JP2011120592A - フコシルトランスフェラーゼ遺伝子 - Google Patents

Abstract

【課題】植物フコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子、及び該遺伝子を含む組換え体を提供する。
【解決手段】特定の塩基配列、または該塩基配列と少なくとも５０％の相同性を有する配列、または厳格な条件下で該配列とハイブリダイズする配列を含むか、あるいは遺伝コードのせいで上記ＤＮＡ配列と縮重した配列を含むＤＮＡ分子であって、前記ＤＮＡ分子がフコシルトランスフェラーゼ活性を有する植物タンパク質をコードするか、あるいはそれと相補的である前記ＤＮＡ分子。およびこの遺伝子を含むベクター。並びに、植物および昆虫ならびにそれらの細胞に、上記ベクターをトランスフェクトし、α１,３−コア−フコースを含まない糖タンパク質を産生させる方法。
【選択図】なし

Description

本発明はフコシルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチドに関する。さらに、本発明はこのポリヌクレオチドの部分配列、ならびにこのポリヌクレオチドを含むベクター、そのポリヌクレオチドまたはそれから派生するＤＮＡのそれぞれでトランスフェクトされた組換え宿主細胞、植物および昆虫ならびにこれらの系で産生される糖タンパク質に関する。

糖クンパク質は多様かつ複雑な炭水化物単位を有し、その組成および配列は種々の生物で特徴的である。糖タンパク質のオリゴ糖単位は多くの役割を担っており、例えば物質代謝を調節するのに重要であり、細胞同士の相互作用の伝達に関与し、循環中のタンパク質の循環期間を決定し、および抗原抗体反応において認識エピトープを決定する。

糖タンパク質のグリコシル化は小胞体（ＥＲ）中で開始され、そこでオリゴ糖がＮ−グリコシド結合によってアスパラギン側鎖に結合するか、Ｏ−グリコシド結合によってセリンまたはスレオニン側鎖に結合する。Ｎ−結合オリゴ糖は、マンノース３つおよびＮ−アセチルグルコースアミン残基２つから成る５糖単位由来の共通コアを含む。さらに、その炭水化物単位の修飾のため、そのタンパク質はＥＲからゴルジ複合体へ輸送される。糖タンパク質のＮ−結合オリゴ糖単位の構造は、それらが処理されるゴルジ区画のグリコシルトランスフェラーゼのコンフォメーションおよびその組成によって決まる。

幾つかの植物細胞および昆虫細胞のゴルジ複合体におけるコア５糖単位は、キシロースおよびα１,３−結合フコースに置換されていることが示された(P. Lerouge et al., 1998, Plant Mol. Biol. 38, 31-48; Rayon et a1., 1998, L Exp. Bot. 49, 1463-1472)。7糖「ＭＭＸＦ^３」形成は、植物の主なオリゴ糖型である(Kurosaka et a1., 1991, J. Bio1. Chem., 266, 4168-4172)。従って、例えばホースラディシュペルオキシダーゼ、ニンジンβ−フルクトシダーゼおよびアメリカデイコ(Erythrina cristagalli)は、レクチンおよびミツバチ毒ホスホリパーゼＡ２またはグリカンコアに結合する昆虫胚α１,３−フコース残基由来の神経細胞膜糖タンパク質を含有する。これらの構造はそれぞれ、複合Ｎ−グリカンまたはマンノース欠乏若しくは断頭Ｎ−グリカンと称される。さらに、α−マンノシル残基はＧｌｃＮＡｃで置換し、ガラクトースおよびフコースが結合して、ヒトルイス(Lewis)ａ−エピトープに相当する構造体を調製することができる(Melo et al., 1997, FEBS Lett 415, 186-191; Fitchette-Laine et al., 1997, Plant J. 12, 1411-1417)。

キシロースおよびα1,3−結合フコースはいずれも、哺乳類の糖タンパク質には存在しない。コア−α１,３−フコースは、植物および昆虫のＮ−結合オリゴ糖に対する抗体のエピトープ認識に重要な役割があり(I. B. H. Wilson et al., Glycobiology Vol. 8, No, 7, pp. 651-661, 1998)、その結果これらのオリゴ糖に対するヒト人体または動物体中の免疫反応を引き起こすことが知られている。さらに、α１,３−フコース残基は種々の植物および昆虫アレルゲン間での広範囲におよぶアレルギー交差反応を引き起こす主要な原因の1つのようであり(Tretter et al., Int. Arch. A11ergy lmmunol. 1993; 102: 259-266)、「交差反応炭性水化物決定因子」(ＣＣＤ)と称される。トマトおよび花粉のエピトープの研究においても、α１,３−結合フコース残基が共通する決定因子として見出され、それが、トマトおよび花粉アレルギーがいっしょに患者において頻繁に生じる理由であると考えられる(Petersen et al., 1996, J. A11ergy Clin. Immunol., Vol. 98, 4; 805-814)。免疫交差反応が頻繁に発生することから、ＣＣＤはさらにアレルギー診断を妨害する。

ヒト人体において植物タンパク質が引き金となる免疫反応は、植物中で産生される組換えヒトタンパク質の医療上の使用において主要な問題である。この問題を回避するためには、α１,３−コア−フコシル化を阻止しなければならないであろう。ある研究では、Ｌ−フコース(６−デオキシ−Ｌ−ガラクトース)の代わりにＬ−ガラクトースを含むオリゴ糖であったにも関わらず、十分に生物学的活性があることが実証された(E. Zablackis et al., 1996, Science, Vol. 272)。別の研究では、Ｎ−アセチルーグルコサミニルトランスフェラーゼＩ(複合グリカンの生合成中の第一酵素)を喪失している植物シロイヌナズナ(Arabiodopsis thaliana)の変異体が単離された。この変異体中の複合糖タンパク質の生合成は阻害される。それにも関わらず、これらの変異体植物は特定の条件下で正常に発育することができる(A. Schaewen et a1, 1993, Plant Physiol. 102; 1109-1118)。

他のグリコシル化過程を妨害することなくオリゴ糖中のコア−α１,３−フコースの結合を意図的に遮断するには、単にこの特有なグリコシル化を直接担う酵素、即ちコア−１,３−フコシルトランスフェラーゼを不活性化しなければならないだろう。この酵素はマングビーンから初めて単離、特徴づけされ、そしてこの酵素活性が、非還元ＧｌｃＮＡｃ末端の存在に依存することが見出された(Staudacher et a1., 1995, Glycoconjugate J. 12, 780-786)。人間および他の脊椎動物にはなく、植物および昆虫にのみ生じるこのトランスフェラーゼを意図的に不活性化、または抑圧しなければならないであろう、そうすることで植物若しくは植物細胞、または昆虫若しくは昆虫細胞のそれぞれ中で産生されるヒトタンパク質は、従来では存在していた免疫反応を引き起こすエピトープをもはや含まなくなる。

John M. Burke ″Clearing the way for ribozymes″（Nature Biotechnology 15: 414-415; 1997）による文献は、リボザイム機能の一般的形態に関する。

Pooga et al., ″Cell penetrating PNA constructs regulate galanin receptor levels and modify pain transmission in vivo″（Nature Biotechnology 16：875-861; 1998）による文献は、ＰＮＡ分子一般に関し、具体的にはヒトガラニン受容体１型ｍＲＮＡに相補的なＰＮＡ分子に関する。

米国 5, 272, 066 A号公報は、真核および原核タンパク質をin vivo（生体内）での循環を延長させるように改変させる方法に関する。この例としては、結合したオリゴ糖を、種々の酵素、その中でもＧｌｃＮＡｃ−α１→３（４）−フコシルトランスフェラーゼを使って改変させる。

欧州特許0 643 132 A1号公報はヒト細胞（ＴＨＰ−１）から単離されるα１,３−フコシルトランスフェラーゼのクローニングに関する。この公報に記載されている炭水化物鎖は、ヒトシアリルルイスｘ−およびシアリルルイスａ−オリゴ糖に相当する。ヒト細胞由来酵素の特性は、植物細胞由来のフコシルトランスフェラーゼの特性とは全く違う。

米国特許 5, 272, 066 A号公報 欧州特許0 643 132 A1号公報

P. Lerouge et al., 1998, Plant Mol. Biol. 38, 31-48 Rayon et a1., 1998, L Exp. Bot. 49, 1463-1472 Kurosaka et a1., 1991, J. Bio1. Chem., 266, 4168-4172 Melo et al., 1997, FEBS Lett 415, 186-191 Fitchette-Laine et al., 1997, Plant J. 12, 1411-1417 I. B. H. Wilson et al., Glycobiology Vol. 8, No, 7, pp. 651-661, 1998 Tretter et al., Int. Arch. A11ergy lmmunol. 1993; 102: 259-266 Petersen et al., 1996, J. A11ergy Clin. Immunol., Vol. 98, 4; 805-814 E. Zablackis et al., 1996, Science, Vol. 272 A. Schaewen et a1, 1993, Plant Physiol. 102; 1109-1118 Staudacher et a1., 1995, Glycoconjugate J. 12, 780-786 John M. Burke, Nature Biotechnology 15: 414-415; 1997 Pooga et al., Nature Biotechnology 16：875-861; 1998 Staudacher et al., 1998, Anal. Biochem, 246, 96-101 Staudacher et al. 1991, Eur. J. Biochem. 199, 745-751 Baucombe 1996, Plant. Mo1. Bio1., 9: 373-382 Brigneti et al., 1998, EMB0 J. 17: 6739-6746 Waterhouse et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: 13959-13964 Wagner et al., 1994, Annu. Rev. Microbiol., 48: 713-742 Rittner et al., 1993, Nuc1, Acids Res., 21: 1381-1387 Patzel et a1. 1998; Nature Biotechnology, 16; 64-68 J. Burke, 1997, Nature Biotechnology; 15, 414-415 Kuwabara et al., 1998, Nature Biotechnology, 16; 961-965 Smith et al., 1990, Mol. Gen. Genet. 224: 447-481 Schaefer et al., 1997, Plant J.; 11(6)：1195-1206 Pooga et al., 1998, Nature Biotechnology, 16; 857-861 Staudacher et al., 1998, Gly-coconjugate J. 15, 355-360 Altmenn 1992, Anal. Biochem. 204, 215-219 Goerg et al. 1988, Electrophoresis, 9, 681-692 Joziasse, 1992, Glycobiology 2, 271-277 Strasser et al., 1999, Glycobiology(印刷中) Wilson et al., 1998, glycobiology 8, 651-661 Kubelka et al.,1994, Arch. Biochem. Giophys. 308, 148-157 Hase et al., 1984, J. Biochem. 95, 197-203

本発明の目的は、植物フコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子をクローニングし、配列決定すること、およびこの遺伝子を含むベクター、そのＤＮＡ断片、またはその改変ＤＮＡ若しくはそこから派生したＤＮＡを調製し、植物および昆虫ならびにそれらの細胞にこれらのベクターの１つをトランスフェクトし、正常では存在するα１,３−コア−フコースを含まない糖タンパク質を産生すること、ならびに相当するそれらの方法を提供することである。

本発明の目的は、２１１塩基対から１７４０塩基対のオープンリーディングフレームを持つ配列番号：１（本明細書では、ＩＵＰＡＣコードを用いることもあり、「Ｎ」はイノシンを意味する）に記載の配列、またはこの配列と少なくとも５０％相同する配列、若しくは以上に示した配列と厳格な(ストリンショントな)条件下でハイブリダイズする配列を含むＤＮＡ分子、または上のＤＮＡ配列とは遺伝コードが縮重している配列を含むＤＮＡ分子であって、該配列はフコシルトランスフェラーゼ活性を持つ植物タンパク質をコードしており、または上記配列に相補しているＤＮＡ分子、によって達成される。

これまでに開示されていないこの配列は、植物フコシルトランスフェラーゼ活性に関する全ての実験、分析および生産等に関する方法に完全に使用することができる。ここで、ＤＮＡ配列およびこの配列によってコードされるそのタンパク質も興味深い。しかし、特にそのＤＮＡ配列がフコシルトランスフェラーゼ活性の阻害に使用され得る。

配列番号１：のオープンリーディングフレームは、５１０アミノ酸を有し理論分子量５６.８ｋＤａであるタンパク質をコードし、膜貫通部分が恐らくはＡｓｎ３６およびＧｌｙ５４間の領域に存在する。配列番号１の配列をコード化したタンパク質の理論的ｐＩ値は、７.５１である。

植物フコシルトランスフェラーゼの活性は、標識したフコースおよび担体（例えば、セファロース）に結合した受容体（例えば、糖タンパク質）を含む試料にフコシルトランスフェラーゼを添加する方法および測定によって決定される。反応時間後、その試料を洗浄し、結合したフコースの含有量を測定する。この場合にフコシルトランスフェラーゼの活性は、活性測定値がネガティブコントロールの活性測定値よりも少なくとも１０から２０％、特に少なくとも３０から５０％高い場合は、ポジティブであると考える。さらに、糖タンパク質の構造はＨＰＬＣ測定によって証明し得る。このようなプロトコールは既に知られている(Staudacher et al., 1998, Anal. Biochem, 246, 96-101; Staudacher et al. 1991, Eur. J. Biochem. 199, 745-751）を参照のこと。

例えば、フコシルトランスフェラーゼを、放射活性標識したフコースおよび受容体（例えば、ＧｌｃＮＡcβ１−２Ｍａｎα１−３（ＧｌｃＮＡβ１−２Ｍａｎα１−６）Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−Ａｓｎ）を含む試料に混合する。その反応時間後、その試料を陰イオン交換クロマトグラフィーによって精製し、結合したフコースの量を測定する。受容体を伴う試料の放射活性測定および受容体を伴わないネガティブコントロールの放射活性測定の差から活性を計算できる。フコシルトランスフェラーゼの測定した放射活性が、ネガティブ試料の測定した放射活性よりも少なくとも３０−４０％高ければ、フコシルトランスフェラーゼ活性はポジティブであると評価される。

ＤＮＡ分子２つの対合は、温度の選択および試料のイオン強度によって変化させることができる。本発明では、厳格な条件とは、条件が正確かつ厳格な結合を可能とする条件と理解される。例えば、ＤＮＡ分子を５０℃、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０.５Ｍ ＮａＰＯ４、ｐＨ７.０、１ｍＭ ＥＤＴＡ中でハイブリダイズさせ、４２℃、１％ ＳＤＳで洗浄する。

配列が配列番号１と少なくとも５０％の相同性があるかは、例えばＥＭＢＬのプログラムＦａｓｔＤＢまたはＳＷＩＳＳＰＲＯＴデータバンクの手段によって決定することができる。

好ましくは、本発明のＤＮＡ分子の配列は、ＧｌｃＮＡｃ−α１,３−フコシルトランスフェラーゼ活性、持にコア−α１,３−フコシルトランスフェラーゼ活性を持つタンパク質をコードしている。

既述のように、α１,３−フコシルトランスフェラーゼのコアは植物および昆虫に存在するが、ヒト人体には存在しないので、特に、このＤＮＡ配列はフコシルトランスフェラーゼ特異的な分析および実験ならびにその生産方法に有用である。

コア−α１,３−フコシルトランスフェラーゼとは、具体的にはＧＤＰ−Ｌ−Ｆｕｃ：Ａｓｎ−結合ＧｌｃＮＡｃ−α１,３−フコシルトランスフェラーゼと考えられる。本発明の範囲内では、用語α１,３−フコシルトランスフェラーゼは、原則として特にコア−α１,３−フコシルトランスフェラーゼを意味する。既述の活性測定に関しては、特に非還元ＧｌｃＮＡｃ末端を持つ受容体を使用する。そのような受容体は、例えば、ＧｌｃＮＡｃβ１−２Ｍａｎα１−３(ＧｌｃＮＡｃβ１−２Ｍａｎα１−６)Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃβｔ−Ａｓｎ、ＧｌｃＮＡｃβ１−２Ｍａｎα１−３(ＧｌｃＮＡｃβ１−２Ｍａｎα１−６)Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４(Ｆｕｃα１−６)ＧｌｃＮＡｃβ１−ＡｓｎおよびＧｌｃＮＡｃβ１−２Ｍａｎα１−３[Ｍａｎα１−３(Ｍａｎα１−６)Ｍａｎα１−６]Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−Ａｓｎである。さらに、フコースが結合するか否かは、Ｎ−グリコシダーゼＦに対する非感受性を測定することによって決定でき、それは質量分光測定方法によって検出できる。

好ましくは、本発明のＤＮＡ分子は、配列番号１の配列と少なくとも７０−８０％、特に好ましくは少なくとも９５％の相同性を有する。この配列は、特に活性なＧｌｃＮＡｃ−α１,３−フコシルトランスフェラーゼをコードする。

ＤＮＡ配列は植物または昆虫に応じて多かれ少なかれ変化し得るので、例えば、配列番号１の配列と７０％の相同性を示す配列もまた、既述のような分析、実験または生産方法に使用するのに十分なフコシルトランスフェラーゼ活性を持つ。

更に有利な態様によれば、ＤＮＡ分子は２１５０個の塩基対から２２５０個の塩基対、特に２１９８個の塩基対を含む。このＤＮＡ分子は開始コドンの上流にある１００個の塩基対から３００個の塩基対、特に２１０個の塩基対を含み、同様にオープンリーディングフレームのストツプコドン後の下流にある３５０個の塩基対から４４０個の塩基対、特に４５８個の塩基対を含み、好ましくは、そのＤＮＡ分子末端は３’−ポリ（Ａ）−テールを含む。この様式では、翻訳レベルにおいて欠陥のない調節が約束され、活性なＧｌｃＮＡｃ−α１,３−フコシルトランスフェラーゼをコードするうえで、特に効果的かつ確実なＤＮＡ分子が提供される。

本発明はさらに、配列番号３の配列を含むＤＮＡ分子、または以上で特定した配列と少なくとも８５％、特に好ましくは少なくとも９５％、とりわけ少なくとも９９％の相同性を持つ配列を含むＤＮＡ分子、または以上で特定した配列と厳格な条件下でハイブリダイズするＤＮＡ分子、または以上で特定したＤＮＡ配列とは遺伝コードが縮重しているＤＮＡ分子に関する。相同性の決定は、好ましくは、挿入および欠失を認識し、それを相同性計算では考慮しないプログラムを用いて行なう。このヌクレオチド配列は保存ペプチドモチーフをコードしており、このことは多数の活性かつ機能性ＧｌｃＮＡｃ−α１,３−フコシルトランスフェラーゼがそれによってコードされるアミノ酸配列を含んでいることを意味する。例えば、その配列は配列番号３の配列と同じ大きさを含んでもよく、もちろん、それより大きいサイズもあり得る。本配列は完全なタンパク質をコードする配列よりも短かいので、組換え、欠失または他の変異に対して感受性が小さい。保存モチーフおよびその高い安定性がおかげで、本配列は特に配列認識試験に有利である。

配列番号３は以下の配列：
５”−ＧＡＡＧＣＣＣＴＧＡＡＧＣＡＣＴＡＣＡＡＡＴＴＴＡＧＣＴＴＡＧＣＧＴＴＴＧＡＡＡＡＴＴＣＧＡＡＴＧＡＧＧＡＡＧＡＴＴＡＴＧＴＡＡＣＴＧＡＡＡＡＡＴＴＣＴＴＣＣＡＡＴＣＣＣＴＴＧＴＴＧＣＴＧＧＡＡＣＴＧＴＣＣＣＴ−３’：
を含有する。

さらなる態様に関して、本発明は既述のＤＮＡ分子の１つの部分配列を含み、２０塩基対から２００塩基対、好ましくは３０塩基対から５０塩基対の大きさを持つＤＮＡ分子に関する。そのＤＮＡ分子は、例えばプローブとしてＧｌｃＮＡｃ−α１,３−フコシルトランスフェラーゼの相補的配列に結合することで、それらを試料から選択することができる。この様式では、さらに大部分の変動する植物および昆虫由来のＧｌｃＮＡｃ−α１,３−フコシルトランスフェラーゼを選択し、単離し、特徴付けることができる。また、任意の所望の配列または幾つかの種々の部分配列、具体的にはすでに既述した保存モチーフの一部を使用し得る。

これを行なうにあたり、既述のＤＮＡ分子の１つがに検出可能な標識物質と共有結合すれば、特に好都合である。標識物質としては、任意の一般的なマーカー、例えば、蛍光、発光、放射性マーカー、非同位体マーカー（例えば、ビオチン）を使用することができる。この様式では、ハイブリッド形成法の手段を用いた固体組織試料中（例えば、植物から）、さらに液体試料中において相当するＤＮＡ分子の検出、選択および定量に適した試薬が提供される。

本発明のさらなる態様は、既述のＤＮＡ分子の１つ、または少なくとも２０塩基対を持つ種々の長さであるそれらの部分を含む、生物学的に機能するベクターに関する。宿主細胞中にトランスフェクトするのに関して、独立して増幅可能なベクターが必要であり、宿主細胞、翻訳機構、ＤＮＡ分子の役割および大きさに依存して、好ましいベクターを使用することができる。多くのベクターが知られているために、それらを列挙することは本明細書の制限を越えることになり得、特にそれらのベクターは当業者には周知であるので、本明細書中では列挙しない（本明細書中で使用する全ての技術および用語と同様に、それらのベクターは当業者に周知である、Sambrook Maniatisも参照のこと）。理想的に、ベクターは分子量が小さく、ベクターを含む宿主細胞か、ベクターを含まない宿主細胞かの選択が容易に行なえるよう、細胞中で容易に認識可能な表現型を導入するような選択遺伝子を含ませるべきである。ＤＮＡおよび相当する遺伝産物の収量を大量に得るために、ベクターは強力なプロモーターと同様にエンハンサー、遺伝子増幅シグナルおよび調節配列を含ませるべきである。ベクターの自律的増殖とは、さらに複製開始点が重要である。ポリアデニル化部位はｍＲＮＡの正確な処理およびＲＮＡ転写に関するスプライシング信号を担う。仮にファージ、ウイルスまたはウイルス粒子をベクターとして使用する場合、パッケージ化信号はベクターＤＮＡのパッケージ化を調節し得る。例として、植物中の転写とはＴｉプラスミドが適しており、昆虫細胞中の転写とはバキュロウイルスが、そして昆虫とは、それぞれＰエレメントのようなトランスポゾンが適している。

既述の発明ベクターを植物または植物細胞中に挿入すれば、内因性のα１,３−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子の遺伝子発現である転写後の抑圧は、それらに相同性のある導入遺伝子またはそれらの部分のセンス方向の転写によって達成される。このセンス技術に関しては、さらに文献としてBaucombe 1996, Plant. Mo1. Bio1., 9: 373-382およびBrigneti et al., 1998, EMB0 J. 17: 6739-6746で公表されている。この「遺伝子サイレンシング」はα１,３−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子の発現を抑圧する効果的な方法である（Waterhouse et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: 13959-13964も参照）。

さらに、本発明は既述の態様の１つのＤＮＡ分子、またはプ口モータに対して逆方向に種々の長さを持つそれらの部分を含む生物学的に機能するベクターに関する。このベクターを宿主細胞中にトランスフェクトすれば、ＧｌｃＮＡｃ−α１,３−フコシルトランスフェラーゼのｍＲＮＡに相補し、後に複合体を形成する「アンチセンスｍＲＮＡ」を読むことになるだろう。この結合は正確なプロセッシング、輸送、安定性を阻害し、またはリボソームのアニーリングを妨げることにより、ＧｌｃＮＡｃ−α１,３−フコシルトランスフェラーゼの転写および正常な遺伝子発現を阻害する。

ＤＮＡ分子はその完全な配列をベクター中に挿入することができるが、それらの部分配列は、大きさが小さいためいに、特定の目的には有利となり得る。アンチセンス態様に関しては、例えばそのトランスフェラーゼｍＲＮＡに結合し得る十分に大きいアンチセンスｍＲＮＡを形成させるのに、ＤＮＡ分子は十分な大きさであることが重要である。天然に生じるアンチセンスＲＮＡ分子がおおよそ１００ヌクレオチドであることがよく知られているので、アンチセンスｍＲＮＡ分子は例えば５０から２００ヌクレオチドを含むことが好ましい。

活性α１,３−フコシルトランスフェラーゼの発現阻害に特に効果的であるので、センス技術およびアンチセンス技術を組み合わせることが好ましい（Waterhouse et a1., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 95: 13959-13964）。

素早くハイブリダイズするＲＮＡ分子を使用のが都合良い。５０ヌクレオチド以上の大きさを持つアンチセンスＲＮＡ分子の効率は、in vitro(無細胞系)でのアニーリング反応速度論に依存する。従って、例えば素早くアニーリングするアンチセンスＲＮＡ分子は、ゆっくりハイブリダイズするＲＮＡ分子よりタンパク質発現を阻害することが顕著である(Wagner et al., 1994, Annu. Rev. Microbiol., 48: 713-742; Rittner et al., 1993, Nuc1, Acids Res., 21: 1381-1387)。そのように素早くハイブリダイズするアンチセンスＲＮＡ分子は、特に多くの外部塩基(遊離末端および連結配列)、多くの構造上のサブドメイン(構成要素)および低度の輪状構造を含む(Patzel et a1. 1998; Nature Biotechnology, 16; 64-68)。アンチセンスＲＮＡ分子の仮説上の２次構造を、例えばコンピュータープログラムを使用して決定することができ、それに応じて好ましいアンチセンスＲＮＡ ＤＮＡ配列を選ぶ。

ＤＮＡ分子の種々の配列領域をベクター中に挿入し得る。可能性の１つとしては、例えばリボソームがアニーリングするその部分のみをベクター中に挿入することがある。ｍＲＮＡのこの領域を遮断すれば、翻訳全体を停止させるのに十分である。また、特に高効率のアンチセンス分子は、遺伝子の５'および３'非翻訳領域に関する結果である。

好ましくは、本発明のＤＮＡ分子は、欠失、挿入および/または置換変異から成る配列を含む。変異ヌクレオチドの多くは可変であり、単一ヌクレオチドから幾つかの欠失、挿入および置換したヌクレオチドに変わる。また、リーディングフレームが変異によってずれることもあり得る。そのような「ノックアウト遺伝子」の場合は、単にＧｌｃＮＡｃ−α１,３−フコシルトランスフェラーゼの発現を妨害するのに重要なだけであり、活性、機能性酵素の形成を防ぐ。これを行なうにあたり、変異の位置は可変であるので、酵素の活性クンパク質の発現を阻止する。好ましくは、酵素のＣ末端領域にある触媒領域中の変異である。ＤＮＡ配列に変異を挿入する方法は当業者に周知であり、従って種々の突然変異生成の可能性をここで詳細に記載する必要はない。偶然一致する変異と同様に、具体的には特異的突然変異、例えば、部位特異的突然変異、オリゴヌクレオチド制御(oligonucleotide-controlled)突然変異、または制限酵素を用いた変異を、この例として用いる。

さらに本発明は、既述の本発明ＤＮＡ分子の部分配列と相補的である少なくとも各々が１０から１５塩基対の部分配列２つを含むリボザイムをコードするＤＮＡ分子を提供し、該リボザイムは天然ＧｌｃＮＡｃ−α１,３−フコシルトランスフェラーゼＤＮＡ分子から転写されたｍＲＮＡと複合体形成し、開裂させる。そのリボザイムはＧｌｃＮＡｃ−αｌ,３−フコシルトランスフエラーゼのｍＲＮＡの相補的な塩基対合によって、そのｍＲＮＡを認識するのだろう。続いて、そのリボザイムは、酵素が翻訳される前に配列特異的様式(sequence-specific manner)によりＲＮＡを分解し、破壊する。開裂させた基質から解離した後、そのリボザイムはＲＮＡ分子と繰り返しハイブリダイズし、特定のエンドヌクレアーゼとして作用しする。一般に、リボザイムはタンパク質をコードする全ＤＮＡ配列が知られていなくても、特定のｍＲＮＡを不活性化するために個別に調製することができる。リボソームがｍＲＮＡに沿ってゆっくり移動する場合、リボザイムは特に効果的である。この場合、リボザイムはｍＲＮＡ上のリボソームがくっついていない部位を見つけることが容易である。この理由により遅いリボソームの変異体もリボザイムに適した系として好ましい(J. Burke, 1997, Nature Biotechnology; 15, 414-415)。このDNA分子は植物ＧｌｃＮＡｃ−α１,３−フコシルトランスフェラーゼの発現の下方調節および阻害それぞれに、特に都合がよい。

可能な方法の１つに、リボザイムの多様型(例えば、ミニザイム)を使用することもある。ミニザイムは大きいｍＲＮＡ分子の開裂に特に効果的である。ミニザイムはステム/ループIIの代わりに短いオリゴヌクレオチドリンカーを持つハンマー状頭の(hamer head)リボザイムである。二量体−ミニザイムは特に効果的である(Kuwabara et al., 1998, Nature Biotechnology, 16; 961-965)。そういった訳で、本発明は最後に挙げた２つのＤＮＡ分子 (変異またはリボザイム−ＤＮＡ分子)の内１つを含む生物学的機能性ベクターにも関するものである。以上のベクターに関して述べたことは、この場合に適用する。そのようなベクターは、例えば微生物中に挿入することができ、既述の高濃度ＤＮＡ分子の製造に使用することができる。さらに、そのようなベクターは、植物および昆虫体中、ＧｌｃＮＡｃ−α１,３−フコシルトランスフェラーゼを下方調節または完全に阻害する目的で、この生体中へ特定のＤＮＡ分子を挿入することに期待できる。

本発明は本発明のＤＮＡ分子を含むｃＤＮＡの調製方法を提供するものであり、それは、ＲＮＡを昆虫または植物細胞、特に胚軸細胞から分離し、逆転写酵素およびプライマーを混合した後、逆転写を行なうことである。本方法の各段階は、本質的に既知手順に従って行なわれる。一方で、逆転写についてオリゴ(ｄＴ)プライマーを使用して全長のｍＲＮＡのｃＤＮＡを生成することができ、その後ただＧｌｃＮＡｃ−α１,３−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ分子を調製するために選択したプライマーを用いてＰＣＲをすることができる。もう一方で、その選択したプライマーを、短く、特定のｃＤＮＡを得るために逆転写に直接用い得る。その好ましいプライマーは、例えばトランスフェラーゼのｃＤＮＡ配列パターンに従って合成的に調製することができる。本方法を用いることで、大分子量の発明ｃＤＮＡ分子を単純な方法で、失敗もほとんどなく、素早く製造することができる。

さらに、本発明はＧｌｃｅＮＡｃ−α１,３−フコシルトランスフェラーゼをクローニングする方法に関するものであり、本発明ＤＮＡ分子を、後に宿主細胞および宿主中それぞれヘトランスフェクトするベクターに組換え、活性ＧｌｃＮＡｃ−α１,３−フコシルトランスフェラーゼを発現するトランスフェクト宿主細胞、細胞株を選択し、増幅することを特徴とする。そのＤＮＡ分子は、例えば制限エンドヌクレアーゼを用いてベクター中に挿入する。そのベクターに関しては、既に以上で述べたことを適用する。本方法では効果的な宿主−ベクター系を選ぶことが重要である。活性酵素を得るためには、真核宿主細胞が持に好ましい。可能な方法の１つに、昆虫細胞中にそのベクターをトランスフェクトすることがある。そうする場合、特に昆虫ウイルス、例えばバキュロウイルスをベクターとして使用しなければならないだろう。

ヒトまたは他の脊椎動物細胞にもトランスフェクトすることができるのは当然であり、その場合、後者は外来の酵素を発現するだろう。

好ましくは、ＧｌｃＮＡｃ−α１,３−フコシルトランスフェラーゼ生産を抑圧または完全に停止させた組換え宿主細胞、特に植物細胞若しくは昆虫細胞または植物若しくは昆虫それぞれの調製方法を提供し、それは、本発明のベクター、即ち本発明ＤＮＡ分子、変異ＤＮＡ分子またはリボザイムをコードしたＤＮＡ分子を含むもの、若しくはプロモーターに対して逆向きのＤＮＡ分子を含むものの少なくとも１つを宿主細胞または植物若しくは昆虫へ挿入することを特徴とする。トランスフェクションに関して以上に述べたことは、本件中にも適応する。

宿主細胞として、例えば植物細胞を使用する場合、例えばアグロバクテリアを用いるＴｉプラスミド系が適格である。アグロバクテリア系とは、直接植物にトランスフェクトすることができる(アグロバクテリアは植物において根茎虫こぶを生じさせる)。傷つけた植物にアグロバクテリアを感染させた場合、そのバクテリア自身はその植物中に入り込まず、輪状の染色体外の腫瘍誘導Ｔｉ−プラスミドから派生する組換えＤＮＡ部分(Ｔ−ＤＮＡと称される)を植物細胞中へ挿入する。そのＴ−ＤＮＡ、およびそこに挿入されたＤＮＡ分子もまた、細胞の染色体に安定な様式で組み込まれ、植物中でそのＴ−ＤＮＡ遺伝子を発現する。

種々の宿主系に関して、既知の効果的なトランスフェクト機構が多数存在する。その例の幾つかは、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム法、マイクロインジェクション、リポソーム法である。

続いて、トランスフェクトした細胞を、例えばベクターが持つ抗生物質耐性遺伝子、または他のマーカー遺伝子に基づいて選択する。その後、トランスフェクトした細胞株を小規模、例えばぺトリ皿にて、または大規模、例えば発酵槽にて増幅する。さらに、植物は特異な特性を持っており、即ち１つの（トランスフェクトされた）細胞またはプロトプラストから発育させることのできる完全な植物体へと再生することができる。

使用するベクターに応じた過程が宿主中に生じる結果、酵素発現が抑圧または完全に停止され得る：

欠失、挿入または置換変異のあるＤＮＡ分子を含むベクターをトランスフェクトした場合、相同組換えが生じる：その変異ＤＮＡ分子はその変異にも関わらず、宿主細胞のゲノム中の同一配列を認識し、その場所に完全に挿入される結果、「ノックアウト遺伝子」が形成される。この様式では、ＧｌｃＮＡｃ−α１,３−フコシルトランスフェラーゼの完全な発現を阻害し得る変異を、ＧｌｃＮＡｃ−α１,３−フコシルトランスフェラーゼの遺伝子中に導入する。以上で説明したように、この技術を用いることで、その変異が活性タンパク質の発現を遮断するのに十分であることは重要である。選択し、増幅した後、さらに相同組換えまたは変異度のそれぞれを決定するために、その遺伝子を調べるように配列決定し得る。

リボザイムをコードするＤＮＡ分子を含むベクターをトランスフェクトした場合、その活性リボザイムを宿主細胞中で発現させ得る。そのリボザイムは、ＧｌｅＮＡｃ−α１,３−フコシルトランスフェラーゼの相補ｍＲＮＡと少なくとも特定の部位で複合体を形成し、この部位を開裂し、この様式でその酵素の翻訳を阻害することができる。この宿主細胞および細胞株、それから派生した任意に植物では、ＧｌｃＮＡｃ−α１,３−フコシルトランスフェラーゼは発現し得ない。そのベクターがプロモーターに対してセンスまたは逆方向に本発明ＤＮＡ分子を含む場合、センスまたはアンチセンスｍＲＮＡがトランスフェクト細胞（または、植物、それぞれ）中で発現し得る。そのアンチセンスｍＲＮＡは、少なくともＧｌｃＮＡｃ−α１,３−フコシルトランスフェラーゼのｍＲＮＡの一部と相補的であり、同様にその酵素の翻訳を阻害し得る。アンチセンス技術による遺伝子発現の抑圧方法の例としては、文献Smith et al., 1990, Mol. Gen. Genet. 224: 447-481によって公表され、この文献中において、トマトの成熟過程に関わる遺伝子の発現が阻害されるとある。

上記すべての系において、ＧｌｃＮＡｃ−α１,３−フコシルトランスフェラーゼの発現は、少なくとも抑圧され、好ましくは更に完全に停止される。遺伝子発現の妨害の程度は、そのゲノムの領域内における複合体形成度、相同組換え頻度、後に同時発生し得る突然変異、および他の過程に依存し得る。そのトランスフエクト細胞をＧｌｃＮＡｃ−α１,３−フコシルトランスフェラーゼ活性に関して調べ、選択する。

その上、既述したベクターの挿入に加えて、哺乳類のタンパク質、例えばβ１,４−ガラクトシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を含むベクターを宿主中に導入することで、α１,３−フコシルトランスフェラーゼの発現の抑圧を、既述するよりもより強めることができる。他の哺乳類の酵素作用、本発明ベクターおよび特に効果的な哺乳類の酵素ベクターを用いた活性α１,３−フコシルトランスフェラーゼの発現の阻害の組み合わせによって、フコシル化を減少させることができる。

あらゆる植物型、例えばマングビーン、タバコ植物、トマトおよび/またはポテト植物をトランスフェクションに使用することができる。組換え宿主細胞、特に植物細胞若しくは昆虫細胞、または植物若しくは昆虫のそれぞれを作成する他の有利な方法は、突然変異を含むＤＮＡ分子を宿主細胞、または植物若しくは昆虫のそれぞれのゲノム中、突然変異のない相同配列の個所に挿入することである(Schaefer et al., 1997, Plant J.; 11(6)：1195-1206)。従って、この方法はベクターではなく、純粋なＤＮＡ分子によって機能する。そのＤＮＡ分子を宿主中へ、例えば遺伝子照射(gene bombardment)、マイクロインジェクションまたはエレクトロポレーション(ちょうど３つの実施例で言及する)によって挿入する。すでに既述したように、ＤＮＡ分子は宿主のゲノム中の相同配列に結合することで、相同組換えした後、欠失、挿入または置換変異のそれぞれをゲノム中で受けることになる：ＧｌｃＮＡｃ−α１,３−フコシルトランスフェラーゼの発現は、それぞれ抑圧または完全に遮断され得る。

さらに本発明の他の態様は、天然の植物または植物細胞それぞれ、および昆虫または昆虫細胞それぞれに生じるＧｌｃＮＡｃ−α１,３−フコシルトランスフェラーゼ活性が５０％以下、特に２０％以下、特に好ましくは０％である植物または植物細胞それぞれ、および昆虫または昆虫細胞それぞれのＧｌｃＮＡｃ−α１,３−フコシルトランスフェラーゼ活性に関する。これらの植物または植物細胞それぞれの利点は、それらによって産生される糖タンパク質が、あらゆるα１,３−結合フコースをほとんどまたは完全に含まないことである。これらの植物または昆虫それぞれの産物をヒト人体または脊椎動物体に用いた場合、α１,３−フコースエピトープに対して免疫反応を示さないだろう。

好ましくは、既述の方法の１つを用いて作成した組換え植物または植物細胞のそれぞれを提供し、それらのＧｌｃＮＡｃ−α１,３−フコシルトランスフェラーゼ生産は、それぞれ抑圧または完全に遮断している。

また、本発明は既述の方法の１つを用いて作成した昆虫または昆虫細胞それぞれに関するものであり、それらのＧｌｃＮＡｃ−α１,３−フコシルトランスフェラーゼ生産は、それぞれ抑圧または完全に遮断している。また、この例としては、α１,３−結合フコース残基を持たない糖タンパク質を産生すること、α１,３−フコースエピトープに対して同様に免疫反応を示さなくなる

また、本発明は、本発明に基づくＤＮＡ分子配列、およびそれらの部分配列と相補的な塩基配列を含むＰＮＡ分子に関する。ＰＮＡ（ペプチド核酸）はＤＮＡ様の配列であり、その核酸塩基はシュードペプチド骨格に結合する。ＰＮＡは一般に、ワトソン−クリツク型塩基対合およびヘリツクス形成によって相補的なＤＮＡ−、ＲＮＡ−またはＰＮＡ−オリゴマーとハイブリダイズする。そのペプチド骨格は、酵素分解に対して耐性が増強されている。従って、ＰＮＡ分子は改善されたアンチセンス物質である。ヌクレアーゼもプロテアーゼもＰＮＡ分子を攻撃できない。ＰＮＡ分子の安定性には、相補配列に結合する場合における、ＤＮＡおよびＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、テロメラーゼおよびリボソームに対する十分な立体障害が含まれる。ＰＮＡ分子が既述の配列を含む場合、ＧｌｃＮＡｃ−α１,３−フコシルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡまたはＤＮＡの部位それぞれに結合し、この方法でこの酵素の転写を阻害することができる。転写および翻訳せさないようなＰＮＡ分子は、例えばｔ−Ｂｏｃ技術によって合成的に調製し得る。有利なことに、本発明ＤＮＡ分子の配列およびそれらの部分配列に相当する塩基配列を含むＰＮＡ分子を提供する。このＰＮＡ分子はＧｌｃＮＡｃ−α１,３−フコシルトランスフェラーゼのｍＲＮＡまたはｍＲＮＡの部分と複合体を形成することで、その酵素の翻訳を阻害し得る。アンチセンスＲＮＡについて記載する同様の議論は、この場合に適用する。従って、例えば特に効果的な複合体形成領域は、ｍＲＮＡの翻訳開始領域、または５’−非翻訳領域でもある。

本発明の更なる態様は転写または翻訳レベルそれぞれで、ＧｌｃＮＡｃ−α１,３−フコシルトランスフェラーゼの発現の遮断を含む植物若しくは昆虫または細胞それぞれ、特に、植物細胞または昆虫細胞の作成方法に関するものであり、それは本発明ＰＮＡ分子を細胞中に挿入することを特徴とする。ＰＮＡ分子(molecule)またはＰＮＡ分子(molecules)それぞれの細胞中への挿入には、再び従来の方法、例えばエレクト口ポレーションまたはマイクロインジェクションを使用する。ＰＮＡオリゴマーが細胞侵入ペプチド、例えばトランスポゾンまたはｐＡｎｔｐに結合する場合、特に効率的であるのは挿入である（Pooga et al., 1998, Nature Biotechnology, 16; 857-861）。

本発明は、ＧｌｃＮＡｃ−α１,３−フコシルトランスフェラーゼ生産がそれぞれ抑圧または完全に遮断された本発明組換え植物または植物細胞それぞれおよび昆虫または昆虫細胞それぞれ、または本発明方法によって、ＰＮＡ分子が挿入された植物若しくは昆虫または細胞それぞれに、糖タンパク質を発現する遺伝子をトランスフェクトすることで組換え糖タンパク質を発現させることを持微とする、糖タンパク質の製造方法を提供する。これを行なう場合、すでに既述したように、所望のタンパク質に対する遺伝子を含むベクターを宿主または宿主細胞中それぞれに、すでに既述したようにトランスフェクトする。トランスフェクト植物細胞または昆虫細胞が所望のタンパク質を発現するようになり、それらはほとんどまたは完全にα１,３−結合フコースを持たない。従って、それらがヒト人体または脊椎動物体で、既述の免疫反応を引き起こすことはない。あらゆるタンパク質を、これらの系で産生し得る。有利なことに、ＧｌｃＮＡｃ−α１,３−フコシルトランスフェラーゼ生産が抑圧または完全に遮断された組換え植物または植物細胞それぞれおよび組換え昆虫または昆虫細胞それぞれ、または本発明方法によって、ＰＮＡ分子が挿入された植物若しくは昆虫、または細胞それぞれに、糖タンパク質を発現する遺伝子をトランスフェクトすることで組換え糖タンパク質を発現することを特徴とする組換えヒト糖タンパク質の製造方法を提供する。この方法によって、植物体(植物細胞)中でヒトタンパク質を産生させることができるようになり、それをヒト人体に用いた場合、α１,３−結合フコース残基に対して直結する全ての免疫反応を引き起こすことはない。そこで、組換え糖タンパク質を産生するために食料品として出す植物類、例えばバナナ、ポテトおよび/またはトマトを利用することができる。この植物組織は組換え糖タンパク質を含むので、例えばその組織から組換え糖タンパク質を抽出し、続いて処理する、または直接植物組織を摂食することそれぞれによって、ヒト人体に組換え糖タンパク質を取り込む。好ましくは、ＧｌｃＮＡｃ−α１,３−フコシルトランスフェラーゼ生産がそれぞれ抑圧または完全に遮断された本発明の組換え植物または植物細胞それぞれと同様に組換え昆虫または昆虫細胞それぞれ、または本発明方法によって、ＰＮＡ分子が挿入された植物若しくは昆虫、または細胞それぞれに糖タンパク質を発現する遺伝子をトランスフェクトすることで、組換え糖タンパク質を発現する医療に適した組換えヒトタンパク質の製造方法を提供する。これを行なうにあたり、医療的に関心のあるあらゆるタンパク質を使用することができる。

その上、本発明は既述の方法によって、組換え糖タンパク質を植物系または昆虫系中で調製し、それらのペプチド配列が、フコシルトランスフェラーゼを縮減させていない植物系または昆虫系で発現されたタンパク質に生じるα１,３−結合フコシル残基の５０％以下、特に２０％以下、特に好ましくは０％を含む組換え糖タンパク質に関する。α１,３−結合フコース残基を含まない糖タンパク質が当然好ましい。α１,３−結合フコースの量は、既述のＧｌｃＮＡｃ−α１,３−フコシルトランスフェラーゼの抑圧の程度に依存し得る。

好ましくは、本発明は既述の方法によって、植物系または昆虫系で産生された組換えヒト糖タンパク質に関するものであり、それらのペプチド配列はフコシルトランスフェラーゼを縮減させていない植物系または昆虫系で発現されたクンパク質に生じるα１,３−結合フコシル残基の５０％以下、特に２０％以下、特に好ましくは０％を含む。

具体的に好ましい態様は既述の方法によって、医療使用に適した組換えヒト糖タンパク質に関するものであり、それらのペプチド配列はフコシルトランスフェラーゼを縮減させていない植物系または昆虫系で発現されたクンパク質に生じるα１,３−結合フコシル残基の５０％以下、特に２０％以下、特に好ましくは０％を含む。

本発明の糖タンパク質は、持定の植物または昆虫それぞれで異なるオリゴ糖結合単位を含むことができ、それによってヒト糖タンパク質の場合、それはこの天然糖タンパク質と異なる。それにもかかわらず、本発明に基づく糖タンパク質によって、ヒト人体においてわずかな免疫反応しか引き起こさず、または全く免疫反応を引き起こすことはなく、それは、本明細書の導入部分ですでに述べたように、α１,３−結合フコシル残基が植物および昆虫糖タンパク質に対する免疫反応または交差免疫反応それぞれに対する主要な要因だからである。

更なる態様は、本発明の糖タンパク質を含む製薬的な組成を含む。本発明の糖タンパク質に加え、さらに製薬的な組成はそのような組成に一般的な添加物を含む。これらは、例えば種々のバッファー内容物（例えば、トリスーＨＣｌ、酢酸塩、リン酸塩、ｐＨ、およびイオン強度）、添加剤、例えば、界面活性剤および可溶化剤(例えば、Ｔｗｅｅｎ ８０、ポリソルビン酸塩 ８０)、防腐剤(例えば、チメロサール、ベンジルアルコール)、補助剤、酸化防止剤(例えば、アルコルビン酸、メタ亜硫酸水素ナトリウム)、乳化剤、充填剤(例えば、ラクトース、マンニトール)、共有結合ポリマー、例えばポリエチレングリコール、タンパク質に対する多因子化合物の粒子組成における物質の取り込み、例えば、ポリ乳酸、ポリグリコール酸など、またリポソームにおいて、それぞれの処置に好ましい助剤および/または担体物質である。そのような組成は、物理的条件、安定性、本発明の糖タンパク質のin vivoでの遊離速度およびin vivoでの分泌速度が影響し得る。

また、本発明は、試料中に標識した本発明のＤＮＡ分子を混合し、それがＧｌｃＮＡｃ−α１,３−フコシルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ分子に結合することで、試料中のＧｌｃＮＡｃ−α１,３−フコシルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ分子を選択する方法も提供する。そのハイブリダイズしたＤＮＡ分子を検出し、定量し、かつ選択することができる。標識したＤＮＡ分子は一本鎖ＤＮＡを含む試料に対してハイブリダイズすることができ、その試料を例えば加熱によって変成させる。可能な方法の１つとして、エンドヌクレアーゼを添加した後に、アガロースゲルを用いたゲル電気泳動によってＤＮＡを分離し、アッセイすることができる。ニトロセルロース膜に移行させた後、本発明の標識したＤＮＡ分子を混合し、相当する相同ＤＮＡ分子にハイブリダイズさせる(サザンブロッティング)。

他の可能な方法には、本発明のＤＮＡ分子配列から派生した特定のおよび/または縮重したプライマーを使用するＰＣＲによる方法によって他種から相同遺伝子を見つけることがある。

好ましくは、以上で定義した本発明方法に関する試料は、植物または昆虫組織の染色体ＤＮＡを含む。この方法によって、ＧｌｃＮＡｃ−α１,３−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子の存在に関して、多くの植物または昆虫を、とても素早くかつ効率的な様式でアツセイできる。この様式では、この遺伝子を含まない植物または昆虫をそれぞれ選択することができ、または既述の本発明方法によって、この遺伝子を含む植物および昆虫中でのＧｌｃＮＡｃ−α１,３−フコシルトランスフェラーゼの発現をそれぞれ抑圧または完全に遮断することによって、続いてそれらをトランスフェクトし、（ヒト）糖タンパク質の産生に使用し得る。また、本発明は最後に挙げた２つの方法によって選択し、続いて試料中から単離したＧｌｃＮＡｃ−α１,３−フコシルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ分子に関する。これらの分子は更にアツセイに使用することができる。それらの配列を決定し、次々にＧｌｃＮＡｃ−α１,３−フコシルトランスフェラーゼを探すＤＮＡプローブとして使用することができる。これらの−１ａと標識された−ＤＮＡ分子は生体に対して機能し、生体から単離したＤＮＡ分子は生体に共通し、本発明のＤＮＡ分子よりもプローブとしてより効率的である。本発明の更なる態様は、本発明に基づいてクローニングされ、ｐＩ値が６.０から９.０の間、好ましくは６.８から８.２の間であるアイソマーを含むＧｌｃＮＡｃ−α１,３−フコシルトランスフェラーゼの調製に関する。タンパク質におけるｐＩ値は、そのタンパク質の総電荷であるｐＨが０となるものであり、アミノ酸配列、グリコシル化パターンと同様にタンパク質の立体構造に依存する。ＧｌｃＮＡｃ−α１,３−フコシルトランスフェラーゼは、ｐＩ値がこの範囲で少なくとも７つのアイソマーを含む。トランスフェラーゼの種々のアイソマーに関する理由は、例えば異なるグリコシル化およびタンパク質限定加水分解がある。検査は、種々の植物であるマングビーンの種形成において、アイソマーは種々の関係を持つことを示している。タンパク質のｐＩ値は、当業者に周知である等電点電気泳動によって決定することができる。本酵素の主なアイソフォームは見かけ上５４ｋＤａの分子量を持つ。

特に、本発明の調製は、ｐＩ値が６.８、７.１および７.６を持つアイソフォームを含む。

また、本発明はフコース単位および既述のＤＮＡ分子によってコードされたＧｌｃＮＡｃ−α１,３−フコシルトランスフェラーゼを、炭水化物単位または糖タンパク質それぞれを含む試料中に混合することで、フコースのα１,３−位置をＧｌｃＮＡｃ−α１,３−フコシルトランスフェラーゼによって炭水化物単位または糖クンパク質それぞれに結合する、ヒトおよび他の脊椎動物糖タンパク質の「植物化（plantified）」炭水化物単位の製造方法に関する。ＧｌｃＮＡｃ−α１,３−フコシルトランスフェラーゼをクローニングすることに関して本発明に基づく方法により、精製した酵素を大量に産生することができる。完全な活性トランスフェラーゼを得るために、適した反応条件を提供する。トランスフェラーゼは、バツファーとして２−（Ｎ−モルホリノ）−エタン硫酸−ＨＣｌを使用する場合、おおよそｐＨ７で、特にトランスフエラーゼ活性が高いことが示された。二価陽イオン、特にＭｎ^２＋の存在下で、組換えトランスフェラーゼの活性が亢進される。炭水化物単位を、タンパク質に対して非結合型または結合型のいずれかである試料に混合する。その組換えトランスフェラーゼはいずれの型に対しても活性がある。本発明は以下の実施例および図式の方法によってより詳細に説明するが、勿論それに制限されない。

溶出した個々のフラクションについてのタンパク質の量および酵素活性を測定し、曲線で表したものである。 溶出した個々のフラクションについてのタンパク質の量および酵素活性を測定し、曲線で表したものである。 ＧｌｃＮＡｃ−α１,３−フコシルトランスフェラーゼの電気泳動ゲル分析を表したものである。 アイソフオーム個々の等電点電気泳動およびトランスフェラーゼ活性を測定した結果を表したものである。 トリプシンペプチド４つ(ｔ−４)のＮ末端配列と同様にプライマー３つ、Ｓ１、Ａ２およびＡ３のＤＮＡ配列を示したものである。 α１,３−フコシルトランスフェラーゼのｃＤＮＡ配列を示したものである。 α１,３−フコシルトランスフェラーゼのｃＤＮＡ配列を示したものである。 それから派生したα１,３−フコシルトランスフェラーゼのアミノ酸配列を示したものである。 それから派生したα１,３−フコシルトランスフェラーゼのアミノ酸配列を示したものである。 α１,３−フコシルトランスフェラーゼと同様にアミノ酸残基の疎水性の模式表示である。 種々のフコシルトランスフェラーゼの保存モチーフの比較を表したものである。 α１,３−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子でトランスフェクトした昆虫細胞のフコシルトランスフェラーゼ活性とネガティブコントロールのフコシルトランスフェラーゼ活性との比較を表したものである。 α１,３−フコシルトランスフェラーゼの異なる受容体の構造を示したものである。 α１,３−フコシルトランスフェラーゼの異なる受容体の構造を示したものである。 質量スペクトルを表したものである。 質量スペクトルを表したものである。 ＨＰＬＣの結果を表したものである。

コア−α１,３−フコシルトランスフェラーゼの単離
すべての工程は４℃で行った。リョクトウ実生をミキサーでホモジナイズ（マメ１ｋｇ当たり０.７５容量の抽出バッファーを用いる）した。次いで、ホモジネートを二層の綿布を通してろ過し、ろ液を３００００ｘｇで４０分間遠心した。上清を廃棄し、ペレットを一晩攪拌しながら、溶解バッファーで抽出した。次いで３００００ｘｇで４０分間遠心し、トリトン抽出物を得た。

トリトン抽出物を以下のように精製した：
工程１：あらかじめバッファーＡで平衡化しておいた Whatman のミクロ顆粒状ジエチルアミノエチルセルロースアニオン交換ＤＥ５２セルロースカラム（５ｘ２８ｃｍ）にトリトン抽出物をアプライした。非結合フラクションをさらに工程２で処理した。
工程２：この試料をバッファーＡで平衡化した Affi-Gel Blue カラム（２,５ｘ３２）カラムにアプライした。カラムをこのバッファーで洗浄した後、吸着したタンパク質を０.５Ｍ ＮａＣｌを含むバッファーＡで溶出した。
工程３：工程２の溶出液をバッファーＢに透析した後、これを、同バッファーで平衡化したＳ−セファロースカラムにアプライした。結合タンパク質をバッファーＢ中の０〜０.５Ｍ ＮａＣｌの直線状濃度勾配で溶出した。ＧｌｃＮＡｃ−α１,３−フコシルトランスフェラーゼを含むフラクションをプールし、バッファーＣに透析した。

工程４：透析した試料を、バッファーＣで平衡化したＧｎＧｎ−セファロースカラムにアプライした。結合タンパク質をＭｎＣｌ_２のかわりに１Ｍ ＮａＣｌを含むバッファーＣで溶出した。
工程５：次いで、酵素をバッファーＤに透析し、ＧＤＰ−ヘキサノールアミン−セファロースカラムにアプライした。カラムをバッファーＤで洗浄した後、ＭｇＣｌ_２およびＮａＣｌを０.５ｍＭ ＧＤＰで置換してこのトランスフェラーゼを溶出した。活性フラクションをプールし、２０ｍＭ トリス−ＨＣｌバッファー（ｐＨ７.３）に透析し、凍結乾燥した。

２−(Ｎ−モルホリノ)エタンスルホン酸−ＨＣｌバッファー、トリトン Ｘ−１００、ＭｎＣｌ_２、ＧｌｃＮＡｃおよびＡＭＰの存在下、それぞれ基質濃度０.５および０.２５のＧｎＧｎペプチドおよびＧＤＰ−Ｌ−[Ｕ−^１４Ｃ]−フコースを用いて、ＧｌｃＮＡｃ−α１,３−フコシルトランスフェラーゼの酵素活性を測定した（Staudacher et al., 1998, Gly-coconjugate J. 15, 355-360; Staudacher et al., 1991, Eur. J. Biochem. 199, 745-751 にしたがう）。

bicinchoninic acid 法（Pierce）を用いることによって、または酵素精製の最終工程においてアミノ酸分析を用いて（Altmenn 1992, Anal. Biochem. 204, 215-219）タンパク質濃度を測定した。

図１ａおよび１ｂでは、溶出液の各フラクションにおけるタンパク質の測定量および測定された酵素活性を曲線で示す。図１ａは上記Ｓ−セファロースカラムでの分離を示し、図１ｂはＧｎＧｎ−セファロースカラムでの分離を示す。円はタンパク質を表し、黒い完全な円はＧｌｃＮＡｃ−α１,３−フコシルトランスフェラーゼを表し、四角はＮ−アセチル−β−グルコサミニダーゼを表す。１Ｕは、１分間当たり１mmolのフコースをアクセプターに転移する酵素量と定義する。

表１はトランスフェラーゼ精製の各工程を示す。
表１

抽出バッファー：
０.５ｍＭ ジチオスレイトール
１ｍＭ ＥＤＴＡ
０.５％ ポリビニルポリピロリドン
０.２５Ｍ スクロース
５０ｍＭ トリス−ＨＣｌバッファー、ｐＨ７.３
溶解バッファー：
０.５ｍＭ ジチオスレイトール
１ｍＭ ＥＤＴＡ
１.５％ トリトン Ｘ−１００
５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７.３
バッファーＡ：
２５ｍＭ トリス−ＨＣｌバッファー、ｐＨ７.３、以下を含む：
０.１％ トリトン Ｘ−１００および
０.０２％ ＮａＮ_３
バッファーＢ：
２５ｍＭ クエン酸Ｎａバッファー、ｐＨ５.３、以下を含む：
０.１％ トリトン Ｘ−１００および
０.０２％ ＮａＮ_３
バッファーＣ：
２５ｍＭ トリス−ＨＣｌバッファー、ｐＨ７.３、以下を含む：
５ｍＭ ＭｎＣｌ_２ｎｄ
０.０２％ ＮａＮ_３
バッファーＤ：
２５ｍＭ トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７.３、以下を含む：
１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２
０.１Ｍ ＮａＣｌおよび
０.０２％ ＮａＮ_３

ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび等電点電気泳動
Biorad Mini-protean cell において、１２.５％アクリルアミドおよび１％ビスアクリルアミドを含むゲルでＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。このゲルを Coomassie Brilliant Blue R-250 または Silver で染色した。フコシルトランスフェラーゼの等電点電気泳動は、既成のｐＩ範囲６〜９を有するゲル（Servalyt precotes 6-9, Serva）で行った。製造元のプロトコルにしたがってこのゲルを銀で染色した。二次元電気泳動用に、レーンを泳動ゲルから切り出し、Ｓ−アルキル化剤およびＳＤＳで処理し、上記のようにＳＤＳ−ＰＡＧＥに付した。

図２はＧｌｃＮＡｃ−α１,３−フコシルトランスフェラーゼの電気泳動ゲルの例を示す。二次元電気泳動を左側に示し、一次元ＳＤＳ−ＰＡＧＥを右側に示す。Ａと記されたレーンは標準であり、Ｂと記されたレーンはＧｎＧｎ−セファロースカラム由来のＧｌｃＮＡｃ−α１,３−フコシルトランスフェラーゼであり、Ｃと記されたレーンは「精製」ＧｌｃＮＡｃ−α１,３−フコシルトランスフェラーゼ、すなわちＧＤＰ ヘキサノールアミン セファロース カラムのフラクションである。５４および５６ｋＤａの２つのバンドはトランスフェラーゼのイソ型を表す。

図３は等電点電気泳動の結果を示す。レーンＡは銀で染色し、レーンＢでは、トランスフェラーゼのイソ型の活性を試験した。この活性はＧＤＰ−フコースから基質に転移されたフコースの％で示す。

ペプチド配列決定
タンパク質の配列決定用に、Coomasie で染色したＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルからバンドを切り出し、カルボキシアミド−メチル化し、トリプシンで分解した（Goerg et al. 1988, Electrophoresis, 9, 681-692 にしたがう）。このトリプシンペプチドを、１.０ｘ２５０ｍｍ Ｖｙｄａｃ Ｃ１８での逆相ＨＰＬＣ（４０℃、流速０.０５ｍＬ／分、ＨＰ １１００装置（Hewlett-Packard）を用いる）で分離した。製造元のプロトコルにしたがい、単離されたペプチドを Hewlett-Packard G1005 A タンパク質配列決定系で分離した。さらに、このペプチド混合物を MALDI-TOF MS を用いる Ingel 消化によって分析した（以下を参照）。
図４は４トリプシンペプチド１〜４のＮ末端配列を示す（配列番号５〜８）。最初の３ペプチドから出発し、プライマーＳ１、Ａ２およびＡ３を調製した（配列番号９〜１１）。

３日生育させたリョクトウ胚軸から、Promega のＳＶ全ＲＮＡ単離系（the SV Total RNA Isolating System）を用いて完全ＲＮＡを単離した。第一鎖ｃＤＮＡを調製するため、完全ＲＮＡを４８℃で１時間、ＡＭＶ逆転写酵素およびオリゴ（ｄＴ）プライマーとインキュベートした。ここでは Promega の逆転写系（the Reverse Transcription System）を用いた。第一鎖ｃＤＮＡをＰＣＲに付し、ここではセンスおよびアンチセンスプライマーを組み合わせて用いた：
逆転写反応混合物１０μＬに以下のものを加えた：
各プライマー０.１mmol、０.１ｍＭ ｄＮＴＰｓ、２ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１０ｍＭ トリス−ＨＣｌバッファー、ｐＨ９.０、５０ｍＭ ＫＣｌおよび０.１％ トリトン Ｘ−１００を含む５０μＬ。
９５℃で２分間の最初の変性工程の後、９５℃で１分間、４９℃で１分間および７２℃で２分間を４０サイクル経過した。最後の伸展（extension）工程は７２℃で８分間行った。Invitrogen のＴＡクローニングキットを用いて、ＰＣＲ産物をｐＣＲ２.１ベクターにサブクローニングし、配列決定した。このＰＣＲの産物は、長さ７４４ｂｐおよび７８０ｂｐの２つのＤＮＡ断片であり、両ＤＮＡ断片は同一５’末端を有していた（また図７も参照）。これらの２つのＤＮＡ断片から出発し、ＲＡＣＥキット（Gibco-BRL）を用いるｃＤＮＡ末端の５’および３’高速増幅（ＲＡＣＥ）によってｃＤＮＡの喪失５’および３’領域を得た。アンチセンスプライマーとしてはキットのユニバーサル増幅プライマーを用い、センスプライマーとしては５’−ＣＴＧＧＡＡＣＴＧＴＣＣＣＴＧＴＧＧＴＴ−３’（配列番号１２）または５’−ＡＧＴＧＣＡＣＴＡＧＡＧＧＧＣＣＡＧＡＡ−３’（配列番号１３）のいずれかを用いた。センスプライマーとして、また、キットの短くされたアンカープライマーを用い、アンチセンスプライマーとして５’−ＴＴＣＧＡＧＣＡＣＣＡＣＡＡＴＴＧＧＡＡＡＴ−３’（配列番号１４）または５’−ＧＡＡＴＧＣＡＡＡＧＡＣＧＧＣＡＣＧＡＴＧＡＡＴ−３’（配列番号１５）を用いた。

このＰＣＲは、上記条件下、アニーリング温度５５℃で行った。５’および３’ＲＡＣＥ産物をｐＣＲ２.１ベクターにサブクローニングし、配列決定した：サブクローン化断片の配列はジデスオキシヌクレオチド法（ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Ready reaction Kit および ABI PRISM 310 Genetic analyser (Perkin Elmer)）を用いて決定した。ベクターｐＣＲ２.１にクローニングされた生成物の配列決定用にはＴ７およびＭ１３正方プライマーを用いた。コーディング領域の両鎖を the Vienna VBC Genomics-Sequencing Service（赤外線ラベルプライマー (IRD700 および IRD800) および LI-COR Long Read IR 4200 Sequencer (Lincoln, NE) を用いる）によって配列決定した。

図５ａおよび５ｂは、サイズが２１９８ｂｐで、１５３０ｂｐのオープンリーディングフレームを有する完全ｃＤＮＡを示す（配列番号１）。このオープンリーディングフレーム（出発コドン（塩基対２１１−２１３）、終止コドン（塩基対１７４０−１７４３））は、分子量５６.８ｋＤＡ、理論的ｐＩ値７.５１を有する５１０アミノ酸のタンパク質をコードする。

図６ａおよび６ｂは、ＧｌｃＮＡｃ−α１,３−フコシルトランスフェラーゼのｃＤＮＡ由来のアミノ酸配列を示す（配列番号２）。アスパラギン結合グリコシル化部位はＡｓｎ３４６およびＡｓｎ４２９である。

図７では、ＧｌｃＮＡｃ−α１,３−フコシルトランスフェラーゼ−ｃＤＮＡの模式図（上）および得られたコード化タンパク質の疎水指数（下）を示す。正の疎水指数は疎水性の増加を意味する。その間には、完全ｃＤＮＡとの関連において２つの上記ＰＣＲ産物のサイズを示す。コーディング領域は帯 (beam) によって示し、「Ｃ」は推定の細胞質内領域をコードし、Ｔは推定の膜貫通領域をコードし、そしてＧはトランスフェラーゼの推定のゴルジルーメン触媒領域をコードする。「TMpred」（EMBnet, Switzerland）によってこのＤＮＡ配列を分析したところ、Ａｓｎ３６とＧｌｙ５４間の推定の膜貫通領域がわかった。この酵素のＣ末端領域はおそらく触媒領域を含み、その結果、ゴルジ装置のルーメン内へ指向するはずである。このことから、このトランスフェラーゼは、これまでに分析された、糖タンパク質の生合成に関与するグリコシルトランスフェラーゼのすべて（Joziasse, 1992, Glycobiology 2, 271-277）と同様にＩＩ型膜貫通タンパク質であると思われる。グレー領域は４つのトリプシンペプチドを表し、六角形は潜在的Ｎ−グリコシル化部位を表す。ＮＣＢＩを介してアクセス可能なすべてのデータバンクにおけるＢＬＡＳＴＰサーチによりＧｌｃＮＡｃ−α１,３−フコシルトランスフェラーゼと他のα１,３／４−フコシルトランスフェラーゼ、例えばヒトフコシルトランスフェラーゼＶＩの類似性が示された。１８〜２１％（SIM-LALN-VIEW, Expase, Switzerland）において、トータルの類似性は任意の有意さを超えた。それにもかからわず、３５アミノ酸の配列領域（配列番号４）は他のα１,３／４−フコシルトランスフェラーゼと非常に高い相同性を示す（図８）。この配列領域は配列番号２のＧｌｕ２６７とＰｒｏ３０１間に位置する。

昆虫細胞における組換えＧｌｃＮＡｃ−α１,３−フコシルトランスフェラーゼの発現
細胞質内および膜貫通領域を含む、推定のＧｌｃＮＡｃ−α１,３−フコシルトランスフェラーゼのエンコーディング領域を、the Expand High Fidelity PCR System (Boehringer Mannheim) により、正方（forward）プライマー：５’−ＣＧＧＣＧＧＡＴＣＣＧＣＡＡＴＴＧＡＡＴＧＡＴＧ−３’（配列番号１６）および逆方（reverse）プライマー：５’−ＣＣＧＧＣＴＧＣＡＧＴＡＣＣＡＴＴＴＡＧＣＧＣＡＴ−３’（配列番号１７）を用いて増幅した。このＰＣＲ産物をＰａｔＩおよびＢａｍＨＩで二重消化し、あらかじめＰｓｔＩおよびＢａｍＨＩで消化されたアルカリホスファターゼ処理バキュロウイルストランスファーベクターｐＶＬ１３９３にサブクローニングした。相同組換えを確実にするために、トランスファーベクターを Baculo Gold viral DNA (PharMingen, Sand Diego, CA) とともに、リポフェクチンを含むＩＰＬ−４１培地のＳｆ９昆虫細胞に同時トランスフェクションした。２７℃で５日間インキュベートした後、組換えウイルスを含む種々の容量の上清をＳｆ２１昆虫細胞の感染に用いた。５％ ＦＣＳを含むＩＰＬ−４１培地中２７℃で４日間インキュベートした後、Ｓｆ１細胞を収穫し、リン酸緩衝化塩溶液で２回洗浄した。２％ トリトン Ｘ−１００を含む２５ｍＭ トリス ＨＣｌバッファー（ｐＨ７.４）にこの細胞を再懸濁し、氷上で超音波処理して破砕した。

ＧｌｃＮＡｃ−α１,３−フコシルトランスフェラーゼ活性に関するアッセイ
ホモジネートおよび細胞上清をＧｌｃＮＡｃ−α１,３−フコシルトランスフェラーゼに関してアッセイした。盲検試料は、タバコ−ＧｌｃＮＡｃ−トランスフェラーゼＩ（Strasser et al., 1999, Glycobiology, in the process of printing）をコードする組換えバキュロウイルスを用いて実行した。

図９は組換えＧｌｃＮＡｃ−α１,３−フコシルトランスフェラーゼおよび負のコントロールの酵素活性の測定値を示す。同時トランスフェクションされた細胞およびその上清の酵素活性は、最大で、負のコントロールの酵素活性より３０倍高かった。組換えトランスフェラーゼの不存在下で測定可能なこの内因性の活性は、実質的に昆虫−α１,６−フコシルトランスフェラーゼ由来であり、そのうち低いパーセンテージのみがＧｌｃＮＡｃ−α１,３−フコシルトランスフェラーゼ由来である。したがって、組換えバキュロウイルス由来のＧｌｃＮＡｃ−α１,３−フコシルトランスフェラーゼの増加は１００倍を大きく超える。活性を２−(Ｎ−モルホリノ)−エタンスルホン酸−ＨＣｌバッファー中で測定した場合、この酵素はｐＨ７.０付近で広い最大活性を示した。表２において明らかであるように、２価のカチオン、特にＭｎ^２＋を加えると組換えトランスフェラーゼの活性が高められる。

表２

表３は、標準的試験条件下では、用いられるアクセプターのうち、ＧｎＧｎ−ペプチドが最も高い包含率を示し、次いでＧｎＧｎＦ^６eptide およびＭ５Ｇｎ−Ａｓｎがそれにせまることを表す。３−結合マンノースの還元ＧｌｃＮＡｃ末端を含まないＭＭペプチドへの転移は見られなかった。この構造はコアのフコシルトランスフェラーゼに必要であると思われる。さらに、組換えトランスフェラーゼは、一般に用いられるアクセプター、血液型の決定に用いられるα,３／４−フコシルトランスフェラーゼ（これはフコースをオリゴ糖の非還元末端のＧｌｃＮＡｃに転移させる）と比較して不活性であった。アクセプター基質ＧｎＧｎ、ＧｎＧｎＦ^６ペプチド、Ｍ５Ｇｎ−Ａｓｎおよびドナー基質ＧＤＰフコースに関する見かけのＫ_ｍ−値はそれぞれ、０.１９、０.１３、０.２３および０.１１であると評価された。この分子の構造を図１０ａおよび１０ｂに示す。
表３

フコシルトランスフェラーゼ生成物の質量分析
ダブシル化ＧｎＧｎヘキサペプチド（２nmol）を、組換えＧｌｃＮＡｃ−α,３−フコシルトランスフェラーゼ（０.０８ｍＵ）を含む昆虫細胞のホモジネートと、非放射能性ＧＤＰ−Ｌ−フコース（１０nmol）、２ (Ｎ−モルホリノ)−エタンスルホン酸−ＨＣｌバッファー、トリトン Ｘ−１００、ＭｎＣｌ_２、ＧｌｃＮＡｃおよびＡＭＰの存在下でインキュベートした。負のコントロールは盲検試料に関する感染昆虫細胞のホモジネートを用いて行った。試料を３７℃で１６時間インキュベートし、ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ質量分析法によって分析した。質量分析はＤＹＮＡＭＯ (Therrmo BioAnalysis, Santa Fe NM)、動的抽出（dynamic extraction、後期抽出（late extraction）の同義語）を可能にするＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳで行った。２つのタイプの試料マトリックス調製物を用いた：ペプチドおよびダブシル化糖ペプチドを５％ギ酸に溶解し、部分試料を標的にアプライし、空気乾燥し、１％ α−シアノ−４−ヒドロキシ−桂皮酸を注いだ。ピリジルアミノ化グリカン、還元オリゴ糖および非誘導化糖ペプチドを水で希釈し、標的にアプライし、空気乾燥した。２％ ２.５−ジヒドロキシ安息香酸を加えた後、減圧して試料を直ちに乾燥した。

図１１はこれらの試料の質量スペクトルを示し、Ａは負のコントロールであり：メインのピーク（Ｓ）はダブシル−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−(ＧｌｃＮＡｃ_４Ｍａｎ_３)Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ 基質を示し、計算された [Ｍ＋Ｈ]^＋値は２２６２.３である。この基質はまた、ナトリウム添加産物として、ならびにダブシル基のＡｚｏ官能基の断片化によって形成されたより小さいイオンとして（Ｓ^★）で現れる。小さい生成物の量（Ｐ、[Ｍ＋Ｈ]^＋＝２４０８.４）は内因性α１,６−フコシルトランスフェラーゼの結果である。ｍ／ｚ＝２４２４.０のピークは基質の不完全な脱ガラクトシル化を示す。質量スペクトルＢは組換えα１,３−フコシルトランスフェラーゼを含む試料を示す。メインのピーク（Ｐ）はフコシル化産物を表し、（Ｐ^★）はその断片化イオンを表す。

さらに両試料の部分試料を互いに混合し、同様の濃度の基質および生成物を得た（試料Ａ）。この混合物を、１０ｍＵのＮ−グリコシダーゼＡ（試料Ｂ）を含む０.１Ｍ 酢酸アンモニウム、ｐＨ４.０または１００ｍＵ（１Ｕは１分当たり基質１mmolを加水分解する）のＮ−グリコシダーゼＦ（試料Ｃ）を含む５０ｍＭ トリス／ＨＣｌ、ｐＨ８.５で希釈した。２および２０時間後、これらの混合物の少量の部分試料を採り、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳによって分析した。

図１２では、試料Ａ、ＢおよびＣの３つの質量スペクトルを示す。未消化試料Ａは２つのメインピークを示す：基質は２２６１.４ｍ／ｚ、フコシル化産物は２４０７.７ｍ／ｚ。真ん中の曲線は試料Ｂの質量スペクトルを示す。これは両糖ペプチドを加水分解するＮ−グリコシダーゼＡで処理されたものである。９６３.３２のピークは脱グリコシル化産物を構成する。下の曲線は試料Ｃの質量スペクトルを示す。Ｎ−グリコシダーゼＦはα１,３−フコシル化基質を加水分解することができないので、スペクトルは、２４０６.７ｍ／ｚのフコシル化産物のピークを有し、一方、加水分解された基質のピークは９６３.０８ｍ／ｚに現れる。

ピリジルアミノ化フコシルトランスフェラーゼ生成物のＨＰＬＣ−分析
上記２つの試料（フコシル化産物および負のコントロール）をＮ−グリコシダーゼＡで消化した。得られたオリゴ糖をピリジル−アミノ化し、逆相ＨＰＬＣによって分析した（Wilson et al., 1998, glycobiology 8, 651-661; Kubelka et al.,1994, Arch. Biochem. Giophys. 308, 148-157; Hase et al., 1984, J. Biochem. 95, 197-203）。

図１３中、上の図Ｂは負のコントロールを表し、残留基質（ＧｎＧｎ−ペプチド）に加えてα１,６−フコシル化産物が見られる。Ａは実質的に保持時間がより短い時点でのピークを有し、これはＧｌｃＮＡｃ−α１,３と結合フコースの減少を示すものである。

下の図では、Ｎ−アセチル−βグルコサミニダーゼ（N-acetyl-βglucosaminidase）による消化前（曲線Ａ）および後（曲線Ｂ）の単離されたトランスフェラーゼ生成物をＭＭＦ^３ミツバチホスホリパーゼＡ_２（曲線Ｃ）と比較した。

Claims (14)

1. 塩基対２１１から塩基対１７４０までのオープンリーディングフレームを有する配列番号１に記載の配列を含む、またはこの上記配列と少なくとも５０％の同一性を有する、または厳格な条件下でこの上記配列とハイブリダイズする、またはこの上記ＤＮＡ配列とは遺伝コードが縮重している配列を含む、ことを特徴とするＤＮＡ分子であって、該配列がフコシルトランスフェラーゼ活性を有する植物タンパク質をコードするか、あるいはそれと相補的である該ＤＮＡ分子。
2. 配列番号３に記載の配列を含むか、あるいはこの配列と少なくとも８５％、特に少なくとも９５％の同一性を有する配列または厳格な条件下でこの配列とハイブリダイズする配列またはこのＤＮＡ配列とは遺伝コードが縮重している配列を含むことを特徴とするＤＮＡ分子。
3. 配列番号1のＤＮＡ分子とストリンジェント条件下(５０℃、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０.５Ｍ ＮａＰＯ４、ｐＨ７.０、１ｍＭ ＥＤＴＡ。４２℃、１％ＳＤＳで洗浄する。)でハイブリダイズすることができる、配列番号１に記載の配列と少なくとも８０％の同一性を有する、サイズが２０〜２００塩基対であることを特徴とするＤＮＡ分子。
4. 請求項１〜３のいずれかに記載のＤＮＡ分子、または請求項１〜３のいずれかに記載のＤＮＡ分子であって、そのプロモーターに対して逆向きに配向するものを含むことを特徴とする生物学的機能性ベクター。
5. リボザイムをコードするＤＮＡ分子であって、請求項１〜３のいずれかに記載のＤＮＡ分子と相補的な、これにより該リボザイムが天然ＧｌｃＮＡｃ−α１,３−フコシルトランスフェラーゼＤＮＡ分子によって転写されるｍＲＮＡと複合体形成し、該ｍＲＮＡを切断することを特徴とするＤＮＡ分子。
6. ＧｌｃＮＡｃ−α１,３−フコシルトランスフェラーゼの産生が抑制されているか、あるいは完全に停止されている組換え宿主細胞、特に植物もしくは昆虫細胞、または植物若しくは昆虫それぞれの調製方法であって、該宿主細胞、または植物若しくは昆虫それぞれに、それぞれ請求項４に記載のベクターまたは請求項５に記載のＤＮＡ分子、または欠失、挿入、および/または置換突然変異を含む請求項１〜３のいずれかに記載のＤＮＡ配列を含むベクターのうち少なくとも１つを挿入することを特徴とする方法。
7. 組換え宿主細胞、特に植物もしくは昆虫細胞、または植物若しくは昆虫それぞれの調製方法であって、欠失、挿入、および/または置換突然変異を含む、フコシルトランスフェラーゼをコードしないが、標的宿主細胞、または植物若しくは昆虫それぞれのゲノムの内因性フコシルトランスフェラーゼ配列とハイブリダイズする、塩基対２１１から塩基対１７４０までのオープンリーディングフレームを有する配列番号１に記載の配列を含む、またはこの上記配列と少なくとも８０％の同一性を有する、または厳格な条件下でこの上記配列とハイブリダイズする、またはこの上記ＤＮＡ配列とは遺伝コードが縮重している配列を含むＤＮＡ分子を、該宿主細胞、または植物若しくは昆虫それぞれのゲノムの突然変異していない相同配列の位置に挿入することを特徴とする方法。
8. 請求項６または７に記載の方法によって調製され、そのＧｌｃＮＡｃ−α１,３−フコシルトランスフェラーゼ産生が抑制されているか、あるいは完全に停止されていることを特徴とする組換え植物もしくは植物細胞または昆虫もしくは昆虫細胞。
9. 請求項１〜３のいずれかに記載のＤＮＡ分子の配列と相補的な塩基配列、または請求項１〜３のいずれかに記載のＤＮＡ分子の配列に対応する塩基配列を含むことを特徴とするＰＮＡ(ペプチド核酸)分子。
10. ＧｌｃＮＡｃ−α１,３−フコシルトランスフェラーゼの発現が転写または翻訳レベルでブロックされている植物若しくは昆虫、または細胞、特に植物もしくは昆虫細胞それぞれの作成方法であって、請求項８または９に記載のＰＮＡ分子を細胞に挿入することを特徴とする方法。
11. 組換え糖タンパク質の調製方法であって、請求項７に記載の系、または請求項９に記載の方法によって調製される植物若しくは昆虫または細胞それぞれを、その糖タンパク質を発現する遺伝子でトランスフェクトし、組換え糖タンパク質を発現させることを特徴とする方法。
12. 試料中のＧｌｃＮＡｃ−α１,３−フコシルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ分子の選択方法であって、ＧｌｃＮＡｃ−α１,３−フコシルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ分子と結合する、請求項１〜３のいずれかに記載のＤＮＡ分子を該試料に加えることを特徴とする方法。
13. 植物または植物細胞中で組み換え糖タンパク質を製造することを含む組み換え糖タンパク質の製造方法であって、内因性GlcNAc-α1,3-フコシルトランスフェラーゼ活性が、天然植物または植物細胞のGlcNAc-α1,3-フコシルトランスフェラーゼ活性の50％以下に抑制されており、GlcNAc-α1,3-フコシルトランスフェラーゼをコードするDNA分子が、塩基対２１１から塩基対１７４０までのオープンリーディングフレームを有する配列番号１に記載のDNA配列を含む、またはこの上記配列と少なくとも５０％の同一性を有する、または厳格な条件下でこの上記配列とハイブリダイズする、またはこの上記ＤＮＡ配列とは遺伝コードが縮重している配列を含む、製造方法。
14. 内因性α1,3-フコシルトランスフェラーゼ産生が抑制もしくは完全に停止されている植物もしくは植物細胞中で組み換え糖タンパク質を発現させることを含む組み換え糖タンパク質の製造方法であって、配列番号1に記載の配列と配列を比較して内因性α1,3-フコシルトランスフェラーゼを同定し、内因性α1,3-フコシルトランスフェラーゼ産生が抑制されることを含む方法。

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