CZ299622B6 - Molekula DNA kódující fukosyltransferázu - Google Patents

Molekula DNA kódující fukosyltransferázu Download PDF

Info

Publication number
CZ299622B6
CZ299622B6 CZ20012943A CZ20012943A CZ299622B6 CZ 299622 B6 CZ299622 B6 CZ 299622B6 CZ 20012943 A CZ20012943 A CZ 20012943A CZ 20012943 A CZ20012943 A CZ 20012943A CZ 299622 B6 CZ299622 B6 CZ 299622B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
plant
fucosyltransferase
dna molecule
sequence
glcnac
Prior art date
Application number
CZ20012943A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ20012943A3 (cs
Inventor
Altmann@Friedrich
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=3486087&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=CZ299622(B6) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed filed Critical
Publication of CZ20012943A3 publication Critical patent/CZ20012943A3/cs
Publication of CZ299622B6 publication Critical patent/CZ299622B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12N9/1051—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/18—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a glycosyl transferase, e.g. alpha-, beta- or gamma-cyclodextrins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/005—Glycopeptides, glycoproteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8218—Antisense, co-suppression, viral induced gene silencing [VIGS], post-transcriptional induced gene silencing [PTGS]

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

Rešení se týká molekuly DNA, která obsahuje SEKVENCI ID. C. 1 s otevreným ctecím rámcem od páru bází 211 do páru bází 1740, nebo je alespon z 50 % homologní s touto sekvencí, nebo s ní hybridizuje zastringentních podmínek, nebo obsahuje sekvenci k ní degenerovanou z duvodu degenerace genetického kódu, kterážto sekvence kóduje rostlinný protein s fukosyltransferázovou aktivitou nebo je k této sekvenci komplementární. Dále se týká polynukleotidu kódujícího fukosyltransferázu. Rovnež se týká cástecných sekvencí takového polynukleotidu a také vektoru obsahujícího tyto polynukleotidy, rekombinantních hostitelských bunek, rostlin a hmyzu transfekovaných polynukleotidy nebo DNA z nich odvozenou.

Description

(57) Anotace:
Řešení se týká molekuly DNA, která obsahuje SEKVENCI ID. C. 1 s otevřeným čtecím rámcem od páru bází 211 do páru bází 1 740, nebo je alespoň z 5 0 % homologní s touto sekvencí, nebo s ní hybridizuje za stringentních podmínek, nebo obsahuje sekvenci k ní degenerovanou z důvodu degenerace genetického kódu, kterážto sekvence kóduje rostlinný protein s fukosyltransferázovou aktivitou neboje k této sekvenci komplementární. Dále se týká polynukleotidu kódujícího fukosyltransferázu. Rovněž se týká částečných sekvencí takového polynukleotidu a také vektoru obsahujícího tyto polynukleotidy, rekombinantních hostitelských buněk, rostlin a hmyzu transfekovaných polynukleotidy nebo DNA z nich odvozenou.
Molekula DNA kódující fukosyltransferázu
Oblast techniky
Předkládaný vynález se týká polynukleotidu kódujícího fukosyltransferázu. Dále se vynález týká částečných sekvencí takového polynukleotidu a také vektoru obsahujícího tyto polynukleotidy, rekombinantních hostitelských buněk, rostlin a hmyzu transfekovaných polynukleotidy podle vynálezu nebo DNA z nich odvozenou.
Dosavadní stav techniky
Glykoproteiny vykazují značnou různorodost a složitost sacharidových složek, přičemž složení a uspořádání sacharidů je vždy charakteristické pro různé organismy. Oligosacharidové jednotky glykoproteinů mají různé úkoly, jsou např. důležité pro regulaci metabolismu, podílejí se na mezibuněčných interakcích typu buňka-buňka, určují biologický poločas proteinu v oběhu a mají rozhodující význam pro rozpoznávání epitopů v reakci antigenů s protilátkou.
Glykosylace glykoproteinu začíná v endoplazmatickém retikulu (ER), kde jsou oligosacharidy navázány buďto na postranní řetězce asparaginu N-glykosidickými vazbami nebo na postranní řetězce šeřinu nebo threoninu O-glykosidickými vazbami.
N-vázané oligosacharidy obsahují společné jádro z pentasacharidové jednotky složené ze tří manéžových a dvou N-acetylglukosaminových zbytků. Pro další modifikaci cukerné složky jsou glykoproteiny transportovány z ER do Golgiho komplexu. Struktura N-vázaných oligosacharidových jednotek glykoproteinů je určována jejich konformací a také složením glykosyltranferáz v kompartmentů Golgiho komplexu, kde dochází k vlastnímu „opracování“.
Bylo ukázáno, že pentasacharidová jednotka tvořící jádro vyskytující se v Golgiho komplexu některých rostlinných a hmyzích buněk je substituována xylózou a a-1,3 vázanou fukózou (P. Lerouge a kol., 1998, Planí Mol. Biol. 38, 31-48, Rayon a kol., 1998, J. Exp. Bot. 49, 1463— 1472). Heptasacharid „MMXF3“ představuje hlavní typ oligosacharidu v rostlinách (Kurosaka a kol, 1991, J. Biol. Chem. 266, 4168-4172). Takže např. peroxidáza křenu, β-fruktosidáza mrkve a Erythrina cristagalli obsahují lektin a fosfolipáza A2 z včelího jedu nebo glykoproteiny membrány neuronů hmyzích embryí a—1,3—fukózové zbytky vázané na glykanové jádro. Tyto struktury se také nazývají komplexní N-glykany nebo manóza-deficitní nebo případně zkrácené Nglykany. α-manosylové zbytky mohou být dále nahrazeny GlcNAc, na který je navázána galaktóza a fukóza, takže se připraví struktura, která odpovídá humánnímu epitopu Lewis-a (Melo a kol, FEBS Lett. 415, 186-191, Fitchette-Laine a kol, 1997, PlantJ. 12, 1411-1417).
Ani xylóza ani al,3-vázaná fukóza se nevyskytují u savců ve formě glykoproteinu. Bylo zjištěno, že al,3-fukóza jádra (tj. pentasacharidové jednotky) hraje důležitou roli v rozpoznávání epitopu protilátek namířených proti rostlinným a hmyzím N-vázaným oligosacharidům (I.B.H.
Wilson a kol., Glycobiology Vol. 8, No. 7, pp. 651-661, 1998), a tím u člověka nebo zvířete spouštějí imunitní reakci proti těmto oligosacharidům. al,3-fukózový zbytek je zřejmě jednou z hlavních příčin rozšířené alergické zkřížení reaktivity mezi různými rostlinnými a hmyzími alergeny (Tretter a kol., Int. Arch. Allergy Immunol. 1993; 102:259-266) a také proto se nazývá „zkříženě-reaktivní sacharidová determinanta“ (CCD, „cross-reactive carbohydrate determi50 nant“). Ve studii zkoumající epitopy rajčat a pylu trav byly nalezeny zbytky al,3-vázané fukózy jako společná determinanta, což se zdá být důvodem, proč se často u pacientů objevují alergie na rajčata a pyl z trav (Petersen a kol., 1996, J. Allergy Clin. Immunol., Vol. 98, 4; 805-814). Vzhledem k častému výskytu imunologických zkřížených reakcí CCD navíc komplikují diagnózu alergií.
-1 CZ 299622 B6
Imunologické reakce spouštěné v lidském těle rostlinnými proteiny představují hlavní problém při léčebném využití rekombinantních humánních proteinů produkovaných v rostlinách. Aby se zabránilo těmto problémům, musí se zabránit al,3-fukosylaci jádra. V předložené studii se uka5 zuje, že oligosacharidy obsahující L-galaktózu místo L-fukózy (6-deoxy-L-galaktóza) jsou přesto plně biologicky aktivní (E. Zablackis a kol., 1996, Science, Vol. 272). Podle jiné studie byla izolována mutanta Arabidopsis thaliana, ve které chybí N-acetyl-glukosaminyltransferáza I, první enzym v biosyntéze komplexních glykanů. Biosyntéza komplexních glykoproteinů v této mutantě je narušena. Nicméně tyto mutované rostliny jsou schopny za jistých podmínek normálio ního vývoje (A. Schaewen a kol., 1993, Plant Physiol. 102; 1109-1118).
Pro cílené blokování jádro-al,3-fukózové vazby v oligosacharidu bez narušení jiných glykosylačních kroků, musí být inaktivován pouze tento enzym, který je přímo zodpovědný za tuto specifickou glykosylaci, tj. enzym jádro-al,3-fukosyltransferáza. Byl izolován a charakterizován poprvé z fazolu mungo, a bylo také zjištěno, že aktivita tohoto enzymu je závislá na přítomnosti neredukujících konců GlcNAc (Staudacher a kol., 1995, Glycoconjugate J. 12, 780-786). Tato transferáza, která se vyskytuje pouze v rostlinách a hmyzu, avšak nikoliv v člověku nebo jiných obratlovcích, by musela být cíleně inaktivována nebo potlačena, aby humánní proteiny produkované v rostlinách nebo rostlinných buňkách, případně v hmyzu nebo hmyzích buňkách, již dále neobsahovaly tento epitop vyvolávající imunitní reakci, jako je tomu dosud.
Publikovaný článek John M. Burke „Clearing the way for ribozymes“ (Nátuře Biotechnology 15:414-415; 1997) se týká obecných funkcí ribozymů.
Článek Pooga a kol., „Cell penetrating PNA constructs regulate galanin receptor levels and modify pain transmission in vivo (Nátuře Biotechnology 16:857-861; 1998) se týká obecně molekul PNA a specificky takové molekuly PNA, kteráje komplementární k mRNA humánního galaninovému receptoru typu 1.
Patent US 5 272 066 se týká způsobu změny eukaryotických a prokaryotických proteinů, která vede k prodloužení doby jejich cirkulace in vivo. V tomto případě jsou navázané oligosacharidy změněny pomocí různých enzymů, knimž patří také např. GlcNAc-al-»3(4)-fukosyltransferáza.
Patent EP 0 643 132 A1 se týká klonování al,3-fukosyl-transferázy izolované z humánních buněk (THP-1). Sacharidové řetězce popsané v tomto patentu odpovídají humánním sialyl— Lewis x- a sialyl-Lewis a-oligosacharidům. Specifita enzymu z humánních buněk je zcela odlišná od specifíty fukosyltransferázy z rostlinných buněk.
Cílem předkládaného vynálezu je klonování a sekvencování genu, který kóduje rostlinnou fukosyltransferázu, a dále příprava vektorů, které obsahují tento gen, jeho DNA fragmenty nebo jeho změněnou DNA nebo DNA z něho odvozenou, pro transfekci rostlin nebo hmyzu nebo jejich buněk, s cílem, aby produkovaly glykoproteiny, které neobsahují normálně se vyskytující otl,3jádro-fukózu, a také odpovídající způsoby přípravy.
Podstata vynálezu
Předmětem předkládaného vynálezu je molekula DNA obsahující sekvenci uvedenou zde jako
SEKVENCE ID. Č. 1 (v popisu vynálezu je užit kód IUPAC, kde „N“ znamená inosin), s otevřeným čtecím rámcem od párů bází 211 do 1740, neboje alespoň z 50 % identická s uvedenou sekvencí nebo s ní hybridizuje za stringentních podmínek, nebo obsahuje sekvenci k ní degenerovanou díky degeneraci genetického kódu, přičemž sekvence kóduje rostlinný protein, který má fukosyltransferázovou aktivitu, neboje k této sekvenci komplementární.
-2CZ 299622 B6
Tato sekvence, která nebyla dosud popsána, je užitečná pro použití v jakémkoliv experimentu, analýze nebo výrobním způsobu, které se týkají rostlinné fukosyltransferázové aktivity. Požadovanými produkty jsou zde sama DNA sekvence a také protein kódovaný touto sekvencí. Avšak také zejména sekvence DNA, která může být použita k inhibici fukosyltransferázové aktivity.
Otevřený čtecí rámec SEKVENCE ID. Č. 1 kóduje protein s 510 aminokyselinami s teoretickou molekulovou hmotností 56 800 (Da), s předpokládanou transmembránovou doménou v úseku mezi Asn36 a Gly54. Vypočtená hodnota pl proteinu kódovaného SEKVENCÍ ID. Č. 1 je 7,51.
ío Aktivita rostlinné fukosyltransferázy se detekuje a měří tak, že se fukosyltransferáza přidá ke vzorku obsahujícímu značenou fukózu a akceptor (např. glykoprotein) navázaný na nosič jako je např. Sepharose. Po reakční době je vzorek promyt a měří se obsah navázané značené fukózy. Aktivita fukosyltransferázy je v takovém případě pozitivní, pokud je měřená aktivita alespoň o 10 až 20 %, zejména o alespoň 30 až 50 %, vyšší než aktivita změřená v negativní kontrole. Struktu15 ra glykoproteinů může být navíc verifikována užitím HPLC. Takové postupy jsou známy ze stavu techniky (Staudacher a kol. 1998, Anal. Biochem. 246, 96-101; Staudacher a kol. 1991, Eur. J. Biochem. 199, 745751).
Např. fukosyltransferáza se smíchá se vzorkem obsahujícím radioaktivně značenou fukózu a akceptor, např. GlcNAcpi-2Manal-3(GlcNapi-2Manal-6)Manpi-4GlcNAcpi-4GlcNAcpiAsn. Po reakci je vzorek purifikován aniontovou iontoměničovou chromatografií a měří se obsah navázané fukózy. Z rozdílu naměřené radioaktivity vzorku s akceptorem a negativní kontroly bez akceptoru může být vypočtena aktivita. Aktivita fukosyltransferázy je hodnocen jako pozitivní, když je naměřená radioaktivita alespoň o 30 až 40 % vyšší než radioaktivita změřená u negativ25 ního vzorku.
Párování (hybridizace) dvou DNA molekul se může měnit výběrem teploty a iontové síly vzorku. Stringentními podmínkami se podle vynálezu rozumí podmínky, které dovolují přesnou, stringentní vazbu (hybridizaci). Např. DNA molekuly jsou hybridizovány v roztoku 7% dodecylulfátu sodného (SDS), 0,5M NaP04, pH 7,0, lMm EDTA při 50 °C, a promývány v 1 % SDS při 42 °C.
Zda má sekvence alespoň 50% homologii se SEKVENCÍ ID. Č. 1 může být určeno např. pomocí programu FastDB z genové databanky EMBL nebo SWISSPROT.
Výhodně sekvence DNA molekuly podle vynálezu kóduje protein s aktivitou GlcNAc-al,3fukosyltransferázy, zejména s aktivitou jádro-al,3-fukosyltransferázy.
Jak již bylo zmíněno výše, jádro al,3-fukosyltransferázy je přítomné v rostlinách a hmyzu, avšak nevyskytuje se v lidském těle, takže sekvence DNA podle vynálezu je zejména užitečná pro experimenty a analýzy, a také pro způsoby výroby týkající se fukosyltransferázy.
Termínem jádro-al,3-fukosyltransferáza je v předkládaném vynálezu označována zejména GDP-L-Fuc:Asn-vázaná GlcNAc-al,3-fukosyltransferáza. Ve smyslu předkládaného vynálezu termín ccl,3-fukosyltransferáza vždy znamená jádro-a 1,3 fukosyl-transferáza. Pro výše zmíněná měření aktivity se užívají zejména akceptory mající neredukující GlcNAc konec. K takovým akceptorům patří např. GlcNAcpi-2Manal-3(GlcNAcpi-2Manal-6)Manpi-4GlcNAcpi4GlcNAcpi-Asn, GlcNAcpl-2Manal-3(GlcNAcpl-2Manal-6)Manpl-4GlcNAcpi 14(Fucal-6)GlcNAcpi-Asn a GlcNAcpl-2Manal-3[Manocl-3(Manal-6)Manal-6]Manpi4GlcNAcpi-4GlcNAcpi-Asn. Zdaje fukóza navázána nebo ne může být dále stanoveno měře50 ním necitlivosti vůči N-glykosidáze F, kterou je možné detekovat hmotovou spektrometrií.
Výhodně molekula DNA podle vynálezu obsahuje alespoň 70 až 80%, zvláště výhodně alespoň 95%, identitu se SEKVENCÍ ID. Č. 1. Tato sekvence kóduje zvláště aktivní GlcNAc-al,3-fukosyltransferázu.
-3 CZ 299622 B6
Jelikož sekvence DNA může být více či méně změněna v závislosti na rostlině nebo hmyzu, sekvence podle vynálezu mající např. 70% identitu se SEKVENCÍ ID. Č. 1 má také fukosyltransferázovou aktivitu, která je dostatečná pro použití v analýzách, experimentech nebo způsobech podle vynálezu.
V dalším výhodném provedení molekula DNA podle vynálezu obsahuje 2 150 až 2 250, zejména 2 198 párů bází. Tato DNA molekula obsahuje 100 až 300, výhodně 210, párů bází ve směru „upstream“ (proti směru transkripce) před startovacím kodonem, a také 350 až 440, zejména 458, ío párů bází ve směru „downstream“ (po směru transkripce) za stop kodonem otevřeného čtecího rámce, přičemž koncový úsek DNA molekuly výhodně obsahuje 3'-poly(A) úsek. Tímto způsobem je zajištěna bezchybná regulace translace a je tak poskytnuta DNA molekula, která je zvláště účinná a bezproblémová pro kódování aktivní GlcNAc-al,3-fukosyltransferázy.
Předkládaný vynález se dále týká molekuly DNA, která obsahuje SEKVENCI ID. C. 3 nebo obsahuje sekvenci, která má alespoň 85%, výhodně alespoň 95%, zvláště vhodně alespoň 99%, identitu s výše uvedenou sekvencí, nebo která za stringentních podmínek hybridizuje s výše uvedenou sekvencí, nebo která je, díky degeneraci genetického kódu, degenerovanou sekvencí vzhledem k sekvenci výše uvedené. Identita se výhodně určuje pomocí počítačového programu, který rozpoznává inzerce a delece a neuvažuje je při výpočtu identity. Tato nukleotidová sekvence kóduje konzervativní (kanonický) peptidový motiv, což znamená, že všechny aktivní a funkční GlcNAc-al,3-fukosyltransferázy obsahují aminokyselinovou sekvenci kódovanou touto nukleotidovou sekvencí. V takovém případě má sekvence buďto stejnou velikost jako SEKVENCE ID.
C. 3, nebo může být, přirozeně, delší. Tato sekvence je kratší než sekvence kódující celý protein, a tudíž je méně náchylná k rekombinaci, delecím nebo jiným typů mutací. Vzhledem ke konzervativnosti motivu a vyšší stabilitě sekvence je tato sekvence zvláště výhodná pro testy rozpoznávání sekvence.
SEKVENCE ID. Č. 3 obsahuje následující sekvenci:
SOAAGCCCTGAAGCACTACAAAITTAGCTTAGCGTTTGAAAATTCGA
ATGAGGAAGATTATGTAACTGAAAAATTCTTCCAATCCCTTGTTGCT
GGAACTGTCCCT-3'
Další aspekt předkládaného vynálezu se týká molekuly DNA, která obsahuje část sekvence výše uvedené molekuly DNA a má velikost 20 až 200, výhodně 30 až 50, párů bází. Tato moleku35 la DNA může být využita, např. jako sonda vázající se na komplementární sekvenci GlcNAcotl,3-fukosyltransferázy, aby mohla být identifikována ve vzorku. Takto je možné najít, identifikovat a pak izolovat další GlcNAc-al,3-fukosyltransferázy z mnoha různých druhů rostlin a hmyzu. Jakákoliv požadovaná část nebo také několik různých částí sekvence se může užít, zejména části sekvence výše zmíněného konzervativního motivu.
Při takovém postupu je zvláště výhodné, když jedna z výše uvedených molekul DNA je kovalentně navázaná na detekovatelnou značící látku. Jako značící látka se může užít jakýkoliv obecně známý markér (značka), jako např. fluorescenční nebo luminiscenční markér, radioaktivní markéry nebo neizotopové markéry jako je např. biotin atd. Takto se tedy připraví činidla vhodná pro detekci, selekci a kvantifikaci odpovídajících molekul DNA ve vzorcích pevné tkáně (např. rostlinného pletiva) nebo v tekutých metodou hybridizace.
Další aspekt předkládaného vynálezu se týká biologicky funkčního vektoru, který obsahuje jednu z výše uvedených molekul DNA nebo její část různých délek alespoň však 20 párů bází. Pro transfekci do hostitelské buňky je nutný nezávislý vektor schopný amplifikace, přičemž vhodný vektor se vybere v závislosti na hostitelské buňce, mechanismu transfekce, funkci a velikosti
-4CZ 299622 B6 molekuly DNA. Jelikož je známo velké množství vektorů, jejich výčet by přesahoval nutný rámec popisu vynálezu, mj. také proto, že tyto vektory jsou oborníkům dobře známy (pokud jde o vektory a také metody molekulární biologie a termíny užívané v této přihlášce, které jsou odborníkům známy, viz laboratorní příručka Sambrook a Maniatis). V ideálním případě je vektor molekula malé relativní molekulové hmotnosti a obsahuje selektovatelné geny, které by vedly ke snadno rozpoznatelnému fenotypu buňky, aby bylo možné snadno odlišit hostitelské buňky obsahující vektor a buňky, které vektor neobsahují. Aby bylo dosaženo vysokého výtěžku DNA a odpovídajícího genového produktu, vektor by měl obsahovat silný promotor, a také enhancer (zesilovač), signál pro amplifikaci genu a regulační sekvence. Kvůli autonomní replikaci vektoru je dále důležitý replikační počátek. Polyadenylační místa jsou zodpovědná za správné zpracování mRNA a sestřihové signály za RNA transkripty. Když jsou jako vektor užity fágy, viry nebo virové částice, sbalovací (pakážovací) signály řídí sbalování vektorové DNA. Např. pro transkripci v rostlinách jsou vhodnými vektory Ti plazmidy, pro transkripci v hmyzích buňkách bakuloviry, a v hmyzu transposony jako např. P element.
Jestliže je výše popsaný vektor podle vynálezu vnesen do rostliny nebo rostlinné buňky, dosáhne se post-transkripční suprese (potlačení) genové exprese endogenního genu otl,3-fukosyltransferázy transkripcí transgenu homologního k tomuto genu nebo jeho části v „senze“ orientaci. Tato technika „senze“ potlačení exprese byla popsána např. v publikacích Baucombe 1996, Plant. Mol.
Biol., 9:373-382 a Brigneti a kol., 1998, EMBO J. 17:6 739-6 746. Tato strategie umlčení genu je účinným způsobem utlumení exprese genu al,3-fukosyltransferázy, viz také např. Waterhouse a kol., 1998, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 95:13 959-13 964.
Předkládaný vynález se dále týká biologicky funkčního vektoru obsahujícího DNA molekulu podle některého z výše uvedených aspektů vynálezu nebo její části různé délky, a sice v opačné orientaci vzhledem k promotoru. Když je takový vektor transfekován do hostitelské buňky, dojde ke transkripci „antisenze mRNA“, která je komplementární kmRNA GlcNAc-al,3-fukosyltransferázy a vytváří s ní komplex. Tato vazba pak buďto zabrání správnému zpracování, transportu mRNA nebo poškodí její stabilitu nebo zabrání nasednutí ribozómů a tím zabrání translaci a tudíž normální expresi genu GlcNAc-al ,3-fukosyltransferázy.
Ačkoliv může být do vektoru vložena celá molekula DNA, vzhledem k menší velikosti je pro určité účely vhodné vložit jen část její sekvence. Pokud jde o antisenze účinek, je důležité, aby molekula byla dostatečně dlouhá na to, aby vytvořila dostatečně dlouhou antisenze mRNA, která se bude vázat na mRNA transferázy. Vhodná antisenze RNA molekula obsahuje např. 50 až 200 nukleotidů, jelikož mnoho známých přirozeně se vyskytujících antisenze RNA molekul obsahuje přibližně 100 nukleotidů.
Pro zvláště účinnou inhibici exprese aktivní al,3-fukosyltransferázy je vhodná kombinace senze a antisenze techniky (Waterhouse a kol., 1998, Proč. Nati. Acad. Sci., USA, 95:13 959-13 964).
Výhodně se užívají rychle hybridizující RNA molekuly. Účinnost antisenze RNA molekul, které mají velikost délku větší než 50 nukleotidů, závisí na kinetice nasedání (annealing) in vitro. Tudíž např. rychle nasedající antisenze RNA molekuly vykazují větší inhibici exprese proteinu než pomalu hybridizující RNA molekuly (Wagner a kol., 1994, Annu. Rev. Microbiol., 48:713— 742; Rittner a kol., 1993, Nucl. Acids Res., 21:1381-1387). Takové rychle hybridizující antisenze RNA molekuly zvláště obsahují velký počet externích bází (volné konce a spojovací sekvence), velký počet strukturních subdomén (složek) a současně malý počet smyček (Patzel a kol. 1998; Nátuře Biotechnology, 16; 64-68). Hypotetické sekundární struktury antisenze
RNA molekul mohou být např. určeny pomocí počítačového programu, který umožní vybrat vhodnou DNA sekvenci pro antisenze RNA.
Různé úseky sekvencí DNA molekul mohou být vloženy do vektoru. Jednou možností je vložit do vektoru pouze takovou část, která je zodpovědná za nasednutí ribozómů. Blokování v tomto
-5CZ 299622 B6 úseku mRNA je dostatečné k zastavení celé translace. Zvláště vysokou účinnost mají antisenze molekuly pro 5'- a 3'-netranslatované úseky genu.
Výhodně molekuly DNA podle vynálezu obsahují sekvence obsahující mutace typu delece, inzer5 ce a/nebo substituce. Počet mutovaných nukleotidů je proměnlivý a může se jednat o deleci inzerci nebo substituci jednoho až několika nukleotidů. Je také možné, že mutací dojde k posunu čtecího rámce. V takovém „knock-out“ genu (gen s vyřazenou funkcí) je důležité jen to, že exprese GlcNAc-al,3-fukosyltransferázy je narušena, aje tudíž zabráněno vytváření aktivního funkčního enzymu. Při takovém postupu je místo mutace v podstatě kdekoliv, pokud zabraňuje ío expresi enzymaticky aktivního proteinu. Výhodná je mutace v katalytickém úseku enzymu, který je lokalizován v C-koncovém úseku. Způsoby vnášení mutací do sekvencí DNA jsou odborníkům dobře známy a proto různé způsoby mutageneze nejsou podrobněji popisovány v přihlášce. V tomto případě se může užít náhodná nebo cílená mutageneze, zejména místně cílená mutageneze, oligonukleotidem řízená mutageneze, nebo mutageneze pomocí restrikčních enzymů.
Předkládaný vynález dále poskytuje molekulu DNA, která kóduje ribozym, který obsahuje dvě sekvenční části každou velikosti alespoň 10 až 15 párů bází, které jsou komplementární se částmi sekvence molekuly DNA podle vynálezu, takže ribozym vytváří komplex s a štěpí mRNA, která je transkribována z přírodní DNA molekuly kódující GlcNAc-al,3-fukosyltransferázu. Ribozym rozpoznává mRNA GlcNAc-al,3-fukosyltransferázy prostřednictvím komplementárního párování bází s mRNA. Tudíž ribozym štěpí a zcela destruuje RNA sekvenčně specifickým způsobem před tím, než dojde k translaci enzymu. Po dizociaci od naštěpeného substrátu ribozym opakovaně hybridizuje s molekulou RNA a působí jako specifická endonukleáza. Obecně řečeno, ribozymy mohou být specificky připravovány pro inaktivaci určitých mRNA, dokonce i v případě, kdy není známa celá DNA sekvence kódující protein. Ribozymy jsou zvláště účinné, když se ribozómy pohybují pomalu podél mRNA. V takovém případě je pro ribozym snazší najít místo na mRNA bez ribozómu. Z tohoto důvodu jsou některé mutanty s pomalými ribozómy také vhodné jako systémy pro ribozymy (J. Burke, 1997, Nátuře Biotechnology; 15, 414-415). Tato DNA molekula je zvláště výhodná pro snížení a případně inhibici exprese rostlinné GlcNAc30 ccl,3-fukosyltransferázy.
Jednou možností je také užít různé formy ribozymů, např. minizym. Minizymy jsou zvláště účinné pro štěpení delších molekul mRNA. Minizymje „kladívkovitý“ ribozym, který má krátký oligonukleotidový linker (spojku) místo stonku/smyčky II. Dimemí minizymy jsou zvláště účin35 né (Kuwabara a kol., 1998, Nátuře Biotechnology, 16; 961-965). Tudíž se předkládaný vynález týká také biologicky funkčního vektoru, který obsahuje jednu ze dvou výše zmíněných molekul DNA (mutovanou DNA molekulu nebo ribozym-DNA molekulu). Co bylo řečeno výše pokud jde o vektory platí také v tomto případě. Takový vektor může být např. vnesen do mikroorganismu a může být využit pro výrobu vysoké koncentrace výše popsaných molekul DNA. Dále je takový vektor zvláště vhodný pro vkládání specifické molekuly DNA do rostliny nebo do hmyzího organismu, aby se snížila nebo úplně inhibovala tvorba GlcNAc-al,3-fukosyltransferázy v těchto organizmech.
Předkládaný vynález poskytuje způsob přípravy cDNA obsahující molekulu DNA podle vynále45 zu, kdy se z hmyzí nebo rostlinné buňky, zejména z buněk hypokotylu, izoluje RNA, jejíž pomocí se po přidání reverzní transkriptázy a primerů provede reverzní transkripce. Jednotlivé kroky této metody jsou samy o sobě odborníkům známy. Reverzní transkripcí je možné na jedné straně připravit cDNA z celé mRNA pomocí oligo(dT) primerů, pak provést PCR reakci pomocí vybraných primerů, čímž se připraví molekula DNA obsahující gen GlcNAc-al,3-fukosyltransferázy.
Na druhé straně vybrané primery mohou být přímo užity pro reverzní transkripci, aby se získaly krátké specifické úseky cDNA. Vhodné primery se připraví synteticky, např. syntézou podle vzorce cDNA sekvencí transferázy. Využitím této metody mohou být rychle jednoduše připravena velká množství molekul cDNA podle vynálezu, sice jen s málo chybami.
-6CZ 299622 B6
Vynález se dále týká způsobu klonování GlcNAc-al,3-fukosyltransferázy, při kterém je molekula DNA podle vynálezu klonována do vektoru, který je po té transfekován do hostitelské buňky nebo hostitele, přičemž selekcí a amplifikaci transfekovaných hostitelských buněk se získají buněčné linie, které exprimují aktivní GlcNac-al,3—fukosyltransferázu, molekula DNA se vloží do vektoru pomocí restrikčních endonukleáz. Pro vektor platí, co již bylo uvedeno výše. Co je důležité při této metodě je to, aby byl vybrán účinný systém hostitel vektor. Pro získání aktivního enzymu jsou zvláště vhodné eukaryotické hostitelské buňky. Jednou z možností je transfekovat vektor do hmyzích buněk. Při této metodě musí být jako vektor užit hmyzí virus, např. bakulovirus.
Samozřejmě také humánní buňky a jiné buňky obratlovců mohou být transfekovány, přičemž v druhém případě pak buňky exprimují cizorodý enzym.
Výhodně vynález poskytuje způsob přípravy rekombinantních hostitelských buněk, zejména rostlinných nebo hmyzích buněk, nebo popřípadě rostlin nebo hmyzu, s potlačenou nebo úplně zastavenou tvorbou GlcNac-al,3-fukosyltransferázy, kterýžto způsob je charakterizován tím, že alespoň jeden z vektorů podle vynálezu, tj. vektor obsahující molekulu DNA podle vynálezu, molekulu mutované DNA nebo DNA molekulu kódující ribozymy nebo vektor obsahující DNA molekulu v inverzní orientaci vzhledem k promotoru, je vložena do hostitelské buňky nebo do rostliny nebo do hmyzu. Co bylo výše řečeno o transfekci je aplikovatelné také v tomto případě.
Jako hostitelské buňky se mohou např. užít rostlinné buňky, kde je využitelný Ti plazmid se systémem agrobaktéria (Agrobacterium). Pomocí Agrobacterium je možné přímo transfekovat rostliny: Agrobacterium způsobuje vznik kořenových hlízek (nádorů) u rostlin. Když Agrobacterium infikuje poraněnou rostlinu, pak samotné Agrobacterium nevstupuje do rostliny, ale přenáší do rostlinné buňky úsek rekombinantní DNA, tzv. T-DNA, z kruhového extrachromo-zomálního Ti-plazmidu, který indukuje tvorbu nádoru. T-DNA, a také molekula DNA do ní vložená, je vložena do chromozomální DNA buňky stabilním způsobem, takže geny z T-DNA jsou exprimovány v rostlině.
Existuje celá řada známých účinných transfekčních mechanismů pro různé hostitelské systémy. K příkladům patří elektroporace, kalciumfosfátová precipitace, mikroinjekce, využití liposomů apod.
Následně se transfekované buňky selektují, např. na základě rezistence k antibiotiku, jejíž gen je vložen také do vektoru, nebo pomocí jiného markerového genu. Pak se transfekované buněčné linie namnoží, buďto v malém množství např. na Petriho miskách, nebo ve velkých množstvích, např. ve fermentorech. Rostliny mají výjimečnou vlastnost, jsou totiž schopné nového vývoje z jediné (transfekované) buňky nebo případně z protoplastu, na celou rostlinu, která může být dále pěstována.
V závislosti na použitém vektoru dojde v hostiteli k tomu, že exprese enzymu bude potlačena nebo zcela zablokována:
Jestliže je transfekován vektor obsahující DNA molekulu s deleční, inzerční nebo substituční mutací, dojde k homologní rekombinací: mutovaná molekula DNA rozpozná identickou sekvenci v genomu hostitelské buňky, přestože obsahuje mutaci, a bude vložena přesně na shodné místo, takže vznikne „knock-out“ gen (nefunkční gen). Tímto způsobem se vnese mutace do genu pro GlcNAc-al,3-fukosyltransferázu, která je schopná inhibovat bezchybnou expresi GlcNAc50 al,3-fukosyltransferázy. Jak bylo již vysvětleno výše, při tomto způsobuje důležité, aby mutace dostatečně blokovala expresi aktivního proteinu. Po selekci a amplifikaci je možné gen sekvencovat jakožto dodatečnou kontrolu toho, že došlo úspěšně k homologní rekombinací nebo požadovanému stupni mutace.
-7CZ 299622 B6
Jestliže je transfekován vektor kódující ribozym, je v hostitelských buňkách exprimován aktivní ribozym. Ribozym vytváří komplexy s komplementární mRNA sekvencí GlcNAc-al,3-fukosyltransferázy alespoň v určitých místech a štěpí tato místa, a tímto způsobem může inhibovat translaci enzymu. V takových hostitelských buňkách nebo buněčných liniích nebo z nich případ5 ně získaných rostlin není GlcNAc-al,3-fukosyltransferáza exprimována.
V případě, že vektor obsahuje molekulu DNA podle vynálezu v senze orientaci nebo v inverzní orientaci vzhledem k promotoru, je v transfekovaných buňkách (případně rostlinách) exprimována senze mRNA nebo antisenze mRNA. Antisenze mRNA je komplementární alespoň k části sekvence mRNA GlcNAc-al,3-fukosyltransferázy a může podobně inhibovat translaci enzymu. Pro příklad způsobu potlačení exprese genu antisenze technikou odkazujeme na publikaci Smith a kol., 1990, Mol. Gen. Gent. 224:477-481, kde je popsána inhibice exprese genů zúčastněných v dozrávání rajčat.
Ve všech systémech je exprese GlcNAc-al,3-fukosyltransferázy alespoň utlumena, výhodně je dokonce zcela zablokována. Stupeň narušení genové exprese je závislý na míře komplexace, homologní rekombinace, na možných následných náhodných mutacích a na dalších procesech probíhajících v genomu. Transfekované buňky jsou testovány na přítomnost GlcNac-al,3-fukosyltransferázové aktivity a selektovány.
Navíc je možné ještě dále zesílit výše popsané potlačení (supresi) exprese al,3-fukosyltransferázy tím, že se do hostitele vnese vektor obsahující gen kódující savčí protein, např. β 1,4-galaktosyltransferázu, navíc k výše popsanému vektoru. Fukosylace může být redukována působením jiných savčích enzymů, kombinace inhibice exprese aktivní al,3-fukosyltransferázy pomocí vektorů podle vynálezu a použitím vektorů pro savčí enzym je zvláště účinná.
Pro transfekci může být užit jakýkoliv druh rostlin, např. fazol mungo, tabák, rajče a/nebo brambor.
Další výhodný způsob přípravy rekombinantních hostitelských buněk, zejména rostlinných nebo hmyzích buněk, spočívá v tom, že molekula DNA obsahující mutaci se vnese do genomu hostitelské buňky, nebo případně rostliny či hmyzu, na místo nemutované homologní sekvence (Schaefer a kol., 1997, Plant J.; 11(6): 1195-1206). Tato metoda tedy nepracuje s vektorem, ale s čistou molekulou DNA. Molekula DNA je vnesena do hostitele např. ostřelováním, mikro35 injekcí nebo elektroporaci, abychom uvedli alespoň tři příklady. Jak již bylo vysvětleno, molekula DNA se váže na homologní sekvenci v genomu hostitele, takže v genomu dojde k homologní rekombinací a výsledkem je, že do genomu je vložena deleční, inzerční nebo substituční mutace: exprese GlcNAc-al,3-fukosyltransferázy může být utlumena nebo úplně zablokována.
Další aspekt předkládaného vynálezu se týká rostlin nebo rostlinných buněk, a také hmyzu nebo hmyzích buněk, jejichž GlcNAc-al,3-fukosyltransferázová aktivita je nižší než 50 %, zejména nižší než 20 %, zvláště výhodně je 0 % GlcNAc-al,3-fukosyltransferázové aktivity v přírodních rostlinných buňkách nebo rostlinách a přírodních hmyzích buňkách nebo hmyzu. Výhodou tako45 vých rostlin nebo rostlinných buněk je to, že v nich vytvářené glykoproteiny neobsahují žádný nebo jen nepatrné množství al,3-vázané fukózy. Pokud produkty z těchto rostlin nebo hmyzu vstoupí do těla člověkem nebo jiného obratlovce, nedojde k žádné imunitní reakci na al,3-fukózový epitop.
Výhodně vynález poskytuje rekombinantní rostliny nebo rostlinné buňky, které byly připraveny jedním z výše uvedených způsobů, a u nichž byla tvorba GlcNAc-al,3-fukosyltransferázy utlumena nebo zcela blokována.
-8CZ 299622 B6
Předkládaný vynález se dále týká rekombinantního hmyzu nebo hmyzích buněk, které byly připraveny jednou z výše popsaných metod, a ve kterých je tvorba GlcNAc-al,3-fukosyltransferázy utlumena nebo zcela zablokována. Také v tomto případě se netvoří žádné glykoproteiny mající al,3-vázané fukózové zbytky, takže nedoje k imunitní reakci na al,3-fukózový epitop.
Předkládaný vynález se dále týká molekul PNA, které obsahují sekvenci bází komplementární k sekvenci molekul DNA podle vynálezu nebo její částečné sekvenci. PNA (peptidová nukleová kyselina) je sekvence podobná DNA, kde jsou nukleobáze vázané na pseudopeptidovou kostru. PNA obecně hybridizuje s komplementárními DNN-, RNN- nebo PNN-oligomery na principu
Watson-Crickova párování bází a vytváření šroubovice. Peptidová kostra zajišťuje větší odolnost vůči enzymatické degradaci. Molekuly PNA jsou proto zlepšenými antisenze činidly. Ani nukleázy ani proteázy nejsou schopné napadat molekuly PNA. Stabilita molekul PNA, jestliže jsou navázány na komplementární sekvenci, je založena na dostatečném sterickém blokování DNA a RNA polymerázy, reverzní transkriptázy, telomerázy a ribozomů.
Když molekula PNA obsahuje výše uvedené sekvence, váže se na DNA nebo případně na místa v DNA, kódující GlcNAc-al,3-fukosyltransferázu, a takovým způsobem je tato molekula schopna inhibovat transkripci tohoto enzymu. Jelikož není ani transkribována ani translatována, molekula PNA se připravuje synteticky, tj. postupem založeným na t-Boc. Výhodně je připrave20 na molekula PNA, která obsahuje sekvenci bází, odpovídající sekvenci molekuly DNA podle vynálezu nebo její částečné sekvenci. Molekula PNA vytváří komplex s mRNA nebo místem v mRNA pro GlcNAc-al,2-fukosyltransferázu, takže translace enzymu je inhibována. Argumenty podobně těm uvedeným pro antisenze RNA platí i v tomto případě. Tudíž zvláště účinným úsekem pro vytvoření komplexu je úsek translačního počátku nebo také 5'-netranslatovaný úsek mRNA.
Další aspekt předkládaného vynálezu se týká způsobu přípravy rostlin nebo hmyzu, nebo jejich buněk, zejména rostlinných nebo hmyzích buněk, u kterých je blokována expres GlcNAc-al,3fukosyltransferázy na úrovni transkripce nebo translace, který je charakterizován tím, že mole30 kuly PNA podle vynálezu jsou vložen do buňky. Pro vnesení molekuly nebo molekul PNA do buňky lze opět využít obvyklých postupů, které jsou odborníkovi známy, jako je např. elektroporace nebo mikroinjekce. Zvláště účinné je vneseni PNA oligomerů navázaných na peptidy penetrující do buňky, jako je např. transportan nebo pAntp (Pooga a kol., 1998, Nátuře Biotechnology, 16; 857-861).
Předkládaný vynález umožňuje přípravu rekombinantních glykoproteinů tak, že rekombinantní rostliny nebo rostlinné buňky podle vynálezu, nebo rekombinantní hmyz nebo hmyzí buňky, u nichž byla tvorba GlcNAc-al,3-fukosyltransferázy utlumena nebo zcela zablokována, nebo rostliny nebo hmyz, případně jejich buňky, do kterých byly vneseny molekuly PNA způsobem podle vynálezu, jsou transfekovány genem, který exprimuje glykoprotein, takže dochází k expresi rekombinantního glykoproteinu. Při tomto postupu, jak již bylo popsáno výše, vektory obsahující geny pro požadovaný protein jsou transfekovány do hostitele nebo hostitelských buněk, jak již bylo také výše popsáno. Transfekované rostlinné nebo hmyzí buňky pak exprimují požadovaný protein a přitom nemají žádnu nebo mají jen nepatrné množství al,3-vázané fukózy. Takže nevyvolávají imunitní reakce u člověka nebo obratlovce, jak již bylo uvedeno výše. V takových systémech může být produkován jakýkoliv protein.
Výhodně vynález umožňuje přípravu rekombinantních humánních glykoproteinů tak, že rekombinantní rostliny nebo rostlinné buňky, případně rekombinantní hmyz nebo hmyzí buňky, jejichž tvorba GlcNAc-al,3-fukosyltransferázy je potlačena nebo zcela zablokována, nebo rostliny nebo hmyz, nebo jejich buňky, do kterých byly vneseny molekuly PNA podle vynálezu, jsou transfekovány genem, který exprimuje glykoprotein, takže je exprimován rekombinantní glykoprotein. Tento způsob umožňuje produkovat v rostlinách (rostlinných buňkách) humánní proteiny, které po vstupu do lidského těla nevyvolávají žádnou imunitní reakci namířenou proti al,3-9CZ 299622 B6 vázaným fukózovým zbytkům. Takže je možné užívat k produkci rekombinantních glykoproteinů různé typy rostlin, které slouží např. jako potraviny, jako např. banány, brambory a/nebo rajčata. Pletiva těchto rostlin obsahují rekombinantní glykoprotein, takže tento rekombinantní glykoprotein je buďto z pletiv extrahován a následně podáván do lidského organismu, neboje podáván přímo konzumací rostlinných pletiv.
Výhodně vynález umožňuje přípravu rekombinantních humánních glykoproteinů pro farmaceutické/lékařské využití, kdy rekombinantní rostliny nebo rostlinné buňky podle vynálezu, nebo rekombinantní hmyz nebo hmyzí buňky podle vynálezu, jejichž tvorba GlcNAc-al,3-fukosyl10 transferázy je potlačena nebo zcela zablokována, nebo rostliny nebo hmyz, nebo jejich buňky, do kterých byly vneseny molekuly PNA podle vynálezu, jsou transfekovány genem, který exprimuje glykoprotein, takže je exprimován rekombinantní glykoprotein. Takto může být připraven jakýkoliv farmaceuticky/lékařsky zajímavý protein.
Další aspekt podle vynálezu se týká farmaceutického přípravku, který obsahuje glykoproteiny podle vynálezu. Kromě glykoproteinů podle vynálezu tento farmaceutický přípravek obsahuje další aditiva typická pro obdobné přípravky. Patří k nim např. vhodná ředidla s obsahem pH pufrujících látek (např. Tris-HCl, acetát, fosfát), látky ovlivňující iontovou sílu jako jsou tenzidy a solubilizační činidla (např. Tween 80, Polysorbate 80), konzervační látky (např. Thimerosal, benzylalkohol), adjuvans, antioxidanty (např. kyselina askorbová, siřičitan sodný), emulgátory a plnidla (např. laktóza, manitol). Účinná látka může být v přípravku kovalentnč vázaná na polymery, jako např. polyethylenglykol, na protein, vložena do částicového (partikulárního) přípravku polymemích sloučenin jako je např. kyselina polymléčná, kyselina polyglykolová atd., nebo do lipozomů. Přípravek dále může obsahovat pomocné látky a/nebo nosiče vhodné pro požadované léčení. Formulace do takových přípravků ovlivní fyzikální vlastnosti, stabilitu, in vivo rychlost uvolňování (liberaci) glykoproteinů podle vynálezu a in vivo exkreci.
Předkládaný vynález poskytuje dále způsob selekce molekul DNA, které kódující GlcNAc-a,3fukosyltransferázu, ve vzorku, kdy se smíchají se vzorkem značené molekuly DNA podle vyná30 lezu, které se váží na molekuly DNA kódující GlcNAc-al,3-fukosyltransferázu. Hybridizované molekuly DNA mohou pak být snadno detekovány, kvantifikovány a selektovány. V případě vzorku, který obsahuje jednořetězcovou molekulu DNA, se kterou může značená molekula DNA hybridizovat, se vzorek denaturuje např. zahřátím. Jednou možností je separovat testovanou DNA, případně po přidání endonukleáz, gelovou elektroforézou na agarózovém gelu. Po přene35 sení na nitrocelulózovou membránu značené molekuly DNA podle vynálezu, které byly přidány, hybridizují s odpovídajícími homologními molekulami DNA („Southern blotting“).
Další možná cesta spočívá v nalezení homologních genů jiných biologických druhů pomocí metod užívajících PCR pomocí specifických a/nebo degenerovaných primerů, navržených na základě sekvence molekuly DNA podle vynálezu.
Výhodně pro způsob identifikace podle vynálezu obsahuje genomovou DNA rostlinného nebo hmyzího organismu. Tímto způsobem lze testovat velmi rychle a účinně velký počet rostlin a hmyzu na přítomnost GlcNAc-al,3-fukosyltransferázového genu. Takto je také možné provádět selekci rostlin a hmyzu, které neobsahují tento gen, nebo utlumit či zcela zablokovat expresi GlcNAc-al,3-fukosyltransferázy v takových rostlinách nebo hmyzu, které obsahují tento gen, a sice výše popsaným způsobem podle vynálezu, takže se následně mohou užít pro transfekci a produkci (humánních) glykoproteinů.
Předkládaný vynález se dále týká molekul DNA kódujících GlcNAc-al,3-fukosyltransferázu, které byly selektovány jednou ze dvou výše zmíněných metod podle vynálezu a pak byly ze vzorku izolovány. Tyto molekuly mohou být užity pro další testování. Lze je sekvencovat a případně dále využít jako DNA sondy při hledání GlcNAc-al,3-fukosyltransferáz. Tyto značené
- 10CZ 299622 B6 molekuly DNA budou fungovat v organizmech, které jsou příbuzné s organizmy, ze kterých byly izolovány, mnohem účinněji než vlastní molekuly DNA podle vynálezu.
Další aspekt vynálezu se týká přípravy klonované GlcNAc-al,3-fukosyltransferázy podle vyná5 lezu, která obsahuje izoformy mající hodnotu pl mezi 6,0 a 9,0, zejména 6,8 až 8,2. pl hodnota proteinuje taková hodnota pH, kdy čistý náboj proteinu je nulový, a je závislá na aminokyselinové sekvenci, glykosylačnímu profilu a také na prostorové struktuře proteinu. GlcNAcal,3-fukosyltransferáza obsahuje alespoň 7 izoforem, které mají hodnotu pl v tomto rozmezí. Důvodem výskytu různých izoforem transferázy jsou např. různé glykosylace a také omezená ío proteolýza. Testy ukázaly, že různé semenáčky fazolu mungo mají různé profily izozymů. pl hodnota proteinu může být určena izoelektrickým fokusováním, což je odborníkům známo.
Hlavní izoforma enzymu má zjevnou molekulovou hmotnost 54 000 (Da).
Preparát podle vynálezu zejména obsahuje izoformy mající hodnoty pl 6,8, 7,1 a 7,6.
Předkládaný vynález se dále týká způsobu přípravy cukerných jednotek rostlinného typu („rostlinifíkovaných“) humánních glykoproteinů či glykoproteinů jiných obratlovců, kdy se fukózové jednotky a GlcNAc-al,3-fukosyltransferáza kódovaná výše popsanou molekulou DNA přidají ke vzorku, který obsahuje cukerné jednotky, případně glykoproteiny, takže fukóza je navázána
GlcNAc-al,3-fukosyltransferázou na sacharidovoujednotku nebo glykoprotein v pozici otl,3. Způsobem klonování GlcNAc-al,3-fukosyltransferázy podle vynálezu je možné produkovat velká množství purifikovaného enzymu. Vynález poskytuje vhodné reakční podmínky pro získání plně aktivní transferázy. Bylo ukázáno, že transferáza má zvláště vysokou aktivitu při pH přibližně 7, jestliže je jako pufr užita 2-(N-morfolino)ethansulfonová kyselina/HCl. V přítom25 nosti bivalentních kationtů, zejména Mn2+, je aktivita rekombinantní transferázy zvýšena. Sacharidové jednotky se smíchají se vzorkem buďto v nenavázané formě nebo vázané na protein. Rekombinantní transferáza je aktivní vůči oběma formám.
Předkládaný vynález je dále podrobněji vysvětlen pomocí ilustrativních příkladů a obrázků, které však vynález nijak neomezují.
Popis obrázků
Obr. la a lb ukazují, ve formě křivek, měřená množství proteinu a měřenou enzymatickou aktivi35 tu v jednotlivých frakcích eluátu.
Obr. 2 ukazuje analýzu GlcNAc-al,3-fukosyltransferázy gelovou elektroforézou.
Obr. 3 ukazuje výsledek izoelektrického fokusingu a měřenou transferázovou aktivitu jednotli40 vých izoforem.
Obr. 4 ukazuje N-koncové sekvence 4 tryptických peptidů 1 až 4 a DNA sekvence tří primerů Sl, A2aA3.
Obr. 5a a 5b ukazují cDNA sekvence otl,3-fukosyltransferáz.
Obr. 6a a 6b ukazují aminokyselinové sekvence odpovídajících al,3-fukosyltransferáz.
Obr. 7 je schematické znázornění al,3-fukosyltransferázy a hydrofobicity aminokyselinových zbytků.
Obr. 8 ukazuje srovnání konzervativních motivů různých fukosyltransferáz.
-11 CZ 299622 B6
Obr. 9 ukazuje srovnání fukosyltransferázové aktivity hmyzích buněk transfekovaných genem al,3-fukosyltransferázy a negativní kontrolou.
Obr. 10a a 10b ukazují struktury různých akceptorů al,3-fukosyltransferáz.
Obr. 11 a 12 ukazují hmotnostní spektra.
Obr. 13 ukazuje výsledek analýzy HPLC.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Izolace jádro-αΐ ,3-fukosyltransferázy
Všechny kroky byly provedeny ve 4 °C. Semenáčky fazolu mungo byly homogenizovány v mixéru, na každý kg bylo přidáno 0,75 objemu extrakčního pufru. Pak byl homogenát filtrován přes dvě vrstvy bavlněné tkaniny a filtrát byl centrifugován 40 minut při 30 000 g. Supematant byl slit a pelet byl extrahován rozpouštěcím pufrem přes noc za stálého míchání. Následná centrifugace 40 minut při 30 000 g poskytla tritonový extrakt.
Tritonový extrakt byl purifikován následovně:
Krok 1: Tritonový extrakt byl nanesen na mikrogranulámí diethylaminoethylcelulózovou iontoměničovu kolonu (5x28 cm) Whatman, která byla před tím ekvilibrována pufrem A. Nenavázaná frakce byla dále zpracována v kroku 2.
Krok 2: vzorek byl nanesen na kolonu Affi-Gel Blue (2,5x32) ekvilibrovanou pufrem A. Po promytí kolony tímto pufrem byl adsorbovaný protein eluován pufrem obsahujícím 0,5M NaCl.
Krok 3: Po dialýze eluátu z kroku 2 proti pufru B, byl nanesen na kolonu se S-Sepharose ekvilibrovanou stejným pufrem. Navázaný protein byl eluován lineárním gradientem od 0 do 0,5M
NaCl v pufru B. Frakce s GlcNAc-al,3-fukosyltransferázou byly sloučeny a dialyzovány proti pufru C.
Krok 4: dialyzovaný vzorek byl nanesen na kolonu GnGn-Sepharose ekvilibrovanou pufrem C. Navázaný protein byl eluován pufrem C obsahujícím ÍM NaCl místo MnCl2.
Krok 5: Poté byl enzym dialyzován proti pufru D a nanesen na klonu GDP-Hexanolamin-Sepharose. Po promytí kolony pufrem D byla transferáza eluována nahrazením MgCl2 a NaCl pomocí 0,5mM GDP. Aktivní frakce byly sloučeny, dialyzovány proti pufru 20mM Tris-HCl, pH 7,3, a a nakonec lyofilizovány.
Enzymatická aktivita GlcNAc-al,3-fukosyltransferázy byla stanovena užitím peptidu GnGn a GDP-L-[U-14C]-fukózy při koncentracích substrátu 0,5 a 0,25 každého, za přítomnosti pufru 2(N-morfolino)ethansulfonová kyselina/HCl, Triton X-100, MnCl2, GlcNAc a AMP (podle Staudacher a kol., 1998, Glycoconjugate J. 15, 355-360; Staudacher a kol., 1991, Eur. J.
Biochem. 199, 745-751).
Koncentrace proteinu byla stanovena pomocí metody s bicinchinonovou kyselinou (Pierce), nebo v posledním kroku purifikace enzymu pomocí analýzy aminokyselin (Altmann 1992, Anal. Biochem. 204, 215-219).
-12CZ 299622 B6
Na obr. la a lb jsou ukázána měřená množství proteinu a měřené enzymatické aktivity jednotlivých frakcí eluátu jakožto křivky. Obr. la ukazuje výše popsanou separaci na koloně S-Sepharose, obr. lb ukazuje separaci na koloně GnGn-Sepharose, kroužky reprezentují protein, černě vyplněná kolečka reprezentují GlcNAc-al,3-fukosyltransferázu, a čtverečky reprezentují N5 acetyl-P-glukosaminidázu. Jedna jednotka (U) je definována jako takové množství enzymu, které přenese 1 mmol fukózy na akceptor za 1 minutu.
Tabulka 1 ukazuje jednotlivé kroky purifikace transferázy.
Tabulka 1
Purifikační krok Celkový protein Celková aktivita Speci- fická aktivita Purifi- kační faktor Výtěžek
mg mU míí/mg násobek %
extrakt Triton X-100 91500 4846 0,05 1 100
DE52 43700 4750 0,10 2 98,0
Affigel Blue 180,5 4134 23 460 85,3
S-Sepharose 8,4 3251 390 7800 67,1
GnGn-Sepharose OJ? 1044 8030 160000 21,5
GDP-Hexanolamin- Sepharose 0,02' 867 43350 867000 17,9
stanoveno aminokyselinovou analýzou
Extrakční pufr:
0,5 mM dithiothreitol 1 mM EDTA
0,5% polyvinylpolypyrolidon
0,25 M sacharóza mM Tris-HCl, pH 7,3
Roztokový pufr:
0,5 mM dithiothreitol
1 mM EDTA
1,5 % Triton X-100 50 mM Tris-HCl, pH 7,3
Pufr A:
25 mM Tris-HCl pufr, pH 7,3, obsahující:
0,1 % Triton X-100 a 0,02 % NaN3
-13CZ 299622 B6
Pufr B:
mM Na-citrátový pufr, pH 5,3, obsahující:
0,1 % Triton X-100 a
0,02 % NaN3
Pufr C:
mM Tris-HCl buffer, pH 7,3, obsahující:
mM MnCl2 a 0,02 % NaN3
Pufr D:
mM Tris-HCl pufr, pH 7,3, obsahující:
mM MgCl2 0,lMNaCla
0,02 %NaN3
Příklad 2
Analýza SDS-PAGE a izoelektrickou fokusací
SDS-PAGE byla provedena na zařízení Biorad Mini-protean cell na gelech obsahujících 12,5% akrylamid a 1 % bisakrylamid. Gely byly obarveny buďto Coomassie Brilliant Blue R250 nebo stříbrem. Izoelektrická fokusace fukosyltransferáz byla provedena na připravených gelech s rozmezím pl 6 až 9 (Servalyt precotes 6-9, Serva). Gely byly barveny stříbrem podle návodu výrobce. Pro dvojrozměrnou elektroforézu byly dráhy vyřezány z fokusačního gelu, podrobeny působení S-alkylačního činidla a SDS a pak analyzovány na SDS-PAGE, jak bylo popsáno výše.
Obr. 2 ilustruje elektroforetický gel GlcNAc-αΙ ,3-fukosyltransferázy, dvojrozměrná elektroforéza je ukázána v levé části a jednorozměrná SDS-PAGE je ukázána v pravé části. Dráha označená Aje standard, dráha označená B je GlcNAc-al,3-fukosyltransferáza z GnGn-Sepharose a dráha označená C je „purifikovaná“ GlcNAc-ccl,3-fukosyltransferáza, tj. frakce z kolony GDPhexanolamin-Sepharose. Dva pásy odpovídající velikostem 54 000 a 56 000 (Da) představují izoformy transferáz.
Obr. 3 ukazuje výsledek izoelektrické fokusace. Dráhy byly obarveny stříbrem a na dráze B byla testována aktivita izoforem transferázy. Aktivita je vyjádřena jako % fukózy, které bylo přeneseno z GDP-fukózy na substrát.
Příklad 3
Sekvencování peptidu
Pro sekvencování proteinu byly pásy vyřezány z SDS-polyakrylamidového gelu obarveného Coomassie modří, karboxyamidomethylovány a pak štěpeny trypsinem podle publikace Garg a kol. 1988, Electrophoresis, 9, 681-692. Tryptické peptidy byly separovány HPLC s reverzní fází na koloně 1,0 x 250 mM Vydac Cl8 při 40 °C a průtoku 0,05 ml/min, užitím zařízení HP 1100 (Hewlett Packard). Izolované peptidy byly separovány na zařízení pro sekvencování HewlettPackard G 1005 Protein Sequencing System podle návodu výrobce. Dále pak byla směs peptidů analyzována naštěpením v gelu pomocí MALDI-TOF MS (viz níže).
- 14CZ 299622 B6
Obr. 4 ukazuje N-koncovou sekvenci 4 tryptických peptidů 1 až 4 (SEKVENCE ID. Č. 5 až 8). Na základě prvních třech peptidů byly připraveny primery Sl, A2 a A3 (SEKVENCE ID. C. 9 až 11).
Příklad 4
RT-PCR a klonování cDNA
Celková RNA byla izolována z hypokotylů 3 dny starých semenáčků fazolu mungo užitím soupravy SV Total RNA Isolating System od firmy Promega. Pro přípravu prvního řetězce cDNA byla celková RNA inkubována 1 hodinu ve 48 °C s AMV reverzní transkriptázou a oligo(dT) primery, přičemž byla užita souprava Reverse Transcription System od firmy Promega. Na jed15 nořetězcové cDNA byla provedena PCR s kombinací senze a antisenze primerů. k 10 μΐ směsi pro reverzní transkripci bylo přidáno 50 μΐ roztoku obsahujícího: 0,1 mmol každého primerů, 0,1 mM dNTPs, 2 mM MgCl2, 10 mM Tris-HCl pufr, pH 9,0,50 mM KC1 a 0,1 % Triton X-100. Po prvním denaturačním kroku v 95 °C po 2 minuty proběhlo 40 cyklů po 1 minutě v 95 °C, 1 minutě ve 49 °C a 2 minutách v 72 °C. Poslední krok extenze v 72 °C byl prodloužen na
8 minut. PCR produkty byly subklonovány do vektor pCR2.1 pomocí soupravy TA Cloning Kit od firmy Invitrogen, a pak byl sekvencován. Produkty této PCR byly dva fragmenty DNA délky 744 bp a 780 bp, přičemž oba fragmenty měly shodný 5'-konec (viz obr. 7). Použitím těchto DNA fragmentů jako výchozího materiálu byly získány chybějící 5' a 3' úseky cDNA užitím metody rychlé amplifíkace 5' a 3' konců cDNA (RACE), přičemž byla užita souprava RACE Kit od firmy Gibco-BRL. Jako antisenze primer byl užit univerzální primer ze soupravy a jako senze primer byl užit buďto primer 5'-CTGGAACTGTCCCTGTGGTT3' (SEKVENCE ID. Č. 12) nebo 5-AGTGCACTAGAGGGCCAGAA-3' (SEKVENCE ID. Č. 13). Byly také užity zkrácený kotvicí primer ze soupravy jako senze primer a jako antisenze primer buďto 5-TTCGAGCACCACAATTGGAAAT-3', (SEKVENCE ID. Č. 14) nebo 5-GAATGCAAAGACGGCACGATG30 AAT-3' (SEKVENCE ID. Č. 15).
PCR probíhala s teplotou nasednutí primerů („annealing“) 55 °C za jinak stejných podmínek jak bylo popsáno výše. Produkty získané metodou 5'- a 3-RACE byly subklonovány do vektoru pCR2.1 a sekvencovány.
Sekvence subklonovaných fragmentů byly určeny metodou dideoxynukleotidového sekvencování na zařízení ABI PRISM 310 Gentic analyser užitím soupravy AB1 PRISM Dye Terminátor Cycle Sequencing Ready Reaction Kit, vše od firmy Perkin Elmer. T7 a Ml3 „forward“ primery byly užity pro sekvencování produktů klonovaných do vektoru pCR2,l. Oba řetězce kódující oblasti byly sekvencovány v servisním středisku VBC Genomics Sequencing Service ve Vídni na zařízení LI-COR Long Read IR 4200 Sequencer (Lincoln, NE) užitím infračerveně značených primerů (IRD700 and IRD800).
Obr. 5a a 5b ukazují celou cDNA velikosti 2 198 bp a otevřený čtecí rámec velikosti 1530 bp (SEKVENCE ID. Č. 1). Otevřený čtecí rámec (start kodon tvoří páry bází 211 až 213, stop kodon 1740 až 1743) kóduje protein obsahující 510 aminokyselin s molekulovou hmotností 56 800 (DA) a teoretickou hodnotou pl 7,51.
Obr. 6a a 6b ukazují aminokyselinovou sekvenci GlcNAc-al,3-fukosyltransferázy (SEK50 VENCE ID. C. 2) odvozenou z cDNA sekvence. Místa glykosylace vázaného asparaginujsou Asn346 a Asn429.
Obr. 7 schématicky ilustruje cDNA GlcNAc-al,3-fukosyltransferázy (dole) a odvozený index hydrofobicity kódovaného proteinu (dole), kde pozitivní index hydrofobicity znamená zvýšenou hydrofobicitu. Ve středu jsou ukázány velikosti výše zmíněných PCR produktů ve vztahu k úplné
- 15CZ 299622 B6 cDNA. Kódující úsek je vyznačen obdélníkem, kde „C“ označuje postulovaný cytoplaznatický úsek, „T“ označuje postulovaný transmembránový úsek a „G“ označuje postulovaný katalytický úsek transferázy v lumen Golgiho aparátu. Analýza sekvence DNA programem „TMpred“ (od firmy EMBnet, Switzerland) vedla k předpokladu transmembránového úseku mezi Asn36 aGly54. C-koncový úsek enzymu pravděpodobně obsahuje katalytický úsek a tudíž by měl vyčnívat do lumen Golgiho aparátu. Podle toho se zdá, že se jedná o transferázu typu II transmembránového proteinu stejně jako jsou všechny dosud analyzované glykosyltransferázy, které se podílejí na biosyntéze glykoproteinů (Joziasse, 1992, Glycobiology 2, 271-277). Šedé úseky představují čtyři tryptické peptidy, šestiúhelníky představují potenciální N-glykosylační místa, ío Prohledávání genových databází pomocí programu BLASTP přístupný prostřednictvím NCBI ukázalo podobnost mezi GlcNAc-al,3-fukosyltransferázou a ostatními otl,3/4-fukosyltransferázami, např. humánní fukosyltransferázou VI. Při 18 až 21 % (vyšetřeno programem SIMLALN VIEW, Expase, Switzerland), byla celková podobnost nevýznamná. Nicméně úsek 35 aminokyselin (SEKVENCE ID. Č. 4) vykazoval překvapivě vysokou homologii s ostatními al,3/4-fukosyltransferázami (obr. 8). Tento sekvenční úsek je lokalizován mezi Glu267 a Pro301 v SEKVENCI ID. Č. 2.
Příklad 5
Exprese rekombinantní GlcNAc-al,3-fukosyltransferázy v hmyzích buňkách
Kódující úsek předpokládané GlcNAc-al,3-fukosyltransferázy obsahující cytoplazmatický a transmembránový úsek byl amplifikován pomocí přímého („forward“) primerů 5'-CGGCGGATCCGCAATTGAATGATG-3' (SEKVENCE ID. Č. 16) a zpětného („reverse“) primerů 5'CCGGCTGCAGTACCATTTAGCGCAT-3' (SEKVENCE ID. Č. 17) užitím soupravy pro polymerázo25 vou řetězovou reakci „Expand High Fidelity PCR System“ od firmy Boehringer Mannheim. PCR produkt byl dvojitě naštěpen Pstl a BamHI a subklonován do bakulovirového transferového vektoru pVL 1393 ošetřeného alkalickou fosfatázou, který byl předtím také naštěpen Pstl a BamHI. Pro zajištění homologní rekombinace byl transferový vektor kotransfekován s virovou DNA „Baculo Gold“ (PharMingen, Sand Diego, CA) do hmyzích buněk Sf9 v médiu IPL-41 s lipofektinem. Po inkubaci 5 dnů v 27 °C byly různé objemy supematantu s rekombinantním virem použity pro infekci hmyzích buněk Sf21. Po inkubaci 4 dny ve 27 °C v médiu IPL-41 s 5 % FCS byly buňky Sfl sklizeny a dvakrát opláchnuty solným roztokem pufrovaným fosfátem (PBS). Pak byly buňky resuspendovány v 25 mM Tris-HCI, pH 7,4, s 2 % Triton X-100 a „rozbity“ sonikací na ledu.
Příklad 6
Test GlcNAc-al,3-fukosyltransferázové aktivity
Homogenát a buněčný supematant byly testovány na GlcNAc-al,3-fukosyltransferázu. „Slepé“ vzorky byly provedeny s rekombinantním bakulovirem, který kódoval GlcNAc-transferázu I z tabáku (Strasser a kol., 1999, Glycobiology, v tisku).
Obr. 9 ukazuje naměřenou enzymatickou aktivitu rekombinantní GlcNAc-otl,3-fukosyltransferázy a negativní kontroly. V nej lepším případě byla enzymatická aktivita kotransfekováných buněk a jejich supematantu 30x vyšší než u negativní kontroly. Endogenní aktivita, kteráje měřitelná v nepřítomnosti rekombinantní transferázy pochází v podstatě z hmyzí al,6-fukosyltransferázy a pouze v nízkém procentu pochází z GlcNAc-al,3-fukosyltransferázy. Tudíž zvýšení GlcNAc-al,3-fukosyltransferázy způsobené rekombinantním bakulovirem je více než lOOnásobné. Enzym vykazuje široké maximum aktivity kolem pH 7,0, pokud je aktivita měřena v pufru 2-(N-morfolino)-ethansulfonová kyselina/HCl. Jak je patrné z tabulky 2, přídavek bivalentího kationtu, zejména Mn2+, zvyšuje aktivitu rekombinantní transferázy.
-16CZ 299622 B6
Tabulka 2
Přídavek Relativní aktivita
(konc. 10 mM) ÍAkceptor: GnGn-peptid)
%
žádný 21
EDTA 18
MnCl2 100
CaCl2 82
MgCl2 52
CdCl2 44
CoCl2 35
CuCl2 3
NiCl2 24
ZnCl2 0,6
Tabulka 3 ukazuje, že z požitých akceptorů GnGn-peptid vykazuje nejvyšší míru inkorporace při standardním testu, pak těsně následuje GnGnF6-peptid a MSGn-Asn. Žádný přenos na mM peptid nebyl zjištěn, neboť mM peptid neobsahuje redukují GlcNAc-konec na 3-vázané manóze. Tato struktura se zdá být nezbytnou pro jádro-fukosyltransferázu. Rekombinantní transferáza byla navíc inaktivní vzhledem k všeobecně užívanému akceptorů, a sice a,3/4-fukosyltransferáze užívané ke stanovení krevních skupin, která přenáší fukózu na GlcNAc na neredukujících koncích oligosacharidů. Hodnoty zjevné Km pro akceptorový substrát GnGn peptid, GnGnF6-peptid, MSGn-Asn, a pro donorový substrát GDP-fukózu, byly stanoveny na 0,19, 0,13, 0,23 a 0,11, v uvedeném pořadí. Struktury molekul jsou ilustrovány na obr. 10a a 10b.
Tabulka 3
Akceptorový substrát Relativní aktivita (%) Km (mM)
GnGn-peptid 100 0,19
GnGnFň-peptid 87 0,13
MSGn-Asn 71 0,23
MM-peptid 0
Galp-4GlcNAc 0
Gaipi-3GlcNAc 0
Galpl-3GlcNAcpl-3Gaipi-4GIc O
- 17CZ 299622 B6
Příklad 7
Hmotnostní spektroskopie produktů fukosyltransferázy
Dabsylovaný GnGn hexapeptid (2 nmol) byl inkubován s homogenátem hmyzích buněk obsahujících rekombinantní GlcNAc-a,3-fukosyltransferázu (0,08 mU) v přítomnosti ne-radioaktivní
GDP-L-fukózy (10 nmol), pufru 2(N-morfolino)ethansulfonová kyselina/HCl, Triton X-100, MnCf, GlcNAc a AMP. Jako negativní kontrola sloužil homogenát hmyzích buněk infikovaných jak „slepý“ vzorek. Vzorky byly inkubovány 16 hodin ve 37 °C a pak byly analyzovány hmotnostní spektrometrií MALD1TOF. Hmotnostní spektrometrie se prováděla na zařízení DYNAMO (Therrmo BioAnalysis, Santa Fe, NM), což je zařízení MALDI-TOF MS schopné ío dynamické extrakce (synonymum pro pozdní extrakci). Byly užity dva typy přípravy matrice vzorků: peptidy a dabsylované glykopeptidy byly rozpuštěny v 5% kyselině mravenčí a alikvoty byly naneseny na cíl, usušeny na vzduchu a překryty 1 % a-kyano-4-hydroxyskořicovou kyselinou. Pyridylaminované glykany, redukované oligosacharidy a nederivatizované glykopeptidy byly naředěny vodou, naneseny na cíl a usušeny ve vzduchu. Po přidání 2% 2,5-dihydroxyben15 zoové kyseliny byly vzorky okamžitě usušeny aplikací vakua.
Obr. 11 ukazuje hmotnostní spektrum těchto vzorků: A je negativní kontrola, hlavní vrchol (S) vykazuje substrát Dabsyl-Val-GlyGlu-(GlcNAc4Man3)Asn-Arg-Thr, vypočtená hodnota [M+H]+je 2 262,3. Tento substrát se vyskytuje také jaké sodná adiční sůl a také jako menší ion, který vznikl fragmentací azoskupiny Dabsylové skupiny v (S*). Množství malých produktů (P, [M+H]+= 2 408,4) je důsledkem endogenní al,6-fukosyltransferázy. Vrchol při m/z = 2 424,0 ukazuje na neúplnou degalaktosylaci substrátu. Hmotnostní spektrum B ukazuje vzorek s rekombinantní al,3-fukosyltransferázou. Hlavní vrchol (P) reprezentuje fukosylovaný produkt, (P*) jeho fragmentovaný ion.
Navíc byly alikvoty obou vzorků navzájem smíchány, aby se získaly podobné koncentrace substrátu a produktu (vzorek A). Tato směs byla naředěna 0,1 M octanem amonným pH 4,0, obsahujícím 10 mU N-glykosidázy (vzorek B), nebo 50 mM Tris/HCl, pH 8,5, obsahujícím 100 mU (1 U hydrolyzuje 1 mmol substrátu za 1 minutu) N-glykosidázy F (vzorek C). Po 2 a 20 hodinách byly odebrány malé alikvoty těchto vzorků a analyzovány metodou MALDI-TOF MS.
Na obr. 12 jsou ukázána tři hmotnostní spektra vzorků A, B a C. Nenaštěpený vzorek A vykazuje dva hlavní vrcholy: substrát při 2 261,4 m/z, a fukosylovaný produkt při 2 407,7 m/z. Střední křivka ukazuje hmotnostní spektrum vzorku B, ošetřeného N-glykosidázou A, která hydrolyzuje oba glykopeptidy. Vrchol v 963,32 představuje deglykosylovaný produkt. Spodní křivka je spektrum vzorku C. N-glykosidáza F není schopna hydrolyzovat al,3-fukosylované substráty, takže spektrum má vrchol v 2 406,7 m/z fukosylovaného produktu, přičemž vrchol hydrolyzovaného substrátu se objevuje při 963,08 m/z.
Příklad 8
HPLC-analýza pyridil-aminovaného produktu fukosyltranferázy
Dva výše zmíněné vzorky (fukosylovaný produkt a negativní kontrola) byly naštěpeny N-glykosidázou A. Oligosacharidy takto získané byly pyridylaminovány a analyzovány užitím HPLC s reverzní fází (Wilson a kol., 1998, Glycobiology 8, 651—661; Kubelka a kol., 1994, Arch. Biochem. Giophys. 308, 148-157; Hase a kol., 1984, J. Biochem. 95, 197-203).
Na obr. 13 horní diagram B představuje negativní kontrolu, kde je kromě reziduálního substrát (GnGn-peptid) viditelný i 1,6-fukosylovaný produkt. A má vrchol při podstatně kratším retenč50 ním čase, což je specifické pro redukci fukózy navázané na GlcNAc-al ,3. Na spodním diagramu je srovnán izolovaný produkt transferázy před (křivka A) a po štěpení (křivka B) N-acetyl-Pglukosaminidázou s fosfolipázou A2 včel mMF3 (křivka C).
-18CZ 299622 B6
Seznam sekvencí
<160> 17
<170> Patentin Ver. 2. 1
<210> 1
<211> 2198
<212> DNA
<213 > rostlina
<400> 1
actaactcaa acgctgcatt ttcttttttc tttcagggaa ccatccaccc ataacaacaa 60
aaaaaacaac agcaagctgt gtttttttta tcgttctttt tctttaaaca agcaccccca 120
tcatggaatc gtgctcataa cgccaaaatt ttccatttcc ctttgatttt tagtttattt 180
tgcggaattg gcagttgggg gcgcaattga atgatgggtc tgttgacgaa tcttcgaggc 240
tcgagaacag atggtgccca acaagacagc ttacccgttt tggctccggg aggcaaccca 300
aagaggaaat ggagcaatct aatgcctctt gttgttgcec ttgtggtcat cgcggagatc 360
gcgtttctgg gtaggttgga tatggccaaa aacgccgcca tggttgactc cctcgctgac 420
ttcttctacc gctctcgagc ggtcgttgaa ggtgacgatt tggggttggg tttggtggct 480
tctgatcgga attctgaatc gtatagttgt gaggaatggt tggagaggga ggatgctgtc 540
acgtattcga ggggcttttc caaagagcct atttttgttt ctggagctga tcaggagtgg 600
aagtcgtgtt cggttggatg taaatttggg tttagtgggg atagaaagcc agatgccgca 660
tttgggttac ctcaaccaag tggaacagct agcattctgc gatcaatgga atcagcagaa 720
tactatgctg agaacaatat tgccatggca agacggaggg gatataacat cgtaatgaca 780
aecagtctat cttcggatgt tcctgttgga tatttttcat gggctgagta tgatatgatg 840
gcaccagtgc agccgaaaac tgaagctgct cttgcagctg ctttcatttc caattgtggt 900
gctcgaaatt tccggttgca agctcttgag gcccttgaaa aatcaaacat caaaattgat 960
tcttatggtg gttgtcacag gaaccgtgat ggaagagtga acaaagtgga agccctgaag 1020
cactacaaat ttagcttagc gtttgaaaat tcgaatgagg aagattatgt aactgaaaaa 1080
ttcttccaat cccttgttgc tggaactgtc cctgtggttg ttggtgctcc aaatattcag 1140
gactttgctc cttctcctgg ttcaatttta catattaaag agatagagga tgttgagtct 1200
gttgcaaaga ccatgagata tctagcagaa aatcccgaag catataatca atcattgagg 1260
tggaagtatg agggtccatc tgactccttc aaggcccttg tggatatggc agctgtgcat 1320
tcatcgtgcc gtctttgcat tcacttggcc acagtgagta gagagaagga agaaaataat 1380
ccaagcctta agagacgtcc ttgcaagtgc actagagggc cagaaaccgt atatcatatc 1440
tatgtcagag aaaggggaag gtttgagatg gagtccattt acctgaggtc tagcaattta 1500
actctgaatg ctgtgaaggc tgctgttgtt ttgaagttca catccctgaa tettgtgcct 1560
gtatggaaga ctgaaaggcc tgaagttata agagggggga gtgctttaaa actctacaaa 1620
19CZ 299622 B6 atatacccaa ttggcttgac acagagacaa gctctttata ccttcagctt caaaggtgat 1680 gctgatttca ggagtcactt ggagaacaat ccttgtgcca agtttgaagt catttttgtg 1740 tagcatgcgc taaatggtac ctctgctcta cctgaattag cttcacttag ctgagcacta 1800 gctagagttt taggaatgag tatggcagtg aatatggcat ggctttattt atgcctagtt 1860 tcttggccaa ctcattgatg ttttgtataa gacatcacac tttaatttta aacttgtttc 1920 tgtagaagtg caaatccata tttaatgctt agttttagtg ctcttatctg atcatctaga 1980 agtcaeagtt cttgtatatt gtgagtgaaa actgaaatct aatagaagga tcagatgttt 2040 cactcaagac acattattac ttcatgttgt tttgatgatc tcgagctttt ttagtgtctg 2100 gaactgtccc tgtggtttga gcacctgtta ttgcttcagt gttactgtcc agtggttatc 2160 gtttttgacc tctaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaa 2198 <210> 2 <211> 510 <212> PRT <213> rostlina <400> 2
Met Met Gly Leu Leu Thr Asn Leu Arg Gly Ser Arg Thr Asp Gly Ala
1 5 10 15
Gin Gin Asp Ser Leu Pro Val Leu Ala Pro Gly Gly Asn Pro Lys Arg
20 25 30
Lys Trp Ser Asn Leu Met Pro Leu Val Val Ala Leu Val Val Ile Ala
35 40 45
Glu Ile Ala Phe Leu Gly Arg Leu Asp Met Ala Lys Asn Ala Ala Met
50 55 60
Val Asp Ser Leu Ala Asp Phe Phe Tyr Arg Ser Arg Ala Val Val Glu
65 70 75 80
Gly Asp Asp Leu Gly Leu Gly Leu Val Ala Ser Asp Arg Asn Ser Glu
85 90 95
Ser Tyr Ser Cys Glu Glu Trp Leu Glu Arg Glu Asp Ala Val Thr Tyr
100 105 110
Ser Arg Gly Phe Ser Lys Glu Pro Ile Phe Val Ser Qiy Ala Asp Gin
115 120 125
Glu Trp Lys Ser Cys Ser Val Gly Cys Lys Phe Gly Phe Ser Gly Asp
130 135 140
Arg Lys Pro Asp Ala Ala Phe Gly Leu Pro Gin Pro Ser Gly Thr Ala
145 150 155 160
Ser Ile Leu Arg Ser Met Glu Ser Ala Glu Tyr Tyr Ala Glu Asn Asn
-20CZ 299622 B6
165 170 175
Ile Ala Met Ala 180 Arg Arg Arg Gly Tyr 185 Asn Ile Val Met Thr 190 Thr Ser
Leu Ser Ser 195 Asp Val Pro Val Gly 200 Tyr Phe Ser Trp Ala 205 Glu Tyr Asp
Met Met 210 Ala Pro Val Gin Pro 215 Lys Thr Glu Ala Ala 220 Leu Ala Ala Ala
Phe 225 Ile Ser Asn Cys Gly 230 Ala Arg Asn Phe Arg 235 Leu Gin Ala Leu Glu 240
Ala Leu Glu Lys Ser 245 Asn Ile Lys Ile Asp 250 Ser Tyr Gly Gly Cys 255 His
Arg Asn Arg Asp 260 Gly Arg Val Asn Lys 265 Val Glu Ala Leu Lys 270 His Tyr
Lys Phe Ser 275 Leu Ala Phe Glu Asn 280 Ser Asn Glu Glu Asp 285 Tyr Val Thr
Glu Lys 290 Phe Phe Gin Ser Leu 295 Val Ala Gly Thr Val 300 Pro Val Val Val
Gly 305 Ala Pro Asn Ile Gin 310 Asp Phe Ala Pro Ser 315 Pro Gly Ser Ile Leu 320
His Ile Lys Glu Ile 325 Glu Asp Val Glu Ser 330 Val Ala Lys Thr Met 335 Arg
Tyr Leu Ala Glu 340 Asn Pro Glu Ala Tyr 345 Asn Gin Ser Leu Arg 350 Trp Lys
Tyr Glu Gly 355 Pro Ser Asp Ser Phe 360 Lys Ala Leu Val Asp 365 Met Ala Ala
Val His 370 Ser Ser Cys Arg Leu 375 Cys Ile His Leu Ala 380 Thr Val Ser Arg
Glu 385 Lys Glu Glu Asn Asn 390 Pro Ser Leu Lys Arg 395 Arg Pro Cys Lys Cys 400
Thr Arg Gly Pro Glu 405 Thr Val Tyr His Ile 410 Tyr Val Arg Glu Arg 415 Gly
Arg Phe Glu Met Glu Ser Ile Tyr Leu Arg Ser Ser Asn Leu Thr Leu
-21 CZ 299622 B6
420 425 430
Asn Ala Val 435 Lys Ala Ala Val Val Leu Lys Phe Thr Ser Leu Asn Leu
440 445
Val Pro Val Trp Lys Thr Glu Arg Pro Glu Val Ile Arg Gly Gly Ser
450 455 460
Ala Leu Lys Leu Tyr Lys Ile Tyr Pro Ile Gly Leu Thr Gin Arg Gin
465 470 475 480
Ala Leu Tyr Thr Phe Ser Phe Lys Gly Asp Ala Asp Phe Arg Ser His
485 490 495
Leu Glu Asn Asn Pro Cys Ala Lys Phe Glu Val Ile Phe Val
500 505 510 <210> 3 <211> 105 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223 > Popis umělé sekvence: cDNA <400> 3 gaagccctga agcactacaa atttagctfca gcgtttgaaa attcgaatga ggaagattat 60 gtaactgaaa aattcttcca atcccttgtt gctggaactg tccct 105 <210> 4 <211> 35 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: peptid <400> 4
Glu Ala Leu Lys His Tyr Lys Phe Ser Leu Ala Phe Glu Asn Ser Asn 15 10 15
Glu Glu Asp Tyr Val Thr Glu Lys Phe Phe Gin Ser Leu Val Ala Gly 20 25 30
Thr Val Pro 35
-22CZ 299622 B6 <210> 5 <211> 15 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: peptid <400> 5
Lys Pro Asp Ala Xaa Phe Gly Leu Pro Gin Pro Ser Thr Ala Ser
1 5 10
<210> <211> <212> <213> 6 10 PRT Umělá sekvence
<220>
<223> Popis umělé sekvence: peptid
<400> 6 Pro Glu Thr Val Tyr His Ile Tyr Val Arg
1 5 10
<210> 7
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Seguence <220>
<223> Description of Artificial Seguence:peptide <400> 7
Met Glu Ser Ala Glu Tyr Tyr Ala Glu Asn Asn Ile Ala 15 10 <210> 8 <211> 10 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: peptid
-23CZ 299622 B6 <400> 8
Gly Arg Phe Glu Met Glu Ser Ile Tyr Leu 15 10 <210> 9 <211> 29 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223 > Popis umělé sekvence: DNA <400> 9 gcngartayt aygcngaraa yaayathgc <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: DNA <400> 10 crtadatrtg rtanacngty tc <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223 > Popis umělé sekvence: DNA <400> 11 tadatnswyt ccatytcraa <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: DNA <400> 12 ctggaactgt ccctgtggtt
-24CZ 299622 B6 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: DNA <400> 13 agtgcactag agggccagaa 20 <210> 14 <211> 22 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: DNA <400> 14 ttcgagcacc acaattggaa at 22 <210> 15 <211» 24 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: DNA <400> 15 gaatgcaaag acggcacgat gaat 24 <210> 16 <211> 24 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: DNA <400> 16 cggcggatcc gcaattgaat gatg 24 <210> 17 <211> 25 <212> DNA
-25CZ 299622 B6 <213 > Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: DNA <400> 17 ccggctgcag taccatttag cgcat 25

Claims (25)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Molekula DNA, která obsahuje SEKVENCI ID. Č. 1 s otevřeným čtecím rámcem od páru
    10 bází 211 do páru bází 1740, neboje alespoň z 50 % identická s touto sekvencí, nebo s ní hybridizuje za stringentních podmínek, nebo obsahuje sekvenci k ní degenerovanou z důvodu degenerace genetického kódu, přičemž sekvence kóduje rostlinný protein s fukosyltransferázovou aktivitou, nebo sekvenci k ní komplementární.
    15
  2. 2. Molekula DNA podle nároku 1, která kóduje protein mající GlcNAc-al,3-fukosyltransferázovou aktivitu, zejména jádro-al,3-fukosyltransferázovou aktivitu.
  3. 3. Molekula DNA podle nároku 1 nebo 2, která že má alespoň 70 až 80%, zvláště výhodně alespoň 95% identitu se SEKVENCÍ ID. Č. 1.
  4. 4. Molekula DNA podle některého z nároků 1 až 3, která obsahuje 2150 až 2250, zvláště 2198 párů bází.
  5. 5. Molekula DNA, která obsahuje SEKVENCI ID. Č. 3 nebo obsahuje sekvenci alespoň z
    25 85 %, zvláště z 95 % s ní identickou nebo sekvenci s ní hybridizující za stringentních podmínek nebo sekvenci k ní degenerovanou z důvodu degenerace genetického kódu.
  6. 6. Molekula DNA, která obsahuje částečnou sekvenci molekuly DNA podle některého z nároků 1 až 4 a má identitu z alespoň 80 % k SEKVENCI ID Č. 1 a má velikost 20 až 200,
    30 výhodně 30 až 50 párů bází.
  7. 7. Molekula DNA podle některého z nároků 1 až 6, která je kovalentně asociována s detekovatelnou markerovou substancí.
    35
  8. 8. Biologicky funkční vektor, který obsahuje molekulu DNA podle některého z nároků 1 až 7.
  9. 9. Biologicky funkční vektor, který obsahuje molekulu DNA podle některého z nároků 1 až 7, která je opačně orientována vzhledem k promotoru.
    40
  10. 10. Molekula DNA kódující ribozym, která má dva sekvenční úseky, každý délky alespoň 10 až
    15 párů bází, které jsou komplementární s úseky sekvencí molekuly DNA podle některého z nároků 1 až 7, takže ribozym komplexuje a štěpí mRNA transkribovanou z přírodní molekuly DNA kódující GlcNAc-al,3-fukosyltransferázu.
    45
  11. 11. Biologicky funkční vektor, který obsahuje molekulu DNA podle nároku 10.
    -26CZ 299622 B6
  12. 12. Způsob přípravy cDNA obsahující molekulu DNA podle některého z nároků 1 až 5, vyznačující se tím, že RNA se izoluje z rostlinných buněk, zvláště z buněk hypokotylu, nebo hmyzích buněk a s touto RNA se po přidání reverzní transkriptázy a primerů provede reverzní transkripce.
  13. 13. Způsob klonování GlcNAc-al,3-fukosyltransferázy, vyznačující se tím, že molekula DNA podle některého z nároků 1 až 5 se klonuje do vektoru, který se pak transfekci vnese do hostitelské buňky nebo hostitele, přičemž selekcí a amplifikaci se získají linie transfekovaných hostitelských buněk, které exprimují aktivní GlcNAc-al,3-fukosyltransferázu.
  14. 14. Způsob přípravy rekombinantních hostitelských buněk, zejména rostlinných nebo hmyzích buněk, nebo rostlin nebo hmyzu, ve kterých je tvorba GlcNAc-al,3-fukosyltransferázy utlumena nebo zcela zastavena, vyznačující se tí m , že se do hostitelských buněk nebo rostliny nebo hmyzu vnese alespoň jeden vektor podle nároků 9 nebo 11, nebo vektor obsahující
  15. 15 molekulu DNA podle některého z nároků 1 až 7, přičemž sekvence DNA obsahuje deleční, inserční a/nebo substituční mutaci.
    15. Způsob přípravy rekombinantních hostitelských buněk, zejména rostlinných buněk, nebo rostin, vyznačující se tím, že do genomu hostitelských buněk nebo rostliny se vloží
    20 molekula DNA podle některého z nároků 1 až 7, přičemž DNA sekvence obsahuje deleční, inserční a/nebo substituční mutaci, do pozice nemutované homologní sekvence.
  16. 16. Rekombinantní rostlina, rostlinná buňka nebo rostlinná tkáň, do které je vložen alespoň jeden z vektorů podle nároků8, 9 nebo 11, nebo vektor obsahující molekulu DNA podle někte25 rého z nároků 1 až 7, přičemž DNA sekvence obsahuje deleční, inserční a/nebo substituční mutaci a ve kterých je tvorba GlcNAc-al,3-fukosyl-transferázy utlumena nebo zcela zastavena.
  17. 17. Rekombinantní rostlina, rostlinná buňka nebo rostlinná tkáň, u které je do genomu buňky, rostliny nebo rostlinné tkáně na místo nemutované homologní sekvence vložena molekula DNA
    30 podle některého z nároků 1 až 7, přičemž DNA sekvence obsahuje deleční, inserční a/nebo substituční mutaci a ve kterých je endogenní tvorba GlcNAc-ccl,3-fukosyltransferázy utlumena nebo zcela zastavena.
  18. 18. Molekula peptidnukleové kyseliny (PNA), která obsahuje sekvenci bází komplementární
    35 k sekvenci DNA molekuly podle některého z nároků 1 až 6, která kóduje GlcNAc-al,3-fukosyltransferázu.
  19. 19. Molekula peptidnukleové kyseliny (PNA), která obsahuje sekvenci bází odpovídající sekvenci molekuly DNA podle některého z nároků 1 až 6, která kóduje GlcNAc-al,3-fukosyltrans40 ferázu.
  20. 20. Způsob přípravy rostlin, popřípadě buněk, zejména rostlinných buněk, které mají blokovanou expresi GlcNAc-al,3-fukosyltransferázy na úrovni transkripce nebo translace, vyznačující se t í m , že se do buněk vloží molekula PNA podle nároku 18 nebo 19.
  21. 21. Způsob přípravy rekombinantních glykoproteinů, vyznačující se tím, že se do rekombinantní rostliny, rostlinné buňky nebo rostlinné tkáně podle nároku 16 nebo 17, nebo rostliny, rostlinné tkáně nebo buňky, do kterých je vnesena molekula PNA podle nároku 18 nebo 19 a které mají blokovanou expresi GlcNAc-al,3-fukosyltransferázy na úrovni transkripce nebo
    50 translace, transfekci vnese gen, který je kódován pro glykoprotein, takže je tento rekombinantní glykoprotein exprimován.
  22. 22. Způsob přípravy rekombinantních humánních glykoproteinů, vyznačující se tím, že se do rekombinantní rostliny, rostlinné buňky nebo rostlinné tkáně podle nároku 16 nebo 17,
    -27CZ 299622 B6 nebo rostliny, rostlinné tkáně nebo buňky, do kterých je vnesena molekula PNA podle nároku 18 nebo 19 a které mají blokovanou expresi GlcNAc-al,3-fukosyltransferázy na úrovni transkripce nebo translace, transfekci vnese gen, který je kódován pro glykoprotein, takže je tento rekombinantní glykoprotein exprimován.
  23. 23. Způsob přípravy rekombinantních humánních glykoproteinů pro léčebné použití, vyznačující se tím, že se do rekombinantní rostliny, rostlinné buňky nebo rostlinné tkáně podle nároku 16 nebo 17, nebo rostliny, rostlinné tkáně nebo buňky, do kterých je vnesena molekula PNA podle nároku 18 nebo 19 a které mají blokovanou expresi GlcNAc-al,3-fukosyltrans10 ferázy na úrovni transkripce nebo translace, transfekci vnese gen, který je kódován pro glykoprotein, takže je tento rekombinantní glykoprotein exprimován.
  24. 24. Způsob selekce molekul DNA kódujících GlcNAc-al,3-fukosyltransferázu ve vzorku, vyznačující se tím, že se ke vzorku přidá molekula DNA podle nároku 7, která se váže
    15 k molekule DNA kódující GlcNAc-αΙ ,3-fukosyltransferázu.
  25. 25. Způsob podle nároku 24, vyznačující se tím, že vzorek obsahuje genomovou DNA rostlinného organismu.
CZ20012943A 1999-02-18 2000-02-17 Molekula DNA kódující fukosyltransferázu CZ299622B6 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AT0027099A AT408446B (de) 1999-02-18 1999-02-18 Fucosyltransferase-gen

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ20012943A3 CZ20012943A3 (cs) 2002-04-17
CZ299622B6 true CZ299622B6 (cs) 2008-09-24

Family

ID=3486087

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ2008-404A CZ308081B6 (cs) 1999-02-18 2000-02-17 Rekombinantní glykoproteiny a způsob jejich výroby
CZ20012943A CZ299622B6 (cs) 1999-02-18 2000-02-17 Molekula DNA kódující fukosyltransferázu

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ2008-404A CZ308081B6 (cs) 1999-02-18 2000-02-17 Rekombinantní glykoproteiny a způsob jejich výroby

Country Status (29)

Country Link
US (3) US8198078B2 (cs)
EP (3) EP1642979A1 (cs)
JP (2) JP5514386B2 (cs)
KR (1) KR20010108234A (cs)
CN (1) CN1360633A (cs)
AT (2) AT408446B (cs)
AU (1) AU771995B2 (cs)
BG (1) BG65140B1 (cs)
BR (1) BR0010114A (cs)
CA (1) CA2362964C (cs)
CZ (2) CZ308081B6 (cs)
DE (1) DE50011116D1 (cs)
DK (2) DK2062977T3 (cs)
EE (1) EE200100432A (cs)
ES (2) ES2444126T3 (cs)
HR (1) HRP20010681A2 (cs)
HU (1) HU230075B1 (cs)
IL (2) IL144777A0 (cs)
IS (1) IS6041A (cs)
MX (1) MXPA01008372A (cs)
NO (1) NO20013993L (cs)
NZ (1) NZ513685A (cs)
PL (2) PL205785B1 (cs)
PT (1) PT2062977E (cs)
SK (1) SK286416B6 (cs)
TR (1) TR200102393T2 (cs)
WO (1) WO2000049153A1 (cs)
YU (1) YU58901A (cs)
ZA (1) ZA200106735B (cs)

Families Citing this family (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2264177B1 (en) 1998-12-09 2015-09-30 Phyton Holdings, LLC Glycoproteins having human-type glycosylation
AT408446B (de) * 1999-02-18 2001-11-26 Altmann Friedrich Dr Fucosyltransferase-gen
EP2275541B1 (en) 1999-04-09 2016-03-23 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Method for controlling the activity of immunologically functional molecule
JP4890712B2 (ja) 1999-10-26 2012-03-07 スティヒティング ディーンスト ランドバウクンディフ オンデルズーク 植物における哺乳類型グリコシレーション
US6946292B2 (en) 2000-10-06 2005-09-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity
CN100385006C (zh) 2001-01-19 2008-04-30 陶氏化学公司 利用植物细胞分泌性生产具有人型糖链的糖蛋白的方法
CA2478297C (en) 2002-03-19 2013-05-14 Plant Research International B.V. Optimizing glycan processing in plants
EP2319935B1 (en) 2002-03-19 2016-04-27 Stichting Dienst Landbouwkundig Onderzoek GnTIII (UDP-N-acetylglucosamine:Beta -D mannoside Beta (1,4)-N-acetylglucosaminyltransferase III) expression in plants.
ES2362419T3 (es) * 2002-04-09 2011-07-05 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Células con depresión o deleción de la actividad de la proteína que participa en el transporte de gdp-fucosa.
AR042145A1 (es) 2002-11-27 2005-06-08 Dow Agrociences Llc Produccion de inmunoglobulinas en plantas con una fucocilacion reducida
ES2322140T3 (es) 2003-08-11 2009-06-17 Greenovation Biotech Gmbh Secuencias promotoras de la expresion de liquines y sus utilizaciones.
FI20055398A0 (fi) 2005-07-08 2005-07-08 Suomen Punainen Risti Veripalv Menetelmä solupopulaatioiden evaluoimiseksi
US8716557B2 (en) 2006-01-17 2014-05-06 Synthon Biopharmaceuticals B.V. Compositions and methods for inhibition of fucosyltransferase and xylosyltransferase expression in plants
US20090060921A1 (en) * 2006-01-17 2009-03-05 Biolex Therapeutics, Inc. Glycan-optimized anti-cd20 antibodies
CN102094020B (zh) * 2007-01-15 2012-11-28 燕秋 用于抑制LeY糖抗原合成的岩藻糖基转移酶I的RNA干涉序列及重组干涉质粒
CN102094019B (zh) * 2007-01-15 2012-11-28 燕秋 用于抑制LeY糖抗原合成的岩藻糖基转移酶Ⅳ的RNA干涉序列及重组干涉质粒
CA2684370C (en) 2007-04-17 2017-10-17 Plant Research International B.V. Mammalian-type glycosylation in plants by expression of non-mammalian glycosyltransferases
WO2009033011A1 (en) * 2007-09-07 2009-03-12 Children's Hospital Medical Center Use of secretor, lewis and sialyl antigen levels as predictors for disease
CA2704108A1 (en) * 2007-10-31 2009-05-07 Bayer Bioscience N.V. Method to produce modified plants with altered n-glycosylation pattern
EP2166085A1 (en) 2008-07-16 2010-03-24 Suomen Punainen Risti Veripalvelu Divalent modified cells
PL2944690T3 (pl) 2010-10-11 2018-05-30 Jennewein Biotechnologie Gmbh Nowe fukozylotransferazy i ich zastosowanie
KR101293658B1 (ko) * 2010-12-30 2013-08-07 대한민국 알파-1,3-푸코실트랜스퍼라아제 및/또는 베타-1,2-자일로실트렌스퍼라아제 유전자를 포함하는 벼 형질전환용 벡터 및 형질전환된 벼
ES2439507T3 (es) * 2011-01-20 2014-01-23 Jennewein Biotechnologie Gmbh Fucosiltransferasas novedosas y sus aplicaciones
EP2789686A1 (en) 2013-04-11 2014-10-15 Greenovation Biotech GmbH Expression of phosphorylated glycoproteins in plants
EP3050973A1 (en) * 2015-01-30 2016-08-03 Jennewein Biotechnologie GmbH Fermentation process for producing monosaccharides in free form from nucleotide-activated sugars
CN110317799A (zh) * 2019-07-18 2019-10-11 江南大学 一种人源岩藻糖转移酶8的原核表达方法及其产品
EP3871687A1 (en) 2020-02-27 2021-09-01 eleva GmbH Enzyme replacement therapy for treating pompe disease

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5272066A (en) 1986-03-07 1993-12-21 Massachusetts Institute Of Technology Synthetic method for enhancing glycoprotein stability
SG49117A1 (en) 1993-03-29 1998-05-18 Kyowa Hakko Kogyo Kk Alfa -1, 3-fucosyltransferase
US6509149B2 (en) * 1995-06-06 2003-01-21 Hybridon, Inc. HPV-specific oligonucleotides
US5770420A (en) * 1995-09-08 1998-06-23 The Regents Of The University Of Michigan Methods and products for the synthesis of oligosaccharide structures on glycoproteins, glycolipids, or as free molecules, and for the isolation of cloned genetic sequences that determine these structures
AT408446B (de) * 1999-02-18 2001-11-26 Altmann Friedrich Dr Fucosyltransferase-gen

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Altmann, F.: "More than silk and honey - or, can insect cells serve in the production of therapeutic glycoproteins a" Glycoconj. J. 14:643-646, 1997 *
EMBL Database ID: AQ158899 AC: AQ158899 Oryza sativa 09/09/1998 *
EMBL Database ID: AQ328306 AC: AQ328306 Oryza sativa 11/01/1999 *
EMBL Database ID: B67847 AC: B67847 Arabidopsis thaliana 09/12/1997 *
Lerouge, P. et al.: "N-glycoprotein biosynthesis in plants: recent developments and future trends" Plant. Mol. Biol.38:31-48, 1998 *
Staudacher, E. et al.: "Functional purification and characterization of a GDP-fucose: beta-N-acetylglucosamine (Fuc to Asn linked GlcNAc) alpha 1,3-fucosyltransferase from mung beans", Glycoconj. J.12(6):780-786, 1995 *

Also Published As

Publication number Publication date
PT2062977E (pt) 2014-04-07
SK11182001A3 (sk) 2002-01-07
BR0010114A (pt) 2002-06-04
US20080234471A1 (en) 2008-09-25
MXPA01008372A (es) 2003-06-06
AU771995B2 (en) 2004-04-08
PL205785B1 (pl) 2010-05-31
CA2362964C (en) 2012-03-27
HUP0200394A3 (en) 2006-06-28
CZ308081B6 (cs) 2019-12-27
US20090199306A1 (en) 2009-08-06
PL363438A1 (en) 2004-11-15
IS6041A (is) 2001-08-08
EP1151109A1 (de) 2001-11-07
US8198078B2 (en) 2012-06-12
AT408446B (de) 2001-11-26
SK286416B6 (sk) 2008-09-05
ZA200106735B (en) 2002-08-15
DE50011116D1 (en) 2005-10-13
KR20010108234A (ko) 2001-12-07
CZ20012943A3 (cs) 2002-04-17
BG105899A (en) 2002-12-29
ATE304053T1 (de) 2005-09-15
IL144777A (en) 2007-12-03
CA2362964A1 (en) 2000-08-24
ATA27099A (de) 2001-04-15
AU2646000A (en) 2000-09-04
JP2011120592A (ja) 2011-06-23
NZ513685A (en) 2001-09-28
PL205710B1 (pl) 2010-05-31
JP5514386B2 (ja) 2014-06-04
HRP20010681A2 (en) 2003-08-31
JP2002536978A (ja) 2002-11-05
EE200100432A (et) 2002-12-16
DK2062977T3 (da) 2014-04-07
TR200102393T2 (tr) 2002-04-22
WO2000049153A1 (de) 2000-08-24
NO20013993L (no) 2001-10-17
ES2246222T3 (es) 2006-02-16
HU230075B1 (hu) 2015-06-29
EP2062977A1 (de) 2009-05-27
CN1360633A (zh) 2002-07-24
NO20013993D0 (no) 2001-08-16
YU58901A (sh) 2004-03-12
ES2444126T3 (es) 2014-02-24
IL144777A0 (en) 2002-06-30
EP1151109B1 (de) 2005-09-07
DK1151109T3 (da) 2006-01-16
BG65140B1 (bg) 2007-03-30
EP1642979A1 (de) 2006-04-05
US20130212740A1 (en) 2013-08-15
HUP0200394A2 (hu) 2002-05-29
US8895806B2 (en) 2014-11-25
EP2062977B1 (de) 2014-01-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US8895806B2 (en) Fucosyl transferase gene
US20070186311A1 (en) BETA 1,2-xylosyltransferase-gene from arabidopsis
KR20090077059A (ko) 갈락토실트랜스퍼라아제

Legal Events

Date Code Title Description
MK4A Patent expired

Effective date: 20200217