ES2294797T3 - Manipulacion de celulosa. - Google Patents

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Richard Edward Williamson
Andreas Stefan Betzner
Liangcai Peng
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Abstract

ESTA INVENCION SE REFIERE EN GENERAL A UNOS GENES AISLADOS QUE CODIFICAN POLIPEPTIDOS QUE DESEMPEÑAN UN PAPEL EN LA BIOSINTESIS DE CELULOSA EN LOS VEGETALES Y EN PLANTAS TRANSGENICAS QUE PERMITEN LA EXPRESION DE ESTOS POLIPEPTIDOS SEGUN UNA ORIENTACION SENTIDO O ANTISENTIDO, O COMO RIBOCIMAS O MOLECULAS DE COSUPRESION O DE OBJETIVACION DE GENES. ESTA INVENCION SE REFIERE MAS ESPECIALMENTE, A UNA MOLECULA DE ACIDO NUCLEICO AISLADA A PARTIR DE ARABIDOPSIS THALINA, DE ORYZA SATIVA, DE TRIGO, DE CEBADA, DE MAIZ, DE BRASSICA SSP., DE GOSSYPIUM HIRSUTUM Y DE EUCALYPTUS SSP. QUE CODIFICAN UNA ENZIMA QUE DESEMPEÑA UN PAPEL IMPORTANTE EN LA BIOSINTESIS DE CELULOSA, EN PARTICULAR LA ENZIMA DE SINTASA DE CELULOSA, ASI COMO SUS HOMOLOGOS, ANALOGOS, DERIVADOS DE LOS MISMOS Y USOS DE LOS MISMOS EN LA PRODUCCION DE PLANTAS TRANSGENICAS QUE EXPRESAN PROPIEDADES DE BIOSINTESIS DE CELULOSA MODIFICADAS.

Description

Manipulación de celulosa.
La presente invención se refiere en general a genes aislados que codifican polipéptidos implicados en la biosíntesis de celulosa y organismos transgénicos que expresan los mismos en orientación sentido o antisentido, o como ribozimas, moléculas de co-supresión o moléculas de reconocimiento de genes. Más particularmente, la presente invención está dirigida una molécula de ácido nucleico aislada a partir de Arabidopsis thaliana, Oryza sativa, trigo, cebada, maíz, Brassica ssp., Gossypium hirsutum y Eucalyptus ssp. que codifican una enzima que es importante en la biosíntesis de celulosa, en particular la enzima celulosa sintasa y sus homólogos, análogos y derivados, y a usos de los mismos en la producción de plantas transgénicas que expresan propiedades biosintéticas alteradas de la
celulosa.
Los detalles bibliográficos de las publicaciones referidas por el autor en esta descripción quedan recogidos al final de la descripción. Después de la bibliografía, se definen los números de identidad de secuencias (SEQ ID Nos.) para las secuencias de nucleótidos y aminoácidos referidas en la descripción.
Por toda esta descripción, salvo que el contexto requiera otra cosa, la palabra "comprenden" o variaciones tales como "comprende" o "que comprende o comprenden", han de ser entendidas como implicando la inclusión de un elemento o entero o grupo de elementos o enteros, establecidos, pero sin excluir cualquier otro elemento o entero o grupo de elementos o enteros.
La celulosa, el biopolímero más abundante del mundo, es el componente más característico de las paredes celulares de las plantas en tanto que forma gran parte del entramado estructural de la pared celular. La celulosa está constituida por microfibrilas cristalinas de \beta-1,4-glucano. Las microfibrilas cristalinas son extremadamente fuertes y resisten la degradación enzímica y mecánica, un factor importante a la hora de determinar la cantidad nutricional, digestibilidad y apetibilidad de alimentos para animales y humanos. Dado que la celulosa es también el componente estructural dominante de fibras vegetales industrialmente importantes, tales como algodón, lino, cáñamo, yute y cultivos de madera tales como Eucalyptus ssp. y Pinus ssp., entre otros, se puede conseguir un beneficio económico considerable a partir de la manipulación del contenido y/o cantidad de celulosa en plantas. En particular, la producción de alimentos y cultivos de fibras con un contenido alterado en celulosa constituye un objetivo altamente
deseable.
La síntesis de celulosa implica el enlace \beta-1,4 de monómeros de glucosa, en forma de una nucleósido difosfoglucosa, tal como UDP-glucosa, a una cadena de celulosa ya existente, catalizado ello por la enzima celulosa
sintasa.
Han fallado diversos intentos de identificar los componentes de la celulosa sintasa funcional en plantas, debido a que los niveles de \beta-1,4-glucano o celulosa cristalina producidos en tales ensayos han sido hasta ahora demasiado bajos como para permitir la purificación enzimática para la determinación de la secuencia de proteínas. Una homología insuficiente entre los genes bacterianos de \beta-1,4-glucano sintasa y genes vegetales de celulosa sintasa ha impedido también el uso de hibridación como una medida para aislar los homólogos vegetales de \beta-1,4-glucano (celulosa) sintasas bacterianas. Amor et al. (1991, The Plant Cell Vol. 3, 989-995) describen la identificación en plantas de dos polipéptidos de la membrana de 83 y 48 kD derivados de fibras de algodón que se unen a ácido diguanílico cíclico y que también se unen a bcsB de Acetobacter.
Por otro lado, no ha sido posible demostrar que la enzima celulosa sintasa de las plantas sea la misma que, o esté funcionalmente relacionada con, otras enzimas purificadas y caracterizadas implicadas en la biosíntesis de polisacáridos. Como consecuencia, la enzima celulosa sintasa no ha sido aislada a partir de plantas y, hasta la presente invención, no se ha caracterizado una molécula de ácido nucleico que codifique funcionalmente una enzima vegetal de celulosa sintasa.
En los trabajos que han conducido a la presente invención, los inventores han generado nuevas y diversas plantas mutantes de Arabidopsis thaliana que son defectuosas en cuanto a la biosíntesis de celulosa. Además, los inventores han aislado un gen de celulosa sintasa designado como RSW1, que está implicado en la biosíntesis de celulosa en Arabidopsis thaliana, y secuencias homólogas en Oryza sativa, trigo, cebada, maíz, Brassica ssp., Gossypium hirsutum y Eucalyptus ssp. Las moléculas aisladas de ácidos nucleicos de la presente invención aportan el medio por el cual el contenido y estructura de celulosa se pueden modificar en plantas para producir una variedad de plantas útiles adecuadas para fines industriales específicos, por ejemplo mayor resistencia a la pudrición de la madera y una digestibilidad alterada de productos alimentarios, entre otros.
En consecuencia, un aspecto de la presente invención proporciona una molécula aislada de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica, o es complementaria a una secuencia que codifica, un polipéptido de celulosa sintasa de una planta o una subunidad catalítica del mismo; que tiene actividad de celulosa sintasa, o una secuencia complementaria a la misma en donde dicha secuencia de nucleótidos:
(a)
es idéntica al menos en un 55% a cualquiera de las SEQ ID Nos: 1, 5, 7, 9, 11 o 13;
(b)
codifica un polipéptido que idéntico en al menos en un 40% a cualquiera de SEQ ID Nos: 2, 6, 8, 10, 12 o 14;
(c)
se hibrida a cualquiera de SEQ ID Nos: 1, 5, 7, 9, 11 o 13 o secuencia complementaria a las mismas bajo cualquiera de las siguientes condiciones de hibridación:
(i)
tampón 0,2 x SSC-2 x SSC, 0,1% (p/v), SDS a 42ºC - 65ºC; o
(ii)
tampón 0,1 x SSC-0,2 x SSC, 0,1% (p/v) SDS a por lo menos 55ºC; o
(d)
es amplificable en una reacción en cadena de la polimerasa empleando dos cebadores que comprenden 20-30 nucleótidos contiguos derivados de cualquiera de SEQ ID Nos: 1, 5, 7, 9, 11 o 13 o una secuencia complementaria a las mismas.
Los expertos en la materia sabrán que la producción de celulosa no solo requiere la presencia de una subunidad catalítica, sino también su activación y organización en disposiciones que favorecen la cristalización de cadenas glucánicas. Esta organización es radicalmente diferente entre las bacterias, las cuales poseen disposiciones lineales, y las plantas superiores, las cuales poseen racimos o "rosetas" hexaméricos, de cadenas glucánicas. La organización y activación correctas de la enzima bacteriana pueden requerir muchos factores que o bien son desconocidos o, alternativamente, se desconoce que estén presentes en células de plantas, por ejemplo lípidos de membrana específicos para impartir una conformación activa sobre el complejo o proteína enzimático, o el sistema de activación bacteriana de c-di-GMP. Por tanto, el uso de una secuencia de origen vegetal en células eucariotas, tal como plantas, aporta importantes ventajas en comparación con el uso de secuencias de origen bacteriano.
En consecuencia, la presente invención no se extiende a genes conocidos que codifican la subunidad catalítica de celulosa sintasa de Agrobacterium tumefaciens o Acetobacter xylinum o Acetobacter pasteurianus o al uso de dichos genes y polipéptidos bacterianos conocidos para manipular celulosa.
De este modo, la invención proporciona una molécula aislada de ácido nucleico que codifica una celulosa sintasa vegetal o una subunidad catalítica de la misma o un homólogo, análogo o derivado que tiene las propiedades de las secuencias indicadas anteriormente. También se describen otros homólogos, análogos y derivados.
Más preferentemente, la molécula aislada de ácido nucleico codifica un polipéptido de celulosa sintasa vegetal que está asociado con la pared celular primaria de una célula vegetal. En una modalidad alternativa preferida, la molécula de ácido nucleico de la presente invención codifica una celulosa sintasa vegetal o una subunidad catalítica de la misma que normalmente está asociada con la pared celular secundaria de una célula vegetal.
En una modalidad más preferida, la molécula de ácido nucleico de la invención es una molécula de cDNA, clon genómico, molécula de mRNA o una molécula de oligonucleótido sintético.
En una modalidad particularmente preferida, la molécula aislada de ácido nucleico de la invención codifica, o es complementaria a una molécula de ácido nucleico que codifica, la enzima de celulosa sintasa, o una subunidad catalítica de la misma, de Arabidopsis thaliana, Gossypium hirsutum (algodón), Oryza sativa (arroz), Eucalyptus ssp., Brassica ssp., trigo, cebada o maíz.
Tal como aquí se ejemplifica, los presentes inventores han identificado genes de la biosíntesis de celulosa en maíz, trigo, cebada, arroz, algodón, Brassica ssp. y Eucalyptus ssp., además de la secuencia génica RSW1 específica de Arabidopsis thaliana que ha demostrado ser particularmente útil para alterar en células los niveles de celulosa y/o \beta-1,4-glucano y/o almidón.
De aquí en adelante, el término "polipéptido de la vía de biosíntesis de celulosa" o cualquier término similar ha de entenderse como refiriéndose a un polipéptido o una proteína o una parte, homólogo, análogo o derivado de tales, que están implicados en una o más de las etapas de biosíntesis que conducen a la producción de celulosa o cualquier polímero de \beta-1,4-glucano relacionado en plantas. En el presente contexto, un polipéptido de la vía de biosíntesis de celulosa se considerará también como incluyendo una enzima activa que contribuye a la biosíntesis de celulosa o cualquier polímero de \beta-1,4-glucano relacionado en plantas y a un componente polipéptido de dicha enzima. Tal y como aquí se emplea, un polipéptido de la vía de biosíntesis de celulosa incluye por tanto celulosa sintasa. Los expertos en la materia conocerán otros polipéptidos en plantas de la vía de biosíntesis de celulosa.
El término "polímero de \beta-1,4-glucano relacionado" se considerará como incluyendo cualquier molécula de carbohidrato constituida por una estructura primaria de monómeros de glucosa \beta-1,4-enlazados similar a la estructura de los componentes de la microfibrila de celulosa, en donde la disposición relativa o configuración relativa de las cadenas glucánicas puede diferir de su configuración relativa en microfibrilas de celulosa. Tal como aquí se emplea, un polímero de \beta-1,4-glucano relacionado incluye aquellos polímeros de \beta-1,4-glucano en donde las microfibrilas individuales de \beta-1,4-glucano están dispuestas en una configuración anti-paralela o en alguna otra configuración relativa no encontrada en una molécula de celulosa de plantas y aquellos \beta-1,4-glucanos no cristalinos descritos como carentes de la resistencia a la destrucción y degradación que caracteriza a las microfibrilas de celulosa.
El término "celulosa sintasa" deberá ser considerado como refiriéndose a un polipéptido que es requerido para catalizar un enlace de \beta-1,4-glucano a una microfibrila de celulosa.
La referencia aquí al término "gen" ha de entenderse en su contexto más amplio que incluye:
(i)
un gen genómico clásico que consiste en secuencias reguladoras de la transcripción y/o traducción y/o una región codificadora y/o secuencias no traducidas (es decir, intrones, secuencias 5'- y 3'-no traducidas); o
(ii)
mRNA o cDNA correspondientes a las regiones codificadoras (es decir, exones) y secuencias 5'- y 3'-sin traducir del gen.
El término "gen" se utiliza también para describir moléculas sintéticas o de fusión que codifican la totalidad o parte de un producto funcional.
En el presente contexto, el término "gen de celulosa" o "secuencia genética de celulosa" o cualquier término similar deberá ser considerado como refiriéndose a cualquier gen como anteriormente se ha definido que codifica un polipéptido de la vía de biosíntesis de celulosa y que incluye un gen de celulosa sintasa.
El término "gen de celulosa sintasa" deberá ser considerado como refiriéndose a cualquier gen de celulosa que codifica específica un polipéptido que es un componente de una enzima funcional que tiene actividad de celulosa sintasa, es decir, una enzima que cataliza un enlace de \beta-1,4-glucano a una microfibrila de celulosa.
Los genes preferidos de celulosa se pueden derivar de un gen de celulosa de origen natural mediante técnicas recombinantes convencionales. En general, un gen de celulosa se puede someter a mutagénesis para producir sustituciones, deleciones y/o adiciones de nucleótidos individuales o múltiples. Los derivados insercionales de nucleótidos del gen de celulosa sintasa de la presente invención incluye fusiones 5' y 3' terminales, así como inserciones intra-secuencias de simples o múltiples nucleótidos. Las variantes de secuencias insercionales de nucleótidos son aquellas en donde se introducen uno o más nucleótidos en un sitio predeterminado de la secuencia de nucleótidos, aunque también es posible la inserción aleatoria con el examen adecuado del producto resultante. Las variantes delecionables se caracterizan por la separación de uno o más nucleótidos de la secuencia. Las variantes sustitucionales de nucleótidos son aquellas en donde al menos un nucleótido de la secuencia ha sido separado y en su lugar ha sido introducido un nucleótido diferente. Dicha sustitución puede ser "silenciosa" dado que la sustitución no cambia el aminoácido definido por el codón. Alternativamente, los sustituyentes están designados para alterar un aminoácido por otro aminoácido de acción similar o aminoácido de carga, polaridad o hidrofobicidad
similares.
Tal y como aquí se emplea, el término "derivado de" deberá ser considerado como indicando que se ha originado un entero particular o grupo de enteros particulares a partir de la especie especificada, pero que necesariamente no se ha obtenido directamente a partir de la fuente especificada.
Para la presente finalidad, los "homólogos" de una secuencia de nucleótidos deberán ser considerados como refiriéndose a una molécula aislada de ácido nucleico que es sustancialmente la misma que la molécula de ácido nucleico de la presente invención o solo secuencia complementaria de nucleótidos, independientemente de la aparición dentro de dicha secuencia de una o más sustituciones, inserciones, deleciones o transposiciones de nucleótidos.
Los "análogos" de una secuencia de nucleótidos aquí establecida deberán ser considerados como refiriéndose a una molécula aislada de ácido nucleico que es sustancialmente la misma que una molécula de ácido nucleico de la presente invención o su secuencia complementaria de nucleótidos, independientemente de la aparición de cualesquiera constituyentes no nucleótidos normalmente no presentes en dicha molécula aislada de ácido nucleico, por ejemplo carbohidratos, compuestos radioquímicos incluyendo radionucleótidos, moléculas informadoras tales como, pero no de forma limitativa, DIG, fosfatasa alcalina o peroxidasa de rábano picante, entre otras.
Los "derivados" de una secuencia de nucleótidos aquí indicada deberán ser considerados como refiriéndose a cualquier molécula aislada de ácido nucleico que contiene una similitud de secuencia importante con dicha secuencia o una parte de la misma. En general, la secuencia de nucleótidos de la presente invención se puede someter a mutagénesis para producir simples o múltiples sustituciones, deleciones y/o inserciones de nucleótidos. Los derivados insercionales de nucleótidos de la secuencia de nucleótidos de la presente invención incluyen funciones 5' y 3' terminales, así como inserciones intra-secuencias de simples o múltiples nucleótidos o análogos de nucleótidos. Las variantes de las secuencias insercionales de nucleótidos son aquellas en donde uno o más nucleótidos o análogos de nucleótidos se introducen en un sitio predeterminado en la secuencia de nucleótidos de dicha secuencia, aunque también es posible una inserción aleatoria realizándose un examen adecuado del producto resultante. Las variantes delecionales se caracterizan por la separación de uno o más nucleótidos de la secuencia de nucleótidos. Las variantes sustitucionales de nucleótidos son aquellas en donde al menos un nucleótido de la secuencia ha sido separado y en su lugar se ha insertado un nucleótido diferente o un análogo de nucleótido diferente.
Como se ha expuesto anteriormente, dichos homólogos, análogos y derivados caen dentro del alcance de la invención cuando se satisfacen plenamente los criterios de secuencias que se indican en las reivindicaciones.
La presente invención se extiende a la molécula aislada de ácido nucleico cuando se integra en el genoma de una célula como una adición al complemento celular endógeno de los genes de celulosa sintasa. Dicha molécula integrada de ácido nucleico puede, o puede no, contener secuencias promotoras para regular la expresión de la secuencia genética particular.
La molécula aislada de ácido nucleico de la presente invención se puede introducir en y expresarse en cualquier célula, por ejemplo una célula vegetal, una célula fúngica, una célula de insecto, una célula de animal, una célula de levadura o una célula bacteriana. Los expertos en la materia conocerán aquellas modificaciones que son necesarias para el uso de codones o secuencias promotoras u otras secuencias reguladoras, con el fin de que ocurra la expresión en dichas células.
La secuencia de ácidos nucleicos de la invención es una secuencia de nucleótidos correspondiente o complementaria a una o más de las secuencias indicadas en SEQ ID Nos: 1, 5, 7, 9, 11 o 13 o que tiene una identidad de secuencia con las mismas de al menos 55%, con preferencia al menos alrededor del 65%, todavía más preferentemente al menos alrededor de 75-80% y aún más preferentemente de al menos alrededor de 85-95%.
También se describen secuencias correspondientes o complementarias a una o más de las secuencias indicadas en SEQ ID Nos: 3 y 4 o que tienen una identidad de secuencia con las mismas de al menos 55%, con preferencia al menos alrededor de 65%, todavía más preferentemente al menos alrededor de 75-80% y aún más preferentemente al menos alrededor de 85-95%, así como secuencias que tienen una identidad de secuencia de al menos alrededor del 40% con cualquiera de las secuencias anteriores.
La molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que codifica, o es complementaria a, una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de celulosa sintasa de una planta o una subunidad catalítica de la misma que tiene actividad de celulosa sintasa. También se describen sus homólogos, análogos o derivados, los cuales caen dentro de la invención en el caso de que los mismos cumplan los criterios de las secuencias que se indican en las reivindicaciones.
Preferentemente, una molécula de ácido nucleico que está relacionada al menos en un 40% con una o más de las secuencias indicadas en SEQ ID Nos: 1, 3, 4, 5, 7, 9, 11 o 13, comprende una secuencia de nucleótidos que codifica o es complementaria a una secuencia que codifica una celulosa sintasa vegetal, más preferentemente una celulosa sintasa que está asociada con la pared celular primaria o secundaria de las especies de plantas de las cuales se ha
derivado.
Además, la molécula de ácido nucleico de la invención se puede derivar de una especie de planta monocotiledónea o dicotiledónea. En una modalidad particularmente preferida, la molécula de ácido nucleico se deriva de Arabidopsis thaliana, Oryza sativa, trigo, cebada, maíz, Brassica ssp., Gossypium hirsutum (algodón) y Eucalyptus ssp., entre otras.
Para fines de nomenclatura, la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 1 se refiere a un gen de celulosa como anteriormente se ha definido que comprende una secuencia de cDNA designada como T20782 y que se deriva de Arabidopsis thaliana. La secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 2 se refiere al polipéptido codificado por T20782.
La secuencia de nucleótidos indicada en SEQ ID NO: 3 se refiere a la secuencia de nucleótidos del gen genómico completo RSW1 de Arabidopsis thaliana, incluyendo secuencias tanto de intrones como de exones. La secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 3 comprende exones 1-14 del gen genómico e incluye 2295 pb de secuencias 5'-sin traducir, de las cuales aproximadamente los primeros 1,9 kb comprenden la secuencia promotora de RSW1 (existe un motivo putativo de caja TATA en las posiciones 1843-1850 de SEQ ID NO: 3). La secuencia de nucleótidos indicada en SEQ ID NO: 3 se deriva del clon cósmido 23H12. Esta secuencia es también el gen genómico equivalente de SEQ ID Nos: 1 y 5.
La secuencia de nucleótidos indicada en SEQ ID NO: 4 se refiere a la secuencia parcial de nucleótidos de una variante de gen genómico de RSW1, derivada del clon cósmido 12C4. La secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 4 comprende la secuencia de exones 1-11 y parte del exón 12 de la secuencia del gen genómico e incluye 862 pb de secuencias 5'-sin traducir, de las cuales aproximadamente 700 nucleótidos comprenden secuencias promotoras de RSW1 (existe un motivo putativo de caja TATA en las posiciones 668-673 de SEQ ID NO: 4). La secuencia de gen genómico indicada en SEQ ID NO: 4 es el equivalente de la secuencia de cDNA indicada en SEQ ID NO: 7 (es decir, el clon Ath-A de cDNA).
La secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 5 se refiere a un gen de celulosa como anteriormente se ha definido que comprende un equivalente de cDNA del gen RSW1 de Arabidopsis thaliana indicado en SEQ ID NO: 3. La secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 6 se refiere al polipéptido codificado por las secuencias del gen RSW1 de tipo salvaje indicadas en SEQ ID Nos: 3 y 5.
La secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 7 se refiere a un gen de celulosa como anteriormente se ha definido que comprende un equivalente de cDNA del gen RSW1 de Arabidopsis thaliana indicado en SEQ ID NO: 4. La secuencia de nucleótidos es una variante de las secuencias de nucleótidos indicadas en SEQ ID Nos: 3 y 5. La secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 8 se refiere al polipéptido codificado por las secuencias del gen RSW1 de tipo salvaje indicadas en SEQ ID Nos: 4 y 6.
La secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 9 se refiere a un gen de celulosa como anteriormente se ha definido que comprende otra variante de tipo salvaje del gen RSW1 de Arabidopsis thaliana indicado en SEQ ID Nos: 3 y 5. La variante de secuencia de nucleótidos viene designada como Ath-B. La secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 10 se refiere al polipéptido codificado por la secuencia del gen RSW1 de tipo salvaje indicada en SEQ ID NO: 9.
La secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 11 se refiere a un gen de celulosa como anteriormente se ha definido que comprende un equivalente de cDNA del gen rsw1 de Arabidopsis thaliana. El gen rsw1 es un gen mutante de celulosa que produce un fenotipo intumescente de raíz radial como describen Baskin et al (1992). Los presentes inventores han demostrado aquí que el gen rsw1 también produce una menor longitud de inflorescencia, una menor fertilidad, células epidérmicas deformadas, menor contenido en celulosa y la acumulación de \beta-1,4-glucano no cristalino, entre otras cosas, cuando se expresa en células de plantas. La secuencia de nucleótidos de rsw1 es otra variante de las secuencias de nucleótidos indicadas en SEQ ID Nos: 3 y 5. La secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 12 se refiere al polipéptido de rsw1 codificado por la secuencia del gen mutante de rsw1 indicada en SEQ ID NO: 11.
La secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 13 se refiere a un gen de celulosa como anteriormente se ha definido que comprende un equivalente de cDNA del gen RSW1 o de tipo RSW1 de Oryza sativa. La secuencia de nucleótidos está estrechamente relacionada con las secuencias de nucleótidos de RSW1 y rsw1 de Arabidopsis thaliana indicadas aquí (SEQ ID Nos: 1, 3, 4, 5, 7, 9 y 11). La secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 14 se refiere al polipéptido codificado por las secuencias del gen RSW1 o de tipo RSW1 indicadas en SEQ ID NO:
13.
Los expertos en la materia son sabedores de procedimientos para el aislamiento de otros genes de celulosa además de los aquí descritos de forma específica, por ejemplo otras secuencias de cDNA y equivalentes del gen genómico, cuando se proporcionan con una o más de las secuencias de nucleótidos indicadas en SEQ ID Nos: 1, 3, 4, 5, 7, 9, 11 o 13. En particular, se pueden efectuar hibridaciones empleando una o más sondas de hibridación de ácido nucleico que comprenden al menos 10 nucleótidos contiguos y preferentemente al menos 50 nucleótidos contiguos derivados de las secuencias de nucleótidos aquí indicadas, para aislar clones de cDNA, moléculas de mRNA, clones genómicos de una librería genómica (en particular clones genómicos que contienen toda la región 5' aguas arriba del gen que incluye la secuencia promotora, y toda la región codificadora y secuencias 3'-sin traducir), y/o moléculas de oligonucleótidos sintéticos, entre otros, a dichas secuencias relacionadas.
La invención se extiende además a cualesquiera homólogos, análogos o derivados de una o más de las secuencias SEQ ID Nos: 1, 5, 7, 9, 11 o 13 que tienen las propiedades de secuencia requeridas anteriormente indicadas.
También se describen moléculas de ácido nucleico que codifican o son complementarias a una molécula de ácido nucleico que codifica, un polipéptido que es necesario para la biosíntesis de celulosa en una planta, tal como celulosa sintasa, y que es capaz de hibridarse, en condiciones de al menos baja estringencia, a la molécula de ácido nucleico indicada en una o más de SEQ ID Nos: 1, 3, 4, 5, 7, 9, 11 o 13, o a una hebra complementaria de las
mismas.
Como ejemplo de lo anterior, los presentes inventores han demostrado que es posible aislar variantes de la secuencia del gen RSW1 de Arabidopsis thaliana indicada en SEQ ID NO: 3, por hibridación en condiciones de baja estringencia. Dichas variantes incluyen secuencias relacionadas derivadas de Gossypium hirsutum (algodón), Eucalyptus ssp. y A. thaliana.
La molécula de ácido nucleico anterior puede comprender también además una secuencia de nucleótidos que codifica, o es complementaria a una secuencia de nucleótidos que codifica, un polipéptido de celulosa sintasa, más preferentemente una celulosa sintasa que está asociada con la pared celular primaria o secundaria de plantas de las especies de las cuales se deriva dicha molécula de ácido nucleico.
Con preferencia, la molécula de ácido nucleico según otro aspecto de la invención codifica, o es complementaria a una molécula de ácido nucleico que codifica, un polipéptido de celulosa sintasa de una planta que es capaz de hibridarse, en condiciones al menos de estringencia media, a la molécula de ácido nucleico indicada en una o más de SEQ ID Nos: 1, 3, 5, 7, 9, 11 o 13 o a una hebra complementaria de las mismas.
Incluso más preferentemente, la molécula de ácido nucleico según este aspecto de la invención codifica, o es complementaria a una molécula de ácido nucleico que codifica, un polipéptido de celulosa sintasa que es capaz de hibridarse en condiciones de al menos alta estringencia, a la molécula de ácido nucleico indicada en una o más de SEQ ID Nos: 1, 5, 7, 9, 11 o 13 o a una hebra complementaria de las mismas.
Al objeto de definir el nivel de estringencia, una estringencia baja se define aquí como siendo una hibridación y/o un lavado que se realizan en tampón 6 x SSC, 0,1% (p/v) SDS a 28ºC. En general, la estringencia se aumenta reduciendo la concentración de tampón SSC y/o aumentando la concentración de SDS y/o aumentado la temperatura de la hibridación y/o del lavado. Una estringencia media comprende una hibridación y/o un lavado que se efectúan en tampón 0,2 x SSC-2 x SSC, 0,1% (p/v) SDS a 42ºC-65ºC, mientras que una alta estringencia comprende una hibridación y/o un lavado que se efectúan en tampón 0,1 x SSC-0,2 x SSC, 0,1% (p/v) SDS a una temperatura de al menos 55ºC. Las condiciones para las hibridaciones y lavados son en general bien conocidas por el experto en la materia. Para los fines de ofrecer solo una mayor claridad, la referencia a los parámetros que afectan a la hibridación entre moléculas de ácidos nucleicos puede encontrarse en las páginas 2.10.8 a 2.10.16 de Ausubel et al. (1987), cuyo documento se incorpora aquí solo con fines de referencia.
También se describen moléculas aisladas de ácidos nucleicos que comprenden una secuencia de nucleótidos que es idéntica al menos en un 40% a por lo menos 10 nucleótidos contiguos derivados de una o más de SEQ ID Nos: 1, 3, 4, 5, 7, 9, 11 o 13 o una hebra complementaria de las mismas.
También se describen moléculas aisladas de ácidos nucleicos que comprenden una secuencia de nucleótidos que es idéntica al menos en un 40% a por lo menos 50 nucleótidos contiguos derivados de la secuencia indicada en una o más de SEQ ID Nos: 1, 3, 4, 5, 7, 9, 11 o 13 o una hebra complementaria de las mismas.
La presente invención está dirigida particularmente a una molécula de ácido nucleico que es capaz de funcionar como un gen de celulosa como anteriormente se ha definido, por ejemplo un gen de celulosa sintasa tal como, pero no de forma limitativa, los genes de celulosa sintasa de Arabidopsis thaliana, Oryza sativa, trigo, cebada, maíz, Brassica ssp., Gossypium hirsutum o Eucalyptus ssp., entre otros. La presente invención contempla claramente genes de celulosa adicionales a los aquí descritos específicamente y que se derivan de dichas especies vegetales tal y como se indica en las reivindicaciones.
La invención contempla además otras fuentes de genes de celulosa tales como, pero no de forma limitativa, tejidos y células de cultivo de origen vegetal. Especies de plantas preferidas de acuerdo con esta modalidad incluyen cáñamo, yute, lino y plantas madereras incluyendo, pero no de forma limitativa, Pinus ssp., Populus ssp., Picea spp., entre otras.
Una secuencia genética que codifica o es complementaria a una secuencia que codifica un polipéptido que está implicado en la biosíntesis de celulosa, puede corresponder a la secuencia de origen natural o puede diferir en una o más sustituciones, deleciones y/o adiciones de nucleótidos. También pueden ser útiles los genes de celulosa y cualesquiera genes funcionales, mutantes, derivados, partes, fragmentos, homólogos o análogos de los mismos o moléculas no funcionales pero que son al menos útiles como, por ejemplo, sondas genéticas, o secuencias cebadoras en la síntesis enzimática o química de dicho gen, o en la generación de moléculas recombinantes inmunológicamente interactivas.
Por ejemplo, las secuencias genéticas de celulosa se pueden emplear para identificar y aislar genes similares de células de plantas, tejidos o tipos de órganos de la misma especie, o bien de las células, tejidos u órganos de otra especie de plantas.
En dicho método para identificar un gen de celulosa relacionado o una secuencia genética de celulosa relacionada, por ejemplo un gen de celulosa sintasa o un gen de tipo celulosa sintasa, el método comprende poner en contacto el DNA o mRNA o cDNA genómico con una cantidad de hibridación eficaz de una primera secuencia genética de celulosa que comprende una o más de SEQ ID Nos: 1, 3, 4, 5, 7, 9, 11 o 13, o una secuencia complementaria, homólogo, análogo o derivado de las mismas, a partir de al menos 10 nucleótidos de dicha primera secuencia, y detectar entonces dicha hibridación.
Preferentemente, la primera secuencia genética comprende al menos 50 nucleótidos contiguos, incluso más preferentemente al menos 100 nucleótidos contiguos e incluso más preferentemente al menos 500 nucleótidos contiguos, derivados de una o más de SEQ ID Nos: 1, 3, 4, 5, 7, 9, 11 o 13 o una hebra complementaria, homólogo, análogo o derivado de las mismas.
El gen de celulosa relacionado o la secuencia genética de celulosa relacionada puede estar en una forma recombinante, en una partícula de virus, una partícula de bacteriofago, célula de levadura, célula animal o una célula vegetal. Preferentemente, el gen de celulosa relacionado o la secuencia genética de celulosa relacionada se deriva de una especie vegetal, tal como una planta monocotiledónea o una planta dicotiledónea seleccionada del grupo consistente en Arabidopsis thaliana, trigo, cebada, maíz, Brassica ssp., Gossypium hirsutum (algodón), Oryza sativa (arroz) y Eucalyptus ssp., cáñamo, yute, lino y plantas madereras incluyendo, pero no de forma limitativa, Pinus ssp., Populus ssp., Picea spp., entre otras.
Más preferentemente, el gen de celulosa relacionado o secuencia genética de celulosa relacionada se deriva de una planta que es útil en las industrias de las fibras o madera, por ejemplo Gossypium hirsutum (algodón), cáñamo, yute, lino, Eucalyptus ssp. o Pinus ssp, entre otras. Alternativamente, el gen de celulosa relacionado o la secuencia genética de celulosa relacionada se deriva de una planta que es útil en la industria de los cereales o del almidón, por ejemplo trigo, cebada, arroz o maíz, entre otras.
En un método particularmente preferido, la primera secuencia genética de celulosa se marca con una molécula informadora capaz de proporcionar una señal identificable (por ejemplo, un radioisótopo tal como ^{32}P o ^{32}S o una molécula biotinilada).
Un método alternativo comprende hibridar dos "moléculas cebadoras" de ácido nucleico a una "molécula de molde" de ácido nucleico que comprenden un gen de celulosa relacionado o una secuencia genética de celulosa relacionada o una parte funcional de los mismos, en donde el primero de dichos cebadores comprende nucleótidos contiguos derivados de una o más de SEQ ID Nos: 1, 3, 4, 5, 7, 9, 11 o 13 o un homólogo, análogo o derivado de las mismas, y el segundo de dichos cebadores comprende nucleótidos contiguos complementarios a una o más de SEQ ID Nos: 1, 3, 4, 5, 7, 9, 11 o 13. Copias de la molécula de ácido nucleico específica de la molécula de molde son amplificadas enzimáticamente en una reacción en cadena de la polimerasa, una técnica que es bien conocida para el experto en la materia.
Dichas moléculas cebadoras de ácido nucleico pueden ser de al menos 10 nucleótidos de longitud, más preferentemente de al menos 20 nucleótidos de longitud, incluso más preferentemente de al menos 30 nucleótidos de longitud, todavía más preferentemente de al menos 40 nucleótidos de longitud e incluso todavía más preferentemente de al menos 50 nucleótidos de longitud.
Además, las moléculas cebadoras de ácido nucleico consisten en una combinación de cualquiera de los nucleótidos adenina, citidina, guadina, timidita o inosina, o análogos funcionales o derivados de los mismos, que son al menos capaces de incorporarse en una molécula de polinucleótido sin presentar un efecto inhibidor sobre la hibridación de dicho cebador a la molécula de molde en el entorno en el cual se utiliza.
Por otro lado, una o ambas de las moléculas cebadoras de ácido nucleico pueden estar contenidas en una mezcla acuosa de otras moléculas cebadoras de ácido nucleico, por ejemplo una mezcla de secuencias cebadoras degeneradas que varían entre sí en una o más sustituciones o deleciones de nucleótidos. Alternativamente, una o ambas moléculas cebadoras de ácido nucleico pueden encontrarse en una forma sustancialmente pura.
La molécula de molde de ácido nucleico puede estar en una forma recombinante, en una partícula de virus, una partícula de bacteriofago, una célula de levadura, una célula animal o una célula vegetal. Preferentemente, la molécula de molde de ácido nucleico se deriva de una célula, tejido u órgano de una planta, en particular una célula, tejido u órgano que se deriva de una planta seleccionada del grupo consistente en Arabidopsis thaliana, Oryza sativa, trigo, cebada, maíz, Brassica ssp., Gossypium hirsutum y Eucalyptus ssp., cáñamo, yute, lino, y plantas madereras incluyendo, pero no de forma limitativa, Pinus ssp., Populus ssp., Picea spp., entre otras.
Los expertos en la materia sabrán que existen muchas variaciones conocidas del procedimiento básico de reacción en cadena de la polimerasa, que se pueden emplear para aislar un gen de celulosa relacionado o una secuencia genética de celulosa relacionada cuando está provista de las secuencias de nucleótidos indicadas en una o más de SEQ ID Nos: 1, 3, 4, 5, 7, 9, 11 o 13. Dichas variaciones se describen, por ejemplo, en McPherson et al.
(1991).
La molécula aislada de ácido nucleico, identificada de acuerdo con cualquiera de estos otros métodos, puede ser clonada en una molécula de plásmido o bacteriofago, por ejemplo para facilitar la preparación de moléculas cebadoras o sondas de hibridación o para la producción de productos de genes recombinantes. Los métodos para la producción de tales plásmidos, cósmidos, moléculas de bacteriofagos recombinantes u otras moléculas recombinantes son bien conocidos para el experto en la materia y se pueden llevar a cabo sin experimentación
indebida.
De este modo, se pueden generar plásmidos, bacteriofagos, cósmidos, todos ellos recombinantes, u otra molécula recombinante que comprende la secuencia de nucleótidos indicada en una o más de SEQ ID Nos: 1, 3, 4, 5, 7, 9, 11 o 13, o una secuencia complementaria, homólogo, análogo o derivado de las mismas.
La molécula de ácido nucleico de la presente invención es también útil para el desarrollo de constructos genéticos que expresan una secuencia genética de celulosa, proporcionando con ello una mayor expresión de los genes implicados en la biosíntesis de celulosa en plantas, seleccionados por ejemplo del grupo consistente en Arabidopsis thaliana, Oryza sativa, trigo, cebada, maíz, Brassica ssp., Gossypium hirsutum y Eucalyptus ssp., cáñamo, yute, lino, y plantas madereras incluyendo, pero no de forma limitativa, Pinus ssp., Populus ssp., Picea spp., entre otras. La presente invención contempla en particular la modificación de la biosíntesis de celulosa en algodón, cáñamo, yute, lino, Eucalyptus ssp. y Pinus ssp., entre otros.
Los presentes inventores han descubierto que las secuencias genéticas aquí descritas son capaces de ser utilizadas para modificar el nivel de \beta-1,4-glucano no cristalino, además de alterar los niveles de celulosa cuando se expresan, en particular cuando se expresan en células de plantas. En especial, el mutante rsw1 de Arabidopsis thaliana presenta niveles incrementados de \beta-1,4-glucano no cristalino, cuando se hace crecer a 31ºC, en comparación con plantas de tipo salvaje, crecidas bajo condiciones idénticas. Se ha comprobado que la expresión de una secuencia genética aquí descrita en la orientación antisentido en plantas transgénicas crecidas a solo 21ºC, reproduce muchos aspectos del fenotipo del mutante rsw1.
En consecuencia, la presente invención se extiende claramente a la modificación de la biosíntesis de \beta-1,4-glucano no cristalino en plantas, seleccionadas por ejemplo del grupo consistente en Arabidopsis thaliana, Oryza sativa, trigo, cebada, maíz, Brassica ssp., Gossypium hirsutum y Eucalyptus ssp., cáñamo, yute, lino, y plantas madereras incluyendo, pero no de forma limitativa, Pinus ssp., Populus ssp., Picea spp., entre otras. La presente invención contempla en particular la modificación de la biosíntesis de \beta-1,4-glucano no cristalino en algodón, cáñamo, yute, lino, Eucalyptus ssp. y Pinus ssp., entre otros.
La presente invención se extiende además a la producción y uso de \beta-1,4-glucano no cristalino y al uso del glucano para modificar las propiedades de las paredes celulares de plantas o fibras de algodón o fibras de madera. Dichas propiedades modificadas se describen aquí (ejemplo 13).
Los inventores han descubierto que el mutante rsw1 presenta una repartición de carbono alterada en comparación con plantas de tipo salvaje, dando ello como resultado niveles de almidón significativamente mayores en el mismo. las moléculas aisladas de ácido nucleico aquí proporcionadas son además útiles para alterar la repartición de carbono en una célula. En particular, la presente invención contempla la producción incrementada en almidón en plantas transgénicas que expresan la molécula de ácido nucleico de la invención en la orientación antisentido.
Métodos alternativos para conseguir esto incluyen la expresión de una ribozima o molécula de co-supresión que comprende la secuencia de ácidos nucleicos de la invención.
La invención contempla además la producción reducida de almidón y/o \beta-1,4-glucano no cristalino en plantas transgénicas que expresan la molécula de ácido nucleico de la invención en la orientación sentido, de manera que se aumenta la producción de celulosa en las mismas.
Cuando se desee aumentar la producción de celulosa en una célula vegetal, la región codificadora del gen de celulosa de la invención se coloca operativamente por detrás de un promotor, en la orientación sentido, de manera que un producto de gen de celulosa es capaz de expresarse bajo el control de dicha secuencia promotora. En una modalidad preferida, la secuencia genética de celulosa es una secuencia genómica de celulosa sintasa, una molécula de cDNA o una secuencia codificadora de proteína.
En una modalidad particularmente preferida, la secuencia genética de celulosa comprende una secuencia de nucleótidos sustancialmente idéntica a la secuencia indicada en una o más de SEQ ID Nos: 1, 5, 7, 9, 11 o 13.
Cuando se desee reducir el contenido en celulosa o aumentar el contenido en \beta-1,4-glucano no cristalino, la molécula de ácido nucleico de la presente invención se expresa en la orientación antisentido bajo el control de un promotor adecuado. Alternativamente, la molécula de ácido nucleico de la invención es también útil para el desarrollo de moléculas de ribozimas o en la co-supresión de un gen de celulosa. La expresión de una molécula antisentido, ribozima o de co-supresión que comprende un gen de celulosa, en una célula tal como una célula vegetal, una célula fúngica, una célula de insecto, una célula animal, una célula de levadura o célula bacteriana, puede también aumentar la solubilidad, capacidad de digestión o capacidad de extracción de metabolitos a partir de tejidos de plantas o, alternativamente, aumentar la disponibilidad de carbono como un precursor para cualquier metabolito secundario distinto de celulosa (por ejemplo, almidón o sucrosa). Mediante el reconocimiento de gen de celulosa endógeno, la expresión se disminuye, reduce o se rebaja de cualquier otro modo a un nivel que da como resultado una menor deposición de celulosa en las paredes celulares primarias o secundarias de la célula vegetal, célula fúngica, célula de insecto, célula animal, célula de levadura o célula bacteriana y, más particularmente una célula vegetal. Además o alternativamente, se incrementa el contenido en \beta-1,4-glucano no cristalino en tales
células.
La co-supresión es la reducción de expresión de un gen endógeno que ocurre cuando se introducen en la célula una o más copias de dicho gen o una o más copias de un gen sustancialmente similar. De este modo, la co-supresión se puede emplear para inhibir la expresión de un gen que codifica un producto genético de celulosa, tal como, pero no de forma limitativa, celulosa sintasa. Una molécula de co-supresión podría ser dirigida, por ejemplo, a una molécula de mRNA de una planta que codifica una enzima de celulosa sintasa, por ejemplo un mRNA de celulosa sintasa de una planta, hongo o bacteria y, más preferentemente un mRNA de una planta derivado de Arabidopsis thaliana, Oryza sativa, trigo, cebada, maíz, Brassica ssp., Gossypium hirsutum y Eucalyptus ssp., cáñamo, yute, lino, y plantas madereras incluyendo, pero no de forma limitativa, Pinus ssp., Populus ssp., Picea spp., entre
otras.
Por ejemplo, el gen que podría ser reconocido por una molécula de co-supresión, podría comprender una secuencia de nucleótidos indicada en una o más de SEQ ID Nos: 1, 3, 4, 5, 7, 9, 11 o 13 o un complemento, homólogo, análogo o derivado de las mismas.
En el contexto de la presente invención, una molécula antisentido es una molécula de RNA que es transcrita a partir de la hebra complementaria de un gen nuclear, de manera que normalmente es transcrita para producir una molécula de mRNA "sentido" capaz de ser traducida a un componente polipéptido de la vía de biosíntesis de celulosa. Por tanto, la molécula antisentido es complementaria al nRNA transcrito a partir de un gen de celulosa sentido o una parte del mismo. Aunque no se intenta limitar el modo de acción de las moléculas antisentido de la presente invención a ningún mecanismo específico particular, la molécula de RNA antisentido posee la capacidad de formar un mRNA de doble hebra mediante el apareamiento de bases con el mRNA sentido, lo cual puede evitar la traducción del mRNA sentido y la posterior síntesis de un producto genético polipeptídico.
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Con preferencia, la molécula antisentido de la presente invención reconoce una molécula de mRNA de una planta que codifica un producto genético de celulosa, por ejemplo celulosa sintasa. Preferentemente, la molécula antisentido de la presente invención reconoce una molécula de mRNA de una planta que codifica una enzima de celulosa sintasa, por ejemplo un mRNA de una planta derivada del grupo consistente en Arabidopsis thaliana, Oryza sativa, trigo, cebada, maíz, Brassica ssp., Gossypium hirsutum y Eucalyptus ssp., cáñamo, yute, lino, y plantas madereras incluyendo, pero no de forma limitativa, Pinus ssp., Populus ssp., Picea spp., entre otras.
En una modalidad particularmente preferida, la molécula antisentido de la presente invención reconoce una molécula de mRNA codificada por una o más de SEQ ID Nos: 1, 3, 4, 5, 7, 9, 11 o 13 o un homólogo, análogo o derivado de las mismas.
Las ribozimas son moléculas sintéticas de RNA que comprenden una región de hibridación complementaria a dos regiones, cada una de al menos 5 bases nucleotídicas contiguas en el mRNA sentido diana. Además, las ribozimas poseen una actividad de endoribonucleasa altamente específica, que escinde autocatalíticamente el mRNA sentido diana. Una descripción completa de la función de las ribozimas es ofrecida por Haseloff y Gerlach (1988) y se encuentra en la solicitud de Patente internacional No. WO 89/05852.
Se pueden generar ribozimas que reconocen un mRNA que codifica un producto genético de celulosa, y dándose con ello a dicho mRNA sentido y escindiéndolo, de manera que ya no es capaz de ser traducido para sintetizar un producto polipéptido funcional. Preferentemente, la molécula de ribozima reconoce una molécula de mRNA vegetal que codifica una enzima de celulosa sintasa, por ejemplo un mRNA vegetal derivado de Arabidopsis thaliana, Oryza sativa, trigo, cebada, maíz, Brassica ssp., Gossypium hirsutum y Eucalyptus ssp., cáñamo, yute, lino, y plantas madereras incluyendo, pero no de forma limitativa, Pinus ssp., Populus ssp., Picea spp., entre
otras.
Por ejemplo, la molécula de ribozima podría reconocer un mRNA codificado por una o más de SEQ ID Nos: 1, 3, 4, 5, 7, 9, 11 o 13 o un homólogo, análogo o derivado de las mismas.
Las ribozimas o moléculas antisentido adecuadas comprenden al menos 5 bases nucleotídicas contiguas derivadas de una o más de SEQ ID Nos: 1, 3, 4, 5, 7, 9, 11 o 13 o una secuencia complementaria de nucleótidos o un homólogo, análogo o derivado de las mismas, en donde dicha molécula antisentido o de ribozima es capaz de formar un complejo enlazado a hidrógeno con un mRNA sentido que codifica un producto genético de celulosa para reducir su
traducción.
En un ejemplo preferido, la molécula antisentido o de ribozima comprende al menos 10 a 20 nucleótidos contiguos derivados de una o más de SEQ ID Nos: 1, 3, 4, 5, 7, 9, 11 o 13 o una secuencia complementaria de nucleótidos o un homólogo, análogo o derivado de las mismas. Aunque las moléculas antisentido y/o de ribozimas preferidas se hibridan a por lo menos 10 a 20 nucleótidos aproximadamente de la molécula diana, se pueden preparar moléculas capaces de hibridarse a por lo menos 50-100 bases nucleotídicas aproximadamente de longitud, o bien una molécula capaz de hibridarse a un mRNA de longitud completa o sustancialmente completa codificado por un gen de celulosa, tal como un gen de celulosa sintasa.
Los expertos en la materia conocerán las condiciones necesarias, si es que las hay, para seleccionar o preparar las moléculas antisentido de la invención y moléculas de ribozimas como aquí se describe.
En la técnica se entiende que pueden realizarse ciertas modificaciones, incluyendo sustituciones de nucleótidos entre otras, en las moléculas antisentido y/o de ribozimas sin destruir la eficacia de dichas moléculas a la hora de inhibir la expresión de un gen que codifica un producto genético de celulosa tal como celulosa sintasa.
Pueden prepararse cualesquiera variantes de secuencias de nucleótidos, homólogos, análogos o fragmentos de dicho gen que codifica los anteriores, con el único requisito de que dicha variante de secuencia de nucleótidos, cuando es transcrita, produzca una molécula antisentido y/o de ribozima que sea capaz de hibridarse a una molécula de mRNA sentido que codifica un producto genético de celulosa.
El reconocimiento genético consiste en el reemplazamiento de una secuencia genética endógena dentro de una célula por una secuencia de DNA relacionada a la cual se hibrida, alterando con ello la forma y/o función del gen endógeno y el posterior fenotipo de la célula.
Al menos una parte de la secuencia de DNA definida por una o más de SEQ ID Nos: 1, 3, 4, 5, 7, 9, 11 o 13, o una secuencia genética relacionada de celulosa, se puede introducir en las células diana que contienen un gen de celulosa endógeno, reemplazando con ello a dicho gen endógeno de celulosa.
De acuerdo con dichos métodos, el producto polipéptido de dicha secuencia genética de celulosa posee diferentes características de actividad catalítica y/o expresión, produciendo a su vez una deposición de celulosa modificada en la célula diana.
El gen endógeno de celulosa de una planta puede ser, por tanto, reemplazado por un gen que simplemente es capaz de producir polímeros de \beta-1,4-glucano no cristalinos o, alternativamente, capaz de producir una celulosa modificada que presenta propiedades similares a las fibras sintéticas tal como rayón, en donde los polímeros de \beta-1,4-glucano están dispuestos en una configuración antiparalela entre sí.
La presente invención se extiende a constructos genéticos diseñados para facilitar la expresión de la secuencia genética de celulosa de la invención, incluyendo un constructo genético diseñado para facilitar la expresión de una molécula sentido o de una molécula antisentido. También se pueden preparar constructos diseñados para facilitar la expresión de un derivado funcional, parte, homólogo o análogo de los mismos, una molécula de ribozima, una molécula de co-supresión o una molécula de reconocimiento de genes.
Los constructos genéticos anteriores comprenden la referida molécula de ácido nucleico sentido, antisentido, o de ribozima o co-supresión, o una molécula de reconocimiento de genes, colocada operativamente bajo el control de una secuencia promotora capaz de regular la expresión de dicha molécula de ácido nucleico en una célula procariota o eucariota, preferentemente una célula vegetal. Dicho constructo genético comprende opcionalmente, además de un molécula de ácido nucleico promotora y sentido o antisentido, o de ribozima o de co-supresión o de reconocimiento de genes, una secuencia terminadora.
El término "terminadora" se refiere a una secuencia de DNA en el extremo de una unidad transcripcional que señala la terminación de la transcripción. Los terminadores son secuencias de DNA 3'-sin traducir que contienen una señal de poliadenilación, que facilita la adición de secuencias de poliadenilato al extremo 3' de un transcripto primario. Los terminadores activos en células de plantas son ya conocidos y han sido descritos en la bibliografía al respecto. Los mismos se pueden aislar a partir de bacterias, hongos, virus, animales y/o plantas. Ejemplos de terminadores particularmente adecuados para su uso en los constructos genéticos de la presente invención incluyen el terminador del gen de nopalina sintasa (NOS) de Agrobacterium tumefaciens, el terminador del gen 35S del virus del mosaico de coliflor (CaMV) y el terminador del gen de zeína de Zea mays.
La referencia que se hace aquí a un "promotor" ha de entenderse en su contexto más amplio e incluye las secuencias reguladoras transcripcionales de un gen genómico clásico, incluyendo la caja TATA que es requerida para una iniciación exacta de la transcripción, con o sin una secuencia de caja CCAAT y elementos reguladores adicionales (es decir, secuencias de activación aguas arriba, acentuadotes y silenciadores) que alteran la expresión genética en respuesta a estímulos de desarrollo y/o externos, o bien de una manera específica a los tejidos. Un promotor está situado normalmente, pero no necesariamente, aguas arriba o 5', de un gen estructural, cuya expresión regula. Además, los elementos reguladores que comprende un promotor están situados normalmente dentro de los 2 kb del sitio de inicio de la transcripción del gen.
En el presente contexto, el término "promotor" se emplea también para describir una molécula sintética o de fusión, o un derivado que confiere, activa o acentúa la expresión de dicha molécula de ácido nucleico sentido, antisentido o de ribozima o co-supresión, en la célula de una planta. Los promotores preferidos pueden contener copias adicionales de uno o más elementos reguladores específicos, para acentuar aún más la expresión de una molécula sentido, antisentido, ribozímica o de co-supresión y/o para alterar la expresión espacial y/o expresión temporal de dicha molécula sentido o antisentido, o ribozímica o de co-supresión o de reconocimiento de genes. Por ejemplo, se pueden colocar elementos reguladores que confieren una capacidad de inducción de cobre en posición adyacente a una secuencia promotora heteróloga que activa la expresión de una molécula sentido antisentido o ribozímica o de co-supresión o de reconocimiento de genes, confiriendo con ello una capacidad de inducción de cobre sobre la expresión de dicha
molécula.
La colocación de una molécula sentido o ribozímica, o antisentido, o de co-supresión o de reconocimiento de genes, bajo el control regulador de una secuencia promotora, significa el posicionamiento de dicha molécula de tal manera que la expresión es controlada por la secuencia promotora. Los promotores son situados generalmente 5' (aguas arriba) con respecto a los genes que los mismos pueden controlar. En la construcción de combinaciones heterólogas de promotor/gen estructural, en general es preferible situar el promotor a una distancia del sitio de inicio de la transcripción del gen que es aproximadamente la misma que la distancia entre dicho promotor y el gen que controla en su posición natural, es decir, el gen del cual se deriva el promotor. Como es conocido en la técnica, se puede admitir cierta variación en esta distancia sin pérdida de la función del promotor. Similarmente, el posicionamiento preferido de un elemento de una secuencia reguladora con respecto a un gen heterólogo a situar bajo su control, se define por el posicionamiento del elemento en su posición natural, es decir, los genes de los cuales se deriva. De nuevo, como es conocido en la técnica, también puede ocurrir cierta variación en esta
distancia.
Ejemplos de promotores adecuados para utilizarse en constructos genéticos de la presente invención incluyen promotores de origen vírico, fúngico, bacteriano, animal y vegetal capaces de funcionar en células procariotas o eucariotas. Los promotores preferidos son aquellos capaces de regular la expresión de los presentes genes de celulosa de la invención en células de plantas, células fúngicas, células de insectos, células de levadura, células de animales o células bacterianas, entre otras. Los promotores particularmente preferidos son capaces de regular la expresión de las presentes moléculas de ácido nucleico en células de plantas. El promotor puede regular la expresión de dicha molécula de forma constitutiva o diferenciar con respecto al tejido en el cual ocurre la expresión o, con respecto a la fase de desarrollo a la cual ocurre la expresión, o en respuesta a estímulos externos tales como tensiones fisiológicas o patógenos de plantas o iones metálicos, entre otros. Preferentemente, el promotor es capaz de regular la expresión de una molécula sentido o ribozímica o antisentido o de co-supresión o de reconocimiento de genes, en una célula de una planta. Ejemplos de promotores preferidos incluyen el promotor 35S de CaMV, el promotor de NOS, el promotor de octopina sintasa (OCS) y similares.
En una modalidad sumamente preferida, el promotor es capaz de expresión en cualquier célula vegetal, tal como, pero no de forma limitativa, a una planta seleccionada del grupo consistente en Arabidopsis thaliana, Oryza sativa, trigo, cebada, maíz, Brassica ssp., Gossypium hirsutum y Eucalyptus ssp., cáñamo, yute, lino, y plantas madereras incluyendo, pero no de forma limitativa, Pinus ssp., Populus ssp., Picea spp., entre otras.
En una modalidad particularmente preferida, el promotor se puede derivar de un clon genómico que codifica un producto genético de celulosa, en particular el promotor contenido en la secuencia indicada en SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4. Preferentemente, la secuencia promotora comprende nucleótidos 1 a 1.900 aproximadamente de SEQ ID NO: 3 o nucleótidos 1 a 700 aproximadamente de SEQ ID NO: 4.
Opcionalmente, los constructos genéticos de la presente invención y/o como aquí se describen, comprenden una secuencia terminadora.
Como un ejemplo de lo anterior, se proporciona un constructo genético primario que comprende la secuencia nucleotídica aislada de nucleótidos indicada en SEQ ID NO: 3. También se proporciona un constructo genético que comprende la secuencia nucleotídica aislada de nucleótidos indicada en SEQ ID NO: 1 en la orientación antisentido, colocada operativamente en conexión con el promotor 35S de CaMV.
En el presente contexto, la expresión "en conexión operativa con" significa que la expresión de la secuencia aislada de nucleótidos se encuentra bajo el control de la secuencia promotora con la cual está conectada, independientemente de la distancia física relativa de las secuencias entre sí o de su orientación relativa entre sí.
También se pueden preparar constructos genéticos que comprenden un promotor o derivado funcional, parte, fragmento, homólogo o análogo del mismo, que es capaz de dirigir la expresión de un polipéptido al principio del desarrollo de una célula vegetal en una etapa en donde la pared celular se encuentra en desarrollo, tal como durante la expansión celular o durante la división celular. Por ejemplo, el promotor puede estar contenido en la secuencia indicada en SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4. Preferentemente, la secuencia promotora comprende los nucleótidos 1 a 1.900 aproximadamente de SEQ ID NO: 3 o los nucleótidos 1 a 700 aproximadamente de SEQ ID NO: 4 o un homólogo, análogo o derivado capaz de hibridarse a la misma bajo condiciones de estringencia al menos bajas.
El polipéptido puede ser una molécula informadora que es codificada por un gen tal como el gen bacteriano de \beta-glucuronidasa o gen de cloranfenicol acetiltransferasa o, alternativamente, el gen de luciferasa de luciérnaga. Alternativamente, el polipéptido puede ser codificado por un gen que es capaz de producir una celulosa modificada en la célula de la planta cuando se pone en combinación con el complemento normal de genes de celulosa que son expresables en el mismo, por ejemplo puede ser un gen de tipo celulosa obtenido a partir de una fuente bacteriana o fúngica o un gen de celulosa obtenido a partir de una fuente vegetal.
Los constructos genéticos de la presente invención son particularmente útiles en la producción de plantas de cultivo con un contenido o estructura de celulosa alterado. En particular, el grado de deposición de celulosa se puede reducir conduciendo ello a una reducción del contenido total en celulosa en plantas mediante transferencia, al interior de una planta, de una o más de las moléculas antisentido, como se ha definido en los métodos de la invención. Alternativamente, moléculas de ribozima o de co-supresión descritas supra pueden ser transferidas a una planta o, alternativamente, se puede conseguir el mismo o similar resultado final reemplazando un gen de celulosa endógeno con un gen de celulosa inactivo o modificado empleando técnicas de reconocimiento de genes. Los beneficios derivados de reducir el contenido en celulosa en plantas resultan especialmente evidentes en cultivos de productos alimenticios y de forraje tales como, pero no de forma limitativa, maíz, trigo, cebada, centeno, arroz, mijo o sorgo, entre otros en donde se desea una capacidad de digestión mejorada de dicho cultivo. Las anteriores moléculas antisentido, ribozímicas o de co-supresión son también útiles en la producción de plantas con una repartición alterada de carbono, de manera que quede disponible una mayor cantidad de carbono para el crecimiento, en lugar de depositarse en forma de
celulosa.
Alternativamente, la introducción en plantas de copias adicionales de un gen de celulosa en la orientación "sentido" y bajo el control de un promotor fuerte, es útil para la producción de plantas con un mayor contenido en celulosa o con velocidades más rápidas de biosíntesis de celulosa, por tanto, dichas plantas pueden exhibir una variedad de rasgos deseados incluyendo, pero no de forma limitativa, resistencia y/o forma y/o propiedades modificadas de las fibras, células y plantas, una mayor protección contra tensiones químicas, físicas o medioambientales tal como deshidratación, metales pesados (por ejemplo, cadmio), frío, calor o viento, una mayor resistencia al ataque por patógenos tales como insectos, nemátodos y similares que físicamente penetran en la barrera de la pared celular durante la invasión/infección de la planta.
Alternativamente, la producción de plantas con propiedades físicas alteradas es posible por la introducción en las mismas de uno o más genes de celulosa alterados. Dichas plantas pueden producir \beta-1,4-glucano que es no cristalino o que muestra una cristalinidad alterada. Dichas plantas pueden también exhibir una variedad de rasgos deseados incluyendo, pero no de forma limitativa, contenido alterado en fibra dietética, capacidad de digestión y de degradación alteradas o producción de plantas con propiedades de capacidad de extracción alteradas.
Además, los constructos genéticos que comprenden un gen vegetal de celulosa en la orientación "sentido" se pueden emplear para complementar la variedad existente de genes de celulosa presentes en una planta, alterando con ello la composición o tiempo de deposición de celulosa depositada en la pared celular de dicha planta. En una modalidad preferida, el gen de celulosa de una especie de plantas o un gen de \beta-1,4-glucano sintasa de una especie no vegetal, se utiliza para transformar una planta de una especie diferente, introduciendo con ello un nuevo metabolismo de biosíntesis de celulosa en la segunda especie vegetal mencionada.
Se pueden producir polipéptidos de fusión recombinantes que contienen el sitio activo de un producto genético de celulosa fusionado a otro producto genético de celulosa, en donde dicho polipéptido de fusión exhibe las propiedades catalíticas en comparación con el polipéptido "parental" del cual se deriva. Dichos polipéptidos de fusión se pueden producir por técnicas convencionales de DNA recombinante conocidas para el experto en la materia, introduciendo en dicha planta un DNA recombinante capaz de expresar el polipéptido de fusión entero o, alternativamente, mediante una técnica de reconocimiento de genes en donde la recombinación al nivel de DNA ocurre in vivo y el gen resultante es capaz de expresar un polipéptido de fusión recombinante.
La molécula de DNA recombinante que porta la molécula sentido o antisentido de la presente invención o que porta una molécula de ribozima o de co-supresión como aquí se ha descrito, y/o un constructo genético que comprende la misma, se puede introducir en el tejido de la planta, produciendo con ello una "planta transgénica", por diversas técnicas conocidas para el experto en la materia. La técnica usada para una determinada especie de planta o tipo específico de tejido de planta depende de las técnicas conocidas que tienen éxito al respecto. Los medios para introducir DNA recombinante en el tejido de una planta incluyen, pero de forma limitativa, transformación (Paszkowski et al., 1984), electroporación (Fromm et al., 1985) o microinyección del DNA (Crossway et al., 1986) o transferencia mediada por T-DNA a partir de Agrobacterium al tejido de la planta. Sistemas vectores de T-DNA representativos se describen en las siguientes referencias: An et al. (1985); Herrera-Estrella et al. (1983a,b); Herrera-Estrella et al. (1985). Una vez introducido en el tejido de la planta, la expresión del gen introducido puede ser analizada en un sistema de expresión transitoria, o bien se puede determinar después de la selección respecto a una integración estable dentro del genoma de la planta. Se conocen técnicas para el cultivo in vitro de tejido de planta y, en un número de casos, para la regeneración a plantas enteras. Los expertos en la materia conocen procedimientos para transferir el gen introducido desde la planta originalmente transformada a variedades vegetales comercialmente
útiles.
Otro aspecto más de la presente invención se extiende a una planta transgénica tal como una planta de cultivo, que porta constructos genéticos que comprenden la molécula de nucleótido de la invención conectada operativamente a una secuencia promotora heteróloga. Preferentemente, dicha secuencia promotora es capaz de regular la expresión en una planta. Con preferencia, la planta transgénica es una o más de las siguientes: Arabidopsis thaliana, Oryza sativa, trigo, cebada, maíz, Brassica ssp., Gossypium hirsutum y Eucalyptus ssp., cáñamo, yute, lino, y plantas madereras incluyendo, pero no de forma limitativa, Pinus ssp., Populus ssp., Picea spp. No quedan excluidas otras
especies.
La presente invención se extiende además a la progenie de dicha planta transgénica.
También se pueden producir plantas que portan las citadas moléculas sentido, antisentido, ribozímicas o de co-supresión o de reconocimiento de genes y/o constructos genéticos que comprenden las mismas.
La presente secuencia genética puede ser expresada en un hospedante adecuado (por ejemplo, una procariota o eucariota) para producir productos genéticos de celulosa recombinantes de longitud completa o de longitud
incompleta.
De aquí en adelante, el término "producto genético de celulosa" deberá ser considerado como refiriéndose a un producto recombinante de un gen de celulosa como anteriormente se ha definido, por tanto, el término "producto genético de celulosa" incluye un producto polipéptido de cualquier gen implicado en la vía de biosíntesis de celulosa en plantas, tal como, pero no de forma limitativa, un producto genético de celulosa sintasa.
Preferentemente, el producto genético de celulosa recombinante comprende una secuencia de aminoácidos que tiene la actividad catalítica de un polipéptido de celulosa sintasa o un mutante funcional, derivado, parte, fragmento o análogo del mismo.
En una modalidad particularmente preferida de la invención, el producto genético de celulosa recombinante comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica al menos en un 40% a una o más de SEQ ID Nos: 2, 6, 8, 10, 12 o 14 o un homólogo, análogo o derivado de las mismas, como queda definido en las reivindicaciones. También se describen otros homólogos, análogos y derivados de las mismas.
En la tabla 1 se ofrecen abreviaturas de una sola letra y de tres letras utilizadas para los residuos aminoácido contenidos en la invención.
En el presente contexto, los "homólogos" de una secuencia de aminoácidos se refiere a aquellos polipéptidos, enzimas o proteínas que tienen una actividad catalítica similar a la de las secuencias de aminoácidos aquí descritas, independientemente de cualesquiera sustituciones, adiciones o deleciones de aminoácidos en las mismas. Un homólogo puede ser aislado o derivado de la misma u otra especie de planta que la especie de la cual se derivan los polipéptidos de la invención.
Los "análogos" abarcan polipéptidos de la invención, independientemente de la existencia en los mismos de análogos de aminoácidos de origen no natural.
Los "derivados" incluyen péptidos modificados en donde están unidos ligandos a uno o más de los residuos aminoácido allí contenidos, tales como carbohidratos, enzimas, proteínas, polipéptidos o moléculas informadoras tales como radionúclidos o compuestos fluorescentes. La presente invención contempla particularmente las formas glicosiladas, fluorescentes, aciladas o alquiladas de los presentes péptidos. Además, los derivados de una secuencia de aminoácidos como aquí se describe, que comprende fragmentos o partes de las presentes secuencias de aminoácidos, quedan dentro del alcance de la invención, tales como homopolímeros y heteropolímeros que comprenden dos o más copias de los presentes polipéptidos. Los procedimientos para la derivación de péptidos son bien conocidos en la
técnica.
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TABLA 1 
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1 
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Las sustituciones abarcan alteraciones de aminoácidos en donde un aminoácido es reemplazado por un residuo aminoácido diferente tanto de origen natural como no convencional. Dichas sustituciones pueden ser clasificadas como "conservadoras" en donde un residuo aminoácido contenido en un producto genético de celulosa es reemplazado por otro aminoácido de origen natural de carácter similar, por ejemplo Gly \leftrightarrow Ala, Val \leftrightarrow Leu, Asp \leftrightarrow Glu, Lys \leftrightarrow Arg, Asn \leftrightarrow Gln o Phe \leftrightarrow Trp \leftrightarrow Tyr.
Las sustituciones pueden ser también "no conservadoras" en donde un residuo aminoácido que está presente en un producto genético de celulosa aquí descrito es sustituido por un aminoácido con propiedades diferentes, tal como un aminoácido de origen natural de un grupo diferente (por ejemplo, un aminoácido cargado o hidrófobo sustituido por alanina) o alternativamente en donde un aminoácido de origen natural está sustituido por un aminoácido no convencional.
Los aminoácidos no convencionales abarcados por la invención incluyen, pero no de forma limitativa, aquellos indicados en la tabla 2.
Las sustituciones de aminoácidos son generalmente de residuos individuales, pero pueden ser de múltiples residuos, bien en racimos o bien dispersados.
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Las deleciones de aminoácidos serán normalmente del orden de alrededor de 1-10 residuos aminoácido, mientras que las inserciones pueden ser de cualquier longitud. Las deleciones e inserciones se pueden efectuar en el terminal N, terminal C o pueden ser deleciones o inserciones internas. En general, las inserciones dentro de la secuencia de aminoácidos serán más pequeñas que las fusiones amino- o carboxi-terminales y serán del orden de 1-4 residuos aminoácido.
Tal y como se ha indicado aquí en varias partes, un homólogo, análogo o derivado de un producto genético de celulosa como al que aquí se hace referencia, cae dentro del alcance de la invención en el caso de que tenga una secuencia como la definida en las reivindicaciones. Un homólogo, análogo o derivado de un producto genético de celulosa, como al que aquí se hace referencia, puede prepararse fácilmente empleando técnicas de síntesis de péptidos bien conocidas en la materia, tal como síntesis de péptidos en fase sólida y similares, o bien por manipulaciones de DNA recombinante. También son bien conocidas las técnicas para producir mutaciones sustituidas en sitios predeterminados empleando la tecnología del DNA recombinante, por ejemplo mediante mutagénesis M13. En la técnica son bien conocidas las manipulaciones de moléculas de ácidos nucleicos para producir péptidos, polipéptidos o proteínas variantes que se manifiestan como sustituciones, inserciones o deleciones.
Los productos genéticos de celulosa aquí descritos se pueden derivar además mediante la inclusión o acoplamiento a los mismos de un grupo protector que impide, inhibe o decelera los procesos proteolíticos o de degradación celular. Dicha derivación puede ser útil cuando se requiere prolongar la vida media del presente polipéptido, por ejemplo para aumentar la cantidad de celulosa producida en una pared celular primaria o secundaria de una célula de una planta o, alternativamente, para aumentar la cantidad de proteína producida en un sistema de expresión bacteriano o eucariótico. Ejemplos de grupos químicos adecuados para esta finalidad incluyen, pero no de forma limitativa, cualquiera de los residuos aminoácidos no convencionales indicados en la tabla 2, en particular un D-estereoisómero o una forma metilada de un aminoácido de origen natural indicado en la tabla 1. Otros grupos químicos que son útiles para esta finalidad se eligen del grupo consistente en sustituyentes arilo o N-acilo heterocíclico, mitades de óxido de polialquileno, muteínas de desulfatohuridina, alfa-muteínas, ácidos alfa-aminofosfónicos, grupos poliméricos solubles en agua tal como polietilenglicol enlazados a residuos de azúcares empleando grupos hidrazona u oxima, derivados de benzodiacepindiona, grupos glicosilo tal como beta-glicosilamina o un derivado de la misma, isocianato conjugado a un grupo funcional poliólico o polioxietilenpoliol terminado con diisocianato, entre otros. Similarmente, un producto genético de celulosa o un homólogo, análogo o derivados del mismo se puede reticular o fusionar a él mismo o a un péptido inhibidor de proteasa, para reducir la susceptibilidad de dicha molécula a la
proteolisis.
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(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA 2
2
3
4
En una modalidad alternativa de la invención, el producto genético de celulosa recombinante se caracteriza por estar contenido en el mismo al menos un dominio funcional de \beta-glicosil transferasa.
El término "dominio de \beta-glicosil transferasa" tal y como aquí se emplea, se refiere a una secuencia de aminoácidos que se encuentra altamente conservada en diferentes enzimas de procesado pertenecientes a la clase de enzimas de glicosil transferasa (Saxena et al., 1995), por ejemplo las enzimas bacterianas de \beta-1,4-glicosil transferasa y enzimas de celulosa sintasa de plantas, entre otras, en donde dicho dominio posee una función putativa a la hora de contribuir a o mantener la actividad catalítica global, especificidad al sustrato o unión al sustrato de una enzima de dicha clase de enzimas. El dominio de \beta-glicosil transferasa es reconocible por la presencia de ciertos residuos aminoácido en posiciones particulares en una secuencia de polipéptidos, pero en el mismo no está comprendido ninguna extensión de residuos de aminoácidos contiguos.
Como consecuencia de la ausencia de contigüidad en un dominio de \beta-glicosil transferasa, no es una materia probada aislar un gen de celulosa sacando provecho de la presencia de un dominio de \beta-glicosil transferasa en el polipéptido codificado por dicho gen. Por ejemplo, el dominio de \beta-glicosil transferasa no sería fácilmente utilizable como una sonda para facilitar el aislamiento rápido de todas las secuencias genéticas de \beta-glicosil transferasa de un organismo particular y aislar entonces, a partir de estas secuencias genéticas, un gen de celulosa tal como celulosa sintasa.
En una modalidad preferida, la presente invención proporciona un polipéptido aislado que:
(i)
contiene al menos un dominio estructural de \beta-gicosil transferasa como anteriormente se ha definido y
(ii)
tiene una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos 40% con la secuencia de aminoácidos indicada en una o más de SEQ ID Nos: 2, 6, 8, 10, 12 o14.
También se describen homólogos, análogos y derivados del mismo.
Los polipéptidos alternativos pueden ser idénticos al menos en un 40% a por lo menos 20 o 50 residuos aminoácido contiguos, incluso más preferentemente a por lo menos 100 residuos aminoácido de una o más de SEQ ID Nos: 2, 6, 8, 10, 12 o14 o un homólogo, análogo o derivado de los mismos.
En una modalidad particularmente preferida, el porcentaje de similitud a una o más de SEQ ID Nos: 2, 6, 8, 10, 12 o14 es de al menos 50-60%, más preferentemente al menos 65-70%, incluso más preferentemente al menos 75-80% e incluso más preferentemente al menos 85-90%, incluyendo 91% o 95% aproximadamente.
En una modalidad relacionada, la presente invención proporciona una forma "secuencialmente pura" de la secuencia de aminoácidos aquí descrita. La expresión "secuencialmente pura" ha sido descrita anteriormente como sustancialmente homogénea para facilitar la determinación de aminoácidos.
El polipéptido de celulosa sintasa se describe como estando en una forma "sustancialmente homogénea" de la presente secuencia de aminoácidos, en donde el término "sustancialmente homogénea" se define anteriormente como siendo una forma adecuada para la interacción con una molécula inmunológicamente interactiva. Con preferencia, el polipéptido es al menos 20% homogéneo, más preferentemente al menos 50% homogéneo, todavía más preferentemente al menos 75% homogéneo y aún todavía más preferentemente al menos alrededor de 95-100% homogéneo, en términos de actividad por microgramo de proteína total en el preparado de proteína.
También se describen péptidos sintéticos de al menos 5 residuos aminoácido de longitud derivados de o que comprenden una parte de la secuencia de aminoácido indicada en una o más de SEQ ID Nos: 2, 6, 8, 10, 12 o14 o que tiene una similitud con las mismas de al menos 40%.
Los expertos en la materia conocerán que tales péptidos sintéticos pueden ser útiles en la producción de moléculas inmunológicamente interactivas para la preparación de anticuerpos o como el componente péptido de un inmunoensayo.
La invención se extiende además a una molécula de anticuerpo tal como un anticuerpo policlonal o monoclonal o una parte o fragmento inmunológicamente interactivo del mismo que es capaz de unirse específicamente a un producto genético de celulosa de acuerdo con cualquiera de las modalidades anteriores.
El término "anticuerpo" como aquí se utiliza, está destinado a incluir fragmentos del mismo que son también específicamente reactivos con un polipéptido de la invención. Los anticuerpos pueden ser fragmentados empleando técnicas convencionales y los fragmentos pueden ser examinados respecto a su utilidad de la misma manera que los anticuerpos enteros. Por ejemplo, se pueden generar fragmentos F(ab')2 por tratamiento del anticuerpo con pepsina. El fragmento F(ab')2 resultante se puede tratar para reducir los puentes disulfuro para producir fragmentos
Fab'.
Los expertos en la materia son conocedores de cómo producir moléculas de anticuerpos cuando están provistos del producto genético de celulosa de la presente invención. Por ejemplo, mediante el uso de un polipéptido de la presente invención, se pueden preparar antisueros policlonales o anticuerpos monoclonales empleando métodos convencionales. Un mamífero (por ejemplo, un ratón, hámster o conejo) puede ser inmunizado con una forma inmunógena de polipéptido que ejerce una respuesta de anticuerpos en el mamífero. Las técnicas para conferir inmunogenicidad en un polipéptido incluyen la conjugación a soportes u otras técnicas ya bien conocidas en la materia. Por ejemplo, el polipéptido puede ser administrado en presencia de adyuvante. El progreso de la inmunización puede ser controlado mediante detección de títulos de anticuerpo en plasma o suero. Puede emplear el ensayo ELISA convencional u otro inmunoensayo con el inmunógeno como antígeno para evaluar los niveles de anticuerpo. Después de la inmunización, se pueden obtener antisueros y, si se desea, a partir de los sueros se pueden aislar moléculas de IgG correspondientes a los anticuerpos policlonales.
Para producir anticuerpos monoclonales, se pueden recoger células productoras de anticuerpos (linfocitos) a partir de un animal inmunizado y funcionadas con células de mieloma mediante procedimientos convencionales de fusión de células somáticas, para inmortalizar así dichas células y proporcionar células de hibridomas. Dichas técnicas son bien conocidas en la materia. Por ejemplo, la técnica de hibridomas desarrollada originalmente por Kohler y Milstein (1975), así como otras técnicas tal como la técnica de hibridomas de células B humanas (Kozbor et al., 1983), la técnica de EBV-hibridomas para producir anticuerpos monoclonales humanos (Cole et al., 1985) y el examen de librerías de anticuerpos combinatoriales (Huse et al., 1989). Las células de hibridomas pueden ser examinadas inmunoquímicamente para la producción de anticuerpos que son específicamente reactivos con el polipéptido y pueden aislarse anticuerpos monoclonales.
Al igual que con todas las composiciones inmunógenas para educir anticuerpos, se deben determinar empíricamente cantidades que sean inmunogénicamente eficaces de los polipéptidos de la invención. Los factores a considerar incluyen la inmunogenicidad de los péptidos naturales, si el péptido ha de ser complejado o no con o enlazado covalentemente a un adyuvante o proteína de soporte u otro soporte y la vía de administración de la composición, es decir, intravenosa, intramuscular, subcutánea, etc, y el número de dosis inmunizantes a administrar. Dichos factores son conocidos en el campo de las vacunas y se encuentra dentro del conocimiento normal de los inmunólogos para llevar a cabo dichas determinaciones sin realizar experimentaciones indebidas.
También se describen segundos anticuerpos (monoclonales, policlonales o fragmentos de anticuerpos) dirigidos a los primeros anticuerpos mencionados y expuestos anteriormente. Tanto los primeros como segundos anticuerpos se pueden emplear en ensayos de detección o bien se puede emplear un primer anticuerpo con un anticuerpo anti-inmunoglobulina comercialmente disponible.
La presente invención se describe además con referencia a las siguientes figuras y ejemplos que no suponen limitación alguna de la invención.
En las figuras:
La figura 1 es una representación fotográfica que muestra la longitud de influorescencia de plantas de Arabidopsis thaliana Columbia de tipo salvaje (plantas 1 y 3) y plantas de rsw1 (plantas 2 y 4) crecidas a 21ºC (plantas 1 y 2) o 31ºC. Las plantas se hicieron crecer inicialmente a 21ºC hasta que comenzó la formación de botones, se retiraron los botones y se siguió el re-crecimiento en plantas crecidas a cada temperatura.
La figura 2 es una representación fotográfica de una micrografía de crio-barrido electrónico que muestra células epidérmicas deformadas en los cotiledones e hipocotilo del mutante de rsw1 cuando se hacen crecer a 31ºC durante 10 días.
La figura 3 es una representación gráfica de un cromatógrafo de gases de altitol acetatos de azúcares metilados a partir de una referencia de celulosa (panel superior) y a partir del glucano neutro derivado de retoños de plantas rsw1 crecidas a 31ºC (panel inferior). Los picos coincidentes demuestran que el glucano en rws1 está 1,4-enlazado.
La figura 4 es una representación esquemática de la región contigua del cromosoma 4 de Arabidopsis thaliana (caja punteada) entre los marcadores cósmidos g8300 y 06455, mostrando la posición de los clones superpuestos de YAC (cajas blancas) dentro de la región contigua. También se indica la posición del locus de RSW1, aproximadamente a 1,2 cM de g8300 y a 0,9 cM de 06455. La escala indica 100 kb de longitud; L, extremo izquierdo de YAC; R, extremo derecho de YAC. Por encima de la representación del cromosoma 4, se indican los fragmentos de YAC y fragmentos de clones cósmidos usados para construir la región contigua, empleando aun designación de prefijos correspondiente a YAC o al cósmido a partir de los cuales se obtuvieron los fragmentos (por ejemplo, yUP9E3, yUP30B12, etc) y una designación de sufijos indicativa de si el fragmento corresponde o no al extremo derecho (RE) o al extremo izquierdo (LE) del clon de YAC; N, Norte; S, Sur; CAPS, versión de la secuencia polimórfica amplificada y escindida (Konieczny y Ausubel, 1993) del marcador g8300.
La figura 5 es una representación esquemática de un mapa de restricción del constructo 23H12 entre las secuencias del borde izquierdo de T-DNA (LB) y del borde derecho de T-DNA (RB) (línea sólida superior), que muestra la posición del locus de RSW1 de Arabidopsis thaliana (caja punteada). La línea en la parte superior de la figura indica la región de 23H12 que está contenida en el constructo pRSW1. La estructura del gen de RSW1 entre los codones de inicio de la traducción (ATG) y de parada de la traducción (TAG) se indica en la parte inferior de la figura. Los exones vienen indicados por cajas negras; los intrones vienen indicados por la línea negra sólida. En la parte inferior de la figura se indica también la alineación del clon T20782 de EST con respecto al extremo 3' del gen de RSW1, desde cerca del extremo del exón 7 al extremo del exón 14. Los sitios de restricción dentro de 23H12 son como sigue: B, BamHI; E, EcoRI; H, HindIII; S, SalI; Sm, SmaI.
La figura 6 es una representación fotográfica que muestra la complementación del fenotipo de hinchamiento radicular radial del mutante de rsw1 por transformación con el constructo 23H12. El mutante de rsw1 fue transformado con 23H12 como se describe en el ejemplo 6. Las plantas de rsw1 transformadas (grupo central de tres plántulas), plantas de rsw1 sin transformar (grupo izquierdo de tres plántulas) y plantas de A. thaliana Columbia sin transformar (grupo derecho de tres plántulas) se hicieron crecer a 21ºC durante 5 días y luego fueron transferidas a 31ºC durante 2 días más, tras lo cual se determinó el grado de alargamiento radicular e hinchamiento radicular radial.
La figura 7 es una representación fotográfica que compara plantas de Arabidopsis thaliana Columbia de tipo salvaje (lado derecho de la regla) y plantas de A. thaliana Columbia transformadas con el constructo de RSW1 antisentido (es decir, EST T20782 expresado en la orientación antisentido bajo el control de la secuencia promotora 35S de CaMV; lado izquierdo de la regla), mostrando el acortamiento de influorescencia a 21ºC en plantas transformadas con el constructo de RSW1 antisentido en comparación con las plantas de Columbia sin transformar. El fenotipo de las plantas antisentido a 21ºC es similar al fenotipo del mutante de rsw1 a 31ºC. La altura de la influorescencia viene indicada en milímetros.
La figura 8 es una representación esquemática que muestra los primeros 90 residuos aminoácido de RSW1 de Arabidopsis thaliana alineados con la secuencia de aminoácidos de polipéptidos homólogos de A. thaliana y de otras especies de plantas. La región sombreada indica secuencias altamente conservadas. Ath-A y Ath-B son clones de cDNA relacionados de Arabidopsis thaliana identificados mediante examen por hibridación empleando parte del cDNA de RSW1 como sonda. S0542, clon EST de arroz (banco de DNA MAFF, Japón); secuencias celA1 y celA2 y cDNA de algodón expresadas en fibra de algodón (Pear et al., 1996); SOYSTF1A y SOYSTF1B, factores de transcripción putativos bZIP de soja. Las designaciones de aminoácidos son como las indicadas en la tabla 1 aquí incorporada. Los residuos de cisteína conservados vienen indicados por el asterisco.
La figura 9 es una representación esquemática que muestra la alineación de la secuencia completa de aminoácidos de RSW1 de Arabidopsis thaliana con la secuencia de aminoácidos de polipéptidos homólogos de A. thaliana y otras especies de plantas. La región sombreada indica secuencias altamente conservadas. Ath-A y Ath-B son clones de cDNA estrechamente relacionados de Arabidopsis thaliana identificados mediante examen por hibridación empleando parte del cDNA de RSW1 como sonda. S0542, clon EST de arroz (banco de DNA MAFF, Japón); celA1, secuencia genética del algodón (Pear et al., 1996); D48636, un clon de cDNA parcial obtenido del arroz (Pear et al., 1996). Las designaciones de aminoácidos son como las indicadas en la tabla 1 aquí incorporada. La numeración indica la posición del aminoácido en la secuencia de RSW1.
La figura 10 es una representación esquemática del polipéptido de RSW1, que muestra las posiciones de hélices de transmembranas putativas (cajas ralladas), la región rica en cisteína (Cys) y los residuos aspartato (D) y la firma de QVLRW que se encuentran conservadas entre RSW1 y secuencias de aminoácidos relacionadas. Las regiones de RSW1 que se encuentran altamente conservadas entre polipéptidos putativos de la biosíntesis de celulosa vienen indicadas por las cajas sombreadas en oscuro, mientras que las regiones menos conservadas vienen indicadas por las cajas sombreadas en tono claro.
La figura 11 es una representación fotográfica de una hibridación de transferencia Southern del extremo 5' del cDNA de RSW1 de Arabidopsis thaliana a DNA digerido con BgIII derivado de A. thaliana (carril 1) y de algodón (carril 2). Las hibridaciones fueron realizadas en condiciones de baja estringencia a 55ºC. Las flechas indican las posiciones de las bandas de hibridación.
Ejemplo 1
Caracterización del rsw1 mutante de Arabidopsis thaliana deficiente en celulosa 1. Morfología
El rsw1 mutante de Arabidopsis thaliana se produjo en un fondo genético que comprende el ecotipo Columbia.
La forma alterada de células radiculares y la sensibilidad a la temperatura de la morfología de la raíz del mutante rsw1 de Arabidopsis thaliana, son descritas, entre otros mutantes morfológicos por Baskin et al., (1992).
Como se muestra en la figura 1, los presentes inventores han demostrado que el mutante rsw1 exhibe el fenotipo sorprendente de presentar una menor altura de influorescencia cuando se hace crecer a 31ºC, en comparación con las plantas Columbia de tipo salvaje crecidas bajo condiciones similares. En contraste, cuando el crecimiento se efectúa a 21ºC, la altura de influorescencia de rsw1 no es diferente de manera significativa respecto de las plantas de tipo salvaje crecidas bajo condiciones similares, indicando ello que el fenotipo de retoños de rsw1 es condicional y dependiente de la temperatura.
Además, la microscopía de crio-barrido electrónico de las células epidérmicas del mutante rsw1 indica una anormalidad importante en la forma celular, particularmente con respecto a aquellas células epidérmicas que forman las hojas, hipocotilo y cotiledóneas, cuando las plántulas se hacen crecer a 31ºC (figura 2).
Las rosetas (complejos terminales) son los complejos putativos hexaméricos de celulosa sintasa de membranas de plasma de plantas superiores (Herth, 1985). Las células radiculares fracturadas por congelación de plantas de Arabidopsis thaliana rsw1 crecidas a 18ºC muestran microfibrilas y rosetas de celulosa sobre la cara PF de la membrana de plasma que se asemejan a aquellas de A. thaliana de tipo salvaje y otros angiospermas. La transferencia del mutante rsw1 a 31ºC reduce el número de rosetas en el mutante en el plazo de 30 minutos, conduciendo a una pérdida extensiva después de 3 horas. Las partículas de la membrana de plasma se alinean en filas tras la exposición prolongada a la temperatura restrictiva. En contraste, no existe cambio de apariencia de los microtúbulos corticales que alinean microfibrilas de celulosa o de cuerpos Golgl que sintetizan otros polisacáridos de la pared y se asemejan a rosetas.
2. Contenido en carbohidratos
El efecto de las mutaciones en el gen de RSW1 sobre la síntesis de celulosa y otros carbohidratos fue evaluado midiendo la incorporación in vivo de ^{14}C (suministrado como glucosa uniformemente marcada) en varias fracciones de pared celular. Semillas de mutante homocigoto rsw1 y de tipo salvaje (RSW1) fueron germinadas a 21ºC en agar conteniendo nutrientes de Hoagland y 1% (p/v) de glucosa sin marcar. Después de 5 días, la mitad de las plántulas fueron transferidas a 31ºC durante 1 día mientras el resto se mantuvo a 21ºC durante el mismo tiempo. Las plántulas fueron cubiertas con una solución conteniendo nutrientes de Hoagland y ^{14}C-glucosa y se incubaron durante 3 horas más a la misma temperatura. Las raíces enjuagadas y los retoños se separaron y se congelaron en nitrógeno líquido. El tejido fue homogeneizado en tampón de fosfato potásico 0,5 M frío (0,5 M KH_{2}PO_{4}, pH 7,0) y una fracción de pared celular en bruto recogida por centrifugado a 2.800 rpm. La fracción de pared se extrajo con cloroformo/metanol [1:1 (v/v)] a 40ºC durante 1 hora, seguido por una incubación breve a 150ºC, para separar lípidos. El pellet se lavó sucesivamente con 2 ml de metanol, 2 ml de acetona y 2 veces con 2 ml de agua desionizada. Finalmente, el pellet se extrajo sucesivamente con dimetilsulfóxido bajo nitrógeno para separar almidón; oxalato amónico al 0,05% para separar pectinas; 0,1 M KOH y 3 mg/ml NaBH_{4} y luego con 4 M KOH y 3 mg/ml NaBH_{4} para extraer hemicelulosas; ácido acético/ácido nítrico/agua [8:1:2 (v/v)] hirviendo para extraer cualesquiera carbohidratos no celulósicos residuales y dejar celulosa cristalina como el pellet insoluble final (Updegraph, 1969). Todas las fracciones fueron analizadas mediante recuento por escintilación en fase líquida y los recuentos en cada fracción derivada del mutante fueron expresados como un porcentaje de los recuentos en el tipo salvaje bajo las mismas condiciones.
Como se muestra en la tabla 3, las plantas mutantes y de tipo salvaje se comportan de manera muy similar a 21ºC (la temperatura permisiva) mientras que, a la temperatura restrictiva de 31ºC, la incorporación de ^{14}C en celulosa es inhibida seriamente (a 36% del tipo salvaje) por la mutación de rsw1. Los datos de la tabla 3 indican que la síntesis de celulosa es inhibida específicamente por el mutante rsw1. El gen de RSW1 de tipo salvaje está por tanto implicado muy directamente en la síntesis de celulosa y cambia su secuencia mediante cambios de mutación de la velocidad de síntesis.
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TABLA 3
5
En plantas homocigotas de rsw1 mutante, la fracción de pectina extraída por oxalato amónico contenía abundante glucosa, caso atípico de las verdaderas pectinas ricas de ácido urónico. La gran mayoría de la glucosa permaneció en el sobrenadante cuando el uso de bromuro de cetiltrimetilamonio precipitó las pectinas cargadas negativamente.
3. Contenido en \beta-1,4-glucano no cristalino
La cantidad de celulosa y la cantidad de un \beta-1,4-glucano no cristalino que se recuperaron de la fracción de oxalato amónico fueron determinadas para plántulas de Columbia de tipo salvaje y para rsw1 homocigoto retrocruzado que se hicieron crecer durante 7 días a 21ºC o alternativamente durante 2 días a 21ºC y 5 días a 31ºC, sobre placas de agar verticales conteniendo medio de crecimiento (Baskin et al., 1992) más 1% (p/v) de glucosa, y bajo luz continua (90 \mumol m^{-1}s^{-1}). Las raíces y retoños se separaron de alrededor de 150 plántulas, se liofilizaron hasta peso constante y se molieron en un mortero y almirez con 3 ml de tampón de fosfato potásico 0,5 M frío (pH 7,0). El homogenado combinado, después de 2 enjuagados con tampón (2 ml cada uno) se centrifugó a 2.800 x g durante 10 minutos. Después de lavar la fracción de pellets dos veces con 2 ml de tampón y dos veces con 2 ml de agua destilada, se retuvieron el pellet, que comprende la fracción de pared celular en bruto, y los sobrenadantes reunidos, que comprenden la fracción de tampón fosfato. La fracción de pellet de pared celular en bruto se agitó con dos partes alícuotas de 3 ml de cloroformo/metanol [1:1 (v/v)] durante 1 hora a 40ºC, 2 ml de metanol a 40ºC durante 30 minutos, 2 ml de acetona durante 30 minutos y dos veces con agua. Se repitió todo el procedimiento en el caso de los retoños. Los sobrenadantes combinados se secaron en una corriente de nitrógeno. El pellet se extrajo sucesivamente con: (i) 3 ml de DMSO-agua 9:1 [v/v], en condiciones estanca bajo nitrógeno, durante la noche con agitación, seguido por dos extracciones de 2 ml empleando DMSO/agua y tres lavados con 2 ml de agua; (ii) 3 ml de oxalato amónico (0,5%) a 100ºC durante 1 hora, seguido por dos lavados con agua; (iii) 3 ml de 0,1 M KOH conteniendo 1 mg/ml de borohidruro sódico durante 1 hora a 25ºC (repetido una vez más para material radicular o dos veces para material de retoños), con un lavado final con 2 ml de agua; (iv) 3 ml de 4 M KOH conteniendo 1 mg/ml de borohidruro sódico, durante 1 hora a 25ºC (repetido una vez para el material radicular o dos veces para el material de retoños). El pellet final se sometió a ebullición con agitación intermitente en 3 ml de ácido acético-ácido nítrico-agua [8:1:2 (v/v)] (Updegraph, 1969), combinado con dos lavados con agua y dilución con 5 ml de
agua.
El residuo insoluble de celulosa fue solubilizado en 67% (v/v) H_{2}SO_{4} y resultó contener más de 97% (p/v) de glucosa empleando GC/MS (Fisons AS800/MD800) de alditol acetatos (Doares et al., 1991) y cuantificado en tres muestras independientes mediante reacción de antrona/H_{2}SO_{4}. En la tabla 4 se ofrecen los resultados de GC/MS para muestras de réplica reunidas.
El \beta-1,4-glucano no cristalino fue recuperado como el sobrenadante de la fracción de oxalato amónico cuando se precipitaron pectinas aniónicas por incubación durante la noche a 37ºC con 2% (p/v) de bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB) y recogido por centrifugado a 2.800 x g durante 10 minutos. El glucano (250 \mug/ml), el almidón (Sigma; 200 \mug/ml) fueron digeridos con mezclas de endocelulasa (EC 3.2.1.4; Megazyme, Australia) de Trichoderma y \beta-glucosilasa de almendras (EC 3.2.1.21; Sigma) o \alpha-amilasa de Bacillus sp. (EC 3.2.1.1; Sigma) y \alpha-glucosidasa de arroz (EC 3.2.1.20; Sigma).
El material recuperado en el sobrenadante de la fracción de oxalato amónico resultó contener un \beta-1,4-glucano puro demostrando con ello que: (i) solo pudo detectarse glucosa cuando se hidrolizó por TFA 2 M en un tubo sellado durante 1 hora a 120ºC en un autoclave, el sobrenadante (2.000 g durante 5 minutos) se secó bajo vacío a 45ºC para separar TFA y la glucosa se determinó por GC/MS; (ii) la metilación (Needs y Selvendran, 1993) proporcionó un pico dominante resuelto por cromatografía de capa delgada y por GC/MS que fue idéntico al de una referencia de celulosa, indicando así el glucano 1,4-enlazado (figura 3); y (iii) la mezcla de endo-celulasa y \beta-1,4-glucosidasa liberó 83% de la glucosa liberable por TFA a partir del glucano producido por rsw1 a 31ºC, mientras que la mezcla de \alpha-amilasa/\alpha-glucosidasa no liberó glucosa a partir del glucano. Por el contrario, la mezcla de \alpha-amilasa/\alpha-glucosidasa liberó 95% de la glucosa liberable por TFA a partir de una muestra de almidón, mientras que la mezcla de endo-celulosa/\beta-1,4-glucosidasa no liberó glucosa a partir del almidón.
La capacidad de extracción del glucano usando oxalato amónico y la susceptibilidad del glucano a endocelulasa/\beta-glucosidasa e hidrólisis con TFA indicaron que el glucano en el mutante de rsw1 no es cristalino, debido a que la cristalinidad del glucano hace que la celulosa sea resistente a la extracción y degradación.
La tabla 4 muestra la cantidad de glucosa en celulosa determinada por la reacción de antrona/H_{2}SO_{4} y la cantidad del glucano no cristalino después de la hidrólisis con TFA, para retoños de tipo salvaje y plantas mutantes de rsw1 Arabidopsis. Los datos indican que la producción de celulosa y del \beta-1,4-glucano no cristalino puede ser manipulada mediante cambios mutacionales en el gen de RSW1.
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TABLA 4 
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6
4. Contenido en almidón
La cantidad de almidón recuperado en la fracción de DMSO a partir de las raíces en el experimento antes descrito se determinó también mediante la reacción de antrona/H_{2}SO_{4} (Tabla 5).
Como se muestra en la tabla 5, el nivel de almidón depositado en el mutante de rsw1 es de cuatro veces el nivel detectable en las raíces de plantas de tipo salvaje a la temperatura restrictiva de 31ºC. Se aprecia también un ascenso similar de almidón en el caso de los datos se expresen como nmol de glucosa por planta. No existe diferencia detectable en la deposición de almidón entre plantas de rsw1 y plantas de tipo salvaje a 21ºC.
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TABLA 5
7 
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En la tabla 6 se resume la composición de las paredes celulares de la planta mutante de rsw1 en comparación con las plantas de tipo salvaje a la temperatura restrictiva de 31ºC.
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TABLA 6
8 
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En conclusión, la mutación de rsw1 desarma a los complejos de celulosa sintasa en la membrana de plasma, reduce la acumulación de celulosa y hace que el \beta-1,4-glucano se acumule en una forma no cristalina.
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Ejemplo 2
Mapaje de clones de YAC al locus de rsw1
El locus rsw1 de la planta mutante de Arabidopsis thaliana descrito en el ejemplo 1 anterior fue mapado al cromosoma 4 de A. thaliana empleando las técnicas de mapaje genético de RFLP (Chang et al., 1988, Nam et al, 1989) para analizar la progenie F_{2} o F_{3} derivada de un cruce de Columbia (Co)/Landsberg (Ler). En particular, se mostró que la mutación de rsw1 se enlazaba genéticamente al locus ga5, que es un marcador visual del cromosoma 4 en A. thaliana.
Tomando como base un análisis de las distancias en el mapa y puntos de rotura cromosómicos en la progenie 293 F_{2} o F_{3} derivada de un cruce de Columbia (Co)/Landsberg (Ler), se localizó rsw1 en una región de aproximadamente 2,1 cM entre los marcadores g8300 y 06455 de RFLP, aproximadamente en 1,2 cM al sur de la CAPS (secuencia polimórfica amplificada y escindida; Konieczny y Ausubel, 1993), versión del marcador g8300 (figura 4).
Se comprobó que el intervalo entre g8300 y 06455 en el que se encontraban residuos de rsw1 estaba abarcado por una serie superpuesta de clones de cromosoma artificial de levadura (YAC). Los clones fueron obtenidos en Plant Industry, Commonwealth Scientific and Industrial Research Organisation, Canberra, Australia. Los YACs se situaron en el intervalo g8300/06455 por hibridación usando marcadores moleculares conocidos de DNA (desde dentro del intervalo) y fragmentos de DNA desde los extremos de los YACs. Se estimó que la longitud del intervalo comprendía 900 kb de DNA.
El mapaje genético refinado de recombinantes dentro de la región abarcada por clones YAC estableció la distancia genética entre el marcador g8300 de RFLP y el locus de rsw1.
La combinación de los datos de distancia en el mapa genético y el mapaje de clones YAC dentro de la región localizó adicionalmente el locus de rsw1 en el clon YAC designado yUP5C8.
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Ejemplo 3
Mapaje de clones de cDNA al YUP5C8 del clon YAC
Se obtuvo un clon de cDNA de Arabidopsis thaliana, designado como T20782, en el Arabidopsis Resource Centre, Ohio State University, 1735 Neil Avenue, Columbus, OH 43210, United States of America. El clon de cDNA de T20782 fue localizado ampliamente en el intervalo de DNA en el cromosoma 4 de Arabidopsis entre los dos marcadores g8300 y 06455 mostrados en la figura 4. Empleando una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se utilizaron cebadores de DNA (5'-AGAACAGCAGATACACGGA-3' y 5'-CTGAAGAAGGCTGGACAAT-3') designados a la secuencia de nucleótidos de cDNA de T20782 para examinar librerías de clones YAC de Arabidopsis. Se comprobó que el clon de cDNA de T20782 localizaba YACs (CIC1F9, CIC10E9, CIC11D9) identificados en el intervalo g8300 y 06455 del cromosoma de Arabidopsis (figura 4). Se utilizó la misma técnica para localizar adicionalmente el clon T20782 con el clon YAC yUP5C8, el mismo YAC designado para contener el locus de rsw1 en el mismo intervalo cromosómico (figura 4).
Además, la amplificación del clon YAC yUP5C8 empleando cebadores derivados de T20782 produce un fragmentos de 500 bp que contienen dos exones putativos idénticos a parte de la secuencia de nucleótidos de T20782, además de dos secuencias de intrones.
El cDNA T20782 fue considerado como un gen candidato implicado en la biosíntesis de celulosa.
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Ejemplo 4
Análisis de la secuencia de nucleótidos del clon T20782 de CDNA
La secuencia de nucleótidos del clon T20782 de cDNA se ofrece en SEQ ID NO: 1. La secuencia de nucleótidos se obtuvo empleando un Dye Terminator Cycle Sequencing kit (Perkin Elmer cat. #401384) en la forma recomendada por el fabricante. Se emplearon cuatro clones de molde para la secuenciación de nucleótidos para generar la secuencia listada. El primer molde fue el clon T20782 de cDNA. Este molde fue secuenciado empleando los siguientes cebadores de secuenciación:
a) 5'-CAATGCATTCATAGCTCCAGCCT-3'
b) 5'-AAAAGGCTGGAGCTATGAATGCAT-3'
c) 5'-TCACCGACAGATTCATCATACCCG-3'
d) 5'- GACATGGAATCACCTTAACTGCC-3'
e) 5'-CCATTCAGTCTTGTCTTCGTAACC-3'
f) 5'-GGTTACGAAGACAAGACTGAAATGG-3'
g) 5'-GAACCTCATAGGCATTGTGGGCTGG-3'
h) 5'-GCAGGCTCTATATGGGTATGATCC-3'
i) Cebador de secuenciación directa M13 estándar.
j) Cebador de secuenciación T7 estándar.
El segundo clon de molde (clon de deleción T20782 SphI) fue construido creando una deleción de DNA dentro del clon T20782. El clon T20782 fue digerido con la enzima de restricción SphI, la enzima fue destruida con calor, el DNA fue ligado y electroporado en células hospedantes de NM522 E. coli. El clon de deleción 20782 SphI fue entonces secuenciado empleando un cebador de secuenciación directa M13 estándar. Se prepararon otros dos clones de deleción para la secuenciación de DNA de manera similar, pero se emplearon las enzimas de restricción EcoRI y SmaI. El clon de deleción EcoRI de T20782 y el clon de deleción SmaI de T20782 fueron secuenciados empleando un cebador de secuenciación T7 estándar. La secuencia de DNA mostrada en SEQ ID NO: 1 es para una hebra de DNA únicamente, pero los expertos en la materia podrán generar la secuencia de nucleótidos de la hebra complementaria a partir de los datos proporcionados.
La secuencia de aminoácidos codificada por el clon T20782 fue derivada y se establece en SEQ ID NO: 2.
El clon T20782 codifica todo menos el primer residuo aspartato (D) de la firma D,D,D, QXXRW conservada en la arquitectura general de \beta-glicosil transferasas. En particular, T20782 codifica cinco residuos aminoácido de la firma D,D,D, QXXRW, entre las posiciones de aminoácidos 109 a 370 de SEQ ID NO: 2. Se muestran a continuación los residuos aminoácido conservados de aspartato, glutamina, arginina y triptofano, en negrita, indicándose también los residuos de aminoácido locales:
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1.
Residuos aminoácido 105 a 113 de SEQ ID NO: 2:
\quad
LLNVDCDHY;
2.
Residuos aminoácido 324 a 332 de SEQ ID NO: 2:
\quad
SVTEDILTG; y
3.
Residuos aminoácido 362 a 374 de SEQ ID NO: 2:
\quad
DRLNQVLRWALGS.
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Ha de observarse que estos aminoácidos invariables indican simplemente que la secuencia de aminoácidos derivada de T20782 pertenece a un grupo muy amplio de glicosil transferasas. Algunas de estas enzimas, tales como celulosa sintasa, quintina sintasa, alginato sintasa y ácido hialurónico sintasa, producen compuestos funcionalmente muy diferentes.
La presencia de los residuos aminoácido conservados indica simplemente que el clon T20782 puede codificar una proteína de \beta-glicosil transferasa, tal como el producto genético de celulosa, celulosa sintasa. El hecho de que el clon se localice en la proximidad de un gen implicado en la biosíntesis de celulosa constituye una característica clave que enfoca ahora el interés sobre el clon T20782 como un candidato para el gen RSW1 (celulosa sintasa).
El T20782 codifica potencialmente una celulosa sintasa.
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Ejemplo 5
Análisis de la secuencia de nucleótidos del clon genómico 23H12
El clon 23H12 contiene aproximadamente 21 kb de DNA genómico de Arabidopsis thaliana en la región entre las secuencias de borde izquierdo y borde derecho de T-DNA, y se localiza en el YAC yUP5C8 del candidato RSW1. El clon 23H12 fue aislado por hibridación empleando DNA inserto de EST20782, de una librería de DNA genómico preparada para la transformación de la planta. También se comprobó que el cósmido 12C4 se hibridaza al clon T20782 de cDNA, pero este cósmido parece comprender una secuencia genómica parcial correspondiente a la secuencia relacionada de cDNA de Ath-A indicada en SEQ ID NO: 7, para la cual se indica la correspondiente secuencia de aminoácidos en SEQ ID NO: 8.
En la figura 5 se presenta un mapa de enzimas de restricción para el clon 23H12.
Se obtuvo la secuencia de nucleótidos de 8411 pb de DNA genómico en el clon cósmido binario 23H12 mediante desplazamiento del cebador a lo largo del molde de 23H12 (SEQ ID NO: 3), empleando un Dye Terminator Cycle Sequencing kit (Perkin Elmer cat. #401384) en la forma recomendada por el fabricante. Se emplearon los siguientes cebadores al menos para la secuenciación del DNA del DNA clónico de 23H12:
a) cs1-R 5'-CAATGCATTCATAGCTCCAGCCT-3'
b) cs1-F 5'-AAAAGGCTGGAGCTATGAATGCAT-3'
c) up 5'-AGAACAGCAGATACACGGA-3'
d) ve76-R2 5'-ATCCGTGTATCTGCTGTTCTTACC-3'
e) est1-R 5'-AATGCTCTTGTTGCCAAAGCAC-3'
f) sve76-F 5'-ATTGTCCAGCCTTCTTCAGG-3'
\newpage
g) ve76-R 5'-CTGAAGAAGGCTGGACAATGC-3'
h) B12-R1 5'-AGGTAAGCATAGCTGAACCATC-3'
i) B12-R2 5'-AGTAGATTGCAGATGGTTTTCTAC-3'
j) B 12-R3 5'-TTCAATGGGTCCACTGTACTAAC-3'
k) B12-R4 5'-ATTCAGATGCACCATTGTC-3'
En la figura 5 se presenta también la estructura del gen de RSW1 contenido en 23H12 del clon cósmido. Como allí se muestra, las secuencias de codificación de 23H12, desde los últimos 12 pb del exón 7 al extremo del exón 14, corresponde a la secuencia completa de cDNA de T20782 (es decir, SEQ ID NO: 1). Las secuencias de nucleótidos del gen de RSW1 que comprenden los exones 1 a 8 fueron amplificadas a partir de cDNA de doble hebra de A. thaliana Columbia, empleando cebadores de amplificación aguas arriba del sitio de inicio de RSW1 y un cebador interno al T20782 del clon EST.
Los exones en el gen de RSW1 van desde 81 pb a 585 pb de longitud y todas las uniones empalmadas intrón/exón 5' y 3' se adaptan a la norma de intrones conservados.
El transcripto de RSW1 comprende una secuencia 5'-sin traducir de al menos 70 pb de longitud, una región codificadora de 3.243 pb y una región 3' sin traducir de 360 pb. Los análisis de hibridación Northern indican que el transcripto de RSW1 en raíces, hojas e influorescencias de A. thaliana de tipo salvaje es de aproximadamente 4,0 kb de longitud y que se presenta un tamaño de transcripto similar en tejido mutante (datos no mostrados).
La secuencia derivada de aminoácidos del polipéptido de RSW1 codificado por el clon cósmido 23H12 (es decir, el polipéptido indicado en SEQ ID NO: 6 tiene una longitud de 1.081 aminoácidos y contiene la firma entera D,D,D, QXXRW característica de proteínas de \beta-glicosil transferasa, entre la posición del aminoácido 395 y la posición del aminoácido 822. Los residuos conservados de aspartato, glutamina, arginina y triptofano se muestran más abajo, en negrita, indicándose también los residuos de aminoácidos locales:
\vskip1.000000\baselineskip
1.
Residuos aminoácido 391 a 399 de SEQ ID NO: 6:
\quad
YVSDDGSAM;
2.
Residuos aminoácido 557 a 565 de SEQ ID NO: 6:
\quad
LLNVDCDHY;
3.
Residuos aminoácido 776 a 784 de SEQ ID NO: 6:
\quad
SVTEDILTG; y
4.
Residuos aminoácido 814 a 826 de SEQ ID NO: 6:
\quad
DRLNQVLRWALGS.
\vskip1.000000\baselineskip
Los segundo y tercero residuos aspartato conservados indicados supra y el cuarto motivo de la secuencia conservada de aminoácidos indicados supra (es decir, QVLRW) están presentes también en el clon T20782 de cDNA (véase el ejemplo 4 anterior).
El clon 23H12 codifica potencialmente una celulosa sintasa.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 6
Complementación de la mutación de rsw1
La complementación del rsw1 de la planta mutante de celulosa constituye el ensayo clave para demostrar la función del producto genético del clon 23H12. La complementación del fenotipo de rsw1 se demostró mediante transformación del clon cósmido binario 23H12 o un clon derivado del mismo que codifica un producto genético funcional, al mutante rsw1 de celulosa de Arabidopsis thaliana. Se emplearon dos constructor de DNA (23H12 y pRSW1) para complementar la línea de la planta mutante rsw1.
\newpage
1. Constructo 23H12
El clon 23H12 se describe en el ejemplo 5 y figura 5.
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2. Constructo pRSW1
El constructo 23H12 tiene un inserto de aproximadamente 21 kb de longitud. Para demostrar que cualquier complementación del fenotipo de la mutación de rsw1 es el resultado de la expresión del gen que corresponde a SEQ ID NO: 3, se produjo un constructo genético, designado como pRSW1, que comprende el gen putativo de RSW1 con la mayor parte del DNA circundante cancelada. En la figura 5 se ofrece un mapa de enzimas de restricción (RE) del inserto genético de RSW1 en pRSW1.
Para producir pRSW1, el gen de RSW1 fue subclonado a partir del cósmido 23H12 y clonado en el plásmido binario pBIN 19. De forma breve, se hicieron crecer células de Escherichia coli conteniendo cósmido 23H12 en medio LB suplementado con tetraciclina (3,5 mg/l). Se preparó DNA plásmido mediante lisis alcalina y se digirió secuencialmente con enzimas de restricción PvuII y SalI. Se aislaron dos fragmentos de co-migración de 9 kb y 10 kb, respectivamente, como una sola fracción a partir de un gel de agarosa al 0,8% (p/v). El gen de RSW1 estaba contenido en el fragmento PvuII/SalI de 10 kb. El fragmento de 9 kb apareció como un producto de escisión de PvuII que no comprende el gen de RSW1. Los fragmentos de restricción fueron ligados en pBIN 19 digerido con SmaI y SalI. Una parte alícuota de la mezcla de ligación fue introducida por electroporación en la cepa E. coli XLB1. Se seleccionaron colonias resistentes a kanamicina (50 mg/l) y posteriormente se caracterizaron mediante análisis con enzimas de restricción para identificar aquellos clones que contenían solo el fragmento PvuII/SalI de 10 kb que comprende el gen de RSW1 en pBIN 19.
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3. Transferencia de los constructor 23H12 y pRSW1 a Abrobacterium tumefaciens
El 23H12 cósmido fue transferido a Agrobacterium mediante apareamiento triparental, esencialmente en la forma descrita por Ditta et al. (1980). Se mezclaron tres cepas bacterianas como sigue en medio LB sólido sin antibióticos: la cepa 1 fue una cepa colaboradora de E. coli que contiene el plásmido de movilización pRK2013, crecida hasta la fase estacionaria; la cepa 2 fue E. coli conteniendo cósmido 23H12, crecida hasta la fase estacionaria; y la cepa 3 fue un cultivo en fase exponencial de la cepa AgL1 de A. tumefaciens (Lazo et al., 1991). La mezcla se dejó crecer la noche a 28ºC antes de listar una parte alícuota sobre medio LB sólido conteniendo antibióticos (ampicilina 50 mg/l, rifampicina 50 mg/l, tetraciclina 3,5 mg/l) para seleccionar AGL1 de A. tumefaciens transformado. Aparecieron colonias resistentes después de 2-3 días a 28ºC y fueron listadas una vez más de nuevo sobre medio selectivo para la purificación adicional. Las colonias seleccionadas fueron entonces subcultivadas en medio LB líquido sumplementado con rifampicina (50 mg/l) y tetraciclina (3,5 mg/l) y guardadas a -80ºC.
El plásmido pRSW1 (designado inicialmente como p2029) se introdujo en la cepa AGL1 de A. tumefaciens por electroporación.
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4. Transformación de plantas rsw1
La línea de la planta rsw1 fue transformada con los constructor 23H12 y pRSW1 usando infiltración en vacío esencialmente en la forma descrita por Bechtold et al. (1993).
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5. Análisis del hinchamiento radial en transformantes
La complementación del fenotipo de hinchamiento radial (rsw), que es una característica de la planta mutante rsw1, fue ensayada mediante germinación de semillas rsw1 transformadas (es decir, semillas T1) obtenidas en la forma descrita supra en placas Hoaglands conteniendo 50 \mug/ml de kanamicina. Las placas conteniendo las semillas transformadas fueron incubadas a 21ºC durante 10-12 días. Las plántulas resistentes a kanamicina fueron transferidas a nuevas placas Hoaglands conteniendo 50 \mug/ml de kanamicina e incubadas a 31ºC durante 2 días. Después de la incubación, se examinó las puntas de las raíces respecto a un fenotipo de hinchamiento radial. Bajo estas condiciones, las raíces de las plantas de tipo salvaje no muestran ningún fenotipo de hinchamiento radial, pero las raíces de las plantas rsw1 muestran un claro hinchamiento radial en la punta de la raíz y también una raíz corta en comparación con las plantas de tipo salvaje. Como consecuencia, la determinación del fenotipo de hinchamiento radial de las plantas transformadas fue indicativo de la complementación con éxito del fenotipo
rsw1.
Las plántulas resistentes a kanamicina se mantuvieron mediante crecimiento adicional de las plántulas a 21ºC después de la incubación a elevada temperatura. Una vez recuperadas las plantas, las plántulas fueron transferidas a tierra y crecidas en armarios a 21ºC (ciclo de 16 horas de luz/8 horas de oscuridad). La semilla T2 fue recogida entonces de las plantas individuales maduras.
Empleando el constructo 23H12 para la transformación de rsw1, se obtuvo un total de 262 plántulas resistentes a kanamicina. Todos estos transformantes fueron ensayados respecto a la complementación del fenotipo de hinchamiento radial de las raíces. Un total de 230 plántulas mostró un fenotipo radicular de tipo salvaje, mientras que solo 32 plántulas mostraron el fenotipo de hinchamiento radial de las raíces característico de las plantas rsw1. A modo de ejemplo, la figura 6 muestra los fenotipos de plántulas transformadas en comparación con plántulas sin transformar de tipo salvaje y de rsw1, después de la incubación a 31ºC. Como se muestra en la figura 6, existe una clara complementación del fenotipo de hinchamiento radial en las plántulas transformadas, mostrando las plántulas transformadas, a 31ºC, una longitud normal de las raíces.
Empleando el constructo pRSW1 para la transformación, se obtuvo un total de 140 plántulas resistentes a kanamicina. La totalidad de las 11 plántulas ensayadas respecto a la complementación del fenotipo de hinchamiento radial de las raíces mostraron un fenotipo de raíces de tipo salvaje y ninguna de las plántulas mostraron signo alguno de hinchamiento radial en las raíces (datos no mostrados).
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6. Análisis morfológico general de la línea mutante rsw1 complementada
Otra caracterización de las plantas rsw1 complementadas ha demostrado que también se han restaurado otras características morfológicas de rsw1 en las líneas transgénicas, por ejemplo la altura de los botones (influorescencia) y la capacidad de las plantas para desarrollar cotiledones, hojas, tricomas, silicuas y flores de tipo salvaje a 31ºC (datos no mostrados).
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7. Complementación bioquímica de la línea mutante rsw1
La semilla T2 procedente de transformaciones empleando el cósmido 23H12 como se ha descrito supra o, alternativamente, empleando el plásmido binario pBin19 que carece de secuencias genéticas de RSW1, fue sembrada en medios sólidos de Hoagland conteniendo kanamicina (50 \mug/ml), incubada durante 2 días a 21ºC y luego transferida a 31ºC durante 5 días. Se hicieron crecer plantas de A. thaliana Columbia de tipo salvaje bajo condiciones similares pero sin kanamicina en el medio de crecimiento. Se recogieron y congelaron para el análisis de celulosa, plántulas de T2 resistentes a kanamicina que tienen al menos una copia de la secuencia del cósmido 23H12, y plántulas de tipo salvaje.
Se determinaron los niveles de celulosa como material insoluble en ácido acético-nítrico (Updegraph, 1969) para 10 líneas de plantas T2 resistentes a kanamicina transformadas con la secuencia del cósmido 23H12, y se compararon con los niveles de celulosa en plantas mutantes rsw1, plantas de A. thaliana Columbia de tipo salvaje y plantas de A. thaliana Columbia transformadas con el plásmido binario pBin19. Los resultados se ofrecen en la tabla
7.
Como se muestra en la tabla 7, los niveles de celulosa se han aumentado de manera importante en las plantas rsw1 (T2) complementadas, en comparación con los niveles de celulosa medidos en la planta parental mutante rsw1. De hecho, los niveles de celulosa en las plantas transformadas con 23H12, expresados con respecto al peso en fresco del material vegetal o tomando una base por plántula, no son significativamente diferentes de los niveles de celulosa de plantas de Arabidopsis thaliana Columbia o de A. thaliana Columbia transformadas con el plásmido binario pBin19. Estos datos indican que el cósmido 23H12 es capaz de complementar totalmente el fenotipo deficiente en celulosa del mutante rsw1.
Se general líneas T3 homocigotas para confirmar los datos ofrecidos en la tabla 7.
Además, los datos ofrecidos en la tabla 7 indican que no existe diferencia en la velocidad de crecimiento de las plantas rsw1 transformadas T2 y plantas de tipo salvaje a 31ºC, debido a que el peso en fresco de tales plantas no difiere de manera importante. En contraste, el peso en fresco de las plántulas rsw1 mutantes crecidas bajo condiciones idénticas es de solo aproximadamente 55% del nivel observado en las líneas T2 transformadas con 23H12 (alrededor del 30% al 80%). Estos datos soportan la conclusión de que los niveles de celulosa han sido manipulados en las plantas rsw1 complementadas (T2).
Además, también se determina la velocidad de síntesis de celulosa en plantas transformadas con 23H12 y plantas de tipo salvaje a 31ºC, medida mediante la incorporación de ^{14}C.
Por otro lado, los niveles de \beta-1,4-glucano y los niveles de almidón en las líneas transformantes 23H12 se muestran como similares a los niveles de \beta-1,4-glucano y de almidón en plantas de tipo salvaje.
TABLA 7
9
Ejemplo 7
Determinación de la secuencia de nucleótidos de longitud completa que codifica el polipéptido RSW1 de tipo salvaje
Se prepararon librerías de cDNA de doble hebra de Arabidopsis thaliana y de cDNA empleando el kit (Clontech). Se aisló RNA de Columbia de tipo salvaje crecida en condiciones estériles durante 21 días.
Se examinaron aproximadamente 100.000 clones de cDNA en una librería de cDNA sin amplificar bajo condiciones de hibridación convencionales a 65ºC, empleando una sonda que comprende DNA marcado con ^{32}P amplificado a partir del cDNA de doble hebra. Para preparar la sonda de hibridación, se emplearon los siguientes cebadores de amplificación:
1.
2280-F:5'GAATCGGCTACGAATTTCCCA 3'
2.
2370-F:5'TTGGTTGCTGGATCCTACCGG 3'
3.
csp1-R:5'GGT TCT AAA TCT TCT TCC GTC 3'
en donde las combinaciones de cebadores fueron 2280-F/csp1-R o 2370-F/csp1-R. El cebador 2280-F corresponde a las posiciones de nucleótidos 2226 a 2246 en SEQ ID NO: 3, aguas arriba del sitio de inicio de la traducción. El cebador 2370-F corresponde a las posiciones de nucleótidos 2314 a 2334 en SEQ ID NO: 3 que codifica los aminoácidos 7 a 13 del polipéptido RSW1. El cebador csp1-R comprende secuencias de nucleótidos complementarias a los nucleótidos 588 a 608 del clon T20782 (SEQ ID NO: 1) correspondiente a los nucleótidos 6120 a 6140 de SEQ ID NO: 3. Las sondas de hibridación producidas son de aproximadamente 1858 nucleótidos de longitud (combinación de cebadores 2280-F/csp1-R) o de 1946 nucleótidos de longitud (combinación de cebadores 2370-F/csp1-R).
Se identificaron cinco clones de bacteriofagos hibridantes, que fueron purificados en placas hasta la homogeneidad durante dos rondas sucesivas de examen. Los plásmidos fueron rescatados de los clones de bacteriofagos que hibridan positivamente, empleando el protocolo de excisión de Stratagene para el vector ZapExpress^{TM} de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las hibridaciones de colonias confirmaron la identidad de los clones.
Clones aislados de cDNA fueron secuenciados mediante el paso de cebadores de manera similar al método descrito en los ejemplos 4 y 5 supra.
A partir de las secuencias de nucleótidos de dos clones de cDNA se recopiló una secuencia de nucleótidos de longitud completa de RSW1 de tipo salvaje. Primeramente, el extremo 3' del cDNA, que codifica los aminoácidos 453-1081 de RSW1, correspondía a la secuencia de nucleótidos del clon EST T20782 (SEQ ID NO: 1). El resto de la secuencia de cDNA, que codifica los aminoácidos 1-654 de RSW1, se generó por amplificación del extremo 5' a partir de cDNA, empleando el cebador 2280-F, que comprende secuencias de nucleótidos aproximadamente 50-70 pb aguas arriba del sitio de inicio de la traducción de RSW1 en el cósmido 23H12, y cebador csp1-R que comprende secuencias de nucleótidos complementarias a los nucleótidos 588 a 608 del clon T20782 (SEQ ID NO: 1).
\global\parskip0.900000\baselineskip
Se secuenciaron varios clones amplificados para demostrar que no se introdujeron errores de nucleótidos por el proceso de amplificación. Las secuencias de nucleótidos 5' y 3' son empalmadas entre sí para producir el marco de lectura abierta completo de RSW1 y la región 3'-sin traducir proporcionada en SEQ ID NO: 5.
Los expertos en la materia conocerán que el extremo 5' y el extremo 3' de los dos cDNAs incompletos se empalman entre sí para obtener un clon de cDNA aislado de longitud completa, cuya secuencia de nucleótidos se indica en SEQ ID NO: 5.
De los restantes clones de cDNA, ningún clon de cDNA aislado comprendía una secuencia de nucleótidos que coincidiera de forma precisa con la secuencia de nucleótidos del gen de RSW1 presente en el cósmido 23H12. Sin embargo, se obtuvieron varios clones que contienen secuencias estrechamente relacionadas, como se resume en la tabla 8. Las secuencias de nucleótidos de los Ath-A y Ath-B cDNAs se proporcionan aquí como SEQ ID Nos: 7 y 9.
TABLA 8
10
Las secuencias derivadas de aminoácidos codificadas por los cDNAs indicadas en la tabla 8, se proporciona en las figuras 8 y 9 y también en SEQ ID Nos: 8 y 10.
La figura 10 es una representación esquemática de las características importantes del polipéptido RSW1 que son conservadas dentro de A. thaliana y entre A. thaliana y otras especies de plantas. Además de las especies indicadas en la figura 10, los presentes inventores han identificado también, mediante investigación por homología, genes biosintéticos de celulosa de maíz, trigo, cebada y Brassica ssp. Por tanto, la presente invención se extiende a genes de celulosa y polipéptidos biosintéticos de celulosa como los anteriormente definidos, derivados de cualquier especie de planta, incluyendo Arabidopsis thaliana, Oryza sativa, trigo, cebada, maíz, Brassica ssp., Gossypium hirsutum y Eucalyptus ssp., cáñamo, yute, lino, y plantas madereras incluyendo, pero no de forma limitativa, Pinus ssp., Populus ssp., Picea spp., entre otras.
Ejemplo 8
Aislamiento de la secuencia de nucleótidos de longitud completa que codifica el polipéptido rsw1 mutante
Se prepararon librerías de cDNA de doble hebra de Arabidopsis thaliana y de cDNA empleando el CAPFINDER cDNA kit (Clontech). El RNA fue aislado de plantas mutantes rsw1 de Arabidopsis thaliana Columbia crecidas en condiciones estériles durante 21 días.
La secuencia de nucleótidos de longitud completa del mutante rsw1 fue generada secuenciando dos fragmentos amplificados de DNA que abarcan el gen mutante de rsw1. La secuencia del 5'-extremo del cDNA (que comprende la región 5'-sin traducir y los exones 1-11) fue amplificada empleando la combinación de cebadores 2280-F/csp1-R (ejemplo 7). La secuencia del 3'-extremo fue amplificada empleando los cebadores EST1-F y cs3-R indicados a continuación:
1.
Cebador EST1-F: 5'AATGCTTCTTGTTGCCAAAGCA 3'
2.
Cebador cs3-R: 5'GACATGGAATCACCTTAACTGCC 3'
en donde el cebador EST1-F corresponde a las posiciones de nucleótidos 1399-1420 de SEQ ID NO: 5 (dentro el exón 8) y el cebador cs3-R es complementario a los nucleótidos 3335-3359 de SEQ ID NO: 5 (dentro de la región 3'-sin traducir del transcripto de tipo salvaje).
La secuencia de longitud completa del transcripto de rsw1 mutante se indica como SEQ ID NO: 11.
Sin que ello suponga limitación alguna a cualquier teoría o modo de acción, una sustitución de un solo nucleótido en la secuencia de nucleótidos del mutante rsw1 (posición de nucleótido 1716 en SEQ ID NO: 11), con respecto a la secuencia de nucleótidos de RSW1 de tipo salvaje (posición de nucleótido 1646 en SEQ ID NO: 5), dando como resultado la sustitución de Ala549 por Val549 en el polipéptido mutante, puede contribuir a la actividad alterada el polipéptido RSW1 a temperaturas no permisivas tal como 31ºC. La presente invención contempla también las sustituciones de aminoácidos adicionales, para alterar la actividad del polipéptido RSW1 o para hacer que el polipéptido sea sensible a la temperatura.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 9
Inhibición antisentido de la producción de celulosa en plantas transgénicas 1. Construcción de un vector binario antisentido de RSW1
Un ejemplo de plantas transgénicas en donde la producción de celulosa es inhibida es proporcionado por la expresión en las mismas de un constructo genético antisentido. La tecnología antisentido se emplea para dirigir la expresión de uno o más genes de celulosa para reducir la cantidad de celulosa producida por plantas transgénicas.
A modo de ejemplo, ha sido construido un constructo de transformación de plantas antisentido para contener el inserto T20782 cDNA (o una parte del mismo) en la orientación antisentido y en conexión operativa con el promotor CaMV 35S presente en el plásmido binario pRD410 (Datla et al. 1992). Más particularmente, el clon de T20782 cDNA, que comprende el extremo 3' del gen de RSW1 de tipo salvaje, fue digerido con XbaI y KpnI y clonado en el derivado resistente a kanamicina de pGEM3zf(-), designado como plásmido, pJKKMf(-). La secuencia de RSW1 fue sub-clonada, en la orientación antisentido, en el vector binario pRD410 como un fragmento XbaI/SacI, reemplazando con ello el gen de \beta-glucuronidasa (GUS o uidA). Esto permite la transcripción de la secuencia de RSW1 en la orientación antisentido bajo el control del promotor CaMV 35S.
El vector plásmido binario antisentido de RSW1 fue transferido a la cepa AGL1 de Agrobacterium tumefaciens por mapaje triparental y selección en rifampicina y kanamicina, como describen Lazo et al. (1991). La presencia del inserto RSW1 en células transformadas de A. tumefaciens fue confirmada por análisis de hibridación Southern (Southern, 1975). Se demostró que el constructo está libre de deleciones o transposiciones antes de la transformación de tejidos de plantas mediante retro-transformación 
\hbox{en la cepa
JM101 de  Escherichia coli  y análisis de digestión por
restricción.}
2. Transformación de Arabidopsis thaliana
Ocho tiestos, conteniendo cada uno de ellos aproximadamente 16 plantas de A. thaliana ecotype Columbia, se sometieron a crecimiento bajo condiciones convencionales. El tejido de las plantas fue transformado con el plásmido binario antisentido de RSW1 por infiltración en vacío en la forma descrita por Bechtold et al (1993). Los medios de infiltración contenían 2,5% (p/v) de sucrosa y las plantas fueron infiltradas durante 2 minutos hasta que se obtuvo un vacío de aproximadamente 400 mm Hg. Se interrumpió la conexión de vacío y las plantas se dejaron bajo vacío durante 5 minutos.
Se examinaron aproximadamente 34.000 semillas T1 en placas MS conteniendo 50 \mug/ml de kanamicina, para seleccionar plantas conteniendo el constructo antisentido de RSW1. Entre las semillas T1 sembradas, se identificaron 135 plántulas resistentes a kanamicina, de las cuales 91 fueron transferidas a tierra y crecidas a 21ºC bajo un fotoperiodo de larga exposición al día (16 horas de luz y 8 horas de oscuridad).
Entre las 91 líneas transgénicas, se eligieron 19 líneas para analizar cuales de ellas tenían filamentos de anteras en cada flor que eran demasiado cortos para depositar polen sobre el estigma y, como consecuencia, necesitaron de polinización manual para obtener semillas T2 a partir de las mismas.
Las semillas T2 de 14 de estas 19 líneas fueron depositadas sobre placas Hoagland verticales conteniendo kanamicina para determinar las relaciones de segregación. Se depositaron entre 5 y 10 semillas por línea transgénica. Se hicieron crecer, bajo las mismas condiciones, semillas de control, incluyendo A. thaliana Columbia que contiene el vector binario pBIN19 (Bevan, 1984) y que segrega 3:1 respecto a la resistencia a kanamicina, y el mutante rsw1 transformado con el gen NPTll, que también segrega 3:1 respecto a resistencia a kanamicina. Las plantas resistentes a kanamicina fueron transferidas a tierra y crecidas a 21ºC bajo largas exposiciones al día, hasta la floración. También se hicieron crecer bajo condiciones similares, 
\hbox{en ausencia de
kanamicina,  plantas sin transformar de  Arabidopsis thaliana
Columbia .}
3. Morfología de las plantas RSW1 antisentido
La comparación de la morfología de las plantas RSW1 antisentido crecidas a 21ºC y de plantas rsw1 mutantes crecidas a la temperatura no permisiva (es decir, 31ºC), identificó un número de fenotipos comunes. Por ejemplo, las plantas antisentido exhibieron una menor fertilidad, un acortamiento de la influorescencia y tenían anteras cortas, en comparación con las plantas de tipo salvaje, cuando se hicieron crecer a 21ºC. Estos fenotipos se observan también en las plantas rsw1 mutantes crecidas a 31ºC. Estos resultados sugieren que el constructo antisentido en las plantas transgénicas puede estar reconociendo la expresión el gen RSW1 de tipo salvaje a 21ºC.
La figura muestra la menor altura de influorescencia (botón) en plantas 35S-RSW1 antisentido en comparación con plantas de A. thaliana Columbia de tipo salvaje crecidas bajo condiciones idénticas.
4. Análisis de carbohidratos en la pared celular de plantas antisentido
Se general plantas T3 que son homozigotas respecto al constructo antisentido de 35S-RSW1 y se determina el contenido de celulosa en las mismas en la forma descrita en el ejemplo 1. Se demuestra que las plantas que expresan el constructo antisentido contienen significativamente menos celulosa en sus paredes celulares, en comparación con las plantas de tipo salvaje. Además, los niveles de \beta-1,4-glucano no cristalino y de almidón son elevados en las células de plantas antisentido, en comparación con líneas de plantas por otro lado isogénicas que no han sido transformadas con el constructo genético antisentido.
5. Niveles de expresión de mRNA en 35S-RSW1 antisentido en plantas transgénicas
Se extrajo todo el RNA a partir de 0,2 g de tejido de hoja derivado de 33 plantas T1 resistentes a kanamicina conteniendo el constructo genético 35S-RSW1 antisentido, de acuerdo esencialmente con Longemann et al. (1986). Se separó todo el RNA (25 \mug) en un gel de formaldehído/agarosa 2,2 M, se transfirió sobre filtros de nylon y se hibridó una ribosonda que comprende la secuencia de hebra sentido del clon T20782 de cDNA. Para producir la ribosonda, se utilizó RNA polimerasa de T7 para transcribir el RNA sentido desde un molde de plásmido linearizado conteniendo T20782, en presencia de [\alpha-^{32}P]UTP. Las hibridaciones y posteriores lavados se efectuaron en la forma descrita por Dolferus et al. (1994). Las membranas hibridazas fueron expuestas a pantallas de fósforo (Molecular Dynamics, USA).
Se determinaron los niveles de expresión del transcripto antisentido de RSW1 y se compararon con el nivel de fertilidad observado en las líneas de plantas. Como se muestra en la tabla 9, el nivel de expresión de gen antisentido está correlacionado con el fenotipo de menor fertilidad de las plantas antisentido. En 13 líneas, se observó un nivel muy alto o alto de expresión del gen antisentido 35S-RSW1 y en 11 de estas líneas se redujo la fertilidad. Únicamente las líneas 2W y 3E que expresaban niveles altos a muy altos de mRNA antisentido, aparecieron como plenamente fértiles. En 12 líneas que expresaron niveles medios de mRNA antisentido, aproximadamente la mitad fueron fértiles y la otra mitad exhibieron una menor fertilidad. En contraste, en 8 líneas de plantas en donde se observó un nivel bajo o muy bajo de expresión del constructo genético 35S-RSW1 antisentido, se observó un fenotipo de tipo salvaje (es decir, fértil) para todas menos una de las líneas transgénicas, la línea 2R.
Los datos presentados en la tabla 9 y figura 7 indican que el fenotipo del rsw1 mutante deficiente en celulosa puede ser reproducido mediante la expresión de constructor genéticos de RSW1 antisentido en plantas transgénicas.
Para confirmar la menor síntesis y/o deposición de celulosa en plantas transgénicas que expresan el gen de RSW1 transgénico, se mide el nivel de celulosa mediante el ensayo de incorporación de ^{14}C o como material insoluble en ácido acético/nítrico y se compara con la producción de celulosa en plantas de tipo salvaje por otro lado isogénicas. Se demuestra que la producción de celulosa en las plantas transgénicas se reduce de manera importante en comparación con las plantas de tipo salvaje. La severidad del fenotipo de las plantas transgénicas así producido varía de forma considerable, dependiendo en cierto grado del nivel de inhibición de biosíntesis de celulosa.
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 9
11 
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 10
Secuencias relacionadas de RSW1 en plantas de arroz
Para identificar secuencias de nucleótidos relacionadas de RSW1 en arroz, se investigó una base de datos de secuencias genéticas respecto a secuencias de nucleótidos que estaban estrechamente relacionadas con las secuencias de nucleótidos de RSW1 de Arabidopsis thaliana descritas en los ejemplos anteriores. Se identificó EST S0542 (banco DNA MAFF, Japón) de la cual solo estaba disponible una secuencia de nucleótidos parcial. Además, con anterioridad a la presente invención, no existía una función probable anexa a la secuencia EST S0542 de arroz.
Los presentes inventores han obtenido la secuencia completa de nucleótidos del clon S0542 y derivaron la secuencia de aminoácidos codificada para el mismo. El cDNA de S0542 tenía una longitud de solo 1741 pb y parecía ser un clon parcial de cDNA debido a que, aunque comprende 100 pb de secuencia 5'-sin traducir y contiene el codón de parada ATG, está truncado en el extremo 3' y, como consecuencia, solo codifica los primeros 547 residuos aminoácido del polipéptido RSW1 o de tipo RSW1 de arroz. En base a la longitud del correspondiente polipéptido RSW1 de Arabidopsis thaliana (1081 aminoácidos), la secuencia de RSW1 de arroz indicada en SEQ ID NO: 14 aparece conteniendo aproximadamente la mitad de la secuencia completa de aminoácidos.
La mitad N-terminal de la secuencia de aminoácidos de RSW1 de arroz es idéntica aproximadamente en un 70% al polipéptido RSW1 de Arabidopsis thaliana indicado en SEQ ID NO: 6, ocurriendo una mayor homología (aproximadamente 90%) entre los residuos aminoácido 271-547 de la secuencia de arroz. Estos datos sugieren de forma destacada que S0542 es el homólogo en arroz del gen RSW1 de A. thaliana. En las figuras 9 y 10 se presentan las alineaciones de las secuencias de aminoácidos de RSW1 en arroz, A. thaliana y algodón.
Para aislar clones de cDNA de longitud completa y equivalentes de clones genómicos de S0542 (este estudio y banco de DNA MAFF, Japón) o D48636 (Pear et al., 1996), se producen librerías de cDNA y de clones genómicos usando mRNA y DNA genómico de arroz respectivamente, y se examinan por hibridación empleando los cDNAs de S0542 o D48636 como sonda, esencialmente en la forma aquí descrita. Se identifican placas de hibridación positiva y se purifican, durante otras rondas de examen por hibridación, a placas individuales.
Los clones de arroz son secuenciados en la forma descrita en los ejemplos anteriores para determinar las secuencias completas de nucleótidos de los genes de RSW1 de arroz y secuencias derivadas de aminoácidos para los mismos. Los expertos en la materia conocerán que dichas secuencias genéticas son útiles para la producción de plantas transgénicas, en particular plantas de cereales transgénicos que tienen un contenido y/o calidad de celulosa alterados, empleando técnicas convencionales. La presente invención se extiende a todas esas secuencias genéticas que tienen una secuencia como la definida en las reivindicaciones, así como a aplicaciones de las mismas.
Ejemplo 11
Secuencias relacionadas con RSW1 en plantas de algodón
Se utilizó un fragmento PCR de RSW1 marcado con ^{32}P para examinar aproximadamente 200.000 clones de cDNA en una librería de cDNA de fibra de algodón. La sonda PCR de RSW1 fue amplificada inicialmente a partir de cDNA de Arabidopsis thaliana de tipo salvaje empleando los cebadores 2280-F y csp1-R descritos en los ejemplos anteriores y efectuando entonces una nueva amplificación empleando la combinación de cebadores 2370-F/csp1-R, también descritos en los ejemplos anteriores.
Las hibridaciones fueron realizadas en condiciones de baja estringencia a 55ºC.
En la primera ronda de examen se identificaron seis placas putativas de hibridación positiva. Empleando dos rondas más de examen por hibridación, se purificaron cuatro de estas placas a placas individuales. Tres placas se hibridan muy fuertemente a la sonda de RSW1 mientras que la cuarta placa se hibrida de manera menos intensa.
Se llega a la conclusión de que las placas de hibridación positiva que han sido purificadas son fuertes candidatos a comprender secuencias genéticas de RSW1 de algodón o secuencias genéticas de tipo RSW1 de algodón. Además, los cDNAs de algodón pueden codificar la subunidad catalítica de celulosa sintasa, debido a que la arquitectura proteica de la subunidad de celulosa sintasa parece estar altamente conservada entre las plantas como se ha resaltado en el ejemplo anterior.
Por otro lado, una transferencia Southern de DNA genómico de algodón digerido con BgIII fue hibridada con el extremo 5' del cDNA de RSW1, en condiciones de hibridación de baja estringencia a 55ºC. Los resultados se presentan en la figura 11. Estos datos demuestran que en genoma de algodón existen secuencias relacionadas con RSW1.
Los clones de cDNA de algodón aquí descritos son secuenciados en la forma descrita en los ejemplos anteriores y utilizados para producir plantas transgénicas de algodón que tienen características alteradas de la fibra. Los cDNAs se utilizan también para alterar genéticamente el contenido y/o calidad de celulosa de otras plantas, empleando técnicas convencionales.
Ejemplo 12
Secuencias relacionadas con RSW1 en Eucalyptus ssp.
Se obtuvieron por amplificación, empleando PCR, fragmentos del gen putativo de la subunidad catalítica de celulosa sintasa de Eucalyptus ssp. Se diseñaron cebadores de DNA para los residuos aminoácido conservados encontrados en RSW1 de Arabidopsis thaliana y secuencias de aminoácidos 12C4. Para la PCR se emplearon tres cebadores. Los dejadores son los siguientes:
pcsF-I 5'-AA/GAAGATIGAC/TTAC/TC/TTIAAA/GGAC/TAA-3'
pcsR-II 5'-A TIGTIGGIGTICG/TA/GTTC/TTG A/T/G/C C T/G A/T/C/G C C -3'
pcsF-II 5'-GCIATGAAA/GA/CGIGAITAC/TGAA/GGA -3'
Empleando condiciones y soluciones convencionales de PCR (temperatura de templado 50ºC), se emplearon las combinaciones de cebadores pcsF-I/pcsR-II y pcsF-II/pcsR-II para amplificar secuencias genéticas de cDNA reunido de Eucalyptus ssp. En la primera reacción, se emplearon los cebadores pcsF-I y pcsR-II para generar un fragmento de aproximadamente 700 pb de longitud. En la segunda reacción PCR, que utilizó los cebadores pcsF-II y pcsR-II, se obtuvo un fragmento estimado en 700 pb. Los tamaños de los fragmentos PCR se encuentran dentro del intervalo de tamaños estimado para las correspondientes secuencias de Arabidopsis thaliana.
Se llega a la conclusión de que los fragmentos PCR amplificados de Eucalyptus ssp. han de estar relacionados probablemente con el gen de RSW1 de Arabidopsis thaliana y pueden codificar al menos una parte de la subunidad catalítica de celulosa sintasa de Eucalyptus ssp.
Los clones PCR de Eucalyptus ssp. aquí descritos son secuenciados en la forma descrita en los ejemplos anteriores y utilizados para aislar los correspondientes cDNAs de longitud completa de Eucalyptus ssp. y equivalentes de genes genómicos. Los expertos en la materia conocerán que dichas secuencias genéticas son útiles para la producción de plantas transgénicas, en particular plantas transgénicas de Eucalyptus ssp. que tienen un contenido y/o calidad de celulosa alterados, empleando técnicas convencionales. La presente invención se extiende a todas esas secuencias genéticas que tienen una secuencia como la definida en las reivindicaciones, así como a sus
aplicaciones.
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Ejemplo 13
\beta-1,4-glucano no cristalino como modificador de las propiedades de la pared celular
Las propiedades de las paredes celulares de las plantas dependen de los carbohidratos, proteínas y otros polímeros de las cuales están constituidas y de las formas complejas en las cuales interaccionan. El incremento de las cantidades de \beta-1,4-glucano no cristalino en las paredes celulares afecta a aquellas propiedades de las paredes que influencian las cualidades mecánicas, nutricionales y otras muchas cualidades, teniendo también consecuencias secundarias resultantes de la diversión de carbono en el glucano no cristalino a expensas de otros usos. Para ilustrar uno de estos efectos, se ha investigado la capacidad del glucano no cristalino para el enlace de hidrógeno a otros componentes de la pared, en particular celulosa, del modo que se ha demostrado que resulta importante para las cualidades mecánicas de la
pared.
Las hemicelulosas, tales como xiloglucanos, reticulan microfibrilas de celulosa mediante el enlace de hidrógeno a la superficie de las microfibrilas (Levy et al., 1991). Puesto que se cree que la espina dorsal \beta-1,4-glucano del xiloglucano es responsable del enlace de hidrógeno (limitando las sustituciones de xilosa, galactosa y fucosa la capacidad para formar más enlaces de hidrógeno, cabe esperar que el \beta-1,4-glucano no cristalino tenga también capacidad para el enlace de hidrógeno y reticulación de la celulosa. Se cree que la eficacia de los álcalis fuertes a la hora e extraer xiloglucanos está relacionada con su rotura de los enlaces de hidrógeno con celulosa (Hayashi y MacLachlan,
1984).
Para demostrar que el \beta-1,4-glucano no cristalino forma asociaciones similares con las microfibrilas de celulosa, se examinó si la fracción de 4 M KOH, extraída de retoños del mutante rsw1 y de plantas RSW1 de tipo salvaje, contenía o no glucano no cristalino además de xiloglucano. El glucano no cristalino se separó del xiloglucano en el extracto de 4 M KOH por diálisis del extracto neutralizado contra agua destilada y centrifugado a 14.000 g durante 1 hora. Se demostró que el pellet consistía en \beta-1,4-glucano puro utilizando métodos para el análisis de monosacáridos, análisis de metilación y digestión enzimática para caracterizar el glucano en la fracción de oxalato amónico (véase ejemplo 1).
La tabla 10 muestra la presencia de cantidades importantes de glucano recuperado en forma pura en el pellet a partir de las fracciones de 4 M KOH extraídas de la sobreproducción de mutante rsw1 de Arabidopsis thaliana. Estos datos también demuestran la presencia de cantidades más pequeñas de \beta-1,4-glucano no cristalino en la fracción de 4 M KOH de las plantas de tipo salvaje, en comparación con rsw1, particularmente cuando se hacen crecer a
31ºC.
TABLA 10
12
Después de la hidrólisis con TFA se determinó la composición de monosacáridos del sobrenadante que queda después del centrifugado. Estos datos, así como los datos del análisis por metilación, están de acuerdo con el hecho de que el sobrenadante es un xiloglucano relativamente puro. El sobrenadante estaba libre de glucano debido a que no se pudo liberar glucosa por la mezcla de endocelulasa/\beta-glucosidasa que liberó glucosa a partir de \beta-1,4-glucano.
La presencia de \beta-1,4-glucano no cristalino y de xiloglucano en la fracción 4 M KOH, considerado junto con las implicaciones derivadas de predicciones estructurales (Levy et al., 1991) es consistente de que parte del \beta-1,4-glucano no cristalino de la pared se une por hidrógeno a microfibrilas de celulosa de manera similar a como lo hace la espina dorsal de \beta-1,4-glucano de xiloglucano.
La reticulación proporcionada cuando los xiloglucanos y otras hemicelulosas se unen a dos o más microfibrilas es un determinante importante de las propiedades mecánicas de las paredes celulósicas (Hayashi, 1989). Los efectos del incremento de las cantidades de \beta-1,4-glucano no cristalino en las paredes son probablemente que sean más grandes en las paredes que por otro lado poseen niveles de reticulación relativamente bajos como resultado de las altas relaciones de celulosa:hemicelulosas. Dichas condiciones son comunes en las paredes secundarias incluyendo aquellas de varias fibras, y la relación celulosa:hemicelulosa es particularmente alta en fibras de algodón.
Los efectos sobre las propiedades mecánicas de las paredes que presenta la sobreproducción de glucano no cristalino son mostrados por plantas en transformación con el alelo mutante de rsw1 (SEQ ID NO: 11) operativamente bajo el control del promotor de RSW1 derivado de SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4 o alternativamente, un promotor constitutivo adecuado tal como el promotor 35S de CaMV. La producción de glucano no cristalino es cuantificada por fraccionamiento de las paredes celulares empleando los métodos descritos anteriormente, para mostrar en particular que se recupera glucano no cristalino en la fracción de 4 M KOH. Las propiedades mecánicas de las paredes celulares se miden empleando métodos convencionales de análisis de fibras para estudiar parámetros tales como las curvas de tensión-deformación y la deformación por rotura, entre otras propiedades.
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Ejemplo 14
Sobre-expresión de celulosa sintasa en plantas transgénicas
Se emplean tres estrategias para sobre-expresar celulosa sintasa en plantas de Arabidopsis thaliana.
En la primera estrategia, la secuencia promotora 35S de CaMV se conecta operativamente al cDNA de longitud completa de celulosa sintasa que se puede obtener mediante extensión con cebador de SEQ ID NO: 1. Esto puede ser conseguido mediante clonación del cDNA de longitud completa que codifica celulosa sintasa, en la orientación sentido, entre el promotor 35S de CaMV u otro promotor adecuado operativo en plantas y las secuencias terminadoras de nopalina sintasa del plásmido binario pBI121.
En la segunda estrategia, la parte codificadora del gen genómico es clonada, en la orientación sentido, entre el promotor 35S de CaMV y las secuencias terminadoras de nopalina sintasa del plásmido binario pBI121.
En la tercera estrategia, se prepara, en una forma adecuada para la transformación del tejido de la planta, el clon cósmido binario 23H12 o el pRSW1 derivado, que contiene la secuencia del gen de celulosa sintasa operativamente bajo el control de las secuencias promotora y terminadora del gen de celulosa sintasa.
Para la transformación de tejido mediada por Agrobacterium, los constructor plásmidos binarios descritos supra se transforman en la cepa AGL1 de Agrobacterium tumefaciens o en otra cepa adecuada. Los constructos de DNA recombinantes son introducidos entonces en plantas de Arabidopsis thaliana de tipo salvaje (ecotipo Columbia), como se ha descrito en los ejemplos anteriores.
Alternativamente, se transforma directamente el tejido de la planta empleando el método de infiltración en vacío descrito por Beshtold et al. (1993).
Las plantas transgénicas así producidas exhiben una variedad de fenotipos, debido parcialmente a los efectos posicionales y niveles variables de expresión del transgen de celulosa sintasa.
El contenido en celulosa de las plantas transgénicas y de plantas de control isogénicas sin transformar se determina por el ensayo de incorporación de ^{14}C o como material insoluble en ácido acético/nítrico como se ha descrito en el ejemplo 1. En general, el nivel de deposición de celulosa y las velocidades de síntesis de celulosa en las plantas transgénicas son significativamente mayores que en las plantas de control sin transformar.
Además, en ciertos casos, la co-supresión conduce a mimetismo del fenotipo del mutante rsw1.
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Ejemplo 15
Mutagénesis dirigida al sitio del gen de RSW1
La secuencia de nucleótidos del gen de RSW1 contenido en 23H12 es mutada empleando mutagénesis dirigida al sitio, en varias posiciones para alterar su actividad catalítica o afinidad por el sustrato o propiedades del glucano. En un ejemplo, el gen de RSW1 es mutado para que comprenda una o más mutaciones presentes en el alelo de rsw1 mutante.
Las secuencias genéticas mutadas son clonadas en el plásmido binario descrito en los ejemplos anteriores, en lugar de las secuencias de tipo salvaje. El tejido vegetal obtenido tanto de las plantas de Arabidopsis thaliana Columbia de tipo salvaje como de las plantas A. thaliana rsw1 es transformado como aquí se describe y las plantas enteras son regeneradas.
Se efectúan transformaciones de control empleando la secuencia del gen de celulosa sintasa de tipo salvaje.
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Ejemplo 16
Fenotipos de plantas que expresan genes de RSW1 mutados
Las plantas transformadas con los constructos genéticos descritos en el ejemplo 15 (y en cualquier otra parte) son inicialmente clasificados en base al número de copias transgénicas, para eliminar la variabilidad que surge de las mismas. Se analizan plantas que expresan copias individuales de diferentes transgenes respecto a otros componentes de la pared celular, incluyendo los contenidos en celulosa, polímero de \beta-1,4-glucano no cristalino, almidón y carbohidratos.
1. Contenido en celulosa
El contenido en celulosa de las plantas transgénicas se determina mediante el ensayo de incorporación de ^{14}C como se ha descrito en el ejemplo 1. Se preparan las paredes celulares, se fraccionan y se determina la composición de monosacáridos de las fracciones individuales como en el ejemplo 1.
2. Contenido en \beta-1,4-glucano no cristalino
Las plantas transgénicas que expresan el alelo del mutante de rsw1 exhiben un mayor nivel de \beta-1,4-glucano no cristalino, y por tanto extractable, en las paredes celulares en comparación con las plantas que expresan una copia adicional del alelo de RSW1 de tipo salvaje. De este modo, es posible cambiar la cristalinidad de las cadenas de \beta-1,4-glucano presentes en al pared celular por mutación del alelo de RSW1 de tipo salvaje.
3. Contenido en almidón
Las plantas transgénicas son también analizadas para determinar el efecto de la mutagénesis del gen de RSW1 sobre el nivel de almidón depositado en sus raíces. La cantidad de almidón presente en el material preparado a partir de la fracción de pared en bruto se determina empleando el método de antrona/H_{2}SO_{4} descrito en el ejemplo 1. Los datos muestran que la mutación del gen de RSW1 al alelo de rsw1 mutante aumenta la deposición de almidón. Esto demuestra que el gen puede ser usado para alterar la repartición de carbono en carbohidratos distintos de celulosa.
4. Composición de la pared celular
También se analiza la composición de la pared celular del material de la planta transgénica. Se hacen crecer plántulas de tipo salvaje y de rsw1 y transgénicas durante 2 días a 21ºC y se mantienen entonces durante 5 días más bien a 21ºC o bien a 31ºC. Con la transferencia a 31ºC cuando la semilla ha germinado escasamente, la composición de la pared en la cosecha final refleja en gran medida la operación del producto genético de rsw1 mutado a su temperatura restrictiva. El fraccionamiento de la pared celular se lleva a cabo de manera similar a la descrita para el experimento con ^{14}C (ejemplo 1) y se cuantifica la composición de monosacáridos de cada fracción mediante GC/MS después de la hidrólisis con ácido trifluoracético o, en el caso de celulosa cristalina, con H_{2}SO_{4}.
En algunas plantas transgénicas en donde el gen de RSW1 está mutado, la composición de monosacáridos es comparable a la observada para plantas homocigotos de rsw1, al menos en algunos casos, confirmando ello que existe una mayor reducción de la cantidad de celulosa cristalina en la fracción final insoluble en ácido. De este modo, se puede realizar la mutación del gen de RSW1 para producir cambios en la composición de las paredes celulares de la planta.
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Ejemplo 17
Modificación química del gen de RSW1 para manipular la producción de celulosa y el contenido de la pared celular de la planta
Como queda demostrado en los ejemplos anteriores, el gen de RSW1 está implicado en la producción de celulosa y en la manipulación del contenido de la pared celular.
En el presente ejemplo, para identificar nuevos fenotipos y secuencias genéticas importantes para el funcionamiento normal del gen de celulosa sintasa, el gen de RSW1 es modificado en las plantas, empleando el mutágeno químico EMS. Las plantas mutantes son identificadas después de la germinación y los genes de RSW1 modificados son aislados y caracterizados al nivel de la secuencia de nucleótidos. La comparación de secuencias entre las secuencias del gen mutante y las secuencias de tipo salvaje revela nucleótidos que codifican aminoácidos importantes para la actividad catalítica normal de la enzima de celulosa sintasa, al menos en plantas de Arabidopsis thaliana.
Este enfoque genera así otras secuencias genéticas de utilidad en la modificación del contenido en celulosa y propiedades en las plantas.
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Ejemplo 18
Discusión
Cinco hechos evidentes hacen que sea un caso preciso que el producto genético de RSW1 codifica la subunidad catalítica de celulosa sintasa:
1.
La mutación de rsw1 inhibe selectivamente la síntesis de celulosa y promueve la acumulación de un \beta-1,4-glucano no cristalino;
2.
La mutación de rsw1 separa complejos de celulosa sintasa de la membrana de plasma, proporcionando un mecanismo plausible para una menor acumulación de celulosa y colocando el producto de RSW1 bien en los complejos o bien interaccionando con los mismos;
3.
La firma D,D,D, QXXRW identifica el producto genético de RSW1 como una enzima procesiva de glicosil transferasa (Saxena, 1995);
4.
El alelo de tipo salvaje corrige el fenotipo sensible a la temperatura del mutante de rsw1; y
5.
La expresión antisentido de RSW1 en plantas transgénicas crecidas a 21ºC reproduce parte del fenotipo de rsw1 que es observado después del crecimiento a 31ºC.
En consistencia con la posición de la membrana de plasma esperada para una subunidad catalítica, el producto putativo de RSW1 de 122 kDa contiene 8 regiones pronosticadas que van de un lado a otro de la membrana. Seis de estas regiones forman racimos cerca del terminal C (figura 10), separadas de las otras dos por un dominio que probablemente es citoplásmico y tiene las similitudes de secuencia débiles a las glicosil transferasas procarióticas (Wong, 1990; Saxena, 1990; Matthyse, 1995; Sofia, 1994; Cutis, 1996).
Por tanto, RSW1 se cualifica como un miembro de la gran familia de genes de Arabidopsis thaliana cuyos miembros muestran similitudes débiles con la celulosa sintasa bacteriana. RSW1 es el primer miembro de dicha familia que ha de ser identificado rigurosamente como una celulosa sintasa auténtica. Entre los diversos genes en A. thaliana, al menos dos genes muestran similitudes de secuencia muy fuertes al gen de RSW1 y muy probablemente son miembros de una sub-familia altamente conservada implicada en la síntesis de celulosa. Las secuencias estrechamente relacionadas procedente del cósmido 12C4, un clon genómico parcial que se hibrida de forma cruzada con EST T20782 designado Ath-A y de un cDNA de longitud completa designado Ath-B.
Ath-A se asemeja a RSW1 (SEQ ID NO: 5) en su terminal N, mientras que Ath-B comienza 22 residuos aminoácido aguas abajo [figura 8 y figura 9(i), (ii) y (iii)]. Secuencias estrechamente relacionadas en otros angiospermas son la EST S0542 de arroz [figura 9(i), (ii) y (iii)], que se asemeja a los polipéptidos codificados por RSW1 y Ath-A y el gen celA1 de algodón (Pear, 1996) en el terminal N.
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Los genes de Arabidopsis thaliana, arroz y algodón tienen regiones de una similitud de secuencia muy alta dispersadas con regiones variables (figuras 9 y 10). La mayor parte de la conservación más alta entre dichos productos genéticos ocurre en su dominio citoplásmico central en donde ocurren las similitudes débiles con la celulosa sintasa bacteriana. La región N-terminal que precede a la primera región que abarca la membrana es probablemente también citoplásmica pero muestra muchas sustituciones de aminoácidos así como secuencias de RSW1 que no tienen contrapartida en algunos de los otros genes como ya se ha observado para celA. Una excepción a esto es una región que comprende 7 residuos de cisteína con separaciones altamente conservadas (figura 10). Esto es una reminiscencia de regiones sugeridas para mediar interacciones proteína-proteína y proteína-lípido en diversas proteínas, incluyendo reguladores de la transcripción, y pueden tenerse en cuenta para la similitud fuerte de secuencias entre esta región de RSW1 y dos factores de transcripción bZIP de soja (Genbank SOYSTF1A y 1B).
En conclusión, los cambios químicos y ultraestructurales apreciados en el mutante deficiente en celulosa se combinan con la clonación y complementación genéticas del mutante para proporcionar una fuerte evidencia de que el locus de RSW1 codifica la subunidad catalítica de celulosa sintasa. La acumulación de \beta-1,4-glucano no cristalino en el retoño del mutante rsw1 sugiere que se requieren propiedades afectadas por la mutación para que las cadenas glucánicas se ensamblen en microfibrilas. Sin que ello suponga limitación alguna a cualquier teoría o modo de acción, una propiedad clave puede ser la agregación de subunidades catalíticas para formar rosetas en la membrana de plasma. A la temperatura restrictiva, se desmontan complejos de sintasa mutante a monómeros (u oligómeros más pequeños) que no son detectables mediante ataque por congelación. Al menos en el retoño, los monómeros parecen permanecer biosintéticamente activos pero sus productos de \beta-1,4-glucano fallan a la hora de cristalizar a microfibrilas, debido probablemente a que las cadenas crecen en sitios dispersos. Por tanto, la cristalización a microfibrilas, con todas sus consecuencias para la mecánica y morfogénesis de la pared, puede depender de subunidades catalíticas que permanecen agregadas como rosetas en la membrana de plasma.
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Esta lista de referencias citadas por el solicitante solo es con fines de conveniencia para el lector. La misma no forma parte del documento de la Patente Europea. Incluso aunque se han tomado grandes precauciones para recopilar las referencias, no pueden excluirse errores u omisiones y la EPO declina toda responsabilidad a este respecto.
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\global\parskip0.000000\baselineskip
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
SOLICITANTE: Australian National University and the Commonwealth Scientific and Industrial Research Organisation
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Manipulación de celulosa de plantas
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 14
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DIRECCIÓN: Davies Collison Cave Patent Attorneys
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: 1, Little Collins Street
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: Melbourne
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
ESTADO: Victoria
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAÍS: Australia
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
ZIP: 3000
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
FORMA LEIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TIPO DE MEDIO: disquete flexible
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
SOFTWARE: PatentIn Release # 1.0, versión #1.25
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO SOLICITUD: PCT INTERNACIONAL
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
(vii)
DATOS DE LA SOLICITUD PRIORITARIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD: AU P00699
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN: 27-JUN-1996
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
INFORMACIÓN DEL AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: SLATTERY, JOHN M
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TELÉFONO: 61-3-9254-2777
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TELEFAX: 61-3-9254-2770
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TELEX: AA31787
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 2248 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NATURALEZA DE LA HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Arabidopsis thaliana 
\vskip0.800000\baselineskip
(vii)
FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CLON: EST T20782
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 1..1887
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
14
15
16
17
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 629 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
19
20
21
22 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 8411 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NATURALEZA DE LA HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Arabidopsis thaliana 
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CEPA: Columbia (tipo salvaje)
\vskip0.800000\baselineskip
(vii)
FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CLON: GEN RSW1 23H12
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: exon
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 2296..2376
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: exon
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 2404..3099
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: exon
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 3198..3370
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: exon
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 3594..3708
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: exon
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 3824..4013
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: exon
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 4181..4447
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: exon
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 4783..5128
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: exon
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 5207..5344
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: exon
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 5426..5551
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: exon
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 5703..5915
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: exon
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 6022..6286
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: exon
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 6374..6570
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: exon
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 6655..7005
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: exon
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 7088..8032
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:
23
24
25
26
27
28
29 
\vskip1.000000\baselineskip
30 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 5009 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NATURALEZA DE LA HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Arabidopsis thaliana 
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CEPA: Columbia
\vskip0.800000\baselineskip
(vii)
FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CLON: 12C4
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: exon
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 863..943
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: exon
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 1454..1840
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: exon
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 1923..2025
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: exon
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 2122..2311
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: exon
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 221..2687
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: exon
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 2776..3121
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: exon
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 3220..3357
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: exon
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 3507..3623
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: exon
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 3723..3935
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: exon
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 4027..4297
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: exon
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 4380..4576
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
31 
\vskip1.000000\baselineskip
32
33
34
35 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 3603 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NATURALEZA DE LA HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Arabidopsis thaliana 
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CEPA: Columbia
\vskip0.800000\baselineskip
(vii)
FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CLON: RSW1 cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 1..3243
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
36
37
38
39
40
41
42
43 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1081 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:
44
45
46
47
48
49 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 3828 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NATURALEZA DE LA HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Arabidopsis thaliana 
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CEPA: Columbia
\vskip0.800000\baselineskip
(vii)
FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CLON: Ath-A
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 239..3490
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:
50
51
52
53
54
55
56
57 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1084 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
58
59
60
61
62
63 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 3614 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NATURALEZA DE LA HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Arabidopsis thaliana 
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CEPA: Columbia
\vskip0.800000\baselineskip
(vii)
FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CLON: Ath-B
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 217..3411
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
64
65
66
67
68
69
70
71 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 10:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1065 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 10:
72
73
74
75 
\newpage
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
\cr}
76 
\newpage
77 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 11:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 3673 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NATURALEZA DE LA HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Arabidopsis thaliana 
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CEPA: Columbia
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
AISLADO INDIVIDUAL: mutante rsw1
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 71..3313
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
78
79
90
91
92
93
94
95
96 
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 12:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1081 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO:aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
97
98
99
100
101
102 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 13:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1741 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NATURALEZA DE LA HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Oryza sativa 
\vskip0.800000\baselineskip
(vii)
FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CLON: S0542
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 101..1741
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
103
104
105
106 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 14:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 547 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 14:
107
108
109

Claims (31)

1. Una molécula aislada de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de celulosa sintasa de una planta o una sub-unidad catalítica de la misma que tiene actividad de celulosa sintasa, o una secuencia complementaria a la misma, en donde dicha secuencia de nucleótidos:
a) es idéntica al menos en un 55% a cualquiera de SEQ ID NOS: 1, 5, 7, 9, 11 o 13;
b) codifica un polipéptido que es idéntico al menos en un 40% a cualquiera de SEQ ID NOS: 2, 6, 8, 10, 12 o 14;
c) se hibrida a cualquiera de SEQ ID NOS: 1, 5, 7, 9, 11 o 13 o una secuencia complementaria a las mismas bajo las siguientes condiciones de hibridación:
i.
tampón 0,2 x SSC-2 x SSC, 0,1% (p/v) SDS a 42ºC-65ºC; o
ii.
tampón 0,1 x SSC-0,2 x SSC, 0,1% (p/v) SDS de al menos 65ºC;
d) es amplificable en una reacción en cadena de polimerasa que utiliza dos cebadores que comprenden 20-30 nucleótidos contiguos derivados de cualquiera de SEQ ID NOS: 1, 5, 7, 9, 11 o 13 o una secuencia complementaria a las mismas.
2. Una molécula aislada de ácido nucleico según la reivindicación 1, en donde dicha secuencia de nucleótidos es cualquiera de SEQ ID NOS: 1, 5, 7, 9, 11 o 13.
3. Una molécula aislada de ácido nucleico según la reivindicación 1, en donde dicha secuencia codifica un polipéptido que es idéntico al menos en un 60% a cualquiera de SEQ ID NOS: 2, 6, 8, 10, 12 o 14.
4. Una molécula aislada de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde dicha planta se elige del grupo consistente en Arabidopsis thaliana, Gossypium hirsutum (algodón), Oryza sativa (arroz), trigo, cebada, maíz, Brassica ssp., Eucalyptus ssp, cáñamo, yute, lino, Pinus ssp. Populus ssp. y Picea ssp.
5. Una molécula aislada de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde dicha planta se elige del grupo consistente en Arabidopsis thaliana, Gossypium hirsutum (algodón), Oryza sativa (arroz), trigo y cebada.
6. Una molécula aislada de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde dicha planta se elige del grupo consistente en Arabidopsis thaliana, Gossypium hirsutum (algodón) y Oryza sativa (arroz).
7. Una molécula aislada de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde dicha celulasa sintasa o subunidad catalítica de la misma es el polipéptido RSW1 de Arabidopsis thaliana codificado por SEQ ID NO: 3.
8. Una molécula aislada de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde dicho polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos elegida 
\hbox{del grupo consistente en  SEQ ID NOS: 2, 4, 8, 10, 12 y
14.}
9. Un constructo genético que comprende la molécula aislada de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.
10. Un constructo genético que comprende la molécula aislada de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 conectada operativamente a una secuencia promotora heteróloga.
11. Un constructo genético según la reivindicación 10, en donde dicha secuencia promotora es capaz de regular la expresión en una planta.
12. Un constructo genético según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, en donde la molécula de ácido nucleico está conectada operativamente a una secuencia promotora en la orientación sentido, de manera que un polipéptido de celulosa sintasa o una subunidad catalítica de la misma o RNA que codifica dicho polipéptido de celulosa sintasa o subunidad catalítica de la misma es capaz de producirse cuando dicha molécula de ácido nucleico es expresada en una célula que contiene dicho constructo genético.
13. Un constructo genético según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, en donde el promotor es el promotor 35S de CaMV o un promotor que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 3 desde el nucleótido en la posición 1 al nucleótido en la posición 1900 o un promotor que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 4 desde el nucleótido en la posición 1 al nucleótido en la posición 700.
14. Una planta transgénica o una parte de planta derivada de dicha planta transgénica, en donde dicha planta o parte de planta comprende un constructo genético según la reivindicación 10 u 11.
15. Un método para aumentar el nivel de celulosa en una célula de planta, tejido de planta, órgano de planta o de la planta entera, comprendiendo dicho método expresar en dichos elementos de la planta la molécula aislada de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en la orientación sentido, durante un tiempo y bajo condiciones al menos suficientes para producir o incrementar la expresión del polipéptido o subunidad catalítica codificada por el mismo.
16. Un método para reducir el nivel de \beta-1,4-glucano no cristalino en una célula de planta, tejido de planta, órgano de planta o planta entera, comprendiendo dicho método expresar en tales elementos de la planta la molécula aislada de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en la orientación sentido, durante un tiempo y bajo condiciones al menos suficientes para producir o aumentar la expresión del polipéptido o subunidad catalítica codificada por el mismo.
17. Un método para reducir el nivel de almidón en una célula de planta, tejido de planta, órgano de planta o de la planta entera, comprendiendo dicho método expresar en dichos elementos de la planta la molécula aislada de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en la orientación sentido, durante un tiempo y bajo condiciones al menos suficientes para producir o incrementar la expresión del polipéptido o subunidad catalítica codificada por el mismo.
18. Un método para reducir el nivel de celulosa en una célula de planta, tejido de planta, órgano de planta o de la planta entera, comprendiendo dicho método expresar en dichos elementos de la planta la molécula aislada de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en la orientación antisentido, durante un tiempo y bajo condiciones al menos suficientes para prevenir o reducir la expresión del polipéptido o subunidad catalítica codificada por el mismo.
19. Un método para aumentar el nivel de \beta-1,4-glucano no cristalino en una célula de planta, tejido de planta, órgano de planta o de la planta entera, comprendiendo dicho método expresar en dichos elementos de la planta la molécula aislada de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en la orientación antisentido, durante un tiempo y bajo condiciones al menos suficientes para prevenir o reducir la expresión del polipéptido o subunidad catalítica codificada por el mismo.
20. Un método para aumentar el nivel de almidón en una célula de planta, tejido de planta, órgano de planta o de la planta entera, comprendiendo dicho método expresar en dichos elementos de la planta la molécula aislada de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en la orientación antisentido, durante un tiempo y bajo condiciones al menos suficientes para prevenir o reducir la expresión del polipéptido o subunidad catalítica codificada por el mismo.
21. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 20, en donde la célula de planta, tejido de planta, órgano de planta o planta entera se elige del grupo consistente en Arabidopsis thaliana, Gossypium hirsutum (algodón), Oryza sativa (arroz), Eucalyptus ssp, Brassica ssp., trigo, cebada, maíz, cáñamo, yute, lino o una planta maderera elegida entre Pinus ssp., Populus ssp. y Picea ssp.
22. Un método para producir un polipéptido de celulosa sintasa recombinante enzimáticamente activo o una subunidad catalítica que tiene actividad de celulosa sintasa, en una célula de planta, comprendiendo dicho método expresar en dicha célula de planta la molécula aislada de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 bajo el control de un promotor heterólogo, durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para producir el polipéptido o subunidad catalítica codificada por el mismo.
23. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 22, que comprende la primera etapa adicional de transformar la célula, tejido, órgano o planta con la molécula aislada de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, o el constructo genético según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12.
24. Un polipéptido de celulosa sintasa recombinante o una subunidad catalítica que tiene actividad de celulosa sintasa en una forma sustancialmente homogénea que comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica al menos en un 40% a la secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEQ ID NOS: 2, 6, 8, 10, 12 o 14.
25. Un método para alterar las propiedades mecánicas de la pared celular de una planta, comprendiendo dicho método expresar la molécula aislada de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en la orientación antisentido, en dicha célula, durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para que aumente el nivel de \beta-1,4-glucano no cristalino en dicha célula.
26. Una molécula de anticuerpo que se une específicamente al polipéptido recombinante según la reivindicación 24.
27. Una planta transgénica o parte de planta según la reivindicación 14, en donde la planta se elige del grupo consistente en Arabidopsis thaliana, Gossypium hirsutum (algodón), Oryza sativa (arroz), Eucalyptus ssp, Brassica ssp., trigo, cebada, maíz, cáñamo, yute, lino, Pinus ssp., Populus ssp. y Picea ssp.
\newpage
28. Uso de una molécula aislada de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 para modificar el contenido en celulosa de la célula de una planta.
29. Uso según la reivindicación 28, en donde si la molécula de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 se expresa en la orientación sentido en dicha célula, se aumenta el nivel de celulosa en la misma.
30. Uso según la reivindicación 28, en donde si la molécula de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 se expresa en la orientación antisentido en dicha célula, se disminuye el nivel de celulosa en la misma.
31. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 28 a 30, en donde la planta se elige del grupo consistente en Arabidopsis thaliana, Gossypium hirsutum (algodón), Oryza sativa (arroz), Eucalyptus ssp, Brassica ssp., trigo, cebada, maíz, cáñamo, yute, lino, Pinus ssp., Populus ssp. y Picea ssp.
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