polegającego na wprowadzeniu do gospodarza oprócz opisanego wektora, dodatkowo wektora zawierającego gen kodujący białko ssacze, np. e1,4-galaktozylotransferazę. Fukozylacja może być obniżona poprzez działanie innych ssaczych enzymów, przy czym połączenie hamowania ekspresji aktywnej a1,3-fukozylotransferazy za pomocą opisanego tu wektora i za pomocą wektora z enzymem ssaczym jest szczególnie skuteczna.
Do transfekcji może być zastosowany każdy rodzaj rośliny, przykładowo fasola Mung, tytoń, pomidor i/lub ziemniak.
W innym sposobie wytwarzania rekombinowanych komórek gospodarza, zwłaszcza komórek roślinnych lub roślin według wynalazku, albo ewentualnie komórek owadzich lub owadów, przeprowadza się etapy, w których cząsteczkę DNA zawierającą mutację wprowadza się do genomu komórki gospodarza lub rośliny lub ewentualnie owada w miejsce niezmutowanej sekwencji homologicznej.
PL 205 710 B1 (Schaefer et al. 1997, Plant J.; 11(6) =1195-1206). W sposobie tym nie stosuje się wektora, lecz czystą cząsteczkę DNA. Cząsteczka DNA jest wprowadzana do gospodarza np. poprzez strzelbę genową, mikroiniekcję lub elektroporację, aby wymienić tylko trzy przykłady. Jak już wyjaśniono wyżej, cząsteczka DNA łączy się z homologiczną sekwencją w genomie gospodarza i dochodzi do rekombinacji homologicznej i w ten sposób przyjęcia do genomu mutacji delecji, insercji lub substytucji: ekspresja GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazy może zostać wyciszona lub całkowicie przerwana.
Zgodnie z wynalazkiem opisano też rośliny lub komórki roślinne, i ewentualnie owady lub komórki owadzie, w których aktywność GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazy wynosi poniżej 50%, w szczególności poniżej 20%, a zwłaszcza 0%, występującej w naturalnych roślinach lub komórkach roślinnych oraz owadach lub komórkach owadów aktywności GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazowej. Zaletą takich roślin lub komórek roślinnych według wynalazku jest to, że glikoproteiny, które są przez nie produkowane, nie posiadają żadnej lub prawie żadnej a1,3-związanej fukozy. Jeśli więc produkty tych roślin lub ewentualnie owadów są przyjmowane przez organizm ludzki lub kręgowców, nie dochodzi do żadnej reakcji immunologicznej wobec epitopu a1,3-fukozy.
W rekombinowanych roślinach lub komórkach roślinnych według wynalazku, które można otrzymać jednym z wyżej opisanych sposobów według wynalazku, produkcja GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazy jest wytłumiona lub całkowicie przerwana.
W rekombinowanych owadach lub komórkach owadzich, które można otrzymać jednym z wyżej opisanych sposobów, produkcja GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazy jest wytłumiona lub całkowicie przerwana. Również tutaj nie są produkowane żadne glikoproteiny z a1,3-związanymi resztami fukozy, dzięki czemu również nie dochodzi do reakcji immunologicznej na epitop a1,3-fukozy.
Zgodnie z wynalazkiem opisano także cząsteczkę PNA, która zawiera sekwencję zasad, która jest komplementarna do sekwencji opisanej tu cząsteczki DNA oraz jej sekwencji częściowych. PNA (kwas peptydonukleinowy) jest sekwencją podobną do DNA, przy czym zasady nukleotydowe są przyłączone do szkieletu pseudopeptydowego. PNA hybrydyzuje ogólnie z komplementarnymi oligomerami DNA, RNA lub PNA na zasadzie tworzenia par Watsona-Cricka oraz tworzenia helis. Szkielet peptydowy zapewnia większą odporność na degradację enzymatyczną. Dzięki temu cząsteczka PNA jest ulepszonym reagentem w technologii antysensownej. Cząsteczki PNA nie są w stanie strawić ani nukleazy, ani proteazy. Stabilność cząsteczki PNA, gdy jest związana z sekwencją komplementarną, wykazuje dostateczne steryczne blokowanie polimeraz DNA i RNA, odwrotnej transkryptazy, telomerazy i rybosomów.
Gdy cząsteczka PNA zawiera wyżej wymienioną sekwencję, wiąże się ona z DNA lub z miejscem DNA kodującym GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazę, i może w ten sposób hamować transkrypcję tego enzymu. Cząsteczka PNA, ze względu na to, że nie ulega ani transkrypcji ani translacji, jest wytwarzana na drodze syntezy, np. za pomocą techniki t-Boc.
Zgodnie z wynalazkiem opisano także cząsteczkę kwasu peptydonukleinowego (PNA), która zawiera sekwencję zasad, która odpowiada sekwencji opisanej tu cząsteczki DNA oraz jej sekwencjom częściowym. Taka cząsteczka PNA tworzy kompleks z mRNA lub miejscem mRNA GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazy, hamując w ten sposób translację tego enzymu. Jest to podobne do działania antysensownego RNA. I tak np. szczególnie efektywnym obszarem tworzenia kompleksów jest region startu translacji lub również nie podlegające translacji regiony 5' mRNA.
W sposobie otrzymywania roślin komórek roślinnych lub roślin według wynalazku, albo ewentualnie komórek owadzich lub owadów, które wykazują zablokowaną ekspresję GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazy na poziomie transkrypcji lub translacji, wprowadza się do komórek opisane tu cząsteczki PNA. Do wprowadzenia cząsteczki PNA lub cząsteczek PNA do komórki stosuje się ponownie znane metody np. elektroporację lub mikroiniekcję. Wprowadzanie jest szczególnie efektywne gdy oligomery PNA są związane z peptydami przenikającymi do komórek np. transportanem lub pAntp (Pooga et al. 1998, Nature Biotechnology, 16; 857-861).
W sposobie otrzymywania rekombinowanych glikoprotein według wynalazku opisane tu rekombinowane rośliny lub komórki roślinne według wynalazku, albo ewentualnie rekombinowane owady lub komórki owadzie, w których wyciszono lub całkowicie stłumiono produkcję GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazy, lub rośliny lub komórki roślinne, albo ewentualnie owady lub komórki owadzie, do których wprowadzono opisanym tu sposobem cząsteczki PNA, transfekuje się genem, kodującym glikoproteinę, dzięki czemu są ekspresjonowane rekombinowane glikoproteiny. Przy tym komórki gospodarza lub gospodarz jak już powyżej także opisano są transfekowani opisanymi już powyżej wektorami zawierającymi geny dla pożądanych białek. Poddane transfekcji komórki roślinne, lub ewentualnie owadzie, ekspresjonują pożądane białPL 205 710 B1 ka, przy czym nie posiadają one żadnej lub prawie żadnej a1,3-związanej fukozy. Dzięki temu nie są wyzwalane wspomniane już powyżej żadne reakcje immunologiczne w organizmie ludzkim lub kręgowców. W tych systemach mogą być produkowane wszelkie białka.
W sposobie otrzymywania rekombinowanych ludzkich glikoprotein według wynalazku rekombinowane rośliny lub komórki roślinne według wynalazku albo ewentualnie rekombinowane owady lub komórki owadzie, w których wyciszono lub całkowicie stłumiono produkcję GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazy, lub rośliny lub komórki roślinne, albo ewentualnie owady lub komórki owadzie, do których wprowadzono opisanym tu sposobem cząsteczki PNA, transfekuje się genem, kodującym glikoproteinę, dzięki czemu są ekspresjonowane rekombinowane glikoproteiny. Sposób ten umożliwia produkcję ludzkich białek w roślinach (komórkach roślinnych), które, jeśli są przyjmowane przez ludzki organizm, nie wyzwalają żadnej reakcji immunologicznej skierowanej wobec a1,3-związanej reszty fukozy. Przy tym możliwe jest dzięki temu stosowanie w produkcji rekombinowanych glikoprotein gatunków roślin, które służą jako środki spożywcze, takie jak np. banan, ziemniak i/lub pomidor. Tkanki tej rośliny zawierają rekombinowaną glikoproteinę, dzięki czemu np. przez ekstrakcję rekombinowanej glikoproteiny z tej tkanki i następnie zaaplikowanie lub bezpośrednio przez spożycie tkanki roślinnej, rekombinowaną glikoproteina jest przyjmowana przez organizm ludzki.
Zalecany przy tym jest sposób otrzymywania rekombinowanych ludzkich glikoprotein do stosowania w medycynie, w którym rekombinowane rośliny lub komórki roślinne, albo ewentualnie rekombinowane owady lub komórki owadzie, w których wyciszono lub całkowicie stłumiono produkcję GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazy, lub rośliny lub komórki roślinne, albo ewentualnie owady lub komórki owadzie, do których wprowadzono opisanym tu sposobem cząsteczki PNA, transfekuje się genem, kodującym glikoproteinę, dzięki czemu są ekspresjonowane rekombinowane glikoproteiny. Przy tym uwzględnia się każde białko będące przedmiotem zainteresowania medycyny.
Zgodnie z wynalazkiem opisano także rekombinowane glikoproteiny, otrzymane sposobem wyżej opisanym w systemach roślinnych lub owadzich, i których sekwencja peptydowa wykazuje poniżej 50%, zwłaszcza poniżej 20%, szczególnie 0%, a1,3-związanych reszt fukozy występujących w białkach ekspresjonowanych w układach roślinnych lub owadzich o nie zredukowanej ilości fukozylotransferazy. Zalecane są oczywiście glikoproteiny, które nie posiadają a1,3-związanych reszt fukozy. Ilość a1,3-związanej fukozy jest zależna od stopnia wyciszenia GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazy opisanego powyżej.
Zgodnie z wynalazkiem opisano także rekombinowane ludzkie glikoproteiny, otrzymane sposobem powyżej opisanym w systemach roślinnych lub owadzich, i których sekwencja peptydowa wykazuje poniżej 50%, zwłaszcza poniżej 20%, szczególnie 0%, a1,3-związanych reszt fukozy występujących w białkach ekspresjonowanych w układach roślinnych lub owadzich o nie zredukowanej ilości fukozylotransferazy.
Szczególnie zalecane są rekombinowane glikoproteiny do zastosowań medycznych, wytworzone sposobem powyżej opisanym w systemach roślinnych lub owadzich, i których sekwencja peptydowa wykazuje poniżej 50%, zwłaszcza poniżej 20%, szczególnie 0%, a1,3-związanych reszt fukozy występujących w białkach ekspresjonowanych w układach roślinnych lub owadzich o nie zredukowanej ilości fukozylotransferazy.
Te glikoproteiny mogą posiadać inne związane jednostki oligosacharydowe, które są specyficzne dla roślin lub owadów, czym w przypadku ludzkich glikoprotein różnią się od naturalnie występujących glikoprotein. Pomimo tego, opisane tu glikoproteiny będą wywoływały mniejszą lub nie będą wywoływały prawie żadnej reakcji immunologicznej w organizmie ludzkim, ponieważ, jak już przedstawiono we wstępie opisu, a1,3-związane reszty fukozy są główną przyczyną reakcji immunologicznych lub krzyżowych reakcji immunologicznych wywoływanych przez glikoproteiny roślinne i owadzie.
Zgodnie z wynalazkiem opisano także kompozycję farmaceutyczną, zawierającą opisane tu glikoproteiny. Obok opisanych tu glikoprotein kompozycja farmaceutyczna może zawierać inne dodatki powszechnie stosowane w takich kompozycjach. Są to np. odpowiednie rozcieńczalniki z różnymi buforami (np. Tris-HCl, octan, fosforan), pH i siłą jonową, dodatkami, takimi jak np. związki powierzchniowo czynne i rozpuszczalniki (np. Tween 80, Polysorbate 80), konserwanty (np. Thimerosal, alkohol benzylowy) adiuwanty, antyutleniacze (np. kwas askorbinowy, disiarczyn disodu), emulgatory, wypełniacze (np. laktoza, mannitol), kowalencyjnie związane z białkiem polimery, takie jak np. glikol polietylowy, wbudowanie materiału w uformowane w cząsteczki preparaty z połączeń polimerowych, takie jak np. kwas polimlekowy, kwas poliglikolowy, itp., lub w liposomy, środki pomocnicze i/lub nośniki, które podczas każdego leczenia są przydatne. Takie kompozycje będą wpływać na stan fizyczny, stabilność, szybkość uwalniania in vivo, i szybkość wydzielania in vivo opisanych tu glikoprotein.
PL 205 710 B1
W sposobie selekcjonowania cząsteczek DNA kodujących GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazę w próbce według wynalazku, do próbki dodaje się znakowane opisane tu cząsteczki DNA, które wiążą się z cząsteczkami DNA kodującymi GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazę. Hybrydyzujące cząsteczki DNA mogą być poddawane detekcji, mierzone i selekcjonowane. Aby w próbce występował jednoniciowy DNA, z którym mogą hybrydyzować znakowane cząsteczki DNA, próbkę poddaje się denaturacji, np. przez podgrzewanie.
Jedną z możliwości jest, ewentualnie po dodaniu endonukleazy, rozdzielenie badanego DNA elektroforezą żelową na żelu agarozowym. Po przeniesieniu na błonę nitrocelulozową dodaje się znakowane opisane tu cząsteczki DNA, które hybrydyzują z odpowiednią homologiczną cząsteczką DNA („Southern Blotting).
Inną możliwością jest uzyskanie homologicznych genów z innych gatunków sposobami wykorzystującymi PCR poprzez zastosowanie specyficznych i/lub zdegenerowanych starterów, wywodzących się z sekwencji opisanej tu cząsteczki DNA.
Korzystnie w wyżej wymienionym sposobie próbka zawiera genomowy DNA organizmu roślinnego lub ewentualnie owada. Tym sposobem można bardzo szybko i wydajnie zbadać dużą ilość roślin i owadów pod kątem występowania genu GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazy. W ten sposób można selekcjonować rośliny i owady, które nie posiadają tego genu albo w takich roślinach i owadach, które posiadają ten gen, powyżej opisanym sposobem może być wyciszona lub całkowicie wytłumiona ekspresja GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazy, dzięki czemu mogą być stosowane następnie do transfekcji i wytwarzania (ludzkich) glikoprotein.
Opisano tu także cząsteczki DNA kodujące GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazę, które zostały wyselekcjonowane dwoma sposobami opisanymi powyżej, a następnie zostały wyizolowane z próbki. Te cząsteczki mogą być zastosowane w dalszych badaniach. Mogą być one zsekwencjonowane i zastosowane też jako sondy DNA do znajdywania GlcNAc-a1,3-fukozylotransferaz. Te znakowane cząsteczki DNA dla organizmów, które są spokrewnione z organizmami, z których zostały one wyizolowane, będą funkcjonować wydajniej jako sondy, niż opisane tu cząsteczki DNA.
Zgodnie z wynalazkiem opisano także preparat sklonowanej zgodnie z wynalazkiem GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazy, która posiada izoformy o wartościach pl pomiędzy 6,0, a 9,0, zwłaszcza pomiędzy 6,8, a 8,2. Wartość pH dla białka jest tą wartością pH, dla której jego ładunek netto wynosi zero i zależy od sekwencji aminokwasów, wzoru glikozylacji oraz struktury przestrzennej białka. GlcNAc-a1,3-fukozylotransferaza ma przynajmniej 7 izoform, które mają wartość pl w tym zakresie. Przyczyną istnienia różnych izoform transferazy są np. różne glikozylacje oraz ograniczona proteoliza. Badania pokazały, że w siewkach z fasoli Mung pochodzących z różnych roślin są różne proporcje izozymów. Wartość pl białka może być określona za pomocą izoogniskowania elektrycznego, które jest znane specjaliście.
Główna izoforma enzymu wykazuje masę cząsteczkową 54 kDa.
Dogodnie opisany tu preparat posiada izoformy o wartościach pl wynoszących 6,8, 7,1 i 7,6.
Zgodnie z wynalazkiem opisano także sposób otrzymywania „uroślinnionych jednostek węglowodanowych z ludzkich lub innych kręgowcowych glikoprotein, przy czym do próbki, która zawiera jednostkę węglowodanową lub glikoproteinę, dodaje się jednostki fukozowe oraz kodowaną przez wyżej opisaną cząsteczkę DNA GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazę, dzięki czemu fukoza zostaje związana w pozycji α1,3 przez GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazę z jednostką węglowodanową lub glikoproteiną. Sposób klonowania GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazy umożliwia otrzymanie dużych ilości oczyszczonego enzymu. W celu uzyskania w pełni aktywnej transferazy, stosuje się odpowiednie warunki reakcji. Okazało się, że transferaza posiada szczególnie wysoką aktywność przy wartości pH około 7, gdy stosuje się bufor kwasu 2-(N-morfolino)etanosulfonowego-HCl. W obecności dwuwartościowych kationów, zwłaszcza Mn2+, wzmacniana jest aktywność rekombinowanej transferazy. Jednostka węglowodanowa jest dodawana do próbki w postaci związanej lub w postaci niezwiązanej z białkiem. Rekombinowana transferaza wykazuje aktywność wobec obu form.
Wynalazek zostanie dalej wyjaśniony na podstawie figur i rysunków, do których nie jest oczywiście ograniczony. Figura 1a i 1b przedstawia szczegółowo na rysunku mierzone ilości białka i mierzoną aktywność enzymatyczną w pojedynczych frakcjach eluatu w postaci krzywej; Fig. 2 przedstawia zdjęcie żelu po elektroforezie GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazy; Fig. 3 przedstawia wynik izoogniskowania elektrycznego i mierzoną aktywność transferazową poszczególnych izoform; Fig. 4 - N-końcowe sekwencje 4 tryptycznych peptydów 1-4 oraz sekwencję DNA trzech starterów S1, A2 i A3; Fig. 5a i 5b - sekwencję cDNA a1,3-fukozylotransferazy; Fig. 6a i 6b - pochodzącą od nich sekwencję aminokwasową a1,3-fukozylotransferazy; Fig. 7 przedstawia schemat a1,3-fukozylotransferazy i hydrofobowość
PL 205 710 B1 reszt aminokwasowych; Fig. 8 - porównanie motywów konserwowanych różnych fukozylotransferaz; Fig. 9 - porównanie aktywności fukozylotransferazy z komórek owadzich transfekowanych genem GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazy z kontrolą negatywną; Fig. 10a i 10b - struktury różnych akceptorów a1,3-fukozylotransferazy; Fig. 11 i 12 - widma masowe; i Fig. 13 - wynik HPLC.
P r z y k ł a d 1
Izolowanie rdzeniowej-a1,3-fukozylotransferazy
Wszystkie etapy prowadzono w 4°C. Siewki fasoli Mung homogenizowano w mikserze, przy czym stosowano 0,75 objętości buforu ekstrakcyjnego na kg fasoli. Homogenizat był następnie filtrowany przez dwie warstwy bawełny i filtrat odwirowywano przy 30000xg przez 40 min. Supernatant odrzucano a osad ekstrahowano przez noc w buforze do rozcieńczeń stale mieszając. Następnie odwirowywano przy 30000xg przez 40 min otrzymując ekstrakt Tritonowy.
Ekstrakt Tritonowy oczyszczano następująco:
Etap 1: Ekstrakt Tritonowy nanoszono na mikrogranularny wymieniacz anionowy dietyloaminoetylocelulozowy DE52 kolumny celulozowej (5x28 cm, Fa. Whatman), zrównoważony wcześniej buforem A. Niezwiązana frakcja była obrabiana dalej w etapie 2.
Etap 2: Próbkę nanoszono na zrównoważoną buforem A kolumnę Affi-Gel Blue (2,5x32). Po przemyciu kolumny tym buforem zaadsorbowane białko eluowano buforem A zawierającym 0,5 M NaCl.
Etap 3: Po dializie eluatu z etapu 2 wobec buforu B 20 był on równoważony w tym samym buforze i nanoszony na kolumnę S-Sepharose. Związane białko eluowano liniowym gradientem od 0 do 0,5 M NaCl w buforze B. Frakcje z GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazą zbierano i dializowano wobec buforu C.
Etap 4: Dializowana próbka była nanoszona na zrównoważoną buforem C kolumnę GnGn-Sepharose. Związane białko eluowano buforem C zawierającym 1 M NaCl w miejsce MnCl2.
Etap 5: Enzym następnie dializowano wobec buforu D i nanoszono na kolumnę GDP-heksanoloamino-Sepharose. Po przemyciu kolumny buforem D eluowano transferazę zastępując MgCl2 i NaCl przez 0,5 mM GDP. Aktywne frakcje zbierano, dializowano wobec buforu 20 mM Tris-HCl, pH 7,3, i liofilizowano.
Aktywność enzymatyczną GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazy określano przez zastosowanie peptydu GnGn i GDP-L-[U-14C] fukozy przy stężeniach substratu każdorazowo 0,5 i 0,25, w obecności buforu kwasu 2-(N-morfolino)etanosulfonowego-HCl, Triton X-100, MnCl2, GlcNAc i AMP (według Staudacher et al. 1998 Glycoconjugate J. 15, 355-360; Staudacher et al. 1991 Eur.J.Biochem. 199, 745-751).
Stężenia białka określano za pomocą metody kwasu bicinchoninowego (Pierce) lub, w ostatnich etapach oczyszczania enzymu, za pomocą analizy aminokwasów (Altmann 1992 Anal.Biochem. 204, 215-219).
Fig. 1a i 1b przedstawia w postaci krzywych mierzone ilości białka i mierzoną aktywność enzymatyczną pojedynczych frakcji eluatu. Fig. 1a pokazuje opisany powyżej rozdział na kolumnie z S-Sepharose, Fig. 1b pokazuje rozdział na kolumnie z GnGn-Sepharose, przy czym kółko oznacza białko, czarne, pełne koło GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazę a kwadrat N-acetyl-e-glukozaminidazę. U określa ilość enzymu, która przenosi 1 μmol fukozy na akceptor przez jedną minutę.
Tabela 1 pokazuje poszczególne etapy oczyszczania transferazy.
T a b e l a 1
etap oczyszczania całkowite białko całkowita aktywność aktywność specyficzna stopień oczyszczania wydajność
Triton X-100 mg mU mU/mg x-razy %
ekstrakt 91500 4846 0,05 1 100
DE52 43700 4750 0,10 2 98,0
Affigel Blue 180,5 4134 23 460 85,3
S-Sepharose 8,4 3251 390 7800 67,1
GnGn-Sepharose 0,131 1044 8030 160000 21,5
GDP-Heksanoloamino-Sepharose 0,021 867 43350 867000 17,9
1 uzyskano za pomocą analizy aminokwasów
PL 205 710 B1 bufor ekstrakcyjny:
0,5 mM ditiotreitol mM EDTA
0,5% poliwinylopolipirolidon
0,25 M sacharoza bufor 50 mM Tris-HCl, pH 7,3 bufor do roztworu:
0,5 mM ditiotreitol 1 mM EDTA
1,5% triton X-100 mM Tris-HCl, pH 7,3 bufor A:
mM Tris-HCl bufor, pH 7,3 z:
0,1% Triton X-100 i
0,02% NaN3 bufor B:
mM bufor Na-cytrynianowy, pH 5,3 z:
0,1% Triton X-100 i
0,02% NaN3 bufor C:
mM bufor Tris-HCl, pH 7,3 z:
mM MnCl2 i
0,02% NaN3 bufor D:
mM Tris-HCl, pH 7,3 z:
mM MgCl2,
0,1 M NaCl i
0,02% NaN3
P r z y k ł a d 2:
SDS-Page i izoogniskowanie elektryczne
SDS-Page prowadzono w oprawie Biorad-Mini-Protean na żelach z 12,5% akrylamidem i 1% bisakrylamidem. Żele wybarwiano Coomassie Brilliant Blue R-250 lub srebrem. Izoogniskowanie elektryczne fukozylotransferazy przeprowadzono na gotowych żelach z zakresem pl pomiędzy 6-9 (Servalyt precotes 6-9, Serva). Żele wybarwiano srebrem według protokołu producenta. Do elektroforezy dwuwymiarowej prążki z elektroforezy wycinano z żelu do ogniskowania, traktowano odczynnikiem S-akilującym i SDS, i prowadzono SDS-Page jak wyżej opisano.
Fig. 2 przedstawia zdjęcie żelu GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazy po elektroforezie, przy czym po lewej stronie przedstawiono elektroforezę dwuwymiarową a po prawej stronie jednowymiarową SDS-Page. Przy czym linia oznaczona jako A to standard, linia oznaczona jako B to GlcNAc-a1,3-fukozylotransferaza z kolumny GnGn-Sepharose i linia oznaczona jako C to „oczyszczona GlcNAc-a1,3-fukozylotransferaza, tj. frakcja z kolumny GDP-heksanoloaminowej-Sepharose. Dwa prążki odpowiadające 54 i 56 kDa przedstawiają izoformy transferazy.
Fig. 3 przedstawia wynik izoogniskowania elektrycznego. Linia A była wybarwiana srebrem, na linii B testowano aktywność izoform transferazy. Aktywność podano przy tym jako ilość fukozy w %, która była przenoszona z GDP-Fukozy na substrat.
P r z y k ł a d 3:
Sekwencjonowanie peptydu
Do sekwencjonowania białka wycinano prążki z żelu SDS-poliakrylamidowego wybarwionego przy użyciu Coomassie, karboksyamidmetylowano i wycięto trypsyną według Gorg et al. 1988, Electrophoresis, 9, 681-692. Tryptyczne peptydy rozdzielano na HPLC z odwróconą fazą na 1,0x250 mm Vydac C18 w 40°C z przepływem 0,05 ml/min, przy czym stosowano aparat HP 1100 (Hewlett-Packard). Izolowane peptydy sekwencjonowano w układzie do sekwencjonowania białek z Hewlett-Packard G1005A postępując według protokołu producenta. Następnie mieszaninę peptydów analizowano przez trawienie Ingel za pomocą MALDI-TOF MS (patrz niżej).
Fig. 4 przedstawia N-końcowe sekwencje 4 peptydów tryptycznych 1-4 (SEQ ID No: 5-8). W oparciu o pierwsze trzy peptydy otrzymano startery S1, A2 i A3 (numery identyfikacyjne sekwencji 9-11).
PL 205 710 B1
P r z y k ł a d 4:
RT-PCR i klonowanie cDNA
Całkowity RNA izolowano z 3 dniowych liścieni fasoli Mung, przy czym stosowano system do izolacji SV Total RNA produkowany przez Promega. Do uzyskania pierwszej nici cDNA inkubowano całkowity RNA przez 1 godz. w 48°C z odwrotną transkryptazą AMV i starterami Oligo(dT), przy czym stosowano Reverse Transkription System z Promega.
Pierwszą nić cDNA poddawano reakcji PCR, przy czym stosowano kombinację sensownych i antysensownych starterów: Do 10 μl mieszaniny reakcji do reakcji odwrotnej transkrypcji dodawano następujące składniki: 50 μl każdego z 0,1 umol roztworu starterów, 0,1 mM dNTP, 2 mM MgCl2, 10 mM bufor Tris-HCl, pH 9,0, 50 mM KCl i 0,1% Triton X-100.
Po pierwszym etapie denaturacji w 95°C przez 2 min, następowały 40 cykle po 1 min w 95°C, 1 min w 49°C i 2 min w 72°C. Ostatni etap wydłużania przeprowadzono w 72°C przez 8 min. Produkty PCR subklonowano do wektora pCR2.1, przy czym stosowano zestaw TA Cloning Kit z Invitrogen i sekwencjonowano. Produktami tej PCR były dwa fragmenty DNA o długości od 744 bp i 780 bp, przy czym obydwa fragmenty DNA wykazywały taki sam koniec 5'(patrz również Fig. 7).
W oparciu o te dwa fragmenty DNA, brakujące regiony 5' i 3' cDNA otrzymywano szybką amplifikacją 5'- i 3'- końców cDNA (RACE), przy czym stosowano zestaw RACE Kit z Gibco-BRL. Jako starter antysensowny zastosowano uniwersalny starter do amplifikacji z zestawu a jako starter sensowny stosowano albo 5'-CTGGAACTGTCCCTGTGGTT-3' (SEQ ID No: 12) albo 5'AGTGCACTAGAGGGCCAGAA-3' (SEQ ID No: 13). Jako starter sensowny stosowano też skrócony starter kotwiczący z zestawu a jako starter antysensowny stosowano 5'-TTCGAGCACCACAATTGGAAAT-3' (SEQ ID No: 14) albo 5'-GAATGCAAAGACGGCACGATGAAT-3' (SEQ ID No: 15).
PCR przeprowadzono w warunkach opisanych powyżej w temperaturze przyłączania starterów 55°C. Produkty 5' i 3' RACE subklonowano do wektora pCR2.1 i sekwencjonowano. Sekwencje subklonowanych fragmentów sekwencjonowano metodą dideoksy-nukleotydową (ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Ready reaction Kit i ABI PRISM 310 Genetic analyser (Perkin Elmer)). Do sekwencjonowania produktów wklonowanych do wektora pCR2.1 stosowano startery zgodne T7 i M13. Obydwie nicie regionu kodującego sekwencjonowano w wiedeńskim VBC Genomics-Sequencing Service, przy czym stosowano znakowane w podczerwieni startery (IRD700 i IRD800) i sekwenotor LI-COR Long Read IR 4200 (Lincoln, NE).
Fig. 5a i 5b pokazują całkowity cDNA, o wielkości 2198 bp z otwartą ramką odczytu 1530 bp (SEQ ID No: 1). Otwarta ramka odczytu (kodon startu przy parach zasad 211-213, kodon stopu przy parach zasad 1740-1743) koduje białko z 510 aminokwasów o masie cząsteczkowej 56,8 kDa i teoretyczną wartością pl 7.51.
Fig. 6a i 6b pokazują sekwencję aminokwasową uzyskaną z cDNA GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazy (SEQ ID No: 2). Miejsca glikozylycji asparaginowej znajdują się w pozycjach Asn346 i Asn429.
Fig. 7 przedstawia schematycznie cDNA GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazy (na górze) i uzyskany wskaźnik hydrofobowości kodowanego białka (na dole), przy czym dodatni wskaźnik hydrofobowości oznacza podwyższoną hydrofobowość. Jednocześnie przedstawiono wielkości obydwu wyżej wspomnianych produktów PCR w odniesieniu do pełnego cDNA. Obszar kodujący oznaczono kreską, przy czym C oznacza postulowy obszar cytoplazmatyczny, T oznacza postulowany obszar przezbłonowy i G oznacza postulowany katalityczny obszar transferazy znajdujący się wewnątrz pęcherzyka Golgiego. Analiza sekwencji DNA za pomocą TMpred (EMBnet, Szwajcaria) umiejscawia przypuszczalny region przezbłonowy pomiędzy Asn36 i Gly54. C-końcowy obszar enzymu zawiera przypuszczalnie region katalityczny i powinien wobec tego znajdować się wewnątrz aparatu Golgiego. Zatem transferaza wydaje się być białkiem przezbłonowym typu II, jak wszystkie dotychczas analizowane glikozylotransferazy, które odgrywają rolę w biosyntezie glikoprotein (Joziasse, 1992 Glycobiology 2, 271-277). Obszary szare przedstawiają cztery peptydy tryptyczne, a sześciokąt miejsca potencjalnej N-glikozylacji. Dostępne przez NCBI przeszukiwanie BLASTP wszystkich baz danych wykazało istnienie podobieństwa pomiędzy GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazą i innymi a1,3/4-fukozylotransferazami, np. ludzką fukozylotransferazą VI. W przypadku 18-21% (zbadane przez SIM-LALNVIEW, Expase, Szwajcaria) całkowite podobieństwo okazało się ono znaczące. Jednak, obszar sekwencji z 35 aminokwasów (SEQ ID No: 4) posiada niezwykle wysoką homologię do innych α1,3/4 fukozylotransferaz (Fig. 8). Ten obszar sekwencji znajduje się pomiędzy Glu267 i Pro301 z SEQ ID No: 2.
PL 205 710 B1
P r z y k ł a d 5:
Ekspresja rekombinowanej GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazy w komórkach owadów
Region kodujący przypuszczalnej GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazy wraz z regionem cytoplazmatycznym i przezbłonowym amplifikowano korzystając z zestawu Expand High Fidelity PCR System z Boehringer Mannheim stosując starter zgodny 5'-CGGCGGATCCGCAATTGAATGATG-3' (SEQ ID NO: 16) i starter odwrotny 5'-CCGGCTGCAGTACCATTTAGCGCAT-3' (SEQ ID No: 17). Produkt PCR trawiono dwukrotnie z użyciem Pstl i BamHl i subklonowano do traktowanego alkaliczną fosfatazą bakulowirusowego wektora do transferu pVL1393, który uprzednio strawiono z użyciem Pstl i BamHI. Aby zapewnić rekombinację homologiczną, wektor transferowy z wirusowym DNA Baculo Gold (PharMingen, San Diego, CA) był współtransfekowany do komórek owadów Sf9 w medium IPL-41 z lipofektyną. Po 5-dniowej inkubacji w 27°C stosowano różne objętości supernatantu z rekombinowanym wirusem do infekowania owadzich komórek Sf21. Po 4 dniowej inkubacji w 27°C w medium IPL-41 z 5% FCS, komórki Sf1 zbierano i przemywano dwukrotnie buforowanym fosforanem roztworem soli. Komórki zawieszano w 25 mM buforu Tris HCl, pH 7,4, z 2% Triton X-100 i przez sonifikację otwierano dla uzyskania białka.
P r z y k ł a d 6:
Test aktywności GlcNAc a1,3-fukozylotransferazy
Homogenat i supernatant komórkowy testowano pod względem aktywności GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazową. Próby ślepe zostały przeprowadzone z rekombinowanym bakulowirusem kodującym GlcNAc-transferazę I tytoniu (Strasser et al. 1999, Glycobiology, w druku).
Fig. 9 pokazuje mierzoną aktywność enzymatyczną rekombinowanej GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazy oraz kontroli negatywnej. W najlepszym przypadku aktywność enzymatyczna komórek poddanych kotransfekcji i ich supernatantów komórkowych była 30-krotnie wyższa niż aktywność kontroli negatywnych. Ta aktywność endogenna, która jest mierzona przy braku rekombinowanej transferazy, zasadniczo pochodzi od owadziej a1,6-fukozylotransferazy i tylko w niewielkim procencie od GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazy. Dlatego też podwyższenie GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazy, pochodzącej od rekombinowanych bakulowirusów, przekracza 100-krotność.
Enzym wykazał szeroką aktywność maksymalną przy wartości pH 7,0, gdy aktywność była mierzona w buforze kwasu 2-(N-morfolino)etanosulfonowego-HCl. Jak widać w tabeli 2, dodanie kationów dwuwartościowych, szczególnie Mn2+, zwiększa aktywność rekombinowanej transferazy.
T a b e l a 2 środek dodatkowy względna aktywność (stęż. 10 mM) (Akceptor: Peptyd GnGn) %
nie ma 21
EDTA 18
MnCl2 100
CaCl2 82
MgCl2 52
CdCl2 44
CoCl2 35
CuCl2 3
NiCl2 24
ZnCl2 0,6
Tabela 3 pokazuje, że spośród zastosowanych akceptorów peptyd GnGn posiada najwyższy stopień wbudowywania w standardowych warunkach badań, tuż za nim są peptyd GnGnF6 i M5Gn-Asn. Nie można było stwierdzić przenoszenia na peptyd MM, który nie posiada redukującego końca GlcNAc na 3-związanej mannozie. Struktura ta wydaje się być konieczna dla rdzeniowej fukozylotransferazy. Rekombinowana transferaza była ponadto nieaktywna wobec dostępnych akceptorów, przy czym a1,3/4-fukozylotransferaza stosowana do określenia grup krwi, przenosi fukozę na GlcNAc na nieredukujących końcach oligosacharydów. Pozorne wartości Km dla substratów akceptorowych
PL 205 710 B1 peptyd GnGn, peptyd GnGnF6, M5Gn-Asn i dla substratu donorowego GDP-fukozy wynosiły odpowiednio 0,19, 0,13, 0,23 lub 0,11. Struktury cząsteczek zostały przedstawione na Fig. 10a i 10b.
T a b e l a 3
Substrat akceptorowy aktywność wzgl. wartość Km
% mM
Peptyd GnGn 100 0,19
Peptyd GnGnF6 87 0,13
M5Gn-Asn 71 0,23
Peptyd MM 0
Gale1-4GlcNAc 0
Gale1-3GlcNAc 0
Gale1-3GlcNAce1-3Gale1-4Glc 0
P r z y k ł a d 7:
Spektrometria masowa produktu fukozylotransferazy
Dabsylowany heksapeptyd GnGn (2 nmol) inkubowano wraz z homogenatem z komórek owadzich zawierających rekombinowaną GlcNAc-a1,3 fukozylotransferazę (0.08 mU) w obecności nieradioaktywnej GDP-L-fukozy (10 nmol), buforu kwasu 2-(N-morfolino)etanosulfonowego-HCL, Triton X-100, MnCl2, GlcNAc i AMP. Kontrola negatywna została przeprowadzona przy użyciu homogenatu komórek owadzich zainfekowanych próbami ślepymi. Próbki inkubowano przez 16 godz. w 37°C i analizowano za pomocą spektrometrii masowej MALDI TOF.
Spektrometria masowa była przeprowadzona za pomocą DYNAMO (Therrmo BioAnalysis, Santa Fe, NM), spektrometru typu MALDI-TOF MS, który zdolny jest do dynamicznej ekstrakcji (synonim późnej ekstrakcji). Zastosowano dwa rodzaje preparatów macierzy prób: peptydy i dabsylowane glikolipidy rozpuszczano w 5% kwasie mrówkowym i nanoszono równoważnik na cel, suszono na powietrzu i przykrywano 1% kwasem a-cyjano-4-hydroksycynamonowym. Pirydyloaminowane glikany, zredukowane oligosacharydy i glikopeptydy nie poddawane obróbce rozcieńczano w wodzie, nanoszono na cel i suszono na powietrzu. Po dodaniu 2% kwasu 2,5-dihydroksybenzoesowego suszono próby bezzwłocznie pod próżnią.
Fig. 11 pokazuje widmo masowe tych próbek, przy czym A przedstawia kontrolę negatywną: główny pik (S) przedstawia substrat dabsylo-Val-Gly-Glu-(GlcNAc4Man3)Asn-Arg-Thr, przy czym wyliczona wartość [M+H]+ wynosi 2262.3. Substrat ten wydaje się być również produktem addycji na sodzie i jako mniejszy jon, który powstaje przez fragmentację grupy azotowej w grupie dabsylowej, przy (S*). Małą ilość produktu (P, [M+H] + = 2408.4) należy sprowadzić do endogennej a1,6-fukozylotransferazy. Pik przy m/z - 2424.0 przedstawia niepełną degalaktozylację substratu. Widmo masowe B pokazuje próbkę z rekombinowaną a1,3-fukozylotransferazą. Główny pik (P) stanowi produkt fukozylacji, (P*) jego jon fragmentowany.
Dodatkowo zmieszano równe ilości obydwu próbek, aby uzyskać podobne stężenia substratu i produktu (Próbka A). Tę mieszaninę rozcieńczano 0,1 M octanem amonu, pH 4,0, zawierającym 10 μU N-glikozydazy A (Próbka B) lub 50 mM Tris/HCl, pH 8,5, zawierającym 100 μU (1 U hydrolizuje 1 μmol substratu na minutę) N-glikozydazy F (Próbka C). Po 2 i 20 godz. pobierano małe równe ilości tych mieszanin i analizowano za pomocą MALDI-TOF MS.
Fig. 12 przedstawia trzy widma masowe próbek A, B i C. Niestrawiona próbka A pokazuje dwa główne piki: substrat przy 2261.4 m/z i fukozylowany produkt przy 2407.7 m/z. Środkowa krzywa pokazuje widmo masowe próbki B, traktowanej N-glikozydazą A, która hydrolizuje obydwa glikopeptydy. Pik przy 963.32 stanowi deglikozylowany produkt. Dolna krzywa pokazuje widmo masowe próbki C. N-glikozydaza F nie jest w stanie hydrolizować substratu α1,3 fukozylowanego, przez co widmo posiada pik przy 2406,7 m/z odpowiadający produktowi fukozylowanemu, podczas gdy pik hydrolizowanego substratu występuje przy 963,08 m/z.
P r z y k ł a d 8:
Analiza HPLC pirydyloaminowanego produktu fukozylotransferazy
Obydwie wyżej opisane próbki (produkt fukozylowany i kontrola negatywna) trawiono N-glikozydazą A. Otrzymane oligosacharydy pirydyloaminowano i analizowano techniką HPLC z odwróconą
PL 205 710 B1 fazą (Wilson et al. 1998 Glycobiology 8, 651-661; Kubełka et al. 1994 Arch.Biochem.Biophys. 308, 148-157; Hase et al. 1984 J. Biochem. 95, 197-203).
Fig. 13 przedstawia na górnym diagramie B kontrolę negatywną, przy czym obok resztkowego substratu (peptyd GnGn) można zobaczyć produkt a1,6 fukozylowany. A prezentuje pik o znacznie obniżonym czasie retencji, co jest specyficzne dla a1,3-fukozy związanej z redukującym GlcNAc.
Na dolnym diagramie porównano wyizolowany produkt transferazy przed (krzywa A) i po trawieniu N-Acetylo-6-glukozoaminidazą (krzywa B) z MMF3 z pszczelej fosfolipazy Az (krzywa C).
<110> Altmann Dr, Friedrich <12 0> Sposoby otrzymywania rekombinowanych glikoprotein, sposób otrzymywania rekombinowanych roślinnych komórek gospodarza lub roślin z wytłumioną lub całkowicie wyłączoną produkcją GlcNAc-al,3fukozylotrasferazy, sposób otrzymywania rekombinowanych roślinnych komórek gospodarza lub roślin, rekombinowane komórki roślinne, rekombinowane rośliny, sposób otrzymywania rekombinowanych komórek roślinnych z zablokowaną ekspresją GlcNAc-al,3-fukozylotrasferazy, sposoby otrzymywania rekombinowanych ludzkich glikoprotein, zwłaszcza do zastosowań medycznych oraz sposób selekcjonowania cząsteczek DNA <130> R 36247 <140>
<141>
<160> 17 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 2198 <212> DNA <213> roślina <400> 1
actaactcaa acgctgcatt ttcttttttc tttcagggaa ccatccaccc ataacaacaa 60
aaaaaacaac agcaagctgt gtttttttta tcgttctttt tctttaaaca agcaccccca 120
tcatggaatc gtgctcataa cgccaaaatt ttccatttcc ctttgatttt tagtttattt 180
tgcggaattg gcagttgggg gcgcaattga atgatgggtc tgttgacgaa tcttcgaggc 240
tcgagaacag atggtgccca acaagacagc ttacccgttt tggctccggg aggcaaccca 300
aagaggaaat ggagcaatct aatgcctctt gttgttgccc ttgtggtcat cgcggagatc 360
gcgtttctgg gtaggttgga tatggccaaa aacgccgcca tggttgactc cctcgctgac 420
ttcttctacc gctctcgagc ggtcgttgaa ggtgacgatt tggggttggg tttggtggct 480
PL 205 710 B1
tctgatcgga attctgaatc gtatagttgt gaggaatggt tggagaggga ggatgctgtc 540
acgtattcga ggggcttttc caaagagcct atttttgttt ctggagctga tcaggagtgg 600
aagtcgtgtt cggttggatg taaatttggg tttagtgggg atagaaagcc agatgccgca 660
tttgggttac ctcaaccaag tggaacagct agcattctgc gatcaatgga atcagcagaa 720
tactatgctg agaacaatat tgccatggca agacggaggg gatataacat cgtaatgaca 780
accagtctat cttcggatgt tcctgttgga tatttttcat gggctgagta tgatatgatg 840
gcaccagtgc agccgaaaac tgaagctgct cttgcagctg ctttcatttc caattgtggt 900
gctcgaaatt tccggttgca agctcttgag gcccttgaaa aatcaaacat caaaattgat 960
tcttatggtg gttgtcacag gaaccgtgat ggaagagtga acaaagtgga agccctgaag 102
cactacaaat ttagcttagc gtttgaaaat tcgaatgagg aagattatgt aactgaaaaa 108
ttcttccaat cccttgttgc tggaactgtc cctgtggttg ttggtgctcc aaatattcag 114
gactttgctc cttctcctgg ttcaatttta catattaaag agatagagga tgttgagtct 1200 gttgcaaaga ccatgagata tctagcagaa aatcccgaag catataatca atcattgagg 1260 tggaagtatg agggtccatc tgactccttc aaggcccttg tggatatggc agctgtgcat 1320 tcatcgtgcc gtctttgcat tcacttggcc acagtgagta gagagaagga agaaaataat 1380 ccaagcctta agagacgtcc ttgcaagtgc actagagggc cagaaaccgt atatcatatc 1440 tatgtcagag aaaggggaag gtttgagatg gagtccattt acctgaggtc tagcaattta 1500 actctgaatg ctgtgaaggc tgctgttgtt ttgaagttca catccctgaa tcttgtgcct 1560 gtatggaaga ctgaaaggcc tgaagttata agagggggga gtgctttaaa actctacaaa 1620
atatacccaa ttggcttgac acagagacaa gctctttata ccttcagctt caaaggtgat 1680
gctgatttca ggagtcactt ggagaacaat ccttgtgcca agtttgaagt catttttgtg 1740
tagcatgcgc taaatggtac ctctgctcta cctgaattag cttcacttag ctgagcacta 1800
gctagagttt taggaatgag tatggcagtg aatatggcat ggctttattt atgcctagtt 1860
tcttggccaa ctcattgatg ttttgtataa gacatcacac tttaatttta aacttgtttc 1920
tgtagaagtg caaatccata tttaatgctt agttttagtg ctcttatctg atcatctaga 1980
agtcacagtt cttgtatatt gtgagtgaaa actgaaatct aatagaagga tcagatgttt 2040
cactcaagac acattattac ttcatgttgt tttgatgatc tcgagctttt ttagtgtctg 2100
gaactgtccc tgtggtttga gcacctgtta ttgcttcagt gttactgtcc agtggttatc 2160
gtttttgacc tctaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaa 2198
PL 205 710 B1
PL 205 710 B1
Ser Arg Gly Phe Ser Lys Glu Pro
115 120
Glu Trp Lys Ser Cys Ser Val Gly
130 135
Arg Lys Pro Asp Ala Ala Phe Gly
145 150
Ser Ile Leu Arg Ser Met Glu Ser
165
Ile Ala Met Ala Arg Arg Arg Gly
180
Leu Ser Ser Asp Val Pro Val Gly
195 200
Met Met Ala Pro Val Gin Pro Lys
210 215
Phe Ile Ser Asn Cys Gly Ala Arg
225 230
Ala Leu Glu Lys Ser Asn Ile Lys
245
Arg Asn Arg Asp Gly Arg Val Asn
260
Ile Phe Val Ser Gly Ala Asp Gin
125
Cys Lys Phe Gly Phe Ser Gly Asp
140
Leu Pro Gin Pro Ser Gly Thr Ala
155 160
Ala Glu Tyr Tyr Ala Glu Asn Asn
170 175
Tyr Asn Ile Val Met Thr Thr Ser
185 190
Tyr Phe Ser Trp Ala Glu Tyr Asp
205
Thr Glu Ala Ala Leu Ala Ala Ala
220
Asn Phe Arg Leu Gin Ala Leu Glu
235 240
Ile Asp Ser Tyr Gly Gly Cys His
250 255
Lys Val Glu Ala Leu Lys His Tyr
265 270
PL 205 710 B1
Lys Phe Ser Leu Ala Phe Glu Asn
275 280
Glu Lys Phe Phe Gin Ser Leu Val
290 295
Gly Ala Pro Asn Ile Gin Asp Phe
305 310
His Ile Lys Glu Ile Glu Asp Val
325
Tyr Leu Ala Glu Asn Pro Glu Ala
340
Tyr Glu Gly Pro Ser Asp Ser Phe
355 360
Val His Ser Ser Cys Arg Leu Cys
370 375
Glu Lys Glu Glu Asn Asn Pro Ser
385 390
Thr Arg Gly Pro Glu Thr Val Tyr
405
Ser Asn Glu Glu Asp Tyr Val Thr
285
Ala Gly Thr Val Pro Val Val Val
300
Ala Pro Ser Pro Gly Ser Ile Leu
315 320
Glu Ser Val Ala Lys Thr Met Arg
330 335
Tyr Asn Gin Ser Leu Arg Trp Lys
345 350
Lys Ala Leu Val Asp Met Ala Ala
365
Ile His Leu Ala Thr Val Ser Arg
380
Leu Lys Arg Arg Pro Cys Lys Cys
395 400
His Ile Tyr Val Arg Glu Arg Gly
410 415
PL 205 710 B1
Arg Phe Glu Met Glu Ser Ile Tyr Leu Arg Ser Ser Asn Leu Thr Leu
420 425 430
Asn Ala Val Lys Ala Ala Val Val Leu Lys Phe Thr Ser Leu Asn Leu
435 440 445
Val Pro Val Trp Lys Thr Glu Arg Pro Glu Val Ile Arg Gly Gly Ser
450 455 460
Ala Leu Lys Leu Tyr Lys Ile Tyr Pro Ile Gly Leu Thr Gin Arg Gin.
465 470 475 480
Ala Leu Tyr Thr Phe Ser Phe Lys Gly Asp Ala Asp Phe Arg Ser His
485 490 495
Leu Glu Asn Asn Pro Cys Ala Lys Phe Glu Val Ile Phe Val
500 505 510 <210> 3 <211> 105 <212> DNA <213> sekwencja sztuczna <220>
<223> Opis sekwencji sztucznej:cDNA <400> 3 gaagccctga agcactacaa atttagctta gcgtttgaaa attcgaatga ggaagattat 60
PL 205 710 B1 gtaactgaaa aattcttcca atcccttgtt gctggaactg tccct 105 <210> 4 <211> 35 <212> PRT <213> sekwencja sztuczna <220>
<223> Opis sekwencji sztucznej:peptyd <400> 4
Glu Ala Leu Lys His Tyr Lys Phe Ser Leu Ala Phe Glu Asn Ser Asn
10 15
Glu Glu Asp Tyr Val Thr Glu Lys Phe Phe Gin Ser Leu Val Ala Gly
25 30
Thr Val Pro <210> 5 <211> 15 <212> PRT <213> sekwencja sztuczna <220>
<223> Opis sekwencji sztucznej:peptyd
PL 205 710 B1 <400> 5
Lys Pro Asp Ala Xaa Phe Gly Leu Pro Gin Pro Ser Thr Ala Ser
10 15 <210> 6 <211> 10 <212> PRT <213> sekwencja sztuczna <220>
<223> Opis sekwencji sztucznej:peptyd <400> 6
Pro Glu Thr Val Tyr His Ile Tyr Val Arg
10 <210> 7 <211> 13 <212> PRT <213> sekwencja sztuczna <220>
<223> Opis sekwencji sztucznej:peptyd <400> 7
Met Glu Ser Ala Glu Tyr Tyr Ala Glu Asn Asn Ile Ala
10
PL 205 710 B1 <210> 8 <211> 10 <212> PRT <213> sekwencja sztuczna <220>
<223> Opis sekwencji sztucznej:peptyd <400> 8
Gly Arg Phe Glu Met Glu Ser Ile Tyr Leu
10 <210> 9 <211> 29 <212> DNA <213> sekwencja sztuczna <220>
<223> Opis sekwencji sztucznej:DNA <400> 9 gcngartayt aygcngaraa yaayathgc 29
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
PL 205 710 B1 <213> sekwencja sztuczna <220>
<223> Opis sekwencji sztucznej:DNA <400> 10 crtadatrtg rtanacngty tc 22 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> sekwencja sztuczna <220>
<223> Opis sekwencji sztucznej:DNA <400> 11 tadatnswyt ccatytcraa 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> sekwencja sztuczna <220>
<223> Opis sekwencji sztucznej:DNA <400> 12 ctggaactgt ccctgtggtt 20
PL 205 710 B1 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> sekwencja sztuczna <220>
<223> Opis sekwencji sztucznej:DNA <400> 13 agtgcactag agggccagaa 20 <210> 14 <211> 22 <212> DNA <213> sekwencja sztuczna <220>
<223> Opis sekwencji sztucznej:DNA <400> 14 ttcgagcacc acaattggaa at 22
<210> 15
<211> 24
<212> DNA
<213> sekwencja sztuczna
<220>
PL 205 710 B1 <223> Opis sekwencji sztucznej:DNA <400> 15 gaatgcaaag acggcacgat gaat 24 <210> 16 <211> 24 <212> DNA <213> sekwencja sztuczna <220>
<223> Opis sekwencji sztucznej:DNA <400> 16 cggcggatcc gcaattgaat gatg 24 <210> 17 <211> 25 <212> DNA <213> sekwencja sztuczna <220>
<223> Opis sekwencji sztucznej:DNA <400> 17 ccggctgcag taccatttag cgcat 25
PL 205 710 B1

Claims (52)

1. Sposób wytwarzania rekombinowanych glikoprotein, znamienny tym, że obejmuje etapy, w których wytwarza się rekombinowane glikoproteiny w roślinach lub komórkach roślinnych, w których endogenna aktywność GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazy jest wytłumiona do poniżej 50% aktywności naturalnych roślin lub komórek roślinnych, przy czym GlcNAc-a1,3-fukozylotransferaza jest kodowana przez sekwencję DNA oznaczoną SEQ ID NO: 1 z otwartą ramką odczytu od pary zasad 211 do pary zasad 1740, albo która wykazuje co najmniej 50% identyczność z tą sekwencją lub hybrydyzuje w ostrych warunkach z tą sekwencją lub obejmuje sekwencję, która ze względu na kod genetyczny zdegenerowała dc tej sekwencji DNA, przy czym ta sekwencja koduje białko roślinne o aktywności fukozylotransferazy lub jest komplementarna do niej.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że wytwarza się ludzkie białka, zwłaszcza białka do zastosowania medycznego.
3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że endogenna aktywność GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazy jest niższa niż 20% aktywności GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazy naturalnych roślin lub komórek roślinnych.
4. Sposób według zastrz. 1 albo 2, albo 3, znamienny tym, że endogenna aktywność GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazy wynosi 0% aktywności GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazy naturalnych roślin lub komórek roślinnych.
5. Sposób według zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 4, znamienny tym, że wytłumienie endogennej aktywności GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazy następuje poprzez hamowanie antysensownym RNA, przy czym stosuje się polinukleotyd, który jest co najmniej częściowo komplementarny do sekwencji DNA GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazy.
6. Sposób według zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 4, znamienny tym, że wytłumienie endogennej aktywności GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazy następuje poprzez mutację knock-out sekwencji DNA GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazy.
7. Sposób otrzymywania rekombinowanych roślinnych komórek gospodarza z wytłumioną lub całkowicie wyłączoną produkcją GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazy, znamienny tym, że do komórki gospodarza wprowadza się przynajmniej jeden wektor zawierający cząsteczkę DNA, która zawiera mutację w postaci delecji, insercji i/lub substytucji, uniemożliwiającą ekspresję aktywnej endogennej fukozylotransferazy, przy czym taka cząsteczka DNA 1) obejmuje sekwencję według SEQ ID NO: 1 z otwartą ramką odczytu od pary zasad 211 do pary zasad 1740 lub wykazuje przynajmniej 50% identyczność z tą sekwencją lub hybrydyzuje w ostrych warunkach z tą sekwencją lub sekwencję, która ze względu na kod genetyczny zdegenerowała do tej sekwencji DNA, przy czym ta sekwencja koduje białko roślinne o aktywności fukozylotransferazy lub jest komplementarna do niej, albo 2) obejmuje częściową sekwencję cząsteczki DNA kodującej białko roślinne o aktywności fukozylotransferazy, wykazującą przynajmniej 80% identyczność z sekwencją według SEQ ID NO: 1 i mającą wielkość od 20 do 200, zwłaszcza 30 do 50 par zasad, albo 3) obejmuje sekwencję według SEQ ID NO: 3 lub sekwencję, która wykazuje przynajmniej 85%, zwłaszcza przynajmniej 95% identyczność z tą sekwencją lub hybrydyzuje w ostrych warunkach z tą sekwencją lub obejmuje sekwencję, która ze względu na kod genetyczny zdegenerowała do tej sekwencji DNA, albo 4) koduje rybozym posiadający dwa odcinki sekwencji, każdy o długości przynajmniej 10 do 15 par zasad, które są komplementarne do odcinków sekwencji cząsteczki DNA kodującej białko roślinne o aktywności fukozylotransferazy określonej w punkcie 1), przez co rybozym przyłącza i tnie mRNA, które jest produktem transkrypcji naturalnej cząsteczki DNA GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazy, przy czym ewentualnie cząsteczka DNA w wektorze ma orientacją przeciwną wobec promotora.
8. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że stosuje się wektor zawierający cząsteczkę DNA, która koduje białko o aktywności GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazy, zwłaszcza o aktywności rdzeniowej a1,3-fukozylotransferazy.
9. Sposób według zastrz. 7 albo 8, znamienny tym, że stosuje się wektor zawierający cząsteczkę DNA, która wykazuje przynajmniej 70-80%, zwłaszcza przynajmniej 95%, identyczność z sekwencją według SEQ ID NO:1.
10. Sposób według zastrz. 7 albo 8, albo 9, znamienny tym, że stosuje się wektor zawierający cząsteczkę DNA, która obejmuje pary zasad 2150 do 2250, zwłaszcza 2198 sekwencji według SEQ ID NO:1.
PL 205 710 B1
11. Sposób według zastrz. 7 albo 8, albo 9, albo 10, znamienny tym, że stosuje się wektor zawierający cząsteczkę DNA, która jest związana kowalencyjnie z odpowiednią wykrywalną substancją znacznikową.
12. Sposób otrzymywania rekombinowanych roślin z wytłumioną lub całkowicie wyłączoną produkcją GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazy, znamienny tym, że do rośliny wprowadza się przynajmniej jeden wektor zawierający cząsteczkę DNA zawierającą mutację w postaci delecji, insercji i/lub substytucji, która uniemożliwia ekspresję aktywnej endogennej fukozylotransferazy, przy czym taka cząsteczka DNA 1) obejmuje sekwencję według SEQ ID NO: 1 z otwartą ramką odczytu od pary zasad 211 do pary zasad 1740 lub wykazuje przynajmniej 50% identyczność z tą sekwencją lub hybrydyzuje w ostrych warunkach z tą sekwencją lub sekwencję, która ze względu na kod genetyczny zdegenerowała do tej sekwencji DNA, przy czym ta sekwencja koduje białko roślinne o aktywności fukozylotransferazy lub jest komplementarna do niej, albo 2) obejmuje częściową sekwencję cząsteczki DNA kodującej białko roślinne o aktywności fukozylotransferazy, wykazującą przynajmniej 80% identyczność z sekwencją według SEQ ID NO: 1 i mającą wielkość od 20 do 200, zwłaszcza 30 do 50 par zasad, albo 3) obejmuje sekwencję według SEQ ID NO: 3 lub sekwencję, która wykazuje przynajmniej 85%, zwłaszcza przynajmniej 95% identyczność z tą sekwencją lub hybrydyzuje w ostrych warunkach z tą sekwencją lub obejmuje sekwencję, która ze względu na kod genetyczny zdegenerowała do tej sekwencji DNA, albo 4) koduje rybozym posiadający dwa odcinki sekwencji, każdy o długości przynajmniej 10 do 15 par zasad, które są komplementarne do odcinków sekwencji cząsteczki DNA kodującej białko roślinne o aktywności fukozylotransferazy określonej w punkcie 1) , przez co rybozym przyłącza i tnie mRNA, które jest produktem transkrypcji naturalnej cząsteczki DNA GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazy, przy czym ewentualnie cząsteczka DNA w wektorze ma orientacją przeciwną wobec promotora.
13. Sposób według zastrz. 12, znamienny tym, że stosuje się wektor zawierający cząsteczkę DNA, która koduje białko o aktywności GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazy, zwłaszcza o aktywności rdzeniowej a1,3-fukozylotransferazy.
14. Sposób według zastrz. 12 albo 13, znamienny tym, że stosuje się wektor zawierający cząsteczkę DNA, która wykazuje przynajmniej 70-80%, zwłaszcza przynajmniej 95%, identyczność z sekwencją według SEQ ID NO:1.
15. Sposób według zastrz. 12 albo 13, albo 14, znamienny tym, że stosuje się wektor zawierający cząsteczkę DNA, która obejmuje pary zasad 2150 do 2250, zwłaszcza 2198 sekwencji według SEQ ID NO:1.
16. Sposób według zastrz. 12 albo 13, albo 14, albo 15, znamienny tym, że stosuje się wektor zawierający cząsteczkę DNA, która jest związana kowalencyjnie z odpowiednią wykrywalną substancją znacznikową.
17. Sposób otrzymywania rekombinowanych roślinnych komórek gospodarza, znamienny tym, że do genomu komórki gospodarza w miejsce niezmutowanej sekwencji homologicznej wprowadza się cząsteczkę DNA obejmującą sekwencję według SEQ ID NO:1 z otwartą ramką odczytu od pary zasad 211 do pary zasad 1740 lub wykazuje przynajmniej 50% identyczność z tą sekwencją lub hybrydyzuje w ostrych warunkach z tą sekwencją lub obejmuje sekwencję, która ze względu na kod genetyczny zdegenerowała dc tej sekwencji DNA, przy czym ta sekwencja koduje białko roślinne o aktywności fukozylotransferazy lub jest komplementarna do niej, i przy czym ta cząsteczka DNA zawiera mutację w postaci delecji, insercji i/lub substytucji, która uniemożliwia ekspresję aktywnej endogennej fukozylotransferazy.
18. Sposób według zastrz. 17, znamienny tym, że stosuje się cząsteczkę DNA, która koduje białko o aktywności GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazy, zwłaszcza o aktywności rdzeniowej a1,3-fukozylotransferazy.
19. Sposób według zastrz. 17 albo 18, znamienny tym, że stosuje się cząsteczkę DNA, która wykazuje przynajmniej 70-80%, zwłaszcza przynajmniej 95%, identyczność z sekwencją według SEQ ID NO:1.
20. Sposób według zastrz. 17 albo 18, albo 19, znamienny tym, że stosuje się cząsteczkę DNA, która obejmuje pary zasad 2150 do 2250, zwłaszcza 2198 sekwencji według SEQ ID NO:1.
21. Sposób według zastrz. 17 albo 18, albo 19, albo 20, znamienny tym, że stosuje się cząsteczkę DNA, która jest związana kowalencyjnie z odpowiednią wykrywalną substancją znacznikową.
22. Sposób otrzymywania rekombinowanych roślin, znamienny tym, że do rośliny w miejsce niezmutowanej, sekwencji homologicznej wprowadza się cząsteczkę DNA obejmującą sekwencję według SEQ ID NO:1 z otwartą ramką odczytu od pary zasad 211 do pary zasad 1740 lub wykazuje
PL 205 710 B1 przynajmniej 50% identyczność z tą sekwencją lub hybrydyzuje w ostrych warunkach z tą sekwencją lub obejmuje sekwencję, która ze względu na kod genetyczny zdegenerowała do tej sekwencji DNA, przy czym ta sekwencja koduje białko roślinne o aktywności fukozylotransferazy lub jest komplementarna do niej, i przy czym ta cząsteczka DNA zawiera mutację w postaci delecji, insercji i/lub substytucji, która uniemożliwia ekspresję aktywnej endogennej fukozylotransferazy.
23. Sposób według zastrz. 22, znamienny tym, że stosuje się cząsteczkę DNA, która koduje białko o aktywności GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazy, zwłaszcza o aktywności rdzeniowej a1,3-fukozylotransferazy.
24. Sposób według zastrz. 22 albo 23, znamienny tym, że stosuje się cząsteczkę DNA, która wykazuje przynajmniej 70-80%, zwłaszcza przynajmniej 95%, identyczność z sekwencją według SEQ ID NO:1.
25. Sposób według zastrz. 22 albo 23, albo 24, znamienny tym, że stosuje się cząsteczkę DNA, która obejmuje pary zasad 2150 do 2250, zwłaszcza 2198 sekwencji według SEQ ID NO:1.
26. Sposób według zastrz. 22 albo 23, albo 24, albo 25, znamienny tym, że stosuje się cząsteczkę DNA, która jest związana kowalencyjnie z odpowiednią wykrywalną substancją znacznikową.
27. Rekombinowane komórki roślinne, znamienne tym, że zawierają wprowadzony co najmniej jeden wektor zawierający cząsteczkę DNA zawierającą mutację w postaci delecji, insercji i/lub substytucji, która uniemożliwia ekspresję aktywnej endogennej fukozylotransferazy, przy czym taka cząsteczka DNA 1) obejmuje sekwencję według SEQ ID NO:1 z otwartą ramką odczytu od pary zasad 211 do pary zasad 1740 lub wykazuje przynajmniej 50% identyczność z tą sekwencją lub hybrydyzuje w ostrych warunkach z tą sekwencją lub sekwencję, która ze względu na kod genetyczny zdegenerowała do tej sekwencji DNA, przy czym taka sekwencja koduje białko roślinne o aktywności fukozylotransferazy lub jest komplementarna do niej, albo 2) obejmuje częściową sekwencję cząsteczki DNA kodującej białko roślinne o aktywności fukozylotransferazy, wykazującą przynajmniej 80% identyczność z sekwencją według SEQ ID NO:1 i mającą wielkość od 20 do 200, zwłaszcza 30 do 50 par zasad, albo 3) obejmuje sekwencję według SEQ ID NO:3 lub sekwencję, która wykazuje przynajmniej 85%, zwłaszcza przynajmniej 95% identyczność z tą sekwencją lub hybrydyzuje w ostrych warunkach z tą sekwencją lub obejmuje sekwencję, która ze względu na kod genetyczny zdegenerowała do tej sekwencji DNA, albo 4) koduje rybozym posiadający dwa odcinki sekwencji, każdy o długości przynajmniej 10 do 15 par zasad, które są komplementarne do odcinków sekwencji cząsteczki DNA kodującej białko roślinne o aktywności fukozylotransferazy określonej w punkcie 1), przez co rybozym przyłącza i tnie mRNA, które jest produktem transkrypcji naturalnej cząsteczki DNA GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazy, przy czym ewentualnie cząsteczka DNA w wektorze ma orientacją przeciwną wobec promotora, i przy czym endogenna produkcja GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazy w tych komórkach jest wytłumiona lub całkowicie wyłączona.
28. Komórki według zastrz. 27, znamienne tym, że zawierają wektor zawierający cząsteczkę DNA, która koduje białko o aktywności GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazy, zwłaszcza o aktywności rdzeniowej a1,3-fukozylotransferazy.
29. Komórki według zastrz. 27 albo 28, znamienne tym, że zawierają wektor zawierający cząsteczkę DNA, która wykazuje przynajmniej 70-80%, zwłaszcza przynajmniej 95%, identyczność z sekwencją według SEQ ID NO:1.
30. Komórki według zastrz. 27 albo 28, albo 29, znamienne tym, że zawierają wektor zawierający cząsteczkę DNA, która obejmuje pary zasad 2150 do 2250, zwłaszcza 2198 sekwencji według SEQ ID NO:1.
31. Komórki według zastrz. 27 albo 28, albo 29, albo 30, znamienne tym, że zawierają wektor zawierający cząsteczkę DNA, która jest związana kowalencyjnie z odpowiednią wykrywalną substancją znacznikową.
32. Rekombinowane rośliny, znamienne tym, że zawierają wprowadzony co najmniej jeden wektor zawierający cząsteczkę DNA zawierającą mutację w postaci delecji, insercji i/lub substytucji, która uniemożliwia ekspresję aktywnej endogennej fukozylotransferazy, przy czym taka cząsteczka DNA 1) obejmuje sekwencję według SEQ ID NO: 1 z otwartą ramką odczytu od pary zasad 211 do pary zasad 1740 lub wykazuje przynajmniej 50% identyczność z tą sekwencją lub hybrydyzuje w ostrych warunkach z tą sekwencją lub sekwencję, która ze względu na kod genetyczny zdegenerowała dc tej sekwencji DNA, przy czym ta sekwencja koduje białko roślinne o aktywności fukozylotransferazy lub jest komplementarna do niej, albo 2) obejmuje częściową sekwencję cząsteczki DNA kodującej białko roślinne o aktywności fukozylotransferazy, wykazującą przynajmniej 80% identyczność z sekwencją według SEQ ID NO:1 i mającą wielkość od 20 do 200, zwłaszcza 30 do 50 par zasad,
PL 205 710 B1 albo 3) obejmuje sekwencję według SEQ ID NO: 3 lub sekwencję, która wykazuje przynajmniej 85%, zwłaszcza przynajmniej 95% identyczność z tą sekwencją lub hybrydyzuje w ostrych warunkach z tą sekwencją lub obejmuje sekwencję, która ze względu na kod genetyczny zdegenerowała do tej sekwencji DNA, albo 4) koduje rybozym posiadający dwa odcinki sekwencji, każdy o długości przynajmniej 10 do 15 par zasad, które są komplementarne do odcinków sekwencji cząsteczki DNA kodującej białko roślinne o aktywności fukozylotransferazy określonej w punkcie 1), przez co rybozym przyłącza i tnie mRNA, które jest produktem transkrypcji naturalnej cząsteczki DNA GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazy, przy czym ewentualnie cząsteczka DNA w wektorze ma orientacją przeciwną wobec promotora, i przy czym endogenna produkcja GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazy w tych komórkach jest wytłumiona lub całkowicie wyłączona.
33. Rośliny według zastrz. 32, znamienne tym, że zawierają wektor zawierający cząsteczkę DNA, która koduje białko o aktywności GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazy, zwłaszcza o aktywności rdzeniowej a1,3-fukozylotransferazy.
34. Rośliny według zastrz. 32 albo 33, znamienne tym, że zawierają wektor zawierający cząsteczkę DNA, która wykazuje przynajmniej 70-80%, zwłaszcza przynajmniej 95%, identyczność z sekwencją według SEQ ID NO:1.
35. Rośliny według zastrz. 32 albo 33, albo 34, znamienne tym, że zawierają wektor zawierający cząsteczkę DNA, która obejmuje pary zasad 2150 do 2250, zwłaszcza 2198 sekwencji według SEQ ID NO:1.
36. Rośliny według zastrz. 32 albo 33, albo 34, albo 35, znamienne tym, że zawierają wektor zawierający cząsteczkę DNA, która jest związana kowalencyjnie z odpowiednią wykrywalną substancją znacznikową.
37. Rekombinowane komórki roślinne, znamienne tym, że zawierają wprowadzoną do ich genomu w miejscu niezmutowanej homologicznej sekwencji cząsteczkę DNA zawierającą mutację w postaci delecji, insercji i/lub substytucji, która uniemożliwia ekspresję aktywnej endogennej fukozylotransferazy, przy czym ta cząsteczka DNA 1) obejmuje sekwencję według SEQ ID NO:1 z otwartą ramką odczytu od pary zasad 211 do pary zasad 1740 lub wykazuje przynajmniej 50% identyczność z tą sekwencją lub hybrydyzuje w ostrych warunkach z tą sekwencją lub sekwencję, która ze względu na kod genetyczny zdegenerowała do tej sekwencji DNA, przy czym ta sekwencja koduje białko roślinne o aktywności fukozylotransferazy lub jest komplementarna do niej, albo 2) obejmuje częściową sekwencję takiej cząsteczki DNA, wykazującą przynajmniej 80% identyczność z sekwencją według SEQ ID NO:1 i mającą wielkość od 20 do 200, zwłaszcza 30 do 50 par zasad, albo 3) obejmuje sekwencję według SEQ ID NO: 3 lub sekwencję, która wykazuje przynajmniej 85%, zwłaszcza przynajmniej 95% identyczność z tą sekwencją lub hybrydyzuje w ostrych warunkach z tą sekwencją lub obejmuje sekwencję, która ze względu na kod genetyczny zdegenerowała do tej sekwencji DNA, albo 4) koduje rybozym posiadający dwa odcinki sekwencji, każdy o długości przynajmniej 10 do 15 par zasad, które są komplementarne do odcinków sekwencji takiej cząsteczki DNA określonej w punkcie 1), przez co rybozym przyłącza i tnie mRNA, które jest produktem transkrypcji naturalnej cząsteczki DNA GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazy, i przy czym endogenna produkcja w tych roślinach GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazy jest wytłumiona lub całkowicie wyłączona.
38. Komórki według zastrz. 37, znamienne tym, że zawierają wektor zawierający cząsteczkę DNA, która koduje białko o aktywności GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazy, zwłaszcza o aktywności rdzeniowej a1,3-fukozylotransferazy.
39. Komórki według zastrz. 37 albo 38, znamienne tym, że zawierają cząsteczkę DNA, która wykazuje przynajmniej 70-80%, zwłaszcza przynajmniej 95%, identyczność z sekwencją według SEQ ID NO:1.
40. Komórki według zastrz. 37 albo 38, albo 39, znamienne tym, że zawierają cząsteczkę DNA, która obejmuje pary zasad 2150 do 2250, zwłaszcza 2198 sekwencji według SEQ ID NO:1.
41. Komórki według zastrz. 37 albo 38, albo 39, albo 40, znamienne tym, że zawierają cząsteczkę DNA, która jest związana kowalencyjnie z odpowiednią wykrywalną substancją znacznikową.
42. Rekombinowane rośliny, znamienne tym, że zawierają wprowadzoną do ich genomu w miejscu niezmutowanej homologicznej sekwencji cząsteczkę DNA zawierającą mutację w postaci delecji, insercji i/lub substytucji, która uniemożliwia ekspresję aktywnej endogennej fukozylotransferazy, przy czym ta cząsteczka DNA 1) obejmuje sekwencję według SEQ ID NO:1 z otwartą ramką odczytu od pary zasad 211 do pary zasad 1740 lub wykazuje przynajmniej 50% identyczność z tą sekwencją lub hybrydyzuje w ostrych warunkach z tą sekwencją lub sekwencję, która ze względu na kod genetyczny zdegenerowała do tej sekwencji DNA, przy czym ta sekwencja koduje białko roślinne
PL 205 710 B1 o aktywności fukozylotransferazy lub jest komplementarna do niej, albo 2) obejmuje częściową sekwencję takiej cząsteczki DNA, wykazującą przynajmniej 80% identyczność z sekwencją według SEQ ID NO:1 i mającą wielkość od 20 do 200, zwłaszcza 30 do 50 par zasad, albo 3) obejmuje sekwencję według SEQ ID NO:3 lub sekwencję, która wykazuje przynajmniej 85%, zwłaszcza przynajmniej 95% identyczność z tą sekwencją lub hybrydyzuje w ostrych warunkach z tą sekwencją lub obejmuje sekwencję, która ze względu na kod genetyczny zdegenerowała do tej sekwencji DNA, albo 4) koduje rybozym posiadający dwa odcinki sekwencji, każdy o długości przynajmniej 10 do 15 par zasad, które są komplementarne do odcinków sekwencji takiej cząsteczki DNA określonej w punkcie 1), przez co rybozym przyłącza i tnie mRNA, które jest produktem transkrypcji naturalnej cząsteczki DNA GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazy, i przy czym endogenna produkcja w tych roślinach GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazy jest wytłumiona lub całkowicie wyłączona.
43. Rośliny według zastrz. 42, znamienne tym, że zawierają cząsteczkę DNA, która koduje białko o aktywności GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazy, zwłaszcza o aktywności rdzeniowej a1,3-fukozylotransferazy.
44. Rośliny według zastrz. 42 albo 43, znamienne tym, że zawierają cząsteczkę DNA, która wykazuje przynajmniej 70-80%, zwłaszcza przynajmniej 95%, identyczność z sekwencją według SEQ ID NO:1.
45. Rośliny według zastrz. 42 albo 43, albo 44, znamienne tym, że zawierają cząsteczkę DNA, która obejmuje pary zasad 2150 do 2250, zwłaszcza 2198 sekwencji według SEQ ID NO:1.
46. Rośliny według zastrz. 42 albo 43, albo 44, albo 45, znamienne tym, że zawierają cząsteczkę DNA, która jest związana kowalencyjnie z odpowiednią wykrywalną substancją znacznikową.
47. Sposób otrzymywania rekombinowanych komórek roślinnych, które wykazują zablokowaną ekspresję GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazy na poziomie transkrypcji lub translacji, znamienny tym, że wprowadza się do komórek cząsteczkę kwasu peptydonukleinowego (PNA) zawierającą sekwencję zasad, która jest komplementarna do cząsteczki DNA kodującej GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazę albo cząsteczkę kwasu peptydonukleinowego (PNA) zawierającą sekwencję zasad, która odpowiada sekwencji cząsteczki DNA kodującej GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazę, przy czym taka cząsteczka DNA 1) obejmuje sekwencję według SEQ ID NO: 1 z otwartą ramką odczytu od pary zasad 211 do pary zasad 1740 lub wykazuje przynajmniej 50% identyczność z tą sekwencją lub hybrydyzuje w ostrych warunkach z tą sekwencją lub sekwencję, która ze względu na kod genetyczny zdegenerowała do tej sekwencji DNA, przy czym ta sekwencja koduje białko roślinne o aktywności fukozylotransferazy lub jest komplementarna do niej, albo 2) obejmuje częściową sekwencję cząsteczki DNA kodującej białko roślinne o aktywności fukozylotransferazy, wykazującą przynajmniej 80% identyczność z sekwencją według SEQ ID NO: 1 i mającą wielkość od 20 do 200, zwłaszcza 30 do 50 par zasad, albo 3) obejmuje sekwencję według SEQ ID NO: 3 lub sekwencję, która wykazuje przynajmniej 85%, zwłaszcza przynajmniej 95% identyczność z tą sekwencją lub hybrydyzuje w ostrych warunkach z tą sekwencją lub obejmuje sekwencję, która ze względu na kod genetyczny zdegenerowała do tej sekwencji DNA.
48. Sposób otrzymywania rekombinowanych glikoprotein, znamienny tym, że rekombinowane rośliny lub komórki roślinne określone w jednym z zastrz. 27-46, albo rekombinowane rośliny lub komórki roślinne zawierające wstawioną cząsteczkę kwasu peptydonukleinowego (PNA) zawierającą sekwencję zasad, która jest komplementarna do cząsteczki DNA kodującej GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazę albo cząsteczkę kwasu peptydonukleinowego (PNA) zawierającą sekwencję zasad, która odpowiada sekwencji cząsteczki DNA kodującej GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazę, przy czym taka cząsteczka DNA 1) obejmuje sekwencję według SEQ ID NO:1 z otwartą ramką odczytu od pary zasad 211 do pary zasad 1740 lub wykazuje przynajmniej 50% identyczność z tą sekwencją lub hybrydyzuje w ostrych warunkach z tą sekwencją lub sekwencję, która ze względu na kod genetyczny zdegenerowała do tej sekwencji DNA, przy czym ta sekwencja koduje białko roślinne o aktywności fukozylotransferazy lub jest komplementarna do niej, albo 2) obejmuje częściową sekwencję cząsteczki DNA kodującej białko roślinne o aktywności fukozylotransferazy, wykazującą przynajmniej 80% identyczność z sekwencją według SEQ ID NO:1 i mającą wielkość od 20 do 200, zwłaszcza 30 do 50 par zasad, albo 3) obejmuje sekwencję według SEQ ID NO:3 lub sekwencję, która wykazuje przynajmniej 85%, zwłaszcza przynajmniej 95% identyczność z tą sekwencją lub hybrydyzuje w ostrych warunkach z tą sekwencją lub obejmuje sekwencję, która ze względu na kod genetyczny zdegenerowała do tej sekwencji DNA, i które wykazują zablokowaną ekspresję GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazy na poziomie
PL 205 710 B1 transkrypcji lub translacji, transfekuje się genem kodującym glikoproteinę, przez co ekspresjonowane są rekombinowane glikoproteiny.
49. Sposób otrzymywania rekombinowanych ludzkich glikoprotein, znamienny tym, że rekombinowane rośliny lub komórki roślinne określone w jednym z zastrz. 27-46, albo rekombinowane rośliny lub komórki roślinne zawierające wstawioną cząsteczkę kwasu peptydonukleinowego (PNA), zawierającą sekwencję zasad, która jest komplementarna do cząsteczki DNA, kodującej GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazę albo cząsteczkę kwasu peptydonukleinowego (PNA), zawierającą sekwencję zasad, która odpowiada sekwencji cząsteczki DNA, kodującej GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazę, przy czym taka cząsteczka DNA 1; obejmuje sekwencję według SEQ ID NO: 1 z otwartą ramką odczytu od pary zasad 211 do pary zasad 1740 lub wykazuje przynajmniej 50% identyczność z tą sekwencją lub hybrydyzuje w ostrych warunkach z tą sekwencją lub sekwencję, która ze względu na kod genetyczny zdegenerowała do tej sekwencji DNA, przy czym ta sekwencja koduje białko roślinne o aktywności fukozylotransferazy lub jest komplementarna do niej, albo 2) obejmuje częściową sekwencję cząsteczki DNA kodującej białko roślinne o aktywności fukozylotransferazy, wykazującą przynajmniej 80% identyczność z sekwencją według SEQ ID NO:1 i mającą wielkość od 20 do 200, zwłaszcza 30 do 50 par zasad, albo 3) obejmuje sekwencję według SEQ ID NO:3 lub sekwencję, która wykazuje przynajmniej 85%, zwłaszcza przynajmniej 95% identyczność z tą sekwencją lub hybrydyzuje w ostrych warunkach z tą sekwencją lub obejmuje sekwencję, która ze względu na kod genetyczny zdegenerowała do tej sekwencji DNA, i które wykazują zablokowaną ekspresję GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazy na poziomie transkrypcji lub translacji, transfekuje się genem kodującym glikoproteinę, przez co ekspresjonowane są rekombinowane glikoproteiny.
50. Sposób otrzymywania rekombinowanych ludzkich glikoprotein do zastosowań medycznych, znamienny tym, że rekombinowane rośliny lub komórki roślinne określone w jednym z zastrz. 27-46, albo rekombinowane rośliny lub komórki roślinne zawierające wstawioną cząsteczkę kwasu peptydonukleinowego (PNA) zawierającą sekwencję zasad, która jest komplementarna do cząsteczki DNA kodującej GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazę albo cząsteczkę kwasu peptydonukleinowego (PNA) zawierającą sekwencję zasad, która odpowiada sekwencji cząsteczki DNA kodującej GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazę, przy czym taka cząsteczka DNA 1) obejmuje sekwencję według SEQ ID NO:1 z otwartą ramką odczytu od pary zasad 211 do pary zasad 1740 lub wykazuje przynajmniej 50% identyczność z tą sekwencją lub hybrydyzuje w ostrych warunkach z tą sekwencją lub sekwencję, która ze względu na kod genetyczny zdegenerowała do tej sekwencji DNA, przy czym ta sekwencja koduje białko roślinne o aktywności fukozylotransferazy lub jest komplementarna do niej, albo 2) obejmuje częściową sekwencję cząsteczki DNA kodującej białko roślinne o aktywności fukozylotransferazy, wykazującą przynajmniej 80% identyczność z sekwencją według SEQ ID NO:1 i mającą wielkość od 20 do 200, zwłaszcza 30 do 50 par zasad, albo 3) obejmuje sekwencję według SEQ ID NO:3 lub sekwencję, która wykazuje przynajmniej 85%, zwłaszcza przynajmniej 95% identyczność z tą sekwencją lub hybrydyzuje w ostrych warunkach z tą sekwencją lub obejmuje sekwencję, która ze względu na kod genetyczny zdegenerowała do tej sekwencji DNA, i które wykazują zablokowaną ekspresję GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazy na poziomie transkrypcji lub translacji, transfekuje się genem kodującym glikoproteinę, przez co ekspresjonowane są rekombinowane glikoproteiny.
51. Sposób selekcjonowania cząsteczek DNA kodujących GlcNAc-a1,3-fukozylotrasferazę w próbce, znamienny tym, że do próbki dodaje się cząsteczkę DNA zawierającą mutację w postaci delecji, insercji i/lub substytucji, która uniemożliwia ekspresję aktywnej endogennej fukozylotransferazy, przy czym ta cząsteczka DNA 1) obejmuje sekwencję według SEQ ID NO:1 z otwartą ramką odczytu od pary zasad 211 do pary zasad 1740 lub wykazuje przynajmniej 50% identyczność z tą sekwencją lub hybrydyzuje w ostrych warunkach z tą sekwencją lub sekwencję, która ze względu na kod genetyczny zdegenerowała do tej sekwencji DNA, przy czym ta sekwencja koduje białko roślinne o aktywności fukozylotransferazy lub jest komplementarna do niej, albo 2) obejmuje częściową sekwencję cząsteczki DNA kodującej białko roślinne o aktywności fukozylotransferazy, wykazującą przynajmniej 80% identyczność z sekwencją według SEQ ID NO:1 i mającą wielkość od 20 do 200, zwłaszcza 30 do 50 par zasad, albo 3) obejmuje sekwencję według SEQ ID NO:3 lub sekwencję, która wykazuje przynajmniej 85%, zwłaszcza przynajmniej 95% identyczność z tą sekwencją lub hybrydyzuje w ostrych warunkach z tą sekwencją lub obejmuje sekwencję, która ze względu na kod genetyczny zdegenerowała do tej sekwencji DNA, albo 4) koduje rybozym posiadający dwa odcinki sekwencji, każdy o długości przynajmniej 10 do 15 par zasad, które są komplementarne do odcinków sekwencji cząsteczki DNA kodującej białko roślinne o aktywności fukozylotransferazy określonej
PL 205 710 B1 w punkcie 1), przez co rybozym przyłącza i tnie mRNA, które jest produktem transkrypcji naturalnej cząsteczki DNA GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazy, które wiążą się z cząsteczkami DNA kodującymi GlcNAc-a1,3-fukozylotransferazę, i która to cząsteczka jest związana kowalencyjnie z odpowiednią wykrywalną substancją znacznikową.
52. Sposób według zastrz. 51, znamienny tym, że próbka zawiera genomowy DNA organizmu
PL385768A 1999-02-18 2000-02-17 Sposoby otrzymywania rekombinowanych glikoprotein, sposób otrzymywania rekombinowanych roślinnych komórek gospodarza lub roślin z wytłumioną lub całkowicie wyłączoną produkcją GlcNAc-α1,3-fukozylotransferazy, sposób otrzymywania rekombinowanych roślinnych komórek gospodarza lub roślin, rekombinowane komórki roślinne, rekombinowane rośliny, sposób otrzymywania rekombinowanych komórek roślinnych z zablokowaną ekspresją GlcNAc-α1,3-fukozylotransferazy, sposoby otrzymywania rekombinowanych ludzkich glikoprotein, zwłaszcza do zastosowań medycznych oraz sposób selekcjonowania cząsteczek DNA PL205710B1 (pl)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AT0027099A AT408446B (de) 1999-02-18 1999-02-18 Fucosyltransferase-gen

Publications (1)

Publication Number Publication Date
PL205710B1 true PL205710B1 (pl) 2010-05-31

Family

ID=3486087

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL363438A PL205785B1 (pl) 1999-02-18 2000-02-17 Cząsteczki DNA, biologicznie czynne wektory, cząsteczka DNA kodująca rybozym, sposób otrzymywania cDNA, sposób klonowania GlcNAc-α1, 3-fukozylotrasferazy, cząsteczki kwasu peptydonukleinowego i sposób otrzymywani roślin
PL385768A PL205710B1 (pl) 1999-02-18 2000-02-17 Sposoby otrzymywania rekombinowanych glikoprotein, sposób otrzymywania rekombinowanych roślinnych komórek gospodarza lub roślin z wytłumioną lub całkowicie wyłączoną produkcją GlcNAc-α1,3-fukozylotransferazy, sposób otrzymywania rekombinowanych roślinnych komórek gospodarza lub roślin, rekombinowane komórki roślinne, rekombinowane rośliny, sposób otrzymywania rekombinowanych komórek roślinnych z zablokowaną ekspresją GlcNAc-α1,3-fukozylotransferazy, sposoby otrzymywania rekombinowanych ludzkich glikoprotein, zwłaszcza do zastosowań medycznych oraz sposób selekcjonowania cząsteczek DNA

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL363438A PL205785B1 (pl) 1999-02-18 2000-02-17 Cząsteczki DNA, biologicznie czynne wektory, cząsteczka DNA kodująca rybozym, sposób otrzymywania cDNA, sposób klonowania GlcNAc-α1, 3-fukozylotrasferazy, cząsteczki kwasu peptydonukleinowego i sposób otrzymywani roślin

Country Status (29)

Country Link
US (3) US8198078B2 (pl)
EP (3) EP1642979A1 (pl)
JP (2) JP5514386B2 (pl)
KR (1) KR20010108234A (pl)
CN (1) CN1360633A (pl)
AT (2) AT408446B (pl)
AU (1) AU771995B2 (pl)
BG (1) BG65140B1 (pl)
BR (1) BR0010114A (pl)
CA (1) CA2362964C (pl)
CZ (2) CZ299622B6 (pl)
DE (1) DE50011116D1 (pl)
DK (2) DK2062977T3 (pl)
EE (1) EE200100432A (pl)
ES (2) ES2246222T3 (pl)
HR (1) HRP20010681A2 (pl)
HU (1) HU230075B1 (pl)
IL (2) IL144777A0 (pl)
IS (1) IS6041A (pl)
MX (1) MXPA01008372A (pl)
NO (1) NO20013993L (pl)
NZ (1) NZ513685A (pl)
PL (2) PL205785B1 (pl)
PT (1) PT2062977E (pl)
SK (1) SK286416B6 (pl)
TR (1) TR200102393T2 (pl)
WO (1) WO2000049153A1 (pl)
YU (1) YU58901A (pl)
ZA (1) ZA200106735B (pl)

Families Citing this family (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2264177B1 (en) 1998-12-09 2015-09-30 Phyton Holdings, LLC Glycoproteins having human-type glycosylation
AT408446B (de) * 1999-02-18 2001-11-26 Altmann Friedrich Dr Fucosyltransferase-gen
ES2569919T3 (es) 1999-04-09 2016-05-13 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Procedimiento para controlar la actividad de una molécula inmunofuncional
CA2925231A1 (en) 1999-10-26 2001-05-03 Stichting Dienst Landbouwkundig Onderzoek Mammalian-type glycosylation in transgenic plants expressing galactosyltransferase and sialyl transferase
US6946292B2 (en) 2000-10-06 2005-09-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity
CN100385006C (zh) 2001-01-19 2008-04-30 陶氏化学公司 利用植物细胞分泌性生产具有人型糖链的糖蛋白的方法
NZ534880A (en) 2002-03-19 2008-04-30 Plant Res Int Bv Optimizing glycan processing in plants
EP1485492B1 (en) 2002-03-19 2011-12-21 Stichting Dienst Landbouwkundig Onderzoek Gntiii (udp-n-acetylglucosamine:beta-d mannoside beta(1,4)-n-acetylglucosaminyltransferase iii) expression in plants
ATE503829T1 (de) * 2002-04-09 2011-04-15 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd Zelle mit erniedrigter oder deletierter aktivität eines am gdp-fucosetransport beteiligten proteins
AR042145A1 (es) 2002-11-27 2005-06-08 Dow Agrociences Llc Produccion de inmunoglobulinas en plantas con una fucocilacion reducida
ATE426033T1 (de) 2003-08-11 2009-04-15 Greenovation Biotech Gmbh Promoter sequenzen aus moos und dessen verwendung
FI20055398A0 (fi) 2005-07-08 2005-07-08 Suomen Punainen Risti Veripalv Menetelmä solupopulaatioiden evaluoimiseksi
BRPI0707290A2 (pt) 2006-01-17 2011-08-16 Biolex Therapeutics Inc composições e métodos para humanização e otimização de n-glicanas em plantas
US20090060921A1 (en) * 2006-01-17 2009-03-05 Biolex Therapeutics, Inc. Glycan-optimized anti-cd20 antibodies
CN102094019B (zh) * 2007-01-15 2012-11-28 燕秋 用于抑制LeY糖抗原合成的岩藻糖基转移酶Ⅳ的RNA干涉序列及重组干涉质粒
CN102094020B (zh) * 2007-01-15 2012-11-28 燕秋 用于抑制LeY糖抗原合成的岩藻糖基转移酶I的RNA干涉序列及重组干涉质粒
KR101460953B1 (ko) 2007-04-17 2014-11-13 스티칭 디엔스트 랜드보위쿤디그 온데조에크 비-포유동물 글리코실트랜스퍼라제의 발현에 의한 식물에서의 포유동물형 글리코실화
JP5766947B2 (ja) * 2007-09-07 2015-08-19 チルドレンズ ホスピタル メディカル センター 臨床サンプルにおける分泌性のルイス抗原およびシアル化抗原のレベルの疾患リスクの予測指標としての使用
CA2704108A1 (en) * 2007-10-31 2009-05-07 Bayer Bioscience N.V. Method to produce modified plants with altered n-glycosylation pattern
EP2166085A1 (en) 2008-07-16 2010-03-24 Suomen Punainen Risti Veripalvelu Divalent modified cells
EP2439264B1 (en) 2010-10-11 2015-06-03 Jennewein Biotechnologie GmbH Novel fucosyltransferases and their applications
KR101293658B1 (ko) * 2010-12-30 2013-08-07 대한민국 알파-1,3-푸코실트랜스퍼라아제 및/또는 베타-1,2-자일로실트렌스퍼라아제 유전자를 포함하는 벼 형질전환용 벡터 및 형질전환된 벼
DK2479263T3 (da) * 2011-01-20 2014-02-03 Jennewein Biotechnologie Gmbh Nye fucosyltransferaser og deres anvendelser
EP2789686A1 (en) 2013-04-11 2014-10-15 Greenovation Biotech GmbH Expression of phosphorylated glycoproteins in plants
EP3050973A1 (en) * 2015-01-30 2016-08-03 Jennewein Biotechnologie GmbH Fermentation process for producing monosaccharides in free form from nucleotide-activated sugars
CN110317799A (zh) * 2019-07-18 2019-10-11 江南大学 一种人源岩藻糖转移酶8的原核表达方法及其产品
EP3871687A1 (en) 2020-02-27 2021-09-01 eleva GmbH Enzyme replacement therapy for treating pompe disease

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5272066A (en) 1986-03-07 1993-12-21 Massachusetts Institute Of Technology Synthetic method for enhancing glycoprotein stability
JP3756946B2 (ja) 1993-03-29 2006-03-22 協和醗酵工業株式会社 α１，３−フコシルトランスフェラーゼ
US6509149B2 (en) * 1995-06-06 2003-01-21 Hybridon, Inc. HPV-specific oligonucleotides
US5770420A (en) * 1995-09-08 1998-06-23 The Regents Of The University Of Michigan Methods and products for the synthesis of oligosaccharide structures on glycoproteins, glycolipids, or as free molecules, and for the isolation of cloned genetic sequences that determine these structures
AT408446B (de) * 1999-02-18 2001-11-26 Altmann Friedrich Dr Fucosyltransferase-gen

Also Published As

Publication number Publication date
AU2646000A (en) 2000-09-04
AU771995B2 (en) 2004-04-08
IL144777A0 (en) 2002-06-30
JP2011120592A (ja) 2011-06-23
ATA27099A (de) 2001-04-15
CA2362964A1 (en) 2000-08-24
ATE304053T1 (de) 2005-09-15
CZ20012943A3 (cs) 2002-04-17
DK2062977T3 (da) 2014-04-07
CA2362964C (en) 2012-03-27
EE200100432A (et) 2002-12-16
ES2444126T3 (es) 2014-02-24
CZ308081B6 (cs) 2019-12-27
HUP0200394A3 (en) 2006-06-28
EP2062977A1 (de) 2009-05-27
NZ513685A (en) 2001-09-28
US20080234471A1 (en) 2008-09-25
MXPA01008372A (es) 2003-06-06
SK11182001A3 (sk) 2002-01-07
PT2062977E (pt) 2014-04-07
NO20013993D0 (no) 2001-08-16
YU58901A (sh) 2004-03-12
BG65140B1 (bg) 2007-03-30
TR200102393T2 (tr) 2002-04-22
NO20013993L (no) 2001-10-17
KR20010108234A (ko) 2001-12-07
AT408446B (de) 2001-11-26
HRP20010681A2 (en) 2003-08-31
CZ299622B6 (cs) 2008-09-24
PL205785B1 (pl) 2010-05-31
DK1151109T3 (da) 2006-01-16
CN1360633A (zh) 2002-07-24
EP1151109A1 (de) 2001-11-07
ES2246222T3 (es) 2006-02-16
HU230075B1 (hu) 2015-06-29
PL363438A1 (pl) 2004-11-15
DE50011116D1 (en) 2005-10-13
IS6041A (is) 2001-08-08
US8895806B2 (en) 2014-11-25
US8198078B2 (en) 2012-06-12
US20090199306A1 (en) 2009-08-06
JP5514386B2 (ja) 2014-06-04
EP1642979A1 (de) 2006-04-05
ZA200106735B (en) 2002-08-15
HUP0200394A2 (hu) 2002-05-29
SK286416B6 (sk) 2008-09-05
WO2000049153A1 (de) 2000-08-24
BG105899A (en) 2002-12-29
IL144777A (en) 2007-12-03
JP2002536978A (ja) 2002-11-05
US20130212740A1 (en) 2013-08-15
EP2062977B1 (de) 2014-01-08
BR0010114A (pt) 2002-06-04
EP1151109B1 (de) 2005-09-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US8895806B2 (en) Fucosyl transferase gene
US20070186311A1 (en) BETA 1,2-xylosyltransferase-gene from arabidopsis