SK11182001A3 - Gén na fukozyltransferázu - Google Patents

Gén na fukozyltransferázu Download PDF

Info

Publication number
SK11182001A3
SK11182001A3 SK1118-2001A SK11182001A SK11182001A3 SK 11182001 A3 SK11182001 A3 SK 11182001A3 SK 11182001 A SK11182001 A SK 11182001A SK 11182001 A3 SK11182001 A3 SK 11182001A3
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
sequence
fucosyltransferase
glcnac
dna molecule
dna
Prior art date
Application number
SK1118-2001A
Other languages
English (en)
Other versions
SK286416B6 (sk
Inventor
Friedrich Altmann
Original Assignee
Friedrich Altmann
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=3486087&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=SK11182001(A3) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Friedrich Altmann filed Critical Friedrich Altmann
Publication of SK11182001A3 publication Critical patent/SK11182001A3/sk
Publication of SK286416B6 publication Critical patent/SK286416B6/sk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12N9/1051—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/18—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a glycosyl transferase, e.g. alpha-, beta- or gamma-cyclodextrins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/005—Glycopeptides, glycoproteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8218—Antisense, co-suppression, viral induced gene silencing [VIGS], post-transcriptional induced gene silencing [PTGS]

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Description

Oblasť techniky
Vynález sa týka polynukleotidov, ktoré kódujú fukozyltransferázu. Ďalej sa vynález týka čiastkových sekvencii týchto polynukleotidov, ako aj vektorov s týmito polynukleotidmi, rekombinovaných hostiteľských buniek, rastlín a hmyzu transfekovaného polynukleotidmi, alebo z nich odvodenou DNA, ako aj glykoproteínov produkovaných v týchto systémoch.
Doterajší stav techniky
Glykoproteíny sa vyznačujú mnohorakosťou a komplexnosťou sacharidových jednotiek, pričom zloženie a usporiadanie sacharidov je charakteristické pre rôzne organizmy. Oligosacharidové jednotky glykoproteínov majú celý rad úloh, sú napr. dôležité pri regulácii látkovej výmeny, podieľajú sa na sprostredkovaní medzibunkových interakcií, určujú cirkulačnú dobu proteínov v krvnom obehu a sú určujúce pri rozoznávaní epitopov v reakciách protilátok s antigénmi.
Glykozylácia glykoproteínov sa začína v endoplazmatickom retikule (ER), kde sa oligosacharidy pripájajú prostredníctvom N-glykozidickej väzby na bočné reťazce asparagínu, alebo prostredníctvom O-glykozidickej väzby na bočné reťazce serínu alebo treonínu. Oligosacharidy s N-glykozidickou väzbou obsahujú spoločné jadro z pentasacharidovej jednotky, ktorá sa skladá z troch manéžových a dvoch N-acetylglukozamínových zvyškov. Na ďalšiu modifikáciu sacharidových jednotiek sa proteiny transportujú z ER do Golgiho komplexu. Štruktúra glykoproteínov, ktoré majú oligosacharidy viazané N-glykozidickou väzbou, je daná ich konformáciou a zložením glykozyltransferáz v tých kompartmentoch Golgiho aparátu, v ktorých dochádza k ich spracovaniu.
31765/H h • ·· · ·· ·· · ·· · · ·· · · · · ·· ··· ··· ··· • ··· · ······ · • · ······ ··· ·· ··· ·· ·· ···
Ukázalo sa, že v Golgiho komplexe niektorých buniek rastlín a hmyzu sa pentasacharidové jadro substituuje xylózou a fukózou viazanou a1,3 väzbou (P. Lerouge etal. 1998 Plánt Mol. Biol. 38, 31-48; Rayon etal. 1998 L. Exp. Bot. 49, 1463-1472). Vytvorený heptasacharid „MMXF3“ je hlavným typom oligosacharidu v rastlinách (Kurosaka etal. 1991 J. Biol. Chem., 266, 41684172). Takéto cd,3-fukózové zvyšky viazané na sacharidové jadro obsahuje napr. v chrenová peroxidáza, karotén β-fruktozidáza, lecitín Erythrina cristagalli, ako aj fosfolipáza A2 jedu včelieho jedu alebo neuronálne membránové glykoproteíny embryí hmyzu. Tieto štruktúry sa nazývajú aj komplexné Nglykány, poprípade manózo-deficientné alebo skrátené N-glykány. Ďalej sa môžu α-manozylové zvyšky nahrádzať za GlcNAc, na ktorých je naviazaná galaktóza a fukóza, takže vzniká štruktúra zodpovedajúca ľudskému Lewis a epitopu (Melo etal. 1997 FEBS Lett. 415, 186-191; Fitchette-Laine etal. 1997 Plánt J. 12, 1411-1417).
Ani xylóza, ani fukóza s od,3 väzbou sa nenachádzajú v glykoproteínoch cicavcov. Ukázalo sa, že jadro scd,3-fukózou hrá dôležitú úlohu pri rozpoznávaní epitopu protilátkami proti rastlinným alebo hmyzím oligosacharidom s N-väzbou (I. B. H. Wilson etal., Glycobiology Vol. 8, č. 7, 651-661, 1998) a tým spúšťa imunitnú odpoveď v ľudskom alebo zvieracom tele proti týmto oligosacharidom. Zdá sa, že a1,3-fukózový zvyšok je tiež jednou z hlavných príčin rozšírenej krížovej alergickej reakcie medzi rozličnými alergénmi rastlinného a hmyzieho pôvodu (Tretter et al., Int. Árch. Allergy Immunol. 1993:102:259-266) a nazýva sa aj „krížovo reagujúci determinant“ (CCD). Pri štúdiu epitopov paradajok a peľov tráv sa tiež zistili fukózové zvyšky s od,3 väzbou ako spoločné determinanty, ktoré spôsobujú často sa vyskytujúcu spoločnú alergiu na paradajky a peľ tráv (Petersen etal. 1996, J. Allergy Clin. Immunol., Vol 98, 4; 805-814). Výskyt CCD zahmlieva diagnózu alergií prostredníctvom často sa vyskytujúcich krížových reakcií.
Imunologické reakcie, ktoré v ľudskom tele vyvolávajú rastlinné proteíny, sú hlavným problémom pri medicínskom použití rekombinantných ľudských
31765/H h • ·· · ·· ·· · ·· · · ·· · · · · ·· ··· ··· ··· • ··· · ······ · • · ······ ··· ·· ··· ·· ·· ··· proteínov produkovaných v rastlinách. Na vyriešenie tohto problému by bolo potrebné zabrániť a1,3-fukozylácii jadra. V jednej štúdii sa podarilo ukázať, že oligosacharidy obsahujúce namiesto L-fukózy (6-deoxy-L-galaktóza) Lgalaktózu, si zachovávajú úplnú biologickú aktivitu (E. Zablackis etal. 1996, Science, Vol 272). Podľa inej štúdie bol izolovaný mutant rastliny Arabidopsis thaliana, ktorému chýba N-acetyl-glukozaminyl-transferáza, ktorá je prvým enzýmom v biosyntéze komplexných glykánov. V týchto mutantoch je zablokovaná biosyntéza komplexných glykoproteínov. Napriek tomu sú tieto mutované rastliny za určitých podmienok schopné normálneho vývoja (A. Schaewen et al. 1993, Plánt Physiol. 102; 1109-1118).
Ak sa má cielene zamedziť viazaniu a1,3-fukózy na jadro (Core) oligosacharidu bez toho, aby sa zasiahlo do iných glykozylačných krokov, musel by sa zablokovať len enzým, ktorý je priamo zodpovedný za túto špecifickú glykozyláciu, t.j. Core-a1,3-fukozyltransferáza. Po prvýkrát bola izolovaná z bôbov Mungo a následne charakterizovaná, pričom sa zistilo, že aktivita tohto enzýmu závisí od prítomnosti neredukovaných zakončení GlcNAc (Staudacher etal., 1995, Glycoconjugate J. 12, 780-786). Táto transferáza, ktorá sa nachádza len v bunkách rastlín a hmyzu, ale nie v bunkách ľudí alebo iných stavovcov, by sa musela cielene inaktivovať alebo potlačiť, aby bolo možné vyrábať ľudské proteíny v rastlinách, rastlinných bunkách alebo v hmyze alebo hmyzích bunkách bez toho, aby obsahovali imunogénny epitop.
Publikácia, ktorú napísal John M. Búrke „Dláždenie cesty pre ribozýmy (Clearing the way for ribozymes)“ (Náture Biotechnology 15:414-415; 1997) sa týka všeobecného spôsobu činnosti ribozýmov.
Publikácia od autorov Pooga et al. „PNA konštrukty prenikajúce do buniek regulujú hladinu galanínového receptora a modifikujú prenos bolesti in vivo (Celí penetrating PNA constructs regulate galanin receptor levels and modify pain transmission in vivo) (Náture Biotechnology 16:857-861; 1998) sa týka molekúl PNA vo všeobecnosti, špecificky sa zaoberá molekulou PNA komplementárnou k mRNA pre ľudský galanínový receptor typu 1.
31765/H h
• ·· • · · • ·· ·· · · ·· • ·
• •
• 999 9 • 9 9 9 • •
• · • · · • •
·· ·· ··· ·· ·· • ·
US 5 272 066 A sa týka postupu na zmenu eukaryotických a prokaryotických proteínov s cieľom predĺžiť ich cirkuláciu in vivo. Dochádza pri tom k zmene viazaných oligosacharidov pomocou rozličných enzýmov, vrátane GlcNAc-a1 >3(4)-fukozyltransferázy.
EP 0 643 132 sa týka klonovania a1,3-fukozyltransferázy izolovanej z ľudských buniek (THP-1). Sacharidové reťazce popísané v publikácii zodpovedajú ľudským oligosacharidom Sialyl Lewis x- a Sialyl Lewis a-. Špecifickosť enzýmu z ľudských buniek je iná, než fukozyltransferáza z rastlinných buniek.
Podstata vynálezu
Cieľom predkladaného vynálezu je klonovať a sekvenovať gén kódujúci rastlinnú fukozyltransferázu, pripraviť vektory obsahujúce tento gén, úseky DNA z tohto génu alebo zmenené alebo z neho odvodené úseky DNA, transfekovať týmito vektormi rastliny alebo hmyz ako aj ich bunky, produkovať glykoproteíny bez normálne sa vyskytujúceho jadra s a1,3-fukózou a poskytnúť tomu zodpovedajúce postupy.
Vyriešením úlohy podľa tohto vynálezu bude molekula DNA, ktorá obsahuje sekvenciu podľa SEQ ID No: 1 (v tejto publikácii sa používa kód IUPAC, v ktorom „N“ označuje inozín) s otvoreným čítacím rámcom od bázového páru 211 po bázový pár 1740, alebo vykazuje aspoň 50 % homológiu k horeuvedenej sekvencii, alebo hybridizuje s horeuvedenou sekvenciou za stringentných podmienok, alebo obsahuje sekvenciu, ktorá je degenerovaná vo vzťahu k horeuvedenej DNA v dôsledku genetického kódu, pričom táto sekvencia kóduje rastlinný proteín s fukozyltransferázovou aktivitou alebo je k nej komplementárna.
Takáto sekvencia, ktorá nebola doteraz popísaná, sa vynikajúco hodí na ľubovoľné experimenty, analýzy a produkčné procesy súvisiace s rastlinnou fukozyltransferázovou aktivitou. Zaujímavá je sekvencia DNA, ako aj proteín
31765/Hh
• ·· • · · • ·· · ·· • ·· • · ··
• ··· · • i • · • ·
• · • e • • ·
·· ·· ··· ·· ·· ··
kódovaný takouto sekvenciou, najmä však sekvencia DNA zabraňujúca fukozyltransferázovej aktivite.
Otvorený čítací rámec sekvencie č. SEQ ID No: 1 kóduje proteín zložený z 510 aminokyselinových zvyškov s teoretickou molekulovou hmotnosťou 56,8 kDa, pričom sa predpokladá existencia transmembránového segmentu medzi Asn36 a Gly54. Vypočítaná hodnota pi proteínu kódovaného sekvenciou podľa SEQIDNo: 1 je 7,51.
Aktivita rastlinnej fukozyltransferázy sa dá dokázať a merať prostredníctvom postupu, pri ktorom sa fukozyltransferáza pridá k zmesi označenej fukózy a akceptora (napr. glykoproteínu) viazaného na nosič, napr. Sepharose. Po určitej reakčnej dobe sa vzorka prepláchne a meria sa obsah naviazanej fukózy. Fukozyltransferázová aktivita sa považuje za pozitívnu, keď je nameraná hodnota aktivity minimálne o 10-20 %, v ideálnom prípade však aspoň o 30-50 % väčšia než aktivita nameraná v negatívnej kontrolnej vzorke. Štruktúru glykoproteínu je možné naviac overiť prostredníctvom HPLC. Takéto postupy zodpovedajú súčasnému stavu technológií (Staudacher etal. 1998, Anál. Biochem. 246, 96-101; Staudacher etal. 1991, Eur. J. Biochem. 199, 745-751).
Je možné napríklad pridať fukozyltransferázu k vzorke zloženej z rádioaktívne označenej fukózy a akceptora, ktorým je napr. GlcNAcpi2Mana1-3(GlcNAcpi-2Mana1-6)Manpi-4GlcNAcp1-4GlcNAcpi-Asn. Po určitej reakčnej dobe sa vzorka prečistí chromatografiou na anexe a odmeria sa obsah viazanej fukózy. Aktivita sa dá vypočítať z rozdielu množstva rádioaktivity nameranej vo vzorke s akceptorom a množstva rádioaktivity nameranej v negatívnej kontrolnej vzorke bez akceptora. Fukozyltransferázová aktivita sa považuje za pozitívnu, ak je nameraná rádioaktivita aspoň o 3040 % vyššia, než rádioaktivita nameraná v negatívnej kontrolnej vzorke.
Vytváranie párov z dvoch molekúl DNA sa dá ovplyvňovať výberom teploty a iónovej sily vzorky. Za stringentné podmienky sa považujú v zmysle
31765/H h ··· ··· ·· • ··· · ······ • · · · · · · ··· ·· ··· ·· ·· tohto vynálezu také podmienky, ktoré umožňujú vznik exaktnej, stringentnej väzby. Molekuly DNA sa hybridizujú napr. v prítomnosti 7 % dodecylsíranu sodného (SDS), 0,5 M NaPO4 pH 7,0; 1 mM EDTA pri 50 °C a premývajú sa v roztoku 1 % SDS pri 42 °C.
Či majú sekvencie aspoň 50 % homológiu so sekvenciou č. SEQ ID No: 1 sa dá zistiť prostredníctvom programu FastDB z Európskeho laboratória pre molekulárnu biológiu (EMBL) alebo databázy SWISSPROT.
V ideálnom prípade kóduje sekvencia molekuly DNA v zmysle tohto vynálezu proteín s GlcNAc-a1,3-fukozyltransferázovou aktivitou, najmä však s Core-a1,3-fukozyltransferázovou aktivitou. Ako už bolo uvedené vyššie, vyskytuje sa Core-cc1,3-fukozyltransferázová aktivita v bunkách rastlín a hmyzu, nie však v ľudskom organizme, takže je práve táto sekvencia DNA vhodná na použitie v špecifických analýzach týkajúcich sa fukozyltransferázy, ako aj v produkčných postupoch. Pod Core-a1,3-fukozyltransferázou sa rozumie najmä GlcNAc-a1,3-fukozyltransferáza viazaná na GDP-L-Fuc:Asn. V rámci predkladaného vynálezu sa pod a1,3-fukozyltransferázou rozumie spravidla Core-a1,3-fukozyltransferáza. Na horeuvedené meranie aktivity slúžia najmä akceptory s neredukujúcim GlcNAc koncom. Takýmito akceptormi sú napríklad GlcNAcp 1 -2Mana1 -3(GlcNAcp 1 -2Mana1 -6)Manp 1 -4GlcNAcp 1 -4GlcNAcp 1 Asn, GlcNAcp 1 -2Mana1 -3(GlcNAcp 1 -2Mana1 -6)Manp 1 -4GlcNAcp 1 -4(Fuca1 6(ΘΙοΝΑοβ1-Α5η a GlcNAcpi-2Mana1-3[Mana1-3(Mana1-6)Man a1-6]Manpi4GlcNAcpi-4GlcNAcpi-Asn. Či je fukóza naviazaná, to sa dá zistiť meraním necitlivosti na N-glykozidázu F a dokázať pomocou hmostnostnej spektrometrie.
Uprednostňuje sa, aby mala molekula DNA v zmysle vynálezu aspoň 7080 % homológiu, v ideálnom prípade však aspoň 95 % homológiu k sekvencií podľa č. SEQ ID No: 1. Táto sekvencia kóduje obzvlášť aktívnu GlcNAc-a1,3fukozyltransferázu. Keďže sa sekvencia DNA môže viac či menej líšiť podľa druhu rastliny alebo hmyzu, vykazuje sekvencia, ktorá má napr. 70 %
31765/H h ··· · · · · · · • ··· · ······ · • · ······ ··· ·· ··· ·· ·· ··· homológiu so sekvenciou podľa SEQIDNo:1, tiež fukozyltransferázovú aktivitu, ktorá postačuje na jej využitie pri analýzach, experimentoch alebo vo výrobe.
V ďalšej vhodnej podobe obsahuje táto molekula DNA 2 150 až 2 250, v ideálnom prípade 2 198 bázových párov. V molekule DNA je 100 až 300, v ideálnom prípade 210 bázových párov protismerne (upstream) pred štartovacím kodónom, a tiež 350 až 400, v ideálnom prípade 458 bázových párov v súhlasnom smere (downstream) za stop-kodónom otvoreného čítacieho rámca, pričom v ideálnom prípade sa na konci molekuly DNA nachádza 3'-Poly(A) sekvencia. Tým sa zabezpečí bezproblémová regulácia na úrovni translácie a k dispozícii bude molekula DNA, ktorá obzvlášť efektívne a bezproblémovo kóduje aktívnu GlcNAc-a1,3-fukozyltransferázu.
Predkladaný vynález sa ďalej týka molekuly DNA obsahujúcej sekvenciu podľa SEQ ID No: 3 alebo sekvenciu, ktorá vykazuje aspoň 85 %, v ideálnom prípade aspoň 95 %, najmä aspoň 99 % homológiu k horeuvedenej sekvencii, alebo ktorá hybridizuje s horeuvedenou sekvenciou za stringentných podmienok, alebo obsahuje sekvenciu, ktorá je degenerovaná vo vzťahu k horeuvedenej DNA v dôsledku genetického kódu. Uprednostňuje sa pri tom stanovenie homológie pomocou programu, ktorý rozoznáva inzercie a delécie a neberie ich do úvahy pri výpočte homológie. Táto nukleotidová sekvencia kóduje konzervovaný peptidový motív, t.j. väčšina aktívnych a funkčných GlcNAc-a1,3-fukozyltransferáz obsahuje aminokyselinový reťazec kódovaný touto sekvenciou. Sekvencia môže mať tú istú veľkosť, ako sekvencia podľa SEQ ID No: 3, alebo môže samozrejme byť aj väčšia. Táto sekvencia je kratšia, než sekvencia kódujúca celý proteín, a je preto menej citlivá na rekombinácie, delécie alebo iné mutácie. Z dôvodu konzervovaného motívu a zvýšenej stability je táto sekvencia zvlášť vhodná na testy rozoznávania sekvencie.
31765/Hh
SEQ ID No: 3 má nasledujúcu sekvenciu: 5'-GAAGCCCTGAAGCACTACAAATTTAGCTTAGCGTTTGAAAATTCGAATGAGGAAGATTATGTAA CTGAAAAATTCTTCCAATCCCTTGTTGCTGGAACTGTCCCT-3'
Podľa ďalšieho hľadiska sa predkladaný vynález týka molekuly DNA, ktorá obsahuje čiastkovú sekvenciu horeuvedených molekúl DNA a má veľkosť od 20 do 200, v ideálnom prípade však 30-50 bázových párov. Táto molekula DNA sa dá použiť napríklad ako sonda na viazanie komplementárnych sekvencii GlcNAc-a1,3-fukozyltransferáz, čo umožní ich selekciu zo vzorky. Týmto spôsobom je možné selektovať, izolovať a charakterizovať ďalšie GlcNAc-a1,3-fukozyltransferázy z rôznych druhov rastlín a hmyzu. Dajú sa pri tom použiť rozličné, respektíve viaceré čiastkové sekvencie, najmä však časť konzervovaného motívu popísaného vyššie.
Veľkou výhodou je pri tom kovalentné naviazanie horeuvedenej molekuly DNA na markerovú zlúčeninu, ktorá sa dá stanoviť. Ako markerová zlúčenina prichádza do úvahy ľubovolný použiteľný marker, ako napríklad fluorescenčný, luminiscenčný alebo rádioaktívny marker, neizotopový marker ako biotín a pod. Dostaneme tak k dispozícii užitočné metódy na dôkaz, výber a kvantitatívne stanovenie zodpovedajúcich molekúl DNA vo vzorkách pevných pletív rastlín alebo na hybridizáciu v tekutých vzorkách.
Ďalší aspekt vynálezu sa týka biologicky funkčného vektora, ktorý obsahuje jednu z horeuvedených molekúl DNA, alebo ich časti rozličnej dĺžky, najmenej však 20 bázových párov. Na transfekciu hostiteľských buniek je potrebný samostatný vektor, ktorý je schopný rozmnoženia, pričom je možné použiť vhodný vektor v závislosti od typu hostiteľskej bunky, mechanizmu transfekcie, úlohy alebo veľkosti molekuly DNA. Keďže je známy veľký počet rozličných vektorov, ich výpočet by presiahol rozsah prihlášky a preto sme od neho upustili. Ďalším dôvodom je aj to, že odborníkom sú tieto vektory dobre známe (vektory a všetky ostatné použité metódy a pojmy sú popísané v publikácii autorov Sambrook a Maniatis). V ideálnom prípade má vektor nízku molekulovú hmotnosť a mal by niesť selekčné markery, ktoré vedú v bunke
31765/H h
• ·· • ·· ··
• · · ·· · · • · ··
• · · • · · • ·
• ··· · • · · • · ·
• · • · · • ·
·· e· ··· ·· ·· ··
k ľahko identifikovateľnému fenotypu, ktorý umožní jednoduchú selekciu hostiteľských buniek s vektorom a bez vektora. Aby bolo možné získať vysoké výťažky DNA a zodpovedajúcich génových produktov, mal by vektor niesť silný promótor, ako aj enhancér, signály na génovú amplifikáciu a regulačné sekvencie. Na autonómnu replikáciu vektora je dôležitý počiatok replikácie. Za správne procesovanie transkriptov mRNA zodpovedajú polyadenylačné signály a signály pre splicing. Ak sa ako vektory používajú fágy, vírusy alebo vírusové častice, potom zbaľovanie vektorovej DNA riadia zbaľovacie signály.
Ak vnesieme vektor podľa popisu tohoto vynálezu do rastliny alebo rastlinnej bunky, dosiahne sa posttranskripčné potlačenie génovej expresie endogénneho génu pre a1,3-fukozyltransferázu prostredníctvom transkripcie k nemu homologického transgénu alebo jeho časti v smere reťazca. Bližší popis tejto metódy je v publikáciách Baulcombe 1996, Plánt. Mol. Biol. 9:373382 a Brigneti etal. 1998, EMBO J. 17:6739-6746. Táto stratégia „umlčania“ génu predstavuje účinnú možnosť na potlačenie expresie génu pre a1,3fukozyltransferázu, pozri aj Waterhouse etal. 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:13959-13964.
Vynález sa ďalej týka biologicky funkčného vektora, ktorý obsahuje molekulu DNA v horeuvedenom uskutočnení, alebo jej časti rozličnej dĺžky, v obrátenej orientácii vzhľadom k promótoru. Ak sa tento vektor transfekuje do hostiteľskej bunky, dochádza k čítaniu anti-sense mRNA, ktorá je komplementárna k mRNA GlcNAc-a1,3-fukozyltransferázy a vytvára s ňou komplex. Táto väzba buď blokuje správne procesovanie, transport a stabilitu, alebo tým, že zamedzuje väzbe ribozómov blokuje transláciu a následne normálnu génovú expresiu GlcNAc-a1,3-fukozyltransferázy.
Aj keď by bolo možné zabudovať do vektora celú sekvenciu molekuly
DNA, môžu byť za určitým cieľom výhodné aj časti tejto sekvencie, z dôvodu ich menšej veľkosti. Pri anti-sense metóde je napríklad dôležité, aby bola molekula DNA dostatočne veľká, aby vznikala aj dostatočne veľká anti-sense mRNA, ktorá sa viaže na mRNA transferázy. Vhodná anti-sense mRNA
I
31765/Hh
• ·· • ·· ·· ·
• · · ·· · · • · ··
• · · • · · • ·
• ··· · • · · • · ·
• · • · · • ·
·· ·· ··· ·· ·· ··
obsahuje napríklad 50 až 200 nukleotidov, keďže mnohé zo známych prirodzene sa vyskytujúcich anti-sense mRNA molekúl majú približne 100 nukleotidov.
Na zvlášť efektívnu inhibíciu expresie aktívnej a1,3-fukozyltransferázy je vhodná kombinácia obidvoch popísaných metód (Waterhouse etal. 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:13959-13964).
Je výhodné použiť rýchlo hybridizujúce molekuly RNA. Účinnosť antisense RNA molekúl, ktoré majú viac než 50 nukleotidov, závisí od väzbovej kinetiky in vitro. Napríklad rýchlo hybridizujúce anti-sense RNA molekuly vykazujú silnejšiu inhibíciu expresie proteínov, než pomaly hybridizujúce molekuly RNA (Wagner etal. 1994, Annu. Rev. Microbiol., 48:713-742' Rittner etal. 1993, Nucl. Acids Res., 21:1381-1387). Takéto rýchlo hybridizujúce molekuly anti-sense RNA majú predovšetkým vysoký počet externých báz (voľné konce a väzobné sekvencie), vysoký počet štruktúrnych subdomén (zložiek) ako aj malý počet slučiek (Patzel etal. 1998; Náture Biotechnology, 16; 64-68). Hypotetické sekundárne štruktúry molekúl anti-sense RNA sa dajú predpovedať napríklad prostredníctvom počítačových programov, ktorý umožní vyhľadanie vhodnej sekvencie anti-sense RNA.
Do vektora sa dajú zabudovať rozličné sekvenčné oblasti molekuly DNA. Existuje tu možnosť zabudovať do vektora len tú časť, ktorá je zodpovedná za väzbu ribozómov. Blokovanie v tejto oblasti mRNA postačuje na zastavenie celej translácie. Vysoká účinnosť anti-sense molekúl sa dosahuje aj pri použití 5'- alebo 3'- netranslatovaných oblastí génu.
Molekula DNA v zmysle vynálezu je tvorená sekvenciou, ktorá zahrnuje mutáciu typu delécie, inzercie a/alebo substitúcie. Počet mutovaných nukleotidov je pritom variabilný a siaha od jediného, až po viaceré deletované, inzertované alebo substituované nukleotidy. V dôsledku mutácie môže dôjsť aj k posunu čítacieho rámca. Pri takomto géne je dôležité len to, aby inhiboval expresiu génu pre GlcNAc-a1,3-fukozyltransferázu a tvorbu aktívneho,
31765/H h
• ·· • · · • ·· ·· · · • · • · • ·
• · · • · · • •
• ··· · • · · • · •
• · • · · • •
·· ·· ··· ·· ·· • e
funkčného enzýmu. Umiestnenie mutácie môže byť variabilné, len musí dochádzať k inhibícii expresie enzymaticky aktívneho proteínu. Uprednostňuje sa mutácia v katalytickej oblasti enzýmu, ktorá sa nachádza v C-terminálnej oblasti. Metódy zavádzania mutácií do sekvencií DNA sú odborníkovi dostatočne známe, takže tu upúšťame od bližšieho popisu rozličných možností mutagenézy. Je pri tom možné použiť náhodnú mutagenézu, najmä však cielenú mutagenézu, napr. mutagenézu zameranú na konkrétne miesto (sitedirected), mutagenézu riadenú oligonukleotidmi, alebo mutagenézu za pomoci reštrikčných enzýmov.
Predmetom vynálezu je ďalej molekula DNA, ktorá kóduje ribozým obsahujúci dva sekvenčné úseky s dĺžkou minimálne 10 až 15 bázových párov, ktoré sú komplementárne k vyššie popísaným sekvenčným úsekom molekuly DNA v zmysle vynálezu a ktorý vytvára komplex a štiepi mRNA transkribovanej z prirodzenej molekuly DNA kódujúcej GlcNAc-a1,3-fukozyltransferázu. Ribozým rozoznáva mRNA pre GlcNAc-a1,3-fukozyltransferázu prostredníctvom komplementárneho párovania báz s touto mRNA. Následne dochádza k vyštiepeniu a degradácii RNA sekvenčne špecifickým spôsobom ešte pred transláciou enzýmu. Po disociácii od degradovaného substrátu ribozým opätovne hybridizuje s molekulou mRNA a funguje ako špecifická endonukleáza. Vo všeobecnosti je možné pripraviť ribozýmy určené na inaktiváciu špecifickej mRNA aj v prípade, že nie je známa celá sekvencia DNA, ktorá kódujúcej protein. Ribozýmy sú efektívne najmä v prípade, keď sa ribozómy pohybujú pozdĺž mRNA pomaly. V tom prípade môže ribozým ľahšie nájsť na mRNA úsek bez ribozómov. Z toho dôvodu sú ako systém pre ribozýmy vhodné mutanty s pomalými ribozómami (J. Búrke, 1997, Náture Biotechnology; 15, 414-415). Takáto molekula DNA je obzvlášť vhodná na potlačenie, poprípade zastavenie expresie rastlinnej GlcNAc-a1,3fukozyltransferázy.
Existuje aj možnosť použiť pozmenenú formu ribozýmu, minizým. Minizýmy sú účinné najmä na štiepenie väčších molekúl mRNA. Minizým je ribozým, ktorý má na mieste Stem/Loop II krátky oligonukleotidový linker. Zvlášť účinné sú
31765/Hh
• ·· • ·· 99
• · · 99 9 9 9 9 99
• · · 9 9 9 9 9
• ··· · 9 9 9 9 9 9
• · 9 9 9 9 9
·· ·· 999 99 99 99
minizýmové diméry (Kuwabara etal., 1998, Náture Biotechnology, 16; 961965).
V tomto zmysle sa vynález týka aj biologicky funkčného vektora, ktorý obsahuje jednu z posledne menovaných molekúl DNA (molekulu s mutáciami, alebo molekulu ribozýmovej DNA). Pri tom platí to čo už bolo uvedené o vektoroch. Takýto vektor je možné vniesť napríklad do mikroorganizmu a použiť ho na produkciu vysokých koncentrácií vyššie popísaných molekúl DNA. Ďalej je takýto vektor vhodný najmä na vnesenie špecifickej molekuly DNA do organizmu rastliny alebo hmyzu za účelom obmedzenia alebo úplného zastavenia produkcie GlcNAc-a1,3-fukozyltransferázy v tomto organizme.
V zmysle vynálezu bude k dispozícii postup na vytvorenie cDNA, ktorá bude obsahovať vyššie popísanú molekulu DNA. Pri tomto postupe sa izoluje RNA z buniek hmyzu alebo rastlín, najmä z buniek hypokotylu, a po pridaní reverznej transkriptázy a primerov sa uskutoční reverzná transkripcia. Jednotlivé kroky tohto postupu sa uskutočnia podľa známych postupov. V prípade reverznej transkripcie existuje možnosť syntetizovať za pomoci oligo(dT) primerov cDNA z celkovej mRNA a až následne vykonať PCR so zvolenými primermi a pripraviť tak molekuly DNA obsahujúce gén pre GlcNAca1,3-fukozyltransferázu. Ďalšou možnosťou je použiť zvolené primery priamo na reverznú transkripciu a získať tak kratšiu, špecifickú cDNA. Vhodné primery sa dajú pripraviť napríklad synteticky, podľa predlohy zo sekvencií cDNA pre transferázu. Za pomoci tohto postupu sa dá veľmi rýchlo, jednoducho a s nízkou chybovosťou pripraviť veľké množstvo molekúl cDNA v zmysle vynálezu.
Vynález sa ďalej týka postupu na klonovanie GlcNAc-a1,3fukozyltransferázy, pri ktorom sa naklonuje molekula DNA v zmysle vynálezu do vektora, ktorý sa transfekuje do hostiteľskej bunky, poprípade do hostiteľa, pričom sa prostredníctvom selekcie a amplifikácie transfekovaných hostiteľských buniek získajú bunkové línie, ktoré exprimujú aktívnu GlcNAca1,3-fukozyltransferázu. Molekula DNA sa napríklad vloží do vektora za
31765/H h ·· ·· pomoci reštrikčných endonukleáz. Pre vektor platia opäť horeuvedené podmienky. Pri tomto postupe je dôležité, aby sa zvolil systém s efektívnym hostiteľským vektorom. Na produkciu aktívneho enzýmu sú vhodné najmä eukaryotické hostiteľské bunky. Jednou z možností je transfekcia vektora do buniek hmyzu. Pri tom sa môže použiť vírus hmyzu ako vektor, ako napr. bakulovírus.
Je samozrejme možné transfekovať ľudské bunky, alebo bunky iných stavovcov, ktoré by exprimovali cudzorodý enzým.
V ideálnom prípade bude k dispozícii postup na prípravu rekombinantných hostiteľských buniek, predovšetkým buniek rastlín a hmyzu, s potlačenou alebo úplne zastavenou produkciou GlcNAc-a1,3fukozyltransferázy. Tieto bunky sa vyznačujú tým, že majú vložený vektor v zmysle tohto vynálezu, ktorý obsahuje molekulu DNA podľa tohto vynálezu, t.j. mutovanú molekulu DNA, alebo molekulu DNA kódujúcu ribozým, alebo ktorý obsahuje molekulu DNA v obrátenej orientácii vzhľadom k promótoru. Pri tom platí to, čo bolo o transfekcii popísané vyššie.
Ako hostiteľské bunky sa môžu použiť napríklad rastlinné bunky, pričom do úvahy prichádza napríklad Ti-plazmid v systéme Agrobacterium. So systémom Agrobacterium je možné priamo transfekovať rastlinu: Agrobaktérie zapríčiňujú u rastlín tvorbu koreňových hľuziek. Keď agrobaktérie infikujú poranenú rastlinu, neprenikajú do rastliny samotné baktérie, ale vnesú do rastlinných buniek rekombinantný úsek DNA, tzv. T-DNA z kruhového, extrachromozomálneho Ti-plazmidu, ktorý spôsobuje tvorbu tumorov. TDNA a s ňou aj vložená molekula DNA sa stabilne vsunie do chromozómovej DNA bunky, aby sa mohli v rastline exprimovať gény T-DNA.
Existuje veľký počet známych, efektívnych transfekčných mechanizmov pre rôzne hostiteľské systémy. Sú to napríklad elektroporácia, metóda s fosforečnanom vápenatým, mikroinjekcia alebo lipozómová metóda.
31765/Hh
Transfekované bunky sa následne selektujú, napr. na základe rezistencie k antibiotikám, pre ktorú nesie vektor patričné gény, alebo na základe iných markerových génov. Potom sa amplifikujú transfekované bunkové línie, buď v malých množstvách napr. na Petriho miskách, alebo vo veľkom, napr. vo fermentoroch. Okrem toho vykazujú rastliny zvláštnu schopnosť -sú totiž schopné vyvinúť sa opätovne z jedinej (transfekovanej) bunky, poprípade z protoplastu na kompletnú rastlinu, ktorú sa môže pestovať.
Podľa druhu použitého vektora dochádza v hostiteľovi k procesom, ktoré potlačia, alebo úplne zastavia expresiu enzýmu:
Ak sa transfekuje vektor s molekulou DNA s delečnou, inzerčnou alebo substitučnou mutáciou, dochádza k homologickej rekombinácii: zmutovaná molekula DNA rozpozná napriek mutácii identickú sekvenciu v genóme hostiteľskej bunky a zabuduje sa na tom istom mieste, takže vznikne tzv. „knock-out“ gén. Takýmto spôsobom sa vnesie do génu pre GlcNAc-a1,3fukozyltransferázu mutácia, ktorá môže inhibovať bezproblémovú expresiu GlcNAc-a1,3-fukozyltransferázy. Ako už bolo popísané vyššie, pri tejto metóde je dôležité, aby mutácia dostatočne bránila expresii aktívneho proteínu. Po selekcii a amplifikácii je možné na dodatočnú kontrolu gén sekvenovať, aby sa overil úspech homologickej rekombinácie, poprípade stupeň mutácie.
Ak sa transfekuje vektor s molekulou DNA, ktorá kóduje ribozým, exprimuje sa v hostiteľskej bunke aktívny ribozým. Ribozým vytvára komplex s komplementárnou sekvenciou mRNA pre GlcNAc-a1,3-fukozyltransferázu minimálne na jednom mieste, štiepi ju na tomto mieste a takýmto spôsobom môže inhibovať transláciu enzýmu. V tejto hostiteľskej bunke, ako aj v bunkových líniách alebo rastlinách, ktoré z nej pochádzajú, nedochádza k žiadnej expresii GlcNAc-a1,3-fukozyltransferázy.
V prípade vektora, ktorý obsahuje molekulu DNA v zmysle vynálezu, ktorá je orientovaná po smere alebo proti smeru promótora, exprimuje sa v transfekovanej bunke (poprípade rastline) „sense“ alebo „anti-sense“ mRNA.
31765/H h
• ·· • ·· ··
• · · ·· · · • · ··
• · · • · · • •
• ··· · • · · • · •
• · • · • •
·· ·· ··· ·· ·· • ·
Anti-sense mRNA je komplementárna aspoň k časti sekvencie mRNA pre GlcNAc-a1,3-fukozyltransferázu a môže tiež inhibovať transláciu enzýmu. Príklad postupu na potlačenie génovej expresie technikou anti-sense je v publikácii Smith etal. 1990, Mol. Gen. Genet. 224:477-481, kde sa popisuje inhibícia expresie génu, ktorý sa zúčastňuje procesu dozrievania paradajok.
Vo všetkých systémoch dochádza minimálne k potlačeniu expresie GlcNAc-a1,3-fukozyltransferázy, v ideálnom prípade k jej úplnému potlačeniu. Stupeň inhibície génovej expresie závisí od stupňa vytvárania komplexov, homologickej rekombinácie, od prípadných následných náhodných mutácií a od ostatných procesov v oblasti genómu. Transfekované bunky sa kontrolujú a selektujú podľa aktivity GlcNAc-a1,3-fukozyltransferázy.
Ďalej existuje možnosť ešte zosilniť vyššie popísanú inhibíciu expresie GlcNAc-a1,3-fukozyltransferázy tým, že sa do hostiteľa vnesie okrem popísaného vektora aj vektor obsahujúci gén, ktorý kóduje cicavčí protein , napríklad 31,4-galaktozyltransferázu. Fukozylácia sa dá obmedziť pôsobením iných cicavčích enzýmov, pričom je zvlášť efektívna kombinácia inhibície expresie aktívnej a1,3-fukozyltransferázy prostredníctvom vektora v zmysle vynálezu spolu s vektorom s cicavčím enzýmom.
Na transfekciu sa dá použiť ľubovoľný rastlinný druh, napríklad bôby Mungo, tabak, paradajka a/alebo zemiak.
Iný výhodný postup na prípravu rekombinantných hostiteľských buniek, najmä buniek rastlín alebo hmyzu, je založený na princípe vnesenia molekuly DNA, ktorá obsahuje mutáciu, do genómu hostiteľskej bunky, poprípade rastliny alebo hmyzu, namiesto nemutovanej, homologickej sekvencie (Schaefer etal. 1997, Plánt J.; 11(6):1195-1206). Pri tomto postupe sa nepoužíva vektor, ale čistá molekula DNA. Aby sme vymenovali aspoň tri metódy, molekula DNA sa vnesie napríklad bombardovaním, mikroinjekciou alebo elektroporáciou. Ako už bolo uvedené vyššie, molekula DNA sa zrovná s homologickou sekvenciou v genóme hostiteľa, takže dôjde k homologickej rekombinácii a vneseniu
31765/H h
• ·· • · · • · · · · ·· • · • ·
• · · • · · • ·
• ··· · • · · • · •
• · • · · • •
·· ·· ··· ·· ·· • ·
delečnej, inzerčnej alebo substitučnej mutácie do genómu: Môže pritom dochádzať k potlačeniu, alebo úplnému zastaveniu expresie GlcNAc-a1,3fukozyltransferázy.
Ďalší aspekt vynálezu sa týka rastlín, poprípade rastlinných buniek, ako aj hmyzu alebo buniek hmyzu, v ktorých klesla GlcNAc-a1,3fukozyltransferázová aktivita pod 50 %, najmä však pod 20 % a v ideálnom prípade na 0 % prirodzenej aktivity GlcNAc-a1,3-fukozyltransferázy v rastlinách alebo rastlinných bunkách, poprípade v hmyze alebo bunkách hmyzu. Výhodou je, že takéto rastliny alebo rastlinné bunky produkujú glykoproteíny s nulovým, alebo s minimálnym množstvom fukózy viazanej <x1,3 väzbou. Ak sa produkty takýchto rastlín alebo hmyzu dostanú do tela človeka alebo iných stavovcov, nevyvolávajú imunitnú reakciu proti od,3-fukózovému epitopu.
V ideálnom prípade budú k dispozícii rekombinantné rastliny alebo rastlinné bunky, ktoré boli pripravené podľa vyššie popísaného postupu a v ktorých bola potlačená alebo úplne zastavená produkcia GlcNAc-a1,3fukozyltransferázy.
Vynález sa týka aj rekombinantného hmyzu alebo buniek hmyzu, ktoré boli pripravené podľa vyššie popísaného postupu a v ktorých bola potlačená alebo úplne zastavená produkcia GlcNAc-a1,3-fukozyltransferázy. Aj v tomto prípade sa neprodukujú glykoproteíny s fukozylovými zvyškami viazanými od,3 väzbou, takže tiež nevyvolávajú imunitnú reakciu proti a1,3-fukózovému epitopu.
Vynález sa vzťahuje aj na molekulu PNAso sekvenciou báz, ktorá je komplementárna k sekvencii molekuly DNA v zmysle vynálezu alebo k jej čiastkovej sekvencii. PNA (kyselina peptidnukleotidová) je sekvencia podobná DNA, v ktorej sú nukleotidové bázy naviazané na pseudopeptidovú kostru. Vo všeobecnosti hybridizuje PNA s komplementárnymi DNA-, RNA- alebo PNAoligomérmi podľa Watson-Crickovho párovania a vytvára helikálnu konformáciu. Peptidová kostra je zodpovedná za zvýšenú rezistenciu proti
31765/H h
• ·· • · · • ·· ·· · · ·· • · • ·
• · · • · · • ·
• ··· · ♦ · · • · •
B · • · · • •
·· ·· ··· ·· ·· • ·
enzýmovej degradácii. Molekula PNA predstavuje zlepšené anti-sense agens. Ani nukleázy ani proteázy nie sú schopné molekulu PNA štiepiť. Stabilita molekuly PNA naviazanej na komplementárnu sekvenciu vykazuje dostatočné stérické blokovanie DNA a RNA polymeráz, reverznej transkriptázy, telomerázy a ribozómov.
Ak má molekula PNA vyššie popísanú sekvenciu, naviaže sa na DNA, poprípade na časť tej DNA, ktorá kóduje GlcNAc-a1,3-fukozyltransferázu, a tak môže inhibovať transkripciu enzýmu. Keďže molekula PNA sa netranskribuje ani netranslatuje, pripravuje sa synteticky, napríklad za pomoci t-Boc metódy.
V ideálnom prípade bude k dispozícii molekula PNA so sekvenciou báz, ktorá zodpovedá sekvencii molekuly DNA v zmysle vynálezu, ako aj jej čiastkovým sekvenciám. Táto molekula PNA vytvára komplexy s mRNA, poprípade s časťami mRNA pre GlcNAc-a1,3-fukozyltransferázu, takže dochádza k inhibícii translácie enzýmu. Výsledok je podobný ako v prípade použitia anti-sense mRNA. Tak napríklad zvlášť efektívnou oblasťou na tvorbu komplexov je oblasť iniciácie translácie, alebo 5' netranslatované oblasti mRNA.
Ďalší aspekt predkladaného vynálezu sa týka postupu na prípravu rastlín alebo hmyzu, poprípade buniek, najmä však buniek rastlín alebo hmyzu, ktoré vykazujú blokovanú expresiu GlcNAc-a1,3-fukozyltransferázy na úrovni transkripcie poprípade translácie a ktoré sa vyznačujú tým, že do buniek bola vnesená molekula PNA v zmysle vynálezu. Na vnesenie molekuly PNA, poprípade molekúl PNA do bunky sa použijú opäť bežné metódy, ako napríklad elektroporácia alebo mikroinjekcia. Zvlášť účinný je prenos v prípade naviazania PNA oligomérov na peptidy penetrujúce do bunky, napríklad transportán alebo pAntp (Pooga etal. 1998, Náture Biotechnology, 16; 857861).
Vynález poskytuje aj postup na prípravu rekombinantných glykoproteínov, ktoré sa vyznačujú tým, že rekombinantné rastliny alebo
31765/H h
• · · • ·· ··
• · · ·· · · • · • ·
• · · • ·♦· · • · · • · · • · • · ·
A · • · · • ·
·· ·· ··· ·· ·· ··
rastlinné bunky, poprípade hmyz alebo bunky hmyzu, v ktorých je potlačená alebo úplne zastavená produkcia GlcNAc-a1,3-fukozyltransferázy, alebo rastliny a hmyz, poprípade bunky, do ktorých bola postupom v zmysle vynálezu vnesená molekula PNA s génom, ktorý kóduje glykoproteín, sú transfekované takže dochádza kexpresii rekombinantných glykoproteínov. Ako už bolo popísané vyššie, dochádza pri vyššie popísaných vektoroch obsahujúcich gény pre želané proteíny k transfekcii do hostiteľa, poprípade hostiteľských buniek. Transfekované bunky rastlín alebo hmyzu exprimujú želané proteíny, ktoré nemajú žiadnu, alebo skoro žiadnu fukózu naviazanú a1,3 väzbou. V dôsledku toho nespúšťajú vyššie spomenutú imunitnú reakciu v tele človeka, alebo iných stavovcov. V týchto systémoch sa dajú produkovať ľubovoľné proteíny.
V ideálnom prípade bude k dispozícii postup na produkciu rekombinantných humánnych glykoproteínov, ktorý sa vyznačuje tým, že rekombinantné rastliny, poprípade rastlinné bunky, ako aj rekombinantný hmyz, poprípade bunky hmyzu v zmysle vynálezu, v ktorých je potlačená alebo úplne zastavená produkcia GlcNAc-a1,3-fukozyltransferázy, alebo rastliny alebo hmyz, poprípade bunky, do ktorých bola vnesená molekula PNA postupom v zmysle vynálezu, sú transfekované génom kódujúcim glykoproteín, takže dochádza k expresii glykoproteínu. Tento postup umožní produkovať v rastlinách (alebo v bunkách) ľudské glykoproteíny, ktoré po vnesení do ľudského tela nevyvolávajú imunitnú reakciu proti fukózovým zvyškom viazaným a1,3 väzbou. Existuje pritom možnosť použiť na produkciu rekombinantných glykoproteínov rastlinné druhy, ktoré slúžia ako zdroj potravy, napríklad banány, zemiaky a/alebo paradajky. Pletivá týchto rastlín obsahujú rekombinantný glykoproteín, takže je možné vpraviť rekombinantný glykoproteín do ľudského tela napríklad po extrakcii rekombinantného glykoproteínu z pletiva a jeho následným podávaním, alebo priamym požívaním rastlinných pletív.
V ideálnom prípade je k dispozícii postup na produkciu rekombinantných ľudských glykoproteínov na medicínske účely prostredníctvom
31765/H h ·· · · · • · · • · · · · • · · · ··· ·· rekombinantných rastlín poprípade rastlinných buniek ako aj rekombinantného hmyzu poprípade buniek hmyzu v zmysle vynálezu, v ktorých bola potlačená alebo úplne zastavená produkcia GlcNAc-a1,3-fukozyltransferázy, alebo prostredníctvom rastlín alebo hmyzu, poprípade buniek, do ktorých boli postupom v zmysle vynálezu vnesené molekuly PNA obsahujúce gén kódujúci glykoproteín, ktoré sú transfekované tak, aby exprimovali rekombinantný glykoproteín. Do úvahy pri tom prichádza ľubovoľný glykoproteín, ktorý je zaujímavý z medicínskeho hľadiska.
Ďalej sa predkladaný vynález týka rekombinantných glykoproteínov, ktoré boli pripravené podľa vyššie popísaného postupu v rastlinných alebo hmyzích systémoch a ktoré obsahujú menej než 50 %, najmä však menej než 20%, v ideálnom prípade 0% fukózových zvyškov viazaných a1,3 väzbou, v porovnaní s proteínmi exprimovanými v rastlinných alebo hmyzích systémoch, v ktorých nebola potlačená hladina fukozyltransferázy. Uprednostňujú sa pritom samozrejme glykoproteíny, ktoré nemajú žiadne fukózové zvyšky viazané a1,3 väzbou. Množstvo fukózy naviazanej od ,3 väzbou závisí, do akého stupňa bol potlačená hladina GlcNAc-a1,3-fukozyltransferázy.
Výhodne sa vynález týka rekombinantných humánnych glykoproteínov, ktoré boli pripravené podľa vyššie popísaného postupu v rastlinných alebo hmyzích systémoch, a ktoré na svojej peptidovej sekvencii obsahujú menej než 50 %, najmä však menej než 20 %, v ideálnom prípade 0 % fukózových zvyškov viazaných a1,3 väzbou, v porovnaní s proteínmi exprimovanými v rastlinných alebo hmyzích systémoch, v ktorých nebola potlačená hladina fukozyltransferázy.
Obzvlášť výhodne sa však uskutočnenie týka rekombinantných humánnych glykoproteínov na medicínske použitie, ktoré boli pripravené podľa vyššie popísaného postupu v rastlinných alebo hmyzích systémoch, a ktoré na svojej peptidovej sekvencii obsahujú menej než 50 %, najmä však menej než
20%, v ideálnom prípade 0% fukózových zvyškov viazaných od ,3 väzbou, ····
31765/Hh • ·· · ·· ·· · •J · · ·· · · · · ·· • · · ··· ··· • ··· · ······ · • · ······ ··· ·· ··· ·· ·· ··· v porovnaní s proteínmi exprimovanými v rastlinných alebo hmyzích systémoch, v ktorých nebola potlačená hladina fukozyltransferázy.
Tieto glykoproteíny v zmysle vynálezu môžu obsahovať iné naviazané oligosacharidové jednotky, ktoré sú špecifické pre rastliny alebo hmyz, čím sa tieto glykoproteíny - v prípade humánnych glykoproteinov - odlišujú od prirodzených glykoproteinov. Napriek tomu však glykoproteíny v zmysle vynálezu nevyvolávajú v ľudskom tele žiadnu, alebo len minimálnu imunitnú reakciu, keďže, ako už bolo napísané v úvode, hlavnou príčinou imunitnej reakcie alebo krížovej imunitnej reakcie proti proteínom rastlín alebo hmyzu sú fukózové zvyšky viazané a1,3 väzbou.
Ďalší aspekt sa týka farmaceutického prípravku, ktorý obsahuje glykoproteíny v zmysle vynálezu. Okrem glykoproteinov v zmysle vynálezu obsahuje farmaceutický prípravok aj ďalšie zložky, bežné v takýchto prípravkoch. Sú to napríklad vhodné riediace roztoky stlmivými zložkami (napríklad Tris-HCI, octan, fosforečnan), zložkami na úpravu pH a iónovej sily, aditíva, ako napríklad tenzidy a rozpúšťadlá (napríklad Tween 80, Polysorbát 80), konzervačné látky (napr. Thimerosal, benzylalkohol), adjuvantné látky, antioxidanty (napr. kyselina askorbová, tiosíran sodný), emulgátory, plnidlá (napr. laktóza, manitol), kovalentne na proteín naviazané polyméry, ako polyetylénglykol, alebo prostriedky na viazanie materiálu do polymérnych častíc, ako polymér kyseliny mliečnej, kyseliny polyglykolovej, alebo do lipozómov a ďalej pomocné látky alebo nosiče, ktoré sú užitočné pri danej liečbe. Takéto prípravky ovplyvňujú fyzikálny stav glykoproteinov v zmysle vynálezu, ich stabilitu, rýchlosť uvoľňovania in vivo a rýchlosť vylučovania in vivo.
Vynález dáva k dispozícii aj postup na selekciu molekúl DNA kódujúcich
GlcNAc-a1,3-fukozyltransferázu vo vzorke, pričom sa označené molekuly
DNA v zmysle vynálezu pridajú ku vzorke a naviažu sa na molekuly DNA, ktoré kódujú GlcNAc-a1,3-fukozyltransferázu. Hybridizované molekuly DNA sa môžu detekovať, kvantifikovať a selektovať. Aby vzorka obsahovala jednovláknovú
31765/H h • · · · · ··· ·· ··· ··
DNA, s ktorou môžu označené molekuly DNA hybridizovať, denaturuje sa napríklad zohrievaním.
Existuje aj možnosť skúmanú DNA po prípadnom pridaní endonukleáz oddeliť gélovou elektroforézou v agarózovom géle. Po prenesení na nitrocelulózovú membránu sa pridajú označené molekuly DNA podľa vynálezu, ktoré hybridizujú so zodpovedajúcou homologickou molekulou DNA („Southern Blotting“).
Ďalšou možnosťou je vyhľadávanie homologických génov iných biologických druhov pomocou postupu založenom na PCR, s použitím špecifických a/alebo degenerovaných primerov odvodených od sekvencie molekuly DNA v zmysle vynálezu.
Prednostne obsahuje vzorka na horeuvedený postup podľa vynálezu genómovú DNA organizmu rastliny alebo hmyzu. Prostredníctvom tohoto postupu je možné preskúmať rýchlym a účinným spôsobom veľký počet druhov rastlín a hmyzu na prítomnosť génu pre GlcNAc-a1,3-fukozyltransferázu. Tak je možné selektovať rastliny alebo hmyz, ktorý neobsahuje tento gén, poprípade je možné v druhoch rastlín alebo hmyzu, ktoré daný gén obsahujú, postupom v zmysle vynálezu potlačiť alebo úplne zastaviť expresiu GlcNAca1,3-fukozyltransferázy a použiť ich na transfekciu a produkciu (ľudských) glykoproteínov.
Vynález sa tiež týka molekúl DNA kódujúcich GlcNAc-a1,3fukozyltransferázu, ktoré boli vyselektované a izolované zo vzorky prostredníctvom vyššie popísaných postupov. Tieto molekuly sa môžu použiť na ďalší výskum. Je možné ich sekvenovať a taktiež použiť ako DNA sondy na hľadanie GlcNAc-a1,3-fukozyltransferáz. Takéto - označené - molekuly DNA sa používajú s väčšou účinnosťou pri organizmoch, ktoré sú príbuzné s organizmami, z ktorých boli molekuly DNA izolované, než molekuly DNA podľa vynálezu.
31765/H h ··· ··· ··· • ···· ······ t • · ······ ··· ·· ··· ·· ·· ···
Ďalší aspekt vynálezu sa týka prípravy GlcNAc-a1,3-fukozyltransferázy klonovanej v zmysle vynálezu, ktorá vykazuje izoformy s hodnotami pl medzi 6,0 až 9,0, najmä však medzi 6,8 až 8,2. Hodnota pl proteínu zodpovedá takej hodnote pH, pri ktorej je jeho celkový elektrický náboj nulový a závisí od sekvencie aminokyselín, glykozylačného vzorca ako aj od priestorovej štruktúry proteínu. GlcNAc-a1,3-fukozyltransferáza má aspoň 7 izoforiem, ktoré majú hodnotu pl v tomto rozsahu. Dôvodom pre existenciu rozličných izoforiem transferázy sú napríklad rozdielna glykozylácia alebo limitovaná proteolýza. Pokusy ukázali, že semenáčiky bôbov Mungo z rozličných materských rastlín obsahujú rozdielny pomer izozýmov. Hodnota pl sa dá určiť postupom, ktorý odborníci poznajú a ktorý sa nazýva izoelektrická fokusácia.
Hlavná izoforma enzýmu má zjavnú molekulovú hmotnosť 54 kDa.
Enzým v zmysle vynálezu má izoformy s hodnotami pl 6,8; 7,1 a 7,6.
Vynález sa tiež týka postupu na prípravu „rastlinných“ sacharidových jednotiek z glykoproteínov ľudí a iných stavovcov, pričom sa ku vzorke obsahujúcej sacharidovú jednotku poprípade glykoproteín pridajú fukózové jednotky a GlcNAc-a1,3-fukozyltransferáza kódovaná vyššie popísanou molekulou DNA, takže GlcNAc-a1,3-fukozyltransferáza naviaže fukózu väzbou a1,3 na sacharidovú jednotku, poprípade na glykoproteín. Postup na klonovanie GlcNAc-a1,3-fukozyltransferázy v zmysle vynálezu umožňuje prípravu veľkých množstiev vyčisteného enzýmu. Aby sa dosiahla úplná účinnosť transferázy, pripravia sa vhodné reakčné podmienky. Ukázalo sa, že transferáza má obzvlášť vysokú aktivitu pri približnej hodnote pH 7, ak sa ako tlmivý roztok použije 2-(N-morfolino)metánsulfonát-HCI. V prítomnosti dvojmocných katiónov, najmä Mn2+ sa aktivita rekombinantnej transferázy zvyšuje. Sacharidové jednotky sa pridávajú ku vzorke buď vo voľnej forme, alebo viazané na protein. Rekombinantná transferáza si zachováva aktivitu v oboch prípadoch.
31765/Hh ·· · · · ; ; .
··· · ······ ·
Vynález bude ďalej objasnený pomocou nasledovných príkladov a obrázkov, nie je však samozrejme na ne obmedzený.
Prehľad obrázkov na výkresoch
Na výkresoch predstavujú obr. 1a a 1b celkové množstvo proteínov a nameranú enzýmovú aktivitu v jednotlivých frakciách eluátu v podobe krivky; obr.2 zobrazuje elektroforézny gél sGlcNAc-a1,3-fukozyltransferázou; na obr. 3 je výsledok izoelektrickej fokusácie a nameraná transferázová aktivita jednotlivých izoforiem; na obr. 4 sú A-terminálne sekvencie 4 tryptických peptidov 1-4 ako aj sekvencia DNA troch primérov S1, A2 a A3; na obr. 5a a 5b je sekvencia cDNA pre a1,3-fukozyltransferázu; na obr. 6a a 6b je z cDNA odvodená aminokyselinová sekvencia a1,3-fukozyltransferázy; na obr. 7 je schematické zobrazenie a1,3-fukozyltransferázy a hydrofóbnosť aminokyselinových zvyškov; na obr. 8 je porovnanie konzervovaných motívov rozličných fukozyltransferáz; na obr. 9 je porovnanie fukozyltransferázovej aktivity z buniek transfekovaných génom pre GlcNAc-a1,3-fukozyltransferázu s negatívnou kontrolou; na obr. 10a a 10b je štruktúra rozličných akceptorov a1,3-fukozyltransferázy; obr. 11 a 12 zobrazujú hmotnostné spektrá a obr. 13 zobrazuje výsledok HPLC.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Príklad 1:
Izolácia jadra s a1,3-fukozyltransferázou
Všetky kroky sa robili pri 4°C. Semenáčiky bôbov Mungo sa zhomogenizovali v mixéri s použitím 0,75 objemu extrakčného tlmivého roztoku na kg bôbov. Homogenát sa následne prefiltroval cez dve vrstvy bavlnenej tkaniny a filtrát sa centrifúgoval 40 min pri 30 000xg. Kvapalná frakcia sa odstránila a pelet sa extrahoval cez noc v rozpúšťačom tlmivom roztoku za stáleho miešania. Po následnej centrifúgach 40 min pri 30 000xg sme dostali Triton-extrakt.
31765/H h
• ·· ·· · · • ·· ·· · · 99 9 9 9
• ··· · • · · · 9 •
• · • · · 9 •
··· ·· ··· 99 99 •
Triton-extrakt sa prečistil nasledovne:
Krokl: Triton-extrakt sa naniesol na kolónu mikrogranulárneho dietylaminoetylcelulózového iónomeniča DE52 (5*28 cm, firma Whatman), ktorý bol predtým kalibrovaný tlmivým roztokom A. Nenaviazaná frakcia sa ďalej spracovala v kroku 2.
Krok 2: Vzorka sa naniesla na kolónu Affi-Gel Blue (2,5x32) kalibrovanú tlmivým roztokom A. Po premytí kolóny týmto tlmivým roztokom sa adsorbovaný proteín vymyl tlmivým roztokom A s 0,5 M NaCI.
Krok 3: Po dialýze eluátu z kroku 2 oproti tlmivému roztoku B sa vzorka naniesla na tým istým tlmivým roztokom kalibrovanú kolónu S-Sepharose. Naviazaný proteín sa eluoval lineárnym gradientom od 0 do 0,5 M NaCI vtlmivom roztoku B. Frakcie s GlcNAc-a1,3-fukozyltransferázou sa spojili a dialyzovali oproti tlmivému roztoku C.
Krok 4: Dialyzovaná vzorka sa naniesla na kolónu GnGn-Sepharose, ktorá bola kalibrovaná tlmivým roztokom C. Naviazaný proteín sa eluoval tlmivým roztokom C, ktorý obsahoval 1 M NaCI namiesto MnCI2.
Krok 5: Enzým sa následne dialyzoval oproti tlmivému roztoku D a naniesol sa na kolónu GDP-Hexanolamin-Sepharose. Po premytí kolóny tlmivým roztokom D sa transferáza eluovala náhradou MgCI2 a NaCI za 0,5 mM GDP. Aktívne frakcie sa spojili a dialyzovali sa oproti tlmivému roztoku 20 mM TrisHCI, pH 7,3 a nakoniec lyofilizovali.
Enzýmová aktivita GlcNAc-a1,3-fukozyltransferázy sa určovala s použitím
GnGn-peptidu a GDP-L-[U-14C]-fukózy s koncentráciou substrátu 0,5 a 0,25 vtlmivom roztoku 2-(N-morfolino)metánsulfonát-HCI za prítomnosti Triton X100, MnCI2 GlcNAc a AMP (podľa Staudacher et al. 1998 Glycoconjugate J. 15,
355-360; Staudacher et al. 1991 Eur. J. Biochem. 199, 745-751).
31765/Hh
Koncentrácia proteínov sa určovala metódou s kyselinou bicinchonínovou (Pierce) alebo v posledných krokoch purifikácie proteínu analýzou aminokyselín (Altmann 1992 Anál. Biochem. 204, 215-219).
Na obr. 1a a 1b je sú namerané hodnoty množstva proteínov a nameranej enzýmovej aktivity v jednotlivých frakciách eluátu v podobe krivky. Obr. 1a zobrazuje vyššie popísané delenia na kolóne S-Sepharose, obr. 1b delenie na kolóne GnGn-Sepharose pričom krúžky označujú množstvo proteínov, plné čierne krúžky označujú GlcNAc-a1,3-fukozyltransferázu a štvorce označujú N-acetyl-á-glukozaminidázu. Jedna enzýmová jednotka (U) je definovaná ako množstvo enzýmu, ktoré prenesie na akceptor 1 μιτιοΙ fukózy za minútu.
Tabuľka 1 ukazuje jednotlivé kroky pri purifikácii transferázy.
Tabuľka 1
Purifikačný krok Celkové množstvo proteínov Celková aktivita Špecifická aktivita Purifikačný faktor Výťažok
mg mU mU/mg -násobok %
Triton X-100 91 500 4 846 0,05 1 100
extrakt
DE52 43 700 4 750 0,10 2 98,0
Affigel Blue 180,5 4 134 23 460 85,3
S- 8,4 3 251 390 7 800 67,1
Sepharose
GnGn- 0,131 1044 8 030 160 000 21,5
Sepharose
GDP- 0,021 867 43 350 867 000 17,9
Hexanolami n-Sepharose 1 stanovené analýzou aminokyselín
31765/Hh • ·· · ·· ·· ·· · · ·· · · ··· • ··· · ······ · • · ······ ··· ·· ··· ·· ·· ···
Extrakčný tlmivý roztok:
0,5 mM ditiotreitol mM EDTA
0,5 % polyvinylpyrolidón
0,25 M sacharóza mM Tris-HCI tlmivý roztok, pH 7,3
Rozpúšťači tlmivý roztok:
0,5 mM ditiotreitol mM EDTA
1,5 % Trithon X-100 mM Tris-HCI tlmivý roztok, pH 7,3
Tlmivý roztok A:
mM Tris-HCI tlmivý roztok, pH 7,3
0,1 % Trithon X-100
0,02 % NaN3
Tlmivý roztok B:
mM Na-citrátový tlmivý roztok, pH 5,3
0,1 % Trithon X-100
0,02 % NaN3
Tlmivý roztok C:
mM Tris-HCI tlmivý roztok, pH 7,3 mM MnCI2
0,02 % NaN3
Tlmivý roztok D:
mM Tris-HCI tlmivý roztok, pH 7,3 mM MgCI2
31765/H h
• ·· • · · • · · ·· • ··
·· · • •
• ··· · • · • • · •
• · • · • • •
·· ·· ··· ·· ·· ··
0,1 M NaCI
0,02 % NaN3
Príklad 2:
SDS-PAGE a izoelektrická fokusácia
SDS-PAGE bola robená v aparatúre Biorad-Mini-Protein na géloch zložených z 12,5% akrylamidu a1% bisakrylamidu. Gély sa farbili buď vCoomassie Brilliant Blue R-250 alebo striebrom. Izoelektrická fokusácia fukozyltransferázy sa robila na hotových géloch s rozsahom pl 6-9 (Servalyt precotes 6-9, Serva). Gély sa farbili striebrom podľa protokolu výrobcu. Na dvojrozmernú elektroforézu sa prúžky vyrezali z fokusačného gélu, opracovali sa S-alkylačnými činidlami aSDS a vykonala sa SDS-PAGE podľa vyššie uvedeného popisu.
Obr. 3 predstavuje výsledky izoelektrickej fokusácie. Dráha A bola zafarbená striebrom, na dráhe B bola testovaná aktivita izoforiem transferázy. Aktivita sa pritom udáva ako % fukózy prenesenej ako GDP-fukóza na substrát. Príklad 3:
Sekvenovanie peptidu
Na sekvenovanie proteínu sa vyrezali prúžky z SDS-polyakrylamidového gélu zafarbeného farbivom Coomassie, opracovali sa karboxyamidometylačným činidlom a štiepili trypsínom , ako bolo publikované vGórg etal. 1998, Electrophoresis, 9, 681-692. Tryptické peptidy sa delili pomocou HPLC s reverznou fázou na kolóne Vydac C18 1,0*250 mm pri 40 °C s prietokom 0,05 ml/min v aparatúre HP1100 (Hewlett-Packard). Izolované peptidy sa sekvenovali podľa protokolu výrobcu v aparatúre Hewlett-Packard G1005A. Zmes peptidov sa analyzovala aj metódou ineglového natrávenia s MALDI-TOF MS (pozri ďalej).
31765/H h • ·· · ·· ·· ···· ···· ··· • ··· · · · · · · · • · · · · · · ·· ·· ··· ·· ··
Obr. 4 predstavuje N-terminálne sekvencie 4 tryptických peptidov 1-4 (SEQ ID No: 5-8). Podľa prvých troch peptidov sa pripravili primery S1, A2 a A3 (identifikačné číslo sekvencie 9-11).
Príklad 4:
RT-PCR a klonovanie cDNA
Izolovala sa celková RNA z trojdňových hypokotylov bôbov Mungo s použitím systému SV Total RNA izolačného systému od spoločnosti Promega. Na vytvorenie prvého vlákna cDNA sa inkubovala celková RNA 1 h pri 48 °C s AMV reverznou transkriptázou a oligo(dT) primermi, s použitím systému Reverse Transcription Systém spoločnosti Promega.
Prvé vlákno cDNA sa použilo v reakcii PCR s kombináciou sense a antisense primerov:
K 10 μΙ zmesi z reverznej transkripcie sa pridali nasledovné zložky:
μΙ roztoku s 0,1 μΓηοΙ každého primeru; 0,1 mM dNTP (deoxyribonukleotidtrifosfáty), 2 mM MgCI2; 10 mM Tris-HCI tlmivý roztok s pH 9,0; 50 mM KCI a 0,1 % Triton X-100.
Po prvom kroku na denaturáciu, 2 min pri 95 °C, prebehlo 40 cyklov 1 min pri 95 °C, 1 min pri 49 °C a 2 min pri 72 °C. Posledný predlžovací krok prebehol 8 min pri 95 °C. Produkty PCR sme subklonovali do vektora pCR2.1 s použitím sady TACIoning Kit od spoločnosti Invitrogen a následne sekvenovali. Produktmi PCR boli dva fragmenty DNA s dĺžkou 744 bp a 780 bp, pričom obidva fragmenty DNA mali rovnaký 5' koniec (pozri aj obr. 7).
Na základe týchto dvoch fragmentov DNA sa pripravili aj chýbajúce 3' a 5' oblasti cDNA prostredníctvom rýchlej amplifikácie 5'- a 3'- koncov cDNA (RAČE) s použitím sady RAČE Kit od spoločnosti Gibco-BRL. Ako antisense primer sme použili univerzálny amplifikačný primer zo sady, ako sense primer buď sekvenciu 5'-CTGGAACTGTCCCTGTGGTT-3' (SEQ ID No: 12)
31765/Hh
• ·· • · · • ·· ·· ·
·· · · · ·
• ··· · • · · · · ·
• · • · · · ·
·· ·· ··· ·· ·· ··
alebo sekvenciu 5'-AGTGCACTAGAGGGCCAGAA-3' (SEQ ID No: 13). Ako sense primér sme použili aj skrátený kotviaci primér zo sady a ako anti-sense primér sekvenciu 5'-TTCGAGCACCACAATTGGAAAT-3' (SEQ ID No: 14) alebo sekvenciu 5'-GAATGCAAAGACGGCACGATGAAT-3' (SEQ ID No: 15).
PCR prebiehala s anelačnou teplotou 55 °C za podmienok popísaných vyššie. Produkty 5' a 3' RAČE sme subklonovali do vektora pCR2.1 a následne sekvenovali: Sekvencie subklonovaných fragmentov sme sekvenovali dideoxynukleotidovou metódou (reakčná sada ABI PRISM Dye Terminátor Cycle Sequencing Ready a analyzátor ABI PRISM 310 - Perkin Elmer). Na sekvenovanie produktov klonovaných vo vektore pCR2.1 sa použili dopredné primery T7 a M13. Obidve vlákna kódujúcej oblasti sekvenovala služba Vienna VBC Genomics-Sequencing Service s použitím primeru s infračerveným značením (IRD700 a IRD800) a sekvenátora LI-COR Long Read IR 4200 (Lincoln, NE).
Obr. 5a a 5b predstavujú celkovú cDNA s dĺžkou 2 198 bp a s otvoreným čítacím rámcom s dĺžkou 1 530 bp (SEQ ID No: 1). Otvorený čítací rámec (štartovací kodón tvoria bázové páry 211-213, stop-kodón tvoria bázové páry 1740-1743) kóduje proteín zložený z 510 aminokyselín s molekulovou hmotnosťou 56,8 kDa a teoretickou hodnotou pl 7,51.
Obr. 6a a 6b predstavujú aminokyselinovú sekvenciu GlcNAc-a1,3fukozyltransferázy odvodenú od cDNA(SEQ ID No: 2). Miesta pre glykozyláciu asparagínu sú na pozíciách Asn346 a Asn429.
Na obr. 7 je schematické znázornenie GlcNAc-a1,3-fukozyltransferázy (hore) a odvodený index hydrofóbnosti kódovaného proteínu (dolu), pričom pozitívny index hydrofóbnosti znamená zvýšenú hydrofóbnosť. Medzi tým je znázornená veľkosť obidvoch spomenutých PCR produktov v porovnaní s úplnou cDNA. Kódujúca oblasť je znázornená pruhom, pričom „C“ označuje cytoplazmatickú oblasť, „T“ označuje predpokladanú transmembránovú oblasť a „G“ označuje predpokladanú katalytickú oblasť transferázy, ktorá je
31765/Hh orientovaná do vnútra Golgiho komplexu. Analýza sekvencie DNA programom „TMpred“ (EMBnet, Švajčiarsko) predpokladá pravdepodobnú transmembránovú oblasť medzi Asn36 a Gly54. C-terminálna oblasť enzýmu pravdepodobne obsahuje katalytickú oblasť a mala by byť teda orientovaná do vnútra Golgiho komplexu. Podľa toho sa zdá, že transferáza je transmembránovým proteínom typu II, tak ako všetky doteraz analyzované glykozyltransferázy, ktoré sa zúčastňujú biosyntézy glykoproteínov (Joziasse, 1992 Glycobiology 2, 271-277). Sivé oblasti predstavujú štyri tryptické peptidy, šesťuholníky predstavujú potenciálne N-glykozylačné miesta. Rešerš BLASTP v dostupných databázach, prístupný cez NCBI, preukázal podobnosť medzi GlcNAc-a1,3-fukozyltransferázou a inými a1,3/4-fukozyltransferázami, napr. ľudskou fukozyltransferázou-VI. S percentuálnym koeficientom 18-21% (porovnanie pomocou SIM-LALNVIEW, Expase, Švajčiarsko) je celková podobnosť ďaleko od akejkoľvek významnosti. Napriek tomu vykazuje časť sekvencie s dĺžkou 35 aminokyselín (SEQ ID No: 4) nápadne vysokú homológiu sinými a1,3/4-fukozyltransferázami (obr. 8). Táto oblasť sekvencie sa nachádza medzi Glu267 a Pro301 v SEQ ID No: 2.
Príklad 5:
Expresia rekombinantnei GlcNAc-a1,3-fukozyltransferázv v bunkách hmyzu
Kódujúcu oblasť predpokladanej GlcNAc-a1,3-fukozyltransferázy, vrátane cytoplazmatickej a transmembránovej oblasti, sme amplifikovali sdopredným primerom 5'-CGGCGGATCCGCAATTGAATGATG-3' (SEQ ID No: 16) a so spätným primerom 5'-CCGGCTGCAGTACCATTTAGGCCAT-3' (SEQ ID No: 17) v PCR systéme Expand High Fidelity PCR Systém od spoločnosti Boehringer Mannheim. Produkt PCR sa štiepil pomocou Psŕl a Bam Hl a subklonoval do bakulovirálneho transferového vektora pVL1393, ktorý bol predtým opracovaný alkalickou fosfatázou a štiepený enzýmami Pst I a Bam Hl. Aby bola zaručená homologická rekombinácia, bol vektor kotransfekovaný spolu s vírusovou DNA Baculo Gold (PharMingen, San Diego, California) do buniek hmyzu Sf9 v médiu IPL-41 s lipofektínom. Po inkubácii
31765/H h • · dní pri 27 °C sa odobrali rozličné objemy média na infekciu hmyzích buniek Sf21. Po inkubácii 4 dni pri 27 °C v médiu IPL-41 s 5 % FCS sa zbierali bunky Sf 1 a premyli sa 2* v soľnom roztoku s fosfátovým tlmivým roztokom. Bunky sa suspendovali v 25 mM Tris-HCI tlmivom roztoku s pH 4,4 a 2 % Triton X-100 a rozbili sonifikáciou v ľadovom kúpeli.
Príklad 6:
Stanovenie GlcNAc-a1,3-fukozyltransferázovei aktivity
Homogenát a médium z buniek sa použili na stanovenie GlcNAc-a1,3fukozyltransferázovej aktivity. Ako kontrola boli použité vzorky s rekombinantným bakulovírusom kódujúcim GlcNAc-transferázu z tabaku (Strasser eŕ a/. 1999, Glycobiology, v tlači).
Obr. 9 ukazuje nameranú enzýmovú aktivitu rekombinantnej GlcNAca1,3-fukozyltransferázy a negatívnej kontrolnej vzorky. V najlepšom prípade bola enzýmová aktivita v kotransfekovaných bunkách a ich médiu 30* vyššia, než v negatívnej kontrolnej vzorke. Táto endogénna aktivita, ktorá sa dá namerať v neprítomnosti rekombinantnej transferázy, pochádza najmä z hmyzej a1,6-fukozyltransferázy a len nízke percento pochádza z GlcNAc-a1,3fukozyltransferázy. Na základe toho je zvýšenie GlcNAc-a1,3fukozyltransferázy pochádzajúcej z rekombinantných bakulovírusov viac než 100-násobné.
Ak sme aktivitu merali v tlmivom roztoku kyseliny 2-(Nmorfolino)etánsulfónovej-HCI, mal enzým širokú maximálnu aktivitu v okolí pH 7,0. Ako je zjavné z tabuľky 2, aktivita rekombinantnej transferázy sa zvyšuje po pridaní dvojmocných katiónov, najmä Mn2+.
31765/H h
• · · • ·· ·· ·
• · · • • · · ·
• ··· · • • · · · e
• ·
·· ·· ··· ·· ·· ··
Tabuľka 2
Pridaná látka (koncentrácia 10 mM) Pomerná aktivita (akceptor: GnGn-peptid) %
žiadna 21
EDTA 18
MnCI2 100
CaCI2 82
MgCI2 52
CdCI2 44
CoCI2 35
CuCI2 3
NiClz 24
ZnCI2 0,6
Tabuľka 3 ukazuje, že spomedzi použitých akceptorov vykazuje za štandardných pokusných podmienok najväčšiu rýchlosť inkorporácie GnGnpeptid, hneď po ňom GnGnF6-peptid a M5Gn-Asn. K žiadnemu transferu nedochádzalo na ΜΜ-peptid, ktorý nemá redukujúci GlcNAc koniec na 3viazanej manóze. Zdá sa, že táto štruktúra je pre Core-fukozyltransferázu potrebná. Rekombinantná transferáza bola ďalej inaktívna čo sa týka akceptorov použiteľných na určovanie a1,3/4-fukozyltransferáz krvných skupín, ktoré prenášajú fukózu na GlcNAc na neredukujúcich koncoch oligosacharidov. Zjavné hodnoty Km pre akceptorové substráty GnGn-peptid, GnGnF6-peptid, M5Gn-Asn a pre donorový substrát GDP-fukóza sa odhadli na 0,19; 0,13; 0,23 a 0,11. Štruktúra týchto molekúl je znázornená na obr. 10a a 10b.
31765/H h
Tabuľka 3
Akceptorový substrát
Pomerná %
GnGn-peptid
100
GnGnF6-peptid 87
M5Gn-Asn aktivita Hodnota mM 0,19 0,13 0,23
Km
MM-peptid
Gaipi-4GlcNAc 0
Gaipi-3GlcNAc 0
Gaipi-3GlcNAcp1-3Galp1- 0
4Glc
Príklad 7:
Hmotnostná spektrometria produktov fukozyltransferázy
Dabsylovaný GnGn-hexapeptid (2 nmol) sa inkuboval s homogenátom hmyzích buniek spolu s rekombinantnou GlcNAc-a1,3-fukozyltransferázou (0,08 mll) za prítomnosti nerádioaktívnej GDP-L-fukózy (10 nmol), tlmivého roztoku 2-(N-morfolino)metánsulfonát-HCI, Triton X-100, MnCfe, GlcNAc a AMP. Negatívna kontrola pozostávala z homogenátu buniek infikovaných ako negatívna kontrola. Vzorky sa inkubovali 16 hodín pri 37 °C a analyzovali hmotnostnou spektrometriou MALDI TOF.
Hmotnostná spektrometria prebehla na prístroji DYNAMO (Therrmo BioAnalysis, Šanta Fe, NM) typu MALDI-TOF MS, ktorý je schopný robiť dynamickú extrakciu (synonymum pre oneskorenú extrakciu). Použili sme dva spôsoby prípravy matice vzoriek: Peptidy adabsylované glykopeptidy sme rozpustili v 5 % kyseline mravčej a alikvóty sme nanášali na cieľ, vysušili na vzduchu a pokryli 1 % kyselinou a-kyano-4-hydroxyškoricovou. Pyridylaminované sacharidy, redukujúce oligosacharidy a glykopeptidy bez
31765/H h
• ·· • ·· 99
• · · ·· · · 9 • • ·
• · · • · · 9 •
• ··· · • · · 9 9 •
• · 9 9 9 9 •
·· ·· 999 99 • · ··
derivátov sme zriedili vodou, naniesli na cieľ a vysušili na vzduchu. Po pridaní 2 % kyseliny 2,5-dihydroxybenzoovej sme vzorky okamžite vysušili vo vákuu.
Obr. 11 zobrazuje hmotnostné spektrum týchto vzoriek, pričom A predstavuje negatívnu kontrolu. Hlavný vrchol krivky (S) ukazuje substrát dabsyl-Val-Gly-Glu-(GlcNAc4Man3)Asn-Arg-Thr s vypočítanou hodnotou [M+Hf 2 262,3. Tento substrát sa prejavuje aj pri (S*) ako produkt adície sodíka a ako menší ión, ktorý vznikol fragmentáciou azo-funkcie dabsylovej skupiny. Malé množstvo produktu (P, [M+H]+= 2 408.4) sa dá pripísať endogénnej a1,6fukozyltransferáze. Vrchol krivky pri m/z = 2 424,0 ukazuje neúplnú degalaktozidáciu substrátu. Hmotnostné spektrum B ukazuje vzorku s rekombinantnou a1,3-fukozyltransferázou. Hlavný vrchol krivky (P) predstavuje fukozylovaný produkt, (P*) jeho fragmentovaný ión.
Okrem toho sme zmiešali alikvóty obidvoch vzoriek, aby sme dosiahli podobnú koncentráciu substrátu a produktu (vzorka A). Túto zmes sme zriedili 0,1 M roztokom octanu amónneho pH 4,0 s 10 μΙ N-glykozidázy A (vzorka B) alebo s 50 mM Tris-HCl pH 8,5 so 100 μΙΙ (1 U hydrolyzuje 1 μπιοΙ substrátu za minútu) N-glykozidázy F (vzorka C). Po 2 a 20 h sme odobrali alikvóty z týchto zmesí a analyzovali za pomoci MALDI-TOF MS.
Na obr. 12 sú znázornené hmotnostné spektrá vzoriek A, B a C. Neštiepená vzorka A vykazuje dva vrcholy krivky: Substrát pri 2 261,4 m/z a fukozylovaný produkt pri 2 407,7 m/z. Prostredná krivka ukazuje hmotnostné spektrum vzorky B opracovanej N-glykozidázou A, ktorá hydrolyzuje obidva peptidy. Vrchol krivky pri 963,32 predstavuje deglykozylovaný produkt. Spodná krivka ukazuje hmotnostné spektrum vzorky C. N-glykozidáza F nie je schopná hydrolyzovať a1,3-fukozylovaný substrát, takže v spektre je zjavný vrchol krivky pri 2 407,6 m/z fukozylovaného produktu, zatiaľ čo vrchol krivky patriaci hydrolyzovanému substrátu sa objavuje pri 963,08 m/z.
Príklad 8:
HPLC analýza pyridylaminovaného produktu fukozyltransferázy
31765/H h
• ·· • ·· ··
• · · ·· · · • · ··
• · · • · · * ·
• ··· · • · · • · ·
• · • · · • ·
·· ·· ··· ·· ·· ··
Obidve vyššie popísané vzorky (fukozylovaný produkt a negatívna kontrola) boli štiepené N-glykozidázou A. Takto získané oligosacharidy sme pyridylaminovali a analyzovali HPLC s reverznou fázou (Wilson etal. 1998 Glycobiology 8, 651-661; Kubelka etal. 1994 Árch. Biochem. Piophys. 308, 148-157; Haase etal. 1984 J. Biochem. 95, 197-203).
Na obr. 13 je na hornom diagrame B negatívna kontrola, pri ktorej je okrem zvyšného substrátu (GnGn-peptid) viditeľný aj a1,6-fukozylovaný produkt. Na diagrame A je viditeľný vrchol krivky s očividne kratším retenčným časom, čo je špecifické pre fukózu naviazanú na redukujúci GlcNAc- a1,3.
Na spodnom diagrame je porovnanie izolovaného transferázového produktu (krivka A) a po štiepení N-acetyl-p-glukozaminidázou (krivka B) s MMF3 z fosfolipázy A2 včely medonosnej (krivka C).
31765/H h
• · · • ·· • ·
• · · ·· · • • • • ·
• · · • · • • ·
• ··· · • · • 9 • •
• · • · • • •
·· ·· ··· ·· • · ··
SEKVENAČNÝ PROTOKOL <110> Altmann Dr., Friedrich <120> alfa 1,3-fukozyltransferáza R36247 <130> R 36247 <140>
<141>
<160> 17 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 2198 <212> DNA <213> rastlina <400> 1 actaactcaa acgctgcatt ttcttttttc tttcagggaa ccatccaccc ataacaacaa60 aaaaaacaac agcaagctgt gtttttttta tcgttctttt tctttaaaca agcaccccca120 tcatggaatc gtgctcataa cgccaaaatt ttccatttcc ctttgatttt tagtttattt180 tgcggaattg gcagttgggg gcgcaattga atgatgggtc tgttgacgaa tcttcgaggc240 tcgagaacag atggtgccca acaagacagc ttacccgttt tggctccggg aggcaaccca300 aagaggaaat ggagcaatct aatgcctctt gttgttgccc ttgtggtcat cgcggagatc360 gcgtttctgg gtaggttgga tatggccaaa aacgccgcca tggttgactc cctcgctgac420 ttcttctacc gctctcgagc ggtcgttgaa ggtgacgatt tggggttggg tttggtggct480 tctgatcgga attctgaatc gtatagttgt gaggaatggt tggagaggga ggatgctgtc540 acgtattcga ggggcttttc caaagagcct atttttgttt ctggagctga tcaggagtgg600 aagtcgtgtt cggttggatg taaatttggg tttagtgggg atagaaagcc agatgccgca660 tttgggttac ctcaaccaag tggaacagct agcattctgc gatcaatgga atcagcagaa720 tactatgctg agaacaatat tgccatggca agacggaggg gatataacat cgtaatgaca780 accagtctat cttcggatgt tcctgttgga tatttttcat gggctgagta tgatatgatg840 gcaccagtgc agccgaaaac tgaagctgct cttgcagctg ctttcatttc caattgtggt900 gctcgaaatt tccggttgca agctcttgag gcccttgaaa aatcaaacat caaaattgat960 tcttatggtg gttgtcacag gaaccgtgat ggaagagtga acaaagtgga agccctgaag1020 cactacaaat ttagcttagc gtttgaaaat Lcgaatgagg aagattatgt aactgaaaaa1080 ttcttccaat cccLtgttgc tggaactgtc cctgtggttg ttggtgctcc aaatattcag1140 gactttgctc cttctcctgg ttcaatttta catattaaag agatagagga tgttgagtct1200 gttgcaaaga ccatgagata tctagcagaa aatcccgaag catataatca atcattgagg1260 tggaagtatg agggtccatc tgactccttc aaggcccttg tggatatggc agctgtgcat1320 tcatcgtgcc gtctttgcat tcacttggcc acagtgagta gagagaagga agaaaataat1380
31765/H h ccaagcctta agagacgtcc ttgcaagtgc actagagggc cagaaaccgt atatcatatc 1440 tatgtcagag aaaggggaag gtttgagatg gagtccattt acctgaggtc tagcaattta 1500 actctgaatg ctgtgaaggc tgctgttgtt ttgaagttca catccctgaa tcttgtgcct 1560 gtatggaaga ctgaaaggcc tgaagttata agagggggga gtgctttaaa actctacaaa 1620 atatacccaa ttggcttgac acagagacaa gctctttata ccttcagctt caaaggtgat 1680 gctgatttca ggagtcactt ggagaacaat ccttgtgcca agtttgaagt catttttgtg 1740 tagcatgcgc taaatggtac ctctgctcta cctgaattag cttcacttag ctgagcacta 1800 gctagagttt taggaatgag tatggcagtg aatatggcat ggctttattt atgcctagtt 1860 tcttggccaa ctcattgatg ttttgtataa gacatcacac tttaatttta aacttgtttc 1920 tgtagaagtg caaatccata tttaatgctt agttttagtg ctcttatctg atcatctaga 1980 agtcacagtt cttgtatatt gtgagtgaaa actgaaatct aatagaagga tcagatgttt 2040 cactcaagac acattattac ttcatgttgt tttgatgatc tcgagctttt ttagtgtctg 2100 gaactgtccc tgtggtttga gcacctgtta ttgcttcagt gttactgtcc agtggttatc 2160 gtttttgacc tctaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaa 2198 <210>2 <211> 510 <212> PRT <213> rastlina <400> 2
Met 1 Met Gly Leu Leu Thr Asn Leu Arg Gly Ser Arg Thr Asp Gly 15 Ala
5 10
Gin Gin Asp Ser Leu Pro Val Leu Ala Pro Gly Gly Asn Pro Lys Arg
20 25 30
Lys Trp Ser Asn Leu Met Pro Leu Val Val Ala Leu Val Val íle Ala
35 40 45
Glu íle Ala Phe Leu Gly Arg Leu Asp Met Ala Lys Asn Ala Ala Met
50 55 60
Val Asp Ser Leu Ala Asp Phe Phe Tyr Arg Ser Arg Ala Val Val Glu
65 70 75 80
Gly Asp Asp Leu Gly Leu Gly Leu Val Ala Ser Asp Arg Asn Ser Glu
85 90 95
Ser Tyr Ser Cys Glu Glu Trp Leu Glu Arg Glu Asp Ala Val Thr Tyr
100 105 110
Ser Arg Gly Phe Ser Lys Glu Pro íle Phe Val Ser Gly Ala Asp Gin
115 120 125
31765/H h
• · · • ·· ··
• · · ·· · · • 9 • ·
• · · • · · • •
• ··· 9 • · · · • •
• · • · · • •
·· ·· ··· ·· • · ··
Glu Trp Lys 130 Ser Cys .Sci Val 135 Gly Cys Lys Phe Gly 140 Phe Ser Gly Asp
Arg Lys Pro Asp Ala Ala Phe Gly Leu Pro Gin Pro Ser Gly Thr Ala
145 150 155 160
Ser íle Leu Arg Ser Met Glu Ser Ala Glu Tyr Tyr Ala Glu Asn Asn
165 170 175
íle Ala Met Ala Arg Arg Arg Gly Tyr Asn íle Val Met Thr Thr Ser
180 185 190
Leu Ser Ser Asp Val Pro Val Gly Tyr Phe Ser Trp Ala Glu Tyr Asp
195 200 205
Met Met Ala Pro Val Gin Pro Lys Thr Glu Ala Ala Leu Ala Ala Ala
210 215 220
Phe íle Ser Asn Cys Gly Ala Arg Asn Phe Arg Leu Gin Ala Leu Glu
225 230 235 240
Ala Leu Glu Lys Ser Asn íle Lys íle Asp Ser Tyr Gly Gly Cys His
245 250 255
Arg Asn Arg Asp Gly Arg Val Asn Lys Val Glu Ala Leu Lys His Tyr
260 265 270
Lys Phe Ser Leu Ala Phe Glu Asn Ser Asn Glu Glu Asp Tyr Val Thr
275 280 285
Glu Lys Phe Phe Gin Ser Leu Val Ala Gly Thr Val Pro Val Val Val
290 295 300
Gly Ala Pro Asn íle Gin Asp Phe Ala Pro Ser Pro Gly Ser íle Leu
305 310 315 320
His íle Lys Glu íle Glu Asp Val Glu Ser Val Ala Lys Thr Met Arg
325 330 335
Tyr Leu Ala Glu Asn Pro Glu Ala Tyr Asn Gin Ser Leu Arg Trp Lys
340 345 350
Tyr Glu Gly Pro Ser Asp Ser Phe Lys Ala Leu Val Asp Met Ala Ala
355 360 365
Val His Ser Ser Cys Arg Leu Cys íle His Leu Ala Thr Val Ser Arg
370 375 380
31765/H h
• ·· • · · 99
• · · ·· · · 9 9 ··
• · • · · 9 9
9 999 9 • · 9 9 9 9
• · 9 9 9 9 •
·· ·· 999 99 99 ··
Glu 385 Lys Glu Glu Asn Asn 390 Pro Ser Leu Lys Arg 395 Arg Pro Cys Lys Cys 400
Thr Arg Gly Pro Glu Thr Val Tyr His íle Tyr Val Arg Glu Arg Gly
405 410 415
Arg Phe Glu Met Glu Ser íle Tyr Leu Arg Ser Ser Asn Leu Thr Leu
t 420 425 430
Asn Ala Val Lys Ala Ala Val Val Leu Lys Phe Thr Ser Leu Asn Leu
- 435 440 445
Val Pro Val Trp Lys Thr Glu Arg Pro Glu Val íle Arg Gly Gly Ser
450 455 460
Ala Leu Lys Leu Tyr Lys íle Tyr Pro íle Gly Leu Thr Gin Arg Gin
465 470 475 480
Ala Leu Tyr Thr Phe Ser Phe Lys Gly Asp Ala Asp Phe Arg Ser His
485 490 495
Leu Glu Asn Asn Pro Cys Ala Lys Phe Glu Val íle Phe Val
500 505 510 <210> 3 <211> 105 <212> DNA <213> umelá sekvencia <220>
<223> Popis umelej sekvencie: cDNA <400> 3 gaagccctga agcactacaa atttagctta gcgtttgaaa attcgaatga ggaagttat 60 gtaactgaaa aattcttcca atcccttgtt gctggaactg tccct 105
31765/H h
• ·· • · · • ·· · ·· • ·· • ·
• •
• ··· · • · • • · •
• · • · • • •
·· ·· ··· ·· ·· ··
<210>4 <211> 35 <212> PRT <213> umelá sekvencia <220>
<223> Popis umelej sekvencie: peptid <400>4
Glu Ala Leu Lys His Tyr Lys Phe Ser Leu Ala Phe Glu Asn Ser Asn
10 15
Glu Glu Asp Tyr Val Thr Glu Lys Phe Phe Gin Ser Leu Val Ala Gly
25 30
Thr Val Pro <210>5 <211> 15 <212> PRT <213> umelá sekvencia <220>
<223> Popis umelej sekvencie: peptid <400> 5
Lys Pro Asp Ala Xaa Phe Gly Leu Pro Gin Pro Ser Thr Ala Ser
10 15 <210>6 <211> 10 <212> PRT <213> umelá sekvencia
31765/Hh ··· ··· ·· · ·· · · ·· · · · · ·· ··· ··· ···
J ··· · ······ · * · *····· ··· ·· ··· ·· ·· ·«· <220>
<223> Popis umelej sekvencie: peptid <400>6
Pro Glu Thr Val Tyr His lle Tyr Val Arg
5 10 <210>7 <211> 13 <212> PRT <213> umelá sekvencia <220>
<223> Popis umelej sekvencie: peptid <400> 7
Met Glu Ser Ala Glu Tyr Tyr Ala Glu Asn Asn lle Ala
5 10 <210> 8 <211> 10 <212> PRT <213> umelá sekvencia <220>
<223> Popis umelej sekvencie: peptid <400> 8
Gly Arg Phe Glu Met Glu Ser lle Tyr Leu
5 10 <210> 9 <211> 29 <212> DNA <213> umelá sekvencia
31765/H h ·· ·· • · <220>
<223> Popis umelej sekvencie: DNA <400> 9 gcngartayt aygcngaraa yayaathgc 29 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> umelá sekvencia <220>
<223> Popis umelej sekvencie: DNA <400> 10 crtadatrtg rtanacngty tc 22 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> umelá sekvencia <220>
<223> Popis umelej sekvencie: DNA <400> 11 tadatnswyt ccatytcraa 20 <210> 12 <211 >20 <212> DNA <213> umelá sekvencia <220>
<223> Popis umelej sekvencie: DNA
31765/Hh
• ·· • ·· ··
·· · · ·· · · • · ·
• · · • · · • ·
• ··· · • · · 9 • 9
• · • · · • a
··· ·· ··· ·« ·· ·
<400> 12 ctggaactgt ccctgtggtt 20 <210> 13 <211 >20 <212> DNA <213> umelá sekvencia <220>
<223> Popis umelej sekvencie: DNA <400> 13 agtgcactag agggccagaa 20 <210> 14 <211 >22 <212> DNA <213> umelá sekvencia <220>
<223> Popis umelej sekvencie: DNA <400> 14 ttcgagcacc acaattggaa at 22 <210> 15 <211 >24 <212> DNA <213> umelá sekvencia <220>
<223> Popis umelej sekvencie: DNA <400> 15 gaatgcaaag acggcacgat gaat 24
31765/H h
• ·· • ·· ··
• · · ·· · · • · • ·
• · · • · · • ·
• ··· · • · · · • ·
• · • · · • ·
·· ·· ··· ·· ·· ··
<210> 16 <211> 24 <212> DNA <213> umelá sekvencia <220>
<223> Popis umelej sekvencie: DNA <400> 16 cggcggatcc gcaattgaat gatg 24 <210> 17 <211> 25 <212> DNA <213> umelá sekvencia <220>
<223> Popis umelej sekvencie: DNA <400> 17 ccggctgcag taccatttag cgcat 25
31765/Hh ·: :: ·: : : : : · • ··· * ···*·· · ··· ·· nähfädná'Strana** ***

Claims (26)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Molekula DNA, vyznačujúca sa tým, že obsahuje sekvenciu podľa SEQ ID NO: 1 s otvoreným čítacím rámcom od bázového páru 211 po bázový pár 1 740, alebo vykazuje aspoň 50 % homológiu s horeuvedenou sekvenciou, alebo ktorá hybridizuje s horeuvedenou sekvenciou za stringentných podmienok, alebo ktorá obsahuje sekvenciu, ktorá je dôsledkom genetického kódu degenerovaná k horeuvedenej sekvencii, pričom sekvencia kóduje rastlinný proteín s fukozyltransferázovou aktivitou alebo je k takejto komplementárna.
  2. 2. Molekula DNA podľa nároku 1, vyznačujúca sa tým, že kóduje proteín s GlcNAc-a1,3-fukozyltransferázovou aktivitou, najmä však s Core-a1,3fukozyltransferázovou aktivitou.
  3. 3. Molekula DNA podľa nároku 1 alebo 2, vyznačujúca sa tým, že vykazuje aspoň 70 až 80 % homológiu, obzvláť výhodne aspoň 95 % homológiu k sekvencii podľa SEQ ID NO: 1.
  4. 4. Molekula DNA podľa jedného z nárokov 1 až 3, vyznačujúca sa tým, že obsahuje 2 150 až 2 250, najmä však 2 198 bázových párov.
  5. 5. Molekula DNA, vyznačujúca sa tým, že obsahuje sekvenciu podľa SEQ ID NO: 3 alebo sekvenciu, ktorá vykazuje aspoň 85 % homológiu, najmä však aspoň 95 % homológiu k horeuvedenej sekvencii alebo ktorá za stringentných podmienok hybridizuje s horeuvedenou sekvenciou alebo ktorá obsahuje sekvenciu, ktorá je dôsledkom genetického kódu degenerovaná k horeuvedenej sekvencii.
  6. 6. Molekula DNA, vyznačujúca sa tým, že je čiastkovou sekvenciou molekuly DNA podľa jedného z nárokov 1 až 4 a ktorá vykazuje aspoň 80 % homológiu k SEQ ID NO: 1 ako aj veľkosť od 20 do 200, s výhodou 30 až 50 bázových párov.
  7. 7. Molekula DNA podľa jedného z nárokov 1 až 6, vyznačujúca sa tým, že je kovalentne naviazaná na značkovaciu látku, ktorú je možné dokázať.
    31765ns/H • ·· ·· ·· · · · · · · · • · · · · · · ··· · · · · · · · . ..’náňAB€llnS*9ŕ?ana ·· · ··
  8. 8. Biologicky funkčný vektor, vyznačujúci sa tým, že obsahuje molekulu DNA podľa jedného z nárokov 1 až 7, alebo jej časti rozličnej dĺžky, najmenej 20 bázových párov.
  9. 9. Biologicky funkčný vektor, vyznačujúci sa tým, že obsahuje molekulu DNA podľa jedného z nárokov 1 až 7, alebo jej časti rozličnej dĺžky v inverznej orientácii k promótoru.
  10. 10. Molekula DNA, ktorá kóduje ribozým a vyznačujúca sa tým, že obsahuje dva úseky sekvencie, každý s dĺžkou 10 až 15 bázových párov, ktoré sú komplementárne k úsekom sekvencie molekuly DNA podľa jedného z nárokov 1 až 7, takže ribozým vytvára komplex a štiepi mRNA, ktorá vzniká transkripciou z prirodzenej molekuly DNA pre GlcNAc-a1,3fukozyltransferázu.
  11. 11. Biologicky funkčný vektor, vyznačujúci sa tým, že obsahuje molekulu DNA podľa nároku 10.
  12. 12. Spôsob výroby cDNA, ktorá obsahuje molekulu DNA podľa jedného z nárokov 1 až 5, vyznačujúci sa tým, že sa izoluje RNA z buniek hmyzu poprípade rastlín, najmä však z buniek hypokotylu a po pridaní reverznej transkriptázy a primérov sa vykoná reverzná transkripcia.
  13. 13. Spôsob klonovania GlcNAc-a1,3-fukozyltransferázy, vyznačujúci sa tým, že sa do vektora klonuje molekula DNA podľa jedného z nárokov 1 až 5 a tento sa následne transfekuje do hostiteľskej bunky poprípade hostiteľa, pričom sa prostredníctvom selekcie a amplifikácie transfekovaných hostiteľských buniek získajú bunkové línie, ktoré exprimujú aktívnu GlcNAca1,3-fukozyltransferázu.
  14. 14. Spôsob výroby rekombinantných hostiteľských buniek, najmä buniek hmyzu alebo rastlín, poprípade hmyzu alebo rastlín s potlačenou alebo úplne zastavenou produkciou GlcNAc-a1,3-fukozyltransferázy, vyznačujúci sa tým, že aspoň jeden z vektorov podľa nároku 8, 9 alebo 11 poprípade vektor obsahujúci molekulu DNA podľa jedného z nárokov 1 až 7, ktorá obsahuje delečnú, inzerčnú a/alebo substitučnú mutáciu, sa vnesie do hostiteľskej bunky poprípade rastliny alebo do hmyzu.
    31765ns/H ·· ···· · · · • · · · · í !
    , ,,’náhraäact etfana* ·· ·
  15. 15. Spôsob výroby rekombinantných hostiteľských buniek, najmä buniek hmyzu alebo rastlín, poprípade hmyzu alebo rastlín, vyznačujúci sa tým, že sa do genómu hostiteľskej bunky poprípade rastliny alebo hmyzu vnesie molekula DNA podľa jedného z nárokov 1 až 7, ktorá obsahuje delečnú, inzerčnú a/alebo substitučnú mutáciu, na miesto nemutovanej, homologickej sekvencie.
  16. 16. Rekombinantné rastliny poprípade rastlinné bunky, vyznačujúce sa tým, že boli pripravené postupom podľa nároku 14 alebo 15 a ktoré majú potlačenú alebo úplne zastavenú produkciu GlcNAc-a1,3fukozyltransferázy.
  17. 17. Rekombinantný hmyz poprípade bunky hmyzu, vyznačujúce sa tým, že boli pripravené postupom podľa nároku 14 alebo 15 a ktoré majú potlačenú alebo úplne zastavenú endogénnu produkciu GlcNAc-a1,3fukozyltransferázy.
  18. 18. Molekula kyseliny peptidnukleovej (PNA), vyznačujúca sa tým, že obsahuje sekvenciu báz, ktorá je komplementárna k sekvencii molekuly DNA podľa jedného z nárokov 1 až 6, alebo obsahuje časti takejto sekvencie.
  19. 19. Molekula kyseliny peptidnukleovej (PNA), vyznačujúca sa tým, že obsahuje sekvenciu báz, ktorá zodpovedá sekvencii molekuly DNA podľa jedného z nárokov 1 až 6, alebo častiam takejto sekvencie.
  20. 20. Spôsob výroby rastlín alebo hmyzu poprípade buniek, najmä buniek rastlín alebo hmyzu, ktoré vykazujú blokovanie expresie GlcNAc-a1,3fukozyltransferáz na úrovni transkripcie poprípade translácie, vyznačujúci sa tým, že sa do buniek vnesie molekula PNA podľa nároku 18 alebo 19.
  21. 21. Spôsob výroby rekombinantných glykoproteínov, vyznačujúci sa tým, že systém podľa nároku 16 alebo 17 alebo rastliny alebo hmyz poprípade bunky, ktoré boli pripravené postupom podľa nároku 22, je (sú) transfekovaný génom kódujúcim glykoproteín, takže sa exprimujú rekombinantné glykoproteíny.
    31765ns/H • ·· · ·· ·· · ·· · · ·· · · · · ·· ··· · · · · · · • ··· · ····»· · ·ΐ· »Jiáhra^fié*9tfana *··’ ···
  22. 22. Spôsob výroby rekombinantných humánnych glykoproteínov, vyznačujúci sa tým, že systém podľa nároku 16 alebo 17 alebo rastliny alebo hmyz poprípade bunky, ktoré boli pripravené postupom podľa nároku 20, je (sú) transfekovaný génom kódujúcim glykoproteín, takže sa exprimujú rekombinantné glykoproteíny.
  23. 23. Spôsob výroby rekombinantných humánnych glykoproteínov na použitie v medicíne, vyznačujúci sa tým, že systém podľa nároku 16 alebo 17 alebo rastliny alebo hmyz poprípade bunky, ktoré boli pripravené postupom podľa nároku 20, je (sú) transfekovaný génom kódujúcim glykoproteín, takže sa exprimujú rekombinantné glykoproteíny.
  24. 24. Spôsob selekcie molekúl DNA kódujúcich GlcNAc-a1,3-fukozyltransferázu zo vzorky, vyznačujúci sa tým, že sa ku vzorke pridajú molekuly DNA podľa nároku 7, ktoré sa naviažu na molekuly DNA kódujúce GlcNAc-a1,3fukozyltransferázu.
  25. 25. Spôsob podľa nároku 24, vyznačujúci sa tým, že vzorka zahrnuje genómovú DNA organizmu rastliny poprípade hmyzu.
  26. 26. Molekuly DNA kódujúce GlcNAc-a1,3-fukozyltransferázu, vyznačujúce sa tým, že boli selektované postupom podľa nároku 24 alebo 25 a následne boli izolované zo vzorky.
SK1118-2001A 1999-02-18 2000-02-17 Gén na fukozyltransferázu SK286416B6 (sk)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AT0027099A AT408446B (de) 1999-02-18 1999-02-18 Fucosyltransferase-gen
PCT/AT2000/000040 WO2000049153A1 (de) 1999-02-18 2000-02-17 Fucosyltransferase-gen

Publications (2)

Publication Number Publication Date
SK11182001A3 true SK11182001A3 (sk) 2002-01-07
SK286416B6 SK286416B6 (sk) 2008-09-05

Family

ID=3486087

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK1118-2001A SK286416B6 (sk) 1999-02-18 2000-02-17 Gén na fukozyltransferázu

Country Status (29)

Country Link
US (3) US20080234471A1 (sk)
EP (3) EP1642979A1 (sk)
JP (2) JP5514386B2 (sk)
KR (1) KR20010108234A (sk)
CN (1) CN1360633A (sk)
AT (2) AT408446B (sk)
AU (1) AU771995B2 (sk)
BG (1) BG65140B1 (sk)
BR (1) BR0010114A (sk)
CA (1) CA2362964C (sk)
CZ (2) CZ308081B6 (sk)
DE (1) DE50011116D1 (sk)
DK (2) DK2062977T3 (sk)
EE (1) EE200100432A (sk)
ES (2) ES2246222T3 (sk)
HR (1) HRP20010681A2 (sk)
HU (1) HU230075B1 (sk)
IL (2) IL144777A0 (sk)
IS (1) IS6041A (sk)
MX (1) MXPA01008372A (sk)
NO (1) NO20013993L (sk)
NZ (1) NZ513685A (sk)
PL (2) PL205785B1 (sk)
PT (1) PT2062977E (sk)
SK (1) SK286416B6 (sk)
TR (1) TR200102393T2 (sk)
WO (1) WO2000049153A1 (sk)
YU (1) YU58901A (sk)
ZA (1) ZA200106735B (sk)

Families Citing this family (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU771908C (en) 1998-12-09 2005-03-10 Phyton Holdings, Llc A method for manufacturing glycoproteins having human-type glycosylation
AT408446B (de) * 1999-02-18 2001-11-26 Altmann Friedrich Dr Fucosyltransferase-gen
ES2571230T3 (es) 1999-04-09 2016-05-24 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd Procedimiento para controlar la actividad de una molécula inmunofuncional
IL149271A0 (en) 1999-10-26 2002-11-10 Plant Res Int Bv Mammalian-type glycosylation in plants
US6946292B2 (en) 2000-10-06 2005-09-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity
ZA200306406B (en) 2001-01-19 2004-09-06 Dow Chemical Co Method for secretory production of glycoprotein having human-type sugar chain using plant cell.
NZ534881A (en) 2002-03-19 2006-09-29 Plant Res Internat B Mammalian GnTIII expression in plants
KR101196023B1 (ko) 2002-03-19 2012-10-30 스티칭 디엔스트 랜드보위쿤디그 온데조에크 식물에서 글리칸 프로세싱의 최적화
AU2003236020B2 (en) * 2002-04-09 2009-03-19 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Cell with depression or deletion of the activity of protein participating in GDP-fucose transport
CL2003002461A1 (es) 2002-11-27 2005-01-07 Dow Chemical Company Agroscien Inmunoglobulina que comprende al menos un glicano afucosilado, composicion que la contiene, secuencia nucleotidica y vector que la comprende, procedimiento para producir dicha inmunoglobulina en plantas.
EP1510584B1 (en) 2003-08-11 2009-03-18 Greenovation Biotech GmbH Expression promoting sequences from mosses and their uses
FI20055398A0 (fi) 2005-07-08 2005-07-08 Suomen Punainen Risti Veripalv Menetelmä solupopulaatioiden evaluoimiseksi
AU2007205935B2 (en) 2006-01-17 2013-07-11 Synthon Biopharmaceuticals B.V. Compositions and methods for humanization and optimization of N-glycans in plants
US20090060921A1 (en) * 2006-01-17 2009-03-05 Biolex Therapeutics, Inc. Glycan-optimized anti-cd20 antibodies
CN102094020B (zh) * 2007-01-15 2012-11-28 燕秋 用于抑制LeY糖抗原合成的岩藻糖基转移酶I的RNA干涉序列及重组干涉质粒
CN102094019B (zh) * 2007-01-15 2012-11-28 燕秋 用于抑制LeY糖抗原合成的岩藻糖基转移酶Ⅳ的RNA干涉序列及重组干涉质粒
AU2008237632B2 (en) 2007-04-17 2014-01-16 Stichting Dienst Landbouwkundig Onderzoek Mammalian-type glycosylation in plants by expression of non-mammalian glycosyltransferases
JP5766947B2 (ja) * 2007-09-07 2015-08-19 チルドレンズ ホスピタル メディカル センター 臨床サンプルにおける分泌性のルイス抗原およびシアル化抗原のレベルの疾患リスクの予測指標としての使用
US20100242128A1 (en) * 2007-10-31 2010-09-23 Bayer BioSceince NV Method to produce modified plants with altered n-glycosylation pattern
EP2166085A1 (en) 2008-07-16 2010-03-24 Suomen Punainen Risti Veripalvelu Divalent modified cells
ES2663627T3 (es) 2010-10-11 2018-04-16 Jennewein Biotechnologie Gmbh Fucosiltransferasas novedosas y sus aplicaciones
KR101293658B1 (ko) * 2010-12-30 2013-08-07 대한민국 알파-1,3-푸코실트랜스퍼라아제 및/또는 베타-1,2-자일로실트렌스퍼라아제 유전자를 포함하는 벼 형질전환용 벡터 및 형질전환된 벼
ES2439507T3 (es) * 2011-01-20 2014-01-23 Jennewein Biotechnologie Gmbh Fucosiltransferasas novedosas y sus aplicaciones
EP2789686A1 (en) 2013-04-11 2014-10-15 Greenovation Biotech GmbH Expression of phosphorylated glycoproteins in plants
EP3050973A1 (en) * 2015-01-30 2016-08-03 Jennewein Biotechnologie GmbH Fermentation process for producing monosaccharides in free form from nucleotide-activated sugars
CN110317799A (zh) * 2019-07-18 2019-10-11 江南大学 一种人源岩藻糖转移酶8的原核表达方法及其产品
EP3871687A1 (en) 2020-02-27 2021-09-01 eleva GmbH Enzyme replacement therapy for treating pompe disease

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5272066A (en) 1986-03-07 1993-12-21 Massachusetts Institute Of Technology Synthetic method for enhancing glycoprotein stability
JP3756946B2 (ja) 1993-03-29 2006-03-22 協和醗酵工業株式会社 α１，３−フコシルトランスフェラーゼ
US6509149B2 (en) * 1995-06-06 2003-01-21 Hybridon, Inc. HPV-specific oligonucleotides
US5770420A (en) * 1995-09-08 1998-06-23 The Regents Of The University Of Michigan Methods and products for the synthesis of oligosaccharide structures on glycoproteins, glycolipids, or as free molecules, and for the isolation of cloned genetic sequences that determine these structures
AT408446B (de) * 1999-02-18 2001-11-26 Altmann Friedrich Dr Fucosyltransferase-gen

Also Published As

Publication number Publication date
US8895806B2 (en) 2014-11-25
EP2062977A1 (de) 2009-05-27
EP1642979A1 (de) 2006-04-05
DK2062977T3 (da) 2014-04-07
CZ299622B6 (cs) 2008-09-24
IL144777A (en) 2007-12-03
NO20013993D0 (no) 2001-08-16
EP2062977B1 (de) 2014-01-08
PL363438A1 (en) 2004-11-15
HRP20010681A2 (en) 2003-08-31
WO2000049153A1 (de) 2000-08-24
AU2646000A (en) 2000-09-04
NO20013993L (no) 2001-10-17
AU771995B2 (en) 2004-04-08
JP2002536978A (ja) 2002-11-05
US20130212740A1 (en) 2013-08-15
CA2362964C (en) 2012-03-27
JP5514386B2 (ja) 2014-06-04
BG65140B1 (bg) 2007-03-30
IS6041A (is) 2001-08-08
EE200100432A (et) 2002-12-16
PL205785B1 (pl) 2010-05-31
BR0010114A (pt) 2002-06-04
KR20010108234A (ko) 2001-12-07
HUP0200394A3 (en) 2006-06-28
IL144777A0 (en) 2002-06-30
SK286416B6 (sk) 2008-09-05
AT408446B (de) 2001-11-26
JP2011120592A (ja) 2011-06-23
US8198078B2 (en) 2012-06-12
BG105899A (en) 2002-12-29
EP1151109B1 (de) 2005-09-07
ES2444126T3 (es) 2014-02-24
DK1151109T3 (da) 2006-01-16
ATE304053T1 (de) 2005-09-15
CZ308081B6 (cs) 2019-12-27
US20080234471A1 (en) 2008-09-25
PT2062977E (pt) 2014-04-07
CA2362964A1 (en) 2000-08-24
DE50011116D1 (en) 2005-10-13
EP1151109A1 (de) 2001-11-07
ES2246222T3 (es) 2006-02-16
HU230075B1 (hu) 2015-06-29
YU58901A (sh) 2004-03-12
HUP0200394A2 (hu) 2002-05-29
CZ20012943A3 (cs) 2002-04-17
NZ513685A (en) 2001-09-28
US20090199306A1 (en) 2009-08-06
MXPA01008372A (es) 2003-06-06
CN1360633A (zh) 2002-07-24
ZA200106735B (en) 2002-08-15
ATA27099A (de) 2001-04-15
PL205710B1 (pl) 2010-05-31
TR200102393T2 (tr) 2002-04-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US8895806B2 (en) Fucosyl transferase gene
US20070186311A1 (en) BETA 1,2-xylosyltransferase-gene from arabidopsis

Legal Events

Date Code Title Description
MK4A Patent expired

Expiry date: 20200217