ES2444126T3 - Gen para la fucosiltransferasa - Google Patents

Gen para la fucosiltransferasa

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ES2444126T3 ES09154489.0T ES09154489T ES2444126T3 ES 2444126 T3 ES2444126 T3 ES 2444126T3 ES 09154489 T ES09154489 T ES 09154489T ES 2444126 T3 ES2444126 T3 ES 2444126T3
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Abstract

Procedimiento para la preparación de glicoproteínas recombinantes, que comprende la producción de unaglicoproteína recombinante en plantas o células de plantas, cuya producción de GlcNAc-a-1,3-fucosiltransferasa esinhibida o completamente impedida y cuya actividad de GlcNAc-a-1,3-fucosiltransferasa endógena es inferior al 50%de la actividad de GlcNAc-a-1,3-fucosiltransferasa que tiene lugar en las plantas o células de plantas naturales, ycuya GlcNAc-a-1,3-fucosiltransfera es codificada por una molécula de ADN, que comprende una secuencia según laSEC ID no 1 con un marco de lectura abierto del par de bases 211 al par de bases 1740 o presenta una homologíade por lo menos un 50% con respecto a la secuencia citada anteriormente o hibridiza con la secuencia citadaanteriormente en condiciones rigurosas o comprende una secuencia que, como consecuencia del código genético,está degenerada en la secuencia de ADN citada anteriormente.

Description

Gen para la fucosiltransferasa.
La presente invención se refiere a polinucleótidos que codifican para una fucosiltransferasa. La invención se refiere también a partes de la secuencia de dichos polinucleótidos así como a vectores que contienen dichos polinucleótidos, a células hospedadoras recombinantes y a plantas que han sido transfectadas por los polinucleótidos o por el ADN procedente de los mismos, así como a las glicoproteínas producidas en dicho sistema.
Las glicoproteínas presentan una multitud y complejidad de unidades de carbohidratos, cuya composición y disposición son características para organismos diferentes. Las unidades de oligosacárido de las glicoproteínas desempeñan una serie de funciones; así, por ejemplo, son importantes en la regulación del metabolismo, participan en la mediación de interacciones intercelulares, establecen los tiempos de circulación de proteínas en la circulación sanguínea y son decisivos para la detección de epítopes en las reacciones antigen/anticuerpo.
La glicosilación de las glicoproteínas comienza en el retículo endoplásmico (RE), donde se unen los oligosacáridos o bien a las cadenas laterales de asparagina por enlaces N-glucosílicos o bien a las cadenas laterales de serina o treonina por enlaces O-glucosílicos. Los oligosacáridos con enlaces N-glucosílicos contienen un núcleo común de una unidad de pentasacárido constituida por tres radicales de manosa y dos radicales de N-acetilglucosamina. Para la modificación ulterior de las unidades de carbohidratos, las proteínas son transportadas por el RE al complejo de Golgi. La estructura de las unidades de oligosacárido con enlace N-glucosílico de las glicoproteínas es determinada por su conformación y la composición de las glicosiltransferasas de los compartimentos Golgi en los que son procesadas.
Se ha demostrado que en el complejo de Golgi de algunas células de plantas e insectos la unidad de pentasacárido del núcleo se encuentra substituida por xilosa y fucosa con enlace α-1,3 (P. Lerouge et al. 1998 Plant Mol. Biol. 38, 31-48; Rayon et al. 1998 L. Exp. Bot. 49, 1463-1472). El heptasacárido “MMXF3” resultante constituye el tipo del oligosacárido principal en las plantas (Kurosaka et al. 1991 J. Biol. Chem., 266, 4168-4172). Así, por ejemplo, la peroxidasa de rábano picante, la β–fructosidasa de zanahorias y la lectina de Erythrina cristagalli así como la fosfolipasa A2 del veneno de las abejas melíferas o las glicoproeínas de la membrana neuronal de los embriones de insectos contienen radicales de α-1,3-fucosa, unidos al núcleo de glicano. Estas estructuras se denominan también N-glicanos complejos o N-glicanos deficientes en manosa o N-glicanos truncados. Además, los radicales α-manosilo pueden ser substituidos por GlcNAc, a los cuales están unidos galactosa y fucosa, produciendo una estructura que corresponde al epítope humano Lewis a (Melo et al. 1997, FEBS Lett. 415, 186-191; Fitchette-Laine et al. 1997 Plant
J. 12, 1411-1417).
Ni la xilosa ni la fucosa con enlace α-1,3 se encuentran en las glicoproteínas de mamíferos. Resulta que la α-1,3fucosa del núcleo desempeña un papel importante en la detección de epítopes de anticuerpos dirigidos contra los oligosacáridos con enlace N de insectos (I.B.H. Wilson et al., Glycobiology Vol. 8, no 7, p. 651-661, 1998), disparando reacciones inmunes en el cuerpo humano o animal contra dichos oligosacáridos. Además, el radical α1,3-fucosa parece ser una de las causas principales para la reactividad cruzada alérgica muy difundida entre los varios alergenos de plantas y de insectos (Tretter et al., Int. Arch. Allergy Immunol. 1993; 102:259-266) y se denomina también “determinante de carbohidrato de reacción cruzada” (CCD). En un estudio de los epítopes de tomates y polen de hierba se determinaron también radicales fucosa con enlace α-1,3 como determinante común, lo cual parece ser la causa de la frecuente aparición común de alergias de tomates y de polen de hierba en pacientes (Petersen et al. 1996, J. Allergy Clin. Immunol, Vol 98, 4; 805-814). Además, por la frecuente apariencia de las reacciones cruzadas inmunológicas, los CCDs ocultan los diagnósticos de alergias.
Dichas reacciones inmunológicas, que son desencadenadas por las proteínas de plantas en el cuerpo humano, representan el problema principal de la utilización médica de las proteínas humanas recombinantes, producidas en plantas. Para evitar dicho problema, habría que impedir la α-1,3-fucosilación del núcleo. En un estudio, se ha podido demostrar que los oligosacáridos que incluyen una L-galactosa en lugar de una L-fucosa (6-deoxi-L-galactosa) son no obstante completamente activos biológicamente (E. Zablackis et al. 1996, Science, Vol 272). Según otro estudio, se aisló una mutante de la planta Arabidopsis thaliana, a la que falta la N-acetilglucosaminiltransferasa I, que constituye la primera enzima en la biosintésis de glicanos complejos. La biosíntesis de las glicoproteínas complejas en dicha mutante se encuentra por lo tanto perturbada. No obstante, dichas plantas mutadas son capaces de desarrollarse de forma normal en ciertas condiciones (A. Schaewen et al. 1993, Plant Physiol. 102; 1109-1118).
Para impedir selectivamente el enlace de la α-1,3-fucosa del núcleo en un oligosacárido, sin por ello intervenir también en otras etapas de la glicosilación, habría que eliminar sólo la enzima que es directamente responsable de dicha glicosilación específica, es decir, la α-1,3-fucosiltransferasa del núcleo. Por primera vez, dicha transferasa se aisló y se caracterizó a partir de judías Mungo, y se descubrió que la actividad de dicha enzima es dependiente de la presencia de términos GlcNAc no reductores (Staudacher et al., 1995, Glycoconjugate J. 12, 780-786). Dicha transferasa, que tiene lugar sólo en plantas e insectos, pero no en el ser humano u otros vertebrados habría que ser desactivada o inhibida selectivamente, con el fin de conseguir que las proteínas humanas que son producidas en
plantas o células de plantas o también en insectos o células de insectos ya no contienen, a diferenica de antes, dicho epítope que dispara las reacciones inmunes.
El artículo de John M. Burke “Clearing the way for ribozymes” (Nature Biotechnology 15:414-415; 1997) se refiere al modo de funcionamiento general de ribozimas.
El artículo de Pooga et al. “Cell penetrating PNA constructs regulate galanin receptor levels and modify pain transmission in vivo” (Nature Biotechnology 16:857-861; 1998) se refiere a las moléculas de ANP de forma generalizada y específicamente a una molécula de ANP que es complementaria al ARNm humano del tipo de receptor de galanina 1.
La patente US no 5.272.066 A se refiere a un procedimiento para la modificación de proteínas eucariotes y procariotes, con el fin de prolongar su circulación in vivo. En dicho procedimiento, se modifican los oligosacáridos ligados con la ayuda de diferentes enzimas, entre las cuales se encuentra también la GlcNac-α1->3 (4)fucosiltransferasa.
El documento EP 0 643 132 A1 se refiere a la clonación de una α-1,3-fucosiltransferasa aislada a partir de células humanas (THP-1). Las cadenas de carbohidratos descritas en dicho documento corresponden a los oligosacáridos humanos del tipo sialil Lewis x y sialil Lewis a. La especificidad de la enzima procedente de células humanas es completamente distinta a la de la fucosiltransferasa procedente de células de plantas.
Otras fucosiltransferasas animales se describen en Costache et al. (J. Biol. Chem. 272(47), (1997): 29721-29728).
Un objetivo de la presente invención es clonar y secuenciar el gen que codifica para una fucosiltransferasa vegetal, así como proporcionar un procedimiento para preparar glicoproteínas, que comprenden la α-1,3-fucosa del núcleo que normalmente tiene lugar.
El objetivo según la invención se alcanza por medio de un procedimiento para preparar glicoproteínas recombinantes, que comprende la producción de una glicoproteína recombinante en plantas o células de plantas, cuya producción de GlcNAc-α-1,3-fucosiltransferasa queda inhibida o completamente impedida y cuya actividad de GlcNAc-α-1,3-fucosiltransferasa está por debajo de un 50% de la actividad de GlcNAc-α-1,3-fucosiltransferasa que tiene lugar en plantas o células de plantas naturales y la GlcNAc-α-1,3-fucosiltransferasa es codificada por una molécula de ADN, que utiliza una secuencia según la SEC ID No:1 (en la presente memoria se utilizó el código IUPAC, en el que “N” representa inosina) con un marco de lectura abierto desde el par de bases 211 hasta el par de bases 1740 o presenta una homología de por lo menos un 50% con respecto a la secuencia citada anteriormente o que se hibridiza con la secuencia citada anteriormente en condiciones rigurosas o comprende una secuencia que, como resultado del código genético, degenera en la secuencia de ADN citada anteriormente.
Dicha secuencia que nunca antes ha sido descrita resulta particularmente apta para cualquier experimento, análisis y procedimiento de preparación, etc., que se refieren a la actividad de la fucosiltransferasa de plantas. Para esto son de interés tanto la secuencia de ADN como la proteína para la que codifica dicha secuencia, utilizándose la secuencia de ADN, sin embargo, en particular para impedir la actividad de la fucosiltransferasa.
El marco de lectura abierto de la SEC ID No: 1 codifica para una proteína con 510 aminoácidos y un peso molecular teórico de 56,8 kDa, en el que se encuentra en la zona entre Asn36 y Gly54 probablemente una pieza transmembrana. El valor pI calculado de la proteína codificada de la secuencia según la SEC ID No: 1 es de 7,51.
La actividad de la fucosiltransferasa de plantas se detecta y se mide por medio de un método, en el que se adiciona la fucosiltransferasa a una muestra que comprende fucosa marcada y un aceptor (por ejemplo una glicoproteína) ligado a un soporte, por ejemplo Sefarosa. Una vez transcurrido el tiempo de reacción, se lava la muestra, y se mide el contenido en fucosa ligada. La actividad de la fucosiltransferasa se considera como positiva cuando la medición de la actividad es más alta en por lo menos un 10 a un 20%, en particular en por lo menos un 30 a un 50%, que la medición de la actividad del control negativo. Adicionalmente, la estructura de la glicoproteína puede verificarse mediante HPLC. Los protocolos de este tipo forman parte del estado de la técnica (Staudacher et al. 1998, Anal. Biochem. 246, 96-101; Staudacher et al. 1991, Eur. J. Biochem. 199, 745-751).
Por ejemplo, se adiciona fucosiltransferasa a una muestra que comprende fucosa marcada radiactivamente y un aceptor, por ejemplo GlcNAcβ1-2Manα-1,3(GlcNAcβ1-2Manα1-6)Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAcβ1-Asn. Una vez transcurrido el tiempo de reacción, se purifica la muestra por cromatografía de intercambio de aniones y se mide el contenido en fucosa ligada. La actividad puede calcularse a partir de la diferencia de la radiactividad medida de la muestra con aceptor y de la de un control negativo sin aceptor. La actividad de la fucosiltransferasa se considera ya como positiva cuando la radiactividad medida es más alta en por lo menos un 30-40% que la radiactividad medida del control negativo.
El apareamiento de dos moléculas ADN puede modificarse en función de la selección de la temperatura y de la
fuerza iónica de la muestra. Por condiciones rigurosas se entienden, según la invención, condiciones que permitan un enlace exacto, riguroso. Por ejemplo, las moléculas de ADN se hibridizan a 50oC en sulfato de sodio y dodecilo (SDS) al 7%, NaPO4 (sic) 0,5 M, pH 7,0; EDTA 1 mM, y el producto resultante se lava con SDS al 1% a 42oC.
Por ejemplo, el progama FastDB del EMBL o el banco de datos SWISSPROT permite determinar si las secuencias presentan una homología de por lo menos un 50% con la SEC ID No: 1.
La secuencia de la molécula ADN codifica para una proteína con una actividad de GlcNAc-α-1,3-fucosiltransferasa, en particular con una actividad de α-1,3-fucosiltransferasa del núcleo. Tal como ya se ha descrito anteriormente, la α-1,3-fucosiltransferasa del núcleo tiene lugar en plantas e insectos, pero no en el organismo humano, con lo cual es apta en particular dicha secuencia de ADN para ser utilizada en los análisis y experimentos específicos de la fucosiltransferasa así como en procedimientos de producción. Por una α-1,3-fucosiltransferasa del núcleo se entiende en particular la GlcNAc-α-1,3-fucosiltransferasa unida a GDP-L-Fuc:Asn. Para los fines de la presente invención, por la denominación α-1,3-fucosiltransferasa se entiende por lo general en particular la α-1,3fucosiltransferasa del núcleo. Para la medición de la actividad descrita anteriormente, son aptos en particular los aceptores con un término GlcNAc no reductor. Entre los ejemplos de aceptores de este tipo se incluyen GlcNAcβ12Manα-1-3(GlcNAcβ1-2Manα1-6)Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAcβ1-Asn, GlcNAcβ1-2Manα-1-3(GlcNAcβ1-2Manα16)Manβ1-4GlcNAcβ1-4(Fucα1-6GlcNAcβ1-Asn y GlcNAcβ1-2Manα-3[Manα-1-3(Manα1-6) Manα1-6]Manβ14GlcNAcβ1-4GlcNAcβ1-Asn. La medición de la insensibilidad a la N-glucosidasa F, lo cual puede detectarse por la espectrometría de masas, permite determinar si la fructosa está ligada.
Preferentemente, la molécula de ADN presenta una homología de por lo menos entre 70 y 80%, de forma particularmente preferida de por lo menos un 95%, con la secuencia según la SEC ID No: 1. Dicha secuencia codifica para una GlcNAc-α-1,3-fucosiltransferasa particularmente activa. Puesto que la secuencia de ADN puede estar modificada en mayor o menor grado según la planta o el insecto, una secuencia con una identidad de por ejemplo un 70% con la secuencia según la SEC ID No: 1, presenta también una actividad de fucosiltransferasa, que es suficiente para ser utilizada para análisis, experimentos o procedimientos de preparación, tal como se ha descrito anteriormente.
Se describe una molécula de ADN que comprende de 2.150 a 2.250, particularmente 2.198, pares de bases. Dicha molécula de ADN presenta de 100 a 300, preferentemente 210, pares de bases corriente arriba del codón de iniciación así como de 350 a 440, en particular 458, pares de bases corriente abajo del codón de terminación del marco de lectura abierto, en la que el extremo de la molécula de ADN presenta preferentemente una cola de 3’poli(A). De esta manera, está asegurada una regulación perfecta al nivel de traducción, y se describe una molécula de ADN que codifica de forma particularmente eficaz y exenta de problemas para una GlcNAc-α-1,3fucosiltransferasa activa.
Además, la presente invención se refiere a una molécula de ADN que comprende una secuencia según la SEC ID No: 3 o una secuencia que presenta una homología de por lo menos un 85%, de forma particularmente preferida de por lo menos un 95%, especialmente de por lo menos un 99%, con la secuencia citada anteriormente, o hibridiza en condiciones rigurosas con la secuencia citada anteriormente o que, como resultado del código genético, está degenerada en la secuencia de ADN citada anteriormente. La homología se determina preferentemente mediante un programa que detecta inserciones y deleciones y no las incluye en el cálculo de la homología. Dicha secuencia de nucleótidos codifica para un motivo de péptido conservado, es decir, que la mayoría de las GlcNAc-α-1,3fucosiltransferasas activas y funcionales comprende la secuencia de aminoácidos codificada por la misma. Dicha secuencia puede presentar el mismo tamaño que la secuencia según la SEC ID No: 3 o, alternativamente, ser naturalmente también más larga. Dicha secuencia presenta una longitud menor que la secuencia que codifica para la proteína entera, siendo por lo tanto menos sensible a recombinaciones, deleciones u otras mutaciones. Debido al motivo conservado y a su mayor estabilidad, dicha secuencia es particularmente apta para las pruebas de deteccción de secuencias.
La SEC ID No: 3 presenta la secuencia siguiente: 5’-gaagccctgaagcactacaaatttagcttagcgtttgaaaattcgaatg aggaagattatgtaactgaaaaattcttccaatcccttgttgctggaactgtccct-3’.
Se divulga una molécula de ADN que comprende una parte de la secuencia de una de las moléculas de ADN citadas anteriormente y presenta un tamaño de 20 a 200, preferentemente 30 a 50, pares de bases. La molécula de ADN puede utilizarse por ejemplo para unirse como sonda a secuencias complementarias de GlcNAc-α-1,3fucosiltransferasas, con lo cual dichas secuencias pueden ser seleccionadas a partir de una muestra. Esto permite seleccionar, aislar y caracterizar otras GlcNAc-α-1,3-fucosiltransferasas a partir de una amplia gama de plantas e insectos. Pueden utilizarse cualquier parte de la secuencia o también varias partes diferentes de la secuencia, en particular una parte del motivo conservado ya descrito anteriormente.
Resulta particularmente ventajoso que una de las moléculas de ADN citadas anteriormente esté asociada de forma covalente a una sustancia de marcaje. Como sustancia de marcaje es apto cualquier marcador convencional, por ejemplo marcadores fluorescentes, luminiscentes, radiactivos, marcajes no isotópicos, tales como biotina, etc. Esto
produce reactivos que son útiles para la detección, selección y cuantificación de moléculas de ADN apropiadas en muestras de tejidos sólidas (por ejemplo de plantas) o también en muestras líquidas por medio de métodos de hibridización.
Además, se divulga un vector biológicamente funcional, que comprende una de las moléculas de ADN citadas anteriormente o parte de las distintas longitudes del mismo, que comprende por lo menos 20 pares de base. Para la transfección en células hospedadoras se necesita un vector independiente, capaz de multiplicación, en el que pueda utilizarse un vector apropiado según la célula hospedadora, el mecanismo de transfección, la función y tamaño de la molécula de ADN. Puesto que se conocen un gran número de vectores diferentes, su enumeración superaría los límites de la presente solicitud de patente, por lo cual se omitirá dicha lista aquí, en particular porque los vectores son bien conocidos por los expertos en la materia (para los vectores y cualquier técnica o término conocidos por los expertos en la materia, ver también Sambrook Maniatis). Idealmente, el vector presenta un bajo peso molecular y debería contener genes seleccionables, con el fin de producir un fenotipo fácilmente detectable en una célula, permitiendo una selección fácil de células hospedadoras que contienen vectores y de las que son libres de vectores. Para obtener un alto rendimiento en ADN y los productos de genes correspondientes, el vector debería contener un fuerte promotor así como un “enhancer”, señales de amplficación de genes y secuencias de regulador. Para una replicación autónoma del vector, se necesita además un origen de replicación. Los puntos de poliadenilación son responsables para un procesamiento correcto del ARNm y las señales de “splicing” para el de los transcriptos de ARN. Si los vectores utilizados son fagos, virus o partículas de virus, las señales de empaquetamiento controlan el empaquetamiento del ADN vectorial. Por ejemplo, para la transcripción en plantas son aptos plásmidos Ti y para la transcripción en células de insectos son aptos los baculovirus y en los de insectos son aptos los transposones, tales como el elemento P.
Si el vector descrito anteriormente se infiltra en una planta o en una célula de plantas, se consigue una inhibición postranscripcional de la expresión génica del gen de α-1,3-fucosiltransferasa endógeno por transcipción de un transgen homólogo al mismo o a partes del mismo en la orientación “sentido”. Para dicha técnica “sentido”, ver además las publicaciones Baulcombe 1996, Plant Mol. Biol. 9:373-382 y Brigneti et al. 1998, EMBO J. 17:6739-6746. Esta strategia de “gene silencing” representa una opción eficaz para inhibir la expresión del gen de α-1,3fucosiltransferasa, ver también Waterhouse et al. 1998, Proc. Natl. Acad. Sci.. USA, 95:13959-13964.
Además, la divulgación se refiere a un vector biológicamente funcional, que comprende una molécula de ADN según una de las formas de realización descritas anteriormente en una orientación inversa al promotor. Si dicho vector se transfecta en una célula hospedadora, se lee un “ARNm antisentido” que es complementario al ARNm de la GlcNAcα-1,3-fucosiltransferasa y forma un complejo con el mismo. Dicho enlace obstaculiza o bien el procesamiento correcto, el transporte, estabilidad o bien la traducción por formación de un aducto con ribosomas y con esto la expresión génica normal de la GlcNAc-α-1,3-fucosiltransferasa.
Aunque toda la secuencia de la molécula ADN podría incorporarse en el vector, partes de la secuencia pueden ser más ventajosas para fines determinadas, debido a su menor tamaño. Lo importante del aspecto “sentido” es por ejemplo que la molécula de ADN sea lo suficientemente grande como para formar un ARN “antisentido” lo suficientemente grande que forma un enlace con el ARN de la transferasa. Por ejemplo, una molécula de ARN adecuada comprende 50 a 200 nucleótidos, puesto que muchas moléculas de ARN “antisentido” conocidas, que tienen lugar naturalmente, comprenden unos 100 nucleótidos.
Para una inhibición particularmente eficaz de la expresión de una α-1,3-fucosiltransferasa activa, resulta apta una combinación de la técnica “sentido” y de la técnica “antisentido” (Waterhouse et al. 1998, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 95:13959-13964).
De forma ventajosa, se utilizan moléculas de ARN de rápida hibridización. La eficacia de las moléculas ARN “antisentido” que presentan un tamaño de más de 50 nucleótidos depende de la cinética de formación de aductos in vitro. Así, por ejemplo, las moléculas de ARN “antisentido” de rápida formación de aductos presentan una mayor inhibición de la expresión de proteínas que las moléculas de ARN de lenta hibridización (Wagner et al. 1994, Annu. Rev. Microbiol., 48:713-742; Rittner et al. 1993, Nucl. Acids Res., 21:1381-1387). Las moléculas de ARN “antisentido” de este tipo de rápida hibridización incluyen en particular un gran número de bases externas (extremos libres y secuencias de unión), un gran número de subdominios estructurales (componentes) así como un bajo grado de bucles (Patzel et al. 1998; Nature Biotechnology, 16; 64-68). Las estructuras secundarias hipotéticas de la molécula de ARN “antisentido” pueden determinarse utilizando, por ejemplo, un programa de software, según el cual se realiza la selección de una secuencia de ADN/ARN “antisentido” adecuada.
Pueden incorporarse en el vector regiones distintas de la secuencia de la molécula de ADN. Una posibilidad consiste por ejemplo en incorporar en el vector sólo la parte que es responsable para la formación de aductos de las ribosomas. Un bloqueo en esta parte del ARNm es suficiente para parar la traducción entera. Una eficacia particularmente alta de las moléculas “antisentido” se obtiene también para las regiones 5’ y 3’ sin traducir del gen.
Una denominada molécula de ADN puede presentar una secuencia, que comprende una mutación por deleción,
inserción y/o substitución. El número de los nucleótidos así mutados es variable y se extiende de un solo nucleótido a varios nucleótidos mutados por deleción, inserción o substitución. También resulta posible que el marco de lectura quede trasladado como resultado de la mutación. Lo importante de un gen “knockout” de este tipo es solamente que la expresión de una GlcNAc-α-1,3-fucosiltransferasa esté perturbada, impidiendo la formación de una enzima activa, funcional. El lugar de dicha mutación es variable mientras se impida la expresión de una proteína enzimáticamente activa. Preferentemente, la mutación se encuentra en la zona catalítica de la enzima situada en la zona C terminal. Los procedimientos para introducir mutaciones en las secuencias de ADN es bien conocido por los expertos en la materia, de modo que aquí no es necesaria una discusión detallada de las varias posibilidades de mutagénesis. Aquí pueden utilizarse tanto las mutagénesis al azar como en particular las mutagenesis selectivas, por ejemplo la “sitedirected mutagenesis”, la mutagénesis controlada por oligonuecleótidos o las mutagenesesis con la ayuda de enzimas de restricción.
También se describe una molécula de ADN, que codifica para una ribozima que presenta dos secciones de la secuencia con por lo menos de 10 a 15 pares de bases cada una, que son complementarias a las secciones de la secuencia de una molécula de ADN, tal como se ha descrito anteriormente, tal como se ha descrito anteriormente, con lo cual la ribozima formará un complejo y cortará el ARNm transcrito por una molécula de ADN de una GlcNAcα-1,3-fucosiltransferasa natural. La ribozima reconoce la ARNm de la GlcNAc-α-1,3-fucosiltransferasa por el apareamiento de bases con el ARNm. A continuación, la ribozima corta y destruye la ARN de una forma específica para la secuencia, antes de que se someta la enzima a una traducción. Tras ser disociada del substrato cortado, la ribozima hibridiza repetidas veces con moléculas de ARN y actúa como endonucleasa específica. Por lo general, es posible preparar ribozimas específicamente para inactivar un ARNm determinado, incluso cuando no se conoce toda la secuencia de ADN que codifica para la proteína. Las ribozimas son particularmente eficaces cuando las ribosomas se deslizan lentamente por el ARNm. En este caso, resulta más fácil para la ribozima encontrar un sitio en el ARNm que es libre de ribosomas. Por este motivo, los mutantes de ribosomas lentos son aptos también como sistema para ribozomas (J. Burke, 1997, Nature Biotechnology; 15, 414-415). Dicha molécula de ADN es particularmente apto para inhibir o impedir la expresión de una GlcNAc-α-1,3-fucosiltransferasa de plantas.
Otra opción es utilizar una forma modificada de una ribozima, es decir, una minizima. Minizimas son eficaces en particular para cortar moléculas de ARNm de mayor tamaño. Una minizima es una ribozima cabeza de martillo que, en lugar del Stem/Loop II, presenta un “linker” de oligonucleótido corto. Son particularmente eficaces las minizimas diméricas (Kuwabara et al. 1998, Nature Biotechnology, 16; 961-965).
Por ello, se describe un vector biológicamente funcional que comprende una de las moléculas de ADN (mutación o molécula de ADN de ribozima) citadas por último. Lo que se ha expuesto anteriormente referente a los vectores es aplicable de forma análoga. Un vector de este tipo puede infiltrarse por ejemplo en un microorganismo y utilizarse para preparar altas concentraciones de las moléculas de ADN descritas anteriormente. Además, un vector de este tipo es particularmente apto para infiltrar la molécula específica de ADN en un organismo vegetal, con el fin de restringir o impedir completamente la producción de la GlcNAc-α-1,3-fucosiltransferasa en dicho organismo.
Se divulga un procedimiento para la preparación de un ADNc, que comprende la molécula de ADN divulgada, en el que se aísla ARN a partir de células de insectos o de plantas, en particular a partir de células del hipocotil, que se utilizará, tras adicionar una transcriptasa reversa y cebadores, para realizar una transcripción reversa. Las etapas individuales de dicho procedimiento se llevan a cabo según los protocoles conocidos de por sí. Para la transcripción inversa, existe, por un lado, la posibilidad de preparar el ADNc de todo el ARNm con ayuda de cebadores oligo(dT) y sólo entonces llevar a cabo una PCR con cebadores seleccionados, con el fin de preparar moléculas de ADN que comprenden el gen de la GlcNAc-α-1,3-fucosiltransferasa. Por otro lado, pueden utilizarse los cebadores seleccionados directamente para la transcripción reversa, con el fin de obtener un ADNc corto, específico. Los cebadores adecuados pueden prepararse por ejemplo por síntesis utilizando los modelos de las secuencias de ADNc de la transferasa. Dicho procedimiento permite preparar grandes cantidades de las moléculas de ADNc según la invención de forma muy rápida y sencilla y con una baja tasa de errores.
Además, se divulga un procedimiento para la clonación de una GlcNAc-α-1,3-fucosiltransferasa, caracterizado porque la molécula de ADN se clona en un vector, que se transfecta, a continuación, en una célula hospedadora o en un huésped, obteniéndose, por medio de selección y amplificación de células hospedadoras transfectadas, líneas de células que expresan la GlcNAc-α-1,3-fucosiltransferasa activa. La molécula de ADN se incorpora en el vector por ejemplo con ayuda de endonucleasas de restricción. Lo expuesto anteriormente es aplicable otra vez al vector. Lo importante de dicho procedimiento es que se seleccione un sistema de huésped/vector eficaz. Para obtener una enzima activa, son aptas en particular las células hospedadoras eucariotes. Una opción radica en transfectar el vector en células de insectos. En este caso, habría que utilizar en particular un virus de insecto como vector, por ejemplo baculovirus.
Naturalmente también es posible transfectar células humanas o las de otros vertebrados, que entonces expresarían una enzima ajena a dichas células.
Se divulga un procedimiento para la preparación de células hospedadoras recombinantes, en particular células de
plantas o células de insectos, u opcionalmente, plantas o insectos con una producción de GlcNAc-α-1,3fucosiltransferasa inhibida o completamente impedida, que está caracterizado porque por lo menos uno de los vectores según la invención, es decir, el que comprende la molecúla de ADN según la invención, la molécula de ADN mutada o la molécula que codifica para ribozimas o el que comprende la molécula de ADN en orientación inversa al promotor se infiltra en la célula hospedadora o la planta. Lo expuesto anteriormente referente a la transcipción es aplicable aquí también.
Las células hospedadoras utilizadas pueden ser por ejemplo células de plantas, siendo apto, por ejemplo, el plásmido Ti con el sistema Agrobacterium. El sistema Agrobacterium permite transfectar una planta directamente: las agrobacterias producen cecidomia de las raíces en las plantas. Cuando las agrobacterias infectan una planta herida, las bacterias mismas no llegan a la planta, sino que infiltran la sección del ADN recombinante, el denominado ADN T, del plásmido Ti anular, extracromosómico, inducido con el tumor en las células de plantas. El ADN T y con ello también la molécula ADN incorporada en el mismo se incorporan de forma estable en el ADN cromosómico de la célula, con lo cual los genes del ADN T vienen a ser expresados en la planta.
Existe un gran número de mecanismos de transfección eficaces conocidos para diferentes sistemas de huéspedes. Entre los ejemplos de dichos sistemas se incluyen la electroporación, el método de fosfato cálcico, la microinyección y el método de liposomas.
A continuación, las células transfectadas se someten a una selección, por ejemplo a base de sus resistencias a los antibióticos, para los cuales el vector posee genes, o de otros genes marcadores. A continuación, se amplifican las líneas de células transfectadas, o bien en cantidades menores, por ejemplo en placas de Petri, o bien en mayores cantidades, por ejemplo en fermentadores. Además, las plantas presentan una característica particular, puesto que son capaces de volver a desarrollarse a partir de una célula (transfectada) o de un protoplasto en una planta completa, que puede cultivarse.
Según el vector utilizado, se producen procesos en el huésped, los cuales inhiben o impiden completamente la expresión de la enzima.
Si el vector que comprende la molécula de ADN se transfecta por la mutación por deleción, inserción o substitución, se producirá una recombinación homóloga: La molécula de ADN mutada reconoce, a pesar de la mutación, la secuencia idéntica en el genoma de la célula hospedadora y se incorporará exactamente en este lugar, con lo cual se produce un gen “knockout”. De esta manera, se introduce en el gen para la GlcNAc-α-1,3-fucosiltransferasa una mutación, que puede inhibir la expresión correcta de la GlcNAc-α-1,3-fucosiltransferasa. Tal como ya se ha expuesto anteriormente, lo importante en esta técnica es que la mutación sea suficiente para impedir la expresión de la proteína activa. Tras la selección y amplificación, una comprobación adicional puede consistir en secuenciar el gen, con el fin de establecer el éxito de la recombinación homóloga o el grado de la mutación.
Si el vector que comprende la molécula de ADN que codifica para una ribozima se transfecta, se expresará la ribozima activa en la célula hospedadora. La ribozima forma un complejo con la secuencia complementaria del ARNm de la GlcNAc-α-1,3-fucosiltransferasa por lo menos en un sitio, corta este sitio, inhibiendo de esta manera la traducción de la enzima. En esta célula hospedadora así como en las líneas de células que proceden de la misma o de la planta, no se expresará la GlcNAc-α-1,3-fucosiltransferasa.
En el caso del vector que comprende la molécula de ADN divulgada en la dirección “sentido” o inversa al promotor, se expresa en la célula (o planta) transfectada un ARNm “sentido” o “antisentido”. El ARNm “antisentido” o “sentido” es complementario con por lo menos una parte de la secuencia del ARNm de la GlcNAc-α-1,3-fucosiltransferasa y puede inhibir igualmente la traducción de la enzima. Como un ejemplo de un procedimiento para inhibir la expresión de un gen mediante la técnica “antisentido”, ver la publicación de Smith et al. 1990, Mol. Gen. Genet. 224:477-481, en la que está inhibida la expresión de un gen involucrado en el proceso de maduración del tomate.
En todos los sistemas, por lo menos se inhibe, preferentemente incluso se impide completamente la expresión de la GlcNAc-α-1,3-fucosiltransferasa. El grado de perturbación de la expresión de gen depende del grado de formación de complejo, recombinación homóloga, de eventuales mutaciones al azar, subsiguientes y de otros procesos en la región del genoma. Las células transfectadas se investigan con respecto a la actividad de GlcNAc-α-1,3fucosiltransferasa y se seleccionan.
También cabe la posibilidad de reforzar aún más la inhibición de la expresión de la GlcNAc-α-1,3-fucosiltransferasa descrita anteriormente, infiltrando en el huésped, además de la infiltración de un vector tal como se ha descrito anteriormente, un vector que comprende un gen que codifica para una proteína de un mamífero, por ejemplo β-1,4galactosiltransferasa. La fucosilación puede quedar disminuida por la acción de otras enzimas de mamíferos, siendo particularmente eficaz la combinación de la inhibición de la expresión de una α-1,3-fucosiltransferasa activa con ayuda de un vector según la invención y con ayuda de un vector de una enzima de mamífero.
Para la transfección puede utilizarse cualquier tipo de planta, por ejemplo la judía Mungo, la planta de tabaco, de
tomate y/o de patata.
Otro procedimiento ventajoso para la preparación de células hospedadoras recombinantes, en particular células de plantas o plantas, consiste en infiltrar la molécula de ADN que comprende la mutación en el genoma de la célula hospedadora o de la planta en lugar de la secuencia homóloga, no mutada (Schaefer et al. 1997, Plant J.; 11(6):1195-1206). Por tanto, dicho procedimiento no funciona con un vector, sino con una molécula pura de ADN. La molécula se infiltra en el huésped por ejemplo por bombardeo genético, microinyección o electroporación, para mencionar sólo tres ejemplos. Tal como ya se ha expuesto anteriormente, la molécula de ADN se coloca al lado de la secuencia homóloga en el genoma del huésped, con lo cual se produce una recombinación homóloga, provocando de esta manera una mutación por deleción, inserción o substitución en el genoma: La expresión de la GlcNAc-α-1,3-fucosiltransferasa puede inhibirse o impedirse completamente.
Se describen las plantas o células de plantas, cuya actividad de GlcNAc-α-1,3-fucosiltransferasa es preferentemente por debajo de un 50%, en particular por debajo de un 20%, de forma particularmente preferida de un 0%, de la actividad de GlcNAc-α-1,3-fucosiltransferasa que tiene lugar en plantas o células de plantas naturales. La ventaja de dichas plantas o células de plantes radica en que las glicoproteínas producidas por las mismas no presenta fucosa con un enlace α-1,3 o muy poco de la misma. Cuando los productos de dichas plantas son ingeridos por el cuerpo humano o el de un vertebrado, no se produce una reacción inmune contra el epítope α-1,3-fucosa.
Se describen plantas o células de plantas recombinantes, que son preparadas según uno de los procedimientos descritos anteriormente y cuya producción de GlcNAc-α-1,3-fucosiltransferasa queda inhibida o completamente impedida.
Se divulgan también insectos o células de insectos recombinantes preparados según uno de los procedimientos descritos anteriormente y cuya producción de GlcNAc-α-1,3-fucosiltransferasa queda inhibida o completamente impedida. Aquí tampoco se producen glicoproteínas con radicales de fucosa con enlace α-1,3, con lo cual tampoco se produce una reacción inmune contra el epítope α-1,3-fucosa.
Se menciona también una molécula de ANP que comprende una secuencia de bases que es complementaria con la secuencia de la molécula de ADN según la invención. El ANP (ácido nucleico peptídico) es una secuencia similar a la de ADN, en la que las nucleobases están unidas a una espina dorsal de seudopéptido. El ANP hibridiza por lo general con los oligómeros de ADN, ARN o ANP complementarios por apareamiento de bases según Watson-Crick y formación de hélix. La espina dorsal de péptido asegura una mayor resistencia a la degradación enzimática. Por lo tanto, la molécula de ANP constituye un mejor reactivo “antisentido”. Ni las nucleasas ni las proteasas son capaces de atacar una molécula de ANP. La estabilidad de la molécula de ANP, en caso de ser unida a una secuencia complementaria, presenta un bloqueo estérico suficiente de las polimerasas de ADN y ARN, de la transcriptasa reversa, telomerasa y de las ribosomas.
Si la molécula de ANP presenta la secuencia citada anteriormente, se unirá al ADN o a un sitio del ADN que codifica para la GlcNAc-α-1,3-fucosiltransferasa y puede inhibir de esta manera la transcripción de dicha enzima. Puesto que la molécula de ANP ni se transcribe ni se traduce, se prepara sintéticamente, por ejemplo con ayuda de la técnica tboc.
Se divulga una molécula de ANP, que comprende una secuencia de bases que corresponde a la secuencia de la molécula de ADN según la invención. Dicha molécula de ANP forma un complejo con el ARNm o un sitio del ARNm de la GlcNAc-α-1,3-fucosiltransferasa, inhibiendo la traducción de la enzima. Lo que se ha dicho con respecto al ARN “antisentido” es aplicable aquí de forma análoga. Así, por ejemplo, una región de formación de complejo particularmente eficaz es la región del inicio de la traducción o también las regiones 5’ no traducidas del ARNm.
Se divulga un procedimiento para la preparación de plantas, insectos o células, en particular células de plantas o de insectos, que presentan una expresión bloqueada de la GlcNAc-α-1,3-fucosiltransferasa al nivel de la transcripción o traducción, que está caracterizado porque en las células se infiltran moléculas de ANP según la invención. Para la infiltración de la molécula de ANP o de las moléculas de ANP en la célula, se utilizan otra vez los métodos convencionales, tales como por ejemplo la electroporación o microinyección. La infiltración resulta particularmente eficaz si los oligómeros de ANP están unidos a péptidos penetradores de células, por ejemplo transportan o pAntp (Pooga et al. 1998, Nature Biotechnology, 16: 857-861).
La invención proporciona un procedimiento para la preparación de glicoproteínas recombinantes, que está caracterizado porque las plantas o células de plantas recombinantes según la invención, cuya producción de la GlcNAc-α-1,3-fucosiltransferasa queda inhibida o completamente impedida, o plantas o insectos o células, en las que se han infiltrado las moléculas de ANP por medio del procedimiento según la invención, se han transfectado con el gen que codifica para la glicoproteína recombinante, con lo cual vienen a ser expresadas las glicoproteínas recombinantes. En dicho procedimiento, se transfectan los vectores ya descritos anteriormente que comprenden genes para las proteínas deseadas en el huésped o en las células hospedadoras, tal como ya se ha descrito también anteriormente. Las células de plantas o de insectos transfectados expresan las proteínas deseadas, no
presentando fucosa con enlace α-1,3 o muy poco de la misma. Por tanto, no disparán las reacciones inmunes ya mencionadas anteriormente en el cuerpo humano o el de un vertebrado. Esto permite producir cualquier proteína en dichos sistemas.
Preferentemente, se proporciona un procedimiento para la preparación de glicoproteínas recombinantes humanas, que está caracterizado porque las plantas o células de plantas recombinantes, cuya producción de la GlcNAc-α-1,3fucosiltransferasa queda inhibida o completamente impedida, o plantas o células, en las que se han infiltrado las moléculas de ANP por medio del procedimiento según la invención, se han transfectado con el gen que codifica para la glicoproteína, con lo cual vienen a ser expresadas las glicoproteínas recombinantes. Dicho procedimiento permite producir proteínas humanas en (células de) plantas, que, al ser absortas por el cuerpo humano, no disparan una reacción inmune dirigida contra los radicales de fucosa con enlace α-1,3. Al mismo tiempo, cabe la posibilidad de utilizar, para la producción de las glicoproteínas recombinantes, tipos de plantas que sirven de alimentos, por ejemplo plátano, patata y/o tomate. Los tejidos de dicha planta comprenden la glicoproteína recombinante, con lo cual la glicoproteína recombinante es absorta por el cuerpo humano por ejemplo por extracción de la glicoproteína recombinante del tejido, seguido por administración o directamente por el consumo del tejido vegetal.
Se prefiere un procedimiento para la preparación de glicoproteínas recombinantes humanas para su utilización en medicina, que está caracterizado porque las plantas o células de plantas recombinantes según la invención, cuya producción de la GlcNAc-α-1,3-fucosiltransferasa queda inhibida o completamente impedida, o plantas o células, en las que se han infiltrado las moléculas de ANP por medio del procedimiento según la invención, se han transfectado con el gen que codifica para la glicoproteína, con lo cual vienen a ser expresadas las glicoproteínas recombinantes. Con tal fin, puede utilizarse cualquier proteína que es de interés en medicina.
La presente invención también se refiere a glicoproteínas recombinantes, que se han preparado según un procedimiento descrito anteriormente en sistemas de plantas o de insectos y cuya secuencia de péptidos presenta menos de un 50%, en particular menos de un 20%, de forma particularmente preferida un 0%, de los radicales de fucosa con enlace α-1,3 que tienen lugar en las proteínas expresadas en los sistemas de plantas o de insectos no reducidos por la fucosiltransferasa. Naturalmente, hay que dar preferencia a las glicoproteínas que no presentan radicales de fucosa con enlace α-1,3. La cantidad de fucosa con enlace α-1,3 depende del grado de la inhibición de la GlcNAc-α-1,3-fucosiltransferasa descrita anteriormente.
Preferentemente, la presente invención se refiere a glicoproteínas recombinantes humanas, que se han preparado según un procedimiento descrito anteriormente en sistemas de plantas o de insectos y cuya secuencia de péptidos presenta menos de un 50%, en particular menos de un 20%, de forma particularmente preferida un 0%, de los radicales de fucosa con enlace α-1,3 que tienen lugar en las proteínas expresadas en los sistemas de plantas o de insectos no reducidos por la fucosiltransferasa.
Se describen glicoproteínas recombinantes humanas para su utilización en medicina, que se han preparado según un procedimiento descrito anteriormente en sistemas de plantas o de insectos y cuya secuencia de péptidos presenta menos de un 50%, en particular menos de un 20%, de forma particularmente preferida un 0%, de los radicales de fucosa con enlace α-1,3 que tienen lugar en las proteínas expresadas en los sistemas de plantas o de insectos no reducidos por la fucosiltransferasa.
Dichas glicoproteínas pueden contener otras unidades de oligosacáridos unidas que son específicas de plantas o de insectos, por lo cual serán diferentes – en el caso de las glicoproteínas humnas – de las glicoproteínas naturales. No obstante, las glicoproteínas iniciarán una menor reacción inmune o ninguna en absoluto en el cuerpo humano, puesto que, tal como ya se ha representado en la introducción de la descripción, los radicales de fucosa con enlace α-1,3 son la causa principal de las reacciones inmunes o reacciones inmunes cruzadas contra las glicoproteínas de plantas y de insectos.
Se divulga una composición farmacéutica que comprende las glicoproteínas. Además de las glicoproteínas, la composición farmacéutica comprende también otros aditivos convencionales para este tipo de composiciones. Se trata por ejemplo de diluyentes con contenidos diferentes de tampones (por ejemplo Tris-HCl, acetato, fosfato), pH y fuerza iónica, aditivos, tales como tensioactivos y disolventes (por ejemplo Tween 80, Polysorbate 80), conservantes (por ejemplo, timerosal, alcohol benzílico), adyuvantes, antioxidantes (por ejemplo ácido ascórbico, metabisulfito sódico), emulsificadores, cargas (por ejemplo lactosa, manitol), enlaces covalentes del polímero, tal como por ejemplo polietilenglicol, con la protéina, incorporación del material en preparaciones en forma de partículas de compuestos poliméricos, tal como por ejemplo ácido poliláctico, ácido poliglicólico, etc., o en liposomas, sustancias auxiliares y/o vehículos útiles para el tratamiento correspondiente. Las composiciones de este tipo afectarán al estado físico, la estabilidad, la velocidad de la liberación in vivo y la velocidad de la excreción in vivo de las glicoproteínas según la invención.
Se describe también un procedimiento para la selección de moléculas de ADN que codifican para una GlcNAc-α-1,3fucosiltransferasa en una muestra, a la que se adicionan las moléculas de ADN divulgadas marcadas, las cuales se unen a las moléculas de ADN que codifican para una GlcNAc-α-1,3-fucosiltransferasa. Las moléculas de ADN
hibridizadas pueden detectarse, cuantificarse y seleccionarse. Con el fin de asegurar que la muestra contiene ADN monohebra que permite hibridizar las moléculas de ADN marcadas, se procede a desnaturalizar la muestra, por ejemplo calentándola.
Una opción consiste en separar el ADN que se va a investigar, si se desea, tras la adición de endonucleasas, por electroporesis sobre gel en un gel de agarosa. Tras trasladarlo a una membrana de nitrocelulosa, se adicionan las moléculas de ADN marcadas, que hibridizan con la molécula de ADN homóloga (“Southern Blotting”).
Otra opción es encontrar genes homólogos procedentes de otras especies por medio de métodos dependientes de PCR, utilizando cebadores específicos y/o degenerados, derivados de la secuencia de la molécula de ADN divulgada.
Preferentemente, la muestra comprende, para el procedimiento según la invención citado anteriormente, ADN genómica de un organismo vegetal. Dicho procedimiento permite investigar un gran número de plantas por presencia del gen de la GlcNAc-α-1,3-fucosiltransferasa de manera muy rápida y eficaz. Esto permite seleccionar las plantas que no contienen dicho gen o inhibir o impedir completamente la expresión de la GlcNAc-α-1,3fucosiltransferasa en las plantas o insectos que contienen dicho gen por medio del procedimiento según la invención descrito anteriormente, de modo que pueden utilizarse a continuación para la transfección y producción de glicoproteínas (humanas).
Asimismo, se mencionan las moléculas de ADN que codifican para una GlcNAc-α-1,3-fucosiltransferasa que han sido seleccionadas y luego aisladas de la muestra según los dos procedimientos citados por último. Dichas moléculas pueden utilizarse para otras investigaciones. Pueden secuenciarse y utilizarse también por su lado como sondas de ADN para encontrar GlcNAc-α-1,3-fucosiltransferasas. Dichas moléculas de ADN marcadas funcionarán de forma más eficaz que las moléculas de ADN según la invención como sondas para los organismos que presentan una relación más estrecha con los organismos a partir de los cuales fueron aisladas.
Se divulga una preparación de GlcNAc-α-1,3-fucosiltransferasa clonada que presenta isoformas con valores pI comprendidos entre 6,0 y 9,0, en particular entre 6,8 y 8,2. El valor pI de una proteína es el valor pH en el que su carga neta es de zero y es una función de la secuencia de aminoácidos, del modelo de glicosilación y también de la estructura espacial de la proteína. La GlcNAc-α-1,3-fucosiltransferasa comprende por lo menos 7 isoformas que presentan un valor pI en dicho intervalo. La razón de las diferentes isoformas de la transferasa son por ejemplo diferentes glicosilaciones y proteólisis limitada. Se ha demostrado por medio de experimentos que las plantas de semillero de las judías Mungo procedentes de plantas diferentes presentan relaciones diferentes de las isozimas. El valor pI de una proteína puede establecerse por enfoque isoeléctrico conocido por los expertos en la materia.
La isoforma principal de la enzima presenta un peso molecular aparente de 54 kDa.
En particular, la preparación comprende isoformas con valores pI de 6,8, 7,1 y 7,6.
Se describe también un procedimiento para la preparación de unidades de carbohidrato “vegetalizadas” procedentes de glicoproteínas humanas y de otros vertebrados, en el que a una muestra que comprende una unidad de carbohidrato o una glicoproteína se adicionan unidades de fucosa así como una GlcNAc-α-1,3-fucosiltransferasa codificada por una molécula de ADN descrita anteriormente, con lo cual la GlcNAc-α-1,3-fucosiltransferasa une la fucosa a la unidad de carbohidrato o a la glicoproteína en la posición α-1,3. El procedimiento según la invención para la clonación de GlcNAc-α-1,3-fucosiltransferasa preparar grandes cantidades de la enzima purificada. Para obtener una transferasa completamente activa, se establecen condiciones de reacción adecuadas. Se ha hallado que la transferasa presenta una actividad particularmente alta a un valor pH de aproximadamente 7, si el tampón utilizado es el ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico-HCl. En presencia de cationes bivalentes, en particular Mn2+, se refuerza la actividad de la transferasa recombinante. La unidad de carbohidrato se adiciona a la muestra o bien en una forma no ligada o ligada a una proteína. La transferasa recombianate es efectiva para ambas formas.
A continuación, la invención se ilustrará con mayor detalle haciendo referencia a los ejemplos y figuras de los dibujos adjuntos, que no limitan la invención. Específicamente, se muestran: en las Figs. 1a y 1b del dibujo, las cantidades de proteína medidas y la activiadad de enzima medida en las fracciones individuales del eluado como curvas; en la Fig. 2, una representación de un gel de electroforesis de la GlcNAc-α-1,3-fucosiltransferasa; en la Fig. 3, el resultado del enfoque isoeléctrico y la actividad de transferasa medida de las isoformas individuales; en la Fig. 4, las secuencias N-terminales de 4 péptidos trípticos 1 – 4 así como la secuencia de ADN de tres cebadores S1, A2 y A3; en las Figs. 5a y 5b, la secuencia de ADNc de la α-1,3-fucosiltransferasa; en las Figs. 6a y 6b, la secuencia de aminoácidos de la α-1,3-fucosiltransferasa derivada de la anterior; en la Fig. 7, una representación esquemática de la α-1,3-fucosiltransferasa así como la hidrofobicidad de los radicales de aminoácidos; en la Fig. 8, una comparación de los motivos conservados de las diferentes fucosiltransferasas; en la Fig. 9, una comparación de la actividad de la fucosiltransferasa de células de insectos transfectadas con el gen de la α-1,3-fucosiltransferasa con un control negativo; en las Figs. 10a y 10 b, las estructuras de diferentes aceptores de la α-1,3-fucosiltransferasa; en las Figs. 11 y 12, los espectros de masas; y, en la Fig. 13, el resultado de una HPLC.
Ejemplo 1:
Aislamiento de la -1,3-fucosiltransferasa del núcleo
5 Todas las etapas se llevaron a cabo a 4oC. Plantas de semillero de judías Mungo se homogenizaron en una mezcladora, utilizando un volumen de 0,75 del tampón de extracción por kg de judías. A continuación, el material homogenizado se filtró pasándolo por dos capas de tejido de algodón, y el filtrado se centrifugó a 30.000 g durante 40 min. Se descartó el sobrenadante, y se extrajo el pellet con un tampón de disolución durante la noche con
10 agitación constante. La centrifugación subsiguiente a 30.000 g durante 40 min. produjo el extracto de Triton.
El extracto de Triton se purificó de la manera siguiente:
Etapa 1: El extracto de Triton se colocó en un intercambiador de aniones microgranular de dietilaminoetilcelulosa 15 con una columna de celulosa DE52 (5x28 cm, de la empresa Whatman), que anteriormente se había calibrado con el tampón A. La fracción no ligada se sometió a un tratamiento posterior en la etapa 2.
Etapa 2: La muestra se colocó en una columna (2,5x32) Affi-Gel Blue calibrada con el tampón A. Tras lavar la columna con este tampón, se eluyó la proteína adsorta con el tampón A que contiene NaCl 0,5 M.
20 Etapa 3: Tras la diálisis del eluado de la etapa 2 utilizando el tampón B, el mismo se colocó en una columna S-Sefarosa calibrada con el mismo tampón. La proteína ligada se eluyó con un gradiente lineal de NaCl 0 a 0,5 M en el tampón B. Las fracciones que contienen la GlcNAc-α-1,3-fucosiltransferasa se combinaron y se sometieron a una diálisis con el tampón C.
25 Etapa 4: La muestra dializada se colocó en una columna GnGn-Sefarosa calibrada con el tampón C. La proteína ligada se eluyó utilizando el tampón C que contiene NaCl 1 M en lugar de MnCl2.
Etapa 5: A continuación, la enzima se sometió a una diálisis con el tampón D y se colocó en una columna de
30 GDP/hexanolamina/Sefarosa. Tras lavar la columna con el tampón D, se eluyó la transferasa reemplazando MgCl2 y NaCl con GDP 0,5 mM. Las fracciones activas se unieron, se dializaron con el tampón Tris-HCl 20 mM, pH 7,3, y se liofilizaron.
La actividad enzimática de la GlcNAc-α-1,3-fucosiltransferasa se determinó utilizando el péptido GnGn y GDP-L-[U
35 34C]-fucosa en una cantidad de substrato de 0,5 y 0,25, respectivamente, en presencia del tampón ácido 2-(Nmorfolino)etanosulfónico-HCl, Triton X-100, MnCl2, GlcNAc y AMP (según Staudacher et al. 1998 Glycoconjugate J. 15, 355-360; Staudacher et al. 1991 Eur. J. Biochem. 199, 745-751).
Las concentraciones de proteína se determinaron con ayuda del método Ácido bicincónico (Pierce) o, durante las 40 últimas etapas de la purificación enzimática, por medio del análisis de aminoácidos (Altmann 1992, Anal. Biochem. 204, 215-219).
En las Figs. 1a y 1b, se han representado las cantidades de proteína medidas y la actividad enzimática medida en las fracciones individuales del eluado como curvas. La Fig. 1a muestra la separación descrita anteriormente en la
45 columna de S-Sefarosa, y la Fig. 1b la separación en la columna de GnGn-Sefarosa, en la que el círculo es la proteína, el círculo lleno negro la GlcNAc-α-1,3-fucosiltransferasa y el cuadrángulo N-acetil-�-glucosaminidasa. Un U es definido como la cantidad de enzima que transfiere 1 μmol de fucosa por minuto a un aceptor.
La Tabla 1 muestra las etapas individuales de la purificación de la transferasa. 50 Tabla 1
Etapa de purificación
Tot. Prot. Tot. Act. Activ. Esp. Factor de purificación Rendimiento
mg
mU mU/mg Veces %
Extracto de Triton X-100
91.500 4.846 0,05 1 100
DE52
43.700 4.750 0,10 2 98,0
Affigel Blue
180,5 4.134 23 460 85,3
S-Sefarosa
8,4 3.251 390 7.800 67,1
GnGn-Sefarosa
0,131 1.044 8.030 160.000 21,5
GDP/hexanolamina/Sefarosa
0,021 867 43.350 867.000 17,9
1 se determinó por medio del análisis de aminoácidos Tampón de extracción:
Ditiotreitol 0,5 mM EDTA 1 mM Polivinilpolipirrolidona al 0,5% Sacarosa 0,25 M Tampón Tris-HCl 50 mM, pH 7,3
Tampón de disolución:
Ditiotreitol 0,5 mM EDTA 1 mM Triton X-100 al 1,5% Tampón Tris-HCl 50 mM, pH 7,3
Tampón A:
Tampón Tris-HCl 25 mM, pH 7,3 que contiene: Triton X-100 al 0,1% y NaN3 al 0,02%
Tampón B:
Tampón citrato sódico 25 mM, pH 5,3 que contiene: Triton X-100 al 0,1% y NaN3 al 0,02%
Tampón C:
Tampón Tris-HCl 25 mM, pH 7,3 MnCl2 5 mMy NaN3 al 0,02%
Tampón D:
Tampón Tris-HCl 25 mM, pH 7,3 que contiene: MgCl2 10 mM NaCl 0,1 M y NaN3 al 0,02%
Ejemplo 2:
SDS-Page y enfoque isoeléctrico
Un SDS-Page se realizó en una Biorad Mini-Protean Cell sobre geles que contenían un 12,5% de acrilamida y 1% de bisacrilamida. Los geles se tiñieron o bien con Coomassie Brilliant Blue R-250 o bien con plata. El enfoque isoeléctrico de la fucosiltransferasa se llevó a cabo sobre geles con un intervalo pI comprendido entre 6 y 9 (Servalyt precotes 6-9, Serva). Los geles se tiñieron con plata según el protocolo del fabricante. Para la electroforesis bidimensional, se cortaron bandas del gel de enfoque, que fueron tratadas con reactivos de S-alquilación y SDS y se sometieron a un SDS-Page tal como se ha descrito anteriormente.
La Fig. 2 muestra un gel de electroforesis de la GlcNAc-α-1,3-fucosiltransferasa, en la que se ha representado la electroforesis bidimensional a mano izquierda y el SDS-Page unidimensional a mano derecha. El trayecto denominado A es un estándar, el trayecto denominado B es la GlcNAc-α-1,3-fucosiltransferasa de la columna de GnGn/Sefarosa y el trayecto denominado C es la GlcNAc-α-1,3-fucosiltransferasa “purificada”, es decir, la fracción de la columna de GDP/hexanolamina/Sefarosa. Las dos bandas a 54 y 56 kDa representan isoformas de la transferasa.
La Fig. 3 muestra el resultado del enfoque isoeléctrico. El trayecto A se tiñió con plata, y la actividad de las isoformas de la transferasa se comprobó en el trayecto B. La actividad se ha indicado como % de fucosa transferido por la GDP-fucosa al substrato.
Ejemplo 3:
Secuenciación de péptidos
Para la secuenciación de la proteína, se cortaron bandas del gel de SDS/poliacrilamida teñido con Coomassie, se
sometieron las mismas a una carboxamidometilación y se disociaron con tripsina según Görg et al. 1988, Electrophoresis, 9, 681-692. Los péptidos trípticos se separaron por medio de HPLC con fase reversa en una columna Vydac C18 de 1,0x250 mm a 40oC a un caudal de 0,05 ml/min, utilizando un aparato HP 1100 (Hewlett-Packard). Los péptidos aislados se secuenciaron con un sistema de secuenciación de proteínas G10005A de Hewlett-Packard según el protocolo del fabricante. Además, se analizó la mezcla de péptidos por medio de digestión Ingel con MALDI-TOF MS (ver abajo).
La Fig. 4 muestra las secuencias N-terminales de 4 péptidos trípticos 1 – 4 (SEC ID No: 5-8). A partir de los tres primeros péptidos, se prepararon los cebadores S1, A2 y A3 (no. de identificación de la secuencia 9-11).
Ejemplo 4:
RT-PCR y clonación de ADNc
Todo el ARN se aisló a partir de un hipocotil de judías mungo de 3 días, utilizándose el sistema de aislamiento de SV Total ARN de Promega. Para la preparación del ADNc de la primera hebra, se incubó todo el ARN a 48oC durante 1 h con AMV transcriptasa reversa y cebadores de oligo(dT), utilizándose el sistema de transcriptasa reversa de Promega.
El ADNc de la primera hebra se sometió a una PCR, utilizando una combinación de cebadores “sentido” y “antisentido”:
A 10 μl de la reacción de transcripción reversa, se adicionó la cantidad siguiente:
50 μl que contenía 0,1 μmol de cada cebador, dNTPs 0,1 mM, MgCl2 2 mM, tampón Tris-HCl 10 mM, pH 9,0, KCl 50 mM y Triton X-100 al 0,1%.
Tras una primera etapa de desnaturalización a 95oC durante 2 min., se realizaron 40 ciclos de 1 min. a 95oC, 1 min. a 49oC y 2 min. a 72oC. La última etapa de extensión se realizó a 72oC durante 8 min. Los productos PCR se subclonaron en el vector pCR2.1, utilizando el TA Cloning Kit de Invitrogen, y se secuenciaron. Los productos de dicha PCR eran dos fragmentos de ADN con una longitud de 744 bp y 780 bp, presentando ambos fragmentos el mismo extremo 5’ (ver también la Fig. 7).
A partir de dichos dos fragmentos de ADN, se obtuvieron las regiones 5’ y 3’ del ADNc que faltaban por Rapid Amplification 5’ y 3’ de los extremos ADNc (RACE), utilizando el RACE kit de Gibco-BRL. Se utilizó como cebador “antisentido” el cebador de amplificación universal del kit y como cebador “sentido” o bien 5’-CTGGAACTGTCCCTGTGGTT-3’ (SEC ID NO: 12) o bien 5’-AGTGCACTAGAGGGCCAGAA-3’ (SEC ID NO: 13). Se utilizó como cebador “sentido” también el cebador de anclaje acortado del kit y como cebador “antisentido” 5’-TTCGAGCACCACAATTGGAAAT-3’ (SEC ID NO: 14) o 5’-GAATGCAAAGACGGCACGATGAAT-3’ (SEC ID NO: 15).
La PCR se realizó a una “Annealing Temperature” de 55oC en las condiciones descritas anteriormente. Los productos RACE 5’ y 3’ se subclonaron en el vector pCR2.1 y se secuenciaron: Las secuencias de los fragmentos subclonados se secuenciaron por medio del método de didesoxinucleótido (ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Ready reaction Kit y ABI PRISM 310 Genetic analyser (Perkin Elmer)). Para la secuenciación de los productos clonados en el vector pCR2.1, se utilizaron los cebadores directos T7 y M13. Ambas hebras de la región codificadora se secuenciaron por el Vienna VBC Genomics Sequencing Service, utilizándose cebadores marcados con infrarrojo (IRD700 e IRD800) y un secuenciador LI-COR Long Read IR 4200 (Lincoln, NE).
Las Figs. 5a y 5b muestran el ADNc entero, que presenta un tamaño de 2.198 bp y un marco de lectura abierto de
1.530 bp (SEC ID NO: 1). El marco de lectura abierto (codón de iniciación en los pares de bases 211-213, codón de terminación en los pares de bases 1740-1743) codifica para una proteína de 510 aminoácidos con un peso molecular de 56,8 kDA y un valor pI teórico de 7,51.
Las Figs. 6a y 6b muestran la secuencia de aminoácidos de la GlcNAc-α-1,3-fucosiltransferasa derivada del ADNc (SEC ID NO: 2). Los sitios para la glicosilación ligada a asparagina se encuentran en Asn346 y Asn429.
En la Fig. 7, se ha representado el ADNc de la GlcNAc-α-1,3-fucosiltransferasa esquemática (arriba) y el índice de hidrofobicidad derivado de la proteína codificada (abajo), en la que un índice de hidrofobicidad positivo significa una mayor hidrofobicidad. Entre ambos, se han representado los tamaños de los dos productos PCR citados anteriormente con relación al ADNc entero. El área de codificación se ha representado por medio de una barra, codificando “C” para la región citoplasmática postulada, T para la región transmembrana postulada y G para la región de la transferasa catalítica postulada para el lumen de Golgi. El análisis de la secuencia de ADN por “TMpred” (de EMBnet, Suiza) dio una región transmembrana probable entre Asn36 y Gly54. La región C terminal de la enzima incluye probablemente la región catalítica y por lo tanto debería de estar dirigida hacia el lumen del aparato de Golgi. Por ello, esta transferasa parece ser una proteína transmembrana del tipo II, tal como lo son todas las
glicosiltransferasas que desempeñan un papel en la biosíntesis de glicoproteínas (Joziasse, 1992 Glycobiology 2, 271-277). Las regiones grises representan los cuatro péptidos trípticos y los hexágonos representan los sitios potenciales de la N-glicolisación. Una búsqueda BLASTP de todos los bancos de datos accessible a través de NCBI demostró una similiaridad entre la GlcNAc-α-1,3-fucosiltransferasa y otras GlcNAc-α-1,3/4-fucosiltransferasas, por ejemplo la fucosiltransferasa VI humana. A 18-21% (investigado por SIM-LALNVIEW, Expase, Suiza), la similaridad total estaba fuera de cualquier significado. No obstante, una parte de la secuencia de 35 aminoácidos (SEC ID NO: 4) presentaba una homología sorprendentemente alta con otras α-1,3-fucosiltransferasas (Fig. 8). Dicha parte de la secuencia se encuentra entre Glu267 y Pro301 de la SEC ID NO: 2.
Ejemplo 5:
Expresión de la GlcNAc-α-1,3-fucosiltransferasa recombinante en células de insectos
La región codificadora de la supuesta GlcNAc-α-1,3-fucosiltransferasa junto con las regiones citoplasmática y transmembranal se amplificó con el cebador directo 5’-CGGCGGATCCGCAATTGAATGATG-3’ (SEC ID NO: 16) y el cebador inverso 5’-CCGGCTGCAGTACCATTTAGCGCAT-3’ (SEC ID NO: 17) con el Expand High Fidelity PCR System de Boehringer Mannheim. El producto PCR se sometió a una doble digestión con PstI y BamHI y se subclonó en el vector de transferencia baculovirus pVL1393 tratado con fosfatasa alcalina, que antes había sido sometido a una digestión con PstI y BamHI. Con el fin de asegurar una recombinación homóloga, se cotransfectó el vector de transferencia con ADN viral del tipo BaculoGold (PharMingen, San Diego, CA) en células de insectos Sf9 en un medio IPL-41 que contenía lipofectin. Tras una incubación de 5 días a 27oC, se utilizaron volúmenes diferentes del sobrenadante que contenía el virus recombinante para la infección de las células de insectos Sf21. Tras una incubación de 4 días a 27oC en el medio IPL-41 que contenía FCS al 5%, se cosecharon las células Sf1 [sic] y se lavaron dos veces con una solución salina tratada con un tampón de fosfato. Las células se volvieron a suspender en el tampón Tris-HCl 25 mM, pH 7,4, que contenía Triton X-100 al 2% y se rompieron por sonificación sobre hielo.
Ejemplo 6:
Ensayo para la actividad de la GlcNAc-α-1,3-fucosiltransferasa
El homogenizado y el sobrenadante de las células se ensayaron por presencia de GlcNAc-α-1,3-fucosiltransferasa. Muestras de control se prepararon con baculovirus recombinante que codifica para la GlcNAc-fucosiltransferasa I de tabaco (Strasser et al. 1999, Glycobiology, en prensa).
La Fig. 9 muestra la actividad enzimática de la GlcNAc-α-1,3-fucosiltransferasa recombinante así como del control negativo. En el mejor caso, la actividad enzimática de las células cotransfectadas y de su sobrenadante era 30 veces más alta que la de los controles negativos. Dicha actividad endógena, que puede medirse en ausencia de la transferasa recombinante, se debe sustancialmente a la α-1,6-fucosiltransferasa de insectos y sólo en un bajo tanto por ciento a la GlcNAc-α-1,3-fucosiltransferasa. Por ello, el aumento de la actividad de la GlcNAc-α-1,3fucosiltransferasa procedente de los baculovirus es mucho más que 100 veces.
La enzima presentaba una ancha actividad máxima alrededor de un valor pH de 7,0, si la actividad se midió en el tampón ácido 2-(morfolin)etanosulfónico·HCl. Tal como puede apreciarse por la Tabla 2, la adición de cationes bivalentes, en particular de Mn2+, aumenta la actividad de la transferasa recombinante.
Tabla 2
Aditivo (conc. 10 mM)
Actividad relativa (aceptor: péptido GnGn)
%
Ninguno
21
EDTA
18
MnCl2
100
CaCl2
82
MgCl2
52
CdCl2
44
CoCl2
35
CuCl2
3
NiCl2
24
ZnCl2
0,6
La Tabla 3 muestra que entre los aceptores utilizados es el péptido GnGn que presenta las mayores tasas de incorporación en condiciones de ensayo estándares, seguido de muy cerca del péptido GnGnF6 y M5Gn-Asn. Ninguna transferencia al péptido MM, que no presenta el término reductor de GlcNAc en la manosa con enlace en la posición 3, ha podido observarse. Dicha estructura parece ser necesaria para la fucosiltransferasa del núcleo. La transferasa recombinante estaba inactiva también con relación a los aceptores convencionales, responsables de la
determinación de las α-1,3/4-fucosiltransferasas de los grupos sanguíneos, que transfieren la fucosa a GlcNAc en los términos no reductores de oligosacáridos. Los valores Km aparentes para los substratos aceptores péptido de GnGn, péptido de GnGnF6, M5Gn-Asn y para el substrato donante GDP-fucosa se estimaron en 0,19, 0,13, 0,23 y 0,11. Las estructuras de las moléculas se han representado en las Figs. 10a y 10b.
Tabla 3
Substrato aceptor
Actividad relativa Valor Km
%
mM
Péptido GnGn Péptido GnGnF6
100 87 0,19 0,13
M5Gn-Asn
71 0,23
Péptido MM
0
Gal,1-4GlcNAc
0
Gal,1-3GlcNAc
0
Gal,1-3GlcNAc,1-3Gal,1-4Glc
0
Ejemplo 7:
Espectrometría de masas del producto de fucosiltransferasa
Un hexapéptido GnGn dabsilado (2 nmol) se incubó con el homogenizado de células de insectos que comprende la GlcNAc-α-1,3-fucosiltransferasa recombinante (0,08 mU) en presencia de GDP-L-fucosa no radiactiva (10 nmol), el tampón ácido 2-(N-morfolin)etanosulfónico·HCl, Triton X-100, MnCl2, GlcNAc y AMP. Un control negativo se realizó con el homogenizado de las células de insectos infectadas para las muestras de control. La muestras se incubaron a 37oC durante 16 h y se analizaron por medio de espectrometría de masas MALDI TOF.
La espectrometría de masas se llevó a cabo en un DYNAMO (Therrmo BioAnalysis, Santa Fe, NM), que es un MALDI-TOF MS, capaz de extracción dinámica (sinónimo para una extracción retrasada). Se utilizaron dos tipos de preparaciones de una matriz de muestra: Los péptidos y los glicopéptidos dabsilados se disolvieron en ácido formico al 5% y se aplicaron alícuotas a la diana, se secaron al aire y se cubrieron con ácido a–ciano-4-hidroxicinámico al 1%. Glicanos piridilaminados, oligosacáridos reductores y glicopéptidos no derivadizados se diluyeron con agua, se aplicaron a la diana y se secaron al aire. Tras la adición de ácido 2,5-dihidroxibenzoico al 2%, las muestras se secaron inmediatamente aplicando un vacío.
La Fig. 11 muestra el espectro de masas de dichas muestras, representando A el control negativo: El pico principal
(S) muestra el substrato dabsilo-Val-Gly-Glu-(GlcNAc4Man3)Asn-Arg-Thr, siendo el valor [M+H]+ calculado 2262,3. Aparentemente, este substrato aparece también como un producto de adición sódico y como un ion más pequeño, formado por fragmentación de la función azo del grupo dabsilo, en (S*). Una pequeña cantidad del producto (P, [M+H]+ = 2408,4) se puede atribuir a la α-1,6-fucosiltransferasa endógena. El pico en m/z = 2424,0 muestra la degalactosilación incompleta del substrato. El espectro de masas B muestra la muestra que contiene la α-1,3fucosiltransferasa recombinante. El pico principal (P) representa el producto fucosilado, y (P*) su ion fragmentado.
Adicionalmente, se mezlaron alícuotas de ambas muestras, con el fin de obtener concentraciones similares de substrato y producto (muestra A). Dicha mezcla se diluyó con acetato de amonio 0,1 M, pH 4,0, que comprende 10 μU de N-glicosidasa A (muestra B) o con Tris-HCl 50 mM, pH 8,5, que contiene 100 μU (1 U hidroliza 1 μmol de substrato por min.) de N-glicosidasa F (muestra C). Tras 2 y 20 h, se retiraron alícuotas pequeñas de dichas mezlas y se analizaron por medio de MALDI-TOF MS.
En la Fig. 12, se han representado los tres espectros de masas de las muestras A, B y C. La muestra A sin digestión muestra dos picos principales: el substrato en un m/z de 2261,4 y el producto fucosilado en un m/z de 2407,7. La curva central muestra el espectro de masas de la muestra B, tratada con N-glicosidasa A, que hidroliza ambas glicoproteínas. El pico de 963,22 representa el producto deglicosilado. La curva inferior muestra el espectro de masas de la muestra C. La N-glicosidasa F no es capaz de hidrolizar los substratos α-1,3-fucosilados, con lo cual el espectro contiene el pico del producto en un m/z de 2406,7, mientras que el pico del substrato hidrolizado aparece en un m/z de 963,08.
Ejemplo 8:
Análisis HPLC del producto de fucosiltransferasa piridilaminado
Las dos muestras descritas anteriormente (producto fucosilado y control negativo) se digerieron con N-glicosidasa A. Los oligosacáridos obtenidos se piridilaminaron y se analizaron por HPLC en fase reversa (Wilson et al. 1998 Glycobiology 8, 651-661; Kubelka et al. 1994 Arch. Biochem. Biophys. 308, 148-157; Hase et al. 1984 J. Biochem. 95, 197-203).
En la Fig. 13, B del diagrama superior representa el control negativo, en el que puede verse también, además del substrato restante (péptido GnGn), el producto a-1,6-fucosilado. A presenta un pico con un tiempo de retención sustancialmente reducido, lo cual es específico de los [sic=términos] reductores GlcNAc de la fucosa con enlace a
5 1,3.
En el diagrama inferior, se comparó el producto de transferasa aislado antes (curva A) y después de la digestión por N-acetil--glucosaminasa (curva B) con MMF3 de la fosfolipasa A2 (curva C) de la abeja melífera.
10 Listado de secuencias
<110> Altmann Dr., Friedrich
<120> Gen para la fucosiltransferasa 15
<130> R 53926 (divisionaria de R 46233)
<150> A 270/99
<151> 1999-02-18 20
<150> EP 05108012.5
<151> 2000-02-17
<160> 17 25
<170> PatentIn ver. 2.1.
<210> 1
<211> 2198 30 <212> ADN
<213> Vigna radiata
<400> 1
<210> 2
<211> 510
<212> PRT
<213> Vigna radiata
<400> 2
<210> 3
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: Fragmento de péptido 10
<400> 3
15 <210> 4
<211> 35
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
20 <220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: ADNc
<400> 4
<210> 5
<213> Secuencia artificial
<220>
<223>
Descripción de la secuencia artificial: Fragmento de péptido 10
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)
<223>
incierto 15
<400> 5
20 <210> 6
<211> 10
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
25 <220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: Fragmento de péptido
<400> 6
<210> 7
<211> 13
<212> PRT
<213> Secuencia artificial 35
<220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: Fragmento de péptido
<210> 8
<211> 10
<212> PRT 45 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: Fragmento de péptido
50 <400> 8 <210> 9
<211> 29 5 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223>
Descripción de la secuencia artificial: Cebador universal 10
<220>
<221> misc_feature
<222> (3), (15)
<223>
n es a, c, g o t 15
<400> 9
<210> 10 20 <211> 22
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220> 25 <223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador universal
<220>
<221> misc_feature
<222> (14), (17) 30 <223> n es a, c, g o t
<400> 10
35 <210> 11
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
40 <220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador universal
<220>
<221> misc_feature 45 <222> (6)
<223> n es a, c, g o t
<400> 11
<210> 12
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial 55
<220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador
<400> 12 60
<210> 13
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador
<210> 14
<211> 22
<212> ADN 15 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador
20 <400> 14
<210> 15
<211> 24 25 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador 30
<400> 15
<210> 16 35 <211> 24
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220> 40 <223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador
<400> 16
45 <210> 17
<211> 25
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
50 <220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador
<400> 17

Claims (5)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Procedimiento para la preparación de glicoproteínas recombinantes, que comprende la producción de una glicoproteína recombinante en plantas o células de plantas, cuya producción de GlcNAc-α-1,3-fucosiltransferasa es 5 inhibida o completamente impedida y cuya actividad de GlcNAc-α-1,3-fucosiltransferasa endógena es inferior al 50% de la actividad de GlcNAc-α-1,3-fucosiltransferasa que tiene lugar en las plantas o células de plantas naturales, y cuya GlcNAc-α-1,3-fucosiltransfera es codificada por una molécula de ADN, que comprende una secuencia según la SEC ID no 1 con un marco de lectura abierto del par de bases 211 al par de bases 1740 o presenta una homología de por lo menos un 50% con respecto a la secuencia citada anteriormente o hibridiza con la secuencia citada
    10 anteriormente en condiciones rigurosas o comprende una secuencia que, como consecuencia del código genético, está degenerada en la secuencia de ADN citada anteriormente.
  2. 2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque las glicoproteínas recombinantes son proteínas
    humanas, en particular proteínas para uso médico. 15
  3. 3. Procedimiento según la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque la actividad de GlcNAc-α-1,3fucosiltransferasa endógena es inferior al 20% de la actividad de la GlcNAc-α-1,3-fucosiltransferasa que tiene lugar en las plantas o células de plantas naturales.
    20 4. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la actividad de la GlcNAc-α-1,3fucosiltransferasa endógena es el 0% de la actividad de la GlcNAc-α-1,3-fucosiltransferasa que tiene lugar en las plantas o células de plantas naturales.
  4. 5. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque la reducción de la actividad de la
    25 GlcNAc-α-1,3-fucosiltransferasa resulta de la inhibición antisentido, siendo utilizado un polinucleótido, que es por lo menos parcialmente complementario de la secuencia de la molécula de ADN.
  5. 6. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque la reducción de la actividad de la
    GlcNAc-α-1,3-fucosiltransferasa resulta de la mutación “knockout” de la secuencia de la molécula de ADN. 30
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Families Citing this family (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU771908C (en) 1998-12-09 2005-03-10 Phyton Holdings, Llc A method for manufacturing glycoproteins having human-type glycosylation
AT408446B (de) * 1999-02-18 2001-11-26 Altmann Friedrich Dr Fucosyltransferase-gen
ES2571230T3 (es) 1999-04-09 2016-05-24 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd Procedimiento para controlar la actividad de una molécula inmunofuncional
IL149271A0 (en) 1999-10-26 2002-11-10 Plant Res Int Bv Mammalian-type glycosylation in plants
US6946292B2 (en) 2000-10-06 2005-09-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity
ZA200306406B (en) 2001-01-19 2004-09-06 Dow Chemical Co Method for secretory production of glycoprotein having human-type sugar chain using plant cell.
NZ534881A (en) 2002-03-19 2006-09-29 Plant Res Internat B Mammalian GnTIII expression in plants
KR101196023B1 (ko) 2002-03-19 2012-10-30 스티칭 디엔스트 랜드보위쿤디그 온데조에크 식물에서 글리칸 프로세싱의 최적화
AU2003236020B2 (en) * 2002-04-09 2009-03-19 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Cell with depression or deletion of the activity of protein participating in GDP-fucose transport
CL2003002461A1 (es) 2002-11-27 2005-01-07 Dow Chemical Company Agroscien Inmunoglobulina que comprende al menos un glicano afucosilado, composicion que la contiene, secuencia nucleotidica y vector que la comprende, procedimiento para producir dicha inmunoglobulina en plantas.
EP1510584B1 (en) 2003-08-11 2009-03-18 Greenovation Biotech GmbH Expression promoting sequences from mosses and their uses
FI20055398A0 (fi) 2005-07-08 2005-07-08 Suomen Punainen Risti Veripalv Menetelmä solupopulaatioiden evaluoimiseksi
AU2007205935B2 (en) 2006-01-17 2013-07-11 Synthon Biopharmaceuticals B.V. Compositions and methods for humanization and optimization of N-glycans in plants
US20090060921A1 (en) * 2006-01-17 2009-03-05 Biolex Therapeutics, Inc. Glycan-optimized anti-cd20 antibodies
CN102094020B (zh) * 2007-01-15 2012-11-28 燕秋 用于抑制LeY糖抗原合成的岩藻糖基转移酶I的RNA干涉序列及重组干涉质粒
CN102094019B (zh) * 2007-01-15 2012-11-28 燕秋 用于抑制LeY糖抗原合成的岩藻糖基转移酶Ⅳ的RNA干涉序列及重组干涉质粒
AU2008237632B2 (en) 2007-04-17 2014-01-16 Stichting Dienst Landbouwkundig Onderzoek Mammalian-type glycosylation in plants by expression of non-mammalian glycosyltransferases
JP5766947B2 (ja) * 2007-09-07 2015-08-19 チルドレンズ ホスピタル メディカル センター 臨床サンプルにおける分泌性のルイス抗原およびシアル化抗原のレベルの疾患リスクの予測指標としての使用
US20100242128A1 (en) * 2007-10-31 2010-09-23 Bayer BioSceince NV Method to produce modified plants with altered n-glycosylation pattern
EP2166085A1 (en) 2008-07-16 2010-03-24 Suomen Punainen Risti Veripalvelu Divalent modified cells
ES2663627T3 (es) 2010-10-11 2018-04-16 Jennewein Biotechnologie Gmbh Fucosiltransferasas novedosas y sus aplicaciones
KR101293658B1 (ko) * 2010-12-30 2013-08-07 대한민국 알파-1,3-푸코실트랜스퍼라아제 및/또는 베타-1,2-자일로실트렌스퍼라아제 유전자를 포함하는 벼 형질전환용 벡터 및 형질전환된 벼
ES2439507T3 (es) * 2011-01-20 2014-01-23 Jennewein Biotechnologie Gmbh Fucosiltransferasas novedosas y sus aplicaciones
EP2789686A1 (en) 2013-04-11 2014-10-15 Greenovation Biotech GmbH Expression of phosphorylated glycoproteins in plants
EP3050973A1 (en) * 2015-01-30 2016-08-03 Jennewein Biotechnologie GmbH Fermentation process for producing monosaccharides in free form from nucleotide-activated sugars
CN110317799A (zh) * 2019-07-18 2019-10-11 江南大学 一种人源岩藻糖转移酶8的原核表达方法及其产品
EP3871687A1 (en) 2020-02-27 2021-09-01 eleva GmbH Enzyme replacement therapy for treating pompe disease

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5272066A (en) 1986-03-07 1993-12-21 Massachusetts Institute Of Technology Synthetic method for enhancing glycoprotein stability
JP3756946B2 (ja) 1993-03-29 2006-03-22 協和醗酵工業株式会社 α１，３−フコシルトランスフェラーゼ
US6509149B2 (en) * 1995-06-06 2003-01-21 Hybridon, Inc. HPV-specific oligonucleotides
US5770420A (en) * 1995-09-08 1998-06-23 The Regents Of The University Of Michigan Methods and products for the synthesis of oligosaccharide structures on glycoproteins, glycolipids, or as free molecules, and for the isolation of cloned genetic sequences that determine these structures
AT408446B (de) * 1999-02-18 2001-11-26 Altmann Friedrich Dr Fucosyltransferase-gen

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